專(zhuān)利名稱(chēng)：產(chǎn)生高度有效抗體的sars疫苗和方法
產(chǎn)生高度有效抗體的SARS疫苗和方法
本申請(qǐng)要求2005年5月31日提交的尚未獲得美國(guó)序列號(hào)的申請(qǐng)和 2004年6月2日提交的美國(guó)序列號(hào)60/576,118的申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，這兩個(gè) 申請(qǐng)的全文內(nèi)容并入本申請(qǐng)中。
本申請(qǐng)引用了許多出版物。為了更充分地描述本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域 的狀態(tài)，因而通過(guò)引用，將這些出版物的完整內(nèi)容并入本申請(qǐng)中。
背景技術(shù)：
嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS), —種新出現(xiàn)的感染疾病，由SARS-相關(guān)的冠狀病毒(SARS-CoV)引起[l-7]，其可能源于一些野生動(dòng)物[8]。 2002/2003年的SARS全球暴發(fā)導(dǎo)致數(shù)千病例和數(shù)百例死亡，嚴(yán)重地威脅 全世界的公共健康。在2003年年末和2004年年初，在中國(guó)報(bào)道了幾例新 的SARS-CoV感染，其毒株不同于那些造成2002/2003年大流行的 SARS-CoV毒株[9]。在臺(tái)灣、新加坡和中國(guó)報(bào)道了由于SARS-CoV分離 株的意外釋放而引起的一些單獨(dú)的發(fā)作(http:〃www.who.int/csr/sars/en)。這 些結(jié)果表明，SARS流行病可能在將來(lái)的任何時(shí)候復(fù)發(fā)，其通過(guò)SARS-CoV 由動(dòng)物到人的傳播或通過(guò)從實(shí)驗(yàn)室樣品溢出的病毒導(dǎo)致發(fā)生。因此，迫切 需要開(kāi)發(fā)有效的和安全的疫苗用于保護(hù)受威脅的人群。
目前，在中國(guó)，應(yīng)用滅活SARS-CoV的一種候選疫苗正處于I期臨床 實(shí)驗(yàn)[9, 10]。盡管已經(jīng)表明所述滅活的SARS-CoV有效地保護(hù)動(dòng)物免受 SARS-CoV的攻擊，但是它在人中的功效尚不清楚。由于病毒體中的一些 抗原可以引起不中和而是增強(qiáng)病毒感染的抗體，因此，關(guān)于它的安全性存 在重要的關(guān)注[IO]。 一些病毒蛋白可以誘導(dǎo)有害的免疫和炎性反應(yīng)，這是 SARS發(fā)病機(jī)理的潛在的起因和應(yīng)用免疫抑制劑(例如，類(lèi)固醇)用于 SARS治療的基本原理[11，12](對(duì)這種治療方案還有很大的爭(zhēng)議)。最近， 據(jù)報(bào)道，雪貂的SARS-CoV感染引起輕微的肝臟炎癥，并且如果雪貂在病毒攻擊之前第一次用基于牛痘病毒的SARS疫苗免疫的話，所述肝臟損 傷變得嚴(yán)重得多[13]。
冠狀病毒S蛋白負(fù)責(zé)病毒結(jié)合、融合和進(jìn)入，并且是中和性抗體的主 要誘導(dǎo)劑[14-16]。此外，它們?cè)诓《景l(fā)病機(jī)理和毒性中起著重要的作用 [17]。 SARS-CoVS蛋白對(duì)于病毒功能和抗原性也是重要的[18, 19]。它是 由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，S1和S2組成的I型跨膜糖蛋白[18](圖l)。 Sl負(fù)責(zé)病毒 與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合。已經(jīng)證明血管緊張肽轉(zhuǎn)變酶2 (ACE2)是 SARS-CoV的功能受體[20-23]。位于Sl中間區(qū)域的片段是受體結(jié)合結(jié)構(gòu) 域(RBD) [24-26]。 S2結(jié)構(gòu)域，其含有推定的融合肽和2個(gè)七殘基重復(fù)序 列(HR1和HR2)區(qū)域(

圖1)，負(fù)責(zé)病毒和靶細(xì)胞膜之間的融合。如同衍 生于HIV-1 gp41 HR2區(qū)域的抗-HIV肽[27， 28]，衍生于SARS-CoV S蛋白 HR2區(qū)域的肽被鑒定為SARS-CoV感染的抑制因子[29]。 HR1和HR2區(qū) 域可以締合形成六螺旋束結(jié)構(gòu)[29， 30]，類(lèi)似于HIV中g(shù)p41 [31]和其它冠 狀病毒，諸如小鼠肝炎冠狀病毒(MHV)中的S蛋白[32， 33]的融合活性核 心結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果表明， 一旦病毒S蛋白上的RBD結(jié)合于靶細(xì)胞上的 ACE2， S2就通過(guò)HR1和HR2區(qū)域之間的相互作用而改變構(gòu)象，從而形 成融合核心結(jié)構(gòu)并且使得病毒和靶細(xì)胞膜緊密接近，導(dǎo)致病毒融合和進(jìn)入 [29]。這表明含有S蛋白上的功能結(jié)構(gòu)域的片段可以用作抗原，用來(lái)誘導(dǎo) 阻礙病毒結(jié)合或融合的抗體。
一些編碼SARS-CoV S蛋白的活的減毒的和遺傳工程疫苗已經(jīng)處于 臨床使用前期的研究中。最近，Nabd和同事[34]報(bào)道了編碼S蛋白的DNA 疫苗候選物誘導(dǎo)T細(xì)胞和中和性抗體的反應(yīng)(中和性抗體滴度在從l: 50 到1: 150的范圍)，并且保護(hù)小鼠免受SARS-CoV攻擊，如由呼吸道中 減少的SARS-CoV滴度所表明的那樣。他們證明所述保護(hù)由中和性抗體 而不是T細(xì)胞依賴(lài)型機(jī)制而介導(dǎo)。目前，Moss同合作者[35]證明，用包 含編碼全長(zhǎng)SARS-CoV S蛋白的基因的高度減毒修飾的疫苗病毒載體病 毒Ankara (MVA) (MVA/S)從鼻內(nèi)或肌內(nèi)接種小鼠，可產(chǎn)生具有SARS-CoV 中和活性的S特異性抗體(平均中和滴度是l: 284)，并且在從免疫小鼠 轉(zhuǎn)移血清后保護(hù)小鼠免受SARS-CoV感染。這些數(shù)據(jù)表明，S蛋白可以誘 導(dǎo)保護(hù)性的中和性抗體，盡管所述中和性抗體滴度相對(duì)較低。
含有連接到人IgG-Fc片段(用于輔助RBD純化)上的RBD的重組 融合蛋白作為抗原(稱(chēng)為RBD-Fc，見(jiàn)圖1)用于免疫小鼠和兔，可以在 免疫動(dòng)物中誘導(dǎo)高度有效的中和性抗體反應(yīng)(平均中和滴度1: 〉10,000)， 并且所述抗體可以結(jié)合RBD并阻礙RBD同ACE2的結(jié)合。這表明，RBD 可以作為預(yù)防SARS的亞單位疫苗進(jìn)行應(yīng)用。
本發(fā)明公開(kāi)一種重組融合蛋白或分離的多肽，其含有連接到人IgG-Fc 片段(用于輔助RBD純化)的RBD，作為可以在免疫動(dòng)物中誘導(dǎo)高度有 效中和性抗體反應(yīng)(平均中和滴度對(duì)于兔是1: 15,360和對(duì)于小鼠是1: 12,553)的抗原(稱(chēng)為RBD-Fc，見(jiàn)圖1)，這表明RBD可以作為預(yù)防SARS 的亞單位疫苗進(jìn)行應(yīng)用。
發(fā)明概述
嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)冠狀病毒(CoV)的突起蛋白(spike protein， Sproteiii)， 一種I型跨膜包膜糖蛋白，由分別負(fù)責(zé)病毒結(jié)合和融 合的Sl和S2結(jié)構(gòu)域組成。Sl含有受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)，其可以特異 性結(jié)合血管緊張肽轉(zhuǎn)變酶(ACE2)—靶細(xì)胞上的受體。
本發(fā)明提供包括有效量的分離的多肽或重組蛋白的疫苗，所述分離的 多肽或重組蛋白含有嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)相關(guān)的冠狀病毒突起 蛋白中的RBD序列，或其功能片段。
