專利名稱：：蛋白質分離的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及從生物源分離蛋白質的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及從血液中分離蛋白質的方法。
背景技術：
：血漿是自然界最有價值的原材料之一，并且從血漿中純化的蛋白質是全世界許多個體的生命和健康所必需的。這其中的大部分蛋白質由Cohn冷乙醇沉淀分級分離法生產(chǎn)。該方法由哈佛大學的EdwinCohn博士在20世紀40年代早期開發(fā)。Cohn發(fā)現(xiàn)可根據(jù)不同條件(pH、離子強度、蛋白質濃度、溫度和乙醇濃度)下蛋白質的沉淀特征分離血漿中的蛋白質。通過改變這些參數(shù)，不同蛋白質以分步方式沉淀出來。Colm技術已用于血漿工業(yè)數(shù)十年，但是該方法在純度和效率方面存在一些局限性。盡管該方法可生產(chǎn)一定品質的產(chǎn)品，但是在步驟的靈活性和所生產(chǎn)產(chǎn)品的純度上存在局限性。商業(yè)上最為常見的依然使用該方法生產(chǎn)的蛋白質包括白蛋白、免疫球蛋白、抗凝血酶III、凝血酶和血纖蛋白原。生產(chǎn)血漿產(chǎn)品的一類技術進步包括層析的使用，該層析分離血漿中的蛋白質是基于液體(流動相)滲透過含固定相的封閉柱時，蛋白質分子選擇性吸附到固定固體表面(固相)。根據(jù)吸附或相互作用的效率，不同蛋白質的運動被不同程度地延緩，這使其能從柱底實現(xiàn)分離并收集。層析本質上是較傳統(tǒng)的Cohn冷乙醇法更為溫和的分離蛋白質的手段，Cohn冷乙醇法使得蛋白質暴露在高濃度乙醇中的時間更長。這就會使蛋白質變性并產(chǎn)生所不需要的聚集物，這轉而對接受這些產(chǎn)品的患者有著不利治療后果。相反，層析分級分離可有效除去雜質，而不影響到蛋白質的天然結構。與Cohn冷乙醇分級分離法中所涉及的反復大規(guī)模沉淀相比，層析是一種更直接的分離方法，它能提高每升血漿所生產(chǎn)的蛋白質的量。迄今為止已被采用的層析法在使產(chǎn)率最優(yōu)化同時維持或提高必要的純度水平方面仍具有挑戰(zhàn)性。仍然需要有效且高性價比的層析技術，該層析技術以相對于現(xiàn)有方法以更高的純度和產(chǎn)量選擇性洗脫血漿組分。20世紀60年代早期，人們注意到低溫孵育血漿時，可觀察到有沉淀物形成。已證實該沉淀物含有因子VIII、VonWillebrand因子和許多其它血漿蛋白質。最初該冷沉淀物被用于治療A型血友病患者，但是需要提高患者對該產(chǎn)品的耐受性，可采用純度更高形式的因子VIII。冷該方法效率不高，并且盡管已進行多種嘗試通過直接使用血漿而非冷沉淀物提高因子VIII的回收，但是這其中很少有嘗試在商業(yè)上獲得成功。因子IX用于治療B型血友病患者，它從上清液I——完善的Cohn血漿分級分離法的副流分一一中分離出。在基本所有的現(xiàn)有制備方法中，上清液I中的因子IX通常采用親合層析步驟使用肝素瓊脂糖凝膠(HeparinSepharose)進一步純化，但是由于整個方法是以Cohn分經(jīng)分離為基礎，所以在制備效率上依然存在著顯著的局限性。在這種情況下，仍需要從含有因子VIII和/或因子IX的混合物中分離因子VIII和/或因子IX的更為有效的方法。
發(fā)明內容根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了一種從含有蛋白質的溶液中分離所述蛋白質的方法，所述溶液選自粗制血漿、血清、來源于血漿的冷上清液、分級分離的人血漿、來源于血漿的冷沉淀物和重組肉湯(recombinantbroth),所述方法包括(i)提供具有下式的固體分離介質M-S-L其中M為基質骨架，S為任選的間隔臂，L是配體巰基煙酸；(ii)將所述固體分離介質與所述溶液相接觸，這樣至少一種所述蛋白質可逆地結合到所述固體分離介質上；(iii)進行至少一步洗脫以從該固體分離介質上選擇性洗脫至少一種蛋白質流分。下列特征涉及本發(fā)明的第一方面。在一個實施方案中，蛋白質為哺乳動物源的或人源的。間隔臂s可來源于含有環(huán)氧基的化合物(如丁二醇二環(huán)氧甘油醚(butanedioldiglycidylether)或表氯醇)或其它合適的本領i戈已知的用于共價連接配體的偶聯(lián)劑?；|骨架M可為樹脂，由此該固體分離介質為與配體起作用的樹脂。另外，該樹脂可為配體可與其連接的任何樹脂。更進一步，該樹脂可為適于諸如流化床吸附和膨脹床吸附的非填充床吸附的高密度樹脂，例如以6°/?；?%瓊脂糖為基礎的高度交聯(lián)微球樣瓊脂糖衍生物、瓊脂糖-碳化鵠凝聚物、瓊脂糖不銹鋼凝聚物、瓊脂糖-石英凝聚物、多孔陶瓷微球、多孔氧化鋯微球、控孔玻璃制成的微球以及其孔中含有有機聚合物的多孔無機材料復合孩i球。在一個實施方案中，該配體可為2-巰基煙酸(2-mercaptonicotinicacid)。由于蛋白質與配體的結合是可逆的，該蛋白質可在下述合適的洗脫條件下與固體分離介質中分離。固體分離介質可包含高密度樹脂，該樹脂平均顆粒大小介于約10微米至約150微米之間，微球密度介于約1.5g/mi至15g/ml之間，或者，平均顆粒大小介于約IO微米至約120微米之間，微球密度介于約2.0g/ml至15g/ml之間，或者，平均顆粒大小介于約15微米至約100微米之間，微球密度介于約2.3g/ml至15g/ml之間，或者，平均顆粒大小介于約15微米至約80微米之間，微球密度介于約3g/ml至15g/ml之間。通過第一方面的方法分離的蛋白質可選自例如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的免疫球蛋白，轉鐵蛋白(Tf),血纖蛋白原或其衍生物，血漿蛋白酶抑制劑例如抗凝血酶如抗凝血酶III，血液促凝固蛋白(bloodpro-coagulationprotein)，血'液抗凝固蛋白，細胞因子，生長因子，白蛋白或其衍生物，溶血栓劑，抗血管發(fā)生蛋白，胰島素或其衍生物，a-l-蛋白酶抑制劑或其衍生物例如a-l-抗胰蛋白酶，a-2-抗纖溶酶或其衍生物，C-l酯酶抑制劑，載脂蛋白，HDL,纖連蛋白或其衍生物，糖蛋白I，纖溶酶原，纖溶酶，纖溶酶原激活物，纖溶酶原抑制劑，尿激酶或其衍生物，鏈激酶或其衍生物，間-a-胰蛋白酶抑制劑，a-2-巨球蛋白，淀粉狀蛋白，血清類黏蛋白，鐵蛋白，前白蛋白，GC-球蛋白，血凝乳酶(haemopexin)和補體C3。蛋白質流分可含有一種蛋白質?；蛘?，蛋白質流分可含有多種蛋白質。該方法可包括1至50、1至30、1至20、I至IO、l至5步洗脫，1至3步或一步洗脫。在一個實施方案中，各種洗脫液可具有介于約4.0至約9.0之間的pH?；蛘撸鞣N洗脫液可具有介于約4.0至8.5之間的pH。或者，各種洗脫液可具有介于約4.0至約8.0之間的pH。另外，各種洗脫液可具有介于約5.0至約8.0之間的pH。另外，各種洗脫液可具有介于約4.5至8.0之間的pH。另外，各種洗脫液可具有介于約5.5至約8.0之間的pH。更進一步，各種洗脫液可具有介于約6.0至8.0之間的pH。各種洗脫液可具有介于約0.00005西門子/厘米(S/cm)至約10.0S/cm之間的離子強度?；蛘?，各種洗脫液可具有介于約0.0005S/cm至約10.0S/cm之間的離子強度?；蛘?，各種洗脫液可具有介于約0.0001S/cm至約6.0S/cm之間的離子強度。另外，各種洗脫液可具有介于約0.001S/cm至約5.5S/cm之間的離子強度。更進一步，各種洗脫液可具有介于約0.001S/cm至約5.0S/cm之間的離子強度。又進一步，各種洗崩L液可具有介于約0.005S/cm至約5.0S/cm之間的離子強度。再進一步，各種洗脫液可具有介于約0.01S/cm至約4.0S/cm之間的離子強度。各種洗脫液可具有上述范圍內的pH和離子強度值的任意組合。第一種洗脫液、第二種洗脫液或第三種洗脫液可具有介于約4.0至約9.0之間的pH，并具有介于約0.00005S/cm至約10.0S/cm之間的離子強度。第一種洗脫液可具有介于約4.0至約8.0之間的pH，并具有介于約0.00005S/cm至約0.1S/cm之間的離子強度。另外，第一種洗脫液可具有介于約4.5至約6.5之間的pH，并具有介于約0.00005S/cm至約0.075S/cm之間的離子強度。另外，第一種洗脫液可具有介于約5.0至約6.0之間的pH,并具有介于約0.001S/cm至約0.05S/cm之間的離子強度。第二種洗脫液可具有介于約5.0至約7.0之間的pH，并具有介于約0.0001S/cm至約0.1S/cm之間的離子強度。或者，第二種洗脫液可具有介于約5.5至約6.5之間的pH,并具有介于約0.0001S/cm至約0.075S/cm之間的離子強度。另外，第二種洗脫液可具有介于約5.5至約6.5之間的pH，并具有介于約0.001S/cm至約0.05S/cm之間的離子強度。第三種洗脫液可具有介于約5.0至約9.0之間的pH,并具有介于約0.0001S/cm至約4.0S/cm之間的離子強度?；蛘?，第三種洗脫液可具有介于約6.0至約8.0之間的pH，并具有介于約0.01S/cm至約3.0S/cm之間的離子強度。另外，第三種洗脫液可具有介于約6.0至約8.0之間的pH，并具有介于約0.05S/cm至約2.0S/cm之間的離子強度。第一種洗脫液可為不會引起蛋白質的生物學功能喪失的洗脫液，例如脫礦質水或一種或多種無才幾強酸的無才幾鹽水溶液，所述鹽例如鹽酸鹽、疏酸鹽和硝酸鹽，如氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、硫酸鈉、辟u酸鉀和硫酸銨?