專利名稱：：診斷應(yīng)激的藥物和方法診斷應(yīng)激的藥物和方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體上涉及測(cè)定免疫系統(tǒng)狀態(tài)的方法和藥物。更具體地說，本發(fā)明涉及以下用途的分子和試驗(yàn)定量或定性測(cè)定應(yīng)激對(duì)免疫系統(tǒng)的影響，因應(yīng)激導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能障礙而對(duì)疾病或病癥易感，與監(jiān)測(cè)動(dòng)物對(duì)付應(yīng)激的能力。本發(fā)明可用于檢測(cè)對(duì)免疫調(diào)節(jié)治療的反應(yīng)，監(jiān)測(cè)在應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)天然疾病的免疫應(yīng)答。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于監(jiān)測(cè)徑賽動(dòng)物的訓(xùn)練，檢測(cè)衰老對(duì)應(yīng)激和外部應(yīng)激反應(yīng)能力的影響，能夠?qū)σ蚴軕?yīng)激作用而處于患病危險(xiǎn)或易于患病動(dòng)物作出更好治療和處理決定。發(fā)明背景
發(fā)明內(nèi)容免疫系統(tǒng)有保護(hù)生物免遭外來侵襲和攻擊的作用。哺乳動(dòng)物的宿主免疫系統(tǒng)按功能可分為適應(yīng)性免疫和先天性免疫。先天免疫力往往是對(duì)外部攻擊的第一道防線，由天然屏障組成，例如角質(zhì)表面、分泌物和化學(xué)物質(zhì)，如皮膚、粘膜、溶菌酶和急性期蛋白。大多數(shù)生物有先天免疫系統(tǒng)，它是非特異性的，作為先天免疫系統(tǒng)一部分的許多防御分子在廣泛物種之間進(jìn)化上保守(例如，在無脊椎動(dòng)物進(jìn)化早期己出現(xiàn)補(bǔ)體組分)。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生特異性應(yīng)答并"記住"感染或入侵因子從而使宿主對(duì)以后的攻擊產(chǎn)生回憶應(yīng)答。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)按功能也可分為體液和細(xì)胞免疫。體液免疫由可溶性因子組成，在哺乳動(dòng)物中是抗體。高等生物的免疫系統(tǒng)細(xì)胞由淋巴(細(xì)胞)或骨髓(細(xì)胞)系組成。淋巴細(xì)胞在胸腺(T細(xì)胞)或骨髓(B細(xì)胞)中分化。B細(xì)胞和T細(xì)胞形態(tài)學(xué)相同。骨髓細(xì)胞有吞噬細(xì)胞和其它細(xì)胞，例如血小板和肥大細(xì)胞。吞噬細(xì)胞有單核細(xì)胞或多形核細(xì)胞。[免疫系統(tǒng)及其細(xì)胞和體液組分的概述見《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(EssentialImmunology),第十版，Roitt和Delves,BlackwellPublishing,2001;《免疫生物學(xué).健康人和病人的免疫系統(tǒng)》(Immunobiology.TheImmunesysteminHealthandDisease),第四版，Janeway等，GarlandPublishing,1999〗。哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的功能性研究已有大量文獻(xiàn)，可采用許多試驗(yàn)來檢測(cè)免疫系統(tǒng)的功能。與細(xì)胞免疫系統(tǒng)相比，體液免疫系統(tǒng)更易于進(jìn)行功能性測(cè)試。例如，抗體與其靶分子特異性結(jié)合，可采用諸如抗體擴(kuò)散與沉淀試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定來直接檢測(cè)，或可用于抗原捕獲試驗(yàn)來檢測(cè)是否存在侵入性生物。細(xì)胞免疫系統(tǒng)的功能更難于檢測(cè)，往往包括用染色劑或細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的特異性抗體對(duì)細(xì)胞的不同亞群進(jìn)行簡(jiǎn)單計(jì)數(shù)。例如，醫(yī)學(xué)上最常見的血液檢測(cè)之一是檢測(cè)紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板數(shù)目的全血計(jì)數(shù)(CBC)。區(qū)別性白細(xì)胞計(jì)數(shù)采用瑞氏(Wright)染色來計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞。細(xì)菌感染往往導(dǎo)致外周血液樣品中嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量增加，寄生蟲感染往往導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量增加。然而，對(duì)外周血液樣品中白細(xì)胞類型的計(jì)數(shù)往往不是免疫系統(tǒng)功能的良好指標(biāo)，它是非特異性的(不能確定感染或攻擊的性質(zhì))，不能區(qū)分B和T細(xì)胞譜系的淋巴細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，T淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)(細(xì)胞)和效應(yīng)(細(xì)胞)。根據(jù)B和T細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的不同(標(biāo)記)可區(qū)分它們的各種亞群。B細(xì)胞在細(xì)胞表面表達(dá)免疫球蛋白(抗體)，T細(xì)胞根據(jù)它們的發(fā)育和功能階段表達(dá)不同標(biāo)記。已開發(fā)了許多不同的試劑(往往是抗體)來區(qū)分人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的T和B細(xì)胞不同亞群，許多試劑可購自例如AlexisCorporation(www.alexis-corp.com)等公司。此外，B和T細(xì)胞(包括亞群)簡(jiǎn)單計(jì)數(shù)不能提供這些細(xì)胞功能的信息。制備用于檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記的試劑是費(fèi)力和高度專門化的工作。檢測(cè)細(xì)胞免疫功能有更直接的方法，包括空斑形成、趨化、隨機(jī)遷移、超氧化物陰離子釋放、測(cè)定用植物凝集素體外刺激后循環(huán)CD4+細(xì)胞中的ATP濃度、耙細(xì)胞的熒光染料釋放試驗(yàn)。但許多這些檢驗(yàn)費(fèi)力，需要預(yù)先制備細(xì)胞和純化方法(往往影響隨后試驗(yàn)的結(jié)果)，并且只能檢測(cè)細(xì)胞某一特定亞組的功能?？傊壳靶枰行У貦z測(cè)免疫系統(tǒng)功能，特別是細(xì)胞免疫系統(tǒng)功能的方法。'競(jìng)賽動(dòng)物不能將它們的健康狀況告知它們的主人或訓(xùn)獸師。此外，人類運(yùn)動(dòng)員往往不知曉自己的健康狀況(因?yàn)楦邚?qiáng)度訓(xùn)練)或不能將這種情況有效地告知教練或醫(yī)師。因此，也需要更有效地監(jiān)測(cè)細(xì)胞免疫系統(tǒng)(特別是競(jìng)賽動(dòng)物)的方法。自從首次發(fā)現(xiàn)應(yīng)激(狀態(tài))可激活對(duì)身體有益或有害的生理應(yīng)答幾乎已有70年了(SeyleH.，1936，Atowe，138:32)。應(yīng)激是導(dǎo)致機(jī)體或精神緊張的一種物理、化學(xué)或情感因素，它可以是致病因素之一。Pedersen等(1994，/W"5iwrtoM^/.，15:5116-5121)發(fā)表文章綜述了對(duì)應(yīng)激與疾病領(lǐng)域所進(jìn)行的工作。近年來，免疫學(xué)領(lǐng)域的高速發(fā)展對(duì)社會(huì)心理學(xué)、營養(yǎng)學(xué)和生理因素誘導(dǎo)的應(yīng)激狀態(tài)與免疫系統(tǒng)之間的相互作用產(chǎn)生了強(qiáng)烈興趣。此工作的主要前提是應(yīng)激可通過產(chǎn)生免疫抑制作用而提高對(duì)疾病的易感性。這在與免疫學(xué)機(jī)制，例如感染、惡性腫瘤和自身免疫疾病密切相關(guān)的疾病中尤其如此。證明應(yīng)激可導(dǎo)致免疫力改變的研究包括許多模型，在這些模型中大多數(shù)類型的實(shí)驗(yàn)性和天然產(chǎn)生的應(yīng)激與免疫系統(tǒng)諸組分的改變相關(guān)聯(lián)。美國國家宇航局(NASA)進(jìn)行了一些最早期的工作。NASA的研究顯示在空間飛行急降落階段(splash-downphase)白細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞升高。然而，在回到地球后的前3天內(nèi)促分裂原刺激的淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答反應(yīng)受損。在發(fā)射前，可能由于期待的原因也觀察到淋巴細(xì)胞對(duì)這種刺激的應(yīng)答略微降低。應(yīng)激與免疫功能的概述見"應(yīng)激、免疫力與疾病一綜述"(Stress,ImmunityandIllness—AReview),Dorian和Garfmkel著，PsychologicalMedicine,17:393-407，(1987)。也已知身體活動(dòng)與鍛煉可產(chǎn)生免疫系統(tǒng)的各種改變。劇烈鍛煉的作用看來可抑制免疫功能，損傷宿主對(duì)上呼吸道感染的防護(hù)能力。流行病學(xué)研究普遍顯示運(yùn)動(dòng)越劇烈對(duì)上呼吸道感染的危險(xiǎn)越大。參見Heath等，1992，S;oWMW"'we，14(6)353-365。除了身體活動(dòng)和鍛煉之外，外部因素例如創(chuàng)傷(身體的)、主要生命活動(dòng)、身體健康狀況和生活方式可導(dǎo)致應(yīng)激狀態(tài)。感知這些外部因素的作用方式與身體調(diào)整方式可影響最終的生理應(yīng)答。主要由交感神經(jīng)系統(tǒng)和下丘腦、垂體、腎上腺軸(HPA軸)組成的始停靜止(allostatic)系統(tǒng)應(yīng)對(duì)機(jī)體對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)(McEwenB.，1998，WewEwg/am/Jowma/o/Me^"'"e，338:171-179)。術(shù)語"始停靜止負(fù)荷"指啟動(dòng)復(fù)雜應(yīng)答與停止此應(yīng)答之間的平衡所致的生理應(yīng)答量。不斷的應(yīng)激、對(duì)應(yīng)激不適應(yīng)、不能關(guān)閉始停靜止應(yīng)答與某一系統(tǒng)中缺乏始停靜止應(yīng)答導(dǎo)致另一系統(tǒng)應(yīng)答增加可產(chǎn)生始停靜止負(fù)荷。有強(qiáng)有力的證據(jù)表明始停靜止負(fù)荷可導(dǎo)致對(duì)疾病的易感性、患病風(fēng)險(xiǎn)和發(fā)病率增加。例如，應(yīng)激誘導(dǎo)的血壓升高可激發(fā)人心肌梗塞與靈長類動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化(Muller等，1989，C7簡(jiǎn)/加.o"，79:733-743，Kaplan等，1991C〖腦/油o",84增刊VI:VI-23-VI-32)。高強(qiáng)度田徑訓(xùn)練增加的始停靜止負(fù)荷可導(dǎo)致體重減輕、閉經(jīng)和神經(jīng)性厭食(Boyar等，1977，7Vew￡"g//M/.，296:190-193;Loucks等，1989，JC/fn.五mfocn'm/.Mefak/.，68:402-411)。小鼠的反復(fù)群居爭(zhēng)斗失敗(socialdefeat)(應(yīng)激源)與已知是免疫抑制劑的皮質(zhì)酮血漿濃度升高相關(guān)(Stark等，爿m.J.iegw/,/"feg/r.Com;.P/zjw.o/.,280:R1799陽R1805)。年齡與HPA軸能力關(guān)閉相關(guān)，對(duì)生理系統(tǒng)的長時(shí)間刺激通過HPA軸可導(dǎo)致大腦海馬回受損及隨后的認(rèn)知缺陷(Lupien等，1994，JA^wmsc/.,14:2893-2903)。在確定具有遺傳性HPA軸反應(yīng)低下的Lewis大鼠中，炎性應(yīng)答增加可導(dǎo)致自身免疫和炎性疾病發(fā)病率增加(Sternburg等，1989，尸rac.A^/.JcW.&/，fOS"，86:4771-4775)。也認(rèn)為HPA反應(yīng)低涉及人纖維肌痛(humanfibromyalgia)(Crofford等，1994，臉謂.，37:1583-1592)、慢性疲勞綜合征(PoteliakhoffA.，1981，J尸^c/zosom.L，25:91-95)、嬰兒異位性皮炎(Buske-Kirschbaum等，1997，i^yc/zosommet/.，59:419-426)和創(chuàng)傷后應(yīng)激疾病(Yehuda等，1991，5/o.P^c/z/afr;;,30:1031-1048)。嘗試了采用以下代謝和心血管生理學(xué)量度來模擬(approximating)始停靜止負(fù)荷，包括收縮血壓、過夜尿皮質(zhì)醇含量和兒茶酚胺分泌量、腰圍與臀圍比例、糖基化血紅蛋白值、血清總膽固醇濃度中血清高密度脂蛋白比例、硫酸脫氫表雄酮血清濃度和高密度脂蛋白膽固醇的血清濃度。檢測(cè)這些參數(shù)(發(fā)現(xiàn))具有較低始停靜止?fàn)顟B(tài)的患者身體和精神功能較強(qiáng)，而心原的血清濃度高也與冠心病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)(Markowe等，1985，BritishMed.J,291:1312-1314)。此外，注意到用磁共振成像檢測(cè)到應(yīng)激誘導(dǎo)了海馬回CA3區(qū)中的錐體神經(jīng)元萎縮(SapolskyR.M.，1996，&/麵，273:749-750)。這些檢測(cè)需要多種不同的試驗(yàn)，費(fèi)用昂貴、費(fèi)力且只能提供始停靜止負(fù)荷的近似值?？傊?，需要更有效的檢測(cè)始停靜止負(fù)荷的方法。應(yīng)激狀態(tài)能影響免疫系統(tǒng)是熟知的(Hawkley和Cacioppo，2004，5ra/"/mm.，18:114-119;Engler等，2004，JA^w/w'mm.,148:106-115;Woods等，2003,5m/"_Se/wv./mw.，17:384-392;Mars等，1998，5/o//z>^.J"Cow肌，249:366-370;Bierhaus等，2003，/Voc,A/a",Jcad5W，(T/5^，100(4):1920-1925;Horohov等，1996，F(xiàn)e〃mm而o/,/7wmmo;a仇，53:221-233)。應(yīng)激主要通過交感神經(jīng)系統(tǒng)和HPA軸導(dǎo)致兒茶酚胺、促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇(類固醇的一個(gè)例子)釋放進(jìn)而作用于免疫系統(tǒng)。已知這些分子具有免疫調(diào)節(jié)作用，但它們的作用機(jī)理尚未完全了解。例如，糖皮質(zhì)激素(類固醇)，如皮質(zhì)醇能與細(xì)胞外表的類固醇受體結(jié)合，然后直接轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核。一旦進(jìn)入核中，類固醇激素可通過基因編碼區(qū)上游的類固醇效應(yīng)元件來調(diào)節(jié)基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫功能(Geng和Vedeckis，2004，Mo/.五Woot'"o/.，18(4):912-924)。按照對(duì)免疫系統(tǒng)的影響，可將應(yīng)激狀態(tài)分為急性(一次持續(xù)不到兩天)和慢性形式(應(yīng)激持續(xù)數(shù)日或數(shù)月)。已證實(shí)急性應(yīng)激能通過使白細(xì)胞從血液再分配至各身體區(qū)室(bodycompartment),例如皮膚、淋巴結(jié)和骨髓而增強(qiáng)免疫力(Dhabhar等，1995，J./mmwo/.，154:5511-5527)，該作用部分是因內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素釋放所致。據(jù)報(bào)道急性應(yīng)激的影響可持續(xù)3-5天(Dhabhar等，1996，J/wwwo/.，157:1638-1644)。另一方面，慢性應(yīng)激可引發(fā)HPA軸和自主神經(jīng)系統(tǒng)(失調(diào))，降低細(xì)胞免疫應(yīng)答并增加對(duì)疾病的易感性(McEwen等，1997，萬ra/"i"^乂，23:79-113;Cohen等，1992，i^yc/zo/.Scz'.，3:301-304;Cohen等，1993，WM4，277:1940-1944;Peijie等，2003，h/e&/e"c^，72:2255-2262)?？傊枰玫臋z測(cè)和監(jiān)測(cè)始停靜止負(fù)荷對(duì)免疫系統(tǒng)功能影響的方法。發(fā)明概述本發(fā)明代表了對(duì)目前定量測(cè)定始停靜止負(fù)荷與檢測(cè)和監(jiān)測(cè)免疫功能技術(shù)的明顯進(jìn)步。對(duì)宿主細(xì)胞，特別是循環(huán)白細(xì)胞的某些功能性標(biāo)記水平的檢測(cè)部分是估計(jì)性的。更具體地說，本發(fā)明涉及的分子和試驗(yàn)可用于篩檢和監(jiān)測(cè)因應(yīng)激狀態(tài)導(dǎo)致免疫功能不全所致疾病或有患病風(fēng)險(xiǎn)的動(dòng)物，測(cè)定動(dòng)物對(duì)付或應(yīng)付外部應(yīng)激的能力，和監(jiān)測(cè)給予免疫調(diào)節(jié)性藥物時(shí)的免疫功能。本發(fā)明可實(shí)際應(yīng)用于監(jiān)測(cè)處于應(yīng)激狀態(tài)，特別是田徑訓(xùn)練中的動(dòng)物，檢測(cè)衰老對(duì)外部應(yīng)激起反應(yīng)能力的影響，能夠?qū)σ驊?yīng)激的作用而處于患病危險(xiǎn)或易患病動(dòng)物作出更好的治療和處理決定。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明可實(shí)際應(yīng)用于檢測(cè)對(duì)疫苗接種或免疫調(diào)節(jié)治療的反應(yīng)，例如，處于應(yīng)激狀態(tài)的動(dòng)物可能不會(huì)對(duì)疫苗接種或治療產(chǎn)生適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)性應(yīng)答。在其它實(shí)施方案中，當(dāng)某動(dòng)物處在應(yīng)激狀態(tài)時(shí)或因?qū)?yīng)激的不恰當(dāng)應(yīng)答而處于危險(xiǎn)中時(shí)，本發(fā)明可實(shí)際應(yīng)用于監(jiān)測(cè)對(duì)天然疾病的免疫應(yīng)答。這代表了對(duì)處于應(yīng)激狀態(tài)的動(dòng)物的篩選、監(jiān)測(cè)和處理的明顯且出乎意料的進(jìn)步。因此，本發(fā)明致力于解決的問題是通過檢測(cè)，例如可檢測(cè)宿主細(xì)胞基因表達(dá)模式的差別(differentialgeneexpressionpattern)來檢測(cè)是否存在生理學(xué)應(yīng)激應(yīng)答及其程度，或評(píng)估健康狀況，包括免疫系統(tǒng)功能。優(yōu)選的實(shí)施方案包括監(jiān)測(cè)免疫系統(tǒng)外周白細(xì)胞中某些基因的表達(dá)，這反映在與始停靜止負(fù)荷或免疫調(diào)節(jié)活動(dòng)有關(guān)的RNA水平或蛋白質(zhì)表達(dá)模式的改變。因此，本發(fā)明一方面提供測(cè)定測(cè)試對(duì)象中對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答或相關(guān)疾病的存在及其程度的方法。這些方法一般包括檢測(cè)該對(duì)象中至少一種選自以下的基因(本文也稱為"應(yīng)激標(biāo)記基因")的異常表達(dá)(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的基因SEQIDNO:l、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、卯、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)含有編碼與以下任一序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴(yán)謹(jǐn)性、中嚴(yán)謹(jǐn)性或高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的基因。按照本發(fā)明，這些應(yīng)激標(biāo)記基因在對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答中或具有始停靜止負(fù)荷的動(dòng)物中表達(dá)異常。合適的相關(guān)疾病是免疫抑制疾病。存在對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答或相關(guān)狀態(tài)與心理應(yīng)激或身體應(yīng)激(例如，身體強(qiáng)迫癥(physicalduress),如田徑訓(xùn)練和身體創(chuàng)傷)適當(dāng)相關(guān)。示范性的心理疾病包括抑郁、全身性焦慮癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激疾病、恐慌、慢性疲勞、疼痛性腦病(myalgicencephalopathy)、通過(行動(dòng))抑制產(chǎn)生的應(yīng)激(stressthroughrestraint)、失眠、暴食和行為(自發(fā)性)調(diào)節(jié)(behavioral(operant)conditioning^其它心理疾病，特別是涉及獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用的，包括但不限于與監(jiān)禁、急轉(zhuǎn)向、航運(yùn)或人-動(dòng)物相互作用相關(guān)的應(yīng)激狀態(tài)。身體應(yīng)激的示范性例子包括身體強(qiáng)迫癥，如田徑訓(xùn)練和身體創(chuàng)傷。本文所用的應(yīng)激標(biāo)記基因多核苷酸表達(dá)產(chǎn)物稱為"應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸"。該應(yīng)激標(biāo)記基因的多肽表達(dá)產(chǎn)物在本文稱為"應(yīng)激標(biāo)記多肽"。因此，在一些實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)選自以下的應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸的異常表達(dá)(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、,29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、,81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)含有編碼與以下任一序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分至少含有該序列的15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少可在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)選自以下應(yīng)激標(biāo)記多肽的異常表達(dá)(i)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(ii)含有以下任一序列一部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；(iii)所含氨基酸序列與以下任一序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基至少有30%(和至少31%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)相似性的多肽SEQIDN0:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;和(iv)含有以下任一序列一部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、,36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少'5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，并且與和(i)、(ii)或(iii)的序列具有免疫相互作用活性的抗原結(jié)合分子具有免疫相互作用活性。應(yīng)激標(biāo)記基因的異常表達(dá)一般通過以下步驟檢測(cè)(1)檢測(cè)得自對(duì)象生物學(xué)樣品中至少一種應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性，和(2)將所檢測(cè)到的各表達(dá)產(chǎn)物水平或功能活性與得自一位或多位正常對(duì)象或一位或多位未處于應(yīng)激狀態(tài)對(duì)象的參比樣品中相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性作比較，其中與參比樣品中相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性相比，該生物學(xué)樣品中表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性有差異，表明存在對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)該表達(dá)產(chǎn)物或各表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)到的水平或功能活性與相應(yīng)的該表達(dá)產(chǎn)物或各表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)到的水平或功能活性不同時(shí)，該方法還包括測(cè)定應(yīng)激應(yīng)答的程度(或應(yīng)激水平)或免疫調(diào)節(jié)水平。在這些實(shí)施方案中，與各相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性相比，該差異通常表示各表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性至少增加約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%，或者甚至至少增加約100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%;或者至少降低約10%、20%、30%40%、50°/。、60%、70%、80%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%，或者甚至至少降低約99.5%、99.9%、99.95%、99.99%、99.995%或99.999%，即本文所稱的"異常表達(dá)"。在此類型的示范性例子中，通過檢測(cè)至少一種選自以下應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸的水平或功能活性降低來測(cè)定是否存在對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、4、7、9、11、19、21、24、25、33、34、38、39、40、41、42、50、51、56、57、59、62、63、66、70、71、73、75、79、81、83、89、90、91、92、93、97、99、105、107、108、111、119、121、122、123、129、130、137、139、140、141、142、143或185，或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸seqidno:2、8、10、12、20、22、43、58、60、67、71、72、74、76、80、82、84、94、98、100、106、112、120、122、123、124或138;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、8、10、12、20、22、43、58、60、67、71、72、74、76、80、82、84、94、98、100、106、112、120、122、123、124或138，其中所述部分至少含有該序列的15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴(yán)謹(jǐn)性、中嚴(yán)謹(jǐn)性或高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它示范性例子中，通過檢測(cè)至少一種選自以下應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸的水平或功能活性的增加來確定是否存在對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:5、13、15、16、17、23、26、28、29、30、32、35、37、44、46、48、52、54、55、64、68、77、85、87、95、96、101、103、113、115、117、118、125、126、131、133、135、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、183、184、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206或210，或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、14、18、27、31、36、45、47、49、53、65、69、78、86、88、102、104、114、116、132、134、136、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、189、191、193、197、199、201、203、205、207或211;(c)含有編碼與以下任一序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、14、18、27、31、36、45、47、49、53、65、69、78、86、88、102、104、114、116、132、134、136、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、189、191、193、197、199、201、203、205、207或211，其中所述部分至少含有該序列的15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴(yán)謹(jǐn)性、中嚴(yán)謹(jǐn)性或高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)該表達(dá)產(chǎn)物或各表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)到的水平或功能活性與相應(yīng)的該表達(dá)產(chǎn)物或各表達(dá)產(chǎn)物的所檢測(cè)水平或功能活性相同或相似時(shí)，該方法還包括測(cè)定是否不存在對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答。在這些實(shí)施方案中，各表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)到的水平或功能活性與各相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)到的水平或功能活性的差異不超過約20%、18%、16%、14%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1°/?；?.1%時(shí)，下文稱為"正常表達(dá)"。在一些實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45種應(yīng)激標(biāo)記基因各表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。例如，這些方法可包括單獨(dú)檢測(cè)一種應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸或聯(lián)合檢測(cè)多至44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1種其它應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸的水平或功能活性。在另一實(shí)施例中，這些方法可包括單獨(dú)檢測(cè)一種應(yīng)激標(biāo)記多肽或聯(lián)合檢測(cè)多至44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或l種其它應(yīng)激標(biāo)記多肽的水平或功能活性。