本發(fā)明還提供一種包括有效量的核酸分子的疫苗，所述核酸分子包括 一個(gè)片段的序列，其編碼嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)的冠狀病毒突起蛋白中 的RBD序列，或其功能片段。
本發(fā)明還提供一種重組融合蛋白，其含有嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)的 冠狀病毒突起蛋白中的RBD序列，或其功能片段，和人IgGFc片段(稱(chēng) 為RBD-Fc)的序列，或其功能片段。
RBD-Fc可以在免疫動(dòng)物，包括兔和小鼠中誘導(dǎo)高度有效的抗體反應(yīng)。 所述抗體識(shí)別嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀病毒突起蛋白中Sl結(jié)構(gòu) 域上的RBD序列，嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀病毒突起蛋白中Sl 結(jié)構(gòu)域的序列，以及嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀病毒突起蛋白的序 列。
來(lái)自用RBD-Fc免疫的動(dòng)物(例如，兔和小鼠)的抗體有效地阻滯嚴(yán) 重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀病毒突起蛋白中的RBD或Sl結(jié)構(gòu)域同可 溶ACE2分子或細(xì)胞上表達(dá)的ACE2的結(jié)合。
來(lái)自用RBD-Fc免疫的動(dòng)物(例如，兔和小鼠)的抗體有效地中和 SARS-CoV和HIV/SARS-CoV S假病毒的感染，具有比由編碼全長(zhǎng) SARS-CoV S蛋白的DNA疫苗和痘苗病毒載體誘導(dǎo)的小鼠抗血清的中和 滴度更高出約50-300倍的中和滴度。
從抗血清中消除抗Fc抗體沒(méi)有影響中和活性。
這表明，嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀病毒突起蛋白中Sl結(jié)構(gòu) 域上的RBD序列可以誘導(dǎo)高度有效的中和性抗體反應(yīng)，并且可以被開(kāi)發(fā) 成為用于預(yù)防SARS的有效的和安全的亞單位疫苗。
連接RBD的IgG Fc可以顯著地增強(qiáng)RBD的免疫原性，以產(chǎn)生高水 平的特異性針對(duì)RBD的抗體。連接IgG Fc與抗原的方法可以用于誘導(dǎo)高 水平的針對(duì)相應(yīng)抗原的抗體。
本發(fā)明提供用于增加抗原免疫原性的組合物，其包括有效量的抗原和 IgGFc結(jié)構(gòu)域，它的功能片段，或含有IgGFc結(jié)構(gòu)域或它的功能片段的 物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原和IgG Fc是連接的。在另一實(shí)施方 案中，它們連接形成融合蛋白。
最后，本發(fā)明還提供將任何上述組合物用于免疫的方法。在一個(gè)實(shí)施 方案中，它們用作疫苗。
附圖詳述
圖1. SARS-CoVS蛋白和重組融合蛋白R(shí)BD-Fc的示意圖。S蛋白由 Sl和S2結(jié)構(gòu)域組成。存在位于S蛋白N端的信號(hào)肽(SP)。 Sl結(jié)構(gòu)域含 有受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)。 S2結(jié)構(gòu)域含有胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(CP)，跨膜結(jié)構(gòu)域 (TM)禾卩由推定的內(nèi)融合肽(FP)和七殘基重復(fù)序列1和2 (HR1和HR2)區(qū) 域組成的胞外結(jié)構(gòu)域。RBD-Fc由RBD和人IgG-Fc片段組成。Sl-C9含 有S蛋白Sl結(jié)構(gòu)域和C9片段。
圖2.小鼠抗血清含有結(jié)合于SARS-CoV S蛋白Sl結(jié)構(gòu)域上的RBD 的高滴度的抗體。(A)通過(guò)從免疫前小鼠(免疫前)和每次增強(qiáng)后4天的 小鼠收集的抗血清(1:10，000)結(jié)合于RBD-Fc; (B)通過(guò)以連續(xù)5倍稀釋 第三次增強(qiáng)后4天收集的小鼠抗血清結(jié)合于RBD-Fc;和(C)通過(guò)以連續(xù) 5倍稀釋第三次增強(qiáng)后4天收集的小鼠抗血清結(jié)合于Sl-C9蛋白。所有的 樣品進(jìn)行兩次檢測(cè)，并且顯示的數(shù)據(jù)是兩次檢測(cè)的平均值(對(duì)下述附圖同 樣)。
圖3.兔抗血清含有結(jié)合于RBD的高滴度的抗體。(A)通過(guò)從免疫前 兔(免疫前)和每次增強(qiáng)后10天的兔收集的抗血清(1:10,000)結(jié)合于 RBD-Fc; (B)通過(guò)以連續(xù)5倍稀釋第一次增強(qiáng)后IO天收集的兔抗血清結(jié) 合于RBD-Fc;和(C)通過(guò)以連續(xù)5倍稀釋第一次增強(qiáng)后10天收集的兔抗 血清結(jié)合于S1-C9蛋白。
圖4.通過(guò)針對(duì)RBD-Fc的小鼠抗血清中和SARS-CoV感染。(A)定 量連續(xù)2倍稀釋的小鼠抗血清對(duì)由SARS-CoV在Vero E6細(xì)胞單層中復(fù)制 誘導(dǎo)的CPE的抑制。從應(yīng)用來(lái)自小鼠M8的抗血清的實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果顯 示于此作為實(shí)例。在顯微鏡下記錄CPE，并且計(jì)算病毒中和滴度；和(B) 通過(guò)連續(xù)2倍稀釋的小鼠抗血清中和HIV/SARS-CoV S假病毒的感染。在 螢光素酶檢測(cè)中確定對(duì)表達(dá)ACE2的293T細(xì)胞單周期感染所述假病毒的 抑制。
圖5.檢測(cè)兔抗血清對(duì)由在Vero E6單層中SARS-CoV感染誘導(dǎo)的 CPE的抑制，如圖4A所描述的那樣進(jìn)行檢測(cè)。
圖6.兔抗血清中和HIV/SARS-CoV S假病毒感染。在螢光素酶檢測(cè) 中確定對(duì)表達(dá)ACE2的293T細(xì)胞單周期感染所述假病毒的抑制。
圖7.從兔抗血清中消除抗-Fc抗體對(duì)結(jié)合Sl-C9和病毒中和活性的作 用。通過(guò)ELISA測(cè)定消除抗-Fc的和未處理的兔抗血清與人IgG (A)和 Sl-C9 (B)的結(jié)合能力。將消除抗-Fc的兔血清針對(duì)HIV/SARS-CoV S假病 毒的中和活性與未處理的兔抗血清的中和活性相比較(C)。
圖8.小鼠和兔抗血清阻滯含有RBD的Sl與ACE2的結(jié)合。通過(guò) ELISA測(cè)定小鼠抗血清(A)和兔抗血清(B)對(duì)Sl-C9與可溶的ACE2的結(jié)合 的抑制。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定兔抗血清對(duì)Sl-C9與細(xì)胞表達(dá)的ACE2的結(jié) 合的抑制(C)。在陽(yáng)性對(duì)照中，不添加兔血清，而在陰性對(duì)照中，兔血清 和Sl-C9都沒(méi)有添加。兔抗血清以劑量依賴(lài)型方式抑制Sl-C9與表達(dá)
ACE2細(xì)胞的結(jié)合(D)。 發(fā)明詳述
本發(fā)明提供一種包括有效量的分離的多肽和重組蛋白的疫苗，所述分 離的多肽或重組蛋白含有嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)的冠狀病毒突起蛋白
的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)或其功能片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，適當(dāng)?shù)淖?劑與本發(fā)明所描述的所述疫苗一起應(yīng)用。在另一實(shí)施方案中，所述疫苗是 偶聯(lián)的。