；蛘撸谝环N洗脫液可為含有無機酸鹽和/或有機酸鹽的緩沖水溶液，該無機酸鹽和/或有機酸鹽不會引起蛋白質的生物學功能喪失，例如含有檸檬酸鹽、醋酸鹽、琥珀酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、甲酸鹽、丙酸鹽、磷酸鹽或硼酸鹽的緩沖液。第二種洗脫液可為含有無機酸鹽和/或有機酸鹽的緩沖水溶液，該無機酸鹽和/或有機酸鹽不會引起蛋白質的生物學功能喪失，例如含有檸檬酸鹽、醋酸鹽、琥珀酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、甲酸鹽、丙酸鹽、磷酸鹽或硼酸鹽的緩沖液。在一個實施方案中，第二洗脫液含有具有非芳香族、芳香族或雜芳族疏水部分的帶負電的分子(例如中鏈至長鏈烷基羧酸和烷基磺酸)和帶負電的洗滌劑(例如十二烷基硫酸鈉和脫氧膽酸鈉)。例如，第二種洗脫液可包含一種或多種選自下列的酸的鹽己酸、庚酸、辛酸、壬酸(perlagonicacid)和癸酸、十一酸、十二酸、十三酸、十四酸和十五烷酸，以及其不飽和書f生物和烷基取^U汙生物?；蛘?，第二種洗脫液可包含一種或多種選自下列的酸的鹽己磺酸、辛磺酸、癸磺酸、十二磺酸，己烷硫酸鹽、辛烷硫酸鹽、癸烷硫酸鹽和十二烷疏酸鹽。第三種洗脫液可為含有無機酸鹽和/或有機酸鹽的緩沖水溶液，該無機酸鹽和/或有機酸鹽不會引起蛋白質的生物學活性喪失，例如含有檸檬酸鹽、醋酸鹽、琥珀酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、甲酸鹽、丙酸鹽、磷酸鹽或硼酸鹽的緩沖液?；蛘叩谌N洗脫液可含有疏液性(lyotrophobicity)相對較高的無才幾鹽或有才幾鹽，例如辟^酸銨、AH酸鈉、硫酸鉀、磷酸銨、磷酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸銨、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀。第一方面的方法可包括用第四種洗脫液洗脫固體分離介質以選擇性洗脫第四蛋白質流分。第^洗脫液可具有介于約5.0至約9.0之間的pH，并具有介于約0.01S/cm至約2S/cm之間的離子強度?；蛘?，第四種洗脫液可具有介于約6.0至約8.0之間的pH,并具有介于約0.01S/cm至約1.0S/cm之間的離子強度。另外，第四種洗脫液可具有介于約6.0至約8.0之間的pH，并具有介于約0.05S/cm至約1.0S/cm之間的離子強度。第四種洗脫液可為含有與待分離蛋白質相容的無機酸鹽和/或有機酸鹽的緩沖水溶液，例如含有檸檬酸鹽、醋酸鹽、琥珀酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、曱酸鹽、丙酸鹽、磷酸鹽或硼酸鹽的緩沖液。第四種洗脫液還可含有一種或多種無機酸特別是無機強酸的無才幾鹽的水溶液，該鹽不會引起蛋白質的生物學功能的喪失，例如鹽酸鹽、石克酸鹽和賄酸鹽，如氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、碌b酸鈉、；危酸鉀、辟u酸銨。第一蛋白質流分可包含一種或多種下列選自白蛋白、血清類黏蛋白、前白蛋白、a-l-蛋白酶抑制劑(a-l-PI)、轉鐵蛋白和血纖蛋白原的蛋白質。第二蛋白質流分可包含一種或多種下列選自抗凝血酶例如抗凝血酶III、白蛋白、免疫球蛋白、轉鐵蛋白和血纖蛋白原的蛋白質。第三蛋白質流分可包含一種或多種下列選自免疫球蛋白例如IgA、IgD、IgE、IgG和/或IgM、轉鐵蛋白和血纖蛋白原的蛋白質。第四蛋白質流分可包含一種或多種下列選自轉鐵蛋白、a-2-巨球蛋白、例如IgM的免疫球蛋白和血纖蛋白原的蛋白質。根據(jù)第二方面，本發(fā)明提供了一種從含有因子VIII和/或因子IX的溶液中分離因子VIII和/或因子IX的方法，所述溶液選自粗制血漿、血清、來源于血漿的冷上清液、分級分離的人血漿、來源于血漿的冷沉淀物和重組肉湯，所述方法包括(i)提供具有下式的固體分離介質<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中M為基質骨架、S為任選的間隔臂，L為配體苯二甲胺；(ii)將所述固體分離介質與所述溶液相接觸，這樣至少因子VIII和/或因子IX將可逆地結合到所述固體分離介質上；(iH)進行第一步洗脫以從該固體分離介質上洗脫未結合蛋白質；(iv)進行第二步洗脫以從該固體分離介質上洗脫因子VIII和/或因子IX。M可為適于諸如流化床吸附和膨脹床吸附的非填充床吸附的高密度樹脂，例如以6%或4%瓊脂糖為基礎的高度交聯(lián)微球樣瓊脂糖衍生物、瓊脂糖-碳化鴒凝聚物、瓊脂糖不銹鋼凝聚物、瓊脂糖-石英凝聚物、多孔陶乾微球、多孔氧化鋯微球、控孔玻璃制成的微球以及其孔中含有有機聚合物的多孔無機材料復合微球。該高密度樹脂具有介于約IO微米至約300微米、或約15微米至約150孩i米之間的平均顆粒大小和介于約1.1g/ml至15g/ml、或約1.5g/ml至15g/ml之間的微球密度，或者具有介于約10微米至約120微米之間的平均顆粒大小和介于約2.0g/ml至15g/ml之間的微球密度，或者具有介于約15微米至約IOO微米之間的平均顆粒大小和介于約2.3g/ml至15g/ml之間的微球密度，或者具有介于約15微米至約80微米之間的平均粒徑和介于約3g/ml至15g/ml之間的微球密度。間隔臂S可來源于含有環(huán)氧基的化合物(如丁二醇二環(huán)氧甘油醚或表氯醇)或其它合適的本領域已知的用于共價連接配體的偶聯(lián)劑。在一個實施方案中，L可為間苯二甲胺。或者L可為對苯二曱胺。L還可為鄰二曱胺。未結合蛋白質可選自但不限于IgG、IgA、IgM、IgD或IgE，轉鐵蛋白(Tf),血纖蛋白原或其衍生物，血漿蛋白酶抑制劑例如抗凝血酶如抗凝血酶III，血液促凝固蛋白，血液抗凝固蛋白，細胞因子，生長因子，白蛋白或其衍生物，溶血栓劑，抗血管發(fā)生蛋白，胰島素或其衍生物，a-l-蛋白酶抑制劑或其衍生物例如a-l-抗胰蛋白酶，a-2-抗纖溶酶或其^"生物，C-l酯酶抑制劑，載脂蛋白，HDL，纖連蛋白或其書亍生物，P-2-糖蛋白I，纖溶酶原，纖溶酶，纖溶酶原激活物，纖溶酶原抑制劑，尿激酶或其衍生物，鏈激酶或其衍生物，間-a-胰蛋白酶抑制劑，a-2-巨球蛋白，淀粉狀蛋白，血清類黏蛋白，鐵蛋白，前白蛋白，GC-球蛋白，血凝乳酶和補體C3。洗脫步驟中所-使用洗脫液可具有介于約5.0至約9.0之間的pH。該洗脫液可具有介于約0.0001S/cm至約10.0S/cm之間的傳導性。該洗脫液可具有介于約6.0至約9.0之間的pH,并具有介于約0.03S/cm至約0.2S/cm之間的傳導性。洗脫液可具有大約相同的pH而在離子強度上有所不同。例如，各種洗脫液可包含不同緩沖體系，和/或任選地包含其它鹽，例如鹽酸鹽、硫酸鹽和硝酸鹽，如氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸銨。各種洗脫液可具有上述范圍內的pH和離子強度值的任意組合。該洗脫液可含有含無機酸鹽或有機酸鹽的緩沖水溶液，該無才幾酸鹽和/或有機酸鹽不會引起因子VIII和/或因子IX的生物學功能喪失，例如含有檸檬酸鹽、醋酸鹽、琥珀酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、甲酸鹽、丙酸鹽、磷酸鹽或硼酸鹽的緩沖液。該洗脫液還可含有一種或多種無機強酸的無機鹽的水溶液，該鹽不會引起蛋白質的生物學功能丟失，例如鹽酸鹽、硫酸鹽和硝酸鹽，如氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸銨。第一種洗脫液和第二種洗脫液可具有介于約6.0至約8.0之間的pH,并具有介于約0.0001S/cm至約1.0S/cm之間的離子強度?；蛘撸谝环N洗脫液可具有介于約5.5至約6.0之間的pH,并具有介于約0.0001S/cm至約0.01S/cm之間的離子強度。另外，第一種洗脫液可具有介于約5.5至約6.0之間的pH，并具有介于約0.0001S/cm至約0.05S/cm之間的離子強度。另外，第一種洗脫液可具有介于約6.0至約6.5之間的pH,并具有介于約0.001S/cm至約0.1S/cm之間的離子強度。第二種洗脫液可具有介于約6.0至約8.0之間的pH,并具有介于約0.0001S/cm至約0.1S/cm之間的離子強度?；蛘撸诙N洗脫液可具有介于約6.0至約8.0之間的pH,并具有介于約0.0001S/cm至約0.5S/cm之間的離子強度。另外，第二種洗脫液可具有介于約7.0至約9.0之間的pH，并具有介于約0.001S/cm至約1S/cm之間的離子強度。通過控制在上面段落中所描述的洗脫液的pH和傳導性，該方法可用于從含有因子VIII和因子IX以及其它物質的溶液中分離作為混合物的因子VIII和因子IX?；蛘撸谌芤簝H含有因子VIII時(例如溶液為來源于血漿的冷沉淀物或其中僅因子VIII表達的重組肉湯時)，通過控制上面段落中所描述的洗脫液的pH和傳導性，本方法可用于僅分離因子VIII。在溶液僅含因子IX時(例如溶液為來源于血漿的冷上清液或其中僅因子IX表達的重組肉湯時)，通過控制上面段落中所描述的洗脫液的pH和傳導性，本方法可用于僅分離因子IX。圖1示出根據(jù)本發(fā)明的方法，示出分離的蛋白質流分的進一步純化。圖2示出使用根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的方法的產(chǎn)品回收率。圖3示出根據(jù)本發(fā)明的第一方面的一個實施方案的SDS-PAGE分析。圖4示出從本發(fā)明的第一方面的一個實施方案獲得的流分的單向放射免疫擴散分析。圖5示出本發(fā)明的一個實施方案，其中本發(fā)明的第一方面和第二方面被連續(xù)使用以分離某些蛋白質流分。