在此類型的示范性例子中，這些方法包括檢測(cè)與存在對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答或風(fēng)險(xiǎn)高度相關(guān)的至少1、2、3、4、5或6種應(yīng)激標(biāo)記基因(下文稱為"一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因水平")各表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:89、90、103、125、126、163、178、182、184或190，或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下氨基酸序列多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:104、179、183或189;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:104、179、183或189，其中所述部分至少含有該序列的15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴(yán)謹(jǐn)性、中嚴(yán)謹(jǐn)性或高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它示范性例子中，這些方法包括檢測(cè)與存在針對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答或風(fēng)險(xiǎn)高度相關(guān)的至少1、2、3、4、5、6、7或8種應(yīng)激標(biāo)記基因(下文稱為"二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因水平")各表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于(a)含有與以下任一序列具有至少50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:17、23、44、52、133、135、144、147、148、151、155、192、196、202或206，或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:18、20、45、53、134、136、149、152、193、197或207;(c)含有編碼與以下任一序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:18、20、45、53、134、136、149、152、193、197或207,其中所述部分至少含有該序列的15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴(yán)謹(jǐn)性、中嚴(yán)謹(jǐn)性或高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它示范性例子中，這些方法包括檢測(cè)與存在對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答或風(fēng)險(xiǎn)中等相關(guān)的至少l、2、3、4、5、6、7、8、9或10種應(yīng)激標(biāo)記基因(下文稱為"三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因")各表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:5、30、37、48、54、55、64、66、70、77、79、85、91、92、95、96、101、115、117、118、121、150、153、158、164、170、180、186或198,或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、31、49、65、67、78、80、86、102、116、122、154、159、181或199;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、31、49、65、67、78、80、86、102、116、122、154、159、181或199,其中所述部分至少含有該序列的15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴(yán)謹(jǐn)性、中嚴(yán)謹(jǐn)性或高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它示范性例子中，這些方法包括檢測(cè)與存在對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答或風(fēng)險(xiǎn)適度相關(guān)的至少l、2、3、4、5、6、7、8、9或10種應(yīng)激標(biāo)記基因(下文稱為"四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因")各表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:7、15、16、19、21、24、25、26、28、35、38、39、42、46、57、68、73、81、83、97、99、107、113、123、160、165、175、187、188、194、195或200，或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:20、22、27、29、36、42、43、58、69、74、82、84、98、100、108、114、124、166、189或201;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:20、22、27、29、36、42、43、58、69、74、82、84、98、100、108、114、124、166、189或201，其中所述部分至少含有該序列的15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴(yán)謹(jǐn)性、中嚴(yán)謹(jǐn)性或高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(C)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它示范性例子中，這些方法包括檢測(cè)與存在對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答或風(fēng)險(xiǎn)較低相關(guān)的至少l、2、3、4、5、6、7、8、9或10種應(yīng)激標(biāo)記基因(下文稱為"五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因")各表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、9、11、13、32、33、34、40、41、50、51、56、59、62、63、71、75、87、93、105、111、119、127、129、130、131、37、139、141、143、145、156、161、167、169、171、173、176、185、204或210，或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、4、12、14、60、61、72、76、88、94、106、112、120、128、132、138、140、142、146、157、162、168、172、174、177、205或211;(c)含有編碼與以下任一序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、4、12、14、60、61、72、76、88、94、106、112、120、128、132、138、140、142、146、157、162、168、172、174、177、205或211，其中所述部分至少含有該序列的15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴(yán)謹(jǐn)性、中嚴(yán)謹(jǐn)性或高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少2種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少2種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少2種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在一些實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少2種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少2種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少3種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在一些實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少2種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少2種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少3種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少4種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在一些實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少2種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少2種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少3種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少4種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在一些實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少2種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少I種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少2種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少2種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少l種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少3種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少4種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在一些實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少2種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少2種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少3種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少4種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少5種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在一些實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少2種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少2種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少2種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少3種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少4種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少l種二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少5種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在一些實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少2種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少2種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少2種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少3種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少4種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少5種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在一些實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少2種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少2種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少3種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少4種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少5種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在一些實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少2種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少3種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少3種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少4種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少5種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少6種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在一些實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少2種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少l種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少2種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少3種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少4種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少5種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性和至少6種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在一些實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少1種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少2種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少3種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少3種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少4種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少5種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)至少6種五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。生物學(xué)樣品優(yōu)選通常含有白細(xì)胞的血液，特別是外周血。所述表達(dá)產(chǎn)物宜選自RNA分子或多肽。在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)產(chǎn)物與相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物相同。在其它實(shí)施方案中，所述表達(dá)產(chǎn)物是相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物的變體(例如，等位基因變體)。在某些實(shí)施方案中，所述表達(dá)產(chǎn)物或相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物是靶RNA(例如，mRNA)或該耙RNA的DNA拷貝，其水平可用至少能在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與該耙RNA或該DNA拷貝雜交的至少一種核酸探針來檢測(cè)，該核酸探針至少含有某應(yīng)激標(biāo)記基因的15個(gè)連續(xù)核苷酸。在這些實(shí)施方案中，將該靶RNA或其DNA拷貝所檢測(cè)到的水平或豐度按存在于同一樣品中的參比RNA或該參比RNA的DNA拷貝的水平或豐度標(biāo)準(zhǔn)化。核酸探針宜固定在固體或半固體支持物上。在此類型的示范性例子中，該核酸探針形成諸核酸探針空間陣列的一部分。在一些實(shí)施方案中，通過雜交(例如采用核酸陣列)檢測(cè)結(jié)合該靶RNA或該DNA拷貝的核酸探針的水平。在其它實(shí)施方案中，通過核酸擴(kuò)增(例如，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR))檢測(cè)結(jié)合該靶RNA或該DNA拷貝的核酸探針的水平。在還有其它實(shí)施方案中，通過核酸酶保護(hù)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)合該靶RNA或該DNA拷貝的核酸探針的水平。在其它實(shí)施方案中，所述表達(dá)產(chǎn)物或相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物是靶多肽，其水平可用能與該靶多肽免疫相互作用的至少一種抗原結(jié)合分子來檢測(cè)。在這些實(shí)施方案中，將該靶多肽檢測(cè)到的水平或豐度按存在于同一樣品中的參比多肽的水平標(biāo)準(zhǔn)化?？乖Y(jié)合分子宜固定于固體或半固體支持物上D在此類型的示范性例子中，該抗原結(jié)合分子形成抗原結(jié)合分子空間陣列的一部分。在一些實(shí)施方案中，通過免疫測(cè)定(例如利用ELISA)檢測(cè)結(jié)合該靶多肽抗原結(jié)合分子的水平。在還有其它實(shí)施方案中，所述表達(dá)產(chǎn)物或相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物是靶多肽，其水平可用能與該靶多肽反應(yīng)形成反應(yīng)產(chǎn)物的至少一種底物來檢測(cè)。在這些實(shí)施方案中，將該耙多肽檢測(cè)到的功能活性按存在于同一樣品中的參比多肽的功能活性標(biāo)準(zhǔn)化。在一些實(shí)施方案中，可用適當(dāng)包括至少一個(gè)與基站(basestation)相耦聯(lián)的終端站(endstation)的某系統(tǒng)來執(zhí)行該方法。該基站宜(a)通過通信網(wǎng)絡(luò)從終端站接受所述數(shù)據(jù)，其中所述數(shù)據(jù)代表生物學(xué)樣品中至少一種表達(dá)產(chǎn)物所檢測(cè)到的或標(biāo)準(zhǔn)化水平或功能活性相應(yīng)的參數(shù)值，和(b)將所述數(shù)據(jù)與代表參比樣品中至少一種相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物的所檢測(cè)到的或標(biāo)準(zhǔn)化水平或功能活性的預(yù)定數(shù)據(jù)作比較，從而測(cè)定與參比樣品中相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物水平或功能活性相比，該生物學(xué)樣品中此表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性的任何差異?；具€可理想地診斷應(yīng)激應(yīng)答是否存在、其程度或發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。在這些實(shí)施方案中，基站還可通過通信網(wǎng)絡(luò)將診斷指征傳遞至終端站。本發(fā)明另一方面提供測(cè)定檢驗(yàn)對(duì)象中是否存在免疫抑制及其程度的方法。這些方法一般包括檢測(cè)至少一種上述應(yīng)激標(biāo)記基因在對(duì)象中的異常表達(dá)。在還有另一方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防檢驗(yàn)對(duì)象中產(chǎn)生應(yīng)激或相關(guān)疾病的方法。這些方法一般包括檢測(cè)至少一種應(yīng)激標(biāo)記基因在對(duì)象中的異常表達(dá)，和處理該對(duì)象的環(huán)境以防止或盡可能不使該對(duì)象與致應(yīng)激源接觸和/或給予該對(duì)象有效量的藥物以治療或緩解癥狀，或者逆轉(zhuǎn)或抑制該對(duì)象發(fā)生應(yīng)激狀態(tài)。在某些實(shí)施方案中，所述相關(guān)疾病是免疫抑制。因此，在一相關(guān)方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防檢驗(yàn)對(duì)象產(chǎn)生免疫抑制的方法。這些方法一般包括檢測(cè)至少一種應(yīng)激標(biāo)記基因在對(duì)象中的異常表達(dá)，處理該對(duì)象的環(huán)境以防止或盡可能不使該對(duì)象與致應(yīng)激源接觸和/或給予對(duì)象有效量的藥物以治療或緩解癥狀，或者逆轉(zhuǎn)或抑制該對(duì)象發(fā)生應(yīng)激狀態(tài)。在還有另一方面，本發(fā)明提供評(píng)估對(duì)象免疫系統(tǒng)對(duì)所選抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答能力的方法。這些方法一般包括測(cè)定至少一種上述應(yīng)激標(biāo)記基因在對(duì)象中的正常還是異常表達(dá)，故而該應(yīng)激標(biāo)記基因或各應(yīng)激標(biāo)記基因正常表達(dá)表明產(chǎn)生免疫應(yīng)答能力正常，而該應(yīng)激標(biāo)記基因或各應(yīng)激標(biāo)記基因異常表達(dá)表明產(chǎn)生免疫應(yīng)答能力受損。在其它方面，本發(fā)明提供給予含有所選抗原的組合物來誘導(dǎo)檢驗(yàn)對(duì)象對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答的方法。這些方法一般包括檢測(cè)至少一種上述應(yīng)激標(biāo)記基因在該對(duì)象中的正常表達(dá)和給予該對(duì)象所述組合物。在一些實(shí)施方案中，這些方法還包括檢測(cè)至少一種上述應(yīng)激標(biāo)記基因在對(duì)象中的異常表達(dá)，處理該對(duì)象的環(huán)境以防止或盡可能不使該對(duì)象與致應(yīng)激源接觸和/或給予該對(duì)象有效量的藥物以逆轉(zhuǎn)或抑制該對(duì)象發(fā)生應(yīng)激狀態(tài)，和給予該對(duì)象所述組合物。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)該應(yīng)激標(biāo)記基因或各應(yīng)激標(biāo)記基因在對(duì)象中正常表達(dá)時(shí)給予該對(duì)象所述組合物。在一相關(guān)方面，本發(fā)明提供改進(jìn)檢驗(yàn)對(duì)象對(duì)所選抗原免疫應(yīng)答的方法，給予所述對(duì)象含該抗原的組合物。這些方法一般包括檢測(cè)至少一種上述應(yīng)激標(biāo)記基因在該對(duì)象中的異常表達(dá)，處理該對(duì)象的環(huán)境以防止或盡可能不使該對(duì)象與致應(yīng)激源接觸和/或給予該對(duì)象有效量的藥物以逆轉(zhuǎn)或抑制該對(duì)象發(fā)生應(yīng)激狀態(tài)，這種處理或給藥從而可使該應(yīng)激標(biāo)記基因或各應(yīng)激標(biāo)記基因在該對(duì)象中正常表達(dá)。在另一方面，本發(fā)明提供本文稱為"應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸"的分離的多核苷酸，所述多核苷酸選自(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，或其互補(bǔ)序列；(b)含有包含以下任一序列一部分的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，其中所述部分至少含有該序列或互補(bǔ)序列的15個(gè)連續(xù)核苷酸；(C)至少能在低嚴(yán)謹(jǐn)性、中嚴(yán)謹(jǐn)性或高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)或(b)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸；和(d)含有以下任一序列的一部分的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，或其互補(bǔ)序列，其中所述部分至少含有該序列或互補(bǔ)序列的15個(gè)連續(xù)核苷酸并至少能在低嚴(yán)謹(jǐn)性、中嚴(yán)謹(jǐn)性或高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)或(C)的序列或其互補(bǔ)序列雜交。在另一方面，本發(fā)明提供含有操作性連接于調(diào)節(jié)元件的上述多核苷酸的核酸構(gòu)建物，該構(gòu)建物可在宿主細(xì)胞中操作。在某些實(shí)施方案中，所述構(gòu)建物是載體形式，特別是表達(dá)載體。在還有另一方面，本發(fā)明提供含有上述核酸構(gòu)建物或載體的分離的宿主細(xì)胞。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞選自細(xì)菌細(xì)胞、酵母菌細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。在還有另一方面，本發(fā)明提供用于所査詢的核酸中是否存在上述多核苷酸的探針。這些探針一般包括至少能在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與上述多核苷酸雜交的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述探針基本上由對(duì)應(yīng)于編碼以下任一氨基酸序列的核苷酸序列一部分或與其互補(bǔ)的核酸序列構(gòu)成SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、40、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分至少長15個(gè)核苷酸。在其它實(shí)施方案中，這些探針含有至少能在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與編碼以下任一氨基酸序列的核苷酸序列至少一部分雜交的核苷酸序列SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、,80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分至少長15個(gè)核苷酸。在還有其它實(shí)施方案中，這些探針含有至少能在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與以下序列的至少一部分雜交的核苷酸序列SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，其中所述部分至少長15個(gè)核苷酸。用于檢測(cè)本發(fā)明應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸的代表性探針如SEQIDNO:250-1807(見表2)所示。在一相關(guān)方面，本發(fā)明提供在其上固定了至少一種上述核酸探針的固體或半固體支持物。在一些實(shí)施方案中，該固體或半固體支持物包含固定于其上的核酸探針空間陣列。在其它方面，本發(fā)明提供稱為"應(yīng)激標(biāo)記多肽"的分離的多肽，所述多肽一般選自(i)含有與上述應(yīng)激標(biāo)記基因的多肽表達(dá)產(chǎn)物至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的氨基酸序列的多肽，所述應(yīng)激標(biāo)記基因具體是例如含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、卯、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243;(ii)(i)所述序列的一部分，其中該部分至少含有該多肽的5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；(iii)含有與(i)所述多肽的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基至少有30%相似性(和至少31%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)的氨基酸序列的多肽；和(iv)含有能與(i)、(U)或(iii)的序列發(fā)生免疫相互作用的抗原結(jié)合分子發(fā)生免疫相互作用的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明還有一方面提供能與上述應(yīng)激標(biāo)記多肽發(fā)生免疫相互作用的抗原結(jié)合分子。在一相關(guān)方面，本發(fā)明提供在其上固定了至少一種上述抗原結(jié)合分子的固體或半固體支持物。在一些實(shí)施方案中，該固體或半固體支持物包含固定于其上的抗原結(jié)合分子空間陣列。本發(fā)明還有另一方面提供一種或多種上述應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸、一種或多種上述探針、一種或多種上述應(yīng)激標(biāo)記多肽或一種或多種上述抗原結(jié)合分子在制備評(píng)估對(duì)象對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答或免疫功能的試劑盒中的應(yīng)用。附圖簡(jiǎn)述圖1是比較(施加)應(yīng)激后第28天與第0天(第0天是道路運(yùn)輸(roadtransport)2天后)基因表達(dá)的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據(jù)交叉驗(yàn)證的組分判另ij功能評(píng)分(crossvalidatedcomponentsdiscriminantfunctionscores)制備。圖2是比較(施加)應(yīng)激后第28天與第2天(第0天是道路運(yùn)輸2天后)基因表達(dá)的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據(jù)交叉驗(yàn)證的組分判別功能評(píng)分制備。圖3是比較(施加)應(yīng)激后第28天與第4天(第0天是道路運(yùn)輸2天后)基因表達(dá)的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據(jù)交叉驗(yàn)證的組分判別功能評(píng)分制備。圖4是比較(施加)應(yīng)激后第28天與第7天(第0天是道路運(yùn)輸2天后)基因表達(dá)的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據(jù)交叉驗(yàn)證的組分判別功能評(píng)分制備。圖5是比較(施加)應(yīng)激后第28天與第9天(第0天是道路運(yùn)輸2天后)基因表達(dá)的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據(jù)交叉驗(yàn)證的組分判別功能評(píng)分制圖6是比較(施加)應(yīng)激后第28天與第11天(第0天是道路運(yùn)輸2天后)基因表達(dá)的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據(jù)交叉驗(yàn)證的組分判別功能評(píng)分制備。圖7是比較(施加)應(yīng)激后第28天與第14天(第0天是道路運(yùn)輸2天后)基因表達(dá)的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據(jù)交叉驗(yàn)證的組分判別功能評(píng)分制備。圖8是比較(施加)應(yīng)激后第28天與第17天(第0天是道路運(yùn)輸2天后)基因表達(dá)的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據(jù)交叉驗(yàn)證的組分判別功能評(píng)分制備。圖9是比較(施加)應(yīng)激后第28天與第21天(第0天是道路運(yùn)輸2天后)基因表達(dá)的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據(jù)交叉驗(yàn)證的組分判別功能評(píng)分制備。圖10是比較(施加)應(yīng)激后第28天與第24天(第0天是道路運(yùn)輸2天后)基因表達(dá)的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據(jù)交叉驗(yàn)證的組分判別功能評(píng)分制備。發(fā)明詳述1.定義除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的意義相同。雖然可利用與本文所述相似或等價(jià)的任何方法和材料來實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明，但本文所述的是優(yōu)選的方法和材料。為本發(fā)明的目的定義了以下術(shù)語。本文所用的冠詞"一"和"一個(gè)"指一個(gè)或多個(gè)(即至少一個(gè))該冠詞在語法上的賓語。例如，"一個(gè)元件"指一個(gè)元件或多個(gè)元件。本文用于描述應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)的術(shù)語"異常表達(dá)"，指與取自健康對(duì)象或未遭受應(yīng)激對(duì)象的細(xì)胞中某應(yīng)激標(biāo)記基因或其變體的表達(dá)水平相比，該應(yīng)激標(biāo)記基因過度表達(dá)或表達(dá)不足，和/或與取自健康對(duì)象或未處于應(yīng)激狀態(tài)對(duì)象的組織樣品或體液中該應(yīng)激標(biāo)記基因產(chǎn)物(例如，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或多肽)的水平相比，較高或較低。具體地說，如果與取自健康對(duì)象或未處于應(yīng)激狀態(tài)對(duì)象的細(xì)胞中某應(yīng)激標(biāo)記基因的表達(dá)水平相比，和/或與取自健康對(duì)象或未處于應(yīng)激狀態(tài)對(duì)象的組織樣品或體液中該應(yīng)激標(biāo)記基因的表達(dá)水平相比，該應(yīng)激標(biāo)記基因高至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%，或甚至至少約100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%,或者低至少約10%、20%、30%40%、50%、60%、70%、80%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%，或甚至至少約99.5%、99.9%、99.95%、99.99%、99.995%或99.999%，則該應(yīng)激標(biāo)記基因異常表達(dá)。"約"指與參比的量、水平、數(shù)值、數(shù)字、頻率、百分比、維數(shù)、大小、用量、重量或長度相比，可多至30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%不同的量、水平、數(shù)值、數(shù)字、頻率、百分比、維數(shù)、大小、用量、重量或長度。術(shù)語"擴(kuò)增子"指擴(kuò)增的靶序列和/或擴(kuò)增的靶序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。在某些其它實(shí)施方案中，"擴(kuò)增子"可包含用于擴(kuò)增的探針或引物序列。"抗原結(jié)合分子"指對(duì)耙抗原具有結(jié)合親和力的分子。應(yīng)該知道該術(shù)語可擴(kuò)展至顯示具有抗原結(jié)合活性的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和非免疫球蛋白衍生的蛋白質(zhì)框架。當(dāng)本文所用的術(shù)語"特異性結(jié)合"、"特異性免疫相互作用"等指某抗原結(jié)合分子時(shí)，這些術(shù)語指能確定在蛋白質(zhì)和其它生物制品的異質(zhì)群體中存在該抗原的結(jié)合反應(yīng)。因此，在所指定的免疫測(cè)定條件下，所述抗原結(jié)合分子能與其特定抗原相結(jié)合而不以明顯量與樣品中存在的其它蛋白質(zhì)或抗原相結(jié)合。在這種條件下與某抗原特異性結(jié)合可能需要選擇對(duì)該特定抗原有特異性的抗原結(jié)合分子。例如，可制備針對(duì)所選蛋白質(zhì)抗原的抗原結(jié)合分子，該分子能與該抗原而非樣品中其它蛋白質(zhì)抗原相結(jié)合?？刹捎酶鞣N免疫測(cè)定方式來選擇能與某特定蛋白質(zhì)起特異性免疫相互作用的抗原結(jié)合分子。例如，常規(guī)采用固相ELISA免疫測(cè)定來選擇能與某蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫相互作用的單克隆抗體?？捎糜跍y(cè)定特異性免疫反應(yīng)的免疫測(cè)定方式和條件可參見Harlow和Lane，(1988)，"抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)"(Antibodies,ALaboratoryManual),ColdSpringHarborPublications，紐約。"生物學(xué)活性部分"指保留了親代分子活性的全長親代肽或多肽的一部分。本文所用的術(shù)語"生物學(xué)活性部分"包括具有親代分子活性的缺失突變體和具有例如至少約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900、1000個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的肽?？捎脴?biāo)準(zhǔn)的重組核酸技術(shù)來獲得或釆用常規(guī)液相或固相合成技術(shù)來合成此種類型部分。例如，可參考如BlackwellScientificPublications出版，Nicholson所編的名為《合成疫苗》(SyntheticVaccines)的出版物中Atherton和Shephard所著名為"肽合成"(PeptideSynthesis)的第9章中所述的液相合成或固相合成。或者，可用蛋白酶，例如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶消化本發(fā)明的肽或多肽來制備這類肽?？赏ㄟ^例如高效液相層析(HPLC)技術(shù)純化所消化的片段。也可采用重組核酸技術(shù)來制備這種蛋白質(zhì)。本文所用的術(shù)語"生物學(xué)樣品"指從動(dòng)物提取的、未處理、處理、稀釋或濃縮的樣品。生物學(xué)樣品可包括生物學(xué)液體，例如全血、血清、血漿、唾液、尿、汗液、腹水、腹膜液、滑膜液、羊水、腦脊液、組織活檢(樣品)等。在某些實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品是血液、特別是外周血。應(yīng)理解本文所用的術(shù)語"順式作用序列"、"順式作用元件"、"順式調(diào)節(jié)區(qū)"或"調(diào)節(jié)區(qū)"或類似的術(shù)語指當(dāng)置于某可表達(dá)遺傳序列的適當(dāng)位置時(shí)能調(diào)節(jié)，至少部分調(diào)節(jié)該遺傳序列表達(dá)的任何核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道順式調(diào)節(jié)區(qū)能在轉(zhuǎn)錄或翻譯后水平上激活、沉默、增強(qiáng)、抑制或者改變基因序列的表達(dá)水平和/或細(xì)胞類型特異性和/或發(fā)育特異性。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，順式作用序列是能增強(qiáng)或刺激某可表達(dá)遺傳序列表達(dá)的激活序列。除非文中另有需要，本說明書中的詞語"包含"和"含有"應(yīng)理解為指包括某所述步驟或元件或者一組步驟或元件，但不排除任何其它步驟或元件或者一組步驟或元件。"對(duì)應(yīng)"或"對(duì)應(yīng)于"指以下的多核苷酸(a)其含有的核苷酸序列與某參比多核苷酸序列的整體或一部分基本上相同或互補(bǔ)，或(b)其編碼的氨基酸序列與某肽或蛋白質(zhì)的氮基酸序列相同。該短語的范圍也包括含有的氨基酸序列與參比肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列基本上相同的肽或多肽。在治療或預(yù)防某疾病的章節(jié)中，"有效量"指將該用量的活性(化合物)以單次劑量或連續(xù)劑量的一部分給予需要這種治療或預(yù)防的個(gè)體，該用量可有效防止該疾病的癥狀發(fā)生、抑制該疾病的這種癥狀和/或治療該疾病的已有癥狀。有效量依待治療個(gè)體的健康和身體狀況、待治療個(gè)體的分類學(xué)組、組合物的劑型、醫(yī)學(xué)狀況的評(píng)估和其它相關(guān)因素而不同。希望該用量可用常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定具有較寬范圍。術(shù)語"表達(dá)"或"基因表達(dá)"指產(chǎn)生信使RNA或信使RNA翻譯為蛋白質(zhì)或多肽。采用本文所述方法檢測(cè)基因表達(dá)的這二種類型之一是本發(fā)明的一部分。"表達(dá)載體"指能指導(dǎo)該載體所含的多核苷酸轉(zhuǎn)錄和適當(dāng)?shù)睾铣稍摱嗪塑账崴幋a的肽或多肽的任何自主遺傳元件。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這種表達(dá)載體。本文所用的術(shù)語"基因"指細(xì)胞基因組的任何與所有的不連續(xù)編碼區(qū)及其相關(guān)的非編碼調(diào)節(jié)區(qū)?；蛞仓妇幋a具體多肽的開放讀框、內(nèi)含子、參與表達(dá)調(diào)節(jié)的毗鄰的5'和3'非編碼核苷酸序列。在這點(diǎn)上，基因還可含有與某給定基因天然相關(guān)的調(diào)控信號(hào)，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止和/或聚腺苷酸化信號(hào)，或異源調(diào)控信號(hào)。DNA序列可以是cDNA或基因組DNA或其片段。可將基因引入合適的載體中而維持于染色體外或整合入宿主。"高密度多核苷酸陣列"等指每cm2至少含有400個(gè)不同特征元件(feature)的那些陣列。短語"高度鑒別性雜交條件"指可測(cè)定出一個(gè)堿基錯(cuò)配的雜交條件。本文用"雜交"表示互補(bǔ)核苷酸序列配對(duì)產(chǎn)生雜交DNA-DNA或雜交DNA-RNA?；パa(bǔ)堿基序列是通過堿基配對(duì)原則相互關(guān)聯(lián)的那些序列。在DNA中，A與T配對(duì)，C與G配對(duì)。在RNA中，U與A配對(duì)，C與G配對(duì)。在這點(diǎn)上，本文所用術(shù)語"匹配"和"錯(cuò)配"表示互補(bǔ)核酸鏈中配對(duì)核苷酸的雜交可能性。匹配的核苷酸能有效雜交，例如上述典型的A-T和C-G堿基配對(duì)。錯(cuò)配是不能有效雜交核苷酸的其它組合。