專(zhuān)利名稱(chēng)：藥物組合物，融合物和結(jié)合物的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求保護(hù)在2004年12月2日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)第60/632361號(hào)的權(quán)利和在2004年06月1日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)第60/576271號(hào)的權(quán)利。上述申請(qǐng)的全部教導(dǎo)通過(guò)在此引證并入本文。
背景技術(shù)：
許多擁有治療和/或診斷作用活性的藥物，其價(jià)值十分有限，因?yàn)楫?dāng)被給藥后，它們很快地從體內(nèi)被除去。例如，許多具有治療有效活性的多肽通過(guò)腎被很快從循環(huán)中清除。因此，為了取得希望的治療效果必需給予一個(gè)較大的劑量。一種具有改進(jìn)藥物動(dòng)力學(xué)特性的改良的治療和診斷制劑成為需要。與血清白蛋白結(jié)合的多肽是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。(見(jiàn)，如，歐洲專(zhuān)利第0486525 B1號(hào)(Cemu Bioteknik AB)；美國(guó)專(zhuān)利第6267964 B1號(hào)(Nygren等)；WO 04/001064 A2(Dyax公司)；WO 02/076489 A1(Dyax公司)；WO 01/45746(Genentech，Inc.))。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及具有改進(jìn)的血清半衰期的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)。在一方面，本發(fā)明是一種藥物融合物，其中的藥物融合物是一種具有如下分子式的連續(xù)多肽鏈
a-(X)n1-b-(Y)n2-c-(Z)n3-d或a-(Z)n3-b-(Y)n2-c-(X)n1-d，其中，X表示對(duì)第一目標(biāo)有結(jié)合特異性的一種多肽藥物；Y表示一種對(duì)血清白蛋白有結(jié)合特異性的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域(VH)，或一種對(duì)血清白蛋白有結(jié)合特異性的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)域(VL)；Z表示對(duì)第二目標(biāo)有結(jié)合特異性的一種多肽藥物；a，b，c和d分別是包括1至大約100個(gè)殘基的多肽或缺失；n1表示1至大約10；n2表示1至大約10；和n3表示0至大約10，附帶條件，當(dāng)n1和n2為1且n3為0時(shí)，X不包括抗體鏈或抗體鏈的片段。
在一些實(shí)施方案中，Y包括從由序列號(hào)10，序列號(hào)11，序列號(hào)12，序列號(hào)13，序列號(hào)14，序列號(hào)15，序列號(hào)24，序列號(hào)25和序列號(hào)26組成的組中選擇的一種氨基酸序列，或從由序列號(hào)16，序列號(hào)17，序列號(hào)18，序列號(hào)19，序列號(hào)20，序列號(hào)21，序列號(hào)22和序列號(hào)23組成的組中選擇的一種氨基酸序列。在某些特殊實(shí)施方案中，X是IL-1ra或IL-1ra的一種功能性變體。
在另一方面，藥物融合物包括一種連續(xù)的多肽鏈，所述的鏈包括X’和T’亞基，其中
X’是一種多肽藥物，附帶條件，X’不包括抗體鏈或抗體鏈的片段；并且Y’是表示對(duì)血清白蛋白有結(jié)合特異性的一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域(VH)，或?qū)ρ灏椎鞍子薪Y(jié)合特異性的一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)域(VL)。在某些實(shí)施方案中，Y’包括從由序列號(hào)10，序列號(hào)11，序列號(hào)12，序列號(hào)13，序列號(hào)14，序列號(hào)15，序列號(hào)24，序列號(hào)25和序列號(hào)26組成的組中選擇的一種氨基酸序列，或從由序列號(hào)16，序列號(hào)17，序列號(hào)18，序列號(hào)19，序列號(hào)20，序列號(hào)21，序列號(hào)22和序列號(hào)23組成的組中選擇的一種氨基酸序列。在某些特殊實(shí)施方案中，X’是IL-1ra或IL-1ra的一種功能性變體。
在另一方面，本發(fā)明是一種藥物結(jié)合物，其包括對(duì)血清白蛋白有結(jié)合特異性的一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域(VH)，或?qū)ρ灏椎鞍子薪Y(jié)合特異性的一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)域(VL)，和共價(jià)地結(jié)合所述VH或VL的藥物。在一些實(shí)施方案中，免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域包括從由序列號(hào)10，序列號(hào)11，序列號(hào)12，序列號(hào)13，序列號(hào)14，序列號(hào)15，序列號(hào)24，序列號(hào)25和序列號(hào)26組成的組中選擇的一種氨基酸序列，或從由序列號(hào)16，序列號(hào)17，序列號(hào)18，序列號(hào)19，序列號(hào)20，序列號(hào)21，序列號(hào)22和序列號(hào)23組成的組中選擇的一種氨基酸序列。在某些特殊實(shí)施方案中，這種藥物是IL-1ra或IL-1ra的一種功能性變體。
在另一方面，本發(fā)明是一種非共價(jià)藥物結(jié)合物，其包括對(duì)血清白蛋白有結(jié)合特異性的一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域(VH)，或?qū)ρ灏椎鞍子薪Y(jié)合特異性的一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)域(VL)，和非共價(jià)地結(jié)合所述VH或VL的藥物。在某些實(shí)施方案中，免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域包括從由序列號(hào)10，序列號(hào)11，序列號(hào)12，序列號(hào)13，序列號(hào)14，序列號(hào)15，序列號(hào)24，序列號(hào)25和序列號(hào)26組成的組中選擇的一種氨基酸序列，或從由序列號(hào)16，序列號(hào)17，序列號(hào)18，序列號(hào)19，序列號(hào)20，序列號(hào)21，序列號(hào)22和序列號(hào)23組成的組中選擇的一種氨基酸序列。
本發(fā)明也提供了編碼這里所述藥物融合物的重組核酸和構(gòu)建物，和包括重組核酸和/或構(gòu)建物的宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括供養(yǎng)宿主細(xì)胞的制備藥物融合物的方法，該宿主細(xì)胞包括一種編碼這里所述的融合藥物的重組核酸和/或構(gòu)建物，在適合所述重組核酸表達(dá)的條件下，可生成該藥物融合物。
本發(fā)明也提供了一種組合物(如藥劑組合物)，其包括本發(fā)明的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)。本發(fā)明也提供了對(duì)具有疾病或失調(diào)的病人進(jìn)行治療方法，如這里所述的，包括給予所述的病人本發(fā)明藥物組合物(藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)的治療有效劑量。在某些實(shí)施方案中，疾病或失調(diào)是一種炎癥疾病，如關(guān)節(jié)炎(風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)。本發(fā)明也提供了使用本發(fā)明的藥物組合物(藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)來(lái)制造治療疾病或失調(diào)(如，炎癥疾病，如關(guān)節(jié)炎(風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎))的藥物的方法。本發(fā)明也涉及這里所述的用于治療，診斷或預(yù)防的一種藥物組合物(藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)。


圖1A是通過(guò)結(jié)合小鼠血清白蛋白(MSA)選擇的三種Vks氨基酸序列的陣列。所列的氨基酸序列來(lái)源于Vks被稱(chēng)為的MSA16，亦稱(chēng)為DOM7m-16(序列1)，MSA12，亦稱(chēng)為DOM7m-12(序列2)，MSA26，亦稱(chēng)為DOM7m-26(序列3)。
圖1B是通過(guò)結(jié)合鼠血清白蛋白(RSA)選擇的六種Vks氨基酸序列的陣列。所列的氨基酸序列來(lái)源于Vks被稱(chēng)為DOM7r-1(序列4)，DOM7r-3序列5)，DOM7r-4(序列6)，DOM7r-5(序列7)，DOM7r-7(序列8)和DOM7r-8(序列9)。
圖1C是通過(guò)結(jié)合人血清白蛋白(HSA)選擇的六種Vks氨基酸序列的陣列。所列的氨基酸序列來(lái)源于Vks被稱(chēng)為DOM7h-2(序列號(hào)10)，DOM7h-3(序列號(hào)11)，DOM7h-4(序列號(hào)12)，DOM7h-6(序列號(hào)13)，DOM7h-1(序列號(hào)14)和DOM7h-7(序列號(hào)15)。
圖1D是通過(guò)結(jié)合人血清白蛋白選擇的七種VHS氨基酸序列和參照序列的陣列。所列的氨基酸序列來(lái)源于VHS被稱(chēng)為DOM7h-22(序列號(hào)16)，DOM7h-23(序列號(hào)17)，DOM7h-24(序列號(hào)18)，DOM7h-25(序列號(hào)19)，DOM7h-26(序列號(hào)20)和DOM7h-21(序列號(hào)21)，和DOM7h-27(序列號(hào)22)。
圖1E通過(guò)結(jié)合人血清白蛋白和鼠血清白蛋白選擇的三種Vks氨基酸序列的隊(duì)列。所列的氨基酸序列來(lái)源于VHS被稱(chēng)為DOM7h-8(序列號(hào)24)，DOM7r-13(序列號(hào)25)，DOM7r-14(序列號(hào)26)。
圖2A和2B是分別用于表達(dá)融合蛋白MSA16IL-1ra(也稱(chēng)DOM7m-16/IL-1ra)和IL-1raMSA16(也稱(chēng)IL-1ra/DOM7m-16)的載體的示意圖。
圖2C-2D表示編碼融合蛋白IL-1raMSA16(也稱(chēng)IL-1ra/DOM7m-16)的核酸序列(序列號(hào)27)和融合蛋白的氨基酸序列(序列號(hào)28)。
圖2E-2F表示編碼融合蛋白MSA16IL-1ra(也稱(chēng)DOM7m-16/IL-1ra)的核酸序列(序列號(hào)29)和融合蛋白的氨基酸序列(序列號(hào)30)。
圖2G-2H表示編碼不與血清白蛋白結(jié)合的融合蛋白DummyIL-1ra的核酸序列(序列號(hào)31)和融合蛋白的氨基酸序列(序列號(hào)32)。
圖3A表示IL-1誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞產(chǎn)生IL-8，及在ELISA分析中檢測(cè)IL-8的機(jī)理。
圖3B是一張顯示通過(guò)MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)，IL-1ra(以“R&D”表示)，MSA16IL-1ra( )和IL-1raMSA16( )分別抑制受IL-1-誘導(dǎo)的IL-8分泌的圖表?？梢?jiàn)的抑制作用依賴(lài)于IL-1ra，MSA16IL-1ra和IL-1raMSA16的劑量。
圖4A-4C分別表示了通過(guò)在不含鼠血清白蛋白(4A)，含5％鼠血清白蛋白(4B)，含10％鼠血清白蛋白(4C)的分析試驗(yàn)中培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞，IL-1ra( )和MSA16IL-1ra( )抑制受IL-1-誘導(dǎo)分泌IL-8的圖表。在所有實(shí)驗(yàn)條件下，所觀察到的抑制作用依賴(lài)于IL-1ra和MSA16IL-1ra的劑量。
圖5示范性表達(dá)了ELISA的結(jié)果，證明了融合蛋白MSA16IL-1ra和融合蛋白IL-1raMSA16都能與血清白蛋白結(jié)合，但是融合蛋白DummyIL-1ra不與血清白蛋白結(jié)合。
圖6A-6C分別是表示DOM7h-1結(jié)合人血清白蛋白(HSA)(6A)，DOM7h-7結(jié)合人血清白蛋白(HSA)(6B)，DOM7r-1結(jié)合鼠血清白蛋白(RAS)(6C)的BIACORE親合數(shù)據(jù)的表格。
圖7是一張表格，表示DOM7h-1，DOM7r-1，DOM7h-2，DOM7r-3，DOM7h-8，DOM7h-7，DOM7r-8，DOM7r-13，DOM7r-14，DOM7m-16，DOM7h-22，DOM7h-23，DOM7h-26，DOM7r-16，DOM7m-26，DOM7r-27和DOM7r-31與血清白蛋白結(jié)合的親合力。DOM7h-8也結(jié)合豬血清白蛋白并且親和力為60nM。
圖8A表示存儲(chǔ)于基因庫(kù)中編號(hào)為NM_173842的編碼人白介素1受體拮抗劑(IL-1ra)的核酸的核苷序列(序列號(hào)33)。該核酸在65的位置有一個(gè)開(kāi)放式閱讀框。
圖8B表示由在圖8A中所示的核酸編碼的人IL-1ra的氨基酸序列(序列號(hào)34)。成熟蛋白質(zhì)由152個(gè)氨基酸殘基(序列號(hào)34的26-177位氨基酸殘基)組成。
圖9是一張圖表，表示了一段時(shí)期內(nèi)(天數(shù))，在給予CD1系雄性動(dòng)物單一靜脈內(nèi)注射(大約1.5mg/kg)后，小鼠血清中結(jié)合dAb/HA表位標(biāo)記融合蛋白的MSA濃度。使用山羊抗-HA(Abcam，UK) 捕獲物和蛋白質(zhì)L-HRP(Invitrogen，USA)檢測(cè)藥物進(jìn)行ELISA測(cè)定血清濃度。存在1×小鼠血清時(shí)，建立已知濃度的結(jié)合dAb/HA融合蛋白的MSA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以保證與測(cè)試樣本的可比性。1分隔模型(WinNonlin軟件，Pharsight公司，美國(guó))顯示結(jié)合dAb/HA表位標(biāo)記融合蛋白的MSA具有29.1小時(shí)的半衰期并在曲線(xiàn)下具有559hr μg/ml面積。
圖10是通過(guò)結(jié)合鼠血清白蛋白(RSA)選擇的Vks氨基酸序列的插圖。圖示序列來(lái)源于被稱(chēng)為DOM7r-15(序列37)，DOM7r-16(序列號(hào)38)，DOM7r-17(序列號(hào)39)，DOM7r-18(序列號(hào)40)，DOM7r-19(序列號(hào)41)的Vks。
圖11A-11B表示結(jié)合鼠血清白蛋白(RSA)的VHS氨基酸序列的氨基酸序列。圖示序列來(lái)源于被稱(chēng)為DOM7r-20(序列號(hào)42)，DOM7r-21(序列號(hào)43)，DOM7r-22(序列號(hào)44)，DOM7r-23(序列號(hào)45)，DOM7r-24(序列號(hào)46)，DOM7r-25(序列號(hào)47)，DOM7r-26(序列號(hào)48)，DOM7r-27(序列號(hào)49)，DOM7r-28(序列號(hào)50)，DOM7r-29(序列號(hào)51)，DOM7r-30(序列號(hào)52)，DOM7r-31(序列號(hào)53)，DOM7r-32(序列號(hào)54)，DOM7r-33(序列號(hào)55)的VHS。
圖12是一張圖表，表示在給予CD1系雄性動(dòng)物單一靜脈內(nèi)注射(大約1.5mg/kg劑量)后，在小鼠血清中包含HA抗原表位標(biāo)記的DOM7m-16，DOM7m-26或未結(jié)合MSA的對(duì)照dAb濃度(％起始劑量)。使用山羊抗-HA(Abcam，UK)捕獲物和蛋白質(zhì)L-HRP(Invitrogen，USA)檢測(cè)藥物進(jìn)行ELISA測(cè)定血清濃度。存在1×小鼠血清時(shí)，建立已知濃度的結(jié)合dAb/HA融合蛋白的MSA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以保證與測(cè)試樣本的可比性。1分隔模型(WinNonlin軟件，Pharsight公司，美國(guó))顯示結(jié)合對(duì)照dAb具有20分鐘的半衰期，而DOM7m-16，DOM7m-26在血清中的持續(xù)性顯著持久。
圖13是一張圖表，表示在鼠膠原質(zhì)-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)模型中，DOM7m-16/IL-1ra與IL-1ra或ENBREL(entarecept；Immunex Corporation)相比，能更有效的治療關(guān)節(jié)炎。誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎，并且在第21天開(kāi)始發(fā)作，小鼠用0.4mg/Kg的氟美松(類(lèi)固醇)，1mg/Kg的DOM7m-16/IL-1ra(IL-1ra/抗-SA 1mg/Kg)或10mg/Kg的DOM7m-16/IL-1ra(IL-1ra/抗-SA 10mg/Kg)，1mg/Kg或10mg/Kg的IL-1ra，或5mg/Kg的ENBREL(entarecept；ImmunexCorporation)，或鹽類(lèi)處理。在這次研究中，結(jié)果顯示DOM7m-16/IL-1ra較IL-1ra或ENBREL(entarecept；ImmunexCorporation)更加有效。正如預(yù)料的，針對(duì)IL-1ra的反應(yīng)是受劑量依賴(lài)的，并且針對(duì)DOM7m-16/IL-1ra的反應(yīng)也是受劑量依賴(lài)的。受1mg/Kg的DOM7m-16/IL-1ra處理所得的平均分始終低于受10mg/Kg的DOM7m-16/IL-1ra處理獲得的平均分。在這項(xiàng)研究中，結(jié)果顯示用DOM7m-16/IL-1ra處理的有效性較IL-1ra高10倍。
圖14A-14G舉例說(shuō)明了皂素蛋白(saporin)多肽的氨基酸序列。圖14A舉例說(shuō)明了皂素蛋白-2前驅(qū)體的氨基酸序列，其以保藏號(hào)為Swissprot Accession Number P27559(序列號(hào)60)被存儲(chǔ)。圖14B舉例說(shuō)明了皂素蛋白-3的氨基酸序列，其作為Swissprot Accession Number P27560(序列號(hào)61)被存儲(chǔ)。圖14C舉例說(shuō)明了皂素蛋白-4先驅(qū)的氨基酸序列，其作為SwissprotAccession Number P27561(序列號(hào)62)被存儲(chǔ)。序列號(hào)62的1-24的氨基酸是信號(hào)多肽。圖14D舉例說(shuō)明了皂素蛋白-5先驅(qū)的氨基酸序列，其作為Swissprot Accession Number Q41389(序列63)被存儲(chǔ)。圖14E舉例說(shuō)明了皂素蛋白-6原始的氨基酸序列，其作為Swissprot Accession Number P20656(序列號(hào)64)被存儲(chǔ)。序列號(hào)64的1-24的氨基酸是信號(hào)多肽，并且序列號(hào)64的278-299的氨基酸是一種潛在的前肽。序列號(hào)64的25-277的氨基酸是成熟多肽(序列號(hào)65)。圖14F舉例說(shuō)明了皂素蛋白-7原始的氨基酸序列，其作為Swissprot Accession NumberQ41391(序列號(hào)66)被存儲(chǔ)。圖14G舉例說(shuō)明了參照氨基酸序列包含一些突變體和皂素蛋白-6的異構(gòu)體(序列號(hào)67)。
圖15舉例說(shuō)明了在WO2004/041862中揭示的結(jié)合鼠血清白蛋白的一些Camelid VHHS的氨基酸序列。序列A(序列號(hào)72)，序列B(序列號(hào)73)，序列C(序列號(hào)74)，序列D(序列號(hào)75)，序列E(序列號(hào)76)，序列F(序列號(hào)77)，序列G(序列號(hào)78)，序列H(序列號(hào)79)，序列I(序列號(hào)80)，序列J(序列號(hào)81)，序列K(序列號(hào)82)，序列L(序列號(hào)83)，序列M(序列號(hào)84)，序列N(序列號(hào)85)，序列O(序列號(hào)86)，序列P(序列號(hào)87)，序列Q(序列號(hào)88)。
具體實(shí)施例方式
在本說(shuō)明書(shū)中，實(shí)施方案以能夠使說(shuō)明書(shū)保持清楚且簡(jiǎn)練的方式被描述，但可以理解的是，在不脫離于本發(fā)明的情況下，實(shí)施方案可以被多樣組合和分離。
與發(fā)明的任何一個(gè)實(shí)施方案具有相同分子式的已知組合物在根本上明確地被免責(zé)。相反地，新型組合物，已知組合物的新型化合物，已知組合物的新用途或包括已知組合物的新方法不被免責(zé)。
正如這里使用的，“藥物”指能對(duì)病人施用，通過(guò)結(jié)合和/或改變病人中的生物目標(biāo)分子的作用來(lái)產(chǎn)生一種有益的治療和診斷效果的任何化合物(如，小有機(jī)分子，核酸，多肽)。目標(biāo)分子可以是由病人基因組編碼的內(nèi)源目標(biāo)分子(如，由病人編碼的酶，受體，生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子)或由病原體的基因組編碼的外源目標(biāo)分子(如病毒的基因組編碼的酶，細(xì)菌，真菌，線(xiàn)蟲(chóng)類(lèi)，或其它病原體)。
正如這里使用的，“藥物組合物”指包括與一種多肽結(jié)合亞基共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合藥物的組合物，其中的多肽結(jié)合亞基包括一個(gè)特異結(jié)合可提高體內(nèi)血清半衰期的多肽的結(jié)合位點(diǎn)(如，一個(gè)抗原-結(jié)合位點(diǎn))。藥物組合物可以是一種結(jié)合物，其中的藥物共價(jià)或非共價(jià)地結(jié)合多肽結(jié)合亞基。藥物可以直接或間接地共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合多肽結(jié)合亞基(如，通過(guò)合適的連接物和/或補(bǔ)充結(jié)合成分(如生物素和抗生物素蛋白)的非共價(jià)結(jié)合)。當(dāng)使用補(bǔ)充結(jié)合成分，結(jié)合成分的一部分能直接或通過(guò)一種合適的連接物亞基共價(jià)地結(jié)合藥物，并且補(bǔ)充結(jié)合成分能直接或通過(guò)一種合適的連接物亞基共價(jià)地結(jié)合多肽結(jié)合亞基。當(dāng)藥物是一種多肽或肽，藥物組合物可以是融合蛋白，其中的多肽或肽藥物和多肽結(jié)合亞基是連續(xù)多肽鏈的非連續(xù)部分(亞基)。
正如這里使用的“結(jié)合物”指一種組合物，其包括與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段，其中血清白蛋白與藥物結(jié)合。這些結(jié)合物包括 “藥物結(jié)合物”，其包括一種與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段，其中，血清白蛋白與藥物共價(jià)結(jié)合；和“非共價(jià)藥物結(jié)合物”，其包括一種與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段，其中，血清白蛋白與藥物非共價(jià)結(jié)合。
正如這里使用的“藥物結(jié)合物”指一種包括與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段的組合物，其中血清白蛋白共價(jià)地與藥物結(jié)合。藥物可以直接地或通過(guò)一個(gè)合適的連接物亞基間接地共價(jià)結(jié)合抗原-結(jié)合片段。在任何合適的位置，如氨基末端，碳末端或通過(guò)合適的氨基酸側(cè)鏈(如賴(lài)氨酸的ε氨基組)，藥物可以與抗原-結(jié)合片段結(jié)合。
正如這里使用的“非共價(jià)藥物組合物”指一種組合物，其包括與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段，其中血清白蛋白非共價(jià)地與藥物結(jié)合。藥物可以直接地(如，靜電相互作用，疏水相互作用)或間接地(如，通過(guò)非共價(jià)結(jié)合補(bǔ)充結(jié)合成分(如生物素和抗生物素蛋白)，其中某一成分與藥物共價(jià)結(jié)合并且此補(bǔ)充結(jié)合成分與抗原-結(jié)合片段共價(jià)結(jié)合)非共價(jià)結(jié)合抗原-結(jié)合片段。當(dāng)使用補(bǔ)充結(jié)合成分時(shí)，結(jié)合成分的一部分可以直接地或通過(guò)合適的連接物亞基共價(jià)地與藥物結(jié)合，并且補(bǔ)充結(jié)合成分可以直接或通過(guò)一種合適的連接物亞基共價(jià)地結(jié)合綁定血清白蛋白抗體的抗原-結(jié)合片段。
正如這里使用的“藥物融合物”指一種包括與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段和多肽藥物的融合蛋白。與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段和多肽藥物作為單獨(dú)的連續(xù)多肽鏈的非連續(xù)部分(亞基)的形式存在。
正如這里使用的術(shù)語(yǔ)“藥物基準(zhǔn)”指藥物組合物和藥物的活性，其根據(jù)用于分析，測(cè)試或測(cè)定活性的藥物(或藥物亞基)的數(shù)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。一般而言，本發(fā)明的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)的分子量比它們包含的藥物更大。因此，在重量上有相等劑量的藥物組合物和藥物，在分子或摩爾基礎(chǔ)上，將包含不同藥物劑量。如，如果本發(fā)明的藥物組合物的分子量?jī)杀队谄浒乃幬铮瑒t活性可以使用2μg的藥物組合物和1μg的藥物根據(jù)“藥物基準(zhǔn)”來(lái)測(cè)定，因?yàn)檫@些量中包含了相同數(shù)量的藥物(就游離藥物或藥物組合物的一部分而言)?？梢愿鶕?jù)“藥物基準(zhǔn)”使用合適的計(jì)算對(duì)活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和表述，如以每目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)為基礎(chǔ)，或者就酶藥物而言，以每活性位點(diǎn)為基礎(chǔ)表示活性。
正如這里使用的“白介素1受體拮抗劑”(IL-1ra)指自然產(chǎn)生的或內(nèi)源性的哺乳動(dòng)物IL-1ra蛋白和與自然的蛋白有著相同的氨基酸序列的蛋白或內(nèi)源性的相應(yīng)哺乳動(dòng)物IL-1ra蛋白(如，重組蛋白，合成蛋白(如通過(guò)化學(xué)有機(jī)合成方法制備的))。因此，正如這里定義的，術(shù)語(yǔ)包括成熟蛋白質(zhì)，多態(tài)性或等位基因突變體，和IL-1ra的其它異構(gòu)體(如，通過(guò)選擇性拼接或其它細(xì)胞機(jī)制來(lái)制備)，和前面所述的修飾的或未修飾的形式(如，脂質(zhì)，糖基化，PEG化)。自然產(chǎn)生的或內(nèi)源性IL-1ra包括野生型蛋白質(zhì)如成熟IL-1ra，多態(tài)性或等位基因突變體和其它在哺乳動(dòng)物中自然出現(xiàn)的異構(gòu)體(如，人，非-人靈長(zhǎng)類(lèi))。這些蛋白質(zhì)可以從自然產(chǎn)生IL-1ra的供體中回收或分離。這些蛋白質(zhì)和IL-1ra蛋白質(zhì)與自然生產(chǎn)的或內(nèi)源性的對(duì)應(yīng)的IL-1ra具有相同的氨基酸序列，以相應(yīng)的哺乳動(dòng)物命名。如，對(duì)應(yīng)的哺乳動(dòng)物為人，則蛋白質(zhì)被稱(chēng)為人IL-1ra。
IL-1ra的“功能性變體”包括功能片段，功能性變體蛋白，和/或功能融合蛋白，其可以通過(guò)合適的方法制備(如，突變(如，化學(xué)突變，放射性突變)，DNA重組技術(shù))。一種“功能性變體”能拮抗白介素-11型受體。一般而言，與成熟IL-1ra(如N-末端，C-末端或內(nèi)部的刪除)相比，IL-1ra的片段或其部分包括一個(gè)氨基酸(如，一種或更多氨基酸)的刪除和/或增加(如一個(gè)或更多氨基酸的刪除或增加)。對(duì)于IL-1ra，片段或部分，其中僅鄰近的氨基酸被刪除或其中非-鄰近的氨基酸也被刪除。
人IL-1ra的功能性變體至少有大約80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％氨基酸序列與人IL-1ra的152個(gè)氨基酸的成熟形式相同并可拮抗人白介素-11型受體。(見(jiàn)，Eisenberg等人的文獻(xiàn)Nature 343341-346(1990))。突變體包括一種或更多額外氨基酸(如，包括153或154或更多氨基酸)。如，突變體IL-1ra，具有一種由氨基-末端的甲硫氨酸殘基組成的氨基酸序列，其位于序列號(hào)33的26-177的殘基后面。(KINERET(anakinra)，Amgen Inc.)。