圖6示出因子VIII吸附的所得流分的SDS-PAGE分析。泳道1示出粗制血漿，泳道2示出流出物(run-through)流分，泳道3示出因子VIII/因子IX的洗脫。將因子VIII/因子IX洗脫物相對于洗脫體積進行稀釋以便與所使用血漿直接比較，即可目視估計產(chǎn)率。圖7示出從第一方面的蛋白質分離方法獲得的蛋白質流分的SDS-PAGE分析，其中所使用原材料(含有所述蛋白質的溶液)為從第二方面的方法獲得的流出物流分。泳道l示出人血漿，泳道2示出流出物流分(a-l-PI)，泳道3示出洗脫2(白蛋白)，泳道4示出洗脫3(IgG)，泳道5示出洗脫4(血纖蛋白原)。圖8示出從第一方面的蛋白質分離方法獲得的流分的單向放射免疫擴散分析，其中所使用原材料(含有所迷蛋白質的溶液)為第二方面的方法獲得的流出物流分。流分1至4分別代表流出物流分、洗脫2、洗脫3和洗脫4。圖8A示出白蛋白的定量，圖8B示出IgG的定量。圖8A和8B的上兩行示出粗制血漿100-20%的標準曲線(兩次測定)。A和B的下兩4亍示出如下物質l:流出物流分；2:洗脫2;3r洗脫3;4:洗脫4。定義下面是一些有助于理解本發(fā)明的描述的定義。在本說明書的上下文中，術語"包含"意味著"主要包括但不必為僅僅包括"。另外，單詞"包含"的變化形式例如"包括"和"含有"具有相應的有所變化的含義。在本發(fā)明的上下文中，術語"洗脫步驟"、"洗脫"或"進行洗脫"可互換使用，旨在指獲得包含一種或多種可能已結合或未結合且隨后與固體分離介質分離的蛋白質的蛋白質流分的步驟。在本說明書的上下文中，術語"洗滌步驟"旨在指用液體沖洗固體分離介質的步驟，此步驟基本不會將任何蛋白質從固體分離介質上釋放。在本說明書的上下文中，術語"平衡步驟"旨在指這么一個步驟，其中4吏充足的溶液流過固體分離介質，這樣流出液(outgoingsolution)的反荷離子濃度、傳導性和pH大約與流入液(incomingsolution)的相同。在本說明書的上下文中，術語"重組肉湯"指由進行過遺傳操縱的細胞體外表達的可溶性蛋白質。重組肉湯中由這些被#:縱的細胞表達的蛋白質包括凝固途徑蛋白質例如因子VII、因子VIII、因子IX或因子XIII,免疫球蛋白例如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE，轉鐵蛋白(Tf)，血纖蛋白原或其衍生物，血漿蛋白酶抑制劑例如抗凝血酶如抗凝血酶III,al-蛋白酶抑制劑，血液促凝固蛋白，血液抗凝固蛋白，細胞因子，生長因子，白蛋白或其衍生物，溶血栓劑，抗血管發(fā)生蛋白，胰島素或其衍生物，a-l-蛋白酶抑制劑或其衍生物例如a-l-抗胰蛋白酶，a-2-抗纖溶酶或其衍生物，C-l酯酶抑制劑，載脂蛋白，HDL，纖連蛋白或其衍生物，P-2-糖蛋白I，纖溶酶原，纖溶酶，纖溶酶原激活物，纖溶酶原抑制劑，尿激酶或其書f生物，鏈激酶或其f斤生物，間-a-月爽蛋白酶抑制劑，a-2-巨球蛋白，淀粉狀蛋白，血清類黏蛋白，鐵蛋白，前白蛋白，GC-球蛋白，血凝乳酶和補體C3。在本說明書的上下文中，術語"血漿，，指血液的液體部分，是一種含有90%以上水的復合溶液。血漿的主要溶質為一組異質性蛋白質。其它血漿成分包括脂肪物質(脂質)、無機電解質、葡萄糖、氨基酸、維生素、激素和代謝廢物。在本說明書的上下文中，術語"血清，，指在血凝過程中除去了血纖蛋白原的血漿。在本說明書的上下文中，術語"冷上清液"和"冷沉淀物"應該根據(jù)下列描述來理解冷上清液是在除去冷沉淀物之后由血漿制得的溶液。冷沉淀物由通過將血漿暴露于rc至io'c之間溫度由血漿沉淀得到的蛋白質組成。在本說明書的上下文中，術語"分級分離的人血漿，，應理解為指代血漿的任何組分或組分的混合物，它們來源于進行例如沉淀、過濾、層析等分離處理的血漿。在本說明書的上下文中，術語"流出物"應理解為指代從本發(fā)明的第二方面獲得的蛋白質流分，包含將血漿溶液上柱時獲得的洗脫物，該洗脫物已與從第一步洗脫中獲得的洗脫物相混合。具體實施例方式蛋白質分離本發(fā)明的第一方面涉及從生物溶液中分離蛋白質的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及從人血漿、來源于人血漿的冷上清液、分級分離的人血漿、來源于人血漿、人血清或重組肉湯的冷沉淀物中分離人蛋白質的方法。含有蛋白質的溶液在與所述固體分離介質相接觸之前可用另一種合適的液體稀釋。例如，血漿可由脫礦質水或與待分離蛋白質相容的一種或多種無機強酸的無機鹽的水溶液稀釋，所述鹽例如鹽酸鹽、辟L酸鹽和硝酸鹽，如氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、好u酸鈉、；克酸鉀、》危酸銨。含有蛋白質的溶液可用另一種合適的液體以從約1000:1至約1:1000的比例稀釋。例如，稀釋比例可為約1000:1，約750:1，約500:1,約250:1，約100:1，約50:1，約25:1，約10:1，約7.5:1，約5:1，約3:1，約2.5:1,約2:1，約1:1，約1:2，約1:2.5，約1:3，約1:5，約1:7.5，約1:10，約1:25，約1:50，約1:100，約1:250，約1:500,約1:750，或約1:1000。含有蛋白質的溶液的pH可在將液體與固體分離介質接觸之前調節(jié)?；蛘?，pH可在含蛋白質的溶液與固體分離介質接觸之后調節(jié)?？缮遬H或者也可降低pH?；蛘撸墒筽H保持不變?？蓪H調為約3.0到約6.0之間的pH,或者，可將pH調節(jié)為約4.5到約6.0之間的pH。例如，可將pH調節(jié)為約pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0。pH可使用合適的酸調節(jié)，所述酸例如鹽酸、硫酸、磷酸、檸檬酸、琥珀酸、醋酸等。pH可使用合適的堿調節(jié)，所述堿例如碳酸鹽、碳酸氫鹽、氨、氫氧化物等。pH可用合適的緩沖體系調節(jié)。緩沖體系為本領域的技術人員熟知，包括例如擰檬酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽、曱酸鹽、琥珀酸鹽、MES、ADA、1，3-雙((三羥曱基)曱基氨基)丙烷(bis-trispropane)、PIPES、ACES、咪唑、MOPS、TES、HEPES、HEPPS、TRICINE、鹽酸甘氨酰胺、TRIS、BICINE、甘氨酰甘氨酸、硼酸、CHES、CAPS。許多緩沖體系可商購，可從例如SigmaChemical公司獲得。本領域的技術人員能根據(jù)所需pH確定合適的緩沖體系。洗脫液可在pH上有所不同。洗脫步驟可包括用pH逐漸升高或pH逐漸降低的洗脫液處理固體分離介質。洗脫液可具有大約相同的pH，但是在離子強度上可有所不同。例如，各個洗脫液可包含不同的緩沖體系，和/或任選包含其它鹽，例如鹽酸鹽、硫酸鹽和硝酸鹽，如氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、硫酸鈉、硫酸鉀、^危酸銨。所洗脫的每種蛋白質的產(chǎn)率可為原材料中的蛋白質的量的至少50%，或至少60%，或至少70%,或至少80%,或至少90%。洗脫步驟可在0。C至4(TC之間的溫度下進行。例如，溫度可為約5°C，約1(TC，約15。C，約20。C，約25"C，約30。C,約35"C或約40°C。第一方面的方法可任選包括一步或多步洗滌。洗滌步驟可在第一方面的方法的任何階段進行，例如在固體分離介質與含有蛋白質的'溶液相接觸之前，在固體分離介質與含有蛋白質的溶液相接觸之后，或在每步洗脫之間?？捎貌粫鸬鞍踪|的生物學功能喪失的任何溶液例如水、鹽水或緩沖溶液例如檸檬酸鹽緩沖液進行洗滌步驟。洗滌步驟可在用第二種洗脫液洗脫固體分離介質之后進行。洗滌緩沖液可包含疏液性相對較高的無4幾鹽或有才幾鹽，例如碌u酸銨、石克酸鈉、硫酸鉀、磷酸銨、磷酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸銨、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀。洗滌《差沖液的離子強度可為至少0.001S/cm，或至少0.01S/cm，或至少0.1S/cm或進一步至少1.0S/cm。第一方面的方法還可包括一步或多步平衡。平衡步驟可在將固體分離介質與所述含有蛋白質的溶液接觸之前進行。平衡步驟可包含用水或合適的緩沖溶液處理所述固體分離介質以調節(jié)固體分離介質的pH和離子強度。用于平衡步驟的溶液可為脫礦質水或與待分離蛋白質相容的一種或多種無機強酸的無機鹽的水溶液，所述鹽例如鹽酸鹽、硫酸鹽和硝酸鹽，如氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸銨?；蛘?，平衡緩沖液可為含有與待分離蛋白質相容的無機酸鹽和/或有機酸鹽的緩沖水溶液，例如含檸檬酸鹽、醋酸鹽、琥珀酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、曱酸鹽、丙酸鹽、磷酸鹽或硼酸鹽的緩沖液。平衡步驟可在約l(TC至40。C之間的溫度下進行。例如，溫度可為約10。C，約15。C，約20。C，約25。C，約30。C或約40。C。含有蛋白質的溶液的pH可與用于在將所述固體分離介質與含有蛋白質的所述溶液相接觸之前平衡固體分離介質的》爰沖溶液的pH相同。含有蛋白質的溶液的pH可與用于在將所述固體分離介質與含有蛋白質的所述溶液相接觸之前平衡固體分離介質的緩沖溶液的pH不同。第一方面的方法還可包括一步或多步再生。再生步驟包括用能將殘留物質從固體分離介質中除去的合適試劑處理固體分離介質。再生步驟可在第一步洗脫完成之后任何時間進行。