短語"特異性雜交"等指在嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，當(dāng)某特定核苷酸序列存在于復(fù)雜的DNA或RNA混合物(例如，總細(xì)胞的)中時(shí)，某分子只與該序列結(jié)合、形成雙螺旋或雜交。本文提及"免疫相互作用"包括提及分子之間(特別是在所述分子之一是或模擬免疫系統(tǒng)某組分的場(chǎng)合)的任何相互作用、反應(yīng)或其它結(jié)合形式。"免疫功能"或"免疫反應(yīng)性"指通過本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)檢測(cè)免疫系統(tǒng)對(duì)外來抗原的反應(yīng)能力。術(shù)語"免疫抑制"指應(yīng)激或?qū)?yīng)激的生理應(yīng)答導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的總免疫反應(yīng)性降低。宜與不存在應(yīng)激狀態(tài)時(shí)的免疫反應(yīng)性相比，其降低了至少20-40%，或至少50-75%、或者甚至至少80%。此外，術(shù)語"免疫抑制"的范圍包括與未處于應(yīng)激的對(duì)象相比，免疫應(yīng)答發(fā)生滯后。免疫應(yīng)答發(fā)生滯后可以是短時(shí)滯后，例如1小時(shí)-10天，即1小時(shí)，2、5或10天。免疫應(yīng)答發(fā)生滯后也可以是長時(shí)間滯后，例如10天-10年(即，30天、60天、90天、180天，1、2、5或10年)。本發(fā)明的"免疫抑制"也可表示免疫應(yīng)答強(qiáng)度降低，例如強(qiáng)度降低比未受應(yīng)激損害對(duì)象的免疫應(yīng)答低5-100%、25-100%或75-100%。"分離的"表示實(shí)質(zhì)上或基本上不含其天然狀態(tài)下正常伴有組分的物質(zhì)。例如，本文所用的"分離的多核苷酸"指去除了天然狀態(tài)下其側(cè)接序列的純化多核苷酸，例如DNA片段是從去除了該片段正常毗鄰序列的片段?；蛘?，本文所用的"分離的肽"或"分離的多肽"等指體外去除了其天然細(xì)胞環(huán)境和與之結(jié)合的細(xì)胞其它組分，即與體內(nèi)物質(zhì)不結(jié)合的分離和/或純化的肽或多肽分子。"標(biāo)記基因"表示能賦予表達(dá)該標(biāo)記基因的細(xì)胞獨(dú)特表型從而使這種轉(zhuǎn)化細(xì)胞能與不含有該標(biāo)記的細(xì)胞相區(qū)別的基因?？蛇x擇標(biāo)記基因能根據(jù)對(duì)選擇性因子(例如，除草劑、抗生素、輻射。熱或其它破壞未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的處理方法)的抗性賦予"選擇"特性。可篩選標(biāo)記基因(或報(bào)道基因)能賦予可通過觀察或檢驗(yàn)，即通過"篩選"來鑒定的特性(例如，未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中不存在的P-葡糖醛酸酶、螢光素酶或其它酶活性)。本文所用的"天然產(chǎn)生的"核酸分子指具有天然產(chǎn)生的核苷酸序列的RNA或DNA分子。例如，天然存在的核酸分子能編碼天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。"取自"表示某樣品，例如細(xì)胞提取物或核酸或多肽提取物是分離自或衍生自特定來源。例如，可直接從對(duì)象的生物學(xué)液體或組織中分離提取物。本文所用的術(shù)語"寡核苷酸"指經(jīng)磷酸二酯鍵相連的多個(gè)核苷酸殘基(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相關(guān)的結(jié)構(gòu)變體或合成類似物，包括含有修飾或取代糖基團(tuán)等的核苷酸)構(gòu)成的聚合物(或其相關(guān)的結(jié)構(gòu)變體或合成類似物)。因此，盡管術(shù)語"寡核苷酸"通常指其中的核苷酸殘基與殘基之間的連接鍵是天然存在的核苷酸聚合物，但應(yīng)知道該術(shù)語的范圍也包括各種類似物，包括但不限于肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酉旨(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoraniladate、亞磷酰胺、膦酸甲酯、2-0-甲基核糖核酸等。該分子的確切大小視具體應(yīng)用而不同。寡核苷酸是長200個(gè)以下堿基的多核苷酸亞組。寡核苷酸優(yōu)選長10-60個(gè)堿基，最優(yōu)選長12、13、14、15、16、17、18、19或20-40個(gè)堿基。雖然寡核苷酸可以是雙鏈，例如用于構(gòu)建不同核酸序列，但寡核苷酸通常是單鏈的，例如探針。本發(fā)明的寡核苷酸可以是有義或反義寡核苷酸。術(shù)語"寡核苷酸陣列"指具有寡核苷酸探針的基板，在該基板表面的已知不連續(xù)位置沉積了不同的已知序列。例如，該基板可以是如美國專利號(hào)5,424,186所述的兩維基板形式。這種基板可用于合成兩維空間尋址的寡核苷酸(矩陣)陣列。或者，該基板的特征在于通過將兩維平面的薄片巻成三維管狀構(gòu)型而形成管狀陣列。該基板也可采取與光纖表面相連的微球或珠形式，例如Chee等在WO00/39587中所述的那樣。這些寡核苷酸陣列至少具有兩種不同的元件，其密度為每cm2至少400個(gè)元件。在某些實(shí)施方案中，這些陣列的密度可以是每cm2約500、至少一千、至少一萬、至少十萬、至少一百萬或至少一千萬個(gè)元件。例如，該基板可以是硅或玻璃，具有載玻片或蓋玻片的厚度，或者可由其它合成聚合物構(gòu)成。當(dāng)在該基板上進(jìn)行試驗(yàn)的方法包括光檢測(cè)時(shí)，可用透光的基板。該術(shù)語也指探針陣列和與其相連形成晶片一部分的基板。本文所用的術(shù)語"操作性連接"或"操作性相連"表示將結(jié)構(gòu)基因置于啟動(dòng)子的調(diào)控下，從而可控制該基因的轉(zhuǎn)錄和任選的翻譯。在構(gòu)建異源啟動(dòng)子/結(jié)構(gòu)基因組合時(shí)，通常優(yōu)選將遺傳序列或啟動(dòng)子安置在與基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離與其天然設(shè)置中該遺傳序列或啟動(dòng)子與其所調(diào)控的基因，即衍生該遺傳序列或啟動(dòng)子的基因的距離大體相同。本領(lǐng)域己知可允許對(duì)此距離作一些變動(dòng)而不喪失功能。類似地，調(diào)控序列元件與置于其控制下的異源基因的優(yōu)選定位可由該元件在其天然設(shè)置，即衍生其的基因中的定位所確定。本文所用的術(shù)語"多核苷酸"或"核酸"指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。該術(shù)語通常指至少長10個(gè)堿基的核苷酸的聚合形式，無論是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或這二類核苷酸的修飾形式。該術(shù)語包括DNA的單鏈或雙鏈形式。術(shù)語"多核苷酸變體"和"變體"指與參比多核苷酸序列的序列基本上相同的多核苷酸，或能在下述嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與參比序列雜交的多核苷酸。這些術(shù)語也包括其中有一個(gè)或多個(gè)核苷酸添加或刪除，或用不同的核苷酸取代的多核苷酸。在這點(diǎn)上，本領(lǐng)域熟知可按照參比多核苷酸對(duì)所述多核苷酸作出某些改變，包括突變、添加、缺失和取代，從而使改變的多核苷酸仍保留該參比多核苷酸的生物學(xué)功能或活性。術(shù)語"多核苷酸變體"和"變體"也包括天然產(chǎn)生的等位變體。"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物及其變體與合成的類似物。因此，這些術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是合成的非天然氨基酸(例如，相應(yīng)的天然氨基酸的化學(xué)類似物)的氨基酸聚合物以及天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物。術(shù)語"多肽變體"指通過至少一個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或取代而與參比多肽相區(qū)別的多肽。在某些實(shí)施方案中，參比多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可用不同的氨基酸所取代。如下所述，本領(lǐng)域熟知一些氨基酸可以改變成具有大致相似性質(zhì)的其它氨基酸而不會(huì)改變多肽的活性(保守取代)。"引物"表示當(dāng)與DNA的一條鏈配對(duì)時(shí)在有合適的聚合試劑存在下能啟動(dòng)引物延伸產(chǎn)物合成的寡核苷酸。為使擴(kuò)增效率最大，引物優(yōu)選單鏈，但或者可以是雙鏈。引物足夠長從而能在聚合試劑存在時(shí)引發(fā)合成延伸產(chǎn)物。引物的長度取決于許多因素，包括應(yīng)用領(lǐng)域、所采用的溫度、模板反應(yīng)條件、其它試劑和引物來源。例如，取決于靶序列的復(fù)雜性，引物的3'末端可比模板序列短至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500到1個(gè)堿基從而延伸核酸鏈，雖然引物5'末端長度可延伸超出模板序列的3'末端。在某些實(shí)施方案中，引物可以是大的多核苷酸，例如約35個(gè)核苷酸到數(shù)千堿基以上。可選出與模板序列"基本上互補(bǔ)"的引物，設(shè)計(jì)這些引物設(shè)計(jì)能與模板雜交并用作合成的起點(diǎn)。"基本上互補(bǔ)"表示該引物的互補(bǔ)性足夠與靶多核苷酸雜交。引物和所設(shè)計(jì)的與其雜交的模板最好不含錯(cuò)配，但這不是必需的。例如，可將非互補(bǔ)核苷酸殘基連接在引物的5'末端，而該引物序列的其余部分與模板互補(bǔ)。或者，可將非互補(bǔ)核苷酸殘基或非互補(bǔ)核苷酸殘基的延伸段間插入引物中，前提是該引物序列與和其雜交的模板序列足夠互補(bǔ)從而可形成合成該引物的延伸產(chǎn)物所需的模板。"探針"指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，術(shù)語"探針"通常指能通過互補(bǔ)堿基配對(duì)與另一多核苷酸(往往稱為"靶多核苷酸")結(jié)合的多核苷酸探針。取決于雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補(bǔ)性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可直接或間接標(biāo)記，其范圍包括引物。本文所用的術(shù)語"重組多核苷酸"指通過操作核酸使其成為自然界中正常沒有發(fā)現(xiàn)的形式而在體外形成的多核苷酸。例如，重組多核苷酸可以采取表達(dá)載體形式。這種表達(dá)載體一般包括操作性連接于該核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)核酸。"重組多肽"表示采用重組技術(shù)，即通過重組子或合成多核苷酸表達(dá)而制備的多肽。"調(diào)節(jié)元件"或"調(diào)節(jié)序列"表示在具體宿主細(xì)胞中表達(dá)操作性相連編碼序列所需的核酸序列(例如，DNA)。例如，適用于原核細(xì)胞的調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子和任選的順式作用序列，如操縱子序列與核糖體結(jié)合位點(diǎn)。適用于真核細(xì)胞的控制序列包括啟動(dòng)子、聚腺苷酸化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、翻譯增強(qiáng)子、調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性的前導(dǎo)和尾隨序列，以及使轉(zhuǎn)錄的多核苷酸編碼產(chǎn)物靶向細(xì)胞內(nèi)區(qū)室或耙向胞外環(huán)境的引導(dǎo)序列。本文所用的術(shù)語"序列相同性"指二序列在比較窗上根據(jù)核苷酸對(duì)核苷酸或氨基酸對(duì)氨基酸的相同性程度。因此，"序列相同性百分比"可通過以下步驟計(jì)算在比較窗上比較兩條最佳比對(duì)的序列，測(cè)定兩條序列中相同的核苷酸堿基(例如，A、T、C、G、I)或相同的氨基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置數(shù)得到匹配的位置數(shù)，將匹配的位置數(shù)除以比較窗口的總位置數(shù)(即，窗口大小)，再將結(jié)果乘以100得到序列相同性百分比。為本發(fā)明的目的，應(yīng)將"序列相同性"理解為用DNASIS計(jì)算機(jī)程序(適用于windows的2.5版；貝勾自HitachiSoftwareengineeringCo,，Ltd.,SouthSanFrancisco,力口禾!j福尼亞，美國)，采用該軟件所附參考手冊(cè)中使用的標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)(參數(shù))計(jì)算的"匹配百分比"。如下表3所定義，"相似性"指相同或構(gòu)成保守取代的氨基酸百分?jǐn)?shù)。可利用序列比較程序，例如GAP(Deveraux等，1984，NucleicAcidsResearch,12，387-395)測(cè)定相似性。長度與本文所述序列相似或基本上不同的序列可以此方式通過在排列中插入空格來比較，這種空格可通過例如GAP所用的比較算法確定。用于描述兩條以上多核苷酸或多肽之間的序列相關(guān)性的術(shù)語包括"參比序列"、"比較窗口"、"序列相同性"、"序列相同性百分比"和"基本上相同"。"參比序列"的長度至少12個(gè)，但更多15-18個(gè)，往往至少25個(gè)單體單元，包括核苷酸和氨基酸殘基。由于兩條多核苷酸各含有(l)兩條多核苷酸之間相似的序列(即，只是整個(gè)多核苷酸序列的一部分)，和(2)兩條多核苷酸序列之間有差別的序列，則一般通過在"比較窗口"上比較這兩條多核苷酸的序列來鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性從而在兩條(以上)多核苷酸之間進(jìn)行序列比較。"比較窗口"指具有至少6個(gè)，通常約50-約100個(gè)，更常見是約100-約150個(gè)連續(xù)位置的概念上的片段，其中某序列與參比序列最佳比對(duì)后，該序列與具有相同數(shù)目連續(xù)位置的參比序列作比較。為(進(jìn)行)兩條序列的最佳比對(duì)，與參比序列(不包含添加或缺失)相比，比較窗口可包含約20%以下的添加或缺失(即，空位)。為比對(duì)比較窗口，可通過計(jì)算機(jī)執(zhí)行算法(GAP、BESTFIT、FASTA禾QTFASTA，WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0，GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMadison,WI，USA)或通過目測(cè)和所選擇的各種方法之一產(chǎn)生的最佳比對(duì)(即導(dǎo)致比較窗口上最高同源性百分比)，對(duì)諸序列進(jìn)行最佳比對(duì)。也可參考如Altschul等，1997，Nucl.AcidsRes.，25:3389所述的BLAST程序族進(jìn)行比對(duì)。序列分析的詳述可見Ausubel等，《最新分子生物學(xué)方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)的第15章，第19.3單元，JohnWiley&SonsInc，1994-1998。在本文可互換使用的術(shù)語"對(duì)象"、"個(gè)體"或"患者"指需要治療或預(yù)防的任何對(duì)象，特別是脊椎動(dòng)物對(duì)象，更特別指哺乳動(dòng)物對(duì)象。本發(fā)明范圍中的合適脊椎動(dòng)物包括但不限于靈長類動(dòng)物、鳥類、家畜(例如，綿羊、母牛、馬、驢、豬)、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)動(dòng)物(例如，家兔、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠)、陪伴動(dòng)物(例如，貓、狗)和捕獲的野生動(dòng)物(例如，狐、鹿、野狗)。優(yōu)選的對(duì)象是需要治療或預(yù)防應(yīng)激的馬。然而，應(yīng)該知道以上術(shù)語并未暗示有癥狀存在。本文的短語"基本上相似的親和力"指靶序列在所選擇的一組嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與它們的互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的寡核苷酸探針雜交時(shí)具有相似的可檢測(cè)強(qiáng)度。本文所用的術(shù)語"模板"指用于產(chǎn)生與該"模板"鏈互補(bǔ)的核酸鏈的核酸。模板可以是RNA和/或DNA，其互補(bǔ)鏈也可以是RNA和/或DNA。在某些實(shí)施方案中，互補(bǔ)鏈可包括該"模板"的所有或部分互補(bǔ)序列，和/或可包含突變，因而其不與該"模板"完全互補(bǔ)。在本文所述的檢測(cè)試驗(yàn)以及本領(lǐng)域己知的其它試驗(yàn)中，不與模板鏈完全互補(bǔ)的鏈可以與模板鏈特異性雜交，這種可用于檢測(cè)試驗(yàn)中的互補(bǔ)鏈?zhǔn)潜景l(fā)明的一部分。術(shù)語"轉(zhuǎn)化"表示通過引入外來或內(nèi)源性核酸而改變某生物體，例如細(xì)菌、酵母菌、哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行動(dòng)物、魚或植物的基因型。"載體"表示可在其中插入或克隆入某多核苷酸的多核苷酸分子，合適的載體可以衍生自，例如質(zhì)粒、細(xì)菌噬菌體、酵母菌、病毒、哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行動(dòng)物或魚的DNA分子。載體優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的限制性位點(diǎn)并能在確定的宿主細(xì)胞，包括靶細(xì)胞或組織或其子代細(xì)胞或組織中自主復(fù)制，或能與確定的宿主細(xì)胞基因組整合從而可復(fù)制所克隆的序列。因此，載體可以是自主復(fù)制的載體，即以染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，例如線形或閉環(huán)質(zhì)粒、染色體外元件、微染色體或人工染色體。載體可含有任何確保自身復(fù)制的元件?；蛘?，當(dāng)將載體引入宿主細(xì)胞后它能整合入基因組中與所整合入的染色體一起復(fù)制。載體系統(tǒng)可包含一種載體或質(zhì)粒，均包含待引入宿主細(xì)胞基因組的總DNA的兩種以上載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。選擇載體一般取決于該載體與待引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體也可包含選擇性標(biāo)記，例如可用于選擇合適轉(zhuǎn)化子的抗生素抗性基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這種抗性基因的例子。術(shù)語"野生型"和"正常的"可互換使用，指大多數(shù)天然產(chǎn)生的物種的特征性表型，其相對(duì)的例子是突變體表型。2.縮寫nt=核苷酸nts=多個(gè)核苷酸aa=氨基酸kb=千堿基或千堿基對(duì)kDa-千道爾頓d=曰h=小時(shí)s=秒3.應(yīng)激標(biāo)記及其應(yīng)用本發(fā)明涉及檢測(cè)感興趣對(duì)象的應(yīng)激水平或針對(duì)應(yīng)激的生理應(yīng)答。本發(fā)明公開了受到應(yīng)激或感到處于應(yīng)激狀態(tài)下的對(duì)象的細(xì)胞，具體是血細(xì)胞，更具體是外周血細(xì)胞中的應(yīng)激標(biāo)記，這些標(biāo)記采取所述序列的RNA分子或這些RNA分子所表達(dá)的多肽形式。這些標(biāo)記是應(yīng)激的指標(biāo)，當(dāng)它們差異性表達(dá)時(shí)可作為測(cè)試對(duì)象產(chǎn)生了對(duì)應(yīng)激的生理應(yīng)答的診斷指標(biāo)。在此領(lǐng)域中，與現(xiàn)有技術(shù)相比，這種標(biāo)記認(rèn)為有許多優(yōu)點(diǎn)。在某些利用外周血進(jìn)行分析的優(yōu)選實(shí)施方案中，監(jiān)測(cè)對(duì)應(yīng)激的應(yīng)答的可能的，此外采集血樣的侵入性很小且相對(duì)廉價(jià)。因此，本文所述的檢測(cè)方法適用于廣泛篩檢對(duì)象?？磥肀疚乃龅暮怂嵝蛄邪l(fā)現(xiàn)可用于評(píng)估對(duì)應(yīng)激的應(yīng)答以及處理和治療應(yīng)激的各種用途。本文范圍內(nèi)的這些應(yīng)用的例子包括利用特異性引物擴(kuò)增應(yīng)激標(biāo)記、通過與寡核苷酸標(biāo)記雜交、將分離的核酸摻入載體、使摻入載體的核酸表達(dá)為RNA和蛋白質(zhì)與使對(duì)應(yīng)于該標(biāo)記所編碼產(chǎn)物的免疫學(xué)試劑顯影來檢測(cè)應(yīng)激標(biāo)記。所鑒定的應(yīng)激標(biāo)記進(jìn)而可用于設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸探針和引物。這種探針和引物可以是能與所鑒定的標(biāo)記基因序列特異性雜交的任何長度，其至少長約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500個(gè)核苷酸，而探針可長達(dá)本文所鑒定的標(biāo)記基因序列的全長。探針也可在其5'和/或3'末端包含其它序列從而能延伸超出與其雜交的靶序列。當(dāng)聯(lián)用核酸擴(kuò)增方法時(shí)，這些探針和引物能快速分析生物學(xué)樣品(例如，外周血樣品)來檢測(cè)或定量測(cè)定標(biāo)記基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。這種方法包括本領(lǐng)域已知或本文所述用于復(fù)制或增加靶核酸或其互補(bǔ)序列的拷貝數(shù)或含量的任何方法或技術(shù)。所鑒定的標(biāo)記也可用于從基因組DNA文庫中鑒定和分離全長基因序列，包括基因表達(dá)的調(diào)節(jié)元件，它們宜為(但不限于)馬來源的元件。本文鑒定的cDNA序列可用作雜交探針采用常規(guī)技術(shù)來篩檢基因組DNA文庫。一旦鑒定到部分基因組克隆，可通過"染色體行走"(也稱為"重疊雜交")釆用，例如Chinault和Carbon(1979，G^e，5:11l-126)所述的方法來分離全長基因。一旦利用cDNA雜交探針分離得到部分基因組克隆，位于該部分基因組克隆兩末端或附近的非復(fù)制型區(qū)段可用作雜交探針作進(jìn)一步基因組文庫篩檢，最終分離得到感興趣應(yīng)激標(biāo)記的整個(gè)基因序列。應(yīng)知道可用本文所述的部分cDNA序列或短的表達(dá)序列標(biāo)簽(ETS)，采用例如Sambrook等，(《分子克隆.實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MOLECULARCLONING.ALABORATORYMANUAL),(冷泉港出版社，1989)和Ausubel等，(《最新分子生物學(xué)方法》(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY),JohnWiley&Sons,Inc.,1994)所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得全長基因。此外，可采用公開的，例如以上參考教材中所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，利用所述序列來鑒定和分離得到全長cDNA序列。可采用本文所述的檢測(cè)方法利用這些技術(shù)鑒定和分離的序列來檢測(cè)應(yīng)激標(biāo)記基因，這些序列是本發(fā)明的一部分。作為本發(fā)明一部分，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能從所鑒定的標(biāo)記基因中選擇一些區(qū)段用于測(cè)定易感性，各種檢測(cè)、診斷或預(yù)后方法，載體構(gòu)建物，制備抗原結(jié)合分子，試劑盒和/或本文所述任何實(shí)施方案中。本發(fā)明需要使用的標(biāo)記基因序列是以下SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109-、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、l卯、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248(參見表l)所示的序列。4.本發(fā)明的核酸分子如實(shí)施例和表1所述，本文提供了通過GeneChipTM分析正常和遭遇應(yīng)激的馬匹的血液鑒定到的134種應(yīng)激標(biāo)記(g卩，134種應(yīng)激標(biāo)記基因)。在這134種標(biāo)記基因中，96種具有全長或基本上全長的編碼序列，其余38種在它們的5'和3'末端的一端或兩端具有部分序列信息。所鑒定的應(yīng)激標(biāo)記基因包括38種以前未特征鑒定的馬基因。根據(jù)本發(fā)明，本文所述分離的核酸序列本身可用作雜交探針或擴(kuò)增引物。這些核酸可用于，例如診斷性評(píng)估生物學(xué)樣品或用于克隆全長cDNA或與其相對(duì)應(yīng)的基因組克隆。在某些實(shí)施方案中，這些探針和引物提供了長度足以和自生物學(xué)樣品提取的RNA或DNA樣品特異性雜交的寡核苷酸。這些序列通常約10-20個(gè)核苷酸長，但可以更長。某些實(shí)施方案需要較長的序列，例如約30、40、50、100、500個(gè)核苷酸和甚至多達(dá)全長。本發(fā)明考慮了具有以下SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、卯、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248所示任一序列的約10、15、17、20、30、40、50、60、75或100或500個(gè)核苷酸的連續(xù)延伸段的核酸分子。本發(fā)明也考慮了與上述序列互補(bǔ)，能在高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與之結(jié)合的分子。這些探針可用于各種雜交實(shí)施方案，例如Southern和Northern印跡。在一些例子中，本發(fā)明考慮可使用能與多種靶序列雜交而不損傷它們有效檢測(cè)應(yīng)激應(yīng)答能力的探針?？傊景l(fā)明考慮了本文所述雜交探針既可用作溶液雜交(如PCR中)的試劑來檢測(cè)相應(yīng)基因的表達(dá)以及可用于固相實(shí)施方案中。設(shè)計(jì)了圍繞所述核苷酸序列的各種探針和引物。例如，在某些實(shí)施方案中，用于設(shè)計(jì)探針和引物的序列可包括通常連接于所鑒定標(biāo)記基因RNA兩末端的腺嘌呤核苷酸的重復(fù)延伸段(poly-A尾部)。在其它實(shí)施方案中，由于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可能認(rèn)為某些區(qū)段更適用于所述檢測(cè)方法，故可將探針和引物專門設(shè)計(jì)為不包括所鑒定標(biāo)記基因的這些或其它區(qū)段。在任何情況中，普通技術(shù)人員均能為所選的應(yīng)用選擇引物或探針序列。用于檢測(cè)應(yīng)激標(biāo)記基因的示范性探針序列見表2。引物可以是雙鏈或單鏈形式，雖然單鏈形式更可取?？蓪⑻结樤O(shè)計(jì)為能與靶DNA或RNA結(jié)合(盡管可能引發(fā)(應(yīng)答))而無需用于擴(kuò)增方法中。在某些實(shí)施方案中，可用放射性物質(zhì)(32P、"C、35S、3H或其它標(biāo)記物)、熒光團(tuán)(例如羅丹明、熒光素)或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(例如，螢光素酶)標(biāo)記這些探針或引物。本發(fā)明提供可用作應(yīng)激標(biāo)記的96種基本上全長的cDNA序列以及59種EST或部分cDNA序列。然而，應(yīng)該知道本文不限于這些公開的序列，特別是至少要包括能與含有所公開序列的核酸或這些核酸的變體雜交的分離的核酸。例如，可用核酸的部分序列來鑒定結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因或其所衍生的全長基因組或cDNA克隆。本領(lǐng)域已知可用作上述探針的耙序列的cDNA和基因組文庫的制備方法(參見，例如Sambrook等，1989，同上和Ausubel等，1994，同上)。所有這種核酸以及本文所述的特異性核酸分子統(tǒng)稱為"應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸。"此外，本發(fā)明的范圍包括應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸的分離或純化的表達(dá)產(chǎn)物(即，RNA轉(zhuǎn)錄物和多肽)。因此，本發(fā)明包括分離的或基本上純化的核酸或蛋白質(zhì)組合物。"分離的"或"純化的"核酸分子或蛋白質(zhì)，或其生物學(xué)活性部分是基本上或在本質(zhì)上不含有在該核酸分子或蛋白質(zhì)天然存在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的與其正常相伴或相互作用的組分。因此，當(dāng)分離或純化的多核苷酸或多肽通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)其基本上不含其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基成分，或者當(dāng)它們用化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。"分離的"多核苷酸宜不含產(chǎn)生該多核苷酸的生物體的基因組DNA中天然側(cè)接該多核苷酸的序列(即，位于該多核苷酸的5'和3'末端的序列)，特別是蛋白質(zhì)的編碼序列。例如，在各種實(shí)施方案中，分離的應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸可含有少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的產(chǎn)生該多核苷酸的細(xì)胞的基因組DNA中天然側(cè)接該多核苷酸的核苷酸序列?；旧喜缓?xì)胞物質(zhì)的多肽包括含有少于約30%、20%、10%、5%(以干重計(jì))的污染蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)制劑。當(dāng)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性部分用重組方法制備時(shí)，培養(yǎng)基成分宜少于約30%、20%、10%或5%(以干重計(jì))的化學(xué)前體或非感興趣蛋白質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明也包括應(yīng)激標(biāo)記基因的全長或基本上全長核苷酸序列的各部分，或者它們的轉(zhuǎn)錄物或這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的DNA拷貝。應(yīng)激標(biāo)記核苷酸序列的各部分可編碼多肽部分或保留該天然多肽生物學(xué)活性的區(qū)段?；蛘?，可用作雜交探針的應(yīng)激標(biāo)記核苷酸序列的各部分通常不編碼保留這種生物學(xué)活性的氨基酸序列。因此，應(yīng)激標(biāo)記核苷酸序列的各部分至少含有編碼本發(fā)明應(yīng)激標(biāo)記多肽的核苷酸序列的約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、80、90、100個(gè)核苷酸，或者幾乎高達(dá)其全長的核苷酸序列。編碼本發(fā)明應(yīng)激標(biāo)記多肽的生物學(xué)活性部分的應(yīng)激標(biāo)記核苷酸序列的一部分至少可編碼全長應(yīng)激標(biāo)記多肽中的約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、卯、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900或1000、或者甚至至少約2000、3000、4000或5000個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，或者幾乎高達(dá)其氨基酸總數(shù)?？捎米麟s交探針或PCR引物的應(yīng)激標(biāo)記核苷酸序列的各部分一般無需編碼應(yīng)激標(biāo)記多肽的生物學(xué)活性部分。因此，應(yīng)激標(biāo)記核苷酸序列的一部分可編碼應(yīng)激標(biāo)記多肽的生物學(xué)活性部分，或者它可以是用作本領(lǐng)域己知標(biāo)準(zhǔn)方法的雜交探針或PCR引物的片段?？赏ㄟ^分離一條本發(fā)明應(yīng)激標(biāo)記核苷酸序列的一部分，表達(dá)其所編碼的應(yīng)激標(biāo)記多肽的一部分(例如通過體外重組表達(dá))并評(píng)估所編碼的該應(yīng)激標(biāo)記多肽的一部分(活性)來制備該應(yīng)激標(biāo)記多肽的生物學(xué)活性部分。作為應(yīng)激標(biāo)記核苷酸序列各部分的核酸分子至少含有全長應(yīng)激標(biāo)記核苷酸序列中的約15、16、17、18、19、20、25、30、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600或650個(gè)核苷酸，或者幾乎高達(dá)其核苷酸總數(shù)。本發(fā)明也考慮了應(yīng)激標(biāo)記核苷酸序列的變體。核酸變體可以是天然產(chǎn)生的，例如等位變體(同一基因座)、同源物(不同基因座)和直向同源物(不同生物體)或者可以是非天然產(chǎn)生的?？刹捎檬熘姆肿由飳W(xué)技術(shù)，例如本領(lǐng)域已知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和雜交技術(shù)鑒定天然產(chǎn)生在的變體，例如這些變體?？赏ㄟ^誘變技術(shù)，包括適用于多核苷酸、細(xì)胞或生物體的技術(shù)來制備非天然產(chǎn)生的變體。這些變體可含有核苷酸取代、缺失、倒位和插入。編碼和/或非編碼區(qū)可發(fā)生變異。變異既可導(dǎo)致保守性也可導(dǎo)致非保守性氨基酸取代(與編碼產(chǎn)物相比)。就核苷酸序列而言，保守性變體包括因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性而編碼本發(fā)明應(yīng)激標(biāo)記多肽之一的氨基酸序列的那些(核酸)序列。變體核苷酸序列也包括合成衍生但仍能編碼本發(fā)明應(yīng)激標(biāo)記多肽的核苷酸序列，例如通過定點(diǎn)誘變產(chǎn)生的那些序列?？傮w上，通過本文所述的序列比對(duì)程序利用默認(rèn)參數(shù)測(cè)定到本發(fā)明某特定核苷酸序列的變體與該核苷酸序列至少具有約30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%，一般至少約75%、80%、85%,優(yōu)選約90%-95%以上，更優(yōu)選約98%以上的序列相同性。本發(fā)明的應(yīng)激標(biāo)記核苷酸序列可用于分離其它生物體，特別是其它哺乳動(dòng)物，尤其是其它品種馬的相應(yīng)序列與等位變體。核酸序列的雜交方法是本領(lǐng)域現(xiàn)有的不難獲得。其它生物體的編碼序列可通過熟知技術(shù)根據(jù)其與本文所述編碼序列的序列相同性分離得到。在這些技術(shù)中，可將所有或部分的已知編碼序列用作探針，與所選生物體的克隆的基因組DNA片段或cDNA片段群(即，基因組或cDNA文庫)中存在的其它應(yīng)激標(biāo)記編碼序列選擇性雜交。因此，本發(fā)明也考慮了在下述嚴(yán)謹(jǐn)性條件下能與所述應(yīng)激標(biāo)記基因核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸。本文所用的術(shù)語"在低嚴(yán)謹(jǐn)性、中等嚴(yán)謹(jǐn)性、高嚴(yán)謹(jǐn)性或極高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下雜交"描述了雜交和洗滌的條件。進(jìn)行雜交反應(yīng)的指南可見Ausubel等(1998，同上)，第6.3.1-6.3.6部分。該參考文獻(xiàn)中描述了水性和非水性方法，二者均可用。本文提及的低嚴(yán)謹(jǐn)性條件包括至少約1-至少約15%v/v的甲酰胺和至少約1-至少約2M的鹽，42'C雜交，與至少約1-至少約2M的鹽，42"C洗滌。低嚴(yán)謹(jǐn)性條件也可包括1%牛血清白蛋白(BSA)、1mMEDTA、0.5MNaHPO4(pH7.2)、7%SDS，65。C雜交，與(i)用2XSSC、0.1%SDS;或(ii)用0.5%BSA、1mMEDTA、40mMNaHPO4(pH7.2)、5%SDS，室溫洗滌。低嚴(yán)謹(jǐn)性條件的一個(gè)實(shí)施方案包括約45t:在6X氯化鈉/擰檬酸鈉(SSC)中雜交，然后至少在5(TC(低嚴(yán)謹(jǐn)性條件的洗滌溫度可升高至55t:)用0.2XSSC，0.1。/。SDS洗滌兩次。中等嚴(yán)謹(jǐn)性條件包括至少約16-至少約30%v/v的甲酰胺和至少約0.5-至少約0.9M的鹽，42'C雜交，與至少約0.1-至少約0.2M的鹽，55'C洗滌。中等嚴(yán)謹(jǐn)性條件也可包括1%牛血清白蛋白(BSA)、1mMEDTA、0.5MNaHPO4(pH7.2)、7%SDS，65。C雜交，與(i)用2XSSC、0.1%SDS;或(ii)用0.5%BSA、lmMEDTA、40mMNaHPO4(pH7.2)、5%SDS，60陽65。C洗滌。中等嚴(yán)謹(jǐn)性條件的一個(gè)實(shí)施方案包括約45'C在6XSSC中雜交，然后6(TC用0.2XSSC，0.1%SDS洗滌一次以上。高嚴(yán)謹(jǐn)性條件包括至少約31-至少約50%v/v的甲酰胺和約0.01-約0.15M的鹽，42'C雜交，與用約0.01-約0.02M的鹽，55。C洗滌。高等嚴(yán)謹(jǐn)性條件也可包括1%BSA、1mMEDTA、0.5MNaHP04(pH7.2)、7%SDS，65。C雜交，與(i)用0.2XSSC、0.1。/。SDS;或(ii)用0.5%BSA、1mMEDTA、40mMNaHPO4(pH7.2)、1%SDS，在超過65'C的溫度洗滌。高嚴(yán)謹(jǐn)性條件的一個(gè)實(shí)施方案包括約45'C在6XSSC中雜交，然后65。C用0.2XSSC，0.1%SDS洗滌一次以上。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸在極高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與所述核苷酸序列雜交。極高嚴(yán)謹(jǐn)性條件的一個(gè)實(shí)施方案包括65'C在0.5M磷酸鈉、7。/。SDS中雜交，然后65。C用0.2XSSC，1。/。SDS洗滌一次以上。