當(dāng)用于本文時(shí)，功能片段是行使所述功能的RBD的部分。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述功能是結(jié)合受體。
具有RBD序列的肽或多肽或蛋白
本發(fā)明提供包括嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征相關(guān)的冠狀病毒突起蛋白 中的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列或其功能片段的分離的肽或多肽或蛋白，其可以 用作用于預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀病毒感染的疫苗。
在一個(gè)實(shí)施方案中，RBD具有下述序列
n工tn:lcpfgevfnatkfpsvyawerkk工sncvadysv:lynstffs tfkcygvsatklndlcfsnvyadsfwkgddvrqiapgqtgvia dynyklpddfmgcvlawntrnidatstgnynykyry:lrhgklrpferdis nvpfspdgkpctppalncywpiindygfytttgigyqpyrvwlsfeiinap atv (seq id no: 1)。
本發(fā)明意欲涵蓋下述序列或下述序列的功能片段
N工TNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKK工SNCVADYSVLYNSTFFS TFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFWKGDD卿IAPGQTGV工A DYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDIS NVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNi)YGFYTTTGIGYQPYRVWLSFELLNAP atv(seq id no: 1)。
本發(fā)明意欲涵蓋具有在目前鑒定的SARS-CoV毒株中的天然突變 [6]:諸如R344—K; F360—S; L472—P; N479—K; D480—G; T487—S，
和任何非天然突變的RBD序列。
如本領(lǐng)域所知，序列的突變，取代，插入和缺失是可能的，而RBD 功能或免疫原性保持不變。本發(fā)明的目的是包括所述突變，取代，插入和缺失。
編碼RBD序列的核酸片段
核酸疫苗提供了用完全基于基因的、由受者自身細(xì)胞表達(dá)的物質(zhì)進(jìn)行 免疫的新機(jī)會(huì)。在免疫過(guò)程中有更大的可控制性。所述疫苗可以在皮膚或 肌肉施用。其它分子，諸如細(xì)胞因子，可以共同表達(dá)。另外，免疫刺激性 DNA序列可以用來(lái)調(diào)節(jié)應(yīng)答類(lèi)型(Thl或Th2)。應(yīng)答的持續(xù)時(shí)間可以通過(guò)
重復(fù)暴露于基因而進(jìn)行控制，通過(guò)各種遞送機(jī)制，諸如直接注射；電穿 孔；黏膜遞送等，使得所述基因瞬時(shí)表達(dá)。嚴(yán)格按照合理設(shè)計(jì)制備DNA 分子的能力使得可能避免對(duì)于產(chǎn)生有效疫苗的數(shù)年的研發(fā)。這些疫苗在宿 主中表達(dá)并且存在，形成胞內(nèi)抗原的理想的模擬物。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6,339,068Bl; 6,821，957B2。
DNA分子，其包括編碼嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀病毒突起 蛋白中的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列或其功能片段的核酸片段(例如，DNA疫 苗)，可以用作用于預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀病毒感染的疫 苗。
包含載體的活的減毒病毒(例如，MVA)可以用作用于預(yù)防嚴(yán)重急 性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀病毒感染的疫苗，所述載體包括核酸片段或所 有分子，所述核酸片段或所有分子包含編碼嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的 冠狀病毒突起蛋白中的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列或其功能片段的所述片段的序列。
含有與IgGFc結(jié)構(gòu)域連接的RBD序列的融合蛋白或多肽
一種融合蛋白或分離的多肽，其包含嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠 狀病毒突起蛋白中的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列或其功能片段，連接于物質(zhì)， 所述物質(zhì)包括IgG Fc結(jié)構(gòu)域，其功能片段或者包含IgG Fc結(jié)構(gòu)域或其功 能片段的物質(zhì)，可以用作用于預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀病毒 感染的疫苗。IgG分子可以被酶木瓜蛋白酶分解，在H鏈間二硫鍵上游位點(diǎn)的鉸鏈
區(qū)產(chǎn)生2個(gè)Fab片段和1個(gè)Fc片段[59]。 Fc結(jié)構(gòu)域主要功能之一是負(fù)責(zé) IgG分子與細(xì)胞表面Fc受體(FcryR)的結(jié)合[60]。 IgG序列的實(shí)例示例如下-
THTCPPCPAPEUiGGPSVFLETPKPKDT皿SRTPEVTCVWDVSHEDP(2V訓(xùn)WYVDGV QVH肌KTKPREQQYNSTYRWSVLTVLHQ冊(cè)LDGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLiPPSREEMTKNQVSIjTCIjVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG. (SEQ ID NO: 2) (61)。
來(lái)自不同種屬的IgGFc應(yīng)該作用相同。
本發(fā)明提供包括任何上述分離的多肽或任何上述融合蛋白和藥用載 體的藥物組合物。
本發(fā)明提供在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀 病毒的抗體的方法，其包括給所述受試者施用任何上述疫苗或有效量的任 何上述融合蛋白或組合物的分離的多肽。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所誘導(dǎo)的抗體是中和性的。
當(dāng)在本文中陳述時(shí)，受試者是具有免疫應(yīng)答的生物體。受試者包括但 不限于哺乳動(dòng)物。所述受試者包括人，但可以是動(dòng)物，諸如狗和貓。
上述方法可以產(chǎn)生多克隆的或單克隆的抗體。
本發(fā)明提供通過(guò)任何上述方法產(chǎn)生的抗體。這些抗體可以用來(lái)治療或 預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀病毒的感染。
抗獨(dú)特型抗體
本發(fā)明提供抗獨(dú)特型抗體，其應(yīng)該模擬RBD，或其功能部分，針對(duì) 特異于SARS冠狀病毒的RBD的單克隆抗體。
本發(fā)明還提供包括有效量的抗獨(dú)特型抗體，其功能部分或可以如抗獨(dú) 特型抗體一樣作用的單鏈抗體的疫苗。
本發(fā)明提供確定包含在嚴(yán)重急性呼吸道綜合征病毒SI中的中和表位 的方法，其包括步驟
(a)從SARS-CoV S蛋白的RBD序列產(chǎn)生肽；(b)用所述肽免疫動(dòng)物(例如，兔，小鼠等)； (C)從所免疫的動(dòng)物收集血液；和
(d)檢測(cè)收集自用衍生于SARS-CoV s蛋白R(shí)BD的肽免疫的動(dòng)物的抗 血清針對(duì)SARS-CoV的中和活性。