正如這里使用的“皂素蛋白(saporin)”指由植物肥皂草產(chǎn)生的單-鏈核糖體-失活多肽的一個(gè)家族。(Stirpe，F(xiàn).，等人的文獻(xiàn)Biochem.J.216617-625(1983)，Bagga，S.等人的文獻(xiàn)J.Biol.Chem.2784813-4820(2003)。)皂素蛋白多肽存在多種形式，其在長(zhǎng)度和/或氨基酸序列上有所不同。(見(jiàn)，如，Id.andBarthelemy，I.等，J.Biol.Chem.2686541-6548(1993)。)皂素蛋白-6是最有活性的皂素蛋白形式。(Bagga，S.等，J.Biol.Chem.2784813-4820(2003)。)據(jù)報(bào)道，自然產(chǎn)生的皂素蛋白-6至少有四種異構(gòu)體，其中在成熟多肽(序列號(hào)65)48位置的氨基酸是Asp或Glu，并且在成熟多肽(序列號(hào)65)91位置的氨基酸是Arg或Lys。(Barehelemy，I.等人的文獻(xiàn)J.Biol.Chem.268654 1-6548(1993)。)皂素蛋白-6的另外的形式包括那些多肽，其在成熟多肽(序列號(hào)65)99位置的氨基酸是Ser或Leu；在成熟多肽(序列號(hào)65)134位置的氨基酸是Gln或Lys；在成熟多肽(序列號(hào)65)147位置的氨基酸是Ser或Leu；在成熟多肽(序列號(hào)65)149位置的氨基酸是Ser或Phe；在成熟多肽(序列號(hào)65)162位置的氨基酸是Asp或Asn；在成熟多肽(序列號(hào)65)177位置的氨基酸是Ala或Val；在成熟多肽(序列號(hào)65)188位置的氨基酸是Ile或Thr；在成熟多肽(序列號(hào)65)196位置的氨基酸是Asn或Asp；在成熟多肽(序列號(hào)65)198位置的氨基酸是Glu或Asp；在成熟多肽(序列號(hào)65)231位置的氨基酸是Asn或Ser；在成熟多肽(序列號(hào)65)233位置的氨基酸是Lys或Arg。(Id.)包含這些異構(gòu)體和突變體的參照序列出現(xiàn)在圖14G中(序列號(hào)67)。
因此，術(shù)語(yǔ)“皂素蛋白”包括前體蛋白，成熟多肽，自然蛋白，多態(tài)性或等位基因突變體，和其它異構(gòu)體(如，通過(guò)選擇性拼接或其它細(xì)胞機(jī)制產(chǎn)生的)，和前面所述的修飾或未修飾的形式(如，脂質(zhì)，糖基化，PEG化)，包括自然產(chǎn)生的，合成的或重組產(chǎn)生的多肽。自然產(chǎn)生的或內(nèi)源性皂素蛋白包括野生型蛋白質(zhì)如成熟皂素蛋白(如成熟皂素蛋白-6)，多態(tài)性或等位基因突變體和其它在肥皂草中自然生成的異構(gòu)體。這些蛋白能使用任何合適的方法從肥皂草中回收或分離。皂素蛋白的“功能性變體”包括功能片段，功能突變蛋白，和/或功能融合蛋白，其可以使用合適的方法(如，突變(如，化學(xué)突變，放射性突變)，DNA重組技術(shù))來(lái)制備。一般而言，相對(duì)于成熟IL-1ra(如N-末端，C-末端或內(nèi)部的刪除)，皂素蛋白的片段或部分(如，皂素蛋白-6)包括含有一個(gè)氨基酸(如，一種或更多氨基酸)的刪除和/或增加(如一個(gè)或更多氨基酸的刪除或增加)的蛋白。與成熟皂素蛋白相比，僅鄰近的氨基酸或其中非-鄰近的氨基酸被刪除的片段或配基也是預(yù)期的?？梢灾苽湓硭氐鞍椎母鞣N功能性變體。如，可制備包含氨基-末端延伸的皂素蛋白-6的融合蛋白并且在兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物分析中，仍然顯示了保留完整的核糖體-抑制活性。(Barthelemy，I.等人的文獻(xiàn)，J.Biol.Chem.2686541-6548(1993)。)在體外分析中，突變體或皂素蛋白-6由于一個(gè)活性位點(diǎn)殘基，Tyr72，Tyr120，Glu176，Arg179或Trp208(序列65的第72，120，176，179，或208)被丙胺酸取代，從而減少了細(xì)胞毒素活性。(Bagga，S.等人的文獻(xiàn)J.Biol.Chem.2784813-4820(2003)。)因此，如果制備另外的皂素蛋白的功能性變體，應(yīng)避免活性位點(diǎn)殘基上的突變，替換，取代，刪除或修飾。優(yōu)選地，與自然出現(xiàn)的成熟多肽相比，包含較少氨基酸的皂素蛋白功能性變體至少包括活性位點(diǎn)。如，與自然出現(xiàn)的成熟多肽相比，包含較少氨基酸的皂素蛋白功能性變體包括成熟皂素蛋白-6的活性位點(diǎn)殘基(Tyr72，Tyr120，Glu176，Arg179或Trp208(序列號(hào)65的第72，120，176，179，或208))，且至少有137個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，至少有150個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，至少有175個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，至少有200個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，至少有225個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，至少有250個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。
皂素蛋白功能性變體具有核糖體-失活活性(如，rRNA N-糖苷酶活性)和/或細(xì)胞毒素活性。這些活性可以用任何合適的方法容易地被評(píng)估，如，使用眾所周知的兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物試驗(yàn)或任何眾所周知的使用腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒素試驗(yàn)進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的抑制。(見(jiàn)，如，Bagga，S.等等J.Biol.Chem.2784813-4820(2003)和Barthelemy，I.等J.Biol.Chem.2686541-6548(1993))。
在某些實(shí)施方案中，皂素蛋白功能性變體至少有約80％，85％，90％，91％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％氨基酸序列與人IL-1ra和成熟皂素蛋白-6相同(序列號(hào)65)。
本發(fā)明涉及了包括一種藥物和一種多肽結(jié)合亞基的藥物組合物，該多肽結(jié)合亞基包含在體內(nèi)特異結(jié)合提高血清半衰期的多肽的結(jié)合位點(diǎn)(如，一個(gè)抗原-結(jié)合位點(diǎn))。正如這里對(duì)藥物組合物的詳細(xì)描述，其包括一種與血清白蛋白特異結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段，藥物和多肽結(jié)合亞基能相互共價(jià)或非共價(jià)地結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物是一種融合蛋白，其包括一種多肽藥物和多肽結(jié)合亞基，該亞基含有與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽特異結(jié)合的抗原-結(jié)合位點(diǎn)。在另一實(shí)施方案中，藥物組合物包括的一種藥物共價(jià)或非共價(jià)地結(jié)合多肽結(jié)合亞基，其包含了具有多肽結(jié)合特異性并提高體內(nèi)血清半衰期的抗原-結(jié)合位點(diǎn)。
典型地，在體內(nèi)提高血清半衰期的多肽是一種在體內(nèi)自然生成，并且可抵抗內(nèi)源性機(jī)制引發(fā)的降解或清除作用，該作用可清除生物體(如，人類(lèi))中非需要物質(zhì)。如，可以從來(lái)源于細(xì)胞外間質(zhì)的蛋白質(zhì)，在血液中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，在血腦屏障或神經(jīng)組織發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，位于腎，肝，肺，心臟，皮膚或骨骼中的蛋白質(zhì)，應(yīng)激蛋白，疾病-特異蛋白，或Fc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)中選取在體內(nèi)提高血清半衰期的多肽。
提高體內(nèi)血清半衰期的合適多肽包括，如，鐵傳遞蛋白受體特異的配基-神經(jīng)藥物制劑融合蛋白(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5977307號(hào)，其指導(dǎo)在此通過(guò)參考被整合)，腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞受體，轉(zhuǎn)鐵蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(如，可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)，胰島素，胰島素-類(lèi)似生長(zhǎng)因子1(IGF1)受體，胰島素-類(lèi)似生長(zhǎng)因子2(IGF2)受體，胰島素受體，血液凝結(jié)因子X(jué)，a-1抗胰蛋白和HNF1a。在體內(nèi)提高血清半衰期的合適的多肽也包括糖蛋白(酸性糖蛋白；AAG)，α-1抗胰糜蛋白酶抗體(ACT)，α-1微球蛋白(蛋白質(zhì)HC；AIM)，抗凝血酶III(ATIII)，載脂蛋白A-1(Apo A-1)，載脂蛋白B(Apo B)，銅藍(lán)蛋白(Cp)，補(bǔ)充成分C3(C3)，補(bǔ)充成分C4(C4)，酯酶抑制子(C1 INH)，C-活性蛋白(CRP)，鐵蛋白(FER)，血液結(jié)合素(HPX)，脂蛋白(α)(Lp(α))，甘露糖-結(jié)合蛋白(MBP)，肌球素(Myo)，前清蛋白(轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白；PAL)，視黃醇-結(jié)合蛋白(RBP)，和類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)。
來(lái)源于細(xì)胞外間質(zhì)的合適的蛋白包括，如，膠原質(zhì)，層粘連蛋白，整合素類(lèi)和纖維連接蛋白。膠原質(zhì)是細(xì)胞外間質(zhì)的主要蛋白質(zhì)。現(xiàn)在已知的膠原質(zhì)分子大約有15種，存在于身體的不同部位，如，在骨骼，皮膚，腱，韌帶，角膜，內(nèi)在器官中被發(fā)現(xiàn)的I型膠原質(zhì)(占身體膠原質(zhì)的90％)或在軟骨，椎間盤(pán)，脊索，和眼睛的玻璃狀液中被發(fā)現(xiàn)的II型膠原質(zhì)。
來(lái)源于血液中的合適的蛋白質(zhì)包括，如，血漿蛋白(如，纖維蛋白，α-2微球蛋白，血清白蛋白，纖維蛋白原(如，纖維蛋白原A，纖維蛋白原B)，血清淀粉蛋白A，觸珠蛋白，抑制蛋白，泛素，胚泡激肽和β-2微球蛋白)，酶和酶抑制子(如，血漿酶原，溶解酵素，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，a-1抗胰蛋白和胰腺的胰島素抑制子)，免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)，如，免疫球蛋白蛋白質(zhì)(如，IgA，IgD，IgE，IgG，IgM，免疫球蛋白輕鏈(kappa/lambda)，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如，視黃醇結(jié)合蛋白，a-1微球蛋白)，防御蛋白(如β-防御1，嗜中性粒細(xì)胞防御1，嗜中性粒細(xì)胞防御2和嗜中性粒細(xì)胞防御3)和類(lèi)似物。
來(lái)源于血腦屏障和神經(jīng)組織的合適的蛋白包括，如，黑皮素受體，髓磷脂，抗壞血酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和類(lèi)似物。
在體內(nèi)提高血清半衰期的合適的多肽也包括位于腎臟中的蛋白質(zhì)(如，多囊蛋白，IV型膠原質(zhì)，有機(jī)的陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白K1，Heymann’s抗原)，位于肝臟中的蛋白質(zhì)(如，酒精脫氫酶，G250)，位于肺臟中的蛋白質(zhì)(如，結(jié)合IgA的分泌成分)，位于心臟中的蛋白質(zhì)(如，HSP27，其與擴(kuò)張型心肌病相連)，位于皮膚中的蛋白質(zhì)(如，角蛋白)，骨骼特異蛋白如形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)，其是具有生骨活性的蛋白質(zhì)生長(zhǎng)因子β超家族的變體亞類(lèi)(如，BMP-2，BMP-4，BMP-5，BMP-6，BMP-7，BMP-8)，腫瘤特異蛋白(如，滋養(yǎng)層抗原，herceptin受體，雌激素受體，組織蛋白酶(如，在肝和脾中發(fā)現(xiàn)的組織蛋白酶B)。
合適的疾病-特異蛋白包括，如，僅在活性T-細(xì)胞中表達(dá)的抗原，包括LAG-3(淋巴細(xì)胞活化基因)，骨保護(hù)素配基(OPGL；見(jiàn)Nature 402，304-309(1999))，OX40(TNF受體家族的成員，其在活性T細(xì)胞中表達(dá)并在產(chǎn)生人T細(xì)胞白血病毒I型(HTLV-1)的細(xì)胞中特異上調(diào)；見(jiàn)，Immunol.165(1)263-70(2000))。合適的疾病-特異蛋白也包括，如，金屬蛋白酶(與關(guān)節(jié)炎/癌相關(guān))包括果蠅CG6512，人paraplegin，人FtsH，人AFG3L2，鼠科ftsH；和拮抗生長(zhǎng)因子，包括酸性纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-1)，基礎(chǔ)纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-2)，血管上皮生長(zhǎng)因子/血管滲透因子(VEGF/VPF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(TGFα)，腫瘤壞死因子-α(TNFα)，血管生成素，白介素-3(IL-3)，白介素-8(IL-8)，血小板-起源上皮生長(zhǎng)因子(PD-ECGF)，胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(P1GF)，中期血小板-起源生長(zhǎng)因子-BB(PDGF)，和fractalkine。
在體內(nèi)提高血清半衰期的合適的多肽包括應(yīng)激蛋白如熱休克蛋白(HSPs)。HSPs通常在細(xì)胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)。當(dāng)它們?cè)诩?xì)胞外被發(fā)現(xiàn)時(shí)，則表示細(xì)胞已經(jīng)凋亡或其內(nèi)部物質(zhì)已經(jīng)溢出。當(dāng)發(fā)生外傷，疾病或傷害后，出現(xiàn)非程序性的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞外HSPs引發(fā)免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。結(jié)合細(xì)胞外HSP能使本發(fā)明的組合物定位于疾病位點(diǎn)。
在Fc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中包括的合適的蛋白包括，如Brambell受體(也稱(chēng)FcRB)。這種Fc受體有兩種功能，兩種都被用于運(yùn)輸。作用(1)穿過(guò)胎盤(pán)從母體轉(zhuǎn)運(yùn)IgG給小孩(2)保護(hù)IgG免受降解從而延長(zhǎng)其血清的半衰期。一般認(rèn)為受體在內(nèi)涵體中進(jìn)行IgG的再生。(見(jiàn)，Holliger等人的文獻(xiàn)Nat Biotechnol 15(7)632-6(1997)。)本發(fā)明的藥物組合物包括任何多肽結(jié)合亞基，該亞基含有與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽特異結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)(如抗原-結(jié)合位點(diǎn))。優(yōu)選地，多肽結(jié)合亞基作為一個(gè)獨(dú)立的分子實(shí)體包括至少31，至少大約40，至少大約50，至少大約60，至少大約70，至少大約80氨基酸，至少大約90氨基酸，至少大約100氨基酸或至少大約110氨基酸。優(yōu)選地，多肽結(jié)合亞基與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽相結(jié)合，其KD值大約至少為5mMKD(KD＝Koff(kd)/Kon(ka))。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)細(xì)胞質(zhì)共振測(cè)定多肽結(jié)合亞基與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽相結(jié)合的KD值大約為10至100nM，或大約是100nM至大約500Nm，或大約500nM至5Mm(如，使用BIACORE儀器)。在特殊的實(shí)施方案中，多肽結(jié)合亞基與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽相結(jié)合的KD值大約為50nM或大約70Nm，或大約100nM，或大約150nM或200nM。
優(yōu)選地，包含特異結(jié)合提高體內(nèi)血清半衰期的多肽的結(jié)合位點(diǎn)(如，抗原-結(jié)合位點(diǎn))的多肽結(jié)合亞基不是原核或細(xì)菌多肽或肽。優(yōu)選地，多肽結(jié)合亞基是真核的，哺乳動(dòng)物的或人的多肽或肽。
在一定的實(shí)施方案中，包含特異結(jié)合提高體內(nèi)血清半衰期的多肽的結(jié)合位點(diǎn)(如，抗原-結(jié)合位點(diǎn))的多肽結(jié)合亞基是一種折疊蛋白區(qū)域。在另一實(shí)施方案中，作為一個(gè)單獨(dú)的分子實(shí)體，多肽結(jié)合亞基的分子量至少有大約4Kda，至少有大約4.5Kda，至少有大約5Kda，至少有大約5.5Kda，至少有大約6Kda，至少有大約6.5Kda，至少有大約7Kda，至少有大約7.5Kda或至少有大約8Kda。
包含特異結(jié)合提高體內(nèi)血清半衰期的多肽的結(jié)合位點(diǎn)(如，抗原-結(jié)合位點(diǎn))的合適的多肽結(jié)合亞基能通過(guò)任何合適的方法被鑒定，如，在合適的粘合分析中，篩選自然產(chǎn)生的或非-自然產(chǎn)生的多肽。正如這里所描述，優(yōu)選的包含特異結(jié)合提高體內(nèi)血清半衰期的多肽的抗原-結(jié)合位點(diǎn)的合適的多肽結(jié)合亞基是特異與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原結(jié)合片段。但是，與提高體內(nèi)血清半衰期的其它多肽特異結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段也能被用于本發(fā)明。
如果期望的話(huà)，一種或更多種與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽結(jié)合的抗體或其抗原-結(jié)合片段的互補(bǔ)決定區(qū)域(CDRs)，可以轉(zhuǎn)變?yōu)榉?免疫球蛋白結(jié)構(gòu)形式，而保留抗體或抗原-結(jié)合片段的抗原-結(jié)合特異性。本發(fā)明的藥物組合物包括這種非-免疫球蛋白結(jié)合亞基。這種非-免疫球蛋白結(jié)合亞基能通過(guò)任何合適的方式制備，例如自然細(xì)菌受體如SpA已經(jīng)被用作CDRs的移植結(jié)構(gòu)，制備特異結(jié)合表位的多肽結(jié)合配基。這種操作的詳細(xì)描述見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第5831012號(hào)，其主旨通過(guò)引證在此并入本文。其它合適的結(jié)構(gòu)包括纖維連接蛋白和親和體(affibodies)。合適操作的詳細(xì)描述見(jiàn)WO98/58965。其它合適的結(jié)構(gòu)包括lipocallin和CTLA4，見(jiàn)van den Beuken等，J.Mol.Biol.310591-601(2001)，和如在WO00/69907中描述的(Medical Research Council)，其基于細(xì)菌GroEL或其它伴侶多肽的環(huán)狀結(jié)構(gòu)范例。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包括特異與血清白蛋白結(jié)合的非-免疫球蛋白結(jié)合亞基，其中的非-免疫球蛋白結(jié)合亞基包括一種，兩種或三種這里描述的CDRs的VH，VK，VHH和合適的結(jié)構(gòu)。在特定的實(shí)施方案中，非-免疫球蛋白結(jié)合亞基包括CDR3，但不包括CDR1或CDR2的VH，VK，VHH和合適的結(jié)構(gòu)。在其它實(shí)施方案中，非-免疫球蛋白結(jié)合亞基包括CDR1和CDR2，但不包括CDR3的VH，VK，VHH和合適的結(jié)構(gòu)。在其它實(shí)施方案中，非-免疫球蛋白結(jié)合亞基包括CDR1和CDR2和CDR3的VH，VK，VHH和合適的結(jié)構(gòu)。在其它實(shí)施方案中，藥物組合物僅包括CDR3的VH，VK，VHH和一種藥物。
本發(fā)明的藥物組合物能使用合適的方法制備，如這里提到的制備藥物融合物，藥物結(jié)合物和非共價(jià)的藥物結(jié)合物的方法。此外，本發(fā)明的藥物組合物具有這里詳細(xì)描述的關(guān)于藥物融合物，藥物結(jié)合物和非共價(jià)的藥物結(jié)合物的優(yōu)勢(shì)和作用。
本發(fā)明提供的藥物組合物(藥物融合物，藥物結(jié)合物和非共價(jià)的藥物結(jié)合物)對(duì)比于單獨(dú)的藥物(非共扼藥物，非藥物融合物)具有優(yōu)化的制藥學(xué)上的特性(如，增加血清半衰期)和其它的優(yōu)勢(shì)。藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物包括特異與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原結(jié)合片段和一種或更多種所希望的藥物。
正如這里提及的，本發(fā)明的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)對(duì)比于單獨(dú)藥物極大延長(zhǎng)了體內(nèi)血清半衰期和/或提高AUC。此外，在藥物組合物(藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)中藥物的活性一般沒(méi)有較大改變。但是，對(duì)比于單獨(dú)的藥物，藥物組合物的活性的一些改變是可以接受的并且一般是藥物組合物(藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)制藥學(xué)特性提高的彌補(bǔ)。如，藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)對(duì)藥物靶標(biāo)的結(jié)合較單獨(dú)藥物的親和力低，但是由于藥物組合物改良的制藥學(xué)特性(如，延長(zhǎng)的體內(nèi)血清的半衰期，提高了AUC)，與單獨(dú)藥物相比，具有相等的或更高的功效。此外，較低劑量的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)能被施用從而取得希望得到的治療或診斷功效。優(yōu)選地，由于不多于100，或不多于50，不多于10，不多于5，不多于4，不多于3，不多于2種因素，藥物組合物(藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)的活性不同于單獨(dú)藥物的活性。例如，一種藥物可以具有一個(gè)1nM的KD，Ki或中和劑量50(ND50)，而一種藥物組合物具有大約2nM，大約3nM，或大約4nM，或大約5nM，或大約10nM的KD，Ki或ND50。
優(yōu)選地，藥物組合物的活性(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)對(duì)比于藥物的活性并不顯著減少。在一定的實(shí)施方案中，藥物組合物的活性相對(duì)于藥物的活性降低程度不多于10％，不多于9％，不多于8％，不多于7％，不多于6％，不多于5％，不多于4％，不多于3％，不多于2％，不多于1％或基本不變?；蛘哒f(shuō)，藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)至少保留了大約90％，大約91％，大約92％，大約93％，大約94％，大約95％，大約96％，大約97％，大約98％，大約99％的藥物活性，或基本與藥物活性相同。優(yōu)選地，藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)和藥物活性的測(cè)定和/或?qū)Ρ葘⒃凇八幬镏饕煞帧鄙线M(jìn)行。
正如這里所描述的，本發(fā)明的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)比單獨(dú)的藥物有更大的活性(如，在體內(nèi)的活性)。如，在例6所示，當(dāng)這些藥物以相同重量的劑量(10mg/Kg或1mg/Kg)被施用時(shí)，在小鼠模型中，DOM7m-16/IL-1ra比IL-1ra在治療關(guān)節(jié)炎方面更有效。即使DOM7m-16/IL-1ra的分子量大約是IL-1ra分子量的兩倍，DOM7m-16/IL-1ra也更有效。因此，與接受IL-1ra的鼠相比，接受DOM7m-16/IL-1ra的鼠僅接受了一半的IL-1ra(作為在DOM7m-16/IL-1ra中的一個(gè)亞基)。
在特定的實(shí)施方案中，藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)比藥物有更大的活性(如，在體內(nèi)的活性)。如，藥物組合物具有至少大約100％，至少大約150％，至少大約200％，至少大約250％，至少大約300％，至少大約350％，至少大約400％，至少大約450％，至少大約500％的藥物的活性。優(yōu)選地，在“藥物主要成分”上進(jìn)行藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)和藥物活性的測(cè)定和/或?qū)Ρ取Ｋ幬锝M合物(如藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)和藥物的活性可以使用合適的體內(nèi)或體外系統(tǒng)測(cè)定。在特定的實(shí)施方案中，在體內(nèi)測(cè)得藥物組合物(如藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)比其包含的藥物具有更大的活性。在另一實(shí)施方案中，在體外測(cè)得藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)比其包含的藥物具有更大的活性。
包括特異與血清白蛋白結(jié)合的抗體區(qū)域(dAb)的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)提供了更大的優(yōu)勢(shì)。相對(duì)于抗體和其它抗體的抗原結(jié)合片段，抗體區(qū)域是非常穩(wěn)定的，也是很小的，其通過(guò)E.coli或酵母(如，Pichiapastoris)的表達(dá)以較高的產(chǎn)量被生產(chǎn)，并且，如這里所述，結(jié)合血清白蛋白的抗體的抗原結(jié)合片段可以很容易的從人源庫(kù)或其它希望的種族中篩選出來(lái)。因此，包括與血清白蛋白結(jié)合的dAb的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)比在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中制備的藥物(如，人，人源化的或嵌合的抗體)更容易制備，并且能使用非免疫原的dAbs(如，人dAb能制備藥物融合物或藥物結(jié)合物用于治療和診斷人類(lèi)中的疾病)。
當(dāng)藥物是含有與血清白蛋白結(jié)合的多肽結(jié)合亞基(如，與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段)的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)的一部分時(shí)，藥物的免疫原性可以被降低。因此，含有與血清白蛋白結(jié)合(如，與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段)的多肽結(jié)合亞基的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)相比，單獨(dú)藥物有較少的免疫原性或是非-免疫原性的。因此，這些藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)能重復(fù)對(duì)病人施用，并將由于病人免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗-藥物抗體導(dǎo)致的失效作用最小化。
因此，這里描述的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物)與單獨(dú)藥物相比，具有更高的安全性和較少的負(fù)面作用。如，作為特異與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段的血清白蛋白-結(jié)合活性結(jié)果，藥物融合物和結(jié)合物(藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物)在血管循環(huán)中具有提高的滯留時(shí)間。另外，在施用于身體組織后(如，血管內(nèi)注射)，共扼物和藥物融合物不能穿越血腦屏障，也不能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中積累。因此，包含有神經(jīng)學(xué)毒性的或不期望的作用于神經(jīng)的效應(yīng)的藥物的共扼物(藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物)和藥物融合物，與單獨(dú)施用藥物相比，具有更大的安全性和更小的副作用。相似地，共扼物(藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物)和藥物融合物比單獨(dú)施用藥物對(duì)特殊器官(如，腎或肝)有更小的毒性。這里描述的共扼物和藥物融合物能在血管循環(huán)中對(duì)一種結(jié)合藥物的物質(zhì)或靶標(biāo)(如，毒素)產(chǎn)生屏蔽，從而降低了藥物或靶標(biāo)對(duì)組織效用(如，抑制了毒素的效用)。