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知其它嚴(yán)謹(jǐn)性條件，技術(shù)人員知道可操縱各種因素來優(yōu)化雜交的特異性?？蓛?yōu)化最終洗滌的嚴(yán)謹(jǐn)性以確保高程度雜交。詳細(xì)例子可參見Ausubel等，同上，第2.10.1-2.10.16頁和Sambrook等，(1989，同上)，第1.101-1.104部分。雖然一般在約42'C-68"C的溫度下進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌，但本領(lǐng)域技術(shù)人員知道其它溫度也適合于嚴(yán)謹(jǐn)性條件。為形成DNA-DNA雜交，發(fā)生最大雜交率的溫度一般比Tm低約2(TC-25。C。本領(lǐng)域熟知Tm是解鏈溫度，或者是兩條互補(bǔ)多核苷酸序列解離的溫度。本領(lǐng)域熟知評(píng)估Tm的方法(參見Ausubel等，同上，第2.10.8頁)?？傮w上，可利用以下公式預(yù)測(cè)DNA的最佳匹配雙螺旋的Tm近似值Tm=81.5+16.6(logioM)+0.41(%G+C)-0.63(%甲酰胺)—(600/長度)其中M是Na+的濃度，優(yōu)選0.01-0.4摩爾；％G+C是鳥苷和胞苷堿基之和占?jí)A基總數(shù)的百分比，其范圍在30%和75%G+C之間；％甲酰胺是以體積計(jì)的甲酰胺濃度的百分比；長度是DNA雙螺旋中堿基對(duì)的數(shù)目。隨機(jī)錯(cuò)配的堿基對(duì)數(shù)目每上升1%，雙螺旋DNA的Tm降低約rC。高嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌通常在Tm-15'C時(shí)進(jìn)行，或者中等嚴(yán)謹(jǐn)性在Im-30'C進(jìn)行。在雜交方法的一個(gè)例子中，含有固定DNA的膜(例如，硝酸纖維素膜或尼龍膜)42'C在含有標(biāo)記探針的雜交緩沖液(50M去離子甲酰胺、5XSSC、5XDenhardt溶液(0.1%ficoll、0.1%聚乙烯妣咯烷酮和0.1%牛血清白蛋白)、0.1。/。SDS和200mg/mL變性鮭魚精子DNA)中雜交過夜。然后以中等嚴(yán)謹(jǐn)性條件連續(xù)洗滌該膜兩次(即，45'C用2XSSC、0.1%SDS洗滌15分鐘，然后5(TC用2XSSC、0.1%SDS洗滌15分鐘)，在較高嚴(yán)謹(jǐn)性連續(xù)洗滌兩次(即，55。C用0.2XSSC、0.1%SDS洗漆12分鐘，然后65-68'C用0.2XSSC、0.1%SDS溶液洗滌12分鐘)。5.本發(fā)明的多肽本發(fā)明也考慮了本發(fā)明的應(yīng)激標(biāo)記基因編碼的全長多肽以及那些多肽的生物學(xué)活性部分，統(tǒng)稱為"應(yīng)激標(biāo)記多肽"。全長應(yīng)激標(biāo)記多肽的生物學(xué)活性部分包括至少長約6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、60個(gè)氨基酸殘基的具有免疫相互作用活性的部分。例如，本發(fā)明所考慮的免疫相互作用片段至少長6個(gè)，優(yōu)選至少8個(gè)氨基酸殘基，它們能在動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答從而產(chǎn)生能與本發(fā)明的應(yīng)激標(biāo)記多肽發(fā)生免疫相互作用的抗原結(jié)合分子。這種抗原結(jié)合分子可用于篩檢其它哺乳動(dòng)物，特別是馬類哺乳動(dòng)物的與結(jié)構(gòu)和/或功能相關(guān)的應(yīng)激標(biāo)記多肽。全長應(yīng)激標(biāo)記多肽的各部分一般可能參與某種相互作用，例如分子內(nèi)或分子間相互作用。分子間相互作用可以是特異性結(jié)合相互作用或酶促相互作用(例如所述相互作用可以是瞬時(shí)性，可形成或打斷某共價(jià)鍵)。全長應(yīng)激標(biāo)記多肽的生物學(xué)活性部分包括含有與某(假定的)全長應(yīng)激標(biāo)記多肽的氨基酸序列，例如以下SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示的氨基酸序列足夠相似或衍生自該氨基酸序列的氨基酸序列的肽，這些序列含有少于全長應(yīng)激標(biāo)記多肽的氨基酸并至少顯示該多肽的一種活性。生物學(xué)活性部分通常包含至少具有全長應(yīng)激標(biāo)記多肽的一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。全長應(yīng)激標(biāo)記多肽的生物學(xué)活性部分可以是長，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、卯、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900或1000，或者甚至至少約2000、3000、4000或5000個(gè)以上氨基酸殘基的多肽。所述部分宜是含有不低于其所衍生的全長多肽的約1%、10%、25%、50%活性的"生物學(xué)活性部分"。本發(fā)明也考慮了應(yīng)激標(biāo)記多肽的變體。"變體"多肽包括通過以下方式從天然蛋白質(zhì)中衍生的蛋白質(zhì)在該天然蛋白質(zhì)的N-末端和/或C-末端刪除(稱為截短)或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；在該天然蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處刪除或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；或者在該天然蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸。本發(fā)明的變體蛋白質(zhì)是生物學(xué)活性的，即它們繼續(xù)具有該天然蛋白質(zhì)的所需生物學(xué)活性。例如，遺傳多態(tài)性或人為操作可形成這種變體。通過本文所述的序列比對(duì)程序利用默認(rèn)參數(shù)測(cè)定到本發(fā)明的天然應(yīng)激標(biāo)記蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性變體與該天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列可具有至少40%、50%、60%、70%，一般至少75%、80%、85%,優(yōu)選約90%-95%以上，更優(yōu)選約98%以上的序列相似性。本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性變體與該蛋白質(zhì)一般可有多達(dá)1000、500、400、300、200、100、50或20個(gè)氨基酸殘基，或者宜少至1-15個(gè)氨基酸殘基、少至1-10個(gè)(例如6-10個(gè))、少至5個(gè)、少至4、3、2或者甚至l個(gè)氨基酸殘基不同。可以各種方式改變本發(fā)明的應(yīng)激標(biāo)記多肽，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。本領(lǐng)域一般知道這種操作方法。例如，可通過DNA突變制備應(yīng)激標(biāo)記蛋白質(zhì)的氨基酸序列變體。本領(lǐng)域熟知誘變與核苷酸序列改變的方法。參見，例如Kunkel(1985，尸麼.JcW.,,82:488-492)，Kunkel等，(1987，M"/zo&〖"￡>zz>wo/.,154:367-382)，美國專利號(hào)4,873,192;Watson，J,D.等，(《基因的分子生物學(xué)》(MolecularBiologyoftheGene)，第四版，Benjamin/Cummings，MenloPark,Calif.，1987)和它們所引用的參考文獻(xiàn)。適當(dāng)進(jìn)行氨基酸取代而不影響感興趣蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的指南見Dayhoff等，(1978)，《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖》(AtlasofProteinS叫uenceandStructure),(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington,D.C.)的模型。本領(lǐng)域已知篩選具有所選特性的通過點(diǎn)突變或截短(方法)制備的組合文庫基因產(chǎn)物和篩選cDNA文庫的基因產(chǎn)物的方法。這種方法適用于快速篩選通過組合誘變產(chǎn)生的應(yīng)激標(biāo)記多肽的基因文庫。可聯(lián)用能提高該文庫中功能性突變體的頻率的技術(shù)-遞推集團(tuán)誘變(REM)技術(shù)與篩選試驗(yàn)來鑒定應(yīng)激標(biāo)記多肽變體(Arkin和Yourvan，(1992)，尸亂淑/.爿cacf.,，S9:7811-7815;Degrave等，(1993)，尸她/w五，'廳"'"g，6:327-331)。下文詳述了理想的保守性取代，例如用另一個(gè)具有相似特性的氨基酸替換某一氨基酸。與親代應(yīng)激標(biāo)記氨基酸序列相比，應(yīng)激標(biāo)記多肽變體在沿它們序列的不同位置可含有保守性氨基酸取代。"保守性氨基酸取代"是用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代某氨基酸殘基。本領(lǐng)域定義了具有相似側(cè)鏈?zhǔn)前被釟埢易?，它們一般可再分為酸性該殘基因在生理pH下失去H離子而帶負(fù)電荷，該殘基受水溶液吸弓|，因此當(dāng)包含它的肽處于生理pH的水性介質(zhì)中時(shí)，它吸附于該肽構(gòu)型的表面位置。含有酸性側(cè)鏈的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。堿性該殘基因在生理PH下或在其一兩個(gè)pH單位內(nèi)結(jié)合H離子而帶正電荷(例如，組氨酸)，該殘基受水溶液吸引，因此當(dāng)包含它的肽處于生理pH的水性介質(zhì)中時(shí)，它吸附于該肽構(gòu)型的表面位置。含有堿性側(cè)鏈的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶電荷的這些殘基在生理pH時(shí)帶電荷，因此包括含有酸性或堿性側(cè)鏈的氨基酸(即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸和組氨酸)。疏水性這些殘基在生理pH下不帶電荷并被水溶液所排斥，因此當(dāng)包含它的肽處于水性介質(zhì)中時(shí)，它吸附于該肽構(gòu)型的內(nèi)部位置。含有疏水側(cè)鏈的氨基酸包括酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。中性/極性這些殘基在生理pH下不帶電荷，但水溶液不十分排斥它們，因此當(dāng)包含該殘基的肽處于水性介質(zhì)中時(shí)，它吸附于該肽構(gòu)型的內(nèi)部位置。含有中性/極性側(cè)鏈的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、組氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。本說明書也將某些氨基酸特征鑒定為"小的"氨基酸，因?yàn)樗鼈兊膫?cè)鏈不夠大(即使缺乏極性基團(tuán))因而不能賦予疏水性。除脯氨酸以外，"小的"氨基酸是當(dāng)側(cè)鏈上有至少一個(gè)極性基團(tuán)時(shí)具有4個(gè)以下碳，和當(dāng)側(cè)鏈上沒有極性基團(tuán)時(shí)具有3個(gè)以下碳的那些氨基酸。具有小側(cè)鏈的氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸?；蚓幋a的二級(jí)氨基酸-脯氨酸因已知其對(duì)肽鏈的二級(jí)構(gòu)型有影響而成為一種特殊情況。脯氨酸的結(jié)構(gòu)不同于所有其它天然產(chǎn)生的氨基酸在于其側(cè)鏈與a-氨基的氮以及oc-碳結(jié)合。例如Dayhoff等((197S)，"蛋白質(zhì)進(jìn)化改變的模型"(Amodelofevolutionarychangeinproteins))公開了幾種氨基酸相似性矩陣(例如，PAM120矩陣和PAM250矩陣)。然而，刊于M.O.Dayhoff編的《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖》(AtlasofProteinS叫uenceandStructure),第5巻，第345-358頁，NationalBiomedicalResearchFoundation,WashingtonDC;禾口Gonnet等，1992，S"'e"ce，256(5062):144301445中用于測(cè)定遠(yuǎn)程關(guān)系的矩陣將脯氨酸包括在與甘氨酸、絲氨酸丙氨酸和蘇氨酸的同一組中。因此，為本發(fā)明的目的將脯氨酸歸類為"小"氨基酸。將(氨基酸)分為極性或非極性所需的吸引或排斥程度是隨意的，因此本發(fā)明專門考慮的氨基酸可分為一類或另一類?？筛鶕?jù)已知的性能對(duì)大多數(shù)未專門命名的氨基酸進(jìn)行分類。氨基酸殘基還可再分為環(huán)狀或非環(huán)狀、芳香族或非芳香族、根據(jù)殘基的側(cè)鏈取代基可自圓其說分類為小的或大的。如果某殘基總共含有4個(gè)以下碳原子(包括羧基碳)，認(rèn)為其是小氨基酸，前提是存在其它極性取代基；如果不存在其它極性取代基，總共含3個(gè)以下碳原子的殘基可認(rèn)為是小氨基酸。小殘基當(dāng)然總是非芳香族殘基。可根據(jù)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)性能將其分為兩種以上的種類。就天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)氨基酸而言，根據(jù)此方案的亞分類見表3.保守性氨基酸取代也包括根據(jù)側(cè)鏈的分類。例如，含有脂族側(cè)鏈的一組氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；含有脂族-羥基側(cè)鏈的一組氨基酸包括絲氨酸和蘇氨酸；含酰胺側(cè)鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；含有芳香族側(cè)鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；含有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；與含有硫側(cè)鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理地希望用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺、絲氨酸取代蘇氨酸，或者用結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸相似地取代某種氨基酸時(shí)不會(huì)嚴(yán)重影響所產(chǎn)生的變體多肽的性能。氨基酸改變是否能產(chǎn)生功能性應(yīng)激標(biāo)記多肽不難通過檢驗(yàn)其活性來測(cè)定。保守性取代可見表4示范性取代的標(biāo)題。更優(yōu)選的取代見優(yōu)選取代標(biāo)題。本發(fā)明范圍內(nèi)的氨基酸取代一般通過選擇其作用對(duì)(a)維持取代區(qū)域中肽骨架的結(jié)構(gòu)，(b)維持該分子在耙位點(diǎn)的電荷或疏水性，或(C)維持側(cè)鏈的體積的作用中沒有明顯不同的.取代來實(shí)現(xiàn)。引入取代后，篩選變體的生物學(xué)活性?；蛘撸筛鶕?jù)側(cè)鏈的相同性將制備保守性取代的相似氨基酸分為三類。如Zubay，G.，《生物化學(xué)》(S/ocAem/W;7)，第三版，Wm.C.BrownPublishers,(1993)所述，第一組包括均含有帶電荷鏈的谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸；第二組包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；第三組包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸。因此，通常用同一側(cè)鏈家族中的另一氨基酸殘基取代應(yīng)激標(biāo)記多肽中預(yù)計(jì)的非必需氨基酸殘基?；蛘?，可沿著全部或部分應(yīng)激標(biāo)記基因編碼序列隨機(jī)引入突變，例如通過飽和誘變，然后篩選得到的突變體有無親代多肽的活性來鑒定保留了該活性的突變體。誘變編碼序列后，可重組表達(dá)所編碼的肽，測(cè)定該肽的活性。因此，本發(fā)明也考慮了天然產(chǎn)生的應(yīng)激標(biāo)記多肽序列的變體或它們的生物學(xué)活性片段，其中所述變體可通過添加、缺失或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而與天然產(chǎn)生的序列相區(qū)別。總體上，變體可顯示與親代應(yīng)激標(biāo)記多肽序列，例如以下SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示任一序列具有至少約30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的相似性。變體優(yōu)選與親代應(yīng)激標(biāo)記多肽序列，例如以下SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、29、22、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示任一序列具有至少約30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的序列相同性。此外，本發(fā)明考慮了通過添加、缺失或取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、500個(gè)以上氨基酸而與天然或親代序列不同但仍保留了該親代應(yīng)激標(biāo)記多肽特性的序列。應(yīng)激標(biāo)記多肽也包括能在本文所定義的嚴(yán)謹(jǐn)條件下，68特別是高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與上述本發(fā)明應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸序列或其非編碼鏈雜交的多核苷酸編碼的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，變體多肽與應(yīng)激標(biāo)記序列有至少一個(gè)但少于50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2個(gè)氨基酸殘基不同。在另一實(shí)施方案中，變體多肽與以下SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示的相應(yīng)序列有至少1%但低于20%、15%、10%或5%的殘基不同。(如果此比較(方法)需要比對(duì)，則應(yīng)比對(duì)這些序列的最大相似性。因缺失或插入或錯(cuò)配所產(chǎn)生的"環(huán)"外序列可認(rèn)為有差別)。這些差別優(yōu)選是位于非必需殘基的差別或改變或保守性取代。"非必需"氨基酸殘基是可從某實(shí)施方案多肽的野生型序列中改變，而不破壞或基本上不改變其一種或多種活性的殘基。所述改變優(yōu)選基本上不改變這些活性，例如不改變野生型多肽的20%、40%、60%、70%或80%活性。"必需"氨基酸殘基是當(dāng)從本發(fā)明應(yīng)激標(biāo)記多肽的野生型序列中改變時(shí)會(huì)破壞該親代分子的活性從而使野生型多肽存在的活性低于20%的殘基。在其它實(shí)施方案中，變體多肽包括與應(yīng)激標(biāo)記多肽的相應(yīng)序列，例如以下SEQIDNO..2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示任一序列具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、卯％、91%、92%、93%、94%95%、96%、97%、98%以上相似性并具有該應(yīng)激標(biāo)記多肽活性的氨基酸序列?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適方法制備本發(fā)明的應(yīng)激標(biāo)記多肽。例如，可通過包括以下步驟的方法制備這些多肽(a)制備含有至少編碼某應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸的一部分并與調(diào)節(jié)元件操作性相連的核苷酸序列的嵌合型構(gòu)建物；(b)將該嵌合型構(gòu)建物引入宿主細(xì)胞；(C)培養(yǎng)該宿主細(xì)胞表達(dá)該應(yīng)激標(biāo)記多肽；和(d)從宿主細(xì)胞中分離該應(yīng)激標(biāo)記多肽。在示范性的例子中，所述核苷酸序列至少編碼以下SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示序列的一部分，或其變體。嵌合型構(gòu)建物通常釆取表達(dá)載體的形式，宜選自自身復(fù)制的染色體外載體(例如質(zhì)粒)和能整合入宿主基因組中的載體。調(diào)節(jié)元件一般應(yīng)適合于表達(dá)該應(yīng)激標(biāo)記多肽所用的宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域己知各種宿主細(xì)胞的許多類型的表達(dá)載體和調(diào)節(jié)元件。此類型的示范性元件包括但不限于啟動(dòng)子序列(例如可以是天然產(chǎn)生的或含多種啟動(dòng)子的組合元件的組成型或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子)、前導(dǎo)或信號(hào)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列、與增強(qiáng)子或激活序列。在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包含可選擇的標(biāo)記基因以選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞?？蛇x擇標(biāo)記基因是本領(lǐng)域熟知的并隨所用的宿主細(xì)胞而不同。所述表達(dá)載體也可包含融合伴侶(通常由該表達(dá)載體提供)從而可將應(yīng)激標(biāo)記多肽表達(dá)制備為含有融合伴侶的融合多肽。融合伴侶的主要優(yōu)點(diǎn)是它們有助于鑒定和/或純化該融合多肽。為制備融合多肽，需要將應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸連接入表達(dá)載體中從而使融合伴侶與應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸的翻譯讀框重合。融合伴侶的熟知例子包括但不限于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、人IgG的Fc部分、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)和六個(gè)組氨酸(hexahistidine)(HIS6)，這些伴侶特別可用于通過親和層析分離融合多肽。在一些實(shí)施方案中，可利用與融合伴侶結(jié)合的基質(zhì)(例如但不限于谷胱甘肽-、直鏈淀粉-和鎳-或鈷-偶聯(lián)樹脂)通過親和層析純化這些融合多肽。許多這種基質(zhì)可以"試劑盒"形式購買到，例如利用(HIS6)伴侶的QIAexpressTM系統(tǒng)(Qiagen)和PharmaciaGST純化系統(tǒng)。本領(lǐng)域己知的其它融合伴侶是發(fā)光蛋白質(zhì)，例如可用作熒光"標(biāo)簽"通過熒光顯微術(shù)或流式細(xì)胞術(shù)來鑒定和/或分離融合多肽的綠色熒光蛋白(GFP)和螢光素酶。流式細(xì)胞術(shù)方法，例如熒光激活細(xì)胞分選(FACS)法在該后一應(yīng)用中特別有用。融合伴侶也優(yōu)選含有蛋白酶切割位點(diǎn)，例如因子Xa或凝血酶的切割位點(diǎn)，從而使相關(guān)蛋白酶能部分消化該融合多肽而從融合構(gòu)建物中釋放應(yīng)激標(biāo)記多肽。隨后可通過層析分離方法來分離所釋放的多肽。融合伴侶的范圍也包括"表位標(biāo)簽"，這些標(biāo)簽通常是可利用特異性抗體(純化)的短肽序列。易于利用特異性單克隆抗體(純化)的表位標(biāo)簽的熟知例子包括c-Myc、流感病毒、血凝素和FLAG標(biāo)簽?？赏ㄟ^包括"轉(zhuǎn)導(dǎo)"和"轉(zhuǎn)染"等適當(dāng)方法將本發(fā)明的嵌合型構(gòu)建物引入.宿主中，這在技術(shù)上意味著通過核酸介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移將核酸，例如表達(dá)載體引入受者細(xì)胞中。然而，"轉(zhuǎn)化"指宿主的基因型因細(xì)胞攝入外源性DNA或RNA而改變的過程，例如轉(zhuǎn)化細(xì)胞含有本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)。將嵌合型構(gòu)建物引入細(xì)胞有許多方法。所用的方法一般取決于宿主細(xì)胞的選擇。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知將嵌合型構(gòu)建物引入宿主細(xì)胞的技術(shù)。己描述了四類將核酸分子遞送入細(xì)胞的方法(1)化學(xué)方法，例如磷酸鈣沉淀、聚乙二醇(PEG)-介導(dǎo)的沉淀和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染；(2)物理方法，例如顯微注射、電穿孔、加速方法和真空滲入；(3)載體方法，例如細(xì)菌和病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；和(4)受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些和其它類型的轉(zhuǎn)化技術(shù)，而新的技術(shù)也不斷涌現(xiàn)。具體選擇轉(zhuǎn)化技術(shù)取決于該技術(shù)轉(zhuǎn)化特定宿主細(xì)胞的效率以及采用具體選擇的方法實(shí)施本發(fā)明之人的經(jīng)驗(yàn)和偏好。技術(shù)人員明顯可知對(duì)本發(fā)明而言，將嵌合型構(gòu)建物引入細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的具體選擇對(duì)本發(fā)明不是實(shí)質(zhì)性的或?qū)Ρ景l(fā)明的限制，只要該系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)可接受的核酸轉(zhuǎn)移水平?？赏ㄟ^培養(yǎng)用嵌合型構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來制備重組應(yīng)激標(biāo)記多肽。適合表達(dá)應(yīng)激標(biāo)記多肽的條件隨所選表達(dá)載體和宿主細(xì)胞而不同，技術(shù)人員通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)不難確定這些條件。適合表達(dá)的宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞。表達(dá)本發(fā)明多肽的示范性宿主細(xì)胞是細(xì)菌。所用的細(xì)菌可以是大腸桿菌C&yc/2^7'cWfl或者，宿主細(xì)胞可以是酵母菌細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞，例如利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的s尸9細(xì)胞?？刹捎萌鏢ambrook等，(1989，同上)，特別是第16和17部分；Ausubel等，(1994，同上)，特別是第10和16章；和Coligan等，《蛋白質(zhì)科學(xué)的最新方法》(CURRENTPROTOCOLSINPROTEINSCIENCE),(JohnWiley&Sons，Inc.,1995-1997)，特別是第1、5和6章中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法不難制備重組應(yīng)激標(biāo)記多肽?；蛘?，可通過化學(xué)合成，例如采用如Atherton和Shephard，(同上)第9章和Roberge等，(1995，腸"ce，269:202)中所述的液相合成或固相合成來化學(xué)合成應(yīng)激標(biāo)記多肽。6.抗原結(jié)合分子本發(fā)明也提供可與本發(fā)明應(yīng)激標(biāo)記多肽發(fā)生特異性免疫相互作用的抗原結(jié)合分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗原結(jié)合分子包括多克隆全抗體?？赏ㄟ^，例如將本發(fā)明的應(yīng)激標(biāo)記多肽注射入能產(chǎn)生(抗體)的動(dòng)物(包括小鼠和家兔)以獲得多克隆抗血清來制備這種抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知制備多克隆抗體的方法。可采用的示范性方法見，例如Coligan等，《免疫學(xué)最新方法》(CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY),(JohnWiley&Sons,Inc，199l)和Ausubel等，(1994-1998，同上)，特別是第ll章的第III部分?？刹捎茫鏚池ler和Milstein(1975，iV倉e，256，495-497)所述的標(biāo)準(zhǔn)方法或采用，例如Coligan等，(1991，同上)所述的最新改進(jìn)方法，用得自接種了一種或多種本發(fā)明應(yīng)激標(biāo)記多肽的產(chǎn)生(抗體的)動(dòng)物的無限增殖脾細(xì)胞或其它抗體產(chǎn)生細(xì)胞來制備單克隆抗體，替代在產(chǎn)生(抗體的)動(dòng)物中得到的多克隆抗血清。本發(fā)明也考慮用Fv、Fab、Fab'和F(ab')2免疫球蛋白片段作為抗原結(jié)合分子?；蛘撸乖Y(jié)合分子可包括合成的穩(wěn)定的Fv片段。此類型的示范性片段包括用肽接頭分別橋連V/z結(jié)構(gòu)域的N末端或C末端與V丄結(jié)構(gòu)域的C末端或N-末端的單鏈Fv片段(sFv，通常稱為scFv)。ScFv缺乏完整抗體的所有恒定區(qū)，因而不能激活補(bǔ)體。可根據(jù)，例如Kreber等(Kreber等，1997，J/mm朋o/.M"/zo&，201(1):35-55)所概述的方法制備ScFv。或者，可通過美國專利號(hào)5,091,513;歐洲專利號(hào)239,400或Winter和Milstein的文章(1991，Mm^e，349:293)和PKickthun等(1996，刊于《抗體工程改造一種實(shí)用方法》(J加》o辦ewg&een'"g:爿prac"ca/appraac/z),203-252)所述的方法制備它們。在另一實(shí)施方案中，合成的穩(wěn)定的Fv片段包括二硫鍵穩(wěn)定的Fv(dsFv)，在該片段中將二個(gè)半胱氨酸殘基引入Vi/和V丄結(jié)構(gòu)域中從而在完全折疊的分子中此二殘基彼此之間形成二硫鍵。產(chǎn)生dsFv的合適方法描述于，例如(Glockscuther等，飾c/j綴,29:1363-1367;Reiter等，1994,C/z謹(jǐn),，269:18327-18331;Reiter等，1994，說oc/zem.，3丄5451-5459;Reiter等，1994，Omcer^M.，54:2714-2718;Webber等，1995，Mo/./wm麗o/.，32:249-258)。本領(lǐng)域已知制備抗-應(yīng)激標(biāo)記多肽的抗原結(jié)合分子的噬菌體展示與組合方法(例如，以下文獻(xiàn)中所述的Ladner等，美國專利號(hào)5,223,409;Kang等，國際公布號(hào)WO92/18619;Dower等，國際公布號(hào)WO91/17271;Winter等，國際公布WO92/20791;Markland等，國際公布號(hào)WO92/15679;Breitling等，國際公布WO93/01288;McCafferty等，國際公布號(hào)WO92/01047;Garrard等，國際公布號(hào)WO92/09690;Ladner等，國際公布號(hào)WO90/02809;Fuchs等，(1991)Sw/rec/mo/ogv，2:1370-1372;Hay等，(1992)，//wm^""k^7/#/^/omw,2:81-85;Huse等，(1989)，謹(jǐn):1275-1281;Griffths等，(1993)，￡MSO/，12:725-734;Hawkins等，(1992)，/M/淑，226:889-896;Clackson等，(1991)，A/fl&re，352:624-628;Gram等，(1992)，iW^4S，3576-3580;Garrad等，(1991)，說'o/Tec/mo/ogy，2:1373-1377;Hoogenboom等，(1991)，7W^爿c/c/b，J^:4133-4137;和Barbas等，(1991)，iWA5，絲7978-7982)。這些抗原結(jié)合分子可用于篩選應(yīng)激標(biāo)記多肽變體的表達(dá)文庫。它們也可用于檢測(cè)和/或分離本發(fā)明的應(yīng)激標(biāo)記多肽。因此，本發(fā)明也考慮可利用這些抗原結(jié)合分子，采用例如任何合適的免疫親和方法(包括但不限于免疫層析和免疫沉淀)來分離應(yīng)激標(biāo)記多肽。合適的方法利用固相吸附，其中抗-應(yīng)激標(biāo)記多肽的抗原結(jié)合分子與合適的樹脂相連，使該樹脂與懷疑含有應(yīng)激標(biāo)記多肽的樣品接觸，然后從樹脂上洗脫應(yīng)激標(biāo)記多肽(如果存在的話)。示范性樹脂包括Sepharose(Pharmacia)、Poros⑧樹月旨(RocheMolecularBiochemicals，Indianapolis)、ActigelSuperflowTM樹月旨(SterogeneBioseparationsInc.,CarlsbadCalif.)禾口Dynabeads(DynalInc.，LakeSuccess,N.Y.)。抗原結(jié)合分子可與某化合物，例如標(biāo)記物，如放射性核素，或成像試劑，如放射性、酶活性(試劑)或其它試劑，如NMR對(duì)比試劑相偶聯(lián)。優(yōu)選能產(chǎn)生可檢測(cè)放射性射線或熒光的標(biāo)記物。為評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá)的豐度和模式，可利用抗-應(yīng)激標(biāo)記多肽的抗原結(jié)合分子(例如，單克隆抗體)來檢測(cè)應(yīng)激標(biāo)記多肽(例如，在細(xì)胞裂解物或細(xì)胞上清液中的)。在本發(fā)明的某些優(yōu)選應(yīng)用中，可用這種抗原結(jié)合分子來監(jiān)測(cè)生物學(xué)樣品(含有完整的細(xì)胞和液體)中的應(yīng)激標(biāo)記多肽水平而診斷是否存在應(yīng)激狀態(tài)及其程度或應(yīng)激所致疾病的風(fēng)險(xiǎn)。將抗體與可檢測(cè)物質(zhì)(即，抗體標(biāo)記)相偶聯(lián)(S卩，物理連接)有助于檢測(cè)?？蓹z測(cè)物質(zhì)的例子包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、(3-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的例子包括鏈霉親和素/生物素與親和素/生物素；合適的熒光材料的例子包括傘形酮、熒光素、熒光素異硫氰酸酯、羅丹明、二氯三吖嗪胺熒光素(dichlorotriazinylaminefluorescein)、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的例子包括魯米諾；生物發(fā)光材料的例子包括螢光素酶、熒光素和水母蛋白；合適的放射性材料的例子包括U5l、131^35s或3h。標(biāo)記物可選自色原、催化劑、酶、熒光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光分子、鑭系離子，如銪(Eu3勺、放射性同位素和直接可見的標(biāo)記物。就直接可見標(biāo)記物而言，可用膠體金屬顆粒或非金屬顆粒、染料顆粒、酶或底物、有機(jī)聚合物、乳膠顆粒、脂質(zhì)體或含有信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的其它載體等制備標(biāo)記。美國專利說明書U.S.4,366,241;U.S.4,843,000和U.S.4,849,338公開了大量可用作標(biāo)記物的酶。本發(fā)明可用的酶標(biāo)記物包括堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶、卩-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶等。溶液中酶標(biāo)記物可單獨(dú)使用或與第二種酶聯(lián)用。7.檢測(cè)應(yīng)激標(biāo)記基因異常表達(dá)或等位基因的方法本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)受應(yīng)激的馬相比，經(jīng)受應(yīng)激的馬的某些基因或者這些基因的某些等位基因(本文稱為應(yīng)激標(biāo)記基因)異常表達(dá)。有人提出在處于應(yīng)激狀態(tài)下的其它動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)這些基因或它們的同源物或直向同源物的異常表達(dá)。因此，本發(fā)明的特征在于通過檢測(cè)取自某對(duì)象(優(yōu)選哺乳動(dòng)物)的生物學(xué)樣品中某應(yīng)激標(biāo)記基因的異常表達(dá)來評(píng)估該對(duì)象的應(yīng)激狀態(tài)或診斷應(yīng)激或應(yīng)激相關(guān)疾病(應(yīng)激后遺癥)的方法。按照一些實(shí)施方案，所述相關(guān)疾病的特征在于皮質(zhì)類固醇或其調(diào)節(jié)劑(例如，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子)的水平升高。這種相關(guān)疾病的示范性例子包括身體應(yīng)激，例如田徑訓(xùn)練和身體外傷；情感障礙，例如抑郁，包括重度抑郁、單一事件抑郁(single印isodedepression)、復(fù)發(fā)性抑郁(recurrentdepression)、虐待兒童誘導(dǎo)的抑郁(childabuseinduceddepression).季節(jié)性情感障礙、產(chǎn)后抑郁、胸腺機(jī)能障礙(dysthemia)、雙相性精神障礙和循環(huán)性情感；焦慮癥，包括恐慌、恐怖癥、強(qiáng)迫性精神失調(diào)；創(chuàng)傷后應(yīng)激疾??；應(yīng)激誘導(dǎo)的睡眠障礙；炎癥；疼痛；慢性疲勞綜合征；應(yīng)激誘導(dǎo)的頭痛；癌癥；人免疫缺陷病毒(HIV)感染；神經(jīng)變性疾病，例如阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓??；腸胃疾病，例如潰瘍、激惹性腸綜合征、克羅恩病、痙攣性結(jié)腸炎、腹瀉、術(shù)后腸梗阻和病理心理學(xué)失調(diào)或應(yīng)激相關(guān)的結(jié)腸過敏癥，-飲食疾病，如厭食和神經(jīng)性貪食；核上麻痹(supranuclearpalsy);肌萎縮性側(cè)索硬化癥；免疫功能降低或免疫抑制；出血性應(yīng)激；應(yīng)激誘導(dǎo)的精神病發(fā)作(stress-inducedpsychoticepisode);甲狀腺機(jī)能不正常綜合征；抗腹瀉激素(ADH)不適當(dāng)綜合征；暴食或肥胖癥；不育癥；頭部創(chuàng)傷；脊髓創(chuàng)傷；缺血性神經(jīng)元損傷(例如，腦缺血，如腦海馬回缺血)；興奮性中毒神經(jīng)元損傷；癲癇；心血管疾病，包括高血壓、心動(dòng)過速和充血性心力衰竭；中風(fēng)；免疫功能失調(diào)，包括應(yīng)激誘導(dǎo)的免疫失調(diào)(如應(yīng)激誘導(dǎo)的發(fā)燒、豬應(yīng)激綜合征、牛航運(yùn)熱、馬陣發(fā)性顫抖與小雞禁閉、綿羊急轉(zhuǎn)向(sheering)應(yīng)激或狗的人-動(dòng)物相互作用相的關(guān)應(yīng)激誘導(dǎo)的失調(diào))；自制；行為(自發(fā)的)調(diào)節(jié)；肌肉痙攣；尿失禁；阿爾茨海默型早老性癡呆；多發(fā)性腦梗死性癡呆；肌萎縮性側(cè)索硬化癥；化學(xué)物質(zhì)依賴性和成癮性(例如，酒精、可卡因、海洛因、苯并二氮雜蕈類或其它藥物)；藥物和酒精戒除癥狀；骨質(zhì)疏松癥；社會(huì)心理(psych0S0cial)侏儒癥；低血糖血癥；脫發(fā)；晝夜節(jié)律異常；和晝夜節(jié)律異常相關(guān)的疾病，例如時(shí)區(qū)改變綜合征、季節(jié)性情感障礙、失眠、睡眠-清醒模式不規(guī)律、遲發(fā)性睡眠階段綜合征、晚期睡眠階段綜合征、非-24小時(shí)睡眠清醒障礙、光誘導(dǎo)的時(shí)鐘重設(shè)置癥、REM睡眠障礙、睡眠過度、深眠狀態(tài)、嗜眠癥、夜間遺尿、下肢不寧綜合征、睡眠呼吸暫停、精神抑郁癥與抗抑郁藥物長期給藥和停藥相關(guān)的心率異常。為作出評(píng)估或診斷，需要定性或定量測(cè)定應(yīng)激標(biāo)記基因轉(zhuǎn)錄物的水平、某應(yīng)激標(biāo)記基因的特定等位基因的存在或水平或應(yīng)激標(biāo)記多肽的水平或功能活性。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)生物學(xué)樣品中存在的某應(yīng)激標(biāo)記基因產(chǎn)物的可檢測(cè)水平低于取自正常對(duì)象或未處于應(yīng)激狀態(tài)的對(duì)象的參比樣品中存在的該基因的水平時(shí)，則可診斷存在應(yīng)激狀態(tài)、其程度或階段或者存在發(fā)生應(yīng)激后遺癥的風(fēng)險(xiǎn)。在其它實(shí)施方案中，當(dāng)生物學(xué)樣品中存在的某應(yīng)激標(biāo)記基因產(chǎn)物的可檢測(cè)水平高于取自正常對(duì)象或未受應(yīng)激的對(duì)象的參比樣品中存在的該基因的水平，則可診斷應(yīng)激的存在、程度或階段或者發(fā)生應(yīng)激后遺癥的風(fēng)險(xiǎn)?？傊?，當(dāng)生物學(xué)樣品中的某應(yīng)激標(biāo)記基因產(chǎn)物的水平或功能活性與參比樣品中相應(yīng)的應(yīng)激標(biāo)記基因產(chǎn)物的水平或功能活性相比至少有10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、卯％、92%、94%、96%、97%、98%或99%，或甚至至少約99.5%、99.9%、99.95%、99.99%、99.995%或99.999%,或甚至至少約100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%的差異時(shí)，可作出這種診斷。代表性應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)水平的示范性升高或降低見表6。相應(yīng)的基因產(chǎn)物通常選自生物學(xué)樣品中存在的同一基因產(chǎn)物、含有等位變體或剪接變體的變體基因(例如，同源或直向同源基因)所表達(dá)的基因產(chǎn)物或它們的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，該方法包括檢測(cè)至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30種應(yīng)激標(biāo)記基因的各表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。生物學(xué)樣品一般含有血液，特別是外周血，或其組分或提取物。生物學(xué)樣品通常含有血細(xì)胞，例如成熟、不成熟和發(fā)育的白細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、腔胞、血細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞，或這些細(xì)胞的組分(例如，核酸或蛋白質(zhì)部分)。在特定的實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品含有的白細(xì)胞，包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)。7.1核酸診斷方法可按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，1989，同上；Ausubel等，1994，同上)從生物學(xué)樣品所含細(xì)胞中分離核酸用于多核苷酸試驗(yàn)。所述核酸一般是分級(jí)的(例如，polyA+RNA)或全細(xì)胞RNA。當(dāng)將RNA作為檢測(cè)對(duì)象時(shí)，需要將RNA轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNA。在一些實(shí)施方案中，采用模板依賴性核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增該核酸?？刹捎迷S多模板依賴性方法來擴(kuò)增某給定模板樣品中存在的應(yīng)激標(biāo)記序列。示范性核酸擴(kuò)增技術(shù)是詳述于美國專利號(hào)4,683,195;4,683,202和4,800,159;Ausubel等(同上)和Innis等，(《PCR方法》(PCRProtocols),AcademicPress,Inc.,SanDiegoCalif.，1990)中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(稱為PCR)。簡(jiǎn)言之，在PCR中，制備與該標(biāo)記序列的相對(duì)互補(bǔ)鏈上區(qū)域互補(bǔ)的兩條引物序列。向反應(yīng)混合物中加入過量的脫氧核苷三磷酸和DNA聚合酶，例如化《聚合酶。如果某樣品中存在同源應(yīng)激標(biāo)記序列，這些引物將與該標(biāo)記(序列)結(jié)合，聚合酶可通過添加核苷酸使該引物沿著標(biāo)記序列延伸。通過升高或降低反應(yīng)混合物的溫度，延伸的引物可與標(biāo)記(序列)解離形成反應(yīng)產(chǎn)物，過量的引物可與標(biāo)記(序列)和反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)合，而反復(fù)進(jìn)行該過程。為定量測(cè)定所擴(kuò)增的mRNA含量，可采用逆轉(zhuǎn)錄酶PCR擴(kuò)增方法。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的方法是熟知的，其描述于Sambrook等，1989,同上。其它逆轉(zhuǎn)錄方法利用熱穩(wěn)定的RNA依賴性DNA聚合酶。WO90/07641描述了這些方法。本領(lǐng)域熟知聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，模板依賴性擴(kuò)增包括實(shí)時(shí)定量測(cè)定轉(zhuǎn)錄物。例如，可采用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)(Higuchi等，1992，萬Zo&c/mo/ogy，10:413-417)定量測(cè)定RNA或DNA。通過測(cè)定PCR反應(yīng)中完成相同數(shù)目擴(kuò)增輪次處于線性范圍內(nèi)的耙DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度，可以測(cè)定原始DNA混合物中特異性靶序列的相對(duì)濃度。如果DNA混合物是從分離自不同組織或細(xì)胞的RNA合成的cDNA，則可測(cè)定產(chǎn)生該靶序列的各組織或細(xì)胞的特異性mRNA的相對(duì)豐度。PCR產(chǎn)物的濃度與mRNA相對(duì)豐度之間的這種直接正比例關(guān)系只在PCR反應(yīng)的線性范圍內(nèi)才正確立。可通過反應(yīng)混合物中試劑的利用率測(cè)定該曲線平臺(tái)部分靶DNA的終濃度，該終濃度獨(dú)立于該靶DNA的原始濃度。另一擴(kuò)增方法是EPONo.320308所公開的連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)("LCR")。在LCR中，制備兩對(duì)互補(bǔ)探針，在靶序列存在下每對(duì)與靶序列的相反互補(bǔ)鏈結(jié)合從而使它們毗鄰。在連接酶存在下，此兩對(duì)探針可相連形成一個(gè)單位。與PCR中一樣，通過溫度循環(huán)，結(jié)合的連接單位從靶序列上解離，然后用作連接過量探針對(duì)的"靶序列"。美國專利號(hào)4,883,750描述了與LCR相似，使探針對(duì)和耙序列結(jié)合的方法。也可使用PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US87/00880所述的QP復(fù)制酶。在此方法中，在RNA聚合酶存在下將具有與靶序列某區(qū)域相互補(bǔ)區(qū)域的RNA復(fù)制序列加入樣品中。聚合酶可拷貝該復(fù)制序列，然后檢測(cè)。利用限制性核酸內(nèi)切酶和連接酶擴(kuò)增在一條鏈的限制性位點(diǎn)含有核苷酸5'a-硫代-三磷酸的耙分子的恒溫?cái)U(kuò)增方法也可用于擴(kuò)增本發(fā)明的核酸，Walker等，(1992，尸亂胸/.顛t/U^，89:392-396)。鏈置換擴(kuò)增(SDA)是進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增的另一種方法，該方法包括多輪鏈置換與合成，即切口平移。稱為修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RCR)的相似方法包括使幾種探針與擴(kuò)增的整個(gè)靶區(qū)域上退火，然后只對(duì)四種堿基中的兩種進(jìn)行修復(fù)反應(yīng)。為便于檢測(cè)將另兩種堿基作為生物素化衍生物加入。SDA中采用了類似的方法。也可采用循環(huán)探針反應(yīng)(CPR)檢測(cè)特異性靶序列。在CPR中，具有非特異性DNA3'和5，序列與特異性RNA中段序列的探針與樣品中存在的DNA雜交。雜交后，用RNA酶H處理反應(yīng)(混合物)，探針的產(chǎn)物鑒定為消化后釋放的不同產(chǎn)物。使原始模板與另一循環(huán)探針退火，重復(fù)進(jìn)行此反應(yīng)。還可采用英國專利申請(qǐng)?zhí)?202328和PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US89/01025所述的另一種擴(kuò)增方法。在前一申請(qǐng)中，將"修飾的"引物用于PCR-樣的模板和酶依賴性合成中?？捎貌东@部分(例如，生物素)和/或檢測(cè)部分(例如，酶)標(biāo)記修飾這些引物。在后一申請(qǐng)中，將過量的標(biāo)記探針加入樣品。在靶序列存在下，探針結(jié)合并被酶催化切割。切割后，靶序列完整釋放進(jìn)而與過量探針結(jié)合。標(biāo)記探針的切割是靶序列存在的信號(hào)。其它核酸擴(kuò)增方法包括轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)，包括核酸序列擴(kuò)增(NASBA)和3SR(Kwoh等，1989，/VocAto/"6*2，86:1173;Gingeras等，PCT申請(qǐng)WO88/10315)。在NASBA中，可通過臨床樣品的標(biāo)準(zhǔn)苯酚/氯仿提取、熱變性、裂解緩沖液處理和微量離心(minispin)柱分離DNA和RNA或通過氯化胍提取RNA來制備用于擴(kuò)增的核酸。這些擴(kuò)增技術(shù)包括使具有靶特異性序列的引物退火。聚合后，用RNA酶H消化雜交的DNA/RNA雜種，對(duì)雙鏈DNA分子再進(jìn)行熱變性。在兩種情況中，通過加入第二條靶特異性引物然后聚合從而將單鏈DNA制成完全雙鏈。然后用RNA聚合酶，例如T7或SP6多次轉(zhuǎn)錄該雙鏈DNA分子。在恒溫循環(huán)反應(yīng)中，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為單鏈DNA，然后轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA，接著用RNA聚合酶，例如T7或SP6再一次轉(zhuǎn)錄。得到的產(chǎn)物無論是截短的還是完整的均顯示為靶特異性序列。Davey等，EPONo.329822公開了核酸擴(kuò)增方法，包括可用于本發(fā)明的循環(huán)合成單鏈RNA("ssRNA")、ssDNA和雙鏈DNA(dsDNA)。ssRNA是逆轉(zhuǎn)錄酶(RNA依賴性DNA聚合酶)延伸的第一引物寡核苷酸的模板。然后利用核糖核酸酶H(RNA酶H，對(duì)含DNA或RNA的雙螺旋中RNA特異性RNA酶)的作用除去得到的DNA:RNA雙螺旋中的RNA。得到的ssDNA是第二引物的模板，該引物在5'(端)也含有與該模板同源的RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶)的啟動(dòng)子序列。然后用DNA聚合酶(例如大腸桿菌DNA聚合酶I的大"Klenow"片段)延伸此引物，得到雙鏈DNA("dsDNA")分子，其序列與引物之間的與原始RNA的相同，在一末端還含有啟動(dòng)子序列。合適的RNA聚合酶可利用此引物序列制備該DNA的多份RNA拷貝。然后這些拷貝可再進(jìn)入循環(huán)從而導(dǎo)致快速擴(kuò)增。適當(dāng)?shù)剡x擇酶，可恒溫進(jìn)行此擴(kuò)增(方法)而無需在每輪加入酶。由于此方法的循環(huán)性質(zhì)，可選擇DNA或RNA形式的起始序列。Miller等在PCT申請(qǐng)WO89/06700中公開的核酸序列擴(kuò)增方案根據(jù)啟動(dòng)子/引物序列與單鏈靶DNA("ssDNA")雜交，然后轉(zhuǎn)錄該序列的多份RNA拷貝。此方案不是循環(huán)性的，即得到的RNA轉(zhuǎn)錄物不會(huì)產(chǎn)生新模板。其它擴(kuò)增方法包括"RACE"禾B"單邊(one-sided)PCR"(Frohman，M.A.，刊于《PCR方法方法與應(yīng)用指南》(PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications),科學(xué)出版社，N.Y.，1990;Ohara等，1989，亂廳A^/."S丄86:5673-567)。也可采用在含有所產(chǎn)生的"二-寡核苷酸"序列的核酸存在下連接兩條(或多條)寡核苷酸從而擴(kuò)增該"二-寡核苷酸"的方法來擴(kuò)增靶核酸序列。Wu等，(1989，G譜w/oy，4:560)。取決于所用的方式，可采用上述模板依賴性擴(kuò)增或在擴(kuò)增后用第二種已知的核酸直接鑒定樣品中感興趣的應(yīng)激標(biāo)記核酸。然后檢測(cè)所鑒定的產(chǎn)物。在某些應(yīng)用中，可通過目測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)(例如，凝膠溴化乙錠染色)。或者，檢測(cè)可包括通過化學(xué)發(fā)光、放射性標(biāo)記的放射性閃爍照相術(shù)或熒光標(biāo)記物或甚至通過利用電或熱脈沖信號(hào)的系統(tǒng)來間接鑒定產(chǎn)物(AffymaxTechnology;Bellus，1994，JMacromo/.Sc/.尸we，J;7p/.CAem.，A31(l):1355-1376)。在一些實(shí)施方案中，可目測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物或"擴(kuò)增子"以證實(shí)應(yīng)激標(biāo)記序列的擴(kuò)增。一種典型的目測(cè)方法包括用溴化乙錠染色凝膠，在UV光下觀察?；蛘?，如果擴(kuò)增產(chǎn)物整體用放射性或熒光標(biāo)記的核苷酸作了標(biāo)記，可在分離后使這些擴(kuò)增產(chǎn)物曝光x-射線膠片或在合適的激發(fā)光譜下目測(cè)。在一些實(shí)施方案中，可間接進(jìn)行目測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物分離后，使標(biāo)記的核酸探針與擴(kuò)增的應(yīng)激標(biāo)記序列接觸。探針優(yōu)選與生色團(tuán)偶聯(lián)，但也可放射性標(biāo)記?；蛘?，探針可與結(jié)合伴侶，例如抗原結(jié)合分子或生物素偶聯(lián)，而結(jié)合對(duì)的另一成員攜帶可檢測(cè)部分或報(bào)導(dǎo)分子。所涉及的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，可在許多分子方法的標(biāo)準(zhǔn)教科書(例如，參見Sambrook等，1989，同上和Ausubel等，1994，同上)中找到。例如，用生色團(tuán)或放射性標(biāo)記的探針或引物可在擴(kuò)增期間或其后鑒定耙(序列)。在某些實(shí)施方案中，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的印跡技術(shù)定量測(cè)定靶核酸。Sourthern印跡利用DNA作為耙子，而Northern印跡利用RNA作為耙子。各方法可提供不同類型的信息，雖然cDNA印跡在許多方面與上述印跡或RNA相似。簡(jiǎn)言之，探針用于靶向固定于合適的基質(zhì)上，往往是硝酸纖維素膜上的DNA或RNA。不同種類核酸在空間上應(yīng)分開以便分析。這一般通過核酸的凝膠電泳，然后"印跡"到膜上來實(shí)現(xiàn)。隨后，在促進(jìn)變性和再雜交(rehybridisation)的條件下共同培育印跡的靶(序列)與探針(通常是作標(biāo)記的探針)。因?yàn)樘结樤O(shè)計(jì)為可與靶(序列)堿基配對(duì)，探針可在復(fù)性條件下與靶序列的一部分結(jié)合。然后除去未結(jié)合的探針，如上所述進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)/定量測(cè)定后，可將某給定對(duì)象中觀察到的結(jié)果與對(duì)照反應(yīng)(結(jié)果)或正常對(duì)象或無應(yīng)激對(duì)象的統(tǒng)計(jì)學(xué)有效參比組作比較。以此方式可使所檢測(cè)的應(yīng)激標(biāo)記核酸含量與疾病的進(jìn)程或嚴(yán)重性相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明也考慮了如Kristensen等，(Biotechniques，30(2):318-322)所述的基因分型方法和等位基因鑒別方法和技術(shù)，這些方法和技術(shù)包括采用單一核苷酸多態(tài)性分析、高效液相層析、TaqManTM、液相層析和質(zhì)譜。本發(fā)明也考慮了生物芯片技術(shù)，例如Hacia等(1996，Ato"reGw拍'"，14:441-447)和Shoemaker等(1996,AtowwGe""/"，14:450-456)所述的技術(shù)。簡(jiǎn)言之，這些技術(shù)包括快速而精確地分析許多基因的定量測(cè)定方法。通過寡核苷酸給基因加標(biāo)簽或者利用固定的探針陣列，可用生物芯片技術(shù)將靶分子分隔成高密度陣列并根據(jù)雜交篩選這些分子。也參見Pease等(1994，Prac.W加/.JcWU^.，91:5022-5026);Fodor等(1991，Sc/e"ce，251:767-773)。簡(jiǎn)言之，制備應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸的核酸探針，如本文所概述，將其與用于篩選和診斷方法的生物芯片相連?？蓪⑦B接生物芯片的核酸探針設(shè)計(jì)為基本上與特異性表達(dá)的應(yīng)激標(biāo)記核酸，即靶序列(無論是樣品的靶序列還是其它探針序列，例如夾心測(cè)定中的序列)互補(bǔ)，從而使得耙序列與本發(fā)明的探針發(fā)生雜交。此互補(bǔ)性無需完美；靶序列與本發(fā)明的核酸探針之間可存在干擾雜交的一定數(shù)量的堿基對(duì)錯(cuò)配。然而，如果錯(cuò)配的數(shù)量太大以致于即使在最低嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件下也不發(fā)生雜交，則該序列不是靶序列的互補(bǔ)序列。在某些實(shí)施方案中，每條序列可利用多種探針，可利用重疊的探針或針對(duì)靶序列不同部分的探針。艮口，可用兩種、三種、四種以上的探針(優(yōu)選三種)構(gòu)建具體靶(序列)的冗余度。這些探針可以是重疊的(即某些序列相同)或分離的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該知道，可以各種方式將核酸連接于或固定于固體支持物。本文的"固定的"或其語法等價(jià)體表示核酸探針與固體支持物之間的連接或結(jié)合在下述的結(jié)合、洗滌、分析和去除條件下足夠穩(wěn)定。結(jié)合可以是共價(jià)或非共價(jià)的。本文的"非共價(jià)結(jié)合"與其語法等價(jià)體表示靜電性、親水性和疏水性相互作用的一種或多種。非共價(jià)結(jié)合包括分子，例如鏈霉親和素與支持物的共價(jià)連接與生物素化探針與鏈霉親和素的非共價(jià)結(jié)合。本文的"共價(jià)結(jié)合"及其語法等價(jià)體表示兩部分、固體支持物與探針至少通過一根鍵，包括CT鍵、兀鍵和配位鍵相連。探針與固體支持物之間可直接形成共價(jià)鍵，或者可通過交聯(lián)接頭或通過固體支持物或探針或此兩種分子上所含的特異性反應(yīng)活性基團(tuán)來形成共價(jià)鍵。固定化也可包括聯(lián)用共價(jià)和非共價(jià)相互作用?？傊绢I(lǐng)域技術(shù)人員知道可以各種方式使探針與生物芯片相連。如本文所述，可先合成核酸，然后與生物芯片相連，或者可直接在生物芯片上合成。生物芯片包含合適的固體或半固體基板或固體支持物。"基板"或"固體支持物"表示可經(jīng)修飾而含有適合與核酸探針相連或結(jié)合的多個(gè)不連續(xù)位點(diǎn)并適用于至少一種檢測(cè)方法的任何材料。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可用的基板很多，包括但不限于玻璃與改性或功能化玻璃，塑料(丙烯酸、聚苯乙烯與苯乙烯和其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonTM等)，多糖，尼龍或硝酸纖維素，樹脂，二氧化硅或含硅與修飾的硅、碳、金屬、無機(jī)玻璃、塑料的二氧化硅材料等?？傊?，這些基板可用光學(xué)方法檢測(cè)并且不帶熒光。所述基板一般是平的，雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員知道也可利用其它構(gòu)型的基板。例如，為對(duì)流過的樣品進(jìn)行分析而盡可能降低樣品體積，可將探針置于試管的內(nèi)表面。類似地，所述基板可以是可彎曲的，例如可彎曲的泡沬塑料，包括特定塑料制成的閉孔泡沫塑料。在某些實(shí)施方案中，本領(lǐng)域己知可在基板上合成寡核苷酸探針。例如，利用光聚合化合物和技術(shù)的光活化技術(shù)。在一示范性例子中，采用熟知的光版印刷技術(shù)，例如WO95/25116;稀95/35505;美國專利號(hào)5,700,637和5,445,934及其引用的參考文獻(xiàn)中所述的技術(shù)原位合成核酸；這些連接方法構(gòu)成AffymetrixGeneChipTM技術(shù)的基礎(chǔ)。在一示范性生物芯片分析的例子中，使生物芯片上的寡核苷酸探針在有助于特異性雜交的條件下與懷疑含有一種或多種應(yīng)激多核苷酸的核酸樣品接觸。可從生物材料的懸液中制備樣品的DNA或RNA提取物(無論單鏈或雙鏈)，或者研碎生物材料，或者按照細(xì)胞裂解步驟制備，所述步驟包括但不限于用SDS(或其它洗滌劑)、滲透壓沖擊、異硫氰酸胍和溶菌酶處理進(jìn)行裂解?？捎糜诒景l(fā)明方法的合適DNA包括cDNA?？刹捎枚喾N常用方法之一制備這種DNA，例如見Ausubel等，1994，同上；和Sambrook等，1989，同上所述?？捎糜诒景l(fā)明方法的合適RNA包括信使RNA、DNA轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)RNA(cRNA)或基因組RNA或次基因組RNA。可采用標(biāo)準(zhǔn)方法制備這種RNA,例如Ausubd等，1994，同上；和Sambrook等，1989，同上所述?？赏ㄟ^，例如超聲波處理或用限制性核酸內(nèi)切酶處理使cDNA片段化。優(yōu)選使cDNA片段化從而使得到的DNA片段長于固定的寡核苷酸探針，但足夠小而可在合適的雜交條件下快速接觸固定的探針。或者，可采用上述合適的核苷酸擴(kuò)增技術(shù)來選擇并擴(kuò)增cDNA片段，這涉及利用合適的隨機(jī)或特異性引物。通常作可檢測(cè)性標(biāo)記靶應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸從而可測(cè)定它們與各探針的雜交。通常用報(bào)導(dǎo)分子可檢測(cè)性標(biāo)記靶多核苷酸，該報(bào)導(dǎo)分子的示范性例子包括色原、催化劑、酶、熒光染料、化學(xué)發(fā)光分子、生物發(fā)光分子、鑭系離子(例如，Eu3勺、放射性同位素和直接可見標(biāo)記物。對(duì)于直接可見標(biāo)記物，可利用膠體金屬顆?；蚍墙饘兕w粒、染料顆粒、酶或底物、有機(jī)聚合物、乳膠顆粒、脂質(zhì)體或含有信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的其它載體等。此類型的示范性標(biāo)記物包括大膠體，例如金屬膠體，如金、硒、銀、錫和鈦氧化物膠體。在一些將酶用作直接可見標(biāo)記物的實(shí)施方案中，將生物素化的堿基摻入靶多核苷酸中。通過與鏈霉親和素-報(bào)導(dǎo)分子溫育來檢測(cè)雜交。合適的熒光染料包括但不限于異硫氰酸熒光素(FITC)、異硫氰酸四甲基羅丹明(TRITC)、R-藻紅蛋白(RPE)和得克薩斯紅(TexasRed)。其它示范性熒光染料包括Dower等(國際公布WO93/06121)中所討論的。熒光染料也可參考美國專利5,573,909(Singer等)；5,326,692(Brinkley等)?；蛘撸瑹晒馊玖峡蓞⒖济绹鴮＠?hào)5,227,487;5,274,113;5,405,975;5,433,896;5,442,045;5,451,663;5,453,517;5,459,276;5,516,864;5,648,270和5,723,218中所述?？少彽玫臒晒鈽?biāo)記物包括，例如熒光素亞磷酰胺，如Fluoreprime(Pharmacia)、FluorediteTM(Millipore)禾卩FAM(AppliedBiosystemsInternational)。放射性報(bào)導(dǎo)分子包括，例如可通過X-射線或磷酸成像(phosphoimager)技術(shù)檢測(cè)的32p。可在適合于寡核苷酸探針與測(cè)試核酸(包括DNA或RNA)雜交的條件下進(jìn)行雜交形成步驟。就此而言，可參考例如《核酸雜交，一種實(shí)用方法》(NUCLEICACIDHYBRIDIZATION,APRACTICALAPPROACH),(Homes和Higgins編)，(IRLpress,WashingtonD.C.，1985)?？傊s交是否發(fā)生受寡核苷酸探針和所測(cè)試寡核苷酸序列的長度、pH、溫度、一價(jià)和二價(jià)陽離子的濃度、雜交形成區(qū)中G和C核苷酸的比例、介質(zhì)粘度和可能存在的變性劑的影響。這些可變因素也影響雜交所需時(shí)間。因此，優(yōu)選的條件取決于具體應(yīng)用。然而，可用常規(guī)方法確定這些經(jīng)驗(yàn)性條件而無需過多實(shí)驗(yàn)。某些優(yōu)選實(shí)施方案采用高度鑒別性雜交條件。例如，可參考Wallace等(1979，A^c/.A^si"，6:3543)，他描述了與含有一個(gè)內(nèi)部堿基對(duì)錯(cuò)配的相似寡核苷酸探針作比較，可區(qū)別與靶序列完美匹配和完全同源的11-17個(gè)堿基長的寡核苷酸探針的雜交條件。也可參考Wood等(1985，iVoc.Ato/.JcW.Sd.t/&4，82:1585)，他描述了利用3M氯化四甲銨使11-20個(gè)堿基長的寡核苷酸雜交條件，其中雜交物的解鏈溫度只取決于寡核苷酸探針的長度，而無論其GC含量。此外，Drmanac等(同上)描述了6-10個(gè)核苷酸長的寡聚物的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件，利用核苷酸類似物，例如"鎖定核酸"不難獲得相似的條件(Christensen等，2001，BiochemJ，354:481-4)。雜交反應(yīng)一般可在有雜交緩沖液存在下進(jìn)行，所述緩沖液任選含有雜交優(yōu)化試劑，例如穩(wěn)定劑(isostabilisingagent)、變性劑和/或復(fù)性加速劑。穩(wěn)定劑的例子包括但不限于甜菜堿和低級(jí)四烷基銨鹽。變性劑是通過干擾雙鏈核酸堿基之間的氫鍵或核酸分子的水合作用來降低雙鏈核酸分子解鏈溫度的組合物。變性劑包括但不限于甲酰胺、甲醛、二甲基亞砜、四乙基乙酸酯(tetraethylacetate)、脲、異硫氰酸胍(guanidiumisothiocyanate)、甘油和離液鹽。雜交加速劑包括核內(nèi)不均一核糖蛋白(hnRP)Al和陽離子洗滌劑，如十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)和十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)、聚賴氨酸、精胺、亞精胺、單鏈結(jié)合蛋白(SSB)、噬菌體T4基因32蛋白和乙酸銨與乙醇的混合物。雜交緩沖液可含有濃度為約0.005-約50nM、優(yōu)選約0.5-5nM、更優(yōu)選約1-2nM的耙多核苷酸。使含有耙應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸的雜交混合物與探針陣列接觸并在室溫培育適當(dāng)時(shí)間以使靶多核苷酸中的靶序列與任何互補(bǔ)探針雜交。接觸可發(fā)生在任何合適的容器中，例如設(shè)計(jì)用于盛放其上連接有探針的固體支持物的碟或小室。培育溫度通常為核酸雜交所用的溫度，例如約20-約75°C、如約25°C、約30。C、約35。C、約40。C、約45。C、約50°C、約55°C、約60。C，或約65。C。長度超過14個(gè)核苷酸的探針優(yōu)選20-5(TC。對(duì)較短的探針而言，優(yōu)選較低溫度。將靶多核苷酸樣品與探針培育足夠時(shí)間使靶多核苷酸中的靶序列與任何互補(bǔ)探針之間達(dá)到所需雜交水平。例如，可在約45'C+A10t:在甲酰胺中雜交1-2天。雜交物形成步驟后，用含有與雜交步驟所用相同濃度的雜交優(yōu)化劑的雜交緩沖液洗滌探針以除去任何未結(jié)合的核酸。此洗滌步驟只留下結(jié)合的靶多核苷酸。然后可檢測(cè)探針以鑒定哪種探針與靶多核苷酸雜交。然后可檢測(cè)雜交反應(yīng)以確定哪種探針與相應(yīng)的靶序列雜交。取決于和靶多核苷酸連接的報(bào)導(dǎo)分子的性質(zhì)，可通過以下方式用儀器檢測(cè)信號(hào)用光照射熒光標(biāo)記物，用熒光計(jì)檢測(cè)熒光；提供酶系統(tǒng)以產(chǎn)生可用分光光度計(jì)檢測(cè)的顏色-,或者利用光反射儀檢測(cè)染料顆?；蛴猩哪z體金屬顆?；蚍墙饘兕w粒；利用放射性標(biāo)記物或化學(xué)發(fā)光分子時(shí)采用輻射計(jì)數(shù)器或放射自顯影術(shù)。因此，檢測(cè)裝置應(yīng)適用于檢測(cè)或掃描標(biāo)記物相關(guān)的光，所述光可包括熒光、冷光、聚焦光束或激光。此時(shí)，可用電荷耦合器件(CCD)或光龜池來掃描微陣列中各位置探針:靶多核苷酸雜交物發(fā)射的光并直接在數(shù)字計(jì)算機(jī)上記錄數(shù)據(jù)。在一些情況中，無需檢測(cè)電子信號(hào)。例如，在酶促產(chǎn)生與核酸陣列模式相關(guān)的顏色斑點(diǎn)情況中，目測(cè)該陣列就可解釋陣列上的模式。在核酸陣列的情況中，檢測(cè)裝置優(yōu)選與模式識(shí)別軟件相連從而將陣列的信號(hào)模式轉(zhuǎn)化為普通語言遺傳分布模式。在某些實(shí)施方案中，不同應(yīng)激標(biāo)記基因產(chǎn)物的特異性寡核苷酸探針采取核酸陣列形式，利用"芯片閱讀器"檢測(cè)陣列上報(bào)導(dǎo)分子所產(chǎn)生的信號(hào)?？刹捎?芯片閱讀器"的檢測(cè)系統(tǒng)如Pimmg等(美國專利號(hào)5,143,854)所述。芯片閱讀器通常也包括一些信號(hào)加工過程來確定某具體陣列位置或元件處的信號(hào)是真陽性或者可能是假信號(hào)。示范性芯片閱讀器例如Fodor等(美國專利號(hào)5，925，525)所述?；蛘?，當(dāng)陣列是由各種可尋址型標(biāo)記的微珠混合物制成時(shí)，可采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)該反應(yīng)。7.2蛋白質(zhì)診斷與本發(fā)明一致的是，存在異常濃度的應(yīng)激標(biāo)記蛋白質(zhì)表明存在應(yīng)激狀態(tài)、及其程度或階段或有發(fā)生應(yīng)激后遺癥的風(fēng)險(xiǎn)?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的任何合適方法檢驗(yàn)生物學(xué)樣品中應(yīng)激標(biāo)記蛋白質(zhì)的水平。例如，當(dāng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白質(zhì)是酶時(shí)，可根據(jù)其催化活性或根據(jù)樣品所含該蛋白質(zhì)分子數(shù)來定量測(cè)定該蛋白質(zhì)?？刹捎每贵w技術(shù)，例如免疫組織學(xué)和免疫組織化學(xué)方法來檢測(cè)組織樣品中感興趣蛋白質(zhì)的水平。例如，用一抗(多克隆或單克隆)提供特異性識(shí)別，用第二檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)一抗的存在(或結(jié)合)情況?？蓪⒖蓹z測(cè)標(biāo)記物，例如熒光標(biāo)記物、放射性標(biāo)記物或能產(chǎn)生可定量測(cè)定(如有色的)的產(chǎn)物的酶(如，堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶)與二抗相偶聯(lián)。在另一合適的方法中，可檢測(cè)性標(biāo)記一抗本身。因此可對(duì)組織切片作免疫組織學(xué)標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，從生物學(xué)樣品(例如，組織、細(xì)胞)中制備分析用蛋白提取物?？刹捎贸Ｒ?guī)免疫印跡方法(Jalkanen等，1985，丄C"/.腸/.,101:976-985;Jalkanen等，1987，/Ce//.5z'o/.，105:3087-3096)經(jīng)western-印跡或斑點(diǎn)/狹線實(shí)驗(yàn)(分析)這種提取物(例如，洗滌劑提取物)中感興趣蛋白質(zhì)的水平。其它有用的抗體方法包括免疫測(cè)定，例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和放射免疫測(cè)定(RIA)。例如，蛋白質(zhì)特異性單克隆抗體可用作免疫吸附劑與酶標(biāo)記探針來檢測(cè)和定量測(cè)定感興趣的應(yīng)激標(biāo)記蛋白質(zhì)?？刹捎镁€性回歸計(jì)算機(jī)算法(參見'Lacobilli等，1988，5reaWCa"cerie"arc/zam/7Vea加ew"11:19-30)，參考標(biāo)準(zhǔn)制劑中的含量來計(jì)算樣品中這種蛋白質(zhì)的含量。其它實(shí)施方案可用針對(duì)感興趣蛋白質(zhì)的兩種不同單克隆抗體，一種作為免疫吸附劑，另一種作為酶標(biāo)記探針。此外，蛋白質(zhì)捕獲陣列領(lǐng)域的最新進(jìn)展使得能同時(shí)檢測(cè)和/或定量測(cè)定大量蛋白質(zhì)。例如，濾膜上的低密度蛋白質(zhì)陣列，如通用蛋白質(zhì)陣列系統(tǒng)(Ge，2000，A^c/w'cJc/&，28(2):e3)釆用標(biāo)準(zhǔn)ELISA技術(shù)和掃描電荷耦聯(lián)器件(CCD)檢測(cè)器拍攝組成陣列的抗原圖像。也開發(fā)了能同時(shí)檢測(cè)臨床分析物的免疫傳感器陣列。目前已能用蛋白質(zhì)陣列來分析體液中，例如健康或患病對(duì)象以及藥物治療前后對(duì)象血清中的蛋白質(zhì)表達(dá)分布模式。蛋白質(zhì)捕獲陣列一般包含多種蛋白質(zhì)捕獲劑，它們各自確定了該陣列上空間位置不同的元件。蛋白質(zhì)捕獲劑可以是能結(jié)合蛋白質(zhì)并將其固定在陣列上的蛋白質(zhì)捕獲劑位點(diǎn)的任何分子或分子復(fù)合物。蛋白質(zhì)捕獲劑可以是一種蛋白質(zhì)，其在細(xì)胞中的天然功能是能特異性結(jié)合另一種蛋白質(zhì)，例如抗體或受體。或者，蛋白質(zhì)捕獲劑可以是能特異性結(jié)合某蛋白質(zhì)的部分合成或全合成或重組的蛋白質(zhì)?；蛘撸鞍踪|(zhì)捕獲劑可以是在體外根據(jù)對(duì)特異性靶蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合親和力選自誘變、隨機(jī)或完全隨機(jī)化與合成文庫的蛋白質(zhì)。所用的選擇方法任選可以是本領(lǐng)域已知的展示方法，例如核糖體展示或噬菌體展示方法?；蛘?，經(jīng)體外選擇得到的蛋白質(zhì)捕獲劑可以是能特異性結(jié)合靶蛋白質(zhì)的DNA或RNA適體(參見，例如Potyrailo等，1998,爿"a/.C/zem.，70:3419-3425;Cohen等，1998,iVoc.Ato/.爿cadScZ.f/S^，95:14272-14277;Fukuda等，1997，7Vwc/dc爿c/^5y^.&廣，37:237-238;得自SomaLogic)。例如，用Selex方法從寡核苷酸文庫中選擇適體，可通過共價(jià)連接，例如摻入溴化脫氧尿苷和紫外光活化的交聯(lián)(光適體)來提高它們與蛋白質(zhì)的相互作用。適體的優(yōu)點(diǎn)在于易通過自動(dòng)寡核苷酸合成來制備和DNA的穩(wěn)定性和強(qiáng)度優(yōu)良；可采用通用熒光蛋白質(zhì)染色技術(shù)來檢測(cè)結(jié)合情況?；蛘撸w外選擇的蛋白質(zhì)捕獲劑可以是多肽(例如，抗原)(參見，例如Roberts和Szostak，1997，iVoc.A^/.Sc/.OS^，94:12297-12302)。捕獲分子的另一種陣列是通過"分子印刷"技術(shù)制成的陣列，其中的肽(例如，來自蛋白質(zhì)的C-末端區(qū)域)用作模板在可聚合基質(zhì)中產(chǎn)生結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的序列特異性空隙；然后這些空隙能特異性捕獲具有合適的一級(jí)氨基酸序列的(變性的)蛋白質(zhì)(例如，得自ProteinPrintTM和AspiraBiosystems)。