合適的再生試劑包括堿例如氫氧化物溶液如氳氧化鈉或氫氧化鉀、過酸溶液或過氧化氫溶液、含有活性氯的溶液如次氯酸鹽溶液、變性劑如鹽酸胍、有^L溶劑如乙醇。根據(jù)第一方面的方法，可將固體分離介質裝入合適的層析柱裝置中。該方法可在填充床柱中以填充床模式進行。或者，該方法可在膨脹床吸附(EBA)柱中以膨脹床模式進行。在第一方面的上下文中，實際上所有的人血漿蛋白質都會被吸附到單根柱中的固體分離介質上。然后本申請所描述的連續(xù)洗脫步驟可用于選擇性洗脫富集特定蛋白質的洗脫蛋白質流分。EBA柱為本領域所熟知，并且合適的柱裝置和設備，包括將液體導入膨脹床柱的方法，可從瑞典的GEHealthcare購得，或者已在WO99/65586、WO01/85329和WO92/00799中得以描述，它們的全部內容通過交叉引用納入本申請。第一方面的一個實施方案包括選擇EBA柱以及將合適量的固體分離介質裝入柱中。所使用的固體分離介質的量取決于將要使用的含有蛋白質的溶液的量以及該蛋白質溶液中的蛋白質濃度。蛋白質溶液為人血漿或冷沉淀血漿時，一般1升固體分離介質用于每0.5到1.5升血漿。若蛋白質溶液為重組發(fā)酵肉湯時，一升固體分離介質可用于l升發(fā)酵肉湯，最高達1000L發(fā)酵肉湯。可在柱底確證流通(flowthrough)直到固體分離介質被流化。合適的柱線性流速包括范圍在0.5至20cm/min或約5cm/min至15cm/min之間的流速。然后固體分離介質可使用合適溶液(例如水、電解質水溶液或i爰沖溶液)平衡，此后可將例如血漿、血清、冷上清液、溶解的冷沉淀物或重組肉湯溶液引入柱底。溶液被負栽到固體分離介質上后，可任選進行另外的洗滌步驟。然后可進行洗脫步驟以選擇性洗脫富集特定蛋白質的蛋白質流分。每步各自的洗脫在適合選擇性洗脫包含一種或多種蛋白質的蛋白質流分的條件下進行。例如，通過改變用于各個洗脫步驟中的洗脫液的pH和/或離子強度，可洗脫不同蛋白質。可使用合適的緩沖液將洗脫液調節(jié)為具有合適的pH和離子強度。離子強度還可使用鹽調節(jié)。連續(xù)洗脫步驟可包括用pH逐漸升高的洗脫液處理固體分離介質?；蛘哌B續(xù)洗脫步驟可包括用pH逐漸降低的洗脫液處理固體分離介質。，根據(jù)第一方面的另一實施方案涉及建立含有與2-巰基煙酸起作用的瓊脂糖-碳化鴒凝聚微球的EBA柱。瓊脂糖-碳化鵠微球大小分布介于40-120微米之間，平均直徑為70微米。微球的密度為2.9g/ml。平衡步驟使用pH約為4.5的檸檬酸鹽緩沖液進行，緊隨其后的是用pH約為5.0的檸檬酸鹽緩沖液進一步平衡的步驟。然后將已由2份水稀釋并用HCl調pH為5.0的人血漿以每升固體分離介質1.5升稀釋血漿的比例應用于該柱。然后用下列緩沖溶、液洗脫該柱洗脫1.10mM檸檬酸鈉，pH5.0洗脫2.5g/升辛酸鈉和HCl，pH6.0洗脫3.1M檸檬酸鈉，pH8.0洗脫4.20mM檸檬酸鈉和0.1M氯化鈉，pH8.0然后固體分離介質用1MNaOH再生。所有操作的流速為7.5cm/分鐘，所使用的每一種溶液的量在表2給出。所4吏用洗脫液的體積一般取決于i午多相關因素，例如(i)加樣、洗滌、洗脫、再生和平衡過程中所使用的流速；(ii)所洗脫產(chǎn)品流分的數(shù)目；(iii)每步所使用洗脫液的選擇，由于洗脫液的選擇影響各個流分的產(chǎn)量和純度；(iv)各個流分之間的最佳間隔，它也對所獲得產(chǎn)品的產(chǎn)量和純度有影響；(v)固體分離介質的床高，由于固體分離介質的床高降低時通常所消耗的洗滌體積和洗脫體積減小。表2示出上述實施方案中每步的最佳溶液體積。參照圖3，從上面的實施方案可見蛋白質a-l蛋白酶抑制劑、白蛋白、IgG和血纖蛋白原可^皮有效分離。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*cv是柱體積下表3示出由SRI測定得到的相對于所使用粗制血漿的蛋白質產(chǎn)率。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>為了測定洗脫液流分1至4中各種蛋白質的相對產(chǎn)量進行單向放射免疫擴散(SRI)。圖4示出白蛋白、IgG、ct-l-蛋白酶抑制劑和凝血因子I的SRI分析。上述方法可以平穩(wěn)、可重現(xiàn)以及不復雜的方式進行。發(fā)現(xiàn)所有最終的洗脫物為澄清液體，任何一種蛋白質均無顯著變性/沉淀的跡象。SDS-PAGE和上述SRI的柱后測試未見洗脫產(chǎn)品的破壞、聚集或免疫反應性發(fā)生改變的跡象。本領域的技術人員應知道第一方面以及第二方面的方法可通過測量從柱中排出的液體的紫外吸光度監(jiān)測。蛋白質和其它UV吸收物質的存在可在進行本發(fā)明的方法的過程中檢出并定量，并且可正確收集不同蛋白質流分。同樣，對pH、傳導性和折射率的連續(xù)監(jiān)測可用于記錄和控制本發(fā)明的方法。因子VIII和/或因子IX的分離含有所述因子VIII和/或因子IX的溶液一般為粗制未稀釋的血漿，可將它與固體分離介質直接接觸?；蛘?，粗制血漿可在與所述固體分離介質接觸前用另一種合適的液體稀釋。例如，血漿可用脫礦質水或與因子VIII和/或因子IX相容的一種或多種無機強酸的無機鹽的水溶液稀釋，所述鹽例如鹽酸鹽、硫酸鹽和硝酸鹽，例如氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、碌u酸鈉、硫酸鉀、好b酸銨。含有因子VIII和/或因子IX的溶液可用另一種合適的液體以從約1000:1到1:1000的比例稀釋。例如，稀釋比例可為約1000:1，約750:1,約500:1,約250:1,約100:1，約50:1，約25:1,約10:1，約7.5:1，約約3:1,約2.5:1，約2:1,約1:1，約1:2,約1:2.5，約1:3，約1:5，約1:7.5,約1:10，約1:25,約1:50，約1:100,約1:250，約1:500,約1:750或約1:1000。含有因子VIII和/或因子IX的溶液的pH可在與固體分離介質接觸之前調節(jié)。或者，pH可在含因子vni和/或因子ix的溶液與固體分離介質接觸之后調節(jié)?？缮遬H或者也可降低pH?；蛘?，可4吏pH保持不變?？蓪H調至約5.0至約9.0之間。例如，可將pH調為約5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0的pH?？?吏用合適的酸調節(jié)pH，所述酸例如鹽酸、硫酸、磷酸、檸檬酸、琥珀酸、醋酸等。pH可使用合適的堿調節(jié)，所述堿如碳酸鹽、碳酸氫鹽、氨、氫氧化物等。pH可用合適的緩沖體系調節(jié)。緩沖體系為本領域的技術人員熟知，包括例如檸檬酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、琥珀酸鹽、MES、ADA、1，3-雙((三羥甲基)曱基氨基)丙烷、PIPES、ACES、咪唑、MOPS、TES、HEPES、HEPPS、TRICINE、鹽酸甘氨酰胺、TRIS、BICINE、甘氨酰甘氨酸、硼酸、CHES、CAPS。許多緩沖體系可商購，可從例如SigmaChemical公司獲得。本領域的技術人員能根據(jù)所需pH確定合適的緩沖體系。該方法可任選包括一步或多步洗滌。洗滌步驟可在固體分離介質與含有因子VIII和/或因子IX的溶液接觸之前進行，或者在固體分離介質與含有因子VIII和/或因子IX的溶液接觸之后進行?？捎貌粫鹨蜃覸III和/或因子IX的生物學功能喪失的任何溶液例如水、鹽水或緩沖溶液例如檸檬酸鹽緩沖液進行洗滌步驟?；蛘?，洗滌緩沖液可包含疏液性相對較高的無機鹽或有機鹽，例如疏酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、磷酸銨、磷酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸銨、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀。洗滌緩沖液可具有介于約5.0至約9.0之間的pH。洗滌緩沖液的pH可為5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8或9.0。洗滌緩沖液可具有介于約0.1mS/cm至約100mS/cm之間的傳導性?；蛘?，洗滌》爰沖液可具有介于約0.1mS/cm到約40mS/cm之間的傳導性。洗滌緩沖液還可包含不會引起蛋白質生物學功能喪失的一種或多種無機強酸的無機鹽的水溶液，所述鹽例如鹽酸鹽、硫酸鹽和硝酸鹽，例如氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、碌u酸鈉、碌b酸鉀、；琉酸銨。該方法還可包括一步或多步平衡。平衡步驟可在將固體分離介質與含有因子VIII和/或因子IX的溶液接觸之前進行。平衡步驟可包含用水或合適的緩沖溶液處理所述固體分離介質以調節(jié)固體分離介質的pH和離子強度。用于平衡步驟的溶液可為脫礦質水或與因子VIII和/或因子IX相容的一種或多種無機強酸的無機鹽的水溶液，所述鹽例如鹽酸鹽、；危酸鹽和硝酸鹽，例如氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、辟b酸鈉、發(fā)u酸鉀、硫酸銨?；蛘撸胶饩彌_液可為含有與因子VIII和/或因子IX相容的無機酸鹽和/或有機酸鹽的緩沖水溶液，例如含檸檬酸鹽、醋酸鹽、琥珀酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、甲酸鹽、丙酸鹽、磷酸鹽或硼酸鹽的緩沖液。平衡步驟可約2"C至約28'C之間的溫度下進行。