作為備選，細(xì)胞可以在體外免疫?？梢允占m當(dāng)?shù)乃拗鞯钠⒓?xì)胞，并 且與SARS-CoVS蛋白的RBD接觸。免疫后，可以進(jìn)行產(chǎn)生單克隆抗體 的常規(guī)流程。
表位
本發(fā)明還提供SARS-CoV S蛋白R(shí)BD的表位。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述表位通過(guò)上述方法確定。在另一實(shí)施方案中，所述表位是中和表位。
含有所述中和表位序列的分離的多肽或重組蛋白可以用作疫苗。
含有編碼所述中和表位的序列的片段的序列的核酸片段或核酸分子， 或者包括含有編碼所述中和表位的序列的片段的序列的核酸片段或核酸 分子的載體，可以用作疫苗。
本發(fā)明還提供含有所述表位的序列或構(gòu)象的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述化合物是肽或多肽。
本發(fā)明還提供包括含有所述表位的化合物、分離的肽或多肽的組合物。
本發(fā)明還提供包括有效量的任何上述組合物的疫苗。 本發(fā)明提供在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)嚴(yán)重急性呼吸道綜合征病毒的抗體 的方法，其包括給所述受試者施用上述疫苗。
通過(guò)連接IgG Fc結(jié)構(gòu)域增加免疫原性
本發(fā)明提供增加抗原免疫原性的方法，其包括將所述抗原連接于IgG Fc結(jié)構(gòu)域，其功能片段或者含有IgG Fc結(jié)構(gòu)域或其功能片段的物質(zhì)。
本發(fā)明還提供用于增加抗原免疫原性的組合物，其包括有效量的抗 原，所述抗原連接于IgG Fc結(jié)構(gòu)域或其功能片段或者含有IgG Fc結(jié)構(gòu)域 或其功能片段的物質(zhì)。
在上述方法或組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接導(dǎo)致融合蛋白。
本發(fā)明還提供在受試者中增加抗原免疫原性的方法，其包括給所述受 試者施用抗原，所述抗原連接于IgG FC結(jié)構(gòu)域或其功能片段，或者含有
IgGFc結(jié)構(gòu)域或其功能片段的物質(zhì)。
本發(fā)明提供用于增加抗原免疫原性的組合物，其包括有效量的抗原和 人IgGFc結(jié)構(gòu)域，其功能片段，或者含有IgGFc結(jié)構(gòu)域或其功能片段的 物質(zhì)。所述IgGFc結(jié)構(gòu)域可以來(lái)自兔、小鼠或任何其它動(dòng)物。
所選擇的抗原可以是任何來(lái)源的，只要它可以激發(fā)(illicit)免疫應(yīng)答。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原包括可以誘導(dǎo)抗體的任何抗原。在另一實(shí)施 方案中，所述抗原衍生于傳染性的試劑。在另一實(shí)施方案中，它是病毒源 性的。
免疫原性的增加可以導(dǎo)致高水平的中和抗體，導(dǎo)致高滴度的針對(duì)所述 抗原的抗體或具有高結(jié)合親和力的抗體。
適當(dāng)?shù)淖魟┮部梢杂迷谒鲆呙缁蚪M合物中，以增加免疫應(yīng)答。佐劑 的所述應(yīng)用是本領(lǐng)域公知的。所述佐劑包括但不限于基于皂苷的佐劑。
本發(fā)明還提供上述組合物和藥用載體，由此形成藥物組合物。
本發(fā)明還提供包括上述組合和藥用載體的藥物組合物。對(duì)于本發(fā)明的 目的，"藥用載體"意指任何標(biāo)準(zhǔn)的藥用載體。適當(dāng)?shù)妮d體的實(shí)例是本領(lǐng) 域內(nèi)公知的，并且可以包括，但不限于，任何標(biāo)準(zhǔn)的藥用載體，諸如磷酸 緩沖鹽溶液和各種濕潤(rùn)劑。其它載體可以包括用于片劑、粒劑和膠囊等中 的添加劑。典型地，這樣的載體包含賦形劑，諸如淀粉、乳(milk)、糖、 某些類(lèi)型的黏土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或鈣、滑石、植物脂肪 或油、樹(shù)膠、二元醇或其它已知的賦形劑。這樣的載體還可以包括調(diào)味和 著色添加劑或其它成分。包括這樣的載體的組合物通過(guò)公知的常規(guī)方法配 制。
本發(fā)明證明，衍生于HR2區(qū)域的肽具有對(duì)SARS-CoV感染的抑制活 性，并且可以與衍生于HR1區(qū)域的肽相互作用，以形成六螺旋束，類(lèi)似 于HIV中g(shù)p41的融合活性核結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果表明SARS-CoV進(jìn)入靶細(xì)胞 的一種模型當(dāng)Sl上的RBD結(jié)合于ACE2時(shí)，S2就通過(guò)HR1和HR2 區(qū)域之間的相互作用而改變構(gòu)象，以形成融合核心結(jié)構(gòu)并且使得病毒和靶 細(xì)胞膜緊密接近，這導(dǎo)致病毒融合和進(jìn)入。這表明含有S蛋白中的功能區(qū)
域的片段可以用作免疫原，以誘導(dǎo)阻滯病毒結(jié)合或融合的抗體。
本發(fā)明還提供用于設(shè)計(jì)預(yù)防SARS的有效和安全的亞單位疫苗的方
法，其應(yīng)用含有連接人IgG Fc片段(用于輔助RBD純化)的RBD的重 組融合蛋白(稱(chēng)為RBD-Fc，見(jiàn)圖1)作為抗原來(lái)免疫兔，并且評(píng)估了結(jié) 合RBD的抗體滴度，并且應(yīng)用中和性SARS-CoV，以設(shè)計(jì)用于預(yù)防SARS 的有效和安全的亞單位疫苗。
通過(guò)下述實(shí)驗(yàn)詳述將更好地理解本發(fā)明，但是本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員 應(yīng)該很容易理解，詳細(xì)描述的具體實(shí)驗(yàn)僅僅是舉例說(shuō)明性的，并不是意欲 限制本文所描述的發(fā)明，其由下文所附的權(quán)利要求而定義。
實(shí)驗(yàn)詳述 材料和方法
重組RBD-Fc和Sl-C9蛋白的表達(dá)。編碼SARS-CoV S蛋白的193個(gè) 氨基酸的片段，其對(duì)應(yīng)于受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其與人IgGl的Fc結(jié)構(gòu)域融合 (RBD-Fc)的質(zhì)粒，和編碼在C端用C9標(biāo)記的S1蛋白(殘基12-672 )(S1-C9) 的質(zhì)粒，先前已經(jīng)描述過(guò)[21， 23]。按照制造者的方案，利用Fugene6試 劑(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)，通過(guò)用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì) 胞分別表達(dá)RBD-Fc和Sl-C9。在轉(zhuǎn)染后72 h收獲上層清液。重組RBD-Fc 融合蛋白通過(guò)蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠4快速柱(Amersham Biosciences, Piscataway， NJ)進(jìn)行純化，并且Sl-C9蛋白通過(guò)用抗C9小鼠單克隆抗體 (mAb) 1D4 (National Cell Culture Center, Minneapolis,畫(huà))的親和層析進(jìn) 行純化。
用RBD-Fc免疫小鼠。將10只Balb/c小鼠(4周齡)在存在MLP+TDM 佐劑系統(tǒng)(Sigma, Saint Louis, MI)情況下用重懸在PBS (pH 7.2)中的10昭 純化的RBD-Fc皮下免疫，并且在3-wk時(shí)間間隔用相同的抗原制備物增 強(qiáng)。作為對(duì)照的兩只Balb/c小鼠以同免疫小鼠相同的方式處理，除了用 PBS代替RBD-Fc以外。在開(kāi)始免疫之前收集免疫前血清，并且在每次增 強(qiáng)后4天收集抗血清。使用前將血清保存在4匸。