示范性蛋白質(zhì)捕獲陣列包括通常稱為抗體陣列的含有空間上可尋址的抗原結(jié)合分子的陣列，該陣列有助于大規(guī)模同時(shí)分析眾多蛋白質(zhì)來確定蛋白質(zhì)組或蛋白質(zhì)亞組?？贵w陣列顯示具有所需的特異性性質(zhì)和可接受的背景，一些陣列可購得(例如，BDBiosciences,Clontech，BioRad和Sigma)。制備抗體陣列的各種方法已有報(bào)道(參見，例如Lopez等，2003，J.C/zramaMgr.S，787:19-27;Cahill，2000，7>e"A/"5/Wec/mo/og;;，7:47-51;美國專利申請(qǐng)公布2002/0055186;美國專利申請(qǐng)公布2003/0003599;PCT公布WO03/062444;PCT公布WO03/077851;PCT公布WO02/59601;PCT公布WO02/39120;PCT公布WO01/79849;PCT公布WO99/39210)。這些陣列的抗原結(jié)合分子至少可識(shí)別某細(xì)胞或細(xì)胞群所表達(dá)蛋白質(zhì)的亞組，其示范性例子包括生長因子受體、激素受體、神經(jīng)遞質(zhì)受體、兒茶酚胺受體、氨基酸衍生物受體、細(xì)胞因子受體、胞外基質(zhì)受體、抗體、凝集素、細(xì)胞因子、絲抑蛋白、蛋白酶、激酶、磷酸酶、ras-樣GTP酶、水解酶、類固醇激素受體、轉(zhuǎn)錄因子、熱激轉(zhuǎn)錄因子、DNA-結(jié)合蛋白、鋅指蛋白、亮氨酸拉鏈蛋白、同源域蛋白、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑和效應(yīng)物、凋亡相關(guān)因子、DNA合成因子、DNA修復(fù)因子、DNA重組因子.、細(xì)胞表面抗原、丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶和HIV蛋白酶。在噬菌體展示或核糖體展示文庫(例如，得自CambridgeAntibodyTechnology,Biolnvent,Affitech和Biosite)中選擇后可通過常規(guī)免疫方法(例如，多克隆血清和雜交瘤)，或作為通常在大腸桿菌中表達(dá)的重組片段制備抗體陣列的抗原結(jié)合分子?；蛘?，可將含非共價(jià)締合的VH和VL結(jié)構(gòu)域的"混合體(combibody)"制備為產(chǎn)生雙抗體細(xì)菌克隆(例如，得自Domantis)組合物所產(chǎn)生的矩陣形式。用作蛋白質(zhì)捕獲劑的示范性抗原結(jié)合分子包括單克隆抗體、多克隆抗體、Fv、Fab、Fab'和F(ab')2免疫球蛋白片段、合成的穩(wěn)定Fv片段(如單鏈Fv片段(scFv)、二硫鍵穩(wěn)定的Fv片段(dsFv))、單可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(dAbs)小抗體(minibody)、混合體和多價(jià)抗體(如雙抗體和多-scFv)、camelids的單種結(jié)構(gòu)域或工程改造的人等價(jià)抗體?？臻g位置不同的各蛋白質(zhì)捕獲劑通常連接在一般是平的或有起伏的支持物表面。常規(guī)物理支持物包括載玻片、硅、微孔、硝酸纖維素或PVDF膜與磁性微珠和其它微珠。雖然廣泛采用將蛋白質(zhì)微滴遞送到平面上，但有關(guān)的其它構(gòu)造包括基于微流體學(xué)進(jìn)展開發(fā)的CD離心裝置(例如，得自Gyros)和專門化的芯片設(shè)計(jì)，例如平面中工程改造的微通道(例如，TheLivingChip,得自Biotrove)和硅表面的微小3D柱(例如，得自Zyomyx)。也可將懸浮液中的顆粒用作陣列的基礎(chǔ)，只要它們有身份編碼；這些系統(tǒng)包括用顏色編碼的微珠(例如，得自Luminex、Bio-Rad禾nNanomicsBiosystems)、半導(dǎo)體納米晶體(例如，Qdots,得自QuantumDots)、棒形編碼珠(UltraPlex,得自Smartbeads)和多金屬微桿(NanobarcodesTM顆粒，得自Surromed)。也可將這些珠在半導(dǎo)體芯片上組裝成平面陣列(例如，得自LEAPStechnology和BioArraySolutions)。當(dāng)用顆粒時(shí)，各蛋白質(zhì)捕獲劑通常連接于各顆粒以提供空間確定位置或分開的陣列。然后分別(但同時(shí))以隔離方式，例如在微滴定板的孔中或不同試管中檢測(cè)這些顆粒。在操作中，將蛋白質(zhì)樣品任選片段化形成肽片段(參見，例如美國專利申請(qǐng)公布2002/0055186)，在適合于蛋白質(zhì)或肽結(jié)合的條件下遞送到蛋白質(zhì)捕獲陣列；洗滌該陣列將樣品中未結(jié)合或非特異性結(jié)合的組分從陣列上洗去。然而，利用合適的檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)存在的與陣列上各元件相結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽，或含量。與陣列上某元件相結(jié)合的蛋白質(zhì)含量可相對(duì)于與該陣列第二元件相結(jié)合的第二蛋白質(zhì)的含量來測(cè)定。在某些實(shí)施方案中，樣品中第二蛋白質(zhì)的含量己知或已知是不變的。為分析兩種細(xì)胞或細(xì)胞群之間蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，將第一種細(xì)胞或細(xì)胞群的蛋白質(zhì)樣品在適合于蛋白質(zhì)結(jié)合的條件下遞送到該陣列。將第二種細(xì)胞或細(xì)胞群的蛋白質(zhì)樣品以類似方式遞送到與第一陣列相同的第二陣列。然后洗滌兩陣列將樣品中未結(jié)合或非特異性結(jié)合的組分從陣列上洗去。最后，將維持與第一陣列元件相結(jié)合的蛋白質(zhì)含量和維持與第二陣列的相應(yīng)元件相結(jié)合的蛋白質(zhì)含量作比較。為測(cè)定兩種細(xì)胞或細(xì)胞群之間蛋白質(zhì)表達(dá)模式的差異，將與第一陣列各元件相結(jié)合的蛋白質(zhì)含量從與第二陣列的相應(yīng)元件相結(jié)合的蛋白質(zhì)含量中扣除。在一示范性例子中，可利用熒光標(biāo)記檢測(cè)與陣列結(jié)合的蛋白質(zhì)。將與解讀DNA微陣列所用相同的儀器應(yīng)用于蛋白質(zhì)捕獲陣列。為差別展示，可用得自兩種不同狀態(tài)細(xì)胞的蛋白質(zhì)作熒光標(biāo)記后檢測(cè)捕獲陣列(例如，抗體陣列)，兩種狀態(tài)中細(xì)胞裂解物用不同熒光團(tuán)(例如，Cy-3和Cy-5)標(biāo)記并混合，從而可將顏色作為靶分子豐度改變的讀數(shù)。通過酪酰胺信號(hào)擴(kuò)增(TSA)(例如，得自PerkinElmerLifesciences)可將熒光讀數(shù)靈敏度提高10-100倍。平面波導(dǎo)技術(shù)(例如，得自Zeptosens)能迸行超靈敏的熒光檢測(cè)，其另一優(yōu)點(diǎn)是無需洗滌。利用藻紅蛋白作標(biāo)記物(例如，得自Luminex)或利用半導(dǎo)體納米晶體(例如，得自QuantumDot)性能的懸浮珠和顆粒也能實(shí)現(xiàn)高靈敏度。已采納熒光共振能量轉(zhuǎn)移來檢測(cè)可用于陣列的未標(biāo)記配體的結(jié)合(例如，得自Affibody)。已開發(fā)了幾種其它讀出裝置，包括以下方法的改進(jìn)裝置表面等離振子共振(例如，得自HTSBiosystems和IntrinsicBioprobes)、滾動(dòng)循環(huán)DNA擴(kuò)增(例如，得自MolecularStaging)、質(zhì)i普(例如，得自SenseProteomic，Ciphergen,Intrinsic和Bioprobes)、共振光散射(例如，得自GeniconSciences)和原子力顯微鏡(例如，得自BioForceLaboratories)。NextGen禾口PerkinElmerLifeSciences共同開發(fā)了用于樣品與載玻片上的陣列自動(dòng)培育和洗滌的微流體系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案中，用于檢測(cè)應(yīng)激標(biāo)記表達(dá)產(chǎn)物的技術(shù)包括內(nèi)部或外部標(biāo)準(zhǔn)品來定量或半定量測(cè)定那些產(chǎn)物，從而能有效地比較生物學(xué)樣品中這些表達(dá)產(chǎn)物與參比樣品中相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。技術(shù)人員采用標(biāo)準(zhǔn)方法可以確定這種標(biāo)準(zhǔn)品。具體實(shí)施例中測(cè)定了各表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性的絕對(duì)值。在特定的實(shí)施方案中，可利用如國際公布號(hào)WO02/090579和2003年11月14日提交的待批PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/AU03/01517中所述的，包括至少一個(gè)與基站相耦聯(lián)的終端站的系統(tǒng)來執(zhí)行此診斷方法?；就ǔＥc一個(gè)或多個(gè)數(shù)據(jù)庫相耦聯(lián)，這些數(shù)據(jù)庫含有來自大量個(gè)體的代表應(yīng)激標(biāo)記表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性的預(yù)定數(shù)據(jù)以及代表收集這些預(yù)定數(shù)據(jù)時(shí)這些個(gè)體實(shí)際狀態(tài)征候令(例如，應(yīng)激存在與否、其程度、階段或發(fā)生應(yīng)激后遺癥的風(fēng)險(xiǎn))。在操作中，基站一般通過通信網(wǎng)絡(luò)從終端站接受數(shù)據(jù)并將所述數(shù)據(jù)與存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫中的預(yù)定數(shù)據(jù)作比較，所述數(shù)據(jù)代表對(duì)應(yīng)于取自測(cè)試對(duì)象的生物學(xué)樣品中至少一種表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)或標(biāo)準(zhǔn)化水平或功能活性。將該對(duì)象的數(shù)據(jù)與預(yù)定數(shù)據(jù)作比較使基站能根據(jù)比較結(jié)果確定該對(duì)象的狀態(tài)。因此，基站試圖鑒定具有相似參數(shù)值的個(gè)體與測(cè)試對(duì)象，一旦根據(jù)該鑒定(結(jié)果)而確定了狀態(tài)，基站會(huì)將診斷指令送至終端站。7.3試劑盒可將檢測(cè)與定量測(cè)定應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物所需的所有必需材料和試劑一起組裝在試劑盒中。這些試劑盒也任選裝有檢測(cè)標(biāo)記物的合適試劑、陽性和陰性對(duì)照、洗滌溶液、印跡膜、微滴定板稀釋緩沖液等。例如，核酸檢測(cè)試劑盒可裝有(i)應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸(可用作陽性對(duì)照)，(ii)能與某種應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸特異性雜交的引物或探針。也可裝有適用于擴(kuò)增核酸的酶，包括各種聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶，Taq，S叫uenaseTMDNA連接酶等，取決于所采用的核酸擴(kuò)增技術(shù))，脫氧核苷酸和緩沖液以提供擴(kuò)增所需的反應(yīng)混合物。這種試劑盒一般以合適的方式裝有各種試劑和酶以及各種引物或探針的不同容器?；蛘?，蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒可裝有(i)應(yīng)激標(biāo)記多肽(可用作陽性對(duì)照)，(ii)能與某應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸發(fā)生免疫相互作用的抗原結(jié)合分子。該試劑盒的特征也在于裝有進(jìn)行本文所述試驗(yàn)的各種裝置和試劑；和/或印制的用該試劑盒定量測(cè)定應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)的使用說明書。7.4監(jiān)測(cè)免疫功能本發(fā)明也提供通過檢測(cè)某對(duì)象的一種或多種應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物水平或功能活性來監(jiān)測(cè)免疫功能的方法。當(dāng)所檢測(cè)的水平或功能活性與取自一位或多位正常對(duì)象或一位或多位未處于應(yīng)激狀態(tài)下的對(duì)象的參比樣品中相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)到的水平或功能活性相同或相似時(shí)，這一般表明該對(duì)象未處于應(yīng)激狀態(tài)下，具有正常的免疫功能。相反，當(dāng)所檢測(cè)的水平或功能活性與相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)到的水平或功能活性不同時(shí)，這一般表明該對(duì)象處于應(yīng)激狀態(tài)下，因而免疫功能降低(或免疫抑制)。正常免疫功能對(duì)有效抵御疾病和天然攻擊的最后保護(hù)很重要。此外，免疫功能對(duì)獲得對(duì)疫苗接種的有效免疫應(yīng)答很關(guān)鍵，就此而言，所鑒定的應(yīng)激標(biāo)記也可用作監(jiān)測(cè)個(gè)體的免疫系統(tǒng)何時(shí)接種疫苗方能產(chǎn)生導(dǎo)致最佳保護(hù)水平的免疫應(yīng)答。例如，就競(jìng)賽動(dòng)物，如人類運(yùn)動(dòng)員和賽馬而言，以此方式監(jiān)測(cè)免疫系統(tǒng)能使競(jìng)賽動(dòng)物(performanceanimal)或其教練降低可能導(dǎo)致對(duì)疫苗接種產(chǎn)生不適當(dāng)或非保護(hù)性免疫應(yīng)答的潛在應(yīng)激狀態(tài)。如利用所鑒定的應(yīng)激標(biāo)記測(cè)定的那樣，當(dāng)競(jìng)賽動(dòng)物的免疫系統(tǒng)恢復(fù)后，可進(jìn)行疫苗接種。所鑒定的應(yīng)激標(biāo)記也可用于評(píng)估免疫系統(tǒng)對(duì)疫苗制劑的應(yīng)答。對(duì)疫苗接種產(chǎn)生不適當(dāng)免疫應(yīng)答時(shí)，可決定再次接種，或改變接種方案，或延遲接種方案直至除去了潛在的應(yīng)激狀態(tài)(影響免疫功能的)和動(dòng)物的免疫系統(tǒng)恢復(fù)。例如，已知已有可用于馬皰疹病毒的疫苗制劑。它在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣為使用，特別是用于妊娠母馬從而可通過傳遞乳汁抗體(初乳)賦予幼駒一定的保護(hù)作用。妊娠和產(chǎn)后時(shí)期是高應(yīng)激和免疫調(diào)節(jié)時(shí)期?？衫盟b定的應(yīng)激標(biāo)記監(jiān)測(cè)這些時(shí)期的免疫功能來安排疫苗接種時(shí)間從而產(chǎn)生合適的與保護(hù)性疫苗應(yīng)答?；蛘?，可利用應(yīng)激標(biāo)記水平根據(jù)監(jiān)測(cè)到的對(duì)疫苗接種的免疫應(yīng)答來修改疫苗接種方案。8.治療或預(yù)防方法在對(duì)象有發(fā)生應(yīng)激后遺癥風(fēng)險(xiǎn)診斷陽性后，本發(fā)明也可拓展至治療或預(yù)防對(duì)象的應(yīng)激狀態(tài)?？傮w上，治療包括給予診斷陽性對(duì)象有效量藥物或療法以改善癥狀或逆轉(zhuǎn)應(yīng)激的發(fā)生，或降低或消除上述應(yīng)激相關(guān)疾病，或降低對(duì)象發(fā)生應(yīng)激相關(guān)疾病的可能性。目前適用于治療應(yīng)激的藥物包括但不限于美國專利號(hào)6，723，721;6,670,371;6,664,261;6,586,456;6,548,509;6,323,312;6,255,310所述的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子拮抗劑；美國專利申請(qǐng)公布號(hào)20020169152公開的糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑；美國專利號(hào)6,642,209所述的腺苷化合物；美國專利號(hào)6,455,542所述的一氧化氮供體；美國專利號(hào)6,444,700;6,391,332和6,218,420所述的營養(yǎng)組合物；美國專利號(hào)6,416,795公開的草藥提取物；美國專利號(hào)6，087，348公開的NK-1受體拮抗劑；美國專利號(hào)6,077,867所述的脂肪酸組合物；美國專利申請(qǐng)公布號(hào)20040101934公開的酵母菌產(chǎn)生的肽衍生物；和美國專利申請(qǐng)?zhí)?0020183300所述的鋅離子載體?；蛘?，可采用本領(lǐng)域已知的應(yīng)激緩解方法治療對(duì)象，包括例如去除或降低對(duì)象環(huán)境中的應(yīng)激源水平；如美國專利申請(qǐng)公布號(hào)20030233124所述，用電場(chǎng)改變通過細(xì)胞膜的離子流。然而，應(yīng)該知道本發(fā)明包括可用于治療或預(yù)防應(yīng)激的任何藥物或方法，并不限于上述的示范性化合物和制劑。應(yīng)激緩解藥物一般與藥學(xué)上可接受的載體組成藥物(或獸醫(yī)學(xué))組合物以有效量給予來達(dá)到它們所需的目的。給予對(duì)象的活性化合物的劑量應(yīng)在一段時(shí)間內(nèi)足以在對(duì)象中實(shí)現(xiàn)有益應(yīng)答，例如降低或減輕應(yīng)激癥狀。待給予的藥學(xué)活性化合物的用量取決于待治療的對(duì)象，包括其年齡、性別、體重和全身健康狀況。就此而言，所給予的活性化合物的精確用量取決于從業(yè)醫(yī)師的判斷。在確定給予治療或預(yù)防應(yīng)激的活性化合物的有效量過程中，醫(yī)師或獸醫(yī)可評(píng)估應(yīng)激存在相關(guān)癥狀的嚴(yán)重性，包括上述應(yīng)激后遺癥相關(guān)癥狀。在任何情況中，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難確定應(yīng)激緩解藥物的合適劑量與合適的治療方案而無需過多實(shí)驗(yàn)。應(yīng)激緩解藥物可與輔助性治療聯(lián)合給予以降低對(duì)象的異常免疫應(yīng)答。這類輔助性治療的示范性例子包括但不限于除去應(yīng)激源、瑜伽、冥想、針灸、按摩、適度運(yùn)動(dòng)和呼吸鍛煉。為便于理解本發(fā)明和付諸實(shí)施，通過以下非限制性實(shí)施例描述了特別優(yōu)選的實(shí)施方案。實(shí)施例實(shí)施例1鑒定應(yīng)激的特異性診斷基因利用含有馬白細(xì)胞所表達(dá)的幾千種基因的GeneChipsTM(使用方法詳述于下文"基因表達(dá)數(shù)據(jù)的產(chǎn)生")分析取自經(jīng)受48小時(shí)期運(yùn)輸應(yīng)激的20只動(dòng)物的血液樣品。分析這些數(shù)據(jù)(參見下文"鑒定應(yīng)答基因與證明診斷潛力")揭示第0天到第28天特異性基因有差別表達(dá)。利用至少一種，優(yōu)選至少兩種應(yīng)激標(biāo)記基因設(shè)計(jì)的試驗(yàn)可以檢測(cè)樣品中的RNA水平，所述應(yīng)激標(biāo)記基因的代表性序列如下所示SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248。麗與方法采血從馬匹(非激動(dòng)狀態(tài))采血提取高質(zhì)量的RNA或蛋白質(zhì)。收集、保藏、轉(zhuǎn)運(yùn)和分離RNA的合適采血試管包括PAXgeneTM試管(PreAnalytixInc.,Valencia,CA，USA)?；蛘?，可將血液采集入含有設(shè)計(jì)用于保藏核酸的溶液(得自Roche，Ambion，Invitrogen和ABI)的試管中。為測(cè)定蛋白質(zhì)水平，將50ml血液收集入含有4ml4%檸檬酸鈉的試管中防止凝結(jié)。分離白細(xì)胞和血槳，冷凍保藏用于隨后特異性蛋白質(zhì)的分析與檢測(cè)。將PAXgene試管維持于室溫，然后提取RNA。以標(biāo)準(zhǔn)格式記錄臨床體征。提取總RNAQiagenInc(Valencia,CA，USA)的試劑盒裝有用于分離收集在PAXgene血液RNA試管中2.5ml血液的總RNA的試劑和使用說明書。分離從離心沉淀PAXgene血液RNA試管中的核酸開始。用含有蛋白酶K的優(yōu)化緩沖液洗滌、重懸并培育沉淀物以消化蛋白質(zhì)。再離心一次除去殘留的細(xì)胞碎片，將上清液轉(zhuǎn)移至新鮮的微離心管中。加入乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件，將裂解物加到PAXgeneRNA旋轉(zhuǎn)柱上。在簡(jiǎn)單離心期間，RNA選擇性地與硅膠膜結(jié)合，而污染物流出。經(jīng)三次有效洗滌步驟除去殘留的污染物，然后用緩沖液BR5洗脫RNA。提取前要用Agilent生物分析儀和分光光度計(jì)以吸光度260/280比值定量和定性測(cè)定RNA。DNA提取QiagenInc(Valencia,CA，USA)的試劑盒裝有用于分離收集在PAXgene血液RNA試管中8.5ml血液的總DNA的試劑和使用說明書。分離從加入額外的裂解溶液開始然后離心。用含有蛋白酶K的優(yōu)化緩沖液洗滌、重懸并培育沉淀物以消化蛋白質(zhì)。乙醇沉淀DNA，再離心一次沉淀核酸。洗滌除去殘留污染物，然后將DNA重懸于緩沖液BG4中。提取前要用分光光度計(jì)或瓊脂糖凝膠龜泳定量和定性測(cè)定DNA。產(chǎn)生基因表達(dá)數(shù)據(jù)選擇方法可采用各種技術(shù)檢測(cè)組織樣品中的特異性RNA水平。本領(lǐng)域熟知的兩種常規(guī)且易于使用的技術(shù)是采用Affymetrix技術(shù)的GeneChip⑧分析；實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(例如，AppliedBiosystems的TaqMan)。GeneChips⑧通過檢測(cè)與構(gòu)建在硅基板上的短寡核苷酸雜交的標(biāo)記cRNA來定量測(cè)定RNA。該技術(shù)和方法詳見www.affymetrix.com。實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)利用兩種PCR引物、標(biāo)記的探針和熱穩(wěn)定的DNA聚合酶來定量測(cè)定RNA。PCR產(chǎn)物產(chǎn)生時(shí)將一種染料釋放入溶液，檢測(cè)之。內(nèi)部對(duì)照，例如18SRNA探針常用于測(cè)定樣品中總RNA的起始水平。各基因與內(nèi)部對(duì)照分別測(cè)定。該技術(shù)和方法詳見www.appliedbiosytems.com或www.qiagen.comorwww.biorad.com。AppliedBiosystems提供以下服務(wù)即客戶提供DNA序列信息并負(fù)費(fèi)，作為回饋該公司提供對(duì)各基因進(jìn)行RT-PCR所需的全部試劑。GeneChip⑧分析的優(yōu)點(diǎn)在于一次能分析數(shù)千個(gè)基因。然而，該分析花費(fèi)大且進(jìn)行一次試驗(yàn)要3天以上。RT-PCR—般一次只能分析一種基因，但廉價(jià)并且能在一天內(nèi)完成。如果待分析的具體基因數(shù)量少于20，則RT-PCR是可選的基因表達(dá)分析方法。當(dāng)需要同時(shí)分析許多基因時(shí)，GeneChip⑧或其它基因表達(dá)分析技術(shù)(例如Illumina珠陣列)是可選的方法。用于產(chǎn)生和分析GeneChip⑧數(shù)據(jù)與實(shí)時(shí)PCR的方法概述于下文。產(chǎn)生GeneChip⑧數(shù)據(jù)制備cDNA和cRNA以下用于從總RNA制備cDNA和cRNA的方法采用Affymetrix(www.affymetrix.com)提供和推薦的方法。步驟是總共3pg的總RNA用作模板來制備雙鏈cDNA。制備cRNA并用生物素化尿嘧啶(dUTP)作標(biāo)記。純化(clean)生物素作標(biāo)記的cRNA，利用分光光度計(jì)和MOPS凝膠分析定量測(cè)定。將作標(biāo)記的cRNA片段化為300bp大小。利用Agilent"Lab陽on-a-Chip"系統(tǒng)(AgilentTechnologies)測(cè)定RNA含量。雜交、洗滌和染色步驟是制備含有0.05pgL作標(biāo)記和片段化的cRNA、spike-in陽性雜交對(duì)照和Affymetrix寡核苷酸B2、bioB、bioC、bioD和cre的雜交混合物。將終體積(80pL)的雜交混合物加入GeneChipTM藥盒中。將該藥盒置于恒定轉(zhuǎn)速的雜交爐中，16小時(shí)。去除GeneChipTM中的液體并保存。將GeneChipTM置于流體站中。將各GeneChip的實(shí)驗(yàn)條件以.EXP文件記錄。加入合適的溶液后，Affymetrix流體站執(zhí)行所有的洗滌和染色過程。洗滌GeneChip,用鏈霉親和素-藻紅蛋白染料染色，然后用低鹽溶液再次洗滌。洗滌完成后，用激光"激發(fā)"探針陣列上的染料，用Affymetrix掃描儀(Agilent制造)通過CCD照相機(jī)拍攝圖像。掃描和產(chǎn)生數(shù)據(jù)文件掃描儀和MAS5軟件產(chǎn)生一站GeneChipTM的圖像文件，稱為.DAT文件(參見背面的圖)。預(yù)處理.DAT文件后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)的預(yù)處理步驟(在任何統(tǒng)計(jì)學(xué)分析之前)包括.DAT文件的質(zhì)量控制(QC)。產(chǎn)生.CEL文件。測(cè)量和標(biāo)準(zhǔn)化。.DAT文件的質(zhì)量控制.DAT文件是一種圖像。手工檢査這些圖像有人為因素(artifact)(例如，高/低強(qiáng)度斑點(diǎn)，劃痕，高局部性或總背景)。(通過改變產(chǎn)生邊界的強(qiáng)度模式和陣列名稱不難鑒定B2寡核苷酸陣列的雜交性能)。MAS5軟件利用B2寡核苷酸邊界來比對(duì)圖像上的柵格從而可集中和鑒定各方塊的寡核苷酸。利用其它尖頭(spiked)雜交對(duì)照(bioB、bioC、bioD和cre)通過讀取隨信號(hào)值增加，反映它們相對(duì)濃度的"本"基因檢測(cè)呼叫來評(píng)估樣品的雜交效率。(如果.DAT文件具有合適的質(zhì)量，用AffymetrixMAS5軟件將其轉(zhuǎn)化為強(qiáng)度數(shù)據(jù)文件(.CEL文件))。產(chǎn)生.CEL文件用MAS5軟件從.DAT文件產(chǎn)生的.CEL文件包含計(jì)算的該探針組的原始強(qiáng)度。從各細(xì)胞(測(cè)定)值中扣除計(jì)算的背景值得到基因表達(dá)數(shù)據(jù)。為除去陰性強(qiáng)度值，應(yīng)用基于最低2%背景值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的局部噪聲值的噪聲校正組分。將GeneChipTM產(chǎn)生的所有.CEL文件應(yīng)用于特定的質(zhì)量衡量標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)。一些衡量標(biāo)準(zhǔn)由Affymetrix常規(guī)推薦，可從作為GeneChipTM的一部分提供的Affymetrix內(nèi)部對(duì)照測(cè)定。其它衡量標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和包括許多GeneChipTM的處理加工。分析GeneChip⑧數(shù)據(jù)可用于數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的三種示范性方法是AffymetrixMAS5算法。Irizarry的可靠多芯片分析(RobustMulti-chipAnalysis)(RMA)算法(Wzarray等，2002，(印刷中))。可靠多芯片分析保留模型(RobustMulti-chipAnalysisSavedmodel)(RMAS)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道可采用許多其它方法而不會(huì)對(duì)本發(fā)明有實(shí)質(zhì)影響。AffymetrixMAS5算法AffymetrixMAS5軟件利用.CEL文件來標(biāo)準(zhǔn)化或測(cè)量數(shù)據(jù)。將一塊芯片的測(cè)量數(shù)據(jù)與另一芯片的相似測(cè)量數(shù)據(jù)作比較。對(duì).CEL文件應(yīng)用MAS5算法的默認(rèn)"球形定標(biāo)(GlobalScaling)"選項(xiàng)來實(shí)現(xiàn)AffymetrixMAS5標(biāo)準(zhǔn)化。此方法扣除了探針值的分布中心的可靠估計(jì)值，再除以探針可變性的可靠估計(jì)值。這產(chǎn)生了在探針?biāo)骄哂泄餐恢煤土慷鹊囊唤M芯片。通過對(duì)某給定基因的所有探針對(duì)采用可靠求平均方法產(chǎn)生基因表達(dá)指數(shù)。將結(jié)果強(qiáng)制定為非陰性。鑒于在探針?biāo)蕉皇窃诨蛩竭M(jìn)行測(cè)量，那即使標(biāo)準(zhǔn)化后在總體基因表達(dá)水平上也可能存在芯片與芯片的差異。將標(biāo)準(zhǔn)MAS5標(biāo)準(zhǔn)化后，根據(jù)芯片強(qiáng)度中值使各基因值去趨勢(shì)(de-trend)。SP，各基因值根據(jù)芯片強(qiáng)度中值回歸，計(jì)算殘差。取這些殘差作為各基因表達(dá)去趨勢(shì)的估計(jì)值。用AffymetrixMAS5算法計(jì)算芯片強(qiáng)中值度，但量度因子固定為一。RMAS分析除了用chip.cel文件的長期文庫建立探針權(quán)重和耙分位數(shù)(quantile)，和不對(duì)這些具體芯片再重復(fù)計(jì)算外，此方法與RAM方法相同。在探針?biāo)皆俅芜M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。產(chǎn)生實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)在例如http:〃dorakmt.tripod.com/genetics/realtime.html禾卩BustinSA的綜述(2000，J7kfo/五/^/ocnV70/，25:169-193)中可獲得執(zhí)行實(shí)時(shí)PCR的背景信息。TaqManTM引物和探針設(shè)計(jì)指南1.PrimerExpress(ABI)軟件設(shè)計(jì)了解鏈溫度(Tm)為58-60。C的引物和Tm值為l(TC以上的探針。兩種引物的Tm應(yīng)該相同；2.引物應(yīng)長15-30個(gè)堿基；3.G+C含量優(yōu)選30-80%。如果G+C含量較高無法避免，則需要采用高退火和解鏈溫度，用共溶劑，例如甘油、DMSO或7-脫氮雜-dGTP;4.應(yīng)避免成串的相同核苷酸。這對(duì)G而言尤其重要，不可以有4個(gè)以上的G串；5.引物3'末端的最后5個(gè)核苷酸中G和C的總數(shù)應(yīng)不超過2個(gè)(較新版本的該軟件具有自動(dòng)執(zhí)行此功能的選項(xiàng))。這有助于在引物的3'末端引入相對(duì)不穩(wěn)定性從而減少非特異性引發(fā)。引物條件與SYBRGreen試驗(yàn)的相同；6.最大擴(kuò)增子的長度不應(yīng)超過400bp(優(yōu)選50-150個(gè)堿基)。較小的擴(kuò)增子能得到更一致的結(jié)果，因?yàn)镻CR更有效且對(duì)反應(yīng)條件更耐受(長度短的需求與5'核酸酶活性的功能無關(guān))；7.該探針不應(yīng)含有成串的相同核苷酸(特別是4個(gè)以上的連續(xù)G)，G+C含量應(yīng)為30-80%，C應(yīng)比G多，5'末端不應(yīng)是G。C的數(shù)量越多，產(chǎn)生的ARn越高。應(yīng)先選擇探針；8.為避免因擴(kuò)增了cDNA制劑中污染性基因組DNA所致的假陽性，引物宜跨越外顯子-外顯子連接區(qū)。這樣不會(huì)擴(kuò)增基因組DNA(用于人GAPDH擴(kuò)增的PDAR試劑盒裝有這種引物)；9.如果用設(shè)計(jì)的TaqManTM探針來區(qū)別等位基因，錯(cuò)配的核苷酸(多態(tài)性位點(diǎn))應(yīng)在探針中間而不是兩端；10.可利用3'末端附近含有dA核苷酸的引物從而可用AmpEraseUNG有效地降解所產(chǎn)生的任何引物二聚體(見EZRT-PCR試劑盒手冊(cè)的第9頁；P/N402877)。如果不能選擇在這些末端附近含有dA核苷酸的引物，則應(yīng)考慮利用具有3'末端dU-核苷酸的引物。(也可參見Invitrogen的《PCR引物設(shè)計(jì)》(PCRPrimerDesign)的普遍原理)。通用方法1.用隨機(jī)六聚體(不含有寡聚-dT)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。如果不得不用寡聚-dT，則應(yīng)避免上游大于兩千堿基的長mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或擴(kuò)增子，18SRNA不能用作標(biāo)準(zhǔn)品；2.多重PCR只在對(duì)照引物有限時(shí)可正確進(jìn)行(ABI對(duì)照試劑不限制它們的引物)；3.靶cDNA用量范圍是10ng-lpg。如果用DNA(主要用于等位基因鑒別研究)，最佳用量是100ng-l叱；4.理想地是用不含RNA酶的DNA酶處理各RNA制品以避免基因組DNA污染。即使是最佳的RNA提取方法也會(huì)產(chǎn)生一些基因組DNA。當(dāng)然最好有根本不擴(kuò)增基因組DNA的引物，但有時(shí)這不可能；5.為得到最佳結(jié)果，試劑(在制備PCR混合物之前)和PCR混合物本身(加樣之前)應(yīng)充分振蕩(vortex)與混合。否則在PCR的早期輪次(0-5)中Rn值可能會(huì)有漂移。在配制試劑混合物之前將探針加入緩沖液組分使其在室溫下平衡也很重要。TaqManTM引物和探針定購自ABI的中等規(guī)模(midi-scale)TaqManTM探針收到時(shí)是100pM的混懸液。如果制備l/20稀釋液，則得到5^M溶液。此儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為等份、冷凍并閉光保存。在50pL反應(yīng)體積中其用量為1^L得到推薦的100nM終濃度。引物收到時(shí)是凍干的，含量以pmol標(biāo)在試管上(例如150.000pmol等于150nmol)。如果將Xnmol的引物重懸在X^L水中，得到的溶液是1mM。最好將此儲(chǔ)備液分成等份冷凍。當(dāng)將1mM儲(chǔ)備液稀釋IOO倍時(shí)，得到的工作溶液是10^M。為使50反應(yīng)體積中的最終引物濃度為推薦的50-卯0nM，應(yīng)每次反應(yīng)用0.25-4.50fiL(500nM終濃度用2.5pL)。PDAR引物和探針以保存于一個(gè)試管中的混合物提供。它們?cè)?0pL反應(yīng)體積中用量為2.5^L。設(shè)置一步TaqManTM反應(yīng)一步實(shí)時(shí)PCR將RNA(與cDNA相反)用作模板。如果RNA溶液濃度低則優(yōu)選此方法，但只是在進(jìn)行單重反應(yīng)時(shí)。缺點(diǎn)是防止酶AmpErase作用而剩下的RNA不能用于一步反應(yīng)中。在此方法中，逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)PCR發(fā)生在同一試管中。下游PCR引物的作用也是逆轉(zhuǎn)錄酶的引物(隨機(jī)六聚體或寡聚-dT不能用于一步RT-PCR中的逆轉(zhuǎn)錄)。一步反應(yīng)需要較高的dNTP濃度(大于或等于300mM與200mM)，因?yàn)樵摲磻?yīng)合并了各自需要dNTP的兩種反應(yīng)。GoldRT-PCR試劑盒的一步PCR所用的典型反應(yīng)混合物如下<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>如果用PDAR，則用2.5的引物+探針。此反應(yīng)優(yōu)選用10pg-100ngRNA。注意將模板用量從100ng降低至50ng將使CT值增加1。為使&值降低3，起始的模板用量應(yīng)增加8倍。ABI宣稱此系統(tǒng)可檢測(cè)到2皮克的RNA,RNA的最大用量可以是1微克。為進(jìn)行常規(guī)分析，可用lOpg-100ng的RNA和100pg-1pg基因組DNA。一步PCR的循環(huán)參數(shù)逆轉(zhuǎn)錄(MuLV)，48°C30分鐘。AmpliT叫活化，95°CIO分鐘。PCR:95t:變性15秒，6(TC退火/延伸1分鐘(重復(fù)40次)(OnABI7700，最低維持時(shí)間是15秒)。最新介紹的EZone-stepRT-PCR試劑盒可利用UNG，因?yàn)槔昧藷岱€(wěn)定性逆轉(zhuǎn)錄酶使得逆轉(zhuǎn)錄的培育時(shí)間是6CTC。此溫度也是避免48"C形成引物二聚體和非特異性結(jié)合的較好選擇。操作ABI7700:開始運(yùn)行前應(yīng)確認(rèn)以下事項(xiàng)1.運(yùn)行的循環(huán)參數(shù)正確；2.光譜補(bǔ)償?shù)倪x擇正確(單重反應(yīng)選0#，多重反應(yīng)選O");3.AnalysisOptionsbox(分析選項(xiàng)框)(Analysis(分析)/Options(選項(xiàng)))中的"NumberofPCRStages(PCR階段數(shù))"選擇正確。如果擴(kuò)增圖中沒有數(shù)據(jù)，但在平面圖中可見，并且擴(kuò)增(圖)的X-軸顯示O-l輪，則在運(yùn)行一次后必須手動(dòng)設(shè)定此(參數(shù))。4.模板對(duì)照(TemplateControl)不如此標(biāo)記(為精確計(jì)算ARn);5.數(shù)據(jù)分析前應(yīng)正確選擇染料組分；6.你必須在運(yùn)行開始前給予名稱(不能維持未命名)并保存；7.在運(yùn)行結(jié)束時(shí)，先保存數(shù)據(jù)再開始分析；(使用)ABI軟件需要極其謹(jǐn)慎。撳下Run(運(yùn)行)按鈕后不要試圖停止運(yùn)行。你有問題并如果需要開關(guān)機(jī)器時(shí)，必須等至少1小時(shí)才能重新啟動(dòng)運(yùn)行。當(dāng)分析數(shù)據(jù)時(shí)，記住默認(rèn)的基線設(shè)置是3-5。如果任何CT值<15，應(yīng)隨之改變基線(基線停止值應(yīng)比最小的CT值小1-2)。此問題的有用討論見《ABI基線與閾值設(shè)置指南》(ABITutorialonSettingBaselinesandThresholds)。(有趣的是，此問題的最佳討論見TaqManTM人內(nèi)源性對(duì)照板(HumanEndogenousControlPlate)的手冊(cè)中)。如果結(jié)果沒有意義，檢查原始光譜看運(yùn)行期間CDC照相機(jī)(是否)可能飽和。利用光學(xué)蓋(opticalcap)而不是光學(xué)粘性罩(opticaladhesivecover)可防止CDC照相機(jī)飽和。當(dāng)利用SYBRGreenI、多重(反應(yīng))和高濃度探針時(shí)，更可能發(fā)生(CDC照相機(jī)飽和)。結(jié)果解析每次反應(yīng)結(jié)束時(shí)，所記錄的熒光強(qiáng)度用于以下計(jì)算Rn+是含所有組分的反應(yīng)的Rn值；Rir是未反應(yīng)樣品的Rn值(基線值或NTC中檢測(cè)的值)。