體內(nèi)半衰期的藥物動(dòng)力學(xué)分析和測(cè)定的合適的方法在本領(lǐng)域已被熟知。這些方法的描述，見(jiàn)，如，Kenneth，A等人的文獻(xiàn)Chemical Stability of PharmacerticalsA Handbook forPharmacists，和Peters等人的文獻(xiàn)Pharmacokinetc analysisAPractical Approach(1996)。也可以參考“Pharmacokinetics”，MGibaldi&D Perron，由Marcel Dekker出版，2ndRev.edition(1982)，其描述了藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)如t和t beta的半衰期(t1/2alpha，t1/2beta)和曲線(xiàn)下的面積(AUC)。
半衰期(t1/2alpha，t1/2beta)和AUC可以由結(jié)合物或融合物的血清濃度的時(shí)間曲線(xiàn)來(lái)測(cè)定。如，使用WinNonlin分析包(從Pharsight Corp.，Mountain View，CA94040，USA購(gòu)得)模擬曲線(xiàn)。在第一階段(alpha階段)，藥物組合物(如藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)主要是在病人中實(shí)行分配，伴有一些消失。第二階段(beta階段)是終止階段，這時(shí)的藥物組合物(如藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)已經(jīng)被分配并且由于藥物組合物從病人中清除而使血清濃度減少。talpha半衰期是第一階段的半衰期而t beta半衰期是第二階段的半衰期。因此，目前發(fā)明提供了一種藥物組合物((如藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)或包括本發(fā)明藥物組合物(如藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)的組合物，依照本發(fā)明該組合物的t alpha半衰期在15分鐘的范圍內(nèi)或更長(zhǎng)。在某一實(shí)施方案中，范圍的下段是30分鐘，45分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)，4小時(shí)，5小時(shí)，6小時(shí)，7小時(shí)，8時(shí)，9小時(shí)，10小時(shí)，11小時(shí)或12小時(shí)。此外，或可選擇地，藥物組合物(如藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)或依據(jù)本發(fā)明的組合物的t alpha半衰期大于等于12小時(shí)。在某一實(shí)施方案中，范圍的上段是11，10，9，8，7，6或5小時(shí)。合適范圍的例子是1-6小時(shí)，2-5小時(shí)或3-4小時(shí)。
有利地，目前發(fā)明提供的藥物組合物(如藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)的tβ半衰期在2.5小時(shí)的范圍內(nèi)或更長(zhǎng)。在某一實(shí)施方案中，范圍的下段是3小時(shí)，4小時(shí)，5小時(shí)，6小時(shí)，7小時(shí)，8小時(shí)，9小時(shí)，10小時(shí)，11小時(shí)或12小時(shí)。在某一實(shí)施方案中，藥物組合物(的tβ半衰期大于等于21天。在某一實(shí)施方案中，范圍的上段是12小時(shí)，24小時(shí)，2天，3天，5天，10天，15天或20天。在特殊的實(shí)施方案中，依據(jù)發(fā)明的藥物組合物(如藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)的tβ半衰期是12-60小時(shí)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，其范圍是12-48小時(shí)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，其范圍是12-26小時(shí)。
此外，或作為上述標(biāo)準(zhǔn)的選擇，目前發(fā)明提供的藥物組合物(如藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)的AUC值(曲線(xiàn)下的面積)在0.01mg.min/ml的范圍內(nèi)或更多，或1mg.min/ml的范圍內(nèi)或更多。在某一實(shí)施方案中，范圍的的下段是0.01，0.1，1，5，10，15，20，30，100，200或300mg.min/ml。在特殊的實(shí)施方案中，藥物組合物(如藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)的AUC值大于600mg.min/ml。在某一實(shí)施方案中，范圍的上段是500，400，300，200，150，100，75或50mg.min/ml。在其它實(shí)施方案中，藥物組合物(如藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)的AUC值可以從下列組中選擇15-150mg.min/ml，15-100mg.min/ml，15-75mg.min/ml，15-50mg.min/ml，0.01-50mg.min/ml，0.1-50mg.min/ml，1-50mg.min/ml，5-50mg.min/ml，和10-50mg.min/ml。
本發(fā)明涉及的藥物組合物(如藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)包括一種藥物和多肽結(jié)合亞基，其含有與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽特異結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)(如，一種抗原-結(jié)合位點(diǎn))。在藥物組合物優(yōu)選的實(shí)施方案中，含有與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽特異結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)(如，一種抗原-結(jié)合位點(diǎn))的多肽結(jié)合亞基，對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性。
在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包括一種藥物，其含有與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽特異結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)(如，一種抗原-結(jié)合位點(diǎn))，能與多肽結(jié)合亞基共價(jià)結(jié)合。在這些實(shí)施方案中，藥物在任何合適的位置共價(jià)地結(jié)合多肽結(jié)合區(qū)域，如氨基-末端，羧基-末端或通過(guò)合適的氨基酸側(cè)鏈(如，賴(lài)氨酸的ε氨基組)。
在其它實(shí)施方案中，藥物組合物包括一種藥物，其含有與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽特異結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)(如，一種抗原-結(jié)合位點(diǎn))，能與多肽結(jié)合亞基非共價(jià)結(jié)合。在這些實(shí)施方案中，藥物直接(如，通過(guò)靜電相互作用，疏水相互作用)或間接地(如，通過(guò)非共價(jià)結(jié)合補(bǔ)充結(jié)合部分(如，生物素和抗生物素蛋白)非共價(jià)結(jié)合抗原-結(jié)合片段，其中某一部分共價(jià)結(jié)合藥物并且互補(bǔ)結(jié)合部分共價(jià)結(jié)合抗原-結(jié)合片段)。當(dāng)使用補(bǔ)充結(jié)合部分時(shí)，其中之一的結(jié)合部分能直接或通過(guò)合適的連接物亞基共價(jià)地結(jié)合藥物，并且補(bǔ)充結(jié)合部分能直接或通過(guò)合適的連接物亞基共價(jià)地結(jié)合多肽結(jié)合區(qū)域。
在其它實(shí)施方案中，藥物組合物是一種融合蛋白，其包括一種多肽藥物和含有與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽特異結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)(如，一種抗原-結(jié)合位點(diǎn))的多肽結(jié)合亞基。這些融合蛋白包括一種連續(xù)的多肽鏈，所述的多肽鏈以含有與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽特異結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)(如，一種抗原-結(jié)合位點(diǎn))的多肽結(jié)合亞基作為第一個(gè)亞基，和一種多肽藥物作為第二個(gè)亞基，其以多肽鏈的不連續(xù)部分(亞基)出現(xiàn)。第一亞基和第二亞基能直接或通過(guò)一種多肽結(jié)合物，或通過(guò)合適的氨基酸，或肽或多肽連接物連接相互綁定。另外的亞基(如，第三，第四)和/或連接序列能以適當(dāng)?shù)男问匠霈F(xiàn)。第一個(gè)亞基可以位于N-末端，C-末端或相對(duì)于第二個(gè)亞基的內(nèi)部(如，多肽藥物)。在特定的實(shí)施方案中，融合蛋白包括一種或更多種多肽藥物亞基和一種或更多種含有與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽特異結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)(如，一種抗原-結(jié)合位點(diǎn))的多肽結(jié)合亞基。在這些實(shí)施方案中，融合蛋白可以包括1-10種(如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10)相同或不同的多肽結(jié)合亞基，和1-20種(如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20)相同或不同的含有與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽特異結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基。
含有與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽特異結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基和多肽藥物亞基能出現(xiàn)在任何期望的位置。如，從氨基末端至羧基末端，亞基以下列順序出現(xiàn)一種或更多種多肽結(jié)合亞基，一種或更多種多肽藥物亞基，一種或更多種多肽結(jié)合亞基。在另一例子中，從氨基末端至羧基末端，亞基以下列順序出現(xiàn)一種或更多種多肽結(jié)合亞基，一種或更多種多肽藥物亞基，一種或更多種多肽結(jié)合亞基，一種或更多種多肽藥物亞基，一種或更多種多肽結(jié)合亞基。正如這里描述的，多肽結(jié)合亞基和多肽藥物可以直接或通過(guò)一種多肽結(jié)合物，或通過(guò)合適的氨基酸，或肽或多肽連接物連接相互綁定。
在特定的實(shí)施方案中，融合蛋白是一種連續(xù)的多肽鏈，其具有下列分子式(從氨基-末端至羧基-末端)a-(P)n2-b-(X)n1-c-(Q)n3-d或a-(Q)n3-b-(X)n1-c-(P)n2-d其中X是一種多肽藥物；P和Q每個(gè)分別是一種含有與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽特異結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基；a，b，c和d分別是包括1至大約100個(gè)殘基的多肽或缺失；n1，n2，n3分別表示X，P或Q亞基存在的數(shù)量；n1是1至大約10；n2是0至大約10；和n3是0至大約10，附加條件n2和n3不能同時(shí)為零；并且當(dāng)n1和n2都為1時(shí)，n3為零，X不包括抗體鏈或抗體鏈的片段。
在一些實(shí)施方案中，n2為1，2，3，4，5，或6，且n3為零。在另一實(shí)施方案中，n3為1，2，3，4，5，或6，且n2為零。在其它實(shí)施方案中，n1，n2和n3都為1。
在特定的實(shí)施方案中，X不包括一種抗體鏈或抗體鏈的片段。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，P和Q每個(gè)分別是能特異與血清白蛋白結(jié)合的多肽結(jié)合亞基。
在特殊的優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)包含一個(gè)多肽結(jié)合亞基，其含有與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽特異結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)(如，抗原結(jié)合位點(diǎn))，其中的多肽結(jié)合區(qū)域是特異與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段。
本發(fā)明也涉及了在體內(nèi)增加藥物的血清半衰期的方法，包括將一種藥物與含有在體內(nèi)特異結(jié)合提高血清半衰期的多肽的結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基相結(jié)合，由此制備了相比與藥物，具有更長(zhǎng)的體內(nèi)血清半衰期的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)。
在某些實(shí)施方案中，在體內(nèi)增加藥物的血清半衰期而不減少藥物的活性的方法，包括將一種藥物與含有特異結(jié)合提高體內(nèi)血清半衰期的多肽的結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基相結(jié)合，由此制備了相比與藥物，具有更長(zhǎng)的體內(nèi)血清半衰期，并至少具有所述藥物活性的大約90％的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)。
在另一實(shí)施方案中，在體內(nèi)增加藥物的血清半衰期并減少藥物的免疫原性的方法，包括將一種藥物與在體內(nèi)特異結(jié)合提高血清半衰期的多肽的結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基結(jié)合，由此制備了在體內(nèi)，比藥物具有更長(zhǎng)的血清半衰期且更少免疫原性的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)。
在另一實(shí)施方案中，減少藥物免疫原性并不減少藥物的活性的方法，包括將一種藥物與在體內(nèi)特異結(jié)合提高血清半衰期的多肽的結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基結(jié)合，由此制備了，比藥物具有更少免疫原性的，至少是所述藥物活性的大約90％的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)。
在另一實(shí)施方案中，在體內(nèi)增加藥物的血清半衰期的并不減少藥物的免疫原性和活性的方法，包括將一種藥物與在體內(nèi)特異結(jié)合提高血清半衰期的多肽的結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基結(jié)合，由此制備了在體內(nèi)，比藥物具有更長(zhǎng)的血清半衰期的，更少免疫原性且至少是所述藥物活性的大約90％的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)。
正如這里描述的，藥物和在體內(nèi)特異結(jié)合提高血清半衰期的多肽的結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基可以通過(guò)共價(jià)的結(jié)合物(如，多肽結(jié)合物)或非共價(jià)的結(jié)合物，使用或不使用連接物而結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，藥物和在體內(nèi)特異結(jié)合提高血清半衰期的多肽的結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基通過(guò)共價(jià)的結(jié)合物結(jié)合。如，制備的藥物組合物是藥物結(jié)合物或藥物融合物。在另外的實(shí)施方案中，藥物和在體內(nèi)特異結(jié)合提高血清半衰期的多肽的結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基通過(guò)非共價(jià)的結(jié)合物結(jié)合，且藥物組合物是一種非共價(jià)的藥物結(jié)合物。
使用這種方法制備的藥物組合物比藥物有更大的活性(如，在體內(nèi)的活性)。在一些實(shí)施方案中，制備比藥物有更大的活性(如，在體內(nèi)的活性)的藥物組合物的方法，包括將一種藥物與在體內(nèi)特異結(jié)合提高血清半衰期的多肽的結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基結(jié)合，由此制備了比藥物具有更長(zhǎng)活性的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)。在這些實(shí)施方案中，優(yōu)選地，藥物組合物的活性比這里所描述的藥物的活性更大。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽結(jié)合亞基具有與血清白蛋白結(jié)合的特異性。在特殊的優(yōu)選實(shí)施方案中，多肽結(jié)合亞基是特異與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段。
在特定的實(shí)施方案中，方法包括從一種或更多多肽(如特異與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段)中選擇所述的多肽結(jié)合亞基，其中所選的多肽結(jié)合亞基與提高體內(nèi)血清白蛋白半衰期的多肽結(jié)合，其KD值至少有大約5mM。
本發(fā)明也涉及使用多肽結(jié)合亞基來(lái)制備藥物，所述多肽結(jié)合亞基具有與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽特異結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)，此藥物包括一種藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)，其中的藥物結(jié)合所述的多肽結(jié)合亞基，提高藥物在體內(nèi)的血清半衰期，而藥物活性的較少不超過(guò)10％。
在某些實(shí)施方案中，此應(yīng)用是為了制備藥物，藥物包括藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)，其中的藥物結(jié)合所述的多肽結(jié)合亞基，提高藥物在體內(nèi)的血清半衰期和減少藥物的免疫原性。
在其它實(shí)施方案中，此應(yīng)用是為了制備藥物，藥物包括藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)，其中的藥物結(jié)合所述的多肽結(jié)合亞基，減少藥物的免疫原性，而藥物活性的較少不超過(guò)10％。
在其它實(shí)施方案中，此應(yīng)用是為了制備藥物，藥物包括藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)，其中的藥物結(jié)合所述的多肽結(jié)合亞基，增加在體內(nèi)藥物的血清半衰期，減少藥物的免疫原性，而藥物活性的減少不超過(guò)10％。
正如這里所述，藥物組合物包括一種藥物和結(jié)合亞基，所述亞基具有與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽特異結(jié)合的多肽的結(jié)合位點(diǎn)，其通過(guò)共價(jià)結(jié)合物(如，多肽結(jié)合物)或非共價(jià)結(jié)合物，使用或不使用連接物被結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，藥物與多肽結(jié)合亞基通過(guò)共價(jià)結(jié)合物結(jié)合，所述多肽結(jié)合亞基具有與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽特異結(jié)合的多肽的結(jié)合位點(diǎn)。例如，藥物組合物可以是一種藥物結(jié)合物或藥物融合物。在其它實(shí)施方案中，藥物組合物包含一種藥物和結(jié)合亞基，其具有與提高體內(nèi)血清半衰期的多肽特異結(jié)合的多肽的結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)非共價(jià)結(jié)合物被結(jié)合，而藥物組合物是一種非共價(jià)藥物結(jié)合物。
在特定的實(shí)施方案中，此應(yīng)用是為了制備藥物，藥物包括藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)，其中的藥物結(jié)合所述的多肽結(jié)合亞基，增加所述藥物的活性(在體內(nèi)的活性)。在這些實(shí)施方案中，優(yōu)選地，藥物組合物的活性比這里描述的藥物的活性更大。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽結(jié)合亞基具有與血清白蛋白結(jié)合的特異性。在特殊的優(yōu)選實(shí)施方案中，多肽結(jié)合亞基是具有特異與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段。
與血清白蛋白結(jié)合抗體的抗原-結(jié)合片段本發(fā)明的藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物包括(如一種或更多)與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段。抗原-結(jié)合片段能夠特異結(jié)合施用藥物結(jié)合物或藥物融合物的動(dòng)物中的血清白蛋白。優(yōu)選地，抗原-結(jié)合片段具有結(jié)合人血清白蛋白的特異性。但是，獸醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用將是預(yù)期的，并且抗原-結(jié)合片段能特異結(jié)合來(lái)源于希望動(dòng)物的血清白蛋白，如來(lái)源于狗，貓，馬，母牛，小雞，綿羊，豬，山羊，貂及類(lèi)似物。在某些實(shí)施方案中，抗原-結(jié)合片段特異結(jié)合來(lái)源于多于一種物種的血清白蛋白。如，正如這里描述的，特異結(jié)合大鼠血清白蛋白和小鼠血清白蛋白的人dAbs，和一種特異結(jié)合大鼠、小鼠和人血清白蛋白的dAbs已被制備。(表1和圖7)這種dAbs具有使用相同藥物結(jié)合物或藥物融合物作臨床前和臨床研究的優(yōu)勢(shì)，從而避免使用其它合適藥物融合物或藥物結(jié)合物替代物作臨床前研究的需要。
在發(fā)明中適合使用的抗原-結(jié)合片段包括，如，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)ab’片段，F(xiàn)(ab’)2片段，F(xiàn)v片段(包括Fv(scFv)單鏈和二硫化物結(jié)合的Fv，一種單一可變區(qū)域，和dAbs(VH，VL)。這些抗原-結(jié)合片段可以使用合適的方法被制備，如使用胃蛋白酶，木瓜蛋白酶或其它具有切割特異性的蛋白酶將抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)水解，或使用重組技術(shù)。如，通過(guò)使用合適的蛋白酶消化或使用DNA重組技術(shù)抗體制備Fv片段。如，編碼輕鏈可變區(qū)域和重鏈可變區(qū)域的核酸可以被制備，其通過(guò)合適的多肽連接物連接，如2至大約20個(gè)甘氨?；鶜埢湣Ｊ褂煤线m的技術(shù)(如，轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)化，感染)，核酸可以被介導(dǎo)進(jìn)入合適的宿主(如，E.coil)并且宿主可以在適合表達(dá)單鏈Fv片段的條件下培養(yǎng)。通過(guò)在自然終止子上游引入一個(gè)或更多終止密碼子，可以用抗體基因制備多種抗體的抗原-結(jié)合片段。如，通過(guò)在編碼重鏈hinge區(qū)域的序列的3’末端引入一種翻譯終止子可以設(shè)計(jì)編碼免疫球蛋白重鏈F(ab’)2部分的表達(dá)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物和藥物融合物包括與血清白蛋白結(jié)合的抗體單獨(dú)重鏈和輕鏈或單獨(dú)鏈的一部分(如，單一的VH，Vk或Vλ)。
結(jié)合需要的血清白蛋白(如，人血清白蛋白)的抗體和其中的抗原-結(jié)合片段能從合適的天然的或人源化的抗體來(lái)源中選擇，或在合適宿主中通過(guò)合適的免疫原的刺激而引發(fā)。如，通過(guò)使用血清白蛋白(如，分離的或純化的人血清白蛋白)或血清白蛋白的肽(如，包含至少大約8，9，10，11，12，15，20，25，30，33，35，37，或40個(gè)氨基酸殘基的肽)免疫合適的宿主(如，小鼠，人抗體-轉(zhuǎn)基因小鼠，大鼠，兔子，小雞，山羊，非-人的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(如，猴))制備抗體。與血清白蛋白結(jié)合的抗體和抗原-結(jié)合片段也可以從重組抗體或抗原-結(jié)合片段庫(kù)中選擇，如噬菌體顯示文庫(kù)。這些文庫(kù)包括抗體或抗體的抗原-結(jié)合片段，其包括天然的或人源化的氨基酸序列。如，文庫(kù)包括包含人源化CDRs(如，任意氨基酸序列)和人結(jié)構(gòu)區(qū)域的Fab片段。(見(jiàn)，如，美國(guó)專(zhuān)利第6300064號(hào)(Knappik等人)。)在其它例子中，文庫(kù)包括在CDRs中有一種或多種序列差異的scFv片段或dAbs(單一的VH，單一的Vk或單一的Vλ)。(見(jiàn)，如，WO99/20479(Tomlinson和Winter)，WO03/002609A2(Winter等人)，WO2004/003019A2(Winter等人)。)合適的與血清白蛋白結(jié)合的抗體和其中的抗原-結(jié)合片段包括，如，人抗體和其中的抗原-結(jié)合片段，人源化抗體和其中的抗原-結(jié)合片段，嵌合抗體和其中的抗原-結(jié)合片段，嚙齒動(dòng)物(如，小鼠，大鼠)的抗體和其中的抗原結(jié)合片段，和單珠抗體(camelid)和其中的抗原-結(jié)合片段。在特定的實(shí)施方案中，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物和藥物融合物包括一種與血清白蛋白結(jié)合的camelidVHH。Camelid VHHs是免疫球蛋白單一的可變區(qū)域多肽，其來(lái)源于天然缺乏輕鏈的重鏈抗體。這些抗體出現(xiàn)在camelid種類(lèi)中包括，駱駝，羊駝，單峰駱駝，和產(chǎn)于南美Andes山脈的駱馬之類(lèi)。VHH分子比IgG分子小大約10倍，并且作為單一多肽，是非常穩(wěn)定的且能抵制極端的PH和溫度條件。合適的與血清白蛋白結(jié)合的Camelid VHH包括于WO2004/041862(AblynxN.V.)和這里(圖15和序列77-78)描述之中。在特定的實(shí)施方案中，結(jié)合人血清白蛋白的Camelid VHH包括的氨基酸序列至少有80％，至少有85％，至少有90％，至少有95％，至少有96％，至少有97％，至少有98％，至少有99％的氨基酸序列與序列73，序列74，序列75，序列76，序列77，序列78，序列79，序列80，序列81，序列82，序列83，序列84，序列85，序列86，序列87，序列88相一致。使用合適的序列隊(duì)列運(yùn)算法則和默認(rèn)參數(shù)，如BLASTP可以測(cè)定氨基酸序列的一致性(Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(6)2264-2268(1990))。
使用合適的技術(shù)可以制備免疫抗原，和多克隆和單克隆抗體產(chǎn)物。各種方法已經(jīng)被描述。(見(jiàn)，如，Kohler等人的文獻(xiàn)Nature，256495-497(1975)和Eur.J.Immunol.6511-519(1976)；Milstein等人的文獻(xiàn)Nature 266550-552(1977)；Koprowski等人的美國(guó)專(zhuān)利第4172124號(hào)；Harlow，E.和D.Lane，1988，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor LaboratoryColdSpring Harbor，NY)；Current protocols In Molecular Biology，Vol.2(Supplement27，summer’94)，Ausubel，F(xiàn).M.等人編輯的(JohnWiley&SonsNew York，NY)，11章(1991))。一般而言，通過(guò)將來(lái)源于永生細(xì)胞系(如，骨髓瘤細(xì)胞系如SP2/0，P3X63Ag8.653或骨髓瘤)的合適細(xì)胞與抗體-生產(chǎn)細(xì)胞融合可以制備雜交瘤細(xì)胞從而獲得希望得到的單克隆抗體?？贵w-生產(chǎn)細(xì)胞可以從人外圍血或，優(yōu)選地，脾或淋巴結(jié)，人-抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或其它合適經(jīng)抗原免疫的動(dòng)物中獲得。生產(chǎn)人源抗體(如，人抗體)的細(xì)胞能用合適的方法制備，如，將人抗體-生產(chǎn)細(xì)胞和骨髓瘤或trioma細(xì)胞融合，或通過(guò)Epatein Barr病毒轉(zhuǎn)染使活性人B細(xì)胞獲得永生。(見(jiàn)，如，美國(guó)專(zhuān)利第6197582號(hào)(Trakht)；Niedbdala等人的文獻(xiàn)Hybridoma，17299-304(1998)；Zanella等人的文獻(xiàn)JImmunol Methods，156205-215(1992)；Gustafsson等人的文獻(xiàn)Hum Antibodies Hybridomas，226-32(1991))。融合的或永生化的抗體-生產(chǎn)細(xì)胞(雜交瘤)能使用選擇性培養(yǎng)基被分離，且通過(guò)有限稀釋被克隆。細(xì)胞能使用合適的分析(如，ELISA)被鑒定，產(chǎn)生具有希望得到的特異性的抗體。