兔抗血清的產(chǎn)生。針對(duì)RBD-Fc的兔抗血清在Covance Research Products Inc. (Denver, PA)應(yīng)用他們的標(biāo)準(zhǔn)流程而產(chǎn)生。簡(jiǎn)要地說(shuō)，將NZW
兔在存在弗氏完全佐劑(FCA)的情況下用重懸在磷酸鹽緩沖溶液(PBS, pH 7.2)中的150昭純化的RBD-Fc皮下免疫，并且在3-wk時(shí)間間隔用免疫 原和弗氏不完全佐劑(FIA)的新鮮制備的乳劑增強(qiáng)。在開(kāi)始免疫之前收集 免疫前血清，并且在每次增強(qiáng)后IO天收集抗血清。使用前將血清保存在 4°C。
酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)。通過(guò)ELISA確定小鼠和兔血清與各種抗 原的反應(yīng)性。簡(jiǎn)要地說(shuō)，分別應(yīng)用l pg/ml重組蛋白(RBD-Fc或Sl-C9) 或純化的人IgG (Zymed, South San Francisco, CA)來(lái)包被96孔微量滴定平 板(Coming Costar, Acton, MA)，在0.1 M碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)中4。C過(guò)夜。 用2%脫脂牛奶封閉后，分別將連續(xù)稀釋的小鼠和兔血清加入，并且在37 。C溫育lh，接著用含有0.1%吐溫20的PBS洗滌4次。通過(guò)分別添加HRP-偶聯(lián)的山羊抗鼠和兔IgG(Zymed)和順序加入底物3，3',5，5'-四甲聯(lián)苯胺 (TMB)檢測(cè)結(jié)合的抗體。通過(guò)ELISA微孔板分析儀(Tecan US， Research Triangle Park, NC)測(cè)定450 nm吸收。
SARS-CoV感染的中和。SARS-CoV感染的中和按照先前所述進(jìn)行評(píng) 估[29]。簡(jiǎn)要地說(shuō)，將Vero E6細(xì)胞(5 X 104細(xì)胞/孔)接種于96孔組織培養(yǎng) 平板并且過(guò)夜生長(zhǎng)。將100TCIDso(5(P/。組織培養(yǎng)感染劑量)的SARS-CoV BJ01毒株(登記號(hào)AY278488)分別與等體積的稀釋的小鼠和兔血清混 合，并且在37。C溫育lh。將所述混合物添加到單層VeroE6細(xì)胞上。按 照先前所描述[29]，在感染后第3天記錄細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。中和滴度 代表按照Reed's方法[36]所計(jì)算在50%的孔中完全阻止CPE [34]的小鼠和 兔抗血清的稀釋液。
假病毒感染的中和。具有SARS-CoV S蛋白的假型HIV (HIV/SARS-CoV S)按照先前所述而制備[23, 24]。簡(jiǎn)要地說(shuō)，應(yīng)用Fugene 6 試劑(Boehringer Mannheim)，將293T細(xì)胞用編碼密碼子優(yōu)化的 SARS-CoVS蛋白的質(zhì)粒和編碼Env-缺陷型、表達(dá)螢光素酶的HIV-1基因 組的質(zhì)粒(pNL4-3.1uc.RE)共同轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后48 h收集含有 HIV/SARS-CoV S蛋白的上層清液，并且用于ACE2-轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的 單周期感染。簡(jiǎn)要地說(shuō)，將表達(dá)ACE2的293T細(xì)胞接種(104細(xì)胞/ 10到 96孔組織培養(yǎng)平板中并且生長(zhǎng)過(guò)夜。在加入細(xì)胞之前，將假病毒分別同2 倍連續(xù)稀釋的小鼠和兔血清一起在37。C預(yù)先溫育1 h。 24h后將在培養(yǎng)板 中添加新鮮培養(yǎng)基，并且再溫育48 h。將細(xì)胞用PBS洗滌，并且應(yīng)用包 含在螢光素酶試劑盒(Promega， Madison， WI)中的裂解試劑裂解。將等試樣 的細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到檢測(cè)發(fā)光信號(hào)的平底96孔板(Corning Costar, Corning, NY)，接著加入螢光素酶底物(Promega)。在Ultra 384微孔板分析儀(Tecan US)上立即確定相對(duì)亮度單位。
Sl蛋白與可溶ACE2結(jié)合的抑制。用2 |ig/ml重組可溶的ACE2 (R&D systems, Inc., Minneapolis, MN)于0.1 M碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)中4。C過(guò)夜 包被96孔ELISA板(Coming Costar)。用2%脫脂牛奶封閉后，將2嗎/ml Sl-C9添加到分別存在2倍連續(xù)稀釋的小鼠和兔血清的孔中。在37。C溫育 1 h后，將mAb 1D4 (National Cell Culture Center)加入并且繼續(xù)在37。C溫 育l h。洗滌后，將HRP-偶聯(lián)的山羊抗鼠IgG (Zymed)和底物TMB用于 檢測(cè)。
通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定Sl與細(xì)胞表達(dá)的ACE2的結(jié)合的抑制。將106 解離的293T/ACE2細(xì)胞用Hank's平衡鹽溶液(HBSS) (Sigma, St. Louis, MO) 洗滌，然后在存在或不存在指定稀釋倍數(shù)的兔血清時(shí)，將S1-C9添加到細(xì) 胞中至終濃度1 lag/ml，接著在室溫溫育30min。徹底洗滌后，將抗C9 mAb 1D4添加到細(xì)胞中至終濃度10pg/ml，并且在室溫溫育30min。將細(xì)胞用 HBSS洗滌，并且與l: 50稀釋的抗鼠IgG-FITC偶聯(lián)物(Sigma)在室溫繼 續(xù)溫育30 min。洗滌后，將細(xì)胞用含1%甲醛的PBS固定，并且應(yīng)用 CellQuest軟件，在Becton FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Mountain View, CA) 中分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
針對(duì)RBD-Fc的小鼠和兔抗血清含有結(jié)合于RBD和Sl結(jié)構(gòu)域的高滴 度抗體。將10只小鼠(M1-M10)用RBD-Fc免疫，并且將2只對(duì)照小鼠(N1 和N2)用PBS處理。在免疫前(免疫前)，和在以3 wks時(shí)間間隔的每次 增強(qiáng)后4天收集小鼠抗血清。通過(guò)ELISA檢測(cè)以1: 10，000稀釋的血清樣 品與重組融合蛋白R(shí)BD-Fc的結(jié)合。如在圖2A中所示，第一次增強(qiáng)后4 天收集的血清表現(xiàn)出中等的結(jié)合能力。然而，這種活性在以3wks時(shí)間間
隔的第二次和第三次增強(qiáng)后顯著地增加了 。在第三次增強(qiáng)后4天收集的抗
血清表現(xiàn)出最高的RBD-Fc結(jié)合能力。因此，我們應(yīng)用這批小鼠抗血清用 于后續(xù)的抗體滴定和中和實(shí)驗(yàn)。這些抗血清以劑量依賴(lài)型方式結(jié)合 RBD-Fc，平均滴度(GMT)在1: 312,500 (圖2B)。由于RBD-Fc還含有人 IgG-Fc片段，因此，除了RBD，小鼠血清中的抗體還可以結(jié)合Fc。因此， 我們檢測(cè)了針對(duì)重組蛋白Sl-C9的小鼠抗血清的結(jié)合能力，所述抗血清含 有RBD但是沒(méi)有Fc。如在圖2C中所示，小鼠抗血清以與圖2B中所示的 在用RBD-Fc作抗原的實(shí)驗(yàn)中所顯示的方式相似的方式結(jié)合Sl-C9，盡管 針對(duì)Sl-C9抗體的GMT (1: 62,500)比針對(duì)RBD-Fc的更低。這表明抗RBD 抗體是小鼠抗血清主要抗體群體中的一員。