例如，溫度可為約2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28。C。含有因子VIII和/或因子IX的溶液的pH與用于在將所述固體分離介質與含有因子VIII和/或因子IX的所述溶液相接觸之前平衡固體分離介質的緩沖溶液的pH相同。含有因子VIII和/或因子IX的溶液的pH可與用于在將所述固體分離介質與含有因子VIII和/或因子IX的所述溶液相接觸之前平衡固體分離介質的緩沖溶液的pH不同。本方法還可包括一步或多步再生。再生步驟包括用能將殘留物質從固體分離介質中除去的合適試劑處理固體分離介質。再生步驟可在用洗脫液洗脫所述固體分離介質以洗脫因子VIII和/或因子IX之后進4亍。合適的再生試劑包括堿，例如氫氧化物溶液如氫氧化鈉或氬IU匕鉀、過酸溶液或過氧化氳溶液、含有活性氯的溶液如次氯酸鹽溶液、變性劑如鹽酸胍、有才幾溶劑如乙醇。該方法可在填充床柱中以填充床模式進行。或者，該方法可在EBA柱中以膨脹床模式進行。如上所述，在一個實施方案中，該方法可用于從含有因子VIII和因子IX以及其它物質的溶液中分離作為混合物的因子VIII和因子IX。在該實施方案中，選用EBA柱，其中裝入了足量的固體分離介質。所使用固體分離介質的量將取決于所要使用的含有因子VIII和因子IX的溶液的量，以及該溶液中因子VIII和因子IX的濃度。蛋白質溶液為人血漿或冷沉淀血漿時，一般1升固體分離介質用于每5到30升的血漿。若蛋白質溶液為重組發(fā)酵肉湯，一升固體分離介質可用于1升發(fā)酵肉湯，最高達1000L發(fā)酵肉湯?？稍谥状_證流通直到固體分離介質3皮流化。合適的柱線性流速包括范圍在0.5cm/min到40cm/min或約3cm/min至15cm/min之間的流速。然后平衡步驟可使用合適溶液(例如水、電解質水溶液或緩沖溶液)進行，此后可將含有因子VIII和因子IX的溶液例如粗制血漿引入柱底，含有因子VIII和因子IX的溶液由此與固體分離介質相接觸。然后進行第一步洗脫以將未結合蛋白質從柱上洗脫。洗滌步驟可任選在第一步洗脫之后進行。然后進行第二步洗脫以將因子VIII和因子IX從固體分離介質上洗脫。本發(fā)明的第一方面和第二方面可以兩步法連續(xù)使用，其中第一步涉及使用發(fā)明的第二方面，用于從含有說明書第4頁所列出任何蛋白質的溶液中分離因子VIII或其與vonWillebrand因子的復合物和/或因子IX，其富集系數(shù)至少為10，第二步涉及使用發(fā)明的第一方面，用于將從第二方面的第一步獲得的未結合蛋白分離為含有例如a-l-蛋白酶抑制劑、白蛋白、IgG、抗凝血酶III和血纖蛋白原的蛋白質的流分，其所有蛋白質產(chǎn)量均很高。第二方面的方法可與其它蛋白質分離方法連續(xù)使用。例如，第二方面的方法可用于從血漿溶液中分離因子VIII和/或因子IX，并將從流出物獲得的流分中存在的殘留蛋白質用作使用各種其它分級分離方法分離其它蛋白質的原材料，所述其它蛋白質例如白蛋白、血纖蛋白原、免疫球蛋白、a-l-蛋白酶抑制劑，所述其它分級分離方法分離例如沉淀、過濾、離子交換層析等?？蓪⒈景l(fā)明方面的第一方面和第二方面的分離蛋白以合適形式如以粉末、溶液、液體形式等形成制劑。一些產(chǎn)品制劑的實例在表4中提供。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>分離蛋白質流分的其它純化方法也可根據(jù)需要或恰當?shù)赜糜诒景l(fā)明的方法中。這么一種方法可涉及包含一系列陰離子交換層析或疏水相互作用層析步驟。諸如此類的方法起著濃縮和進一步純化從本發(fā)明的方法獲得的蛋白質流分的作用。通過選擇一步或多步系列層析的最佳固定介質和洗脫條件，從本發(fā)明的方法獲得的所有蛋白質可結合到柱上。然后結合蛋白質可在不同的一組化學條件下從第二柱(secondarycolumn)上選擇性洗脫，該化學條件可引起蛋白質顯著濃縮并有可能被進一步純化。其它層析技術例如親和層析、金屬螯合層析和凝膠過濾也可單獨使用或組合使用。本發(fā)明的方法可任選包括病毒滅活步驟。例如，每種產(chǎn)品的病毒失說明書第20/32頁活/清除步驟在表5中示出，其中每種產(chǎn)品可通過本發(fā)明的方法分離。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>現(xiàn)在本發(fā)明將就下列實施例僅通過舉例詳細描述。實施例旨在用于解釋本發(fā)明，而不應該解釋為限制通篇說明書中描述公開的普遍性。實施例實施例1a-l-蛋白酶抑制劑、抗凝血酶III、血纖蛋白原、免疫球蛋白和白蛋白的分離步驟l.固體分離介質:與2-巰基煙酸起作用的瓊脂糖-碳化鎢微球。瓊脂糖-碳化鴒微球大小分布介于40-120微米之間，平均直徑為70微米。微球的密度為2.9g/ml(FastLineUFCNNSDWcat.No.:CS48,UpFrontChromatographyA/S，Copenhagen,Denmark.)。將微球裝入EBA柱(FastLine100,UpFrontChromatographyA/S,Copenhagen,Denmark)(直徑為10cm;床高設為50cm;設定床體積=3.926L)中。在溫度為25°C時，用2.5柱體積(9.8L)40mM檸檬酸鈉(pH4.5),然后用另一2.5柱體積(9.8L)40mM檸檬酸鈉(pH5.0)，以7.5cm/min線性流速進行平衡。步驟2.2L解凍人血漿由4L水以1:2比例稀釋，將含解凍人血漿的6升稀釋血漿溶液上于該柱。稀釋的血漿溶液在用于柱前其pH用1MHCll調為pH5.0,并且上樣比為每升樹脂1.5升稀釋血漿溶液。步驟3.將稀釋血漿溶液上樣后,該柱用洗脫緩沖液l洗脫，該洗脫緩沖液含有4.2柱體積(16.49L)含10mM檸檬酸鈉(pH5.0)的緩沖溶液。由此除去用于柱的稀釋血漿溶液中存在的包括95%以上a-1-蛋白酶抑制劑在內的未結合蛋白質、脂質和其它物質。步驟4.步驟3后，該柱用2.9柱體積(11.39L)含5g/L辛酸鈉/HCl的洗脫緩沖液2(pH6.0)洗脫。步驟4將白蛋白從柱上洗脫，其產(chǎn)量高于用于柱的稀釋血漿溶液中存在的白蛋白的量的95%。該步驟還洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的60。/?？鼓竔n。步驟5.如上面的步驟4所述柱洗脫之后，該柱用4.4柱體積(17.27L)含有1M檸檬酸鈉(pH8.0)的洗脫^爰沖液3洗脫。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的95。/。以上免疫球蛋白。步驟6.如上面的步驟5所述柱洗脫之后，該柱用洗脫緩沖液4(pH8.0)洗脫，該洗脫緩沖液4含有2.1柱體積(8.24L)含0.1M氯化鈉的20mM檸檬酸鈉。步驟7.如步驟6所述柱洗脫之后，該柱用1柱體積(3.926L)1M氫氧化鈉再生，并用2.5柱體積(9.8L)40mM檸檬酸鈉(pH4.5)、再2.5柱體積(9.8L)40mM檸檬酸鈉(pH5.0)再次平衡。實施例2a-l-蛋白酶抑制劑、白蛋白、免疫球蛋白和血纖蛋白原的分離，其中還包括洗滌步驟用于本實施例的固體分離介質與用于實施例1的固體分離介質相同。步驟1.在2rC溫度下,用2.5柱體積(196.3mL)40mM檸檬酸鈉(pH4.5)，以5.0cm/min的線性流速平衡EBA柱(FastLine20，UpFrontChromatographyA/S,CopenhagenDenmark)(直徑為2cm;床高為25cm;i殳定床體積=78.5mL)。步驟2.39.3mL解凍人血漿由78.5mL水以1:2比例稀釋，將含解凍人血漿的117.8mL稀釋血漿溶液上于該柱。稀釋血漿溶液在用于柱前其pH用1MHC1調為pH5.0,并且上樣比為每升樹脂1.5升血漿溶液。步驟3.將稀釋血漿溶液上樣后，該柱用3.3柱體積(259.2mL)含10mM檸檬酸鈉(pH5.0)的洗脫緩沖液1洗脫。由此除去用于柱的稀釋血漿溶液中存在的包括a-l-蛋白酶抑制劑在內的未結合蛋白質、脂質和其它物質。步驟4.上述步驟3后，該柱用2.6柱體積(204.2mL)含5g/L辛酸鈉/HCl的洗脫緩沖液2(pH6.0)洗脫。步驟4洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的白蛋白。步驟4a.如上面的步驟4所述柱洗脫之后，該柱用1.0柱體積(78.5mL)1M檸檬酸鈉(pH8.0)洗滌。步驟5.如上面的步驟4a所述柱洗滌之后，該柱用4.9柱體積(384.8mL)含有0.3M檸檬酸鈉(pH8.0)的洗脫緩沖液3洗脫。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的免疫球蛋白。步驟6.如上面的步驟5所述柱洗脫之后，該柱用洗脫緩沖液4(pH8.0)洗脫，該洗脫緩沖液4含有2.6柱體積(204.2mL)含0.1M氯化鈉的20mM檸檬酸鈉。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的血纖蛋白原。步驟7.如步驟6所述柱洗脫之后，該柱用1柱體積(78.5mL)1M氫氧化鈉再生，并用2.0柱體積(157mL)40mM檸檬酸鈉(pH4.5)再次平衡。實施例3a-l-蛋白酶抑制劑、白蛋白、轉鐵蛋白、免疫球蛋白和血纖蛋白原的分離用于本實施例的固體分離介質與用于實施例1的固體分離介質相同。步驟1.在21。C溫度下，用2.5柱體積(196.3mL)40mM檸檬酸鈉(pH5.0),以15.0cm/min的線性流速平衡EBA柱(FastLine20,UpFrontChromatographyA/S,CopenhagenDenmark)(直徑為2cm;床高為25cm;設定床體積=78.5mL)。