抗體也可以直接由分離的抗原-特異性抗體生產(chǎn)細(xì)胞(例如，來(lái)源于外圍血或，優(yōu)選地，脾或淋巴結(jié)的細(xì)胞，其產(chǎn)生具有希望特異性的抗體)制備，該細(xì)胞來(lái)源于經(jīng)希望抗原免疫的人，人-抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或其它合適的動(dòng)物。
當(dāng)藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物或藥物融合物施用于人時(shí)，則與血清白蛋白結(jié)合(如，人血清白蛋白)的抗體或其中的抗原-結(jié)合片段是人，人源化的或嵌合的抗體或這些抗體的抗原-結(jié)合片段。這些抗體和抗原-結(jié)合片段的類(lèi)型在人類(lèi)中，具有較少的免疫原性或非免疫原性并且提供了廣為人知的優(yōu)勢(shì)。如，由于對(duì)結(jié)合藥物結(jié)合物或藥物融合物的人抗體進(jìn)行了加工，包含人，人源化的，或嵌合抗體的藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物或藥物融合物，能被重復(fù)施用于人體而功效損失較小或不損失(相對(duì)于其它完全的免疫原抗體)。當(dāng)藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物或藥物融合物是給家畜施用時(shí)，能使用相似的抗體或抗原-結(jié)合片段。如，來(lái)源于鼠科動(dòng)物或人抗體的CDRs能被移植入來(lái)源于希望的動(dòng)物，如馬或牛的結(jié)構(gòu)區(qū)域。
人抗體和編碼相同抗體的核酸可以來(lái)源于，如人或來(lái)源于人-抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。人-抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如，老鼠)是能夠產(chǎn)生人抗體全套文庫(kù)的動(dòng)物，如XENOMOUSE(Abgenix，F(xiàn)remont，CA)，HUMAB-MOUSE，KIRIN TC MOUSE或KM-MOUSE(MEDAREX，Princeton，NJ)。一般而言，人-抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因組已經(jīng)被改變，包括一個(gè)可以進(jìn)行功能性調(diào)整的轉(zhuǎn)移基因，其包括了來(lái)源于人免疫球蛋白位點(diǎn)的DNA。在人-抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的內(nèi)源性免疫球蛋白位點(diǎn)能被破壞或刪除以除去動(dòng)物產(chǎn)生由內(nèi)源基因編碼的抗體的能力。合適的制備人-抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法在本領(lǐng)域已被熟知。(見(jiàn)，如美國(guó)專(zhuān)利第5939598號(hào)和6075181號(hào)(Kucherlapati等人)，美國(guó)專(zhuān)利第5569825號(hào)，第5545806號(hào)，第5625126號(hào)，第5633425號(hào)，第5661016號(hào)和第5789650號(hào)(Lonberg等人)，Jakobovits等人的文獻(xiàn)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90551-2555 (1993)，Jakobovits等人的文獻(xiàn)Nature，362255-258(1993)，Jakobovits等人的WO98/50443，Jakobovits等人的WO98/24893，Lonberg等人的WO98/24884，Lonberg等人的WO97/13852，Lonberg等人的WO94/25585，Lonberg等人的EP0814259A2，Lonberg等人的GB2272440A，Lonberg等人的文獻(xiàn)Nature 368856-859(1994)，Lonberg等人的文獻(xiàn)Int Rev Immunol 13(1)65-93(1995)，Kucherlapati等人的 WO96/34096，Kucherlapati 等人的 EP 0463151B1 ，Kucherlapati等人的.EP0710719A1，Surani等人的美國(guó)專(zhuān)利第5545807號(hào)，Bruggemann等人的WO90/04036，Bruggemann等人的EP0438474B1，Taylor等人的文獻(xiàn)Int.Immunol.6(4)579-591(1994)，Taylor等人的文獻(xiàn)Nucleic Acids Research 20(23)6287-6295(1992)，Green等人的文獻(xiàn)Nature Genetics 713-21(1994)，Mendez等人的文獻(xiàn)Nature Genetics 15146-156(1997)，Tuaillon等，Proc Natl Acad Sci USA90(8)3720-3724(1993)和Fishwild等人的文獻(xiàn)Nat Biotechnol14(7)845-851(1996)，前面的每一篇文獻(xiàn)的主旨通過(guò)引證在此并入全文。)使用合適的抗原(如，人血清白蛋白)免疫人-抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并且通過(guò)傳統(tǒng)的方法分離和融合抗體生成細(xì)胞形成雜交瘤。使用合適的分析(如，ELISA)能定具有希望特性(如，特異性，親合性)的產(chǎn)生人抗體的雜交瘤，且如果有需要，可施用合適的培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行挑選和亞克隆。
人源化抗體和其它CDR-移植抗體能使用合適的方法來(lái)制備。CDRs的一種CDR-移植抗體可以來(lái)源于與血清白蛋白結(jié)合(指供體抗體)的合適的抗體。其它合適CDRs的來(lái)源包括天然和人源化血清白蛋白-特異抗體，所述抗體來(lái)源于人或非人源如嚙齒動(dòng)物(如，小鼠，大鼠，兔)，小雞，豬，山羊，非-人靈長(zhǎng)類(lèi)(如，猴)或一種文庫(kù)。
人源化抗體的結(jié)構(gòu)區(qū)域優(yōu)選地起源于人，且可以來(lái)源于任何人抗體可變區(qū)域，該區(qū)域具有與供體抗體的抗原-結(jié)合區(qū)域的類(lèi)似或相同區(qū)域(如，重鏈可變區(qū)域或輕鏈可變區(qū)域)相似的序列。起源于人的結(jié)構(gòu)區(qū)域的其它來(lái)源包括人可變區(qū)域的標(biāo)準(zhǔn)序列。(見(jiàn)，如，Kettleboro μgh，C.A等人的文獻(xiàn)Protein Engineering 4773-783(1991)；Carter等人的WO94/04679；Kabat，E.A.等人的Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，U.S.GovernmentPrinting Office(1991))。CDR移植抗體的其它類(lèi)型包括合適來(lái)源的結(jié)構(gòu)區(qū)域，如由來(lái)源于馬，牛，狗，貓等類(lèi)似物的種系抗體基因片段編碼的結(jié)構(gòu)區(qū)域。
起源于人的結(jié)構(gòu)區(qū)域能包括氨基酸的置換或交換，如“回復(fù)突變”，其用供給抗體相應(yīng)位置的氨基酸殘基替換來(lái)源于人或動(dòng)物的結(jié)構(gòu)區(qū)域的氨基酸殘基。結(jié)構(gòu)區(qū)域中可以發(fā)生一個(gè)或更多突變，包括一個(gè)或更多氨基酸的刪除，插入和置換。變體可以通過(guò)各種合適的方法來(lái)制備，包括非人供體或受體人鏈的突變。(見(jiàn)，如，美國(guó)專(zhuān)利第5693762號(hào)(Queen等人)和第5859205號(hào)(Adair等人)，全部教導(dǎo)通過(guò)在此引證并入本文。)抗體的恒定區(qū)域，抗體鏈(如，重鏈，輕鏈)或其片段或部分，如果存在，可以來(lái)源于任何合適的資源。如，人，人源化和特定嵌合抗體，抗體鏈(如，重鏈，輕鏈)或其片段或部分的恒定區(qū)域，如果存在，可以是起源于人并來(lái)源于任何合適的人抗體或抗體鏈。如，來(lái)源于人的恒定區(qū)域或其部分可以是來(lái)源于人的κ或λ輕鏈，和/或人γ(例如γ1，γ2，γ3，γ4)，μ，α(例如α1，α2)，δ或ε重鏈包括等位基因突變體。在特定的實(shí)施方案中，抗體或抗原-結(jié)合片段(如，來(lái)源于人的抗體，人抗體)能包括改變或裁剪功能(如效用功能)的氨基酸置換或替代。如，起源于人的恒定區(qū)域(如，γ1恒定區(qū)域，γ2恒定區(qū)域)能被設(shè)計(jì)從而減少補(bǔ)體的活性和/或Fc受體的結(jié)合。(見(jiàn)，如，美國(guó)專(zhuān)利第5648260號(hào)(Winter等)，5624821(Winter等)和5834597(Tso等)，整個(gè)教導(dǎo)通過(guò)在此引證并入本文。)優(yōu)選地，包含這種氨基酸置換或替代的起源于人的氨基酸序列的恒定區(qū)域與來(lái)源于人的未改變的恒定區(qū)域的完整長(zhǎng)度氨基酸序列至少有95％相同，優(yōu)選地，與來(lái)源于人的未改變的恒定區(qū)域的完整長(zhǎng)度氨基酸序列至少有99％相同。
人源化抗體，CDR移植抗體或人源化或CDR移植抗體的抗原-結(jié)合片段能使用任何合適的方法被制備。一些方法在本領(lǐng)域熟知。(見(jiàn)，如，美國(guó)專(zhuān)利第5225539號(hào)(Winter)，美國(guó)專(zhuān)利第5530101號(hào)(Qneen等人)。)人源化或CDR移植抗體的部分(如，CDRs，結(jié)構(gòu)，恒定區(qū)域)能直接從合適的抗體中獲得或起源(如，通過(guò)部分的全新合成)，或具有希望特性的編碼抗體或其鏈的核酸能被制備或表達(dá)。為了制備鏈的一部分，一種或更多的終止密碼子可以被介導(dǎo)入希望的位置。如，編碼人源化的或CDR移植可變區(qū)域的核酸序列(如，DNA)能使用PCR突變的方法被構(gòu)建以改變現(xiàn)有的DNA序列。(見(jiàn)，如，Kamman，M.，等人，Nucl.Acids Res.175404(1989)。)編碼新的CDRs的PCR的引物能與先前的人源化可變區(qū)域的DNA模板雜交，該區(qū)域以相同的或非常相似的人可變區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)。(Sato，K.等人，CancerResearch53851-856(1993))。如果不能獲得用作模板的一種相似的DNA序列，則包含編碼可變區(qū)域序列的核酸可以通過(guò)合成的寡核苷酸來(lái)構(gòu)建(見(jiàn)，如，Kolbinger，F(xiàn).，Protein Engineering8971-980(1993))。編碼一種信號(hào)肽的序列也能被整合進(jìn)入核酸(如，合成，通過(guò)插入進(jìn)入一種載體)。來(lái)源于受體抗體的天然信號(hào)肽序列，來(lái)源于其它抗體的信號(hào)肽序列或其它合適的序列可以被使用。(見(jiàn)，如，Kettleborough，C.A.，Protein Engineering 4773-783(1991))。使用這些方法或其它合適的方法，能容易地制備突變體。在某一實(shí)施方案中，克隆的可變區(qū)域可以被突變，并且編碼帶有希望特性的序列可以被選擇(如，來(lái)源于噬菌體文庫(kù)；見(jiàn)，如，美國(guó)專(zhuān)利第5514548(Krebber等)和WO93/06213(Hoogenboom等))。
與血清白蛋白結(jié)合的抗體或抗原-結(jié)合片段可以是一種嵌合抗體或嵌合抗體的抗原-結(jié)合片段。嵌合抗體或其抗原-結(jié)合片段包括一種來(lái)源于某一物種的可變區(qū)域(如，小鼠)和至少來(lái)源于其它物種(如，人)的恒定區(qū)域的一部分。嵌合抗體或嵌合抗體的抗原-結(jié)合片段能使用任何合適的方法來(lái)制備。一些合適的方法是本領(lǐng)域熟知的。(見(jiàn)，如，美國(guó)專(zhuān)利第4816567號(hào)(Cabilly等)，美國(guó)專(zhuān)利第5116946號(hào)(Capon等)。
獲得與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段的優(yōu)選方法包括從抗原-結(jié)合片段的全部集合中選擇特異結(jié)合期望血清白蛋白的抗原-結(jié)合片段(如，scFvs，dAbs)。如，正如這里描述，結(jié)合血清清單蛋白的dAbs能從合適的噬菌體顯示文庫(kù)中選擇。許多合適的細(xì)菌噬菌體顯示文庫(kù)和選擇方法(如，單價(jià)的顯示系統(tǒng)和多價(jià)的顯示系統(tǒng))已經(jīng)被描述。(見(jiàn)，如，Griffiths等，美國(guó)專(zhuān)利第6555313B1(在此通過(guò)參考被整合)；Johnson等，美國(guó)專(zhuān)利第5733743(通過(guò)在此引證并入本文)；McCaffetty等，美國(guó)專(zhuān)利第5969108(通過(guò)在此引證并入本文)；Mulligan-Kehoe，美國(guó)專(zhuān)利第5702892(通過(guò)在此引證并入本文)；Winter，G等，Annu.Rev.Immunol.12433-455 (1994)；Sounillion，P等，Appl.Biochem.Biotechnol.47(2-3)175-189(1994)；Castagnoli，L.等，Comb.chem.High Throughput Screen，4(2)121-133(2001)；WO99、20749(Tomlinson and Winter)；WO 03/002609 A2(Winter等)；WO 2004/003019A2(Winter等)。)在一種細(xì)菌噬菌體文庫(kù)中顯示的多肽能用任何合適的細(xì)菌噬菌體顯示，如絲狀噬菌體(如，fd，M13，F(xiàn)1)，溶解性噬菌體(如T4，T7，lambda)，或RNA噬菌體(如，MS2)，并選取那些與血清白蛋白(如，人血清白蛋白)結(jié)合的多肽。
一般而言，可以使用顯示作為帶有合適的噬菌體外殼蛋白的融合蛋白多肽全套文庫(kù)的噬菌體文庫(kù)。這種文庫(kù)可以使用任何合適的方法被制備，如介導(dǎo)編碼顯示抗體或其抗原-結(jié)合片段的噬菌體載體或噬菌體展示載體的文庫(kù)進(jìn)入合適的宿主細(xì)菌，培養(yǎng)這些細(xì)菌以產(chǎn)生噬菌體(如，使用合適的輔助噬菌體或補(bǔ)充噬菌體)。使用合適的方法，如沉淀和離心，噬菌體文庫(kù)可以從培養(yǎng)物中收集。
文庫(kù)包括包含任何氨基酸序列差異的抗體或其抗原-結(jié)合片段的全套文庫(kù)。如，全套文庫(kù)可以包含抗體或其抗原-結(jié)合片段的氨基酸序列，其對(duì)應(yīng)于期望物種的自然產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列，和/或包括一種或更多任意或隨機(jī)氨基酸序列區(qū)域(如，CDR序列)。在這種基因組或文庫(kù)中的抗體或其抗原-結(jié)合片段包括任意或隨機(jī)氨基酸序列區(qū)域和普通氨基酸序列區(qū)域。在特定的實(shí)施方案中，基因組中的所有多肽是抗體的抗原-結(jié)合片段的期望類(lèi)型(如，人VH或人VL)。如，在基因組中，每一多肽可以包括VH，VL或Fv(如，F(xiàn)v單鏈)。
使用合適的方法，氨基酸序列的差異能被介導(dǎo)入抗體或其抗原-結(jié)合片段的希望區(qū)域。例如，通過(guò)使用合適的突變方法(如，低保真度PCR，寡核苷酸-介導(dǎo)的或位點(diǎn)直接突變，使用NNK代碼造成的多樣化)或任何合適的方法制備編碼多樣化的抗體或其抗原-結(jié)合片段的核酸文庫(kù)，氨基酸序列差異可以被介導(dǎo)入目標(biāo)區(qū)域，如抗體可變區(qū)域的補(bǔ)充決定區(qū)域。如果希望，多樣化的抗體或其抗原-結(jié)合片段的區(qū)域可以是任意的。
合適的噬菌體顯示文庫(kù)能用于選擇與血清白蛋白結(jié)合并具有其它有益特性的抗體或抗原-結(jié)合片段。如，當(dāng)未折疊時(shí)，抵制聚合的抗體或抗體結(jié)合片段能被選擇。聚合受多肽濃度的影響并在許多時(shí)候從部分折疊或展開(kāi)的媒介中出現(xiàn)。有助于部分折疊媒介的因素和條件，如提高的溫度和較高的多肽濃度，促進(jìn)不可逆的聚合。(Fink，A.L.，F(xiàn)olding & Design 3R1-R23(1998)。)如，以濃縮的形式存儲(chǔ)純化的多肽，如以?xún)龈傻漠a(chǎn)物形式，經(jīng)常導(dǎo)致至少部分多肽的不可逆聚合。在生物體系表達(dá)的多肽產(chǎn)物，如E.coli，經(jīng)常導(dǎo)致包含體的形式，其包含了聚合多肽。對(duì)于生物產(chǎn)物體系來(lái)說(shuō)，從包含體收集活性多肽將是非常困難的且需要增加額外的步驟，如重新折疊步驟。
當(dāng)加熱時(shí)，可可逆地抵制聚合和展開(kāi)的抗體和抗原-結(jié)合片段能從合適的噬菌體顯示文庫(kù)中被選擇。一般而言，包括顯示抗體或其抗原-結(jié)合片段的全套文庫(kù)的噬菌體顯示文庫(kù)被加熱至至少有部分的顯示抗體或其抗原-結(jié)合片段達(dá)到展開(kāi)的溫度(Ts)，然后被冷卻至一種溫度(Tc)，(其中Ts＞Tc，)由此至少抗體或其抗原-結(jié)合片段的部分已經(jīng)被重新折疊并且多肽的部分已經(jīng)被聚合。然后，可逆地展開(kāi)及結(jié)合血清白蛋白的抗體或其抗原-結(jié)合片段在Tr的溫度下被恢復(fù)。收集的可逆地展開(kāi)的抗體或其抗原-結(jié)合片段有一個(gè)解鏈溫度(Tm)，且優(yōu)選地，全套文庫(kù)被加熱至Ts，冷卻至Tc且可逆地展開(kāi)的抗體或其抗原-結(jié)合片段在Tr被分離，在這里Ts＞Tm＞Tc，且 Ts＞Tm＞Tr。一般而言，噬菌體顯示文庫(kù)被加熱至大約80℃且在選擇前，冷卻至室溫或大約4℃。通過(guò)用具有可逆展開(kāi)能力的殘基代替一定的氨基酸殘基，可以設(shè)計(jì)或制造可逆地展開(kāi)并抵制聚合的抗體或其抗原-結(jié)合片段。選擇和設(shè)計(jì)或制造可逆地展開(kāi)的抗體或其抗原-結(jié)合片段的方法的詳細(xì)描述，(見(jiàn)，WO2004/101790(Jespers等)，和美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)第60/470340號(hào)(歸檔在2003，5，14)和第60/554021號(hào)(歸檔在2004，3，17)。WO2004/101790和兩個(gè)美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)的教導(dǎo)通過(guò)在此引證并入本文。
可逆地展開(kāi)和抵制聚合的抗體或其抗原-結(jié)合片段提供了某些優(yōu)勢(shì)。如，由于它們抵制聚合，使用合適的生物生產(chǎn)體系，如E.coil，通過(guò)表達(dá)，能容易地以高產(chǎn)的可溶性蛋白形式制備可逆地展開(kāi)的抗體或抗原-結(jié)合片段。此外，可逆地展開(kāi)和抵制聚合的抗體或其抗原-結(jié)合片段能以比傳統(tǒng)的多肽更高的濃縮形式存在和/或存儲(chǔ)，且?guī)в懈俚木酆虾突钚詠G失。DOM7h-26(序列號(hào)20)是可逆展開(kāi)的人VH。
優(yōu)選地，與血清白蛋白結(jié)合的抗體或抗原-結(jié)合片段包括一個(gè)可變區(qū)域(VH，Vk，Vλ)，其中的一種或更多的結(jié)構(gòu)區(qū)域(FR)包括(a)人結(jié)構(gòu)區(qū)域的氨基酸序列，(b)人結(jié)構(gòu)區(qū)域的氨基酸序列的至少8個(gè)相鄰的氨基酸，或(c)編碼人抗體基因片段的氨基酸序列，其中所述的結(jié)構(gòu)區(qū)域被稱(chēng)為Kabat。在特定的實(shí)施方案中，一種或更多結(jié)構(gòu)區(qū)域的氨基酸序列與由人抗體基因片段編碼的相應(yīng)的結(jié)構(gòu)區(qū)域的氨基酸序列相同，或一種或更多結(jié)構(gòu)區(qū)域的氨基酸序列與由人抗體基因片段編碼的相應(yīng)的結(jié)構(gòu)區(qū)域的氨基酸序列有5個(gè)氨基酸的不同。
在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)R1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3，F(xiàn)R4的氨基酸序列與由人抗體基因片段編碼的相應(yīng)結(jié)構(gòu)區(qū)域的氨基酸序列相同，或FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3，F(xiàn)R4的氨基酸序列與由人抗體基因片段編碼的相應(yīng)結(jié)構(gòu)區(qū)域的氨基酸序列有10個(gè)氨基酸的不同。在其它實(shí)施方案中，所述的FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3，的氨基酸序列與由所述的人抗體基因片段編碼的相應(yīng)結(jié)構(gòu)區(qū)域的氨基酸序列相同。
在特殊的實(shí)施方案中，與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段包括基于人種系序列的免疫球蛋白的可變區(qū)域(如，(VH，VL)，和具有一個(gè)或更多個(gè)多變化的區(qū)域，如補(bǔ)充決定區(qū)域。VH的合適的人種系序列包括，如，由VH基因片段DP4，DP7，DP8，DP10，DP31，DP33，DP45，DP46，DP47，DP49，DP50，DP51，DP53，DP54，DP65，DP66，DP67，DP68，DP69編碼的序列，和JH片段JH1，JH2，JH3，JH4，JH5，和JH6。VL的合適的人種系序列包括，如，由Vk基因片段DPK1，DPK2，DPK3，DPK4，DPK5，DPK6，DPK7，DPK8，DPK9，DPK10，DPK12，DPK13，DPK15，DPK16，DPK18，DPK19，DPK20，DPK21，DPK22，DPK23，DPK24，DPK25，DPK26和DPK28編碼的序列，和Jκ片段Jκ1，Jκ2，Jκ3，Jκ4，和Jκ5。
在特定的實(shí)施方案中，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物或藥物融合物不包括小鼠，大鼠和/或兔子的與血清白蛋白結(jié)合的抗體或這種抗體的抗原-結(jié)合片段。
抗原-結(jié)合片段能以任何希望的親合力，親和速率和解離速率與血清白蛋白結(jié)合。親和力(KD)，親和速率(kon或ka)和解離速率(koff或kd)能夠被選取以獲得希望的特定藥物的血清半衰期。如，可以得到藥物的最大血清半衰期，其抑制慢性炎癥疾病的發(fā)炎媒介(如，結(jié)合和抑制炎癥細(xì)胞因子的dAb)，盡管有某些毒性藥物希望有較短的半衰期(如，化學(xué)療法的藥物)。
一般而言，對(duì)于與血清白蛋白結(jié)合，快速的親和速率和一種快速或中等速度的解離速率是優(yōu)選的。當(dāng)被施用后，帶有這些特性的包含一種抗原-結(jié)合片段的藥物結(jié)合物和藥物融合物將快速與血清白蛋白結(jié)合，并且又快速地與血清白蛋白解離和重新結(jié)合。這些特性將降低藥物的快速清除(如，通過(guò)腎)，但是仍然保證了藥物靶標(biāo)的高效傳輸和分布。
與血清白蛋白(如，dAb)結(jié)合的抗原-結(jié)合片段通常的結(jié)合親和力為大約1nM至500uM。在某些實(shí)施方案中，與血清白蛋白結(jié)合的抗原-結(jié)合片段的KD(KD＝Koff(kd)/Kon(ka)的結(jié)合親和力為大約10至100nM，或100nM至500nM，或500nM至5mM，如由表面胞質(zhì)基因共振所測(cè)(如，用BIACORE儀器)。在特殊的實(shí)施方案中，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物或藥物融合物包括與血清白蛋白結(jié)合的抗體和抗體(如，dAb)的抗原-結(jié)合片段，其與血清白蛋白(如，人血清白蛋白)結(jié)合的KD值為大約50nM，或70nM，或100nM，或150nM或大約200nM。這里描述的具有改良的制藥學(xué)上的特性的(如，延長(zhǎng)的t1/2β，增加的AUC)藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物和藥物融合物可以和結(jié)合血清白蛋白的抗原-結(jié)合片段的親和力相關(guān)。因此，具有改良的制藥學(xué)上的特性的藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物和藥物融合物可以使用與血清白蛋白(如，人血清白蛋白)具有高結(jié)合親和力(如，KD為大約500nM或更少，大約250nM或更少，大約100nM或更少，大約50nM或更少，大約10nM或更少，或大約1nM或更少，或大約100pM或更少)的抗原-結(jié)合片段來(lái)制備。
優(yōu)選地，與結(jié)合血清白蛋白的抗原-結(jié)合片段共扼或融合的藥物，結(jié)合其靶標(biāo)(藥物靶標(biāo))的親和力(KD)比與血清白蛋白結(jié)合的抗原-結(jié)合片段的親和力更強(qiáng)和/或Koff(kd)比與血清白蛋白結(jié)合的抗原-結(jié)合片段的Koff值更快，如由表面胞質(zhì)基因共振所測(cè)(如，使用BIACORE儀器)。例如，結(jié)合其靶標(biāo)的藥物的親和力可以比SA與結(jié)合SA的抗原-結(jié)合片段的親和力強(qiáng)大約1至100,000，或大約100至100,000，或1000至100,000，或10,000至100,000倍。例如，結(jié)合SA的抗體的抗原-結(jié)合片段的結(jié)合親和力大約為10uM，而結(jié)合靶標(biāo)的藥物的親和力大約為100pM。
在特殊的實(shí)施方案中，與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段是一種結(jié)合人血清白蛋白的dAb。如，可以從由序列號(hào)10，序列號(hào)11，序列號(hào)12，序列號(hào)13，序列號(hào)14，序列號(hào)15，序列號(hào)24，序列號(hào)25和序列號(hào)26組成的組中選擇的VkdAb，或，可以從由序列號(hào)16，序列號(hào)17，序列號(hào)18，序列號(hào)19，序列號(hào)20，序列號(hào)21，序列號(hào)22，和序列號(hào)23組成的組中選擇的VHdAb。在其它實(shí)施方案中，與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段是結(jié)合人血清白蛋白的dAb，其包含任何前述的氨基酸序列的CDRs。在其它實(shí)施方案中，與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段是結(jié)合人血清白蛋白的dAb且包含的氨基酸序列至少有80％，或至少有85％，或至少有90％，或至少有95％，或至少有96％，或至少有97％，或至少有98％，或至少有99％的氨基酸序列與序列號(hào)10，序列號(hào)11，序列號(hào)12，序列號(hào)13，序列號(hào)14，序列號(hào)15，序列號(hào)24，序列號(hào)25，序列號(hào)26，序列號(hào)16，序列號(hào)17，序列號(hào)18，序列號(hào)19，序列號(hào)20，序列號(hào)21，序列號(hào)22或序列號(hào)23相同。使用合適的序列隊(duì)列運(yùn)算法則和默認(rèn)參數(shù)，如BLASTP(Karlin and Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(6)2264-2268(1990))可以?xún)?yōu)選的測(cè)定氨基酸序列的一致性。
藥物本發(fā)明的特定的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物)可以包括任何通過(guò)結(jié)合和/或改變個(gè)體中生物靶標(biāo)分子的作用被施用入個(gè)體并產(chǎn)生有利的治療或診斷作用的藥物(如，小有機(jī)分子，核酸，多肽)。本發(fā)明的其它藥物組合物(如，藥物融合物)包括一種多肽或肽藥物。在藥物融合物的優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物不包括抗體鏈或抗體鏈的片段(如，VH，VκV，Vλ)。