對(duì)于在免疫前(免疫前)和以3 wks時(shí)間間隔的每次增強(qiáng)后IO天收 集的兔抗血清，也檢測(cè)它們結(jié)合RBD-Fc和Sl-C9的活性。如在圖3A中 所示，第一次增強(qiáng)后10天收集的抗血清(1: 10，000)具有最大的與RBD-Fc 反應(yīng)性，并且在第二次和第三次增強(qiáng)后保持所述高水平。在第一次增強(qiáng)后 10天收集的抗血清的GMT是1:7,812,500 (圖3B)。因此，我們將這些抗 血清樣品用于后續(xù)的研究。這些兔抗血清還以劑量依賴(lài)型方式結(jié)合 Sl-C9，具有1: 312,500的GMT (圖3C)，與用小鼠抗血清得到的結(jié)果一 致。
針對(duì)RBD-Fc的小鼠和兔抗血清含有高滴度的SARS-CoV-中和抗體。 應(yīng)用2種不同的檢測(cè)系統(tǒng)，即，在VeroE6中感染SARS-CoV，和在表達(dá) ACE2的293T細(xì)胞中感染具有SARS-CoV S蛋白的假型HIV (HIV/SARS-CoV S)，檢測(cè)所述抗血清它們的中和活性。來(lái)自5只小鼠 1: 10，240的抗血清和來(lái)自其余5只小鼠1:5,120的抗血清完全保護(hù)VeroE6 細(xì)胞免受SARS-CoV感染(即，沒(méi)有觀察到CPE并且細(xì)胞單層保持完好)。 在更高的血清稀釋度，細(xì)胞數(shù)目由于SARS-CoV在細(xì)胞中復(fù)制誘導(dǎo)的CPE 而減少。這里我們顯示從小鼠M8獲得的結(jié)果作為實(shí)例(圖4A)?；?Reed's方法[36]計(jì)算的平均中和性抗體滴度是1: 10,862。 1: 40稀釋的免 疫前小鼠血清對(duì)SARS-CoV感染沒(méi)有抑制活性。這些小鼠抗血清還高度 有效地抑制HIV/SARS CoV S假病毒的感染，具有1:13,636的50%中和 滴度(GMT)(圖4B)，這表明抗RBD抗體可以抑制SARS-CoV和含有
SARS-CoV S蛋白的假病毒的感染。類(lèi)似地，在第一次增強(qiáng)后10天收集 1: 10,240稀釋的兔抗血清也完全抑制由SARS-CoV在VeroE6細(xì)胞中復(fù)制 引起的CPE，具有1: 14,482的中和GMT (圖5)。這些兔抗血清也有效地 抑制HIV/SARS-CoV S假病毒的感染(圖6)。在第二次和第三次增強(qiáng)后 10天收集的抗血清具有同等的針對(duì)SARS-CoV和假病毒感染的中和活性 (數(shù)據(jù)未顯示)。
從針對(duì)RBD-Fc的抗血清中消除抗Fc抗體沒(méi)有影響RBD結(jié)合和中和 活性。由于重組融合蛋白R(shí)BD-Fc還含有人IgG Fc片段，所以期望這種 抗原也將誘導(dǎo)抗Fc抗體。事實(shí)上，兔抗血清(1:100)與在平板孔中包被的 人IgG-Fc起反應(yīng)(圖7A)。然而，由于消除抗Fc的抗血清在ELISA中 不與人IgG反應(yīng)(圖7A)，所以，通過(guò)將所述抗血清通過(guò)用人IgG偶聯(lián)的 柱子，抗Fc抗體可以從所述抗血清中消除。消除抗Fc的抗血清保留了 RBD結(jié)合活性(圖7B)和針對(duì)HIV/SARS-CoV S假病毒感染的中和活性 (圖7C)，同未處理的兔抗血清相當(dāng)。這些結(jié)果表明，由人IgG-Fc誘導(dǎo) 的抗血清中的抗Fc抗體對(duì)兔抗血清的RBD結(jié)合和病毒中和活性沒(méi)有貢 獻(xiàn)。
針對(duì)RBD-Fc的小鼠和兔抗血清有效地阻滯了 RBD與ACE2的結(jié)合。 我們分別應(yīng)用ELISA和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠和兔抗血清中的抗RBD抗體 是否阻滯RBD與可溶的和細(xì)胞相關(guān)的(cell-associated)ACE2的結(jié)合。由于 RBD-Fc還可以與抗血清中針對(duì)RBD-Fc的抗Fc抗體起反應(yīng)，我們?cè)谟糜?確定RBD結(jié)合的所有實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用只含有RBD但是沒(méi)有Fc的Sl-C9。 ELISA檢測(cè)中，將可溶的ACE2包被在ELISA平板的孔上，Sl-C9顯著 地結(jié)合ACE2 (數(shù)據(jù)未顯示)。小鼠和兔抗RBD抗血清都以劑量依賴(lài)型方 式有效地阻滯Sl與ACE2的結(jié)合，而免疫前血清沒(méi)有抑制活性(圖8A 禾口8B)。有趣地，來(lái)自5只小鼠(M6-M10)具有更好的抑制S1-ACE2結(jié) 合活性的血清在Vero E6細(xì)胞中具有比來(lái)自小鼠Ml-M5的抗血清更加有 效的針對(duì)SARS-CoV感染的中和活性(數(shù)據(jù)未顯示)。包被在酶標(biāo)板上的 可溶的ACE2可能失去天然構(gòu)象，所以我們還應(yīng)用了細(xì)胞表達(dá)的ACE2， 預(yù)計(jì)其保留天然構(gòu)象，用來(lái)在流式細(xì)胞測(cè)定中檢測(cè)結(jié)合RBD的能力。如 在圖8C中所示，當(dāng)用抗C9 mAb 1D4 (陽(yáng)性對(duì)照)測(cè)定時(shí)，Sl-C9顯著地結(jié)
合表達(dá)ACE2的細(xì)胞。如果不添加Sl-C9 (陰性對(duì)照)，只檢測(cè)到背景信 號(hào)。1: 100的兔抗血清有效地阻滯S1結(jié)合細(xì)胞表達(dá)的ACE2，而相同稀 釋度的免疫前兔血清沒(méi)有抑制活性。兔抗血清對(duì)Sl與表達(dá)ACE2的細(xì)胞 結(jié)合的抑制活性是劑量依賴(lài)性的。從兔抗血清中消除抗Fc抗體沒(méi)有影響 兔抗血清對(duì)S1-ACE2相互作用的抑制活性(圖8D)，這證實(shí)抗RBD活性 不是受到抗Fc抗體的介導(dǎo)。
結(jié)果討論
在SARS流行的2002/2003年期間，盡管缺乏有效的和具體的治療， 但是大多數(shù)SARS患者還是從這種急性疾病康復(fù)了，并且只有非常少數(shù)患 者可能被再次感染SARS-CoV (http:〃www.who.int/csr/sars/en)。中和性抗體 可在SARS患者康復(fù)期的血清中檢測(cè)到[37]。被動(dòng)給予康復(fù)期血清可用于 治療SARS-CoV感染(http:〃www.crienglish.com/144/ 2003-5-7/11@12493. htm)。
接種來(lái)自SARS-CoV感染的[38]或用MVA/S免疫的[35]小鼠的超免疫 血清在攻擊后減少了呼吸道中SARS-CoV的滴度。這些數(shù)據(jù)表明保護(hù)性 體液免疫是可獲得的并且可以開(kāi)發(fā)用于預(yù)防SARS的疫苗。
許多疫苗候選物正處于臨床試驗(yàn)和臨床前期的研究，包括編碼 SARS-CoV S蛋白的滅活疫苗、DNA疫苗和基于牛痘病毒的疫苗[9, 10, 34， 35]。這些試劑在動(dòng)物中有效地誘導(dǎo)保護(hù)性的中和性抗體反應(yīng)[34， 35]。在 本研究中，由于RBD是負(fù)責(zé)病毒與靶細(xì)胞上受體結(jié)合的S蛋白的主要功 能結(jié)構(gòu)域[24-26]，并且含有中和表位[39]，所以我們將重組融合蛋白 (RBD-Fc)用作免疫原來(lái)免疫小鼠和兔。針對(duì)其它冠狀病毒，諸如MHV， 傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和人冠狀病毒(HCoV-229E) S蛋白上的RBD的 抗體[40-42]，和針對(duì)所述冠狀病毒受體的那些抗體[43， 44]，高度有效地 阻滯RBD受體相互作用并且中和相應(yīng)的冠狀病毒感染。我們發(fā)現(xiàn)RBD-Fc 融合蛋白在免疫的小鼠和兔中激發(fā)高度有效的中和性抗體反應(yīng)，并且所述 抗血清在1:5,120-1:10,240的血清稀釋度可以完全阻滯SARS-CoV感染(圖 4和5)，具有1:10,381 (小鼠抗血清)和1:14,451 (兔抗血清)的平均中和滴 度，比來(lái)自用編碼全長(zhǎng)S蛋白的DNA疫苗和基于痘苗病毒的疫苗免疫的