ARn是Rn+與Rn-之間的差異。它是PCR產(chǎn)生的信號(hào)數(shù)量級(jí)指標(biāo)。定量測(cè)定模板含量有三種示范性方法1.絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法:在此方法中，用含量已知的標(biāo)準(zhǔn)品，例如體外翻譯的RNA(cRNA)。2.相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法:每次運(yùn)行的試驗(yàn)設(shè)計(jì)中包括己知量的靶核酸；3.比狡性Ct方法:此方法不用含量已知的標(biāo)準(zhǔn)品，而是比較靶序列的相對(duì)量與選擇的任何參比值，結(jié)果以相對(duì)于參比值(例如靜息淋巴細(xì)胞或標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系的表達(dá)水平)給出。基因表達(dá)的相對(duì)定量測(cè)定的比較性CT方法(AACT):此方法在觀察相對(duì)于活性參比對(duì)照物(標(biāo)準(zhǔn)品)的表達(dá)水平時(shí)無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線即能相對(duì)地定量測(cè)定模板并增加樣品處理量。為成功實(shí)施此方法，應(yīng)使靶標(biāo)和參比物的動(dòng)態(tài)范圍相似?？刂拼?動(dòng)態(tài)范圍)的靈敏方法是觀察AC丁(同一起始模板用量作兩次PCR所得兩個(gè)CT值之間的差異)如何隨模板的稀釋度而變化。如果這兩種擴(kuò)增子的效率大致相等，將輸入量的對(duì)數(shù)與ACT作圖得到接近水平的線(斜率〈0.10)。這表示在起始模板用量范圍內(nèi)進(jìn)行的兩次PCR效率相同。如果該圖顯示效率不相等，應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線方法來定量測(cè)定基因表達(dá)。應(yīng)測(cè)定(l)靶標(biāo)的精確最低和最高濃度和(2)兩種基因含量的精確最低和最高比例這二者的動(dòng)態(tài)范圍。在常規(guī)競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR中，該動(dòng)態(tài)范圍限制在靶標(biāo)-競(jìng)爭(zhēng)物比例約為10:1-1:10(1:1的比例可獲得最佳精確性)。實(shí)時(shí)PCR能實(shí)現(xiàn)更廣泛的動(dòng)態(tài)范圍。在不同試管中擴(kuò)增耙標(biāo)和內(nèi)源對(duì)照物與采用標(biāo)準(zhǔn)曲線方法幾乎不需要優(yōu)化和驗(yàn)證。采用比較性CT方法的優(yōu)點(diǎn)在于無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(樣品可利用更多的孔)。該方法也消除了制作標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品可能產(chǎn)生的任何稀釋誤差的負(fù)面影響。只要靶標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)品具有相似的動(dòng)態(tài)范圍，比較性Ct方法(AACt方法)是最實(shí)用的方法。預(yù)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)品比靶標(biāo)的表達(dá)水平高(因此，Ct僮狡低)。從得到靶標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)品的CT值之間的差異(ACT)開始定量計(jì)算ACT=CT(靶標(biāo))-CT(標(biāo)準(zhǔn)品)計(jì)算待定量的各樣品的此值(除非靶標(biāo)的表達(dá)水平高于標(biāo)準(zhǔn)品，此值應(yīng)為陽性值。如果是陰性也無害)。每次比較選擇這些樣品之一作為參比品(基線)。比較性AACT計(jì)算包括找到各樣品ACT與基線ACT之間的差異。如果基線值表示最低表達(dá)水平，則預(yù)計(jì)AACT值是陰性(因?yàn)榛€樣品的ACT最大，由于它具有最大CT值)。如果一些樣品中表達(dá)增加，而另一些中減少，AACT值將是陰性和陽性數(shù)值的混合值。定量測(cè)定的最后一步是將這些數(shù)值轉(zhuǎn)化為絕對(duì)值。此計(jì)算公式是比較性表達(dá)水平=2_AACT與基線水平相比，(樣品)表達(dá)增加約23=8倍，而(樣品)表達(dá)降低約為參比品水平的2-3=1/8。通過簡(jiǎn)單地輸入Ct值用微軟Excel進(jìn)行這些計(jì)算(ABI在http:〃www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/7700amp/有關(guān)于利用擴(kuò)展層程序(spreadsheetprogram)來產(chǎn)生擴(kuò)增圖的在線指南；TaqMan人內(nèi)源性對(duì)照板(HumanEndogenousControlPlate)方法也包括有關(guān)用MSExcel進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)分析的詳細(xì)說明)。其它(絕對(duì))定量方法概述于ABI用戶公告(http:〃docs.appliedbiosystems.com/search.taf_UserReference=A8658327189850A13A0C598E)。公告#2和#5對(duì)全面理解實(shí)時(shí)PCR和定量最有用。推薦方法1.利用正位移移液管(positive-displacementpipette)以避免移液不精確；2.實(shí)時(shí)PCR的靈敏度可檢測(cè)出2pg總RNA中的靶標(biāo)。反應(yīng)中總RNA的拷貝數(shù)宜足夠從而可通過25-30輪即產(chǎn)生信號(hào)(優(yōu)選低于100ng)。為實(shí)現(xiàn)此目的應(yīng)降低或增加用量；3.各試劑的最佳濃度如下；i.氯化鎂的濃度應(yīng)是4-7mM。對(duì)用PrimerExpresssoftware(引物表達(dá)軟件)設(shè)計(jì)的引物/探針而言最佳是5.5mM;ii.除dUTP夕卜(如果使用的話)，各dNTP的濃度應(yīng)平衡。用dUTP取代dTTP來控制PCR產(chǎn)物殘留需要dUTP濃度是其它dNTP的兩倍。雖然dNTP濃度的最佳范圍是500mM(—步RT-PCR)，但典型的TaqMan反應(yīng)(只是PCR)的各種dNTP采用200(400的dUTP);iii.通常向每50pL反應(yīng)中加入0.25pL(1.25U)AmpliTaqDNA聚合酶(5.0UL)。這是最低要求。如果需要，可將此量增加0.25U達(dá)到最優(yōu)；iv.最佳探針濃度是50-200nM，引物濃度是100-900nM。應(yīng)對(duì)三種不同溫度(TaqMan引物的58、60和62。C)和三種濃度(50、300、900nM)的各種組合優(yōu)化各對(duì)引物。這意味著設(shè)置了不同的三組(三種溫度)，每組利用固定量的靶模板有九種反應(yīng)(50/50mM、50/300mM、50/卯0、300/50、300/300、300/，、900/50、900/300、900/900mM)。如果需要，可(進(jìn)行)第二輪優(yōu)化來改善結(jié)果?？赏ㄟ^選擇可提供最低CT和最高ARn的引物濃度來實(shí)現(xiàn)最佳性能。類似地，應(yīng)將探針濃度優(yōu)化為25-225nM;4.如果用AmpliTaqGoldDNA聚合酶，為實(shí)現(xiàn)此目的需要在PCR前于92-95T加熱9-12分鐘。如果用AmpliTaqGoldDNA聚合酶，無需將反應(yīng)設(shè)置在冰上。典型的T叫Man反應(yīng)包括50°C2分鐘UNG(參見下文)培育；95°C10分鐘活化聚合酶；和95°C15秒(變性)40輪與60°C1分鐘(退火與延伸)。如果起始材料是總RNA，在TaqMan反應(yīng)之前應(yīng)進(jìn)行典型的逆轉(zhuǎn)錄循環(huán)，該循環(huán)(cDNA合成)由25。C10分鐘(引物培育)，48。C30分鐘(利用常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄)和95°C5分鐘(滅活逆轉(zhuǎn)錄酶)；5.向該反應(yīng)中加入AmpErase尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)來除去摻入擴(kuò)增子中的任何尿嘧啶防止殘留的PCR產(chǎn)物再擴(kuò)增。這是PCR反應(yīng)中為何使用dUTP而不是dTTP的原因。UNG在55'C以上不起作用，不切割含末端dU核苷酸的單鏈DNA。除非逆轉(zhuǎn)錄和PCR使用rrADNA聚合酶，否則含UNG的主混合物不應(yīng)與一步RT-PCR聯(lián)用(TaqManEZRT-PCR試劑盒)；6.每塊反應(yīng)平板中必需包含至少三份非擴(kuò)增對(duì)照(NAC)以及三份非模板對(duì)照^丁(:)(為在確定的耙標(biāo)擴(kuò)增+/-閾值這達(dá)到99.7%可信度水平，必須進(jìn)行一式六份NTC)。NAC加樣板含有樣品，不含酶。需要排除樣品中或熱循環(huán)儀的加熱塊(heatingblock)中熒光污染物的存在(這些污染物可導(dǎo)致假陽性)。如果PCR后NAC的絕對(duì)熒光大于NTC，樣品中或熱循環(huán)儀的加熱塊中可能存在熒光污染物。7.如果要將AACT方法用于相對(duì)定量測(cè)定，應(yīng)核査引物/探針系統(tǒng)及其標(biāo)準(zhǔn)品的動(dòng)態(tài)范圍。通過以5種RNA濃度(例如，0、80pgL、400pgL、2ng/^L和50ng/^iL)進(jìn)行(一式三份)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)此核查。相同的總RNA濃度范圍的靶標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR得到的起始含量的對(duì)數(shù)與CT值作圖(標(biāo)準(zhǔn)曲線)應(yīng)該是(接近)直線；8.被動(dòng)參比物是加入'反應(yīng)中的染料(ROX)(存在于TaqMan通用PCR主混合物中)。它不參與5'核酸酶反應(yīng)。它提供了背景發(fā)射熒光的內(nèi)部參比物。可用此來標(biāo)準(zhǔn)化受體-染料信號(hào)。對(duì)孔與孔之間(濃度或體積差異)或隨時(shí)間變化發(fā)生的非PCR相關(guān)熒光波動(dòng)進(jìn)行此標(biāo)準(zhǔn)化，不同于對(duì)cDNA用量或PCR效率進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)化。將報(bào)導(dǎo)染料的發(fā)射光強(qiáng)度除以被動(dòng)參比物的發(fā)射光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。得到的比值定義為Rn;9.如果進(jìn)行多重(反應(yīng))，更豐富的靶標(biāo)將在其它靶標(biāo)得以擴(kuò)增之前耗盡所有的反應(yīng)成分。為避免此種情況，對(duì)更豐富靶物質(zhì)應(yīng)限制引物的濃度；10.TaqMan通用PCR主混合物應(yīng)保存于2-8°C(不是-20°C);11.用JOE報(bào)導(dǎo)染料標(biāo)記TaqManGoldRT-PCR試劑盒提供的GAPDH探針，用VIC標(biāo)記Pre-DevelopedTaqManAssayReagents(PDAR)試劑盒提供的同一探針。設(shè)計(jì)的這些人GAPDH試驗(yàn)的引物不會(huì)擴(kuò)增基因組DNA;12.為防止酶殘留，需要在48t:培育的一步RT-PCR法不能用AmpEraseUNG，但EZRT-PCR試劑盒中可用；13.單重反應(yīng)只能用一步RT-PCR法，逆轉(zhuǎn)錄法只能選擇下游引物(非隨機(jī)六聚體或寡聚-dT);14.優(yōu)選進(jìn)行一式兩份(反應(yīng))來控制移液誤差，但這不可避免會(huì)增加成本；15.如果進(jìn)行多重(反應(yīng))，在運(yùn)行前應(yīng)核查光譜補(bǔ)償選項(xiàng)(在AdvancedOptions(高級(jí)選項(xiàng))中)；16.利用反應(yīng)中的被動(dòng)參比物(ROX)將熒光波動(dòng)(值)標(biāo)準(zhǔn)化，和用內(nèi)源性對(duì)照物(例如GAPDH，活性參比物)將cDNA/PCR用量的效率標(biāo)準(zhǔn)化是不同的方法；17.ABI7700不僅可用于定量RT-PCR也可用于終點(diǎn)PCR。后者包括存在/不存在的檢測(cè)試驗(yàn)或等位基因鑒別試驗(yàn)(例如SNP分型)；18.PCR的早期輪次(0-5輪)中Rn值漂移表示反應(yīng)諸組分最初不平衡，但不影響最終結(jié)果，只要重新設(shè)置基線范圍的下限值；19.如果注意到擴(kuò)增圖異常(CT值<15，在早期輪次中檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào))，應(yīng)降低基線范圍的上限值，應(yīng)稀釋樣品以提高CT值(污染也可能提高CT值)；20.ARn值低(或高于預(yù)計(jì)的Ct值)表明PCR效率不佳或者耙標(biāo)的拷貝數(shù)低；21.Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差〉0.16表明移液不精確；22.純色彩設(shè)置(PureDyeSetup)中的SYBR綠色條目(SYBRGreenentry)以大寫字母縮寫為"SYBR"。任何其它縮寫或小寫字母會(huì)產(chǎn)生問題；23.ABI7700的SDS軟件與8.1版的Macintosh操作系統(tǒng)有沖突。不應(yīng)在這種計(jì)算機(jī)上分析數(shù)據(jù)。24.ABI7700不應(yīng)長期停用。如果將其關(guān)閉，在運(yùn)行前應(yīng)預(yù)熱至少1小時(shí)。推薦將儀器隨時(shí)開著，這對(duì)激光有益。如果運(yùn)行前剛開機(jī)，可能會(huì)出現(xiàn)顯示操作系統(tǒng)版本沖突的出錯(cuò)框。如果發(fā)生此情況，選擇"AutoDownload(自動(dòng)下載)"選項(xiàng)。25.ABI7700只是可得到的實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)中的^種，其它包括BioRad、Cepheid、CorbettResearch、Roche禾卩Stratagene的系統(tǒng)?；蛐头治鲈S多方法可用于分析DNA的基因型。等位基因鑒別方法的綜述見Kristensen等(Biotechniques,30(2):318-322，(2001))。本文只描述了一種方法，等位基因特異性PCR法。引物設(shè)計(jì)可利用隨意得到的計(jì)算機(jī)程序，例如Primer3(http:〃frodo.wi.mit.edu/primer3/primer3—code.html)來設(shè)計(jì)對(duì)具體等位基因的特異性上游和下游PCR引物?；蛘?，可利用諸如ClustalW(http:〃www.ebi.ac.uk/clustalw/)程序和針對(duì)存在DNA序列差異但保持留足夠特異性而能確保擴(kuò)增正確擴(kuò)增子的區(qū)域設(shè)計(jì)的特異性引物，比對(duì)各等位基因的DNA序列。優(yōu)選將PCR擴(kuò)增子設(shè)計(jì)為在一個(gè)等位基因中具有限制性酶切位點(diǎn)，而在其它等位基因中沒有。引物通常長18-25個(gè)堿基對(duì)，具有相似的解鏈溫度。PCR擴(kuò)增對(duì)PCR反應(yīng)組成的描述隨處可見(《PCR的臨床應(yīng)用》(ClinicalApplicationsofPCR)，DennisLo(編)，BlackwellPublishing,1998)。簡(jiǎn)言之，此反應(yīng)含有引物、DNA、緩沖液和熱穩(wěn)定性聚合酶。反應(yīng)在熱循環(huán)儀，例如PTC-96V型MJResearch熱循環(huán)儀上通過變性、雜交和DNA延伸的溫度步驟進(jìn)行循環(huán)(最多50次)。DNA分析可用各種方法，包括用質(zhì)譜、毛細(xì)管凝膠電泳和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分子大小鑒別來分析PCR產(chǎn)物。如果將PCR擴(kuò)增子設(shè)計(jì)為含有不同的限制性酶切位點(diǎn)，可用DNA-結(jié)合柱或沉淀和用水重懸，然后用合適的限制性酶進(jìn)行限制性切割來純化PCR反應(yīng)中的DNA。然后將限制性切割的DNA作瓊脂糖凝膠電泳，利用電流對(duì)DNA進(jìn)行大小分離。某基因的各種等位基因根據(jù)是否含有限制性位點(diǎn)而具有不同大小。實(shí)施例2基因鑒定和基因的優(yōu)先排序按照EmpiricalBayes方法(Lonnstedt禾卩Speed,2002，5toZWca<S7m'c<3，12:3146)，根據(jù)第28天的所有動(dòng)物與第0、2、4、7、9、11、14、17、21和24天的動(dòng)物作比較對(duì)(表達(dá)變化)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因排序。用經(jīng)驗(yàn)性Bayes方法提供各組內(nèi)各基因方差的減少估算量(shrinkageestimator)。利用此減少估算量根據(jù)t檢驗(yàn)計(jì)算各p值。采用Holms方法調(diào)整t檢驗(yàn)的p值以有力控制基因家族I型誤差(familywisetypeIerrorrate)。在各天(表達(dá)變化)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(pO.05)的總共783種基因是表5所列的基因。通過去除(表達(dá)變化)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不到兩天并且pX).OOl的那些基因來修正此基因列表。然后按照它們的p值對(duì)剩余的基因以升序排列。應(yīng)注意此基因列表不排除可用于診斷應(yīng)激的基因(也參見最低預(yù)測(cè)設(shè)置和基因本體論(geneontology))。表6所列基因按它們的統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)值排序可解釋為信號(hào)-噪聲比。該表格也顯示了1og2倍變化(M值)與調(diào)整的p值。具有負(fù)t值(因此M也是負(fù)值)的基因表達(dá)下調(diào)。具有正的t和M值的基因表達(dá)上調(diào)。根據(jù)應(yīng)激誘導(dǎo)后第一天(表達(dá)變化)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(pO.001)的各基因和至少3次取樣時(shí)間檢測(cè)(表達(dá)變化)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因的t值增加值進(jìn)行基因的優(yōu)先排序。實(shí)施例3證明對(duì)測(cè)定應(yīng)激應(yīng)答具有診斷潛力根據(jù)基因表達(dá)計(jì)算的主要組分評(píng)分(Jolliffe，I.T.，《主要組分分析》(Principalcomponentsanalysis),Springer-Verlag，1986)采用辨另U分析(Venables和Ripley，2002，《統(tǒng)計(jì)學(xué)在S中的現(xiàn)代應(yīng)用》(ModernAppliedStatisticsinS)，Springer)評(píng)估了整組基因的診斷潛力。對(duì)遭遇應(yīng)激之后立即獲得的和遭遇應(yīng)激后第2、4、7、9、11、14、17、21、24和28天獲得的樣品作比較。整個(gè)方法經(jīng)交叉驗(yàn)證。靈敏度和特異性經(jīng)計(jì)算均為優(yōu)先級(jí)(uniformprior)。這可解釋為是一種對(duì)減少的調(diào)節(jié)，此減少的估算值位于減小范圍(reducedspace)內(nèi)。然后利用辯別函數(shù)評(píng)分(discriminantfunctionscores)的交叉驗(yàn)證估算值來構(gòu)建ROC曲線(LloydC丄，1998，"采用平滑ROC曲線進(jìn)行總結(jié)和比較的診斷系統(tǒng)"(TheuseofsmoothedROCcurvestosummarizeandcomparediagnosticsystems),Jowma/o/爿mm'ca"iSY加Wca/jmocZ油'ow，93:1356-1364)。ROC曲線根據(jù)具有用Lloyd方法(同上)選擇的平滑窗的經(jīng)驗(yàn)性累積分布函數(shù)與核心密度估算值制備。比較每天與第28天的ROC曲線分別見圖1-10。經(jīng)歷運(yùn)輸應(yīng)激狀態(tài)后基因表達(dá)改變的數(shù)量級(jí)足以產(chǎn)生優(yōu)秀的診斷潛力。實(shí)施例4具有預(yù)測(cè)功能的最小基因組雖然鑒定到大量具有診斷潛力的基因，但通常進(jìn)行診斷所需可接受的只是很少數(shù)目的基因。表7顯示根據(jù)選自具有診斷潛力基因組的兩種基因進(jìn)行線性辯別分析獲得交叉驗(yàn)證分類結(jié)果、靈敏度和特異性。提出的諸對(duì)基因是能產(chǎn)生最高預(yù)測(cè)結(jié)果的基因，許多其它基因?qū)Φ玫娇山邮艿姆诸惤Y(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難鑒定其它基因?qū)?。鑒定基因?qū)Φ募夹g(shù)包括(但不限于)正向可變性選擇(VenablesW.N.和RipleyB.D.，《統(tǒng)計(jì)學(xué)在S中的現(xiàn)代應(yīng)用》(ModernAppliedStatisticsinS)，第四版，2002.，Springer)、最佳亞組選擇、反向(backward)消除(VenablesW.N.和RipleyB.D.，2002，同上)、逐步(stepwise)選擇(VenablesW.N.和RipleyB.D.，2002，同上)和隨機(jī)可變消除(FigueradoM.A.，《監(jiān)督學(xué)習(xí)的適應(yīng)性稀疏》(AdaptiveSparsenessforSupervisedLearning))。表8顯示根據(jù)用選自診斷組三種基因進(jìn)行線性辯別分析得到的交叉驗(yàn)證分類結(jié)果。只提供了20組三種基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難明白可根據(jù)三種應(yīng)激標(biāo)記基因作出其它合適的診斷選擇。表9顯示根據(jù)選自診斷組的四種基因，線性判別分析得到的交叉驗(yàn)證分類結(jié)果。只給出了20組四種基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難明白根據(jù)四種應(yīng)激標(biāo)記基因作出其它合適的診斷選擇。表10顯示根據(jù)用選自診斷組五種基因進(jìn)行線性辯別分析得到的交叉驗(yàn)證分類結(jié)果。只提供了20組五種基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難明白可根據(jù)五種應(yīng)激標(biāo)記基因作出其它合適的診斷選擇。表11顯示根據(jù)用選自診斷組六種基因進(jìn)行線性辯別分析得到的交叉驗(yàn)證分類結(jié)果。只提供了20組六種基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難明白可根據(jù)六種應(yīng)激標(biāo)記基因作出其它合適的診斷選擇。表12顯示根據(jù)用選自診斷組七種基因進(jìn)行線性辯別分析得到的交叉驗(yàn)證分類結(jié)果。只提供了20組七種基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難明白可根據(jù)七種應(yīng)激標(biāo)記基因作出其它合適的診斷選擇。表13顯示根據(jù)用選自診斷組八種基因進(jìn)行線性辯別分析得到的交叉驗(yàn)證分類結(jié)果。只提供了20組八種基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難明白可根據(jù)八種應(yīng)激標(biāo)記基因作出其它合適的診斷選擇。表14顯示根據(jù)用選自診斷組九種基因進(jìn)行線性辯別分析得到的交叉驗(yàn)證分類結(jié)果。只提供了20組九種基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難明白可根據(jù)九種應(yīng)激標(biāo)記基因作出其它合適的診斷選擇。表15顯示根據(jù)用選自診斷組十種基因進(jìn)行線性辯別分析得到的交叉驗(yàn)證分類結(jié)果。只提供了20組十種基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難明白可根據(jù)十種應(yīng)激標(biāo)記基因作出其它合適的診斷選擇。表16顯示根據(jù)用選自診斷組二十種基因進(jìn)行線性辯別分析得到的交叉驗(yàn)證分類結(jié)果。只提供了20組二十種基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難明白可根據(jù)二十種應(yīng)激標(biāo)記基因作出其它合適的診斷選擇。實(shí)施例5特異性的證實(shí)應(yīng)激標(biāo)記基因的特異性難以定義，因?yàn)檫@種測(cè)試是一種評(píng)估而不是診斷。然而，可將整組"應(yīng)激基因"用于850GeneChipTM的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫的訓(xùn)練組。數(shù)據(jù)庫中的基因表達(dá)結(jié)果得自患有以下各種疾病和病癥的馬匹樣品慢性和極性誘導(dǎo)的EPM、EPM的臨床病例、皰疹病毒感染、退變性骨關(guān)節(jié)炎、紅球菌感染、內(nèi)毒素血癥、蹄葉炎、胃潰瘍綜合征、田徑訓(xùn)練動(dòng)物和臨床上正常動(dòng)物。這些動(dòng)物的應(yīng)激狀態(tài)事先未知。利用該訓(xùn)練組中的基因計(jì)算各GeneChipTM中的應(yīng)激指數(shù)評(píng)分。由于是從經(jīng)調(diào)整的辨別函數(shù)計(jì)算該評(píng)分可將大評(píng)分值與產(chǎn)生應(yīng)激狀態(tài)的高度可能性相關(guān)聯(lián)，評(píng)分的方差應(yīng)約為1。根據(jù)此評(píng)分將GeneChipTM測(cè)定結(jié)果從最通過改變陽性診斷的閾值檢測(cè)了此法的特異性。各閾值的特異性定義為真陽性(樣品)陽性結(jié)果的比例(S卩，GeneChipTM指數(shù)評(píng)分高于該閾值)。采用2個(gè)閾值(即，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差)。當(dāng)利用四種主要組分和整個(gè)基因組(3105)時(shí)，對(duì)不屬于該誘導(dǎo)應(yīng)激試驗(yàn)一部分的數(shù)據(jù)庫的59只動(dòng)物經(jīng)鑒定具有應(yīng)激相關(guān)的免疫應(yīng)答改變與辨別函數(shù)的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差高于0。在這59只動(dòng)物中，10只進(jìn)行了蹄葉炎試驗(yàn)，14只有馬紅球菌(R.叫ui)感染，9只患有胃炎。用作"對(duì)照"的13只動(dòng)物中3只近期經(jīng)歷轉(zhuǎn)運(yùn)，兩只處于試驗(yàn)中，3只臨床上不正常，5只是接觸馬紅球菌的幼駒。12只臨床上正常的動(dòng)物進(jìn)行了應(yīng)激標(biāo)記鑒定。根據(jù)此信息，可以說該應(yīng)激標(biāo)記用于含有850個(gè)以上樣品的數(shù)據(jù)庫時(shí)其特異性超過90%。當(dāng)利用四種主要組分和表1所列獨(dú)特的應(yīng)激標(biāo)記基因時(shí)，對(duì)不屬于該誘導(dǎo)應(yīng)激試驗(yàn)一部分的數(shù)據(jù)庫的79只動(dòng)物經(jīng)鑒定為具有應(yīng)激相關(guān)的免疫應(yīng)答改變，與辨別函數(shù)的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差高于O。在這79只動(dòng)物中，15只進(jìn)行了蹄葉炎試驗(yàn)，8只有馬紅球菌感染，24只患有胃炎。用作"對(duì)照"的21只動(dòng)物中12只處于試驗(yàn)中，3只臨床上不正常。9只臨床上正常的動(dòng)物進(jìn)行了應(yīng)激標(biāo)記鑒定。根據(jù)此信息，可以說該應(yīng)激標(biāo)記用于含有850個(gè)以上樣品的數(shù)據(jù)庫時(shí)其特異性超過卯％。實(shí)施例7基因本體為根據(jù)功能、代謝過程或細(xì)胞組分對(duì)基因分組，采用BLAST算法(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.和Lipman，D丄，(19卯)，"局部序列比對(duì)基本檢索工具"(Basiclocalalignmentsearchtool),M/.5/o/.，215:403-410)將基因序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫作比較，并進(jìn)行基因同源性和基因本體檢索。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)和當(dāng)時(shí)可得到的信息，表17列出了這些基因的分組。也參見含有各基因序列信息的表1。本文引用的每篇專利、專利申請(qǐng)和出版物的內(nèi)容全文納入本文作為參考。本文所引用的任何參考文獻(xiàn)不應(yīng)理解為承認(rèn)該參考文獻(xiàn)是可用于本申請(qǐng)的"現(xiàn)有技術(shù)"。整篇說明書的目的是描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案而不是將本發(fā)明限制于某一實(shí)施方案或特征的特定組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道借助本文內(nèi)容可對(duì)示例的具體實(shí)施方案作出各種改進(jìn)與改變而不脫離本發(fā)明的范圍。所有這種改進(jìn)與改變要包括在附加的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>基因名稱<image>imageseeoriginaldocumentpage123</image><table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage140</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage143</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage146</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage149</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage151</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage153</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage154</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage155</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage157</column></row><table>.<table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage160</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage162</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage163</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage164</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage165</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage166</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage167</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage168</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage169</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage170</column></row>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GACACACTCCAGGAGCTGCTGGACGTGCACACAGCCTGTGAG361藤REAIAFFMEHSFKDENQEFQAGAGAGGCCATTGCATTTTTCATGGAGCACTCCTTCMGGATGAAAATCAGGAATTCCAG381KKFMET丁MNKKGDFLLQNEE200580026241.2轉(zhuǎn)溢齒被353/4453<table>tableseeoriginaldocumentpage372</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage373</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage374</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage375</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage376</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage377</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage378</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage379</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage380</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage381</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage382</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage383</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage384</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage385</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage386</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage387</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage388</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage389</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage390</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage391</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage392</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage393</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage394</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage395</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage396</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage397</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage398</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage399</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage400</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage401</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage402</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage403</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage404</image><table>tableseeoriginaldocumentpage405</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage406</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage407</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage408</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage409</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage410</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage411</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage412</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage413</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage414</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage415</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage416</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage417</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage418</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage419</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage420</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage421</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage422</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage423</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage424</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage425</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage426</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage427</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage428</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage429</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage430</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage431</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage432</column></row><table>表3氨基酸亞類<table>tableseeoriginaldocumentpage433</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage434</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage435</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage436</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage437</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage438</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage439</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage440</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage441</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage442</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage443</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage444</column></row><table>根據(jù)應(yīng)激誘導(dǎo)后第一天t值增加值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(pO.OOl)的各基因和至少3個(gè)取樣時(shí)間(表達(dá)變化)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因進(jìn)行基因的優(yōu)先排序。