在本發(fā)明中使用的合適的藥物包括，如，免抑抑制藥物(如，環(huán)孢霉素A，雷帕霉素，F(xiàn)K506，強(qiáng)的松)，抗病毒藥物(阿昔洛韋，更昔洛韋，英地納韋)，抗生素(青霉素，美滿(mǎn)霉素，美滿(mǎn)霉素，四環(huán)素)，抗-炎癥藥物(阿斯匹林，異丁苯丙酸，強(qiáng)的松)，細(xì)胞毒素或細(xì)胞藥物(如，紫杉醇，細(xì)胞松弛素B，短桿菌肽D，溴化乙錠，土根堿，絲裂霉素c，依托泊甙，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春堿，秋水仙素，阿霉素，柔紅霉素，二羥基炭疽菌素，米托蒽醌，光輝霉素，放線(xiàn)菌素D，1-二氫睪酮，糖皮質(zhì)激素類(lèi)，普魯卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛爾，嘌呤霉素，和與任何前述藥物類(lèi)似或相當(dāng)?shù)乃幬铩：线m的藥物也包括抗代謝物(如，氨甲蝶呤，6-巰基嘌呤，6-硫鳥(niǎo)嘌呤，阿糖胞苷，5-氟脲嘧啶，氮烯咪胺)，烷基化藥物(如，氮芥，硫代苯丁酸氮芥，CC-1065，苯丙氨酸氮芥，卡氮芥(BSNU)，環(huán)己亞硝脲(CCNU)，環(huán)磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，鏈脲菌素，絲裂霉素C，和順鉑(II)(DDP)cisplatin)，蒽環(huán)類(lèi)(如，柔紅霉素(柔毛霉素前體)和阿霉素)，抗生素(如，放線(xiàn)菌素d(放線(xiàn)菌素前體)，博來(lái)霉素，光輝霉素，和氨茴霉素(AMC))，放射性物質(zhì)(如，碘-125，-126)釔(如，釔-90，-91)和鐠(如，鐠-144，-145)，和蛋白酶抑制劑(如，基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制劑)。其它合適的藥物是核酸如反義核酸和RNAi。卡里奇霉素也可以用于發(fā)明中。
合適的藥物也包括鎮(zhèn)痛劑藥物，其包括麻醉品(如，甲基嗎啡，嗎啡，鈉洛酮，芬太尼，哌替啶，嗎啡，曲馬多，丙氧芬，羥可酮，美散痛，納布啡)，非甾體抗-炎癥藥物(如，消炎痛，酮咯酸，奧濕克，布洛芬，萘普生，水楊酸鹽，塞萊昔布，羅非昔布)，醋氨酚，辣椒辣素，齊考諾肽(ziconotide)，等類(lèi)似物。
在特定的實(shí)施方案中，藥物是多肽毒素，如，一種毒素如相思豆毒素，篦麻毒素A，假單胞菌外毒素，或白喉毒素。其它合適的多肽藥物包括抗體或抗體的抗原-結(jié)合片段(如dAb)，多肽增效劑，催化劑，促分泌素，拮抗劑或抑制劑。如，多肽或肽藥物能結(jié)合和增效或拮抗細(xì)胞表面蛋白，如CD抗原，細(xì)胞因子受體(如，白介素受體，趨化因子受體)，粘著分子或共刺激分子。如，多肽藥物能結(jié)合一種細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子受體，生長(zhǎng)因子受體和其它靶標(biāo)亞基，其包括但不非限制于ApoE，Apo-SAA，BDNF，心肌營(yíng)養(yǎng)素-1CEA，CD40，CD40亞基，CD56，CD38，CD138，EGF，EGF受體，ENA-78，嗜酸粒細(xì)胞趨化因子，嗜酸粒細(xì)胞趨化因子-2，Exodus-2，F(xiàn)APα，酸性FGF，堿性FGF，纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子-10，F(xiàn)LT3亞基，F(xiàn)ractalkine(CX3C)，GDNF，G-CSF，GM-CSF，GF-β1，人血清白蛋白，胰島素，IFN-γ，IGF-I，IGF-II，IL-1α，IL-1β，IL-1受體，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8(72.a.a.)，IL-8(77a.a.)，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18(IGIF)，胰島素α，胰島素β，IP-10，角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(KGF-2)，KGF，瘦素，LIF，淋巴細(xì)胞趨化因子，Mullerian抑制物質(zhì)，單核細(xì)胞群落抑制因子，單核細(xì)胞引誘蛋白，M-CSF，MDC(67a.a.)，MDC(69a.a.)，MIG，MIP-1α，MIP-1β，MIP-3α，MIP-3β，MIP-4，骨髓起源的抑制因子-1(MPIF-1)，NAP-2，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白，神經(jīng)生長(zhǎng)因子，β-NGF，NT-3，NT-4，制瘤素M，PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB，PF-4，RANTES，SDF1α，SDF1β，SCF，SCGF，干細(xì)胞因子(SCF)，TARC，TGF-α，TGF-β，TGF-β2，TGF-β3，腫瘤壞死因子(TNF)，TNF-α，TNF-β，TNF受體I，TNF受體II，TNIL-1，TPO，VEGF，VEGFA，BEGFB，BEGFC，VEGFD，VEGF受體1，VEGF受體2，VEGF受體3，GCP-2，GRO/MGSA，GRO-β，GRO-γ，HCC1，1-309，HER1，HER2，HER3，HER4。這種列表是決非窮盡的。
合適的藥物也包括激素，包括垂體激素(PTH)，促腎上腺皮質(zhì)的激素(LHRH)，促性腺激素-釋放激素(GnRH)，黃體激素(LH)，促卵泡激素(FSH)，醛固酮等類(lèi)似物。合適的藥物也包括角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子，干擾素(如，IFN-α，IFN-β，IFN-γ)，促紅細(xì)胞生成素(EPO)，蛋白酶，酯酶，LHRH類(lèi)似物，增效劑和拮抗劑，阿片肽受體增效劑，如kappa阿片肽受體增效劑(如，強(qiáng)啡肽 A)，降血鈣素和降血鈣素類(lèi)似物，抗利尿激素(后葉加壓素)，催產(chǎn)素拮抗劑，血管活性的腸的多肽，凝血酶抑制劑，血管性血友病因子，表面活性劑和蝸牛毒液(如，ziconotide)。
合適的藥物也包括具有抗-癌活性(如，增殖抑制，生長(zhǎng)抑制，細(xì)胞凋亡包括，轉(zhuǎn)移抑制，粘著抑制，新生血管形成抑制)的肽和多肽，其。一些這種肽和多肽為本領(lǐng)域所知。(見(jiàn)，如，Janin Y.L.，Amino Acids，251-40(2003)。該文獻(xiàn)的教導(dǎo)，尤其是其中描述的肽和多肽，通過(guò)在此引證并入本文。)一些這種肽的氨基酸序列出現(xiàn)在表8中。
其它合適的藥物包括具有抗-病毒活性的肽和多肽。一些這樣的肽和多肽在本領(lǐng)域所熟知，如，在Giannecchini，等，J Viro.，77(6)3724-33(2003)；Wang，J.，等，Clin Chem(2003)；Hilleman，M.R.，Vaccine，21(32)4626-49(2003)；Tziveleka，L.A.，等，Curr Top Med Chem，3(13)1512-35(2003)；Poritz，M.A.，等，Virology，313(1)170-83(2003)；Oevermann，A.，等，Antiviral Res，59(1)23-33(2003)；Cole，A.M.等，Curr Pharm Des，9(18)1463-73(2003)；Pinon，J.D.，等，Virol，77(5)3281-90(2003)；Sia，S.K.，等，Proc Natl Acad Sci USA，99(23)14664-9(2002)；Biochem J，66(pt3)863-72(2002)；de Soultrait，V.R.，et al，J MolBiol，18(1)45-58(2002)；Witherell，G.，Curr Opin InvestingDrugs，2(3)340-7(2001)；Ruff，M.R.，等，Antiviral Res，52(1)63-75(2001)；Bultmann，H.，等，J.Virol，75(6)2634-45(2001)；Egal，M.，等，Int J Antimicrob A Gents，13(1)57-60(1999)；和Robinson，W.E.，Jr.，J Leukoc Biol，63(1) 94-100(1998)中描述的肽和多肽。這些參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容，尤其是這里描述的肽和多肽，通過(guò)在此引證并入本文。這些肽和多肽是能用于目前發(fā)明的藥物組合物，藥物融合物，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物的例子。
多肽藥物也可以包括細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子或受體的可溶性部分(如，細(xì)胞因子受體，生長(zhǎng)因子受體，激素受體)或其它如上面所列的多肽。如，合適的多肽藥物也可以包括受體(如，生長(zhǎng)因子受體，細(xì)胞因子受體，激素受體)增效劑和拮抗劑，如，白介素1受體拮抗劑(Eisenberg等，Nature 343341-346(1990))，凝血生成素受體增效劑(如，GW395058(de Serres等，Stem Cells17316-326(1999))，黑色素皮質(zhì)素受體拮抗劑(如，MCR-4拮抗劑(Cepoi等，Brain Res.100064-71(2004))，anginex，6DBF7(Mayo等，J.Biol.Chem.27845746-45752(2003))，趨化因子模擬物(如，RANTES模擬物(Nardese等，Nat.Struct.Biol.8611-615(2001))，生長(zhǎng)激素(如，人生長(zhǎng)激素)，生長(zhǎng)激素類(lèi)似物和生長(zhǎng)激素促泌劑(如，CP-424391(MacAndrew等，Eur.J.Pharmacol.432195-202(2001))，生長(zhǎng)激素釋放激素模擬物(如，MK-677(Chapman等，J.Clin.Endocrinol.Metab.823455-3463(1997))，細(xì)胞粘著分子相互作用抑制劑 (如，LFA-1/ICAM-1，VLA-1/VCAM-1(Yusuf-Makagiansar等，Med.Res.Rev.22146-167(2002))，干擾素模擬物(如，SYR6(Sato等，Biochem.J.371(Pt.2)603-608(2003)，赫賽汀模擬物(NatureBiotechnol.18137(2000))，抗原表達(dá)抑制劑(Bolin等，J.Med.Chem.432135-2148(2000))，GPIIB/IIIA拮抗劑(如，F(xiàn)K633(Aoki等，Thromb.Res.81439-450(1996))，alphaVbeta3拮抗劑(如，SC56631(Engleman等，J.Clin.Invest.992284-2292(1997))，促紅細(xì)胞生成素模擬物(如，EMP1(Johnson等，Biochemistry373699-3710(1998))，阿片受體拮抗劑(如，〔(2S，3R)-TMT1〕DPDPE(Liao等，J.Med.Chem.414767-4776(1998))，造血因子(如，)促紅細(xì)胞生成素(EPO)，粒細(xì)胞群落刺激因子(GM-CSF))。
另外的合適的肽和多肽藥物包括結(jié)合人IL-1受體1型的肽拮抗劑(如，AF11377(FEWTPGYWQPYALPL，序列號(hào)56)，AF11869(FEWTPGYWQJYALPL，序列號(hào)57(J＝1-氮雜環(huán)丁二烯-2-羧酸)，F(xiàn)EWTPGYWOJY(序列號(hào)58)，F(xiàn)EWTPGWYQJY(序列號(hào)59)，F(xiàn)EWTPGWYQJYALPL(序列號(hào)60)，或任何包括?；陌被┒撕?或氨化羧基末端的隨意前述序列(Akeson等，J.Biol.Chem.27130517-305123(1996))，TNF-alpha-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的肽拮抗劑(如，在Chirinos-Rojas等人的文獻(xiàn)J.Immunol.1615621-5626(1998)中描述的)，促紅細(xì)胞生成素受體的肽增效劑(如，在McConnel等，Biol.Chem.3791279_1286(1998)或Wrighton等，Science 273458-464(1996)中描述的)，胰高血糖素-類(lèi)似多肽-1(GLP-1(7-37)，GLP-1(7-36)氨基化合物和其類(lèi)似物(見(jiàn)，如，Ritzel U.等，J.Endocrinology 15993-102(1998))，和干擾素(如，INFα，INFβ，INFγ)。另外合適的多肽和肽藥物包括整聯(lián)蛋白抑制劑(如，RGD肽，如H-Glu[cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)]2(Janssen，M.L.等，Canner Research626146-6151 (2002))，cyclo (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)(Haubner，R.，等，J.Nucl.Med.42326-336(2001)，核糖體-失活蛋白(RIPs)如皂角毒(如，序列號(hào)67)，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(如，美國(guó)專(zhuān)利第5616605號(hào))，和抗病毒肽和多肽，如HIV融合抑制劑(如，T-1249和T-20(FUZEON(enfuvirtide)；Trimeris Inc.)，和可溶性受體拮抗劑如免疫粘著劑(如，LFA3-Ig，CTLA4-Ig)。
抗菌多肽和肽藥物也適用于本發(fā)明。合適的抗菌多肽和肽藥物的例子包括adenoregulin，人汗腺抗菌肽(dermcidin-1L)，殺菌肽(如，殺菌肽-類(lèi)似物肽，人-LL-37/Hcap-18)，防御素類(lèi)，包括α-防御素類(lèi)(如，人嗜中性粒細(xì)胞肽1(HNP-1)，HNP-2，HNP-3，HNP-4，人防御素5，人防御素6)，β-防御素類(lèi)(如，人β-防御素-1，人β-防御素-2)，和θ-防御素類(lèi)(如，θ-防御素-1)，富組蛋白(如，富組蛋白1，富組蛋白3，富組蛋白5)，乳鐵蛋白肽-來(lái)源的肽和相關(guān)肽(見(jiàn)，Tomita M.，等，Acta Paediatr.Jpn.36585-591(1994)和Strom，M.B.，等Biochem Cell Biol.8065-74(2002))。
藥物融合物發(fā)明的藥物融合物是包括一種連續(xù)的多肽鏈的融合蛋白，所述的鏈包括與血清白蛋白結(jié)合作為第一亞基的抗體的抗原-結(jié)合片段，其與作為第二亞基的多肽藥物連結(jié)。第一和第二亞基可以通過(guò)肽結(jié)合物相互直接地結(jié)合，或通過(guò)一個(gè)合適的氨基酸或肽或多肽連接物連接。另外的亞基(如，第三，第四)和/或連接物序列可以適當(dāng)?shù)爻霈F(xiàn)。第一亞基可以位于N-末端，C-末端或第二亞基(即，多肽藥物)的內(nèi)部。在特定的實(shí)施方案中，每一亞基的出現(xiàn)可以多于一個(gè)拷貝。如，藥物融合物可以包括兩個(gè)或更多第一亞基，每一亞基包括與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段(如，結(jié)合人血清白蛋白的VH和結(jié)合人血清白蛋白的VL或兩種或更多結(jié)合人血清白蛋白的VHs或VLs)。
在某些實(shí)施方案中，藥物融合物是一種連續(xù)的多肽鏈，其公式如下a-(X)n1-b-(Y)n2-c-(Z)n3-d或a-(Z)n3-b-(Y)n2-c-(X)n1-d；其中X是對(duì)第一靶標(biāo)具有結(jié)合特異性的一種多肽藥物；Y是對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性的抗體的單鏈抗原-結(jié)合片段；Z是對(duì)第二靶標(biāo)具有結(jié)合特異性的多肽藥物；a，b，c和d分別是包括約1-100個(gè)氨基酸殘基的多肽或缺失；n1是1至大約10；n2是1至大約10；和n3是0至大約10，附加條件當(dāng)n1和n2都為1而n3為零時(shí)，X不包括抗體鏈或抗體鏈的片段。
在某一實(shí)施方案中，X和Z都不包括抗體鏈或抗體鏈的片段。在某一實(shí)施方案中，n1為1，n3為2，n2為2，3，4，5，6，78，或9。優(yōu)選地，Y是對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域(VH)，或Y是對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)域(VL)。更優(yōu)選地，Y是結(jié)合人血清白蛋白的dAb(如，VH，Vk，或Vλ)。在特殊的實(shí)施方案中，X或Z是人IL-1α或人IL-1ra的功能性變體。
在特定的實(shí)施方案中，Y包括從序列號(hào)10，序列號(hào)11，序列號(hào)12，序列號(hào)13，序列號(hào)14，序列號(hào)15，序列號(hào)24，序列號(hào)25和序列號(hào)26組成的組中選擇的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，Y包括從序列號(hào)16，序列號(hào)17，序列號(hào)18，序列號(hào)19，序列號(hào)20，序列號(hào)21，序列號(hào)22和序列號(hào)23組成的組中選擇的氨基酸序列。
在其它實(shí)施方案中，藥物融合物包括亞基X’和Y’，其中X’是一種多肽藥物，附加條件為X不包括抗體鏈或抗體鏈的片段；并且Y’是對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性的抗體的單鏈抗原-結(jié)合片段。優(yōu)選地，Y’是對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域(VH)，或Y’是對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)域(VL)。更優(yōu)選地，Y’是結(jié)合人血清白蛋白的dAb(如，VH，Vk，或Vλ)。X’可以位于Y’的氨基末端，或Y’可以位于X’的氨基末端。在某些實(shí)施方案中，X’和Y’被氨基酸分離，或被包含兩個(gè)至大約100個(gè)氨基酸的肽或多肽連接物分離。在特殊的實(shí)施方案中，X’是人IL-1ra或人IL-1ra的功能性變體。
在特定的實(shí)施方案中，Y’包括從序列號(hào)10，序列號(hào)11，序列號(hào)12，序列號(hào)13，序列號(hào)14，序列號(hào)15，序列號(hào)24，序列號(hào)25和序列號(hào)26組成的組中選擇的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，Y’包括從序列號(hào)16，序列號(hào)17，序列號(hào)18，序列號(hào)19，序列號(hào)20，序列號(hào)21，序列號(hào)22和序列號(hào)23組成的組中選擇的氨基酸序列。
在特殊的實(shí)施方案中，藥物融合物包括與血清白蛋白結(jié)合的dAb和人IL-1ra(如，序列號(hào)28)。優(yōu)選地，dAb結(jié)合人血清白蛋白并包含人結(jié)構(gòu)區(qū)域。
在其它實(shí)施方案中，藥物融合物或藥物結(jié)合物包括的人IL-1ra功能性變體至少有大約80％，或至少有大約85％，或至少有大約90％，或至少有大約95％，或至少有大約96％，或至少有大約97％，或至少有大約98％，或至少有大約99％的氨基酸序列與人IL-1ra的成熟的152個(gè)氨基酸形式和人白介素-11型受體拮抗劑相同。(見(jiàn)，Eisenberg等，Nature 343341-346(1990)。)突變體包括一個(gè)或更多個(gè)另外的氨基酸(如，包括153或154或更多氨基酸)。本發(fā)明的藥物融合物可以用任意合適的方法來(lái)制備。如，在某些實(shí)施方案中可以通過(guò)在合適的表達(dá)載體中插入編碼藥物融合物的核酸來(lái)制備。作為結(jié)果的結(jié)構(gòu)隨后被介導(dǎo)入合適的細(xì)胞用于表達(dá)。表達(dá)后，使用合適的方法，融合蛋白可以從細(xì)胞溶解產(chǎn)物，或優(yōu)選地從培養(yǎng)基或外周胞質(zhì)中分離或純化。(見(jiàn)，如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel，F(xiàn).M.等，eds.，Vol.2，Suppl.26，pp.16.4.1-16.7.8(1991))。
合適的表達(dá)載體可以包括許多成分，如，復(fù)制起點(diǎn)，選擇性標(biāo)記基因，一種或更多表達(dá)控制元件，如，轉(zhuǎn)錄控制元件(如，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，終止子)和/或一種或更多翻譯信號(hào)，信號(hào)序列或前導(dǎo)序列，等類(lèi)似物。如果存在，載體或其它資源可以提供表達(dá)控制元件和信號(hào)序列。如，編碼抗體鏈的克隆核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯控制序列能用于指導(dǎo)表達(dá)。
啟動(dòng)子能用于在希望的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。啟動(dòng)子可以是結(jié)構(gòu)型的或誘導(dǎo)型的。如，啟動(dòng)子可以與編碼抗體，抗體鏈或其部分的核酸相連，從而指導(dǎo)核酸的轉(zhuǎn)錄。各種合適的原核啟動(dòng)子(如，lac，tac，E.coli的T3，T7啟動(dòng)子)和真核啟動(dòng)子(如，肉瘤病毒40的早期或晚期啟動(dòng)子，Rous肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)啟動(dòng)子，細(xì)胞巨化病毒啟動(dòng)子，腺病毒晚期啟動(dòng)子)可以通過(guò)購(gòu)買(mǎi)得到。
此外，典型地，表達(dá)載體包括一種用于選擇帶有載體的宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記，在載體為可復(fù)制的表達(dá)載體情況下，包括一個(gè)起點(diǎn)或復(fù)制點(diǎn)。編碼抗菌或藥物抗性產(chǎn)物的基因是普遍的可選擇性標(biāo)記并可以用于原核(如，內(nèi)酰胺酶基因(氨芐青霉素抗性)，針對(duì)四環(huán)素抗性的Tet基因)和真核細(xì)胞(如，新霉素(G418或geneticin)，gpt(霉酚酸)，氨芐青霉素，或潮霉素抗性基因)。吲哚滿(mǎn)還原酶標(biāo)記基因允許在各種宿主中選擇氨甲蝶呤。編碼宿主營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的基因產(chǎn)物的基因(如，LEU2，URA3，HIS3)經(jīng)常在酵母中作為選擇性標(biāo)記。使用病毒(如，桿狀病毒)或噬菌體載體，和能夠整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組的載體，逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體，也是預(yù)期的。合適的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和原核細(xì)胞(E.coli)，昆蟲(chóng)細(xì)胞(果蠅Schnieder S2細(xì)胞，Sf9)和酵母(P.methanolica，P.pastoris，S.cerevisiae)中表達(dá)的表達(dá)載體在本領(lǐng)域熟知。
正如這里描述的，提供了表達(dá)一種藥物融合物的重組宿主細(xì)胞和制備藥物融合物的方法。重組宿主細(xì)胞包括編碼藥物融合物的重組核酸。藥物融合物可以通過(guò)在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼蛋白的重組核酸來(lái)制備，或使用其它合適的方法。如，這里描述的表達(dá)結(jié)構(gòu)可以被介導(dǎo)進(jìn)入合適的宿主細(xì)胞，而結(jié)果細(xì)胞在合適于結(jié)構(gòu)表達(dá)的條件下被維持(如，在培養(yǎng)，在動(dòng)物中)。合適的宿主細(xì)胞可以是原核的，包括細(xì)菌細(xì)胞如E.coli，B.subtilis和/或其它合適的細(xì)菌，真核的，如真菌或酵母細(xì)胞(如，畢氏酵母，黑曲霉菌株，釀酒酵母菌，裂殖酵母體系，粗糙脈孢菌)，或其它低等的真核細(xì)胞，和高等真核細(xì)胞如來(lái)源于昆蟲(chóng)的宿主細(xì)胞(如，Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞(WO 94/06087(O’Connor)或哺乳動(dòng)物(如，COS細(xì)胞，如COS-1(ATCC編目號(hào)CRL-1650)和COS-7((ATCC編目號(hào)CRL-1651)，CHO(如，ATCC編目號(hào)CRL-9096)，293(ATCC編目號(hào)CRL-1573)，HeLa(ATCC編目號(hào)CRL-2)，CV1(ATCC編目號(hào)CRL-70)，WOP(Dailey等，J.Virol.54739-749(1985))，3T3，293T(Pear等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，908392-8396(1993))，NSO細(xì)胞，SP2/0，HuT78細(xì)胞，和類(lèi)似物(見(jiàn)，如，Avsubel，F(xiàn).M.等，eds.Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and John Wiley&Son Inc.，(1993)。
本發(fā)明也包括制備藥物融合物的方法，包括在適合于藥物融合物表達(dá)的條件下維持本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞的方法。方法可以進(jìn)一步包括藥物融合物分離或收集的步驟。在另一實(shí)施方案中，藥物融合物的成分(如結(jié)合人血清白蛋白的dAb和IL-1ra)通過(guò)化學(xué)聚集以創(chuàng)建連續(xù)的多肽鏈。
結(jié)合物在另一方面，本發(fā)明提供的結(jié)合物包括與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段，其用于結(jié)合藥物。這種結(jié)合物包括“藥物結(jié)合物”，所述藥物結(jié)合物包括與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段，其與一種藥物共價(jià)結(jié)合，和“非共價(jià)藥物結(jié)合物”，所述非共價(jià)藥物結(jié)合物包括與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段，其與一種藥物非共價(jià)結(jié)合。優(yōu)選地，結(jié)合物非常穩(wěn)定從而與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段和藥物在體內(nèi)(如，當(dāng)進(jìn)入人體時(shí))仍然相互結(jié)合(無(wú)論是共價(jià)地或非共價(jià)的)。優(yōu)選地，不多于大約20％，不多于大約15％，不多于大約10％，不多于大約9％，不多于大約8％，不多于大約7％，不多于大約6％，不多于大約5％，不多于大約4％，不多于大約3％，不多于大約2％，不多于大約1％或沒(méi)有結(jié)合物在體內(nèi)分離或分解釋放藥物和抗原-結(jié)合片段。如，在“體內(nèi)”的穩(wěn)定性可以通過(guò)在血清中(如，人血清)在37℃下連續(xù)24小時(shí)孵育藥物結(jié)合物或非共價(jià)的藥物結(jié)合物而方便地評(píng)估。在這樣的方法的某一例子中，相等數(shù)量的藥物結(jié)合物和未結(jié)合藥物被稀釋在兩瓶不同的血清中。每瓶的一半的內(nèi)容物被速凍于-20℃，另一半在37℃下連續(xù)24小時(shí)孵育。通過(guò)合適的方法，如SDS-PAGE和/或Westernblotting，分析四個(gè)樣本。使用結(jié)合藥物的抗體，可以探測(cè)Westernblotting。如果沒(méi)有分離，在藥物結(jié)合物通道中的所有藥物停留于藥物結(jié)合物的大小上。許多其它合適的方法能用于評(píng)估“體內(nèi)”的穩(wěn)定性，如，使用合適的分析方法如，色譜(如，凝膠過(guò)濾，離子交換，倒相)，ELISA，質(zhì)譜分析法和類(lèi)似的方法，分析通過(guò)上面描述的方法制備的樣本。
藥物結(jié)合物在另一方面，本發(fā)明提供的藥物結(jié)合物包括對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性的抗體的抗原-結(jié)合片段，和共價(jià)地結(jié)合所述抗原-結(jié)合片段的藥物，附加條件藥物結(jié)合物不是單獨(dú)的連續(xù)多肽鏈。
在某些實(shí)施方案中，藥物結(jié)合物包括一種對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域(VH)，或一種對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)域(VL)和一種共價(jià)地結(jié)合所述VH或VL的藥物，附加條件藥物結(jié)合物不是單獨(dú)的連續(xù)多肽鏈。優(yōu)選地，藥物結(jié)合物包括與血清白蛋白結(jié)合的獨(dú)立的VH或與血清白蛋白結(jié)合的獨(dú)立的VL。在特定的實(shí)施方案中，包括結(jié)合人血清白蛋白的dAb的Vk和包括從序列號(hào)10，序列號(hào)11，序列號(hào)12，序列號(hào)13，序列號(hào)14，序列號(hào)15，序列號(hào)24，序列號(hào)25和序列號(hào)26組成的組中選擇的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，藥物結(jié)合物包括結(jié)合人血清清單蛋白的dAb的VH和從序列號(hào)16，序列號(hào)17，序列號(hào)18，序列號(hào)19，序列號(hào)20，序列號(hào)21，序列號(hào)22，和序列號(hào)23組成的組中選擇的氨基酸序列。