小鼠的抗血清的平均中和滴度要高出約40-200倍[34， 35]。
由于全長(zhǎng)S蛋白包含RBD和其它病毒功能結(jié)構(gòu)域和多個(gè)中和表位， 預(yù)計(jì)它比單獨(dú)RBD誘導(dǎo)更加有效的中和性抗體。為什么RBD實(shí)際上比全 長(zhǎng)S蛋白激發(fā)滴度高得多的中和性抗體的一種可能的原因?yàn)椋笳吆蟹?中和性表位，其可以激發(fā)增強(qiáng)性抗體，如同由HIV和埃博拉病毒的包膜 糖蛋白上的抗原位點(diǎn)所誘導(dǎo)的那些[45-48]。來(lái)自一些冠狀病毒的S蛋白也 可能誘導(dǎo)增強(qiáng)性抗體。例如，用編碼貓科傳染性腹膜炎病毒(FIPV)的S蛋 白的牛痘病毒載體免疫貓?jiān)诓《竟艉髮?dǎo)致病毒復(fù)制的增強(qiáng)[49， 50]，并 且激發(fā)增強(qiáng)性抗體的表位位于S蛋白中[51]。盡管在用編碼SARS-CoV S 蛋白的DNA疫苗和基于痘苗病毒的疫苗免疫的小鼠中沒(méi)有觀察到增強(qiáng)的 病毒復(fù)制，但是這不可能排除這樣的可能性，即，增強(qiáng)性抗體滴度比中和 性抗體滴度更低。在這樣的情形中，增強(qiáng)性抗體可以抑制或"中和"中和 性抗體活性，這導(dǎo)致中和性抗體滴度降低。
重組融合蛋白R(shí)BD-Fc能夠誘導(dǎo)高度有效的中和性抗體的另一種可能 性可能是由于所述抗原包含人IgG Fc片段?？乖蔬f細(xì)胞(APCs)，諸如 樹(shù)突細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，可以將抗原捕獲，處理并且呈遞到T輔 助細(xì)胞，T輔助細(xì)胞調(diào)控抗體生產(chǎn)。已經(jīng)表明，APCs表達(dá)對(duì)IgG Fc高親 和力的受體，F(xiàn)qRI (也稱(chēng)為CD64)和低親和力受體，F(xiàn)qRIII (CD16) [52,53]。通過(guò)這些受體，APCs可以促進(jìn)含有抗原和抗體IgG的免疫復(fù)合 物的遞呈，并且增強(qiáng)針對(duì)所述免疫復(fù)合物的抗體應(yīng)答，從而導(dǎo)致自體免疫 疾病[53]。然而，通過(guò)所述抗原是病毒蛋白，諸如SARS-CoVS蛋白中的 RBD，將人IgGFc與其偶聯(lián)可以促進(jìn)RBD到免疫細(xì)胞的遞呈，以激發(fā)高 度有效的抗RBD抗體反應(yīng)并且中和SARS-CoV感染。
針對(duì)RBD的小鼠和兔抗血清有效地結(jié)合SARS-CoV S蛋白Sl結(jié)構(gòu)域 上的RBD (圖2和3)，并且抑制RBD與可溶的和細(xì)胞表達(dá)的ACE2的結(jié) 合(圖8)。這些結(jié)果證實(shí)小鼠和兔抗血清含有特異性靶向RBD的抗體。 盡管我們沒(méi)有檢測(cè)小鼠和兔抗RBD抗體在動(dòng)物模型中抗SARS-CoV攻擊 的保護(hù)性活性，但是體外所檢測(cè)的這些抗血清的高中和性滴度表明， RBD-Fc可以在動(dòng)物和人中誘導(dǎo)強(qiáng)保護(hù)性的免疫作用，這是根據(jù)針對(duì) SARS-CoV感染的有效的保護(hù)可以通過(guò)來(lái)自具有1:20到1:1，280范圍的中
和性抗體滴度的SARS患者的康復(fù)期血清[37]和通過(guò)來(lái)自用具有低中和性 抗體滴度(1:50-1:284)編碼S蛋白的DNA疫苗和基于痘苗病毒的疫苗免疫 的小鼠的抗血清[34，35]而獲得的。
大多數(shù)冠狀病毒的S蛋白，尤其是S1結(jié)構(gòu)域的序列，是高度可變的 [14]，這是在研發(fā)針對(duì)具有獨(dú)特的基因型和表型的病毒毒株的有效的疫苗 中的主要關(guān)注點(diǎn)。然而，最近的研究已經(jīng)表明SARS-CoV毒株十分穩(wěn)定， 并且變化沒(méi)有像最初預(yù)計(jì)的那樣多[IO]。在2002/2003年SARS流行病的 早期，由于在從動(dòng)物(例如，果子貍(palm civet)) SARS-樣-CoV到人 SARS-CoV傳播過(guò)程中的正向選擇壓力，SARS-CoVS蛋白R(shí)BD中的193 個(gè)氨基酸中有5個(gè)是易變的。然而，在中期和后期(在這兩個(gè)階段，大多 數(shù)毒株從SARS患者分離出來(lái))，在RBD序列中沒(méi)有突變[6]。并且，即 使RBD的線性序列可能是易變的，但是RBD的構(gòu)象是相對(duì)保守的，以保 證具有不同亞型的病毒與靶細(xì)胞上的特異受體結(jié)合。一個(gè)實(shí)例是單克隆抗
體B12，其識(shí)別HIV-1 gpl20上CD4結(jié)合結(jié)構(gòu)域上的中和性表位，并且中 和多種亞型的HIV-1臨床分離株，盡管來(lái)自相應(yīng)的毒株的gpl20中CD4 結(jié)合區(qū)域的線性序列是高度易變的[54, 55]。我們的數(shù)據(jù)表明，由于所述 抗血清不與覆蓋RBD序列的任何肽起反應(yīng)，所以小鼠和兔抗血清中針對(duì) RBD的抗體可能是主要識(shí)別RBD上的構(gòu)象表位(He等，未發(fā)表數(shù)據(jù))。這 些結(jié)果表明抗RBD抗體可以具有針對(duì)廣譜SARS-CoV毒株的特異性的中 和活性。
綜上所述，由于與滅活病毒或活的減毒病毒載體相比較，它能誘導(dǎo)抑 制Sl與受體的相互作用以及中和SARS-CoV感染的高度有效的抗體，并 且僅具有低水平的風(fēng)險(xiǎn)，所以重組融合蛋白R(shí)BD-Fc是理想的疫苗候選物。 因此，RBD-Fc可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為用于SARS預(yù)防的有效的和安全的亞單 位疫苗。 參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1.一種包括有效量的分離的多肽或重組蛋白的疫苗，其中所述分離的多肽或重組蛋白含有嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀病毒突起蛋白中受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列或其功能片段。
2. 權(quán)利要求1的疫苗，其中所述受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括含有下述序列的全部或部分序列nitnlcpfgevfnatkfpsvyawerkkisncvadysvlynstetstfkcygvsatk:lnd:lcfsnvyadsfwkgddvrqiapgqtgv工ad ynykl p ddfmgcvlawntrn工dat stgn ynykyrylrhgklrp ferdisnvp fs p dgkpct p palnc ywplndygfytttgigyqp yrvwls fellnapatv (SEQIDNO: 1)。
3. —種包括有效量的核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子包括一個(gè)片段 的序列，其編碼嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀病毒突起蛋白中的 受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列或其功能片段。
4. 一種分離的多肽，其不同于嚴(yán)重急性呼吸道綜合征病毒的S1蛋白，包 括嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀病毒突起蛋白中的受體結(jié)合結(jié)構(gòu) 域的序列或其功能片段。
5. 權(quán)利要求4的分離的多肽，其包括含有下述序列的全部或部分序列N工TNLC P FGEVFNATKFP SVYAWERKK工SNCVADY SVLYN S T FFS TFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFWKGDDVRQIAPGQTGVIA 訓(xùn)YKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYIiRHGKLRPFERDIS NVP FS P DGKPCT P PALNC YWPLND YGFYTTTGIGYGP YRVWLS FELLNAPatv (SEQIDNO: 1)。