表7選擇的兩種基因<table>tableseeoriginaldocumentpage445</column></row><table>表8選擇的三種基因<table>tableseeoriginaldocumentpage446</column></row><table>表9選擇的四種基因<table>tableseeoriginaldocumentpage447</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage448</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage449</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage450</column></row><table>表12選擇的<table>tableseeoriginaldocumentpage451</column></row><table>表13選擇的八種基因<table>tableseeoriginaldocumentpage452</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage453</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage454</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage455</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage456</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage457</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage458</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage459</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage460</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage461</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage462</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage463</column></row><table>權(quán)利要求1.一種測(cè)定測(cè)試對(duì)象中對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答或相關(guān)疾病的存在或程度的方法，包括檢測(cè)測(cè)試對(duì)象中至少一種選自以下的應(yīng)激標(biāo)記基因的異常表達(dá)(a)其具有的多核苷酸表達(dá)產(chǎn)物含有與以下任一序列至少有50％序列相同性的核苷酸序列的基因SEQIDNO1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互補(bǔ)序列；(b)其具有的多核苷酸表達(dá)產(chǎn)物含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249；(c)其具有的多核苷酸表達(dá)產(chǎn)物含有編碼與以下序列至少一部分至少有50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO22、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)其具有的多核苷酸表達(dá)產(chǎn)物含有至少在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的基因。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，包括檢測(cè)選自以下的應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸的異常表達(dá)(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、17、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、2U、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，包括檢測(cè)選自以下的應(yīng)激標(biāo)記多肽的異常表達(dá)(i)含有與以下任一序列至少有50%序列相似性的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(ii)含有以下任一序列一部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、135、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；(iii)所含的氨基酸序列與以下任一序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基至少有30%相似性的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;和(iv)含有以下任一序列一部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，并且與和(i)、(ii)或(iii)的序列具有免疫相互作用活性的抗原結(jié)合分子具有免疫相互作用活性。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，通過以下步驟檢測(cè)所述的異常表達(dá)(1)檢測(cè)得自測(cè)試對(duì)象的生物學(xué)樣品中的至少一種應(yīng)激標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性，和(2)將所檢測(cè)到的各表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性與得自一位或多位正常對(duì)象或一位或多位未處于應(yīng)激狀態(tài)對(duì)象的參比樣品中相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性作比較，其中與參比樣品中相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性相比，該生物學(xué)樣品中該表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性有差異表明該測(cè)試對(duì)象存在對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，還包括當(dāng)該表達(dá)產(chǎn)物或各表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)到的水平或功能活性比相應(yīng)的該表達(dá)產(chǎn)物或各表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)到的水平或功能活性低10%時(shí)，診斷該測(cè)試對(duì)象中對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答的存在、階段或程度。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，通過檢測(cè)至少一種選自以下的應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸的水平或功能活性降低來確定是否存在對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、4、7、9、II、19、21、24、25、33、34、38、39、40、41、42、50、51、56、57、59、62、63、66、70、71、73、75、79、81、83、89、90、91、92、93、97、99、105、107、108、111、119、121、122、123、129、130、137、139、140、141、142、143或185，或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、8、10、12、20、22、43、58、60、67、71、72、74、76、80、82、84、94、98、100、106、112、120、122、123、124或138;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、8、10、12、20、22、43、58、60、67、71、72、74、76、80、82、84、94、98、100、106、112、120、122、123、124或138，其中所述部分含有該序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，還包括當(dāng)該表達(dá)產(chǎn)物或各表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)到的水平或功能活性比相應(yīng)的該表達(dá)產(chǎn)物或各表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)到的水平或功能活性高10%時(shí)，診斷該測(cè)試對(duì)象對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答的存在、階段或程度。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，通過檢測(cè)至少一種選自以下的應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸的水平或功能活性增加來確定是否存在對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:5、13、15、16、17、23、26、28、29、30、32、35、37、44、46、48、52、54、55、64、68、77、85、87、95、96、101、103、113、115、117、118、125、126、131、133、135、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、183、184、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206或210，或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、14、18、27、31、36、45、47、49、53、65、69、78、86、88、102、104、114、116、132、134、136、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、189、191、193、197、199、201、203、205、207或211;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、14、18、27、31、36、45、47、49、53、65、69、78、86、88、102、104、114、116、132、134、136、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、189、191、193、197、199、201、203、205、207或211，其中所述部分含有該序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。9.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，還包括當(dāng)該表達(dá)產(chǎn)物或各表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)到的水平或功能活性與相應(yīng)的該表達(dá)產(chǎn)物或各表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)到的水平或功能活性相同或相似時(shí)，診斷不存在對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答。10.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，各表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)到的水平或功能活性與相應(yīng)的各表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)到的水平或功能活性的差異不超過5%。11.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包括檢測(cè)至少約2種應(yīng)激標(biāo)記基因各表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性。12.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包括檢測(cè)至少一種選自以下的一級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因各表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:89、90、103、125、126、163、178、182、184或l卯，或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:104、179、183或189;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:104、179、183或189，其中所述部分含有該序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。13.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包括檢測(cè)至少一種選自以下的二級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因各表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:17、23、44、52、133、135、144、147、148、151、155、192、196、202或206，或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:18、20、45、53、134、136、149、152、193、197或207;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:18、20、45、53、134、136、149、152、193、197或207，其中所述部分含有該序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。14.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包括檢測(cè)至少一種選自以下的三級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因各表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:5、30、37、48、54、55、64、66、70、77、79、85、91、92、95、96、101、115、117、118、121、150、153、158、164、170、180、186或198，或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、31、49、65、67、78、80、86、102、116、122、154、159、181或199;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、31、49、65、67、78、80、86、102、116、122、154、159、181或199，其中所述部分含有該序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。15.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包括檢測(cè)至少一種選自以下的四級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因各表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:7、15、16、19、21、24、25、26、28、35、38、39、42、46、57、68、73、81、83、97、99、107、113、123、160、165、175、187、188、194、195或200，或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:20、22、27、29、36、42、43、58、69、74、82、84、98、100、108、114、124、166、189或201;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:20、22、27、29、36、42、43、58、69、74、82、84、98、100、108、114、124、166、189或201，其中所述部分含有該序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。16.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包括檢測(cè)至少一種選自以下的五級(jí)相關(guān)應(yīng)激標(biāo)記基因各表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、9、11、13、32、33、34、40、41、50、51、56、59、62、63、71、75、87、93、105、111、119、127、129、130、131、137、139、141、143、145、156、161、167、169、171、173、176、185、204或210，或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、4、12、14、60、61、72、76、88、94、106、112、120、128、132、138、140、142、146、157、162、168、172、174、177、205或211;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、4、12、14、60、61、72、76、88、94、106、112、120、128、132、138、140、142、146、157、162、168、172、174、177、205或211，其中所述部分含有該序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。17.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物學(xué)樣品包括血液。18.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物學(xué)樣品包括外周血。19.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物學(xué)樣品包括白細(xì)胞。20.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)產(chǎn)物是RNA分子。21.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)產(chǎn)物是多肽。22.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)產(chǎn)物與相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物相同。23.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)產(chǎn)物是相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物的變體。24.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)產(chǎn)物或相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物是靶RNA或該靶RNA的DNA拷貝，其水平用至少在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與該靶RNA或其DNA拷貝雜交的至少一種核酸探針來檢測(cè)，其中所述核酸探針含有應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述靶RNA或其DNA拷貝的所檢測(cè)水平或豐度按存在于同一樣品中的參比RNA或該參比RNA的DNA拷貝的水平或豐度標(biāo)準(zhǔn)化。26.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述核酸探針固定在固體或半固體支持物上。27.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述核酸探針形成核酸探針空間陣列的一部分。28.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，通過雜交檢測(cè)與該靶RNA或其DNA拷貝結(jié)合的核酸探針的水平。29.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，通過核酸擴(kuò)增檢測(cè)與該耙RNA或其DNA拷貝結(jié)合的核酸探針的水平。30.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，通過核酸酶保護(hù)試驗(yàn)檢測(cè)與該靶RNA或其DNA拷貝結(jié)合的核酸探針的水平。31.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，檢測(cè)應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸的所述探針含有SEQIDNO:250-1807之一所示的序列。32.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)產(chǎn)物或相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物是靶多肽，其水平采用與該耙多肽具有免疫相互作用活性的至少一種抗原結(jié)合分子來檢測(cè)。33.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，包括將所述靶多肽檢測(cè)到的水平按存在于同一樣品中的參比多肽的水平標(biāo)準(zhǔn)化。34.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述抗原結(jié)合分子固定在固體或半固體支持物上。35.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述抗原結(jié)合分子形成抗原結(jié)合分子空間陣列的一部分。36.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，通過免疫測(cè)定檢測(cè)與靶多肽結(jié)合的抗原結(jié)合分子的水平。37.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)產(chǎn)物或相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物是靶多肽，其水平采用與該靶多肽反應(yīng)形成反應(yīng)產(chǎn)物的至少一種底物來檢測(cè)。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，將所述靶多肽檢測(cè)到的功能活性按存在于同一樣品中的參比多肽的功能活性標(biāo)準(zhǔn)化。39.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，利用包括至少一個(gè)與基站相連接的終端站的系統(tǒng)來執(zhí)行該方法，其中所述基站用于(a)通過通信網(wǎng)絡(luò)從所述終端站接受對(duì)象數(shù)據(jù)，其中所述對(duì)象數(shù)據(jù)提供了對(duì)應(yīng)于生物學(xué)樣品中至少一種表達(dá)產(chǎn)物所檢測(cè)的或標(biāo)準(zhǔn)化的水平或功能活性參數(shù)值，和(b)將所述對(duì)象數(shù)據(jù)與代表參比樣品中至少一種相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物所檢測(cè)的或標(biāo)準(zhǔn)化的水平或功能活性的預(yù)定數(shù)據(jù)作比較，從而確定與參比樣品中相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性相比，該生物學(xué)樣品中該表達(dá)產(chǎn)物的水平或功能活性有無任何差異。40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述基站還用于診斷對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答的存在或程度。41.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述基站還經(jīng)通信網(wǎng)絡(luò)將診斷出的適應(yīng)癥傳遞至所述終端站。42.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測(cè)到異常表達(dá)表明對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答的存在或風(fēng)險(xiǎn)。43.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述測(cè)試對(duì)象是馬。44.一種治療、預(yù)防或抑制對(duì)象中產(chǎn)生應(yīng)激狀態(tài)的方法，所述方法包括檢測(cè)該對(duì)象中至少一種應(yīng)激標(biāo)記基因的異常表達(dá)，并給予該對(duì)象有效量藥物來治療或緩解癥狀或者逆轉(zhuǎn)或抑制該對(duì)象中產(chǎn)生應(yīng)激狀態(tài)，其中所述應(yīng)激標(biāo)記基因選自(a)其具有的多核苷酸表達(dá)產(chǎn)物含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的基因SEQIDNO:l、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、卯、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互補(bǔ)序列；(b)其具有的多核苷酸表達(dá)產(chǎn)物含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)其具有的多核苷酸表達(dá)產(chǎn)物含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)其具有的多核苷酸表達(dá)產(chǎn)物含有至少在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的基因。45.—種選自以下的分離的應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，或其互補(bǔ)序列；(b)含有包含以下任一序列一部分的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，其中所述部分含有該序列或互補(bǔ)序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸；(c)至少在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)或(b)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸；和(d)含有以下任一序列一部分的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，或其互補(bǔ)序列，其中所述部分含有該序列或互補(bǔ)序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸并至少在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)或(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交。46.—種含有與調(diào)控元件操作性相連的如權(quán)利要求45所述應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸的核酸構(gòu)建物，所述調(diào)控元件在宿主細(xì)胞中可操作。47.—種含有如權(quán)利要求46所述核酸構(gòu)建物的分離的宿主細(xì)胞。48.—種含有至少在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與如權(quán)利要求45所述多核苷酸雜交的核苷酸序列的探針。49.如權(quán)利要求48所述的探針，其特征在于，所述探針含有能至少在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與以下任一序列的至少一部分雜交的核苷酸序列SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，其中所述部分的長度至少為15個(gè)核苷酸。50.如權(quán)利要求49所述的探針，其特征在于，所述探針含有SEQIDNO:250-1807之一所示的序列。51.—種在其上固定有至少一種如權(quán)利要求48所述探針的固體或半固體支持物。52.以下物質(zhì)在制備用于診斷對(duì)象中對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答的存在情況的試劑盒中的應(yīng)用(i)一種或多種選自以下的應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:l、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、l卯、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互補(bǔ)序列;(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%(和至少51°/。-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、,58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、2H、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸；或(ii)一種或多種含有至少在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(i)所述應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸雜交的核苷酸序列的探針；(iii)一種或多種選自以下的應(yīng)激標(biāo)記多肽(1)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、M6、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(2)含有以下任一序列的一部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；(3)所含有的氨基酸序列與以下任一序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基至少有30%(和至少31%-至少99%及其之間所有整數(shù)百分比)相似性的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;和(4)含有以下任一序列的—部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、LV1、，A2;U、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少5個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，并且與和(l)、(2)或(3)的序列具有免疫相互作用活性的抗原結(jié)合分子具有免疫相互作用活性；或(iv)—種或多種與(iii)所述應(yīng)激標(biāo)記多肽具有免疫相互作用活性的抗原結(jié)合分子。53.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述針對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答選自身體應(yīng)激；情感障礙；焦慮癥；炎癥；疼痛；慢性疲勞綜合征；應(yīng)激誘導(dǎo)的頭痛；癌癥；人免疫缺陷病毒(HIV)感染；神經(jīng)退變性疾病；腸胃道疾??；核上麻痹；肌萎縮性側(cè)索硬化癥；免疫功能降低或免疫抑制；出血性應(yīng)激；應(yīng)激誘導(dǎo)的精神病發(fā)作；甲狀腺機(jī)能不正常綜合征；抗腹瀉激素(ADH)不適當(dāng)綜合征；暴食或肥胖癥；不育癥；頭部創(chuàng)傷；脊髓創(chuàng)傷；缺血性神經(jīng)元損傷；興奮性中毒神經(jīng)元損傷；癲癇；心血管疾??；中風(fēng)；免疫功能失調(diào)；抑制；行為(自發(fā)性)調(diào)節(jié)；肌肉痙攣；尿失禁；阿爾茨海默型早老性癡呆；多發(fā)性腦梗死性癡呆；肌萎縮性側(cè)索硬化癥；化學(xué)物質(zhì)依賴性和成癮；藥物和酒精戒除癥狀；骨質(zhì)疏松癥；社會(huì)心理侏儒癥；低血糖癥；脫發(fā)；晝夜節(jié)律異常；和晝夜節(jié)律異常相關(guān)疾病。54.—種診斷測(cè)試對(duì)象中是否存在對(duì)應(yīng)激的生理學(xué)應(yīng)答的方法，包括檢測(cè)測(cè)試對(duì)象中至少一種選自以下的應(yīng)激標(biāo)記多核苷酸的異常表達(dá)(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:l、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、或248，或其互補(bǔ)序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>247或249，其中所述部分含有該序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。全文摘要本發(fā)明公開了定性或定量測(cè)定應(yīng)激對(duì)免疫系統(tǒng)影響，因應(yīng)激導(dǎo)致免疫系統(tǒng)失調(diào)而對(duì)發(fā)生疾病或病癥易感性和監(jiān)測(cè)動(dòng)物對(duì)付應(yīng)激的能力的分子和試驗(yàn)。本發(fā)明可用于檢測(cè)對(duì)免疫調(diào)節(jié)治療的應(yīng)答，和監(jiān)測(cè)在應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)天然疾病的免疫應(yīng)答。文檔編號(hào)C07K14/47GK101133157SQ200580026241公開日2008年2月27日申請(qǐng)日期2005年6月3日優(yōu)先權(quán)日2004年6月3日發(fā)明者M(jìn)·R·托馬斯,R·B·布蘭登申請(qǐng)人:阿什洛米克斯控股有限公司