藥物結(jié)合物可以包括任何希望的藥物并可使用任意合適的方法制備。如，藥物可以結(jié)合與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段，所述片段直接地或通過(guò)一種合適的連接物在一個(gè)或更多個(gè)位置，如氨基-末端，羧基-末端或通過(guò)氨基酸側(cè)鏈間接地結(jié)合。在某一實(shí)施方案中，藥物結(jié)合物包括一種結(jié)合人血清白蛋白的dAb和一種多肽藥物(如，人IL-1ra或人IL-1ra的功能性變體)，并且多肽藥物的氨基-末端(如，人IL-1ra或人IL-1ra的功能性變體)直接地或通過(guò)合適的連接物亞基結(jié)合dAb的羧基-末端。在其它實(shí)施方案中，藥物結(jié)合物包括結(jié)合人血清白蛋白的dAb和共價(jià)結(jié)合dAb的兩種或更多種不同藥物。如，第一種藥物可以被共價(jià)地(直接或間接)結(jié)合至dAb的羧基-末端而第二種藥物可以被共價(jià)地(直接或間接)結(jié)合至氨基-末端或通過(guò)側(cè)鏈氨基酸組(如，賴(lài)氨基的ε氨基酸組)結(jié)合。這種藥物結(jié)合物可以使用熟知的選擇性耦合的方法被制備。(見(jiàn)，如，Hermanson，G.T.，Bioconj μgate Techniques，Academic PressSan Diego，CA(1996)。)可以使用多種將藥物與特異結(jié)合血清白蛋白的抗體的抗原-結(jié)合片段結(jié)合的方法。選擇的特定方法依賴(lài)于被結(jié)合的藥物。如果需要的話(huà)，包含末端功能性基團(tuán)的連接物能被用于抗原-結(jié)合片段和藥物的連接。一般而言，包含一種反應(yīng)功能性基團(tuán)(或被修飾以包含一種反應(yīng)的功能性基團(tuán))的藥物通過(guò)一種連接物或直接與結(jié)合血清白蛋白的抗體的抗原-結(jié)合片段接觸完成結(jié)合過(guò)程。在適當(dāng)?shù)臈l件下，包含(或被修飾以包含)一種化學(xué)亞基或功能性基團(tuán)的藥物與第二種化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)，從而形成一種共價(jià)結(jié)合。如果希望，合適的化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)能通過(guò)任何合適的方法加入抗原-結(jié)合片段或一種連接物。(見(jiàn)，如，Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic PressSan Diego，CA(1996)。)在本領(lǐng)域已知許多合適的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)化合物，如氨基能與親電子基團(tuán)如甲苯磺酸鹽，mesylate，鹵素基團(tuán)(氯，溴基，氟代，碘代)，N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)，等類(lèi)似物反應(yīng)。硫基能與馬來(lái)酰亞胺，碘乙酰，丙烯基鄰甲苯基，氮苯基二硫化物，5-硫醇-2-硝基安息香酸(TNB-thiol)，等類(lèi)似物反應(yīng)。醛功能基團(tuán)耦合氨基-或肼-包含分子，而疊氮基能與三價(jià)磷基團(tuán)反應(yīng)形成氨基磷酸酯或磷酸酰亞胺連接的。介導(dǎo)活性基團(tuán)進(jìn)入分子的合適的方法被本領(lǐng)域所知(見(jiàn)如，Hermanson，G.T.，Bioconj μgateTechniques，Academic PressSan Diego，CA(1996)。
在某些實(shí)施方案中，通過(guò)兩個(gè)硫醇的反應(yīng)形成二硫化合物連接，使對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性的抗體的抗原-結(jié)合片段與藥物結(jié)合。在其它實(shí)施方案中，通過(guò)磷酸酰亞胺基團(tuán)和伯胺形成異硫脲連接，使對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性的抗體的抗原-結(jié)合片段與藥物結(jié)合。
合適的連接分子可以是線(xiàn)性的或分支型的，并包括如，四甘醇，C2-C12亞烴基，-NH-(CH2)P-NH-或-(CH2)P-NH-(其中p是1-12)，-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-CH-NH-，包括1-100(尤其是1-12)個(gè)氨基酸和類(lèi)似物的多肽鏈。
非共價(jià)藥物結(jié)合物某些非共價(jià)鍵(如，氫鍵，范德華鍵)能產(chǎn)生穩(wěn)定的，高特異的分子間連接。如，通過(guò)在補(bǔ)充結(jié)合部分之間多價(jià)的非共價(jià)連接獲得的分子識(shí)別相互作用，成為許多重要的生物相互作用基礎(chǔ)，如使酶與底物的結(jié)合，抗體與抗原的識(shí)別，亞基結(jié)合受體，和多肽和肽的穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)。因此，這種弱的非共價(jià)相互作用(如，氫鍵，范德華健)能被用于對(duì)血清白蛋白有結(jié)合特異性的抗體的抗原-結(jié)合片段與藥物的相互結(jié)合。
優(yōu)選地，連接抗原-結(jié)合片段和藥物的非共價(jià)鍵是足夠穩(wěn)定的以至于其在體內(nèi)仍保持相互結(jié)合(如，當(dāng)被注射進(jìn)入人體)。通常，連接抗原-結(jié)合片段和藥物的非共價(jià)鍵的強(qiáng)度大約是1010M-1。在特殊的實(shí)施方案中，非共價(jià)鍵的強(qiáng)度大約是1011M-1，大約是1012M-1，大約是1013M-1，大約是1014M-1，大約是1015M-1。已知在生物素和抗生物素蛋白之間及生物素和抗生蛋白鏈菌素之間的這種相互作用是非常有效的且在許多條件下十分穩(wěn)定，且正如這里描述的在生物素和抗生物素蛋白之間和生物素和抗生蛋白鏈菌素之間的這種相互作用能被用于制備本發(fā)明的非共價(jià)藥物結(jié)合物。
非共價(jià)鍵能在對(duì)血清白蛋白有結(jié)合特異性的抗體的抗原-結(jié)合片段與藥物之間直接地形成，或能在合適的補(bǔ)充結(jié)合部分之間形成(如生物素和抗生物素蛋白之間或生物素和抗生蛋白鏈菌素之間)，其中某一部分共價(jià)地結(jié)合藥物而補(bǔ)充結(jié)合部分共價(jià)地結(jié)合抗原-結(jié)合片段。當(dāng)補(bǔ)充結(jié)合部分被使用時(shí)，某一結(jié)合部分能直接或通過(guò)合適的連接亞基共價(jià)地結(jié)合藥物，而補(bǔ)充結(jié)合部分能直接或通過(guò)合適的連接亞基共價(jià)地結(jié)合與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合部分。
補(bǔ)充結(jié)合配對(duì)是選擇性地相互結(jié)合的分子對(duì)。許多補(bǔ)充結(jié)合配對(duì)被本領(lǐng)域所知，如，抗體(或其抗原-結(jié)合片段)和其同類(lèi)的抗原或表位，酶和其底物，及受體和其配基。優(yōu)選的補(bǔ)充結(jié)合配對(duì)是生物素和抗生物素蛋白，及生物素和抗生蛋白鏈菌素。
針對(duì)特異結(jié)合血清白蛋白的抗原-結(jié)合片段或藥物的補(bǔ)充結(jié)合對(duì)的成員，其直接或間接共價(jià)結(jié)合可以通過(guò)上述方法被制備，如，通過(guò)使用或不使用連接物將補(bǔ)充結(jié)合部分與結(jié)合血清白蛋白的抗體的抗原-結(jié)合片段反應(yīng)，該補(bǔ)充結(jié)合部分包括一種反應(yīng)功能基團(tuán)(或被修飾以包含反應(yīng)功能基團(tuán))。特殊方法的選擇依賴(lài)于被結(jié)合的化合物(如，藥物，補(bǔ)充結(jié)合配對(duì)，與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段)。如果需要的話(huà)，包含末端反應(yīng)的功能基團(tuán)的連接(如，同型雙功能基化合物連接，異型雙功能基化合物連接)可以被用于抗原-結(jié)合片段和/或藥物與補(bǔ)充結(jié)合配對(duì)的連接。在某一實(shí)施方案中，包含兩個(gè)明顯反應(yīng)亞基的異型雙功能基化合物連接能被使用。異型雙功能基化合物連接能被選擇以至于某一反應(yīng)亞基可以與對(duì)血清白蛋白有結(jié)合特異性的抗體的抗原-結(jié)合片段或藥物反應(yīng)，而其它的反應(yīng)亞基可以與補(bǔ)充結(jié)合部分反應(yīng)。任何合適的連接(如異型雙功能基化合物連接)能被使用并且許多這種亞基被本領(lǐng)域所知且可通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)得(如，Pierce Biotechnology，Inc.IL)。
組合物及治療和診斷的方法提供了包括本發(fā)明的藥物組合物的組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)，包括制藥學(xué)上的或生理學(xué)上的組合物(如，人和/或獸用藥)。制藥學(xué)或生理學(xué)組合物包括一種或更多藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)，及制藥學(xué)或生理學(xué)可接受載體。典型地，這些載體包括水的或酒精/水的溶液，乳液或懸浮液，包括鹽和/或帶緩沖的媒介。腸道外的媒介包括氯化鈉溶液，Ringer’葡萄糖，葡萄糖和氯化鈉和Ringer’s乳酸鹽。合適的生理學(xué)-可接受的輔劑，如果需要保持多肽復(fù)合物的懸浮劑的形式，可以選擇如羧甲纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，凝膠和藻酸鹽等增稠劑。靜脈內(nèi)介質(zhì)包括流動(dòng)的和有營(yíng)養(yǎng)的補(bǔ)充物和電解補(bǔ)充物，如基于Ringer’s的葡萄糖。也可以存在防腐劑和其它添加劑，如抗菌劑，抗氧化劑，鰲合藥物和惰性氣體(Mack(1982)Remington’s PharmaceuticalSciences，16th Edition)。
組合物可以包括一種希望數(shù)量的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)。如，組合物可以包含大約5％-大約99％重量的藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物或藥物融合物。在特殊的實(shí)施方案中，組合物可以包括大約10％-大約99％，大約20％-大約99％，大約30％-大約99％，大約40％-大約99％，大約50％-大約99％，大約60％-大約99％，大約70％-大約99％，大約80％-大約99％，大約90％-大約99％，大約95％-大約99％重量的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)。在某一例子中，組合物是冷凍干燥(凍干的)。
這里描述的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)，典型地用于阻止，抑制或治療炎癥情況(如，急性和/或慢性的炎癥疾病)，如慢性阻塞性肺炎(如，慢性支氣管炎，慢性阻塞性支氣管炎，肺氣腫)，過(guò)敏的超敏性，癌，細(xì)菌或病毒感染，肺炎，如細(xì)菌性肺炎(如，由葡萄球菌引起的肺炎))，自體免疫疾病(其包括，但不限于，I型糖尿病，多元硬化病，關(guān)節(jié)炎(如，骨關(guān)節(jié)炎，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，少年風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病關(guān)節(jié)炎，狼瘡性關(guān)節(jié)炎，脊柱關(guān)節(jié)病(如，強(qiáng)直性脊柱炎)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，腸內(nèi)炎癥疾病(如，Crohn’s疾病，潰瘍性結(jié)腸炎)，Behcet’s綜合癥和重癥肌無(wú)力)，子宮內(nèi)膜異位，牛皮癬，腹腔粘連(如，腹腔手術(shù)后遺癥)，哮喘，和感染性休克。這里描述的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)，能被用于阻止，抑制或治療疾病，如慢性或急性外傷疾病，慢性或急性神經(jīng)疾病，急性或慢性肌與骨骼疾病，慢性或急性癌癥及類(lèi)似疾病。這里描述的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)，能作為診斷的目的而被使用。
使用這里描述的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)的藥物結(jié)合物，藥物融合物)，能阻止，抑制或治療癌癥，包括淋巴瘤(如，B細(xì)胞淋巴瘤，急性骨髓淋巴瘤，Hodgkin’s淋巴瘤，非-Hodgkin’s淋巴瘤)，骨髓瘤(如，多元骨髓瘤)，肺癌(如，小細(xì)胞肺癌，非-小細(xì)胞肺癌)，直腸癌，頭和頸癌，胰腺癌，肝癌，胃癌，胸癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病(如，急性骨髓性白血病，慢性骨髓性白血病，急性淋巴細(xì)胞的白血病，慢性淋巴細(xì)胞的白血病)，腺癌，直腸癌，造血癌(如，骨髓增生異常綜合癥，骨髓及外骨髓增殖的疾病(如，真性紅血球增多癥，原發(fā)性血小板增多癥，先天性骨髓纖維變性)，及類(lèi)似疾病。
這里描述的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)也合適用于阻止，抑制或治療子宮內(nèi)膜異位，纖維癥，不育性，早產(chǎn)，勃起功能障礙，骨質(zhì)疏松癥，糖尿病(如，II型糖尿病)，生長(zhǎng)疾病，HIV感染，呼吸疾病綜合癥，腫瘤和遺尿。
在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“阻止”包括在疾病感染之前施用保護(hù)組合物?！耙种啤敝冈诟腥臼录l(fā)生后，但是在臨床疾病出現(xiàn)之前，施用組合物。“治療”包括在疾病癥狀明顯后施用保護(hù)組合物。
用于篩選保護(hù)或治療疾病的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)的效用的動(dòng)物模型可購(gòu)買(mǎi)得到。在易感老鼠中測(cè)試系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的方法被本領(lǐng)域所知(Knight等(1978)J.Exp.Med.，1471653；Reinersten等(1978)New Eng.J.Med.，299515)。通過(guò)引入其它物種的可溶性AchR蛋白而誘導(dǎo)產(chǎn)生疾病，在SJL/J雌鼠中測(cè)定Myasthenia Gravis(MG)。(Lindstrom等(1988)Adv.Immunol.，42233)。通過(guò)注射II型膠原質(zhì)在易感小鼠種類(lèi)中誘導(dǎo)產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎(Surart等(1984)Ann.Immunol.42233)。通過(guò)注射分枝桿菌熱休克蛋白在易感大鼠中誘導(dǎo)佐劑性關(guān)節(jié)炎的模型已經(jīng)被描述(Van Eden等(1988)Nature，331171)。治療骨關(guān)節(jié)炎的效率可以在通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射膠原酶誘導(dǎo)產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎的鼠科模型中被評(píng)估(Blom，A.B.等，Oateoarthritis Carlilage 12627-635(2004)。正如描述的，通過(guò)施用甲狀腺球蛋白在小鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生甲狀腺炎(Maron等(1980)J.Exp.Med.，1521115)。胰島素依賴(lài)型糖尿病(IDDM)可以自然發(fā)生或能在特定的小鼠種類(lèi)中誘導(dǎo)，如由Kanasawa等(1984)Diabetologia，27113中描述的。EAE在小鼠和大鼠中作為在人中的MS的模型。在這種模型中，通過(guò)施用髓鞘堿性蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)脫髓鞘疾病(見(jiàn)，Paterson(1986)Texbook of Immunopathology，Mischer等，eds.，Grune and Stratton，New York，pp.179-213；McFarlin等(1973)Science，179478and Satoh等(1987)J.Immunol.，138179)。
本發(fā)明的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)可以作為單獨(dú)藥物施用或和其它藥物聯(lián)合使用。包括各種免疫治療藥物，如，cylcosporine，氨甲蝶呤，阿霉素，順鉑，免疫毒素和類(lèi)似物。制藥學(xué)組合物可以包括各種細(xì)胞毒素或其它與本發(fā)明的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)聯(lián)合的藥物的“混合”物，或根據(jù)目前發(fā)明的包括不同藥物的藥物組合物((如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)的合并。
根據(jù)任何合適的技術(shù)，藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)可以被施用入任何個(gè)人或病人。依賴(lài)于藥物組合物和治療的疾病或情況不同，用藥的不同途徑包括，如，口服，飲食，局部，透皮，直腸的，注射(如，靜脈內(nèi)的，動(dòng)脈內(nèi)的，肌肉內(nèi)的，皮下的，皮內(nèi)的，腹膜內(nèi)，胸內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)注射)，吸入(例如，支氣管內(nèi)，鼻腔或口腔內(nèi)吸入，鼻內(nèi)點(diǎn)滴)。正如需要，給藥可以是局部的或全身的。給藥的優(yōu)選的模式依賴(lài)于藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)的選擇，和治療情況(如，疾病)可以是不同的。給藥的劑量和頻率依賴(lài)于年齡，性別和病人的條件，協(xié)同注射的其它藥物，禁忌癥和其它臨床醫(yī)生考慮的參數(shù)。藥物組合物的治療有效劑量(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)被施用。治療有效劑量是在給藥條件下獲得希望的治療效果的劑量。
這里定義的術(shù)語(yǔ)“主體”或“個(gè)體”包括動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，包括，但不限于，靈長(zhǎng)目(人)，牛，綿羊，山羊，馬，狗，貓，兔子，豚鼠，大鼠，小鼠或其它牛，羊，馬，犬，貓，嚙齒目的或鼠科物種。
藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)能作為中性組合物或鹽被施用。通過(guò)與合適的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸，如氯化氫，溴化氫，醋酸，高氯酸等類(lèi)似物反應(yīng)，組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)的鹽包括胺或其它能獲得的堿性基團(tuán)。帶有季銨基團(tuán)的化合物也含有抗陰離子劑如，氯化物，溴化物，碘化物，醋酸鹽，高氯酸鹽等類(lèi)似物。包含羧酸或其它酸性功能基團(tuán)的化合物的鹽類(lèi)可以通過(guò)與合適的基團(tuán)，如，羥基反應(yīng)來(lái)制備。酸性功能基團(tuán)的鹽含有抗陰離子劑如鈉，鉀等類(lèi)似物。
本發(fā)明也提供了給主體(如病人)施用藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)的試劑盒，包括藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)，藥物輸送裝置和，可選擇地，使用說(shuō)明書(shū)。藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)可以某種形式提供，如凍干形式。在特定的實(shí)施方案中，藥物輸送裝置從注射器，吸入器，鼻內(nèi)的或眼睛的給藥裝置(如，mister，眼睛或鼻子的點(diǎn)滴器)，和無(wú)針注射裝置組成的組中選擇。
本發(fā)明的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)能被凍干存儲(chǔ)且在使用前在合適的容器中復(fù)溶。任何合適凍干的方法(如，噴霧干燥，原絲烘干)和/或復(fù)溶技術(shù)都可以被使用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)為凍干和復(fù)溶可以導(dǎo)致抗體活性不同程度的丟失(如，傳統(tǒng)的免疫球蛋白，IgM抗體比IgG抗體的活性丟失更多)且不得不通過(guò)調(diào)整使用水平而獲得補(bǔ)償。在特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，其包括如這里描述的一種凍干的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)。優(yōu)選地，凍干的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)在復(fù)溶時(shí)，丟失的活性不多于20％，或不多于25％，或不多于30％，或不多于35％，或不多于40％，或不多于45％，或不多于50％(如針對(duì)血清白蛋白的結(jié)合活性)?；钚允窃谒幬锝M合物凍干前需要產(chǎn)生效果的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)的劑量。如，藥物結(jié)合物或藥物融合物在希望的時(shí)期內(nèi)需要取得或維持希望的血清濃度的劑量。在凍干前任何合適的方法可以用于測(cè)定藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)的活性，且在復(fù)溶后使用相同的方法測(cè)定活性以測(cè)得丟失的活性的數(shù)量。
包括藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)或其混合物的組合物能被用藥從而起到預(yù)防和/或治療的作用。在特定的治療應(yīng)用中，在給藥的情況下，被選細(xì)胞群足夠起到預(yù)期治療或預(yù)防效果的劑量，如至少局部阻止，抑制，調(diào)控，殺死，或其它可測(cè)參數(shù)，被定義為“治療-有效數(shù)量或劑量”。需要取得的這種劑量的數(shù)量依賴(lài)于疾病的嚴(yán)重程度和病人自身免疫系統(tǒng)的普通狀態(tài)和健康情況，但是大致的范圍從大約10μg/kg至大約80mg/kg，或大約每千克重含0.005至5.0mg的藥物結(jié)合物或藥物融合物，0.05至2.0mg/kg/dose的劑量是被普遍使用的。如，本發(fā)明的藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)可以每天(如，每天4次注射)，每?jī)商?，每三天，一周兩次，一周一次，兩周一次，一個(gè)月一次，或兩個(gè)月一次，按10μg/kg-80mg/kg，大約100μg/kg-80mg/kg，大約1mg/kg-80mg/kg，大約1mg/kg-70mg/kg，大約1mg/kg-60mg/kg，大約1mg/kg-50mg/kg，大約1mg/kg-40mg/kg，大約1mg/kg-30mg/kg，大約1mg/kg-20mg/kg，大約1mg/kg-10mg/kg，大約10μg/kg-10mg/kg，大約10μg/kg-5mg/kg，大約10μg/kg-2.5mg/kg，大約1mg/kg，大約2mg/kg，大約3mg/kg，大約4mg/kg，大約5mg/kg，大約6mg/kg，大約7mg/kg，大約8mg/kg，大約9mg/kg，大約10mg/kg的劑量被注射。
在預(yù)防應(yīng)用中，包括藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)或其混合物的組合物也可以以相似的或稍低的劑量給藥。根據(jù)目前的發(fā)明，包括藥物組合物(如，藥物結(jié)合物，非共價(jià)藥物結(jié)合物，藥物融合物)的組合物可以用于預(yù)防和治療以幫助改變，鈍化，殺死或清除哺乳動(dòng)物中的選擇性靶標(biāo)細(xì)胞。
實(shí)施例白介素1受體拮抗劑(IL-ra)是一種通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制IL-1與白介素-1型1受體(IL-1R1)的結(jié)合來(lái)阻止IL-1的生物活性的拮抗劑。炎癥刺激和包括發(fā)炎和免疫學(xué)反應(yīng)的各種生理性反應(yīng)的調(diào)節(jié)能誘導(dǎo)IL-1產(chǎn)生。IL-1具有的活性范圍包括軟骨的降解和骨骼再吸收的刺激。在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人中，局部產(chǎn)生IL-1的數(shù)量被提高并且自然出現(xiàn)IL-1ra的水平是不足以競(jìng)爭(zhēng)這些反常增加的數(shù)量。有一些對(duì)RA有用的治療方法，包括疾病調(diào)節(jié)風(fēng)濕病藥(DMARDS)如，氨甲蝶呤，和生物制劑如KINERET(anakinra，Amgen Inc)。
KINERET(anakinra，Amgen Inc)是一種重組物，由153個(gè)氨基酸組成并具有17.3kilodaltons分子量，是人白介素-1受體拮抗劑的非糖基化形式。(KINETET(anakinra，Amgen Inc)對(duì)應(yīng)于在自然出現(xiàn)的IL-1ra中的152個(gè)氨基酸和額外的N-末端的甲硫氨酸。)在對(duì)一種或多種DMARDs失效的18歲或更大年齡的病人中，KINERET(anakinra，Amgen Inc)被用來(lái)減少?lài)?yán)重風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的征兆和病癥程度。劑量為每天單劑量皮下注射100mgs。Tβ1/2為4-6小時(shí)并且在14-28天71％病人在注射部位具有反應(yīng)。
我們?cè)谶@里示范了一種血清-清蛋白結(jié)合物dAb與治療多肽相連接形成的化合物，其(i)具有與治療多肽相似的活性(ii)也與血清白蛋白結(jié)合。而且，目前的發(fā)明提供了一種方法來(lái)制備更長(zhǎng)血清半衰期的治療多肽，如我們將血清白蛋白結(jié)合物dAb與IL-1ra相連產(chǎn)生的化合物的半衰期長(zhǎng)于單獨(dú)的IL-1ra。
實(shí)施例1結(jié)合小鼠，大鼠和人血清白蛋白的區(qū)域抗體的選擇這個(gè)實(shí)施例解釋了針對(duì)血清白蛋白的單獨(dú)區(qū)域抗體(dAb)的制備方法。描述了針對(duì)小鼠血清白蛋白(MSA)，人血清白蛋白(HSA)和大鼠血清白蛋白(RSA)的dAb的選擇。
如在W02004/003019A2中所描述選擇針對(duì)小鼠血清白蛋白的dAbs。使用了三種人噬菌體顯示抗體文庫(kù)。每一文庫(kù)基于單獨(dú)的人VH(V3-23/DP47和JH4b)或Vk(o12/o2/DPK9和Jκ)結(jié)構(gòu)，其與補(bǔ)充決定區(qū)域(CDR1，CDR2，CDR3)合并的側(cè)鏈上帶有由NNK密碼子編碼的差異。
文庫(kù)1(VH)差異位置H30，H31，H33，H35，H50，H52，H52a，H53，H55，H56，H58，H95，H97，H98。
文庫(kù)位置6.2×109文庫(kù)2(VH)差異位置H30，H31，H33，H35，H50，H52，H52a，H53，H55，H56，H58，H95，H97，H98，H99，H100，H100A，H100B。
文庫(kù)位置4.3×109文庫(kù)3(Vk)差異位置L30，L31，L32，L34，L50，L53，L91，L92，L93，L94，L96文庫(kù)位置2×109VH和Vk文庫(kù)已經(jīng)通過(guò)預(yù)選分別結(jié)合基因亞基蛋白A和蛋白L，因此在選擇文庫(kù)中大部分的克隆是有功能的。上面所示的文庫(kù)的大小對(duì)應(yīng)于預(yù)選后的大小。
使用獨(dú)立文庫(kù)進(jìn)行血清白蛋白的兩輪選擇。對(duì)于每一選擇，抗原被包被在100μg/ml的4mlPBS免疫管中。在第一輪選擇中，三種文庫(kù)的每一文庫(kù)針對(duì)HSA(Sigma)或MSA(Sigma)被單獨(dú)地包被。在第二輪選擇中，從第一輪選擇的六種噬菌體被包被，針對(duì)(i)相同的抗原(如，第一輪的MSA，第二輪的MSA)和(ii)針對(duì)相互作用的抗原(如，第一輪的MSA，第二輪的HSA)結(jié)果產(chǎn)生第二輪選擇的12種結(jié)果。在每一例子中，在第二輪的選擇后測(cè)試48種克隆與HSA和MSA的結(jié)合。可溶的dAb片段正如由Harrison et al，Methods Enzymol.1996；26783-109所描述作為scFv片段被制備，并且隨后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的ELISA方案(Hoogenboom等1991)Nucleic Acids Res.，194133)，除了使用的2％tween PBS作為抑制緩沖液，及用蛋白質(zhì)L-HRP(Sigma)(針對(duì)VkS)和蛋白A-HRP(Amersham Pharmacia Biotech)(針對(duì)VHS)測(cè)定結(jié)合的dAbs。
一種高于背景的信號(hào)顯示了與MSA，HSA或其兩者結(jié)合的dAbs，將以可溶的形式結(jié)合塑料并在ELISA中被測(cè)試，但其所有都是血清白蛋白特異的?？寺⊥ㄟ^(guò)測(cè)序(見(jiàn)表1)揭示21種唯一的dAb序列被鑒定。在選擇的VkdAb克隆之間，氨基酸水平最小的相似性為86.25％((69/80)×100；當(dāng)所有的各種殘基是不同的結(jié)果，如克隆24和34)。在選擇的VHdAb克隆之間，氨基酸水平最小的相似性為94％(127/136)×100)。