步驟2.39.3mL解凍人血漿由78.5mL水以1:2比例稀釋，將含解凍人血漿的117.8mL稀釋血漿溶液上于該柱。稀釋血漿溶液在用于柱前其pH用1MHC1調為pH5.0，并且上樣比為每升樹脂1.5升血漿溶液。步驟3.將稀釋血漿溶液上樣后,該柱用含9.4柱體積(738.3mL)脫礦質水的洗脫緩沖液l洗脫。由此除去用于柱的稀釋血漿溶液中存在的包括100%a-l-蛋白酶抑制劑、10%白蛋白、5%轉纟失蛋白和10%凝血因子I在內的未結合蛋白質、脂質和其它物質。步驟4.上面的步驟3后，該柱用8.9柱體積(699mL)含5g/L辛酸鈉/HCl的洗脫緩沖液2(pH6.0)洗脫。步驟4從柱上洗脫了白蛋白，其產(chǎn)量為用于柱的稀釋血漿溶液中存在的白蛋白的量的90%。該步驟還洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的5。/。免疫球蛋白。步驟5.如上面的步驟4所述柱洗脫之后，該柱用9.0柱體積(706.8mL)含有0.3M檸檬酸鈉(pH8.0)的洗脫緩沖液3洗脫。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的85。/。以上免疫球蛋白。該步驟還洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的95。/。轉鐵蛋白和30。/。血纖蛋白原。步驟6.如上面的步驟5所述柱洗脫之后，該柱用洗脫緩沖液4(pH8.0)洗脫，該洗脫緩沖液4含有5.0柱體積(392.7mL)含0.1M氯化鈉的20mM檸檬酸鈉。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的60%血纖蛋白原和10%免疫球蛋白。步驟7.如步驟6所述柱洗脫之后，該柱用1柱體積(78.5mL)lM氫氧化鈉再生，并用2.0柱體積(157mL)40mM檸檬酸鈉(pH5.0)再次平衡實施例4a-l-蛋白酶抑制劑、白蛋白、免疫球蛋白、轉鐵蛋白和血纖蛋白原的分離用于本實施例的固體分離介質與用于實施例1的固體分離介質相同。步驟1.在21。C溫度下，用2.5柱體積(196.3mL)40mM檸檬酸鈉(pH5.0)，以5.0em/min的線性流速平衡EBA柱(FastLiae20，UpFrontChromatographyA/S，CopenhagenDenmark)(直徑為2cm;床高為25cm;i殳定床體積=78.5mL)。步驟2.39.3mL解凍人血漿由78.5mL水以1:2比例稀釋，將含解凍乂、血漿的117.8mL稀釋血漿溶液上于該柱。稀釋血漿溶液在用于柱前其pH用1MHC1調為pH5.0,并且上樣比為每升樹脂1.5升血漿溶液。步驟3.將稀釋血漿溶液上樣后，該柱用含6.8柱體積(533.8mL)脫礦質水的洗脫^爰沖液1洗脫。由此除去用于柱的稀釋血漿溶液中存在的包括100%a-l-蛋白酶抑制劑、10%白蛋白、5%轉4失蛋白和10%凝血因子I在內的未結合蛋白質、脂質和其它物質。步驟4.上面的步驟3所述柱洗滌之后，該柱用5.5柱體積(431.75mL)含5g/L辛酸鈉/HCl的洗脫緩沖液2(pH6.0)洗脫。步驟4從柱上洗脫了白蛋白，其產(chǎn)量為用于柱的稀釋血漿溶液中存在的白蛋白的量的90%。該步驟還洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的5%免疫球蛋白。步驟5.上面的步驟4之后，該柱用5.0柱體積(392.5mL)含有0.3M檸檬酸鈉(pH8.0)的洗脫緩沖液3洗脫。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的85。/。以上免疫J求蛋白。該步驟還洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的95%轉鐵蛋白和30%血纖蛋白原。步驟6.如上面的步驟5所述柱洗脫之后，該柱用洗脫緩沖液4(pH8.0)洗脫，該洗脫緩沖液4含有3.1柱體積(243.35mL)含0.1M氯化鈉的20mM檸檬酸鈉。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的60%血纖蛋白原和10%免疫5求蛋白。步驟7.如步驟6所述柱洗脫之后，該柱用1柱體積(78.5mL)1M氫氧化鈉再生，并用2.0柱體積(157mL)40mM檸檬酸鈉(pH5.0)再次平衡。實施例5a-l-蛋白酶抑制劑、白蛋白、免疫球蛋白、血纖蛋白原和轉鐵蛋白的分離用于本實施例的固體分離介質與用于實施例1的固體分離介質相同。步驟1.在2rC溫度下，用2,5柱體積(196.3mL)40mM檸檬酸鈉(pH5.0)，以10.0cm/min的線性流速平衡EBA柱(FastLine20，UpFrontChromatographyA/S，CopenhagenDenmark)(直徑為2cm;床高為25cm;i殳定床體積=78.5mL)。步驟2.39.3mL解凍人血漿由78.5mL水以1:2比例稀釋，將含解凍人血漿的117.8mL稀釋血漿溶液上于該柱。稀釋血漿溶液在用于柱前其pH用1MHC1調為pH5.0，并且上樣比為每升樹脂1.5升血漿溶液。步驟3.將稀釋血漿溶液上樣后，該柱用含9.5柱體積(745.75mL)脫礦質水的洗脫緩沖液1洗脫。由此除去用于柱的稀釋血漿溶液中存在的包括100%a-l-蛋白酶抑制劑、10%白蛋白、5%轉《失蛋白和10%凝血因子I在內的未結合蛋白質、脂質和其它物質。200580026695.X說明書第25/32頁步驟4.上面的步驟3之后，該柱用7.1柱體積(557.35mL)含5g/L辛酸鈉/HCl的洗脫緩沖液2(pH6.0)洗脫。步驟4從柱上洗脫了白蛋白，其產(chǎn)量為用于柱的稀釋血漿溶液中存在的白蛋白的量的90%。該步驟還洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的5。/。免疫球蛋白。步驟5.上面的步驟4之后，該柱用5.9柱體積(463.15mL)含有0.3M檸檬酸鈉(pH8.0)的洗脫緩沖液3洗脫。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的85%以上免疫球蛋白。該步驟還洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的95。/。轉鐵蛋白和30。/。血纖蛋白原。步驟6.如上面的步驟5所述柱洗脫之后，該柱用洗脫緩沖液4(pH8.0)洗脫，該洗脫緩沖液4含有3.1柱體積(243.35mL)含0.1M氯化鈉的20mM檸檬酸鈉。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的60%血纖蛋白原和10%免疫5求蛋白。步驟7.如步驟6所述柱洗脫之后，該柱用1柱體積(78.5mL)lM氳氧化鈉再生，并用2.0柱體積(157mL)40mM檸檬酸鈉(pH5.0)再次平衡。實施例6a-l-蛋白酶抑制劑、白蛋白、免疫球蛋白、轉鐵蛋白和血纖蛋白原的分離用于本實施例的固體分離介質與用于實施例1的固體分離介質相同。步驟l.在21。C溫度下，用2,5柱體積(196.3mL)40mM檸檬酸鈉(pH5.0),以20.0cm/min的線性流速平衡EBA柱(FastLine20，UpFrontChromatographyA/S,CopenhagenDenmark)(直徑為2cm;床高為25cm;i史定床體積=78.5mL)。步驟2.39.3mL解凍人血漿由78.5mL水以1:2比例稀釋，將解凍人血漿的117.8mL稀釋血漿溶液上于該柱。稀釋血漿溶液在用于柱前其pH用1MHC1調為pH5.0，并且上樣比為每升樹脂1.5升血漿溶液。步驟3.將稀釋血漿溶液上樣后，該柱用含12.6柱體積(989.1mL)脫礦質水的洗脫緩沖液1洗脫。由此除去用于柱的稀釋血漿溶液中存在的包括100%a-l-蛋白酶抑制劑在內的未結合蛋白質、脂質和其它物質。應該注意的是，顯著量的白蛋白在該步驟中也可以20cm/min的流速得以洗脫。步驟4.上面的步驟3之后，該柱用10.6柱體積(832.1mL)含5g/L辛酸鈉/HCl的洗脫緩沖液2(pH6.0)洗脫。步驟4從柱上洗脫了白蛋白，其產(chǎn)量為用于柱的稀釋血漿溶液中存在的白蛋白的量的卯％。該步驟還洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的5%免疫球蛋白。步驟5.上面的步驟4之后，該柱用6.9柱體積(541.65mL)含有0.3M檸檬酸鈉(pH8.0)的洗脫緩沖液3洗脫。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的85%以上免疫球蛋白。該步驟還洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的95。/。轉鐵蛋白和30。/。血纖蛋白原。步驟6.如上面的步驟5所述柱洗脫之后，該柱用洗脫緩沖液4(pH8.0)洗脫，該洗脫緩沖液4含有6.8柱體積(533.8mL)含0.1M氯化鈉的20mM檸檬酸鈉。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的60%血纖蛋白原和10%免疫5求蛋白。步驟7.如步驟6所述柱洗脫之后，該柱用1柱體積(78.5mL)lM氫氧化鈉再生，并用2.0柱體積(157mL)40mM檸檬酸鈉(pH5.0)再次平衡。實施例7a-l-蛋白酶抑制劑、白蛋白和IgG的分離用于本實施例的固體分離介質與用于實施例1的固體分離介質相同。步驟1.在2rC溫度下，用2.5柱體積(196.3mL)40mM檸檬酸鈉(pH4,5),以5.0cm/min的線性流速平衡EBA柱(FastLine20,UpFrontChromatographyA/S，CopenhagenDenmark)(直徑為2cm;床高為25cm;i殳定床體積=78.5mL)。