6. 權(quán)利要求4或5的分離的多肽，其連接于物質(zhì)，所述物質(zhì)包括IgG Fc 結(jié)構(gòu)域，其功能片段或者含有IgGFc結(jié)構(gòu)域或其功能片段的物質(zhì)。
7. 權(quán)利要求6的連接的多肽，其包括含有下述序列的全部或部分序列 sft:lyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqks:ls:lspg (SEQ ID NO: 2)。
8. 權(quán)利要求6或7的分離的連接多肽，其中所述IgGFc是來(lái)自人、兔、 小鼠和其它動(dòng)物。
9. 權(quán)利要求6或7的分離的連接多肽，其為融合蛋白。
10. —種核酸分子，其包括編碼權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)的多肽的片段的序 列。
11. 一種載體，其包括權(quán)利要求10的包含片段的序列的核酸分子。
12. —種組合物，其包括有效量的權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)的分離的多肽，權(quán) 利要求10的核酸片段，或權(quán)利要求11的載體。
13. —種藥物組合物，其包括權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)的分離的多肽，或權(quán)利 要求10的包括片段的序列的核酸分子，或權(quán)利要求11的載體，和藥 用載體。
14. 一種用于在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)嚴(yán)重急性呼吸道綜合征病毒的抗體的方 法，其包括給所述受試者施用權(quán)利要求1或2的疫苗，或有效量的下 列各項(xiàng)權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)的分離的多肽，或權(quán)利要求10的包括 片段的序列的核酸分子，或權(quán)利要求11的載體，或權(quán)利要求11或12 的組合物。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述抗體是中和性的。
16. 權(quán)利要求14或15的方法，其中所述受試者是人或動(dòng)物。
17. 權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是多克隆抗體。
18. 權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
19. 一種由權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的抗體。
20. —種抗獨(dú)特型抗體或其功能部分，其針對(duì)權(quán)利要求18的單克隆抗體。
21. —種疫苗，其包括有效量的權(quán)利要求20的抗獨(dú)特型抗體或其功能部分。
22. —種用于確定包含在嚴(yán)重急性呼吸道綜合征病毒的S1中的中和性表位 的方法，其包括步驟(a) 從SARS CoV S蛋白的RBD序列產(chǎn)生肽；(b) 用所述肽免疫動(dòng)物；(c) 從所免疫的動(dòng)物收集血液；和 (d)檢測(cè)收集自用衍生于SARS CoV S蛋白R(shí)BD的肽免疫的動(dòng)物的抗 血清針對(duì)SARS-CoV的中和活性。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述動(dòng)物是兔或小鼠。
24. 通過(guò)權(quán)利要求22的方法確定的表位，或含有所述表位的序列或構(gòu)象的 分離的肽，或包括編碼所述表位的片段的序列的核酸分子。
25. —種化合物，其含有權(quán)利要求23的表位或其功能等價(jià)物。
26. —種組合物，其包括權(quán)利要求23的表位，權(quán)利要求24的分離的肽， 或權(quán)利要求25的化合物，或包括編碼所述表位的片段的序列的核酸分 子。
27. —種疫苗，其包括有效量的權(quán)利要求26的組合物。
28. —種用于在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)嚴(yán)重急性呼吸道綜合征病毒的抗體的方 法，其包括給所述受試者施用權(quán)利要求27的疫苗。
29. —種增加抗原免疫原性的方法，其包括將所述抗原連接于IgG Fc結(jié)構(gòu) 域，其功能片段或者含有IgGFc結(jié)構(gòu)域或其功能片段的物質(zhì)。
30. —種增加抗原的免疫原性的組合物，其包括有效量的抗原，所述抗原 連接到IgG Fc結(jié)構(gòu)域或其功能片段或者含有IgG Fc結(jié)構(gòu)域或其功能片 段的物質(zhì)上。
31. 權(quán)利要求29的方法或權(quán)利要求29的組合物，其中所述抗原連接到IgG Fc結(jié)構(gòu)域或其功能片段上以形成融合蛋白。
32. —種增加抗原在受試者中免疫原性的方法，其包括給所述受試者施用 所述抗原，所述抗原連接到IgGFc結(jié)構(gòu)域或其功能片段，或者含有IgG Fc結(jié)構(gòu)域或其功能片段的物質(zhì)上。
33. —種用于增加抗原的免疫原性的組合物，其包括有效量的抗原和IgG Fc結(jié)構(gòu)域，其功能片段，或者含有IgGFc結(jié)構(gòu)域或其功能片段的物質(zhì)。
34. 權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)的方法或權(quán)利要求33的組合物，其中所述抗 原衍生于一種傳染性試劑。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中所述免疫原性的增加導(dǎo)致高水平的中和抗體。
36. 權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)的方法或權(quán)利要求33的組合物，其中所述抗 原是可以誘導(dǎo)抗體的任何抗原。
37. 權(quán)利要求36的方法，其中所述免疫原性的增加導(dǎo)致高滴度的針對(duì)所述 抗原的抗體。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述免疫原性的增加導(dǎo)致具有高結(jié)合親和力 的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種疫苗，其包括有效量的含有SARS相關(guān)的冠狀病毒突起蛋白中受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列或其功能片段的分離的多肽或重組蛋白，或者提供一種核酸分子，其包括編碼嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀病毒突起蛋白中受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列或其功能片段的序列。本發(fā)明提供一種用于增加抗原的免疫原性的組合物，其包括有效量的抗原和IgG Fc結(jié)構(gòu)域，其功能片段，或者含有IgG Fc結(jié)構(gòu)域或其功能片段的物質(zhì)。所述抗原和IgG Fc可以是連接的或不連接的。最后，本發(fā)明還提供將任何上述組合物用于免疫的方法。
文檔編號(hào)C07K1/00GK101098710SQ200580026179
公開(kāi)日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2005年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月2日
發(fā)明者何玉先, 劉叔文, 姜世勃 申請(qǐng)人:紐約血液中心