下面，結(jié)合dAbs的血清白蛋白被測(cè)試其從溶液中捕獲生物素化抗原的能力。ELISA方案(如上所述)隨后被執(zhí)行，除了ELISA板包被了1μg/ml的蛋白L(針對(duì)Vk克隆)和1μg/ml蛋白A(針對(duì)VH克隆)。按照方案，可溶的dAb從溶液中被捕獲，并用生物素標(biāo)記的MSA或HSA和鏈霉親和素標(biāo)記的HRP測(cè)定。以每血清白蛋白分子獲得平均2個(gè)生物素為目標(biāo)，根據(jù)制造商的方案制備生物素化的MSA和HSA。通過(guò)ELISA測(cè)定了捕獲溶液中生物素化MSA的24個(gè)克隆。這些中的兩個(gè)克隆(克隆2和38)同時(shí)捕獲HSA。接著，dAbs被測(cè)試其與包被在CM5 biacore芯片上的MSA結(jié)合的能力。在biacore上，八種克隆被發(fā)現(xiàn)結(jié)合MSA。
正如先前所描述的針對(duì)抗-MSA的dAbs，針對(duì)人血清白蛋白和大鼠血清白蛋白的dAbs被選擇，除了下面方案的修正合成的VH區(qū)域的噬菌體文庫(kù)是文庫(kù)4G，其基于包含DP47種系基因和JH4片段的人VH3。下面特異位點(diǎn)的差異通過(guò)突變(使用NNK密碼子；根據(jù)Kabat標(biāo)號(hào))而引入，如CDR130，31，33，35；CDR250，52，52a，53，55，56；和CDR34-12的各種殘基如H95，H96，H97，和H98在4GH11和H95，H96，H97，H98，H99，H100，H100a，H100b，H100c，H100d，H100e和H100f在4GH19。最后的3種CDR3殘基是FDY因此CDR3的長(zhǎng)度的變化范圍為7-15殘基。文庫(kù)包括了＞1×1010種獨(dú)立的克隆。
VH和Vk文庫(kù)的子集已經(jīng)被預(yù)選分別結(jié)合種屬配基蛋白A和蛋白L，因此在未選擇的文庫(kù)中大多數(shù)的克隆是功能性的。上述顯示的文庫(kù)的大小與預(yù)選后的大小相應(yīng)。
分別使用VH和Vk文庫(kù)的亞類(lèi)對(duì)大鼠和人血清白蛋白進(jìn)行兩輪選擇。對(duì)于每一選擇，抗原可以(i)以100μl/ml濃度溶于4mlPBS并包被于免疫管(nunc)中，或(ii)被生物標(biāo)記并隨后被生物素珠(第一步)和抗生物素蛋白珠(第二步)捕獲，用于可溶形式的選擇。(見(jiàn)表1用于分離每個(gè)克隆的選擇策略的詳細(xì)描述。)在每一例子中，在第二輪選擇后，24個(gè)噬菌體克隆被測(cè)試其結(jié)合HSA或RSA的能力。
在其中的一輪選擇中，在噬菌體ELISA中，如果克隆的大部分是陽(yáng)性，則來(lái)源于這一選擇的DNA被克隆進(jìn)入表達(dá)載體制備可溶性dAb，且挑選單個(gè)克隆。按Harrison等描述的制備scFv片段(Methods Enzymol.1996；26783-109)的方法，制備可溶性dAb片段并且隨后執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)的ELISA方案(Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.，194133)，除了使用2％的TWEEN PBS作為封閉緩沖液及用抗-myc-HRP測(cè)定結(jié)合的dAbs。在ELISA中呈陽(yáng)性的克隆，隨后使用BIACORE表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振儀(Biacore AB)篩選結(jié)合MSA，RSA或HSA的克隆。結(jié)合MSA，RSA或HSA的dAbs被進(jìn)一步研究?？寺‰S后被測(cè)序并且唯一的dAb序列被鑒定。
表1.結(jié)合血清白蛋白的dAbs的選擇方案


與BIACORE芯片上(Biacore AB)的血清白蛋白結(jié)合的dAbs被進(jìn)一步分析以獲得關(guān)于親合力的信息。分析通過(guò)使用包被了血清白蛋白的CM5芯片(羧甲基右旋糖苷基質(zhì))進(jìn)行。流動(dòng)細(xì)胞1是未包被的，封鎖的陰性對(duì)照，流動(dòng)細(xì)胞2被HSA包被，流動(dòng)細(xì)胞3被RSA包被而流動(dòng)細(xì)胞4被MSA包被。使用BIACORE包被液，血清白蛋白被固定在PH為5.5的醋酸鹽的緩沖液中，達(dá)到500共振單位(Rus)包被材料的目標(biāo)。每一感興趣的dAb在200ml-500ml的E.coli周質(zhì)中表達(dá)，且用PH為2.2的氨基乙酸和PBS交換緩沖液洗脫，對(duì)VHs使用蛋白質(zhì)A-streamline親合樹(shù)脂(Amersham，UK)，對(duì)Vks使用蛋白質(zhì)L-瓊脂糖親合樹(shù)脂(Affitech，Norway)從上清中分離分批吸收。通過(guò)在BIACOREHBS-EP緩沖液中稀釋并流經(jīng)BIACORE芯片，制備一系列濃度的dAb(在5nM至5uM范圍)。
在KD的范圍內(nèi)濃縮dAb獲得數(shù)據(jù)，親合力(KD)將通過(guò)數(shù)據(jù)的親和速率和解離速率曲線(xiàn)的相稱(chēng)性從BIACORE數(shù)據(jù)中計(jì)算。測(cè)定對(duì)血清白蛋白有不同親合力的dAbs。針對(duì)HSA的DOM7h-8，針對(duì)HSA的DOM7h-2，針對(duì)RSA的DOM7r-1的親合力在10-100nM范圍內(nèi)。針對(duì)HSA的DOM7h-7，針對(duì)RSA的DOM7h-8，針對(duì)HSA的DOM7h-26的親合力在100-500nM范圍內(nèi)。針對(duì)HSA的DOM7h-23，針對(duì)HSA的DOM7h-1的親合力在500nM-5uM范圍內(nèi)。實(shí)施例的數(shù)據(jù)包括在圖6A-6C中。
實(shí)施例2.制備帶有IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)的抗-血清白蛋白抗體融合蛋白本實(shí)施例表述了制備包含IL-1ra和結(jié)合血清白蛋白的dAb的融合蛋白的方法。制備兩種融合蛋白，一種在dAb N-末端帶有IL-1ra(MSA16IL-1ra)和一種在dAb C-末端帶有IL-1ra(IL-1raMSA16)。融合蛋白的序列和載體在圖2C和2D中顯示。同時(shí)也制備不結(jié)合MSA的對(duì)照融合蛋白，其序列在圖2E中顯示。
KINERET(anakinra，Amgen Inc)具有4-6小時(shí)的短半衰期，推薦劑量要求稱(chēng)為每日注射。這種要求導(dǎo)致71％的案例在14-28天中產(chǎn)生注射位點(diǎn)反應(yīng)。因此，具有較長(zhǎng)血清半衰期的人IL-1ra的形式是有利的并且能提高功效和降低劑量頻率。這些都是制藥學(xué)希望的特性。
克隆簡(jiǎn)要地，正如下面描述，設(shè)計(jì)兩種多克隆位點(diǎn)(MCSs)并且插入帶有T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體中。設(shè)計(jì)限制性位點(diǎn)用于插入IL1-ra，dAb，GAS引導(dǎo)序列和連接物。其中一種(MCS1+3)編碼帶有IL-1ra dAb N末端的蛋白而另一(MCS 2+4)編碼帶有IL-1ra dAb C末端的蛋白。
dAbIL1-ra融合蛋白的克隆位點(diǎn)1+3NdeI，stuffer，SalI，stuffer，XhoI，BamHIgcgcatatgttagtgcgtcgacgtcaaaaggccatagcgggcggccgctgcaggtctcgagtgcgatggatcc(序列號(hào)35)IL-1ra dAb融合蛋白的克隆位點(diǎn)2+4NdeI，stuffer，StUI，SacI，sutffer，SalI，NotI，TAA TAA BamHIGcgcatatgttaagcgaggccttctggagagagctcaggagtgtcgacggacatccagatgacccaggcggccgctaataaggatccaatgc(序列號(hào)36)
使用合適的限制性?xún)?nèi)切酶剪切MCS及連接編碼引導(dǎo)序列的退火啟動(dòng)子，GAS引導(dǎo)序列被插入每一表達(dá)載體。接著，編碼連接子的連接DNA以相似的方式被插入。從一種cDNA克隆通過(guò)PCR獲得編碼IL-1ra的DNA(使用經(jīng)設(shè)計(jì)增加所需限制性位點(diǎn)的引物)且被插入TOPO克隆載體。通過(guò)核酸測(cè)序確定正確的序列后，從TOPO載體切離編碼IL-1ra的DNA且連接入包含引導(dǎo)序列和連接物的載體。最后，通過(guò)SalI/NotI對(duì)片段(通過(guò)凝膠純化提純)和載體酶切，從dAb表達(dá)載體切離編碼dAb的DNA并插入載體中。
表達(dá)和純化MSA16IL 1-ra，IL1-ra MSA16和dummyIL-1ra在E.coli周質(zhì)表達(dá)，并使用蛋白質(zhì)L-瓊脂糖親合樹(shù)脂(Affitech，Norway)用PH為2.2的氨基乙酸洗脫，從上清中分批吸收純化。在考馬斯染色后，通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳分析純化dAbs。對(duì)于一種蛋白質(zhì)(IL-1raMSA16)，＞90％的蛋白質(zhì)具有預(yù)期的大小因此不用進(jìn)一步純化被即可進(jìn)行活性分析。其它蛋白質(zhì)(MSA16IL1-ra和dummyIL-1ra)受較小的條帶污染且需在PH為9的RESOURSEQ離子交換柱上通過(guò)FPLC離子交換色譜進(jìn)一步提純。使用0-500mM線(xiàn)性鹽梯度的NaCl洗脫蛋白。在SDS-PAGE凝膠電泳后，含有預(yù)期大小蛋白質(zhì)的片段被結(jié)合從而產(chǎn)生純度＞90％的結(jié)合部分。這種蛋白被用于進(jìn)一步的純化。
實(shí)施例3.在體外測(cè)定IL1-ra融合蛋白的活性MRC-5 IL-8分析MSA16IL-1ra融合蛋白被測(cè)試其中和在MRC-5細(xì)胞中由IL-1引發(fā)的IL-8分泌的能力(ATCC Accession No.CCL-171；American Type Culture Collection，Manassas，VA)。該方法由Akeson，L.et al (1996) Journal of Biological Chemistry27130517-30523描述的方法調(diào)整而來(lái)，其介紹了在HUVEC中由IL-1引發(fā)的IL-8的分泌，使用MRC-5細(xì)胞替代HUVEC細(xì)胞系。簡(jiǎn)要地，將MRC-5細(xì)胞置于微孔板中，和dAbIL-1ra融合蛋白或作為對(duì)照的IL-1ra，和IL-1(100pg/ml)一起孵育過(guò)夜。孵育后吸出細(xì)胞上清且通過(guò)夾心ELISA測(cè)量IL-8的濃度。(R&DSystems)。
IL-1ra在融合蛋白中的活性導(dǎo)致IL-8分泌的減少。由于MSA16IL-1ra融合蛋白的活性和IL-1ra MSA16融合蛋白的活性引起的IL-8分泌的減少將與IL-1ra對(duì)照(重組體人IL-1ra，R&Dsystems)的引起的減少進(jìn)行對(duì)比。每一測(cè)試蛋白質(zhì)的中和劑量50(ND50)被測(cè)定并且顯示在表2中。
表2

結(jié)果表示，IL-1ra保留了作為帶有抗-血清白蛋白dAb的融合結(jié)構(gòu)的部分活性。MSA16IL-1ra蛋白質(zhì)被進(jìn)一步研究以評(píng)估其藥物代謝動(dòng)力學(xué)(PK研究)。
血清白蛋白，抗IL-1ra夾心ELISA測(cè)試三種dAb/IL-1ra融合蛋白結(jié)合血清白蛋白的能力并同時(shí)通過(guò)單克隆抗-IL1ra抗體測(cè)定。被測(cè)試的融合蛋白是MSA16IL-1ra，IL-1ra MSA16和dummyIL-1ra。簡(jiǎn)要地，ELISA板用10μg/ml的大鼠血清白蛋白包被過(guò)夜，用0.05％Tween PBS洗脫5次，然后用4％Marvel PBS封閉1小時(shí)。封閉后，板用0.05％Tween PBS洗脫5次，然后用4％MPBS稀釋的每種dAb IL-1ra融合蛋白孵育1小時(shí)。每一融合蛋白在1uM及7個(gè)連續(xù)的4倍稀釋(如，至60pM)濃度時(shí)被孵育。在孵育后，板用0.05％TweenPBS洗脫5次，然后根據(jù)制造商推薦的稀釋度，以4％MPBS稀釋的針對(duì)人IL-1受體拮抗劑(Abcam，UK)的兔多克隆抗體(ab-2573)稀釋液孵育1小時(shí)。孵育之后，板被用0.05％Tween PBS洗脫5次，且用4％MPBS進(jìn)行1/2000稀釋的二抗(抗-兔IgG-HRP)稀釋液孵育1小時(shí)。用二抗孵育后，板用0.05％TweenPBS洗脫3次并用PBS洗脫2次，然后用50ul每孔的TMB微孔過(guò)氧化物底物(KPL，MA)反應(yīng)并用50ul每孔的HCL終止反應(yīng)。在450nM讀取吸收值。
在超過(guò)2×背景水平的夾心ELISA中以1uM濃度測(cè)定MSA16IL-1ra和IL-1raMSA16蛋白。MSA16IL-1ra蛋白在2×或更高背景水平以低至3.9nM的稀釋液測(cè)定，而IL-1raMSA16蛋白在2×背景水平以低至500nM的稀釋液測(cè)定。據(jù)報(bào)道，由于對(duì)照結(jié)構(gòu)(dummyIL-1ra)不結(jié)合血清白蛋白，結(jié)合血清白蛋白的MSA16IL-1ra融合蛋白對(duì)血清白蛋白是特異的。
實(shí)施例4.在小鼠PK研究中測(cè)定藥物融合物的血清半衰期A.在小鼠中測(cè)定結(jié)合MSA的dAb/HA表位標(biāo)記融合蛋白的血清半衰期結(jié)合MSA的dAb/HA表位標(biāo)記融合蛋白在E.coli周質(zhì)中表達(dá)，使用蛋白質(zhì)L-瓊脂糖親合樹(shù)脂(Affitech，Norway)并且用PH為2.2的氨基乙酸洗脫，從上清中分批吸收純化。在以大約1.5mg/kg靜脈內(nèi)注射進(jìn)入CD1品系雄性動(dòng)物后，在小鼠中測(cè)定融合蛋白的血清半衰期。通過(guò)ELISA方法，使用羊抗-HA(Abcam，UK)捕獲并用4％Marvel封閉的蛋白L-HRP(Invitrogen，USA)檢測(cè)，分析融合蛋白的血清半衰期。用0.05％Tween-20，PBS洗脫。在存在1×小鼠血清時(shí)建立已知濃度的結(jié)合dAb/HA融合蛋白的MSA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以提供測(cè)試樣本間的比較。1分隔模型(WinNonlin軟件，Pharsight公司，美國(guó))顯示結(jié)合MSA的dAb/HA表位標(biāo)記融合蛋白具有29.1小時(shí)的半衰期并在曲線(xiàn)下具有559hr.μg/ml面積。這表明了與單獨(dú)的HA表位標(biāo)記多肽的預(yù)期的數(shù)分鐘半衰期相比，具有很大的提高。
運(yùn)用HA表位標(biāo)簽作為藥物模型的研究結(jié)果表明，當(dāng)藥物與結(jié)合血清白蛋白的抗體的抗原-結(jié)合片段(例如，dAb)形成融合物或共扼物時(shí)，藥物的體內(nèi)血清半衰期可以延長(zhǎng)。
在小鼠中抗-MSA dAbs DOM7m-16和DOM7m-26，和不結(jié)合MSA的對(duì)照dAb的體內(nèi)半衰期也被評(píng)估。并且，DOM7m-16，DOM7m-26和對(duì)照dAb包含HA表位標(biāo)記，作為藥物模型(如，蛋白質(zhì)，多肽或肽藥物)。在這一研究中，不結(jié)合MSA的對(duì)照dAb的體內(nèi)半衰期為20分鐘，而DOM7m-16和DOM7m-26的體內(nèi)半衰期明顯大于此半衰期。(圖12)在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)DOM7m-16在小鼠的體內(nèi)半衰期為29.5小時(shí)。
在另外的研究中，包含HA表位標(biāo)記的DOM7h-8小鼠體內(nèi)半衰期(t1/2β)也被估計(jì)。一種2分隔模型(WinNonlin軟件，Pharsight公司，美國(guó))顯示DOM7h-8具有29.1小時(shí)的t1/2β。
使用HA表位標(biāo)記作為藥物模型的每一項(xiàng)研究的結(jié)果(如，蛋白質(zhì)，多肽或肽藥物)，顯示了當(dāng)藥物被制備成帶有與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原-結(jié)合片段的藥物融合物或藥物結(jié)合物藥物時(shí)，藥物的體內(nèi)半衰期能被極大的增加。
B.測(cè)定在小鼠中結(jié)合MSA的dAb/IL-1ra融合蛋白的血清半衰期結(jié)合MSA的dAb/IL-1ra融合蛋白(MSA16IL-1ra)在E.coli周質(zhì)中表達(dá)，使用蛋白質(zhì)L-瓊脂糖親合樹(shù)脂(Affitech，Norway)并用PH為2.2的氨基乙酸洗脫，從上清中分批吸收純化。以大約1.5mg/kg靜脈內(nèi)注射進(jìn)入CD1品系雄性動(dòng)物后，測(cè)定小鼠中MSA16IL-1ra(DOM7m-16/IL-1ra)，帶有不結(jié)合MSA的dAb的IL-1ra融合蛋白(Dummy dAb/IL-1ra)，和融合HA表位標(biāo)記的抗-MSAdAb(DOM7m-16HA標(biāo)記)的血清半衰期。
通過(guò)IL-1ra夾心ELISA(R&D系統(tǒng)，USA)分析血清水平。在存在1×小鼠血清時(shí)建立已知濃度dAb/IL-1ra融合蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以提供測(cè)試樣本的比較。使用WinNonlin藥物動(dòng)力學(xué)軟件(Pharsight Corp.USA)建立模型。
預(yù)期地，當(dāng)與非-MSA結(jié)合的dAb與IL-1ra形成的融合蛋白對(duì)照相比，帶有抗-MSA dAb的IL-1ra融合蛋白的血清半衰期有極大地提高。非-MSA結(jié)合的dAb/IL-1ra融合蛋白對(duì)照預(yù)期具有短的血清半衰期。
研究的結(jié)果顯示在表3中，并顯示帶有抗-MSA dAb的IL-1ra融合蛋白(DOM7m-16/IL-1ra)與帶有不結(jié)合MSA的dAb的IL-1ra融合蛋白(Dummy dAb/IL-1ra)相比，其血清半衰期大約增長(zhǎng)了10倍。結(jié)果也揭示了，與dummy/IL-1ra(AUC1.5hr.μg/ml)相比，DOM7m-16/IL-1ra(AUC267hr.μg/ml)的濃度時(shí)間曲線(xiàn)下的面積有＞200倍的提高。
表3

這些研究的結(jié)果表明當(dāng)藥物作為帶有結(jié)合血清白蛋白的抗體的抗原-結(jié)合片段的藥物融合蛋白或藥物結(jié)合物被制備時(shí)，藥物在體內(nèi)的血清半衰期和AUC有明顯地提高。
實(shí)施例5.測(cè)定在大鼠中結(jié)合RSA的dAb/HA表位標(biāo)記融合蛋白的血清半衰期帶有C-末端HA標(biāo)記的抗-鼠血清白蛋白dAbs在E.coli周質(zhì)表達(dá)且用PH為2.2的氨基乙酸和PBS交換緩沖液洗脫，對(duì)VHS使用蛋白質(zhì)A-streamline親合樹(shù)脂(Amersham，UK)，對(duì)VkS使用蛋白質(zhì)L-瓊脂糖親合樹(shù)脂(Affitech，Norway)從上清中分離分批吸收。
為了測(cè)定血清半衰期，將大鼠分組，每組4只，以1.5mg/Kg的濃度被給予單獨(dú)i.v.施用DOM7r-27，DOM7r-31，DOM7r-16，DOM7r-3，DOM7h-8或結(jié)合非相關(guān)抗原的對(duì)照dAb(HEL4)。7天后，從尾部血管連續(xù)放血獲得血清樣本，通過(guò)在ELISA板上包被山羊抗-HA(Abcam，cambridge UK)，并隨后用蛋白質(zhì)A-HRP(針對(duì)VHdAbs)或蛋白質(zhì)L-HRP(針對(duì)VkdAbs)測(cè)定進(jìn)行夾心法ELISA分析。在存在1×小鼠血清時(shí)建立已知濃度的dAb標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以提供測(cè)試樣本的比較。使用一種2分隔模型(使用WinNonlin參數(shù)軟件(Pharsight公司，美國(guó)))計(jì)算t1/2β和曲線(xiàn)下的面積(AUC)(表4)。在鼠中HEL4對(duì)照的t1/2β為30分鐘，且基于獲得的數(shù)據(jù)，DOM7h-8預(yù)期的AUC在大約150hr.μg/ml和2500hr.μg/ml之間。
表4

使用HA表位標(biāo)記作為藥物(如蛋白質(zhì)，多肽，或肽藥物)模型進(jìn)行小鼠研究，結(jié)果表明當(dāng)藥物被制備成帶有與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原結(jié)合片段的藥物融合物或藥物結(jié)合物時(shí)，藥物的內(nèi)體的血清半衰期被極大地提高。
人體內(nèi)半衰期的預(yù)測(cè)使用異速生長(zhǎng)標(biāo)度在動(dòng)物中獲得的半衰期數(shù)據(jù)能估計(jì)dAb，藥物融合物或藥物結(jié)合物在人體內(nèi)的半衰期。根據(jù)動(dòng)物重量的log值和在3種動(dòng)物中測(cè)定的體內(nèi)半衰期的log值繪制圖表。通過(guò)描繪的點(diǎn)劃制直線(xiàn)并根據(jù)公式logY＝log(a)+blog(W)，使用直線(xiàn)的斜率和y軸的截距計(jì)算人體內(nèi)半衰期，其中Y是人體內(nèi)半衰期，log(a)是y軸的截距，b是斜率，和W是人的體重。使用體重大約為35克(如小鼠)，大約為260克(如，大鼠)和大約重2710克的動(dòng)物獲得的體內(nèi)半衰期的數(shù)據(jù)可以繪制這一直線(xiàn)。對(duì)于這種計(jì)算，人的體重可以認(rèn)為是70000克?；谠谛∈蠛痛笫笾蝎@得的半衰期的數(shù)據(jù)，在人類(lèi)中結(jié)合血清白蛋白的dAbs，如DOM7h-8的t1/2β預(yù)期為大約5.5小時(shí)至40小時(shí)，且AUC大約為150hr.μg/mL至2500hr.μg/mL。
例6.抗-SA dAb/IL-1ra藥物融合物在膠原質(zhì)引發(fā)的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)炎模型中的效用。
融合DOM7m-16/IL-1ra和IL-1ra在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中(以II型膠原質(zhì)在DBA/1小鼠中引發(fā)關(guān)節(jié)炎)的效用被評(píng)估。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，小鼠在裝有HEPA-過(guò)濾Scantainer的標(biāo)準(zhǔn)2型飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)，溫度為20-24℃，并按12-小時(shí)明亮，12-小時(shí)黑暗為一個(gè)周期。食物(Harlan-Teklad通用食物2016)和UV滅菌水被隨意提供。小鼠應(yīng)至少在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)7天前放入設(shè)備中飼養(yǎng)以保證環(huán)境適應(yīng)性。
將Arthrogen-CIA佐劑和Arthrogen-CIA膠原質(zhì)(都來(lái)源于MD biosciences)以1∶1的比例進(jìn)行乳化直至形成穩(wěn)定的乳化液，注射7-8周齡的DBA/1小鼠(來(lái)源于Taconic M and B，Domholtveg，丹麥)一次。當(dāng)乳化液加入至一大杯水中可形成固體小塊時(shí)則該乳化液被認(rèn)為是穩(wěn)定的。隨后可將乳化物注射小鼠。
乳化物注射21天后，引發(fā)關(guān)節(jié)炎最嚴(yán)重的20只動(dòng)物被挑清除出該研究，而剩余的小鼠按10只每組分組(每組含5只雄性，5只雌性)。小鼠按表5進(jìn)行治療，所治療的輸送濃度都經(jīng)計(jì)算，按10ml/Kg給藥。
表5

從21天至49天，每周3次對(duì)關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度臨床分值進(jìn)行記錄。如果個(gè)別小鼠的關(guān)節(jié)炎分值大于等于12，或具有嚴(yán)重的惡化的病癥時(shí)則進(jìn)行安樂(lè)死。
在臨床分值中，每個(gè)肢體將根據(jù)一下的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，而四個(gè)肢體的分值相加獲得小鼠的總分值。以每個(gè)小鼠具有0到16之間的分值作為該方法的結(jié)果。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0＝正常；1＝輕微但明確的踝和腕的紅腫，或限定于個(gè)別趾的明顯紅腫，而不考慮感染趾的數(shù)量；2＝中等的踝和腕的紅腫；3＝包括腳趾的整個(gè)掌的嚴(yán)重紅腫；4＝包括多個(gè)關(guān)節(jié)的肢體的最嚴(yán)重紅腫。
在治療的每一天根據(jù)個(gè)體小鼠的臨床分值對(duì)每個(gè)治療組進(jìn)行計(jì)算，獲得組平均關(guān)節(jié)炎分值。任何由于倫理原因從研究中去除的動(dòng)物將給予最大分值16。根據(jù)時(shí)間繪制組平均關(guān)節(jié)炎分值圖(圖13)。
運(yùn)用Wilcoxon試驗(yàn)對(duì)第49天的平均關(guān)節(jié)炎分值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)分析表明與鹽水對(duì)照組相比(組6)，DOM7m-16/IL-1ra(1mg/Kg或10mg/Kg(組3和4))治療的兩個(gè)組在第49天的關(guān)節(jié)炎分值具有明顯改善(明顯性水平分別為P＜1％和P＜0.05％)。相反，以1mg/Kg的IL-1ra治療的小鼠(組1)第49天的關(guān)節(jié)炎分值沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改善，而以10mg/Kg的IL-1ra治療的小鼠(組2)具有明顯的改善，其明顯性水平為P＜5％。以ENBREL(entarecept；Immunex Corporation)(組5)治療的小鼠第49天的關(guān)節(jié)炎分值具有明顯性水平P＜10％的明顯改善。
與以5mg/Kg的5ENBREL(entarecept；ImmunexCorporation)(組5)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)治療相比，以10mg/Kg劑量DOM7m-16/IL-1ra進(jìn)行治療的組(組4)，能有效地改善第49天的關(guān)節(jié)炎分值(明顯性水平為P＜0.05％)。此外，以1mg/Kg更低劑量的DOM7m-16/IL-1ra進(jìn)行治療的組(組3)，與相同劑量的IL-1ra單獨(dú)治療(組1)(明顯性水平為P＜10％)相比，能跟有效地改善第49天的關(guān)節(jié)炎分值。
本研究的結(jié)果表明特定劑量的DOM7m-16/IL-1ra比IL-1ra和5ENBREL(entarecept；Immunex Corporation)更為有效。如預(yù)期的，IL-1ra的效應(yīng)是劑量依賴(lài)的，而DOM7m-16/IL-1ra的效應(yīng)也是劑量依賴(lài)的。以1mg/Kg的DOM7m-16/IL-1ra進(jìn)行治療的平均分值要低于10mg/Kg的DOM7m-16/IL-1ra進(jìn)行治療的平均分值。這些圖示結(jié)果(圖13)表明以DOM7m-16/IL-1ra進(jìn)行治療與以IL-1ra進(jìn)行治療相比，其效果要高10倍。
DOM7m-16/IL-1ra融合蛋白具有出眾的療效，盡管其僅含有一半重量的作為IL-1受體結(jié)合表位的IL-1ra(例如，與1mgIL-1ra(MW＝17.1KD)相比，1mg DOM7m-16/IL-1ra融合蛋白(MW＝31.2KD)僅含有約一半IL-1受體結(jié)合表位。)
本研究的結(jié)果表明結(jié)合血清白蛋白的dAb可以與IL-1ra連接(對(duì)RA進(jìn)行臨床治療)并且藥物融合兼具更長(zhǎng)的血清半衰期特性(相對(duì)于dAb)和受體結(jié)合特性(相對(duì)于IL-1ra)。由于藥物融合物的血清保留期，治療CIA所需的DOM7m-16/IL-1ra融合蛋白效應(yīng)劑量要顯著低于IL-1ra。
本研究的結(jié)果表明除了增長(zhǎng)的半衰期和提高的AUC優(yōu)點(diǎn)之外，與結(jié)合血清白蛋白的抗體的抗原-結(jié)合片段 (例如，dAb)相結(jié)合的藥物融合物或藥物結(jié)合物，是高效的并優(yōu)于單獨(dú)藥物的治療藥物。例如，在小鼠CIA模型中顯示，與單獨(dú)使用IL-1ra相比，更低劑量的藥物融合物是有效的并可長(zhǎng)期抑制由IL-1引發(fā)的關(guān)節(jié)炎癥和關(guān)節(jié)損壞，并可提供針對(duì)疾病進(jìn)程的更好的保護(hù)。
實(shí)施例7.抗-SA dAb/皂素蛋白的非共價(jià)藥物結(jié)合物核糖體-失活蛋白皂素蛋白(一種抗-癌藥物)對(duì)變性劑和蛋白酶是高度穩(wěn)定的且被用作一種針對(duì)T淋巴細(xì)胞的目標(biāo)毒素。通過(guò)生物素-鏈霉親和素連接物將皂素蛋白聯(lián)接到DOM7h-8，制備非-共價(jià)藥物結(jié)合物。這種非-共價(jià)藥物結(jié)合物獲得的結(jié)果表明，當(dāng)與藥物聯(lián)接時(shí)，DOM7h-8保留了其結(jié)合血清白蛋白的特性。
通過(guò)在HB2151細(xì)胞中表達(dá)重組核酸，制備的變體DOM7h-8亦稱(chēng)DOM7h-8cys，其C-末端108位的精氨酸(序列號(hào)24的108位氨基酸)被半胱氨酸殘基取代。細(xì)胞生長(zhǎng)后，在30℃用過(guò)夜表達(dá)自體誘導(dǎo)物Tbreadymix(Merck Kga，Germany)誘導(dǎo)72小時(shí)，通過(guò)離心收集上清。使用蛋白L-瓊脂糖親合捕獲，從上清提純DOM7h-8cys。然后用10個(gè)柱狀物體積的2×PBS洗脫樹(shù)脂并用pH為2的0.1M的氨基乙酸洗脫DOM7h-8cys。洗脫的DOM7h-8cys用0.2×體積的pH為8的Tris中和并濃縮至1mg/ml(使用一種CENTRICON 20集中器(Millipore Corp.，MA)。
使用NAP5脫鹽柱(GE Healthcare/Amersham Biosciences，NJ)，濃縮的DOM7h-8cys溶液交換至PBS并測(cè)定濃度。然后使用EZ-LINK sulfo-NHS-LC-biotin(Pierce Biotechnology Inc.，IL)將dAb生物素化(通過(guò)原初胺)。被生物素化的dAb和鏈霉親和素-皂素蛋白(Advanced Targeting Systems，San Deigo)以1∶1的摩爾比例混合。