步驟2.39.3mL解凍人血漿由78.5mL水以1:2比例稀釋，將含解凍,、血漿的117.8mL稀釋血漿溶液上于該柱。稀釋血漿溶液在用于柱前其pH用1MHC1調為pH5.0，并且上樣比為每升樹脂1.5升血漿溶液。步驟3.將稀釋血漿溶液上樣后,該柱用3.3柱體積(259.2mL)含10mM檸檬酸鈉(pH5.0)的洗脫l爰沖液l洗脫。由此除去用于柱的稀釋血漿溶液中存在的包括a-l-蛋白酶抑制劑在內的未結合蛋白質、脂質和其它物質。步驟4.上面的步驟3所述柱洗滌之后,該柱用2.7柱體積(211.95mL)含5g/L辛酸鈉/HCl的洗脫緩沖液2(pH6.0)洗脫。步驟4洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的白蛋白。步驟5.已刪除。步驟6.如上面的步驟4所述柱洗脫之后，該柱用洗脫緩沖液4(pH8.0)洗脫，該洗脫緩沖液4含有3.8柱體積(298.3mL)含0.1M氯化鈉的20mM檸檬酸鈉。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的IgG。步驟7.如步驟6所述柱洗脫之后，該柱用1柱體積(78.5mL)1M氫氧化鈉再生，并用2.0柱體積(157mL)40mM檸檬酸鈉(pH4.5)再次平衡。實施例8a-l-蛋白酶抑制劑、白蛋白、免疫5求蛋白和血纖蛋白原的分離，其中還包括洗滌步驟用于本實施例的固體分離介質與用于實施例1的固體分離介質相同。步驟1.在21。C溫度下，用2.5柱體積(392.5mL)40mM檸檬酸鈉(pH4.5),以5.0cm/min的線性流速平衡EBA柱(FastLine20，UpFrontChromatographyA/S，CopenhagenDenmark)(直徑為2cm;床高為25cm;i殳定床體積=78.5mL)。步驟2.39.3mL解凍人血漿由78.5mL水以1:2比例稀釋，將含解凍/、血漿的117.8mL稀釋血漿溶液上于該柱。稀釋血漿溶液在用于柱前其pH用1MHC1調為pH5.0，并且上樣比為每升樹脂1.5升血漿溶液。步驟3.將稀釋血漿溶液上樣后，該柱用2.9柱體積(455.3mL)含10mM檸檬酸鈉(pH5.0)的洗脫緩沖液l洗脫。由此除去用于柱的稀釋血漿溶液中存在的包括a-l-蛋白酶抑制劑在內的未結合蛋白質、脂質和其它物質。步驟4.上面的步驟3之后，該柱用2.8柱體積(439.6mL)含5g/L辛酸鈉/HCl的洗脫緩沖液2(pH6.0)洗脫。步驟4洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的白蛋白。步驟4a，如上面的步驟4所述柱洗脫之后，該柱用1.0柱體積(157mL)1M檸檬酸鈉(pH8.0)洗滌。步驟5.如上面的步驟4a所述柱洗滌之后，該柱用4.5柱體積(706.5mL)含有0.3M檸檬酸鈉(pH8.0)的洗脫緩沖液3洗脫。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的免疫球蛋白。歩驟6.如上面的步驟5所述柱洗脫之后，該柱用洗脫緩沖液4(pH8.0)洗脫，該洗脫緩沖液4含有1.9柱體積(298.3mL)含0.1M氯化鈉的20mM檸檬酸鈉。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的血纖蛋白原。步驟7.如步驟6所述柱洗脫之后，該柱用1柱體積(157mL)1M氫氧化鈉再生，并用1.9柱體積(298.3mL)40mM檸檬酸鈉(pH4.5)再次平衡。實施例9a-l-蛋白酶抑制劑、白蛋白、免疫球蛋白和血纖蛋白原的分離，其中還包括洗滌步驟用于本實施例的固體分離介質與用于實施例1的固體分離介質相同。步驟1.在21。C溫度下，用2.5柱體積(392.5mL)40mM檸檬酸鈉(pH4.5)，以10.0cm/min的線性流速平衡EBA柱(FastLine20，UpFrontChromatographyA/S，CopenhagenDenmark)(直徑為2cm;床高為25cm;i殳定床體積=78.5mL)。步驟2.39.3mL解凍人血漿由78.5mL水以1:2比例稀釋，將含解凍人血漿的117.8mL稀釋血漿溶液上于該柱。稀釋血漿溶液在用于柱前其pH用1MHC1調為pH5.0，并且上樣比為每升樹脂1.5升血漿溶液。步驟3.將稀釋血漿溶液上樣后,該柱用3.7柱體積(580.9mL)含10mM檸檬酸鈉(pH5.0)的洗脫緩沖液l洗脫。由此除去用于柱的稀釋血漿溶液中存在的包括a-l-蛋白酶抑制劑在內的未結合蛋白質、脂質和其它物質。步驟4.上面的步驟3之后，該柱用3.6柱體積(565.2mL)含5g/L辛酸鈉/HCl的洗脫緩沖液2(pH6.0)洗脫。步驟4洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的白蛋白。步驟4a.如上面的步驟4所述柱洗脫之后,該柱用1.0柱體積(157mL)1M檸檬酸鈉(pH8.0)洗涂。步驟5.如上面的步驟4a所述柱洗滌之后，該柱用5.4柱體積(847.8mL)含有0.3M檸檬酸鈉(pH8.0)的洗脫緩沖液3洗脫。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的免疫球蛋白。步驟6.如上面的步驟5所述柱洗脫之后，該柱用洗脫緩沖液4(pH8.0)洗脫，該洗脫緩沖液4含有1.7柱體積(266.9mL)含0.1M氯化鈉的20mM檸檬酸鈉。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的血纖蛋白原。步驟7.如步驟6所述柱洗脫之后，該柱用1柱體積(157mL)1M氫氧化鈉再生，并用2.6柱體積(408.2mL)40mM檸檬酸鈉(pH4.5)再次平衡。分析測定上述實施例的所有產(chǎn)量通過比較單向》丈射免疫擴散確定(AgneteInglldin:HandbookofImmunoprecipitation-in-GelTechniques,ed.NilsH.Axelsen,ScandinavianJournalofImmunology,Suppl.No.10，Vol17，pp.41-57，1983)。實施例10從粗制血漿中分離因子VIII和因子IX步驟l.固體分離介質:基質骨架為瓊脂糖-碳化鴒樹脂，間隔物來源于環(huán)氧基，配體為對苯二曱胺或間苯二甲胺。將微球裝入EBA柱(F;astLine10,UpFrontChromatographyA/S,Copenhagen,Denmark)(直徑為1cm;床高設為25em;設定床體積=20mL)中。在溫度為25°C時，用20mM檸檬酸鈉(pH6.0),以5.0cm/min的線性流速進行平衡。步驟2(加樣步驟).將300mL未稀釋的粗制血漿上于該柱。血漿在用于柱前其pH用1MHC1調為pH6.0，并且上樣比為每升樹脂15升血漿。步驟3(洗脫1).將血漿上樣后,該柱用9柱體積(180mL)含20mM檸檬酸鈉的洗脫緩沖液l(pH6.0)洗脫。由此除去未結合蛋白質。步驟4.然后該柱用6.4柱體積(128mL)洗滌纟爰沖液洗滌，該洗滌緩沖液含有20mM檸檬酸鈉+0.2M氯化鈉，pH為6.0。步驟5(洗脫2).上面的步驟4之后，該柱用6.0柱體積(120mL)洗脫緩沖液2洗脫，該洗脫緩沖液含有20mM檸檬酸鈉+1.0M氯化鈉，pH為8.0。該步驟洗脫了用于柱的血漿中存在的45。/。以上的因子VIII活性。該步驟還洗脫了用于柱的血漿中存在的85。/。以上的因子IX活性。步驟6.步驟5所述柱洗脫之后，該柱用1柱體積(20mL)1M氫氧化鈉再生，并用2.0柱體積(40mL)20mM檸檬酸鈉(pH6.0)再次平衡。因子VIII活性的測定使用購自Coamatic(目錄編號822585-63)的因子VIII活性試劑盒在粗制血漿和EBA蛋白質流分中測定相對因子VIII活性。使用未稀釋的(100%活性)和稀釋為初始活性的80%、60%、40%、20%和0%(空白)的粗制血漿制備標準曲線(未給出)。對來自柱的流出物、洗滌物和洗脫物(洗脫2)的流分進行了分析并通過參照標準曲線確定了洗脫物中的活性產(chǎn)率(參見表7)。從表7可見，在所使用的條件下固體分離介質結合和洗脫了45"/。的因子VIII活性。表7:因子VIII、流分體積和活性產(chǎn)率<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>因子IX抗原的測定通過使用商品抗體的因子IX夾心ELISA在粗制血漿和EBA蛋白質流分中測定相對因子IX抗原濃度。使用未稀釋(100。/。)的和稀釋為初始濃度的80%、60%、40%、20%和0%(空白)的粗制血漿制備標準曲線(未給出)。對來自柱的流出物、洗滌物和洗脫物(洗脫2)的流分進行了分析并通過參照標準曲線確定了洗脫物(洗脫2)中的抗原產(chǎn)率(參見表8)。從表8可見，在所使用的條件下固體分離介質結合和洗脫了85%因子IX抗原。表8:因子IX、流分體積和抗原產(chǎn)率<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>圖8通過SDS-PAGE示出洗脫物(洗脫2)包含極少比例所4吏用蛋白質。當為了與粗制血漿直接比較而稀釋時，僅可見IgG、白蛋白和其它蛋白的極微弱條帶，這表明相對于FVIII/FIX流分這些蛋白質的丟失不顯著。同樣，為了與粗制血漿直接比較將流出物流分稀釋，未觀察到蛋白質的顯著丟失。RID示出在流出物流分中a-l-PI和血纖蛋白原也被完全回收(未給出)。實施例11第二方面的方法與第一方面的方法的相容性為了確定先除去因子VIII和因子IX是否會對第一方面的分離方法產(chǎn)生負面影響，來自實施例10的流出物流分被用作第一方面的方法的原材料。