為了確定dAb/皂素蛋白混合物的形成，使用夾心法ELISA測(cè)定完整的復(fù)合物。以每孔100ul體積，10μg/ml濃度的人血清白蛋白(HSA)在ELISA板的半數(shù)孔中包被過(guò)夜。孵育過(guò)夜后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后整個(gè)板用2％PBS封閉2小時(shí)。封閉后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用在2％TwenPBS中稀釋至0.5uM的DOM7h-8/皂素蛋白非-共價(jià)共扼物孵育1小時(shí)。作為相同ELISA板上的對(duì)照，0.5uM的未耦聯(lián)的皂素蛋白和0.5uM的未耦聯(lián)的DOM7h-8在2％的Tween PBS中孵育。另外的對(duì)照是相同的三種被稀釋的蛋白質(zhì)，其在不包被HSA并經(jīng)2％Tween封閉的ELISA板的孔中孵育。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用2％Tween PBS稀釋至1/2000的山羊抗-皂素蛋白多克隆抗體(Advanced Therapeutic Systems)稀釋液孵育1小時(shí)。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用二抗體孵育1小時(shí)(1/2000的抗-山羊Ig HRP共扼物)。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用PBS洗一次并在紙上輕打使其干燥。用100ul 3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺作為底物進(jìn)行ELISA反應(yīng)并用50ul的1M鹽酸終止反應(yīng)。通過(guò)比較共扼物的OD600和每一非共扼部分的OD600，可以確定非-共價(jià)的共扼物DOM7h-8和皂素蛋白的存在。
表6

研究結(jié)果表明，一種藥物可以與結(jié)合血清白蛋白的抗體的抗原-結(jié)合片段共扼，且共扼的抗原-結(jié)合片段仍保留血清白蛋白-結(jié)合活性。此外，由于生物素-鏈霉親和素相互作用的穩(wěn)定性和強(qiáng)度，結(jié)果表明可以制備共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合的共扼物，其仍保留結(jié)合血清白蛋白的抗體的抗原-結(jié)合片段的血清白蛋白-結(jié)合活性。
實(shí)施例8.抗-SA dAb/熒光素共扼物熒光素異硫氰酸鹽(FITC)能通過(guò)氨基，巰基，咪唑基，酪氨?；螋驶鶛M向連接在蛋白質(zhì)上。它具有389Da的分子量，其在大小上相當(dāng)于許多小分子藥物。帶有這一共扼物獲得的結(jié)果表明，當(dāng)與小分子化學(xué)物耦聯(lián)時(shí)，抗-SA dAb保留了其結(jié)合血清白蛋白的特性，并且小分子藥物能與抗-SA dAb共扼。
正如在實(shí)施例7中所描述的方法可以制備濃縮的DOM7h-8cys。使用 NAP5脫鹽柱(GE Healthcare/AmershamBiosciences，NJ)，濃縮的DOM7h-8cys被交換至pH為8的50mM的Borate(耦合緩沖液)，然后使用2ml的CENTRICON 20濃縮器(Millipore Corp.，MA)將其濃縮至2.3mg/ml。根據(jù)制造商的說(shuō)明FITC(Pierce Biotechnology Inc.)在二甲替甲酰胺(DMF)中被稀釋至10mg/ml，然后FITC∶dAb以摩爾比24∶1的比例，在耦合緩沖液中與dAb混合。反應(yīng)被允許進(jìn)行30分鐘。之后，使用經(jīng)PBS預(yù)先-平衡的PD10脫鹽柱(GE Healthcare/AmershamBiosciences，NJ)從反應(yīng)中移去過(guò)量的未反應(yīng)的FITC，并用PBS洗DOM7h-8cys/FITC。
為了確定FITC/dAb耦合反應(yīng)是成功的，夾心法ELISA被用于測(cè)定耦合的dAb。每孔100ul體積，10μg/ml濃度的人血清白蛋白(HSA)被包被在ELISA板的半數(shù)孔中過(guò)夜。孵育過(guò)夜后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后所有的孔用2％PBS封閉2小時(shí)。封閉后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用在2％TwenPBS中稀釋至1uM的DOM7h-8cys/FITC孵育1小時(shí)。作為在相同ELISA板上的對(duì)照，1uM與抗體耦聯(lián)的FITC和1uM未耦聯(lián)的DOM7h-8在2％Tween PBS中孵育。另外的對(duì)照是相同的三種被稀釋的蛋白質(zhì)，其在不包被HSA并經(jīng)2％Tween封閉的ELISA板的孔中孵育。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用2％Tween PBS稀釋至1/500的兔抗-FITC抗體(Serotec)稀釋液孵育1小時(shí)。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用2％Tween PBS稀釋的二抗(1/5000抗-兔Ig HRP共扼物)孵育1小時(shí)。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后在紙上輕打使其干燥。每孔用100ul 3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺底物進(jìn)行ELISA反應(yīng)并且每孔用50ul 1M鹽酸終止反應(yīng)。通過(guò)比較共扼物的0D600和每一非共扼部分的OD600，可以確定非-共價(jià)的共扼物DOM7h-8和FITC的存在。
表7

實(shí)施例9.抗-SA dAb/多肽共扼物許多多肽具有治療效果。帶有N-或C-末端半胱氨酸的模型多肽能與抗-血清白蛋白dAb耦合。
在這種情況中，四種不同的多肽將被使用多肽1YPYDVPDYAKKKKKKC(序列號(hào)68)；多肽2CKKKKKKYPYDVPDYA(序列號(hào)69)；多肽3HHHHHHKKKKKKC(序列號(hào)70)；多肽4CKKKKKKHHHHHH(序列號(hào)71)。多肽1和2包含紅血球凝聚素標(biāo)記(HA標(biāo)記)的序列而多肽3和4包含His標(biāo)記序列。正如在實(shí)施例7中描述的方法可以制備濃縮的DOM7h-8cys。
用5mM二硫蘇糖醇還原濃縮的dAb，然后使用NAP5脫鹽柱(GE Healthcare/Amersham Biosciences，NJ)，濃縮的dAb被交換至耦合緩沖液(pH為6.5的20mM的BisTris，5mM EDTA，10％氨基乙酸)。使用5mM終濃度的二硫基聯(lián)吡啶封閉半胱氨酸(為了阻止dAb與其自身形成二聚體)，該二硫基聯(lián)吡啶來(lái)源于100mM的二硫基聯(lián)吡啶DMSO儲(chǔ)存液，并被加入至dAb溶液。dAb與二硫基聯(lián)吡啶一起耦合20-30分鐘。使用PD10脫鹽柱移去多余的未反應(yīng)的二硫基聯(lián)吡啶且在耦合緩沖液中(pH為6.5的20mM的BisTris，5mM EDTA，10％氨基乙酸)洗脫dAb。最終的蛋白質(zhì)被凍干直至需要使用。
多肽1-4分別以200uM的濃度溶解在水中，并使用5mM DTT還原，然后用NAP5脫鹽柱(GE Healthcare/AmershamBiosciences，NJ)脫鹽。然后，為了生成多肽-dAb耦合物，每一多肽加入到還原溶液中并以20∶1的比例封閉dAb。為了確定多肽，dAb耦合反應(yīng)的成功性，夾心法ELISA將被用于測(cè)定抗-SAdAb/多肽共扼物。
每孔100ul體積，10μg/ml濃度的人血清白蛋白(HSA)在ELISA板半數(shù)孔中包被過(guò)夜。孵育過(guò)夜后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用4％MarvelPBS封閉2小時(shí)。封閉后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用4％MarvelPBS稀釋至1uM的DOM7h-8/多肽共扼物孵育1小時(shí)。作為在相同ELISA板上的對(duì)照，20uM未耦聯(lián)的多肽和1uM未耦聯(lián)的DOM7h-8在4％MPBS中孵育。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后在4％Marvel PBS中，用針對(duì)多肽1和2的山羊抗-HA抗體(Abcam)的1/2000稀釋液，和針對(duì)多肽3和4的NiNTA-HRP的1/2000稀釋液孵育1小時(shí)。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用4％MPBS稀釋至1/2000的抗-山羊HRP二抗孵育1小時(shí)(其它孔封閉孵育1小時(shí))。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，用PBS洗一次，然后在紙上輕打使其干燥。用3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺底物進(jìn)行ELISA反應(yīng)并用1M鹽酸終止反應(yīng)。通過(guò)比較共扼物的OD600和每一非共扼部分的OD600，可以確定非-共價(jià)的共扼物DOM7h-8/多肽共扼物的存在。








盡管此發(fā)明已經(jīng)用其中涉及的優(yōu)選實(shí)施方案被顯著地表示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員明白，在不背離發(fā)明及附加的權(quán)利要求的范圍的條件下，可以有各種形式和描述的改變。
權(quán)利要求
1.一種藥物融合物，其具有如下的分子式a-(X)n1-b-(Y)n2-c-(Z)n3-d或a-(Z)n3-b-(Y)n2-c-(X)n1-d，其中X是對(duì)第一靶標(biāo)具有結(jié)合特異性的一種多肽藥物；Y是一種對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域(VH)，或一種對(duì)血清白蛋白有結(jié)合特異性的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)域(VL)；Z是對(duì)第二靶標(biāo)具有結(jié)合特異性的一種多肽藥物；a，b，c和d分別是一種包括1至大約100個(gè)氨基酸殘基的多肽或缺失；n1是1至大約10；n2是1至大約10；和n3是0至大約10，附帶條件，當(dāng)n1和n2都為1且n3為0時(shí)，則X不包括抗體鏈或抗體鏈的片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物融合物，其中n1和n3都為1，且n2為2至大約10。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物融合物，其中Y包括從由序列號(hào)10，序列號(hào)11，序列號(hào)12，序列號(hào)13，序列號(hào)14，序列號(hào)15，序列號(hào)24，序列號(hào)25和序列號(hào)26組成的組中選擇的一種氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物融合物，其中Y包括從由序列號(hào)16，序列號(hào)17，序列號(hào)18，序列號(hào)19，序列號(hào)20，序列號(hào)21，序列號(hào)22和序列號(hào)23組成的組中選擇的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物融合物，其中X是IL-1ra或IL-1ra的功能變體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物結(jié)合物，其中X是止痛劑，抗-癌藥劑，激素或抗菌的多肽或肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物結(jié)合物，其中X是免疫抑制劑，抗病毒劑，抗生素，抗-發(fā)炎劑，細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物結(jié)合物，其中X是蛋白酶抑制劑。
9.一種藥物融合物，其包括X’和Y’亞基，其中X’是多肽藥物，附帶條件，X’不包括抗體鏈或抗體鏈的片段；并且Y’是表示對(duì)血清白蛋白有結(jié)合特異性的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域(VH)，或?qū)ρ灏椎鞍子薪Y(jié)合特異性的一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)域(VL)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的藥物融合物，其中X’位于Y’的氨基末端。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的藥物融合物，其中Y’位于X’的氨基末端。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的藥物融合物，其中所述的VH和VL對(duì)人血清白蛋白具有結(jié)合特異性。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的藥物融合物，其中Y’包括從由序列號(hào)10，序列號(hào)11，序列號(hào)12，序列號(hào)13，序列號(hào)14，序列號(hào)15，序列號(hào)24，序列號(hào)25和序列號(hào)26組成的組中選擇的氨基酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的藥物融合物，其中Y’包括從由序列號(hào)16，序列號(hào)17，序列號(hào)18，序列號(hào)19，序列號(hào)20，序列號(hào)21，序列號(hào)22和序列號(hào)23組成的組中選擇的氨基酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求9的藥物融合物，其中X’是IL-1ra或IL-1ra的功能性變體。
16.一種藥物結(jié)合物，包括對(duì)血清白蛋白有結(jié)合特異性的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域(VH)，或?qū)ρ灏椎鞍子薪Y(jié)合特異性的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)域(VL)，和共價(jià)地結(jié)合VH或VL的藥物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的藥物結(jié)合物，其中藥物結(jié)合物包括單一的VH。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的藥物結(jié)合物，其中藥物結(jié)合物包括單一的VL。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的藥物結(jié)合物，其中所述的藥物通過(guò)連接物亞基共價(jià)地結(jié)合所述的VH或VL。
20.根據(jù)權(quán)利要求16的藥物結(jié)合物，其中兩種或更多種不同的藥物共價(jià)地結(jié)合所述的VH或VL。
21.根據(jù)權(quán)利要求16的藥物結(jié)合物，其中藥物是多肽。
22.根據(jù)權(quán)利要求22的藥物結(jié)合物，其中所述的多肽是IL-1ra或IL-1ra的功能性變體。
23.根據(jù)權(quán)利要求16的藥物結(jié)合物，其中藥物是止痛劑，抗-癌藥劑，激素或抗菌的多肽或肽。
24.根據(jù)權(quán)利要求16的藥物結(jié)合物，其中藥物是免疫抑制劑，抗病毒劑，抗生素，抗-炎癥劑，細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒素的藥劑，抗代謝物，烷化劑，抗癌劑，或放射性藥物。
25.根據(jù)權(quán)利要求16的藥物結(jié)合物，其中藥物是蛋白酶抑制劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求16的藥物結(jié)合物，其中所述的對(duì)血清白蛋白有結(jié)合特異性的一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域(VH)，或?qū)ρ灏椎鞍子薪Y(jié)合特異性的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)域(VL)，包括從序列號(hào)10，序列號(hào)11，序列號(hào)12，序列號(hào)13，序列號(hào)14，序列號(hào)15，序列號(hào)24，序列號(hào)25和序列號(hào)26，序列號(hào)16，序列號(hào)17，序列號(hào)18，序列號(hào)19，序列號(hào)20，序列號(hào)21，序列號(hào)22和序列號(hào)23組成的組中選擇的氨基酸序列。
27.一種重組核酸，其編碼權(quán)利要求1或權(quán)利要求9的藥物融合物的。
28.一種包括權(quán)利要求27的重組核酸的核酸構(gòu)建物。
29.一種包括權(quán)利要求27的重組核酸的宿主細(xì)胞。
30.一種制備一種藥物融合物的方法，包括在合適的條件下維持權(quán)利要求27的宿主細(xì)胞表達(dá)所述的重組核酸，由此制備一種藥物融合物。
31.一種的藥物組合物，包括權(quán)利要求1或權(quán)利要求9的藥物融合物和一種生理學(xué)上可接受的載體。
32.一種的藥物組合物，包括權(quán)利要求16的藥物結(jié)合物和一種生理學(xué)上可接受的載體。
33.一種治療患有炎癥疾病的患者的方法，包括給所述的個(gè)體施用治療有效劑量的權(quán)利要求5，15，22中任何一種藥物結(jié)合物或藥物融合物。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的炎癥疾病是關(guān)節(jié)炎。
35.權(quán)利要求3，4，13，14和26中的任何一種藥物結(jié)合物或藥物融合物在治療，診斷或預(yù)防中的應(yīng)用。
36.權(quán)利要求5，15，22中的任何一種藥物結(jié)合物或藥物融合物在治療，診斷或預(yù)防中的應(yīng)用。
37.權(quán)利要求5，15，22中的任何一種藥物結(jié)合物或藥物融合物在制備用于治療炎癥疾病的藥物中的應(yīng)用。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的應(yīng)用，其中所述的炎癥疾病是關(guān)節(jié)炎。
39.一種非共價(jià)的藥物結(jié)合物，其包括一種對(duì)血清白蛋白有結(jié)合特異性的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域(VH)，或一種對(duì)血清白蛋白有結(jié)合特異性的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)域(VL)，和一種非共價(jià)地結(jié)合所述VH或VL的藥物。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的非共價(jià)藥物結(jié)合物，其中所述的VH或VL和所述的藥物通過(guò)補(bǔ)充結(jié)合部分非共價(jià)地結(jié)合。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的非共價(jià)的藥物結(jié)合物，其中所述的補(bǔ)充結(jié)合部分是生物素和抗生物素蛋白，或生物素或鏈霉親合素。
42.一種具有特異性結(jié)合位點(diǎn)能夠特異結(jié)合對(duì)血清體內(nèi)半衰期有提高作用的多肽的多肽結(jié)合亞基在藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用，所述藥物包括一種藥物組合物，在此藥物組合物中，藥物與所述的多肽結(jié)合亞基相結(jié)合，從而增加了藥物的體內(nèi)半衰期且對(duì)于藥物的活性的減少不多于大約10％，
43.一種具有特異性結(jié)合位點(diǎn)能夠特異結(jié)合對(duì)血清體內(nèi)半衰期有提高作用的多肽的多肽結(jié)合亞基在藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用，所述藥物包括一種藥物組合物，在此藥物組合物中，藥物與所述的多肽結(jié)合亞基相結(jié)合，從而增加了藥物的體內(nèi)半衰期且減少了藥物的免疫原性。
44.一種具有特異性結(jié)合位點(diǎn)能夠特異結(jié)合對(duì)血清體內(nèi)半衰期有提高作用的多肽的多肽結(jié)合亞基在藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用，所述藥物包括一種藥物組合物，在此藥物組合物中，藥物與所述的多肽結(jié)合亞基相結(jié)合，從而減少了藥物的免疫原性且使藥物活性的減少不多于大約10％。
45.一種具有特異性結(jié)合位點(diǎn)能夠特異結(jié)合對(duì)血清體內(nèi)半衰期有提高作用的多肽的多肽結(jié)合亞基在藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用，所述藥物包括一種藥物組合物，在此藥物組合物中，藥物與所述的多肽結(jié)合亞基相結(jié)合，從而增加了藥物的體內(nèi)血清半衰期并減少了藥物的免疫原性且對(duì)于藥物活性的減少不多于大約10％。
46.根據(jù)權(quán)利要求42-45所述的任何一種應(yīng)用，其中藥物包括一種藥物組合物，其中的一種藥物與所述的多肽結(jié)合亞基共價(jià)地結(jié)合。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的應(yīng)用，其中藥物組合物是一種藥物融合物或藥物結(jié)合物。
48.根據(jù)權(quán)利要求42-45所述的任何一種應(yīng)用，其中藥物包括一種藥物組合物，其中的一種藥物與所述的多肽結(jié)合亞基非共價(jià)地結(jié)合。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的應(yīng)用，其中藥物組合物是一種非共價(jià)的藥物結(jié)合物。
50.根據(jù)權(quán)利要求42-49所述的任何一種應(yīng)用，其中所述的多肽結(jié)合亞基具有對(duì)血清白蛋白的結(jié)合特異性。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的應(yīng)用，其中所述的多肽結(jié)合亞基是一種對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性的抗體的抗原-結(jié)合片段。
52.根據(jù)權(quán)利要求42-51所述的任何一種應(yīng)用，其中的藥物包括一種比所述藥物具有更大活性的藥物組合物。
53.一種增加藥物體內(nèi)血清半衰期且不明顯減少藥物活性的方法，包括將一種藥物與一種具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基結(jié)合，該結(jié)合位點(diǎn)對(duì)提高體內(nèi)血清半衰期的多肽有結(jié)合特異性，由此制備一種藥物組合物。其中所述的藥物組合物相對(duì)于所述的藥物具有更長(zhǎng)的體內(nèi)血清半衰期，并具有至少所述藥物90％的活性。
54.一種增加藥物的體內(nèi)血清半衰期和減少藥物的免疫原性的方法，包括將一種藥物與一種具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基結(jié)合，該結(jié)合位點(diǎn)對(duì)提高體內(nèi)血清半衰期的多肽有結(jié)合特異性，由此制備一種藥物組合物，其中所述的藥物組合物相對(duì)于所述的藥物具有更長(zhǎng)的體內(nèi)血清半衰期，和比所述藥物較小的免疫原性。
55.一種增減少藥物的免疫原性而不明顯減少藥物活性的方法，包括將一種藥物與一種具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基結(jié)合，該結(jié)合位點(diǎn)對(duì)提高體內(nèi)血清半衰期的多肽有結(jié)合特異性，由此制備一種藥物組合物，其中所述的藥物組合物相對(duì)于所述的藥物具有較小的免疫原性，和具有至少所述藥物90％的活性。
56.一種增加藥物的體內(nèi)血清半衰期和減少藥物的免疫原性的方法，包括將一種藥物與一種具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基結(jié)合，該結(jié)合位點(diǎn)對(duì)提高體內(nèi)血清半衰期的多肽有結(jié)合特異性，由此制備一種藥物組合物，其中所述的藥物組合物相對(duì)于所述的藥物具有更長(zhǎng)的體內(nèi)血清半衰期，比所述藥物有較小的免疫原性，和具有至少所述藥物90％的活性。
57.根據(jù)權(quán)利要求53-56所述的任何一種方法，包括將所述藥物與所述多肽結(jié)合亞基共價(jià)地結(jié)合。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中藥物組合物是一種藥物融合物或藥物結(jié)合物。
59.根據(jù)權(quán)利要求53-56所述的任何一種方法，包括將所述藥物與所述多肽結(jié)合亞基非共價(jià)地結(jié)合。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，其中藥物組合物是一種非共價(jià)的藥物結(jié)合物。
61.根據(jù)權(quán)利要求53-60所述的任何一種方法，其中的方法進(jìn)一步包括從一種或更多種多肽中選擇所述的多肽結(jié)合亞基，其中被選擇的多肽帶有至少大約5mM的KD值，結(jié)合亞基結(jié)合提高體內(nèi)半衰期的一種多肽。
62.根據(jù)權(quán)利要求53-61所述的任何一種方法，其中所述的多肽結(jié)合亞基對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述的多肽結(jié)合亞基是一種對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性的抗體的抗原-結(jié)合片段。
64.根據(jù)權(quán)利要求53-63所述的任何一種方法，其中藥物組合物比所述的藥物具有更大的活性。
65.一種藥物組合物，包括一種與具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基結(jié)合的藥物，該結(jié)合位點(diǎn)在藥物制備時(shí)對(duì)提高體內(nèi)血清半衰期的多肽有結(jié)合特異性，其中所述的藥物組合物相對(duì)于藥物具有更長(zhǎng)的體內(nèi)血清半衰期，和具有至少大約90％的藥物活性。
66.一種藥物組合物，包括一種與具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基結(jié)合的藥物，該結(jié)合位點(diǎn)在藥物制備時(shí)對(duì)提高體內(nèi)血清半衰期的多肽有結(jié)合特異性，其中所述的藥物組合物相對(duì)于藥物具有更長(zhǎng)的體內(nèi)血清半衰期，并比所述的藥物更小的免疫原性。
67.一種藥物組合物，包括一種與具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基結(jié)合的藥物，該結(jié)合位點(diǎn)在藥物制備時(shí)對(duì)提高體內(nèi)血清半衰期的多肽有結(jié)合特異性，其中所述的藥物組合物相比所述的藥物更小的免疫原性，并具有至少90％的所述藥物的活性。
68.一種藥物組合物，包括一種與具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的多肽結(jié)合亞基結(jié)合的藥物，該結(jié)合位點(diǎn)在藥物制備時(shí)對(duì)提高體內(nèi)血清半衰期的多肽有結(jié)合特異性，其中所述的藥物組合物相對(duì)于藥物具有更長(zhǎng)的體內(nèi)血清半衰期，比所述的藥物更小的免疫原性，并具有至少90％的所述藥物的活性。
69.根據(jù)權(quán)利要求65-68所述的任何一種藥物組合物，其中的藥物與所述的多肽結(jié)合亞基共價(jià)地結(jié)合。
70.根據(jù)權(quán)利要求69的藥物組合物，其中所述的藥物組合物是一種藥物融合物或藥物結(jié)合物。
71.根據(jù)權(quán)利要求65-68的所述任何一種藥物組合物，其中的藥物與所述的多肽結(jié)合亞基非共價(jià)地結(jié)合。
72.根據(jù)權(quán)利要求71的藥物組合物，其中所述的藥物組合物是一種非共價(jià)的藥物結(jié)合物。
73.根據(jù)權(quán)利要求65-72所述的任何一種方法，其中所述的多肽結(jié)合亞基對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性。
74.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述的多肽結(jié)合亞基是一種對(duì)血清白蛋白具有結(jié)合特異性的抗體的抗原-結(jié)合片段。
75.根據(jù)權(quán)利要求65-74所述的任何一種藥物組合物，其中的藥物組合物比所述的藥物具有更大的活性。
全文摘要
提供了藥物組合物，融合物和結(jié)合物。這種藥物組合物和結(jié)合物包含一種治療或診斷試劑，該試劑與結(jié)合血清白蛋白的抗體的抗原－結(jié)合片段融合或結(jié)合。相對(duì)于未結(jié)合或未融合的治療或診斷試劑來(lái)講，藥物組合物、融合物和結(jié)合物具有更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。
文檔編號(hào)C07K16/44GK101031588SQ200580026031
公開(kāi)日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2005年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月1日
發(fā)明者露西·J·霍爾特, 蘭·M·湯姆林森 申請(qǐng)人:多曼蒂斯有限公司