步驟l，固體分離介質與2-巰基煙酸起作用的瓊脂糖-碳化鎢微球。瓊脂糖-碳化鴒微球大小分布介于40-120微米之間，平均直徑為70微米。農t球的密度為2.9g/ml(FastLineUFCNNSDWcat.No.:CS48，UpFrontChromatographyA/S，Copenhagen,Denmark,)。將微球裝入EBA柱(FastLine20,UpFrontChromatographyA/S，Copenhagen,Denmark)(直徑為2cm;床高設為50cm;設定床體積=157mL)。在25。C溫度下，用2.5柱體積(392.5mL)40mM檸檬酸鈉(pH4.5)，然后用另一2.5柱體積(392.5mL)40mM杼檬酸鈉(pH5.0),以線性流速為7.5cm/min進行平衡。步驟2.來自實施例10所述柱的流出物被調節(jié)為1份粗制血漿+2份水，將該流出物上于該柱。稀釋血漿溶液在用于柱前其pH用1MHCl調為pH5.0，并且上樣比為每升樹脂1.5升血漿。步驟3.將稀釋血漿溶液上樣后,該柱用3.3柱體積(518mL)含10eiM檸檬酸鈉(pH5.0)的洗脫緩沖液l洗脫。由此除去用于柱的稀釋血漿溶液中存在的包括a-l-蛋白酶抑制劑在內的未結合蛋白質、脂質和其它物質。步驟4.上面的步驟3之后，該柱用2.6柱體積(408mL)含5g/L辛酸鈉/HCl的洗脫緩沖液2(pH6.0)洗脫。步驟4洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的白蛋白。步驟4a.如上面的步驟4所述柱洗脫之后，該柱用1.0柱體積(157mL)1M檸檬酸鈉(pH8.0)洗涂。步驟5.上面的步驟4a所述柱洗滌之后，該柱用4.9柱體積(769mL)含有0.3M檸檬酸鈉(pH7.4)的洗脫緩沖液3洗脫。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的免疫球蛋白。步驟6.如上面的步驟5所述柱洗脫之后，該柱用洗脫緩沖液4(pH7.4)洗脫，該洗脫緩沖液4含有2.6柱體積(408mL)含0.1M氯化鈉的20mM檸檬酸鈉。該步驟洗脫了用于柱的稀釋血漿溶液中存在的血纖蛋白原。步驟7.步驟6所述柱洗脫之后，該柱用1柱體積(157mL)1M氫氧化鈉再生，并用2.0柱體積(314mL)40mM檸檬酸鈉(pH4.5)再次平衡。如圖7所示，由缺失因子VIII/因子IX的血漿獲得的定性條帶形式與實施例4中獲得的條帶形式相同。每個流分獲得的處理體積也與實施例4所描述的相同。圖8A-B示出不同蛋白質流分中白蛋白和IgG的定量分析，并且正如所觀察到的那樣，實際上所有白蛋白在洗脫2中回收得到，并且實際上所有IgG在洗脫3中回收得到。白蛋白和IgG在其它流分中幾乎枱r測不到。還發(fā)現(xiàn)a-l-蛋白酶抑制劑和血纖蛋白原與第一方面的方法所描述的^f亍為方式相同。這些結果表明對苯二曱胺或間苯二曱胺能以有效方式從未稀釋血漿中選擇性提取因子VIII和因子IX,并且不會顯著降低其它血漿蛋白質的水平，其它血漿蛋白質可在隨后的(一種或多種)方法如第一方面的方法中^皮分離。因子vin/因子ix的分離方法與第一方面的白蛋白/IgG/血纖蛋白原/a-1-蛋白酶抑制劑的分離方法相容。權利要求1.一種從含有蛋白質的溶液中分離所述蛋白質的方法，所述溶液選自粗制血漿、血清、來源于血漿的冷上清液、分級分離的人血漿、來源于血漿的冷沉淀物和重組肉湯，所述方法包括(i)提供具有下式的固體分離介質M-S-L其中M為基質骨架，S為任選的間隔臂，L是配體巰基煙酸；(ii)將所述固體分離介質與所述溶液相接觸，這樣至少一種所述蛋白質可逆地結合到所述固體分離介質上；(iii)進行至少一步洗脫以從該固體分離介質上選擇性洗脫至少一種蛋白質流分。2.根據(jù)權利要求l的方法，其中該溶液為粗制血漿。3.根據(jù)權利要求1或權利要求2的方法，其中M為高密度樹脂。4.根據(jù)權利要求1至3任一項的方法，其中L為2-巰基煙酸。5.根據(jù)權利要求1至4任一項的方法，其中S為包含環(huán)氧基的化合物。6.根據(jù)權利要求1至5任一項的方法，其中該至少一種蛋白質流分包含選自下列的至少一種蛋白質免疫J求蛋白例如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE，轉鐵蛋白，血纖蛋白原或其衍生物，血漿蛋白酶抑制劑例如抗凝血酶如抗凝血酶III，血液促凝固蛋白，血液抗凝固蛋白，細胞因子，生長因子，白蛋白或其衍生物，溶血栓劑，抗血管發(fā)生蛋白，胰島素或其衍生物，a-l-蛋白酶抑制劑或其書于生物例如a-l-抗月夷蛋白酶，a-2-抗纖溶酶或其衍生物，C-l酯酶抑制劑，載脂蛋白，HDL,纖連蛋白或其衍生物，P-2-糖蛋白I，纖溶酶原，纖溶酶，纖溶酶原激活物，纖溶酶原抑制劑，尿激酶或其衍生物，鏈激酶或其書f生物，間-a-胰蛋白酶抑制劑，a-2-巨球蛋白，淀粉狀蛋白，血清類黏蛋白，鐵蛋白，前白蛋白，GC-球蛋白，血凝乳酶和補體C3。7.根據(jù)權利要求6的方法，其中該至少一種蛋白質流分包含至少一種選擇下列的蛋白質免疫球蛋白、轉鐵蛋白、血纖蛋白原或其衍生物、a-l-蛋白酶抑制劑和白蛋白，或其衍生物。8.根據(jù)權利要求1至7任一項的方法，其中含有所述蛋白質的該溶液具有介于約3.0至約6.0之間的pH。9.根據(jù)權利要求8的方法，其中含有所述蛋白質的該溶液具有介于約4.5至約6.0之間的pH。10.根據(jù)權利要求1至9任一項的方法，其中第一步洗脫包括用pH介于約4至約8之間、離子強度介于約0.00005S/cm至約0.1S/cm之間的溶液洗脫該固體分離介質以洗脫第一蛋白質流分。11.根據(jù)權利要求10的方法，其中該第一蛋白質流分包含至少一種選自a-l-蛋白酶抑制劑、白蛋白、血清類黏蛋白和前白蛋白的蛋白質。12.根據(jù)權利要求IO或權利要求11的方法，其中第二步洗脫包括用pH介于約5至約7之間、離子強度介于約0.0001S/cm至約0.1S/cm之間的溶液洗脫該固體分離介質以洗脫第二蛋白質流分。13.根據(jù)權利要求12的方法，其中該溶液還包含芳香族、非芳香族或雜芳族疏水化合物。14.根據(jù)權利要求13的方法，其中該非芳香族疏水化合物為烷基羧酸鹽、磺酸鹽或帶負電的洗滌劑。15.根據(jù)權利要求12至14任一項的方法，其中該第二蛋白質流分包含至少一種選自白蛋白和免疫球蛋白的蛋白質。16.根據(jù)權利要求12至15任一項的方法，其中第三步洗脫包括用pH介于約5至約9之間、離子強度介于約0.001S/cm至約4S/cm之間的溶液洗脫該固體分離介質以洗脫第三蛋白質流分。17.根據(jù)權利要求16的方法，其中該第三蛋白質流分包含至少一種選自免疫球蛋白、轉鐵蛋白和血纖蛋白原的蛋白質。18.根據(jù)權利要求16或權利要求17的方法，其中第四步洗脫包括用pH介于約5至約9之間、離子強度介于約0.01S/cm至約2S/cm之間的溶液洗脫該固體分離介質以洗脫第四蛋白質流分。19.根據(jù)權利要求18的方法，其中該溶液還包括無機酸鹽。20.才艮據(jù)權利要求18或權利要求19的方法，其中該第四蛋白質流分包含至少一種選自轉鐵蛋白、免疫球蛋白、血纖蛋白原和a-2-巨球蛋白的蛋白質。21.權利要求1至20任一項的方法，其中所述方法在膨脹床吸附柱中以膨脹床模式進行。22.權利要求1至20任一項的方法，其中所述方法在填充床柱中以填充床模式進行。23.—種從含有因子VIII和/或因子IX的溶液中分離因子VIII和/或因子IX的方法，所述溶液選自粗制血漿、血清、來源于血漿的冷上清液、分級分離的人血漿、來源于血漿的冷沉淀物和重組肉湯，所述方法包括(i)提供具有下式的固體分離介質M-S-L其中M為基質骨架、S為任選的間隔臂，L為配體苯二曱胺；(ii)將所述固體分離介質與所述溶液相接觸，這樣至少因子VIII和/或因子IX可逆地結合到所述固體分離介質上；(iii)進行第一步洗脫以從該固體分離介質上洗脫未結合蛋白質；(iv)進行第二步洗脫以從該固體分離介質上洗脫因子VIII和/或因子IX。24.根椐權利要求23的方法，其中含有因子VIII和因子IX的溶液為凈且制血漿。25.根據(jù)權利要求23或權利要求24的方法，其中M為高密度樹脂。26.根據(jù)權利要求23至25任一項的方法，其中S為含有環(huán)氧基的化合物。27.根據(jù)權利要求23至26任一項的方法，其中第一步洗脫包括用pH介于約5.5至約6.5之間、離子強度介于約0.001S/cm至約0.02S/cm之間的溶液洗脫固體分離介質以洗脫第一蛋白質流分。28.根據(jù)權利要求27的方法，其中第二步洗脫包括用pH介于約7至約9之間、離子強度介于約0.03S/cm至約0.2S/cm之間的溶液洗脫固體分離介質以洗脫第二蛋白質流分。29.根據(jù)權利要求27或權利要求28的方法，其中該溶液還包含無機酸鹽。全文摘要一方面，本發(fā)明涉及一種從含有蛋白質的溶液中分離蛋白質的方法，其中所述溶液選自粗制血漿、血清、來源于血漿的冷上清液、分級分離的人血漿、來源于血漿的冷沉淀物和重組肉湯。本方法涉及提供具有式M-S-L的固體分離介質，其中M為基質骨架，S為任選的間隔臂，L是配體巰基煙酸；將所述固體分離介質與含有蛋白質的溶液相接觸，這樣至少一種所述蛋白將可逆地結合到所述固體分離介質。然后進行至少一步洗脫以從該固體分離介質上選擇性洗脫至少一種蛋白質流分。另一方面，本發(fā)明涉及一種分離因子VIII和/或因子IX的方法。文檔編號C07K14/755GK101111511SQ200580026695公開日2008年1月23日申請日期2005年6月6日優(yōu)先權日2004年6月7日發(fā)明者A·利赫姆申請人:Avt血漿有限公司