專利名稱：細(xì)胞表面糖蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種稱為INSP201的新型蛋白質(zhì)，在本文中將其鑒定為細(xì)胞表面糖蛋白，以及該蛋白質(zhì)和源自其編碼基因的核酸序列在診斷、預(yù)防、和治療疾病中的應(yīng)用。
本文所引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均以其全文納入本文作為參考。
背景技術(shù)：
隨著功能基因組學(xué)時(shí)代的來臨，藥物發(fā)現(xiàn)過程目前正經(jīng)歷著一場(chǎng)基礎(chǔ)性革命。術(shù)語“功能基因組學(xué)”指利用生物信息學(xué)方法將功能歸因于感興趣的蛋白質(zhì)序列的一種方法。由于序列數(shù)據(jù)產(chǎn)生的速度已快速超過研究實(shí)驗(yàn)室將功能歸因于這些蛋白序列的能力，因而越來越需要這些方法。
隨著生物信息學(xué)方法的效力和準(zhǔn)確性的提高，這些方法迅速取代了常規(guī)的生物化學(xué)特性鑒定技術(shù)。實(shí)際上，用于鑒定本發(fā)明的高級(jí)生物信息學(xué)方法目前已能輸出具有高度可信性的結(jié)果。
各研究所和商業(yè)機(jī)構(gòu)正在檢驗(yàn)他們可得到的序列數(shù)據(jù)，并在進(jìn)行這種檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上取得了重大發(fā)現(xiàn)。然而，仍然需要對(duì)其它基因和它們編碼的多肽進(jìn)行鑒定和特征分析，從而將其作為研究和發(fā)現(xiàn)藥物的靶標(biāo)。
發(fā)明介紹分泌性蛋白質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生和分泌胞外蛋白質(zhì)的能力是許多生物學(xué)活動(dòng)過程的中心。酶、生長因子、胞外基質(zhì)蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子都是由細(xì)胞分泌的。這是通過分泌囊泡與胞質(zhì)膜融合得以進(jìn)行的。在大多數(shù)但不是全部例子中，蛋白質(zhì)可通過信號(hào)肽導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而進(jìn)入分泌囊泡。信號(hào)肽是影響多肽鏈從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜結(jié)合區(qū)室compartment(例如分泌囊泡)的順式作用序列。靶向分泌囊泡的多肽或被分泌到胞外基質(zhì)中，或留在胞質(zhì)膜中。留在胞質(zhì)膜中的多肽具有一個(gè)或多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。在細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用的分泌蛋白的例子有細(xì)胞因子、激素、胞外基質(zhì)蛋白(粘附分子)、蛋白酶以及生長和分化因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于INSP201多肽是一種細(xì)胞表面糖蛋白這一發(fā)現(xiàn)的。
在本發(fā)明第一方面的一具體實(shí)施方案中，提供一種如下的多肽(i)含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ IDNO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16和/或SEQ ID NO18所示的氨基酸序列；(ii)是其片段，該片段是細(xì)胞表面糖蛋白家族成員的片段，或與(i)所述多肽具有共同的抗原決定簇；或(iii)是(i)或(ii)的功能等價(jià)物。
本發(fā)明第一個(gè)方面所述的多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO12所示的氨基酸序列。這種蛋白質(zhì)優(yōu)選包含SEQ ID NO8所示的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明第一方面的第二具體實(shí)施，提供一種多肽，其由SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16和/或SEQ ID NO18所示的氨基酸序列組成。
本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選不包括由SEQ ID NO8的前79個(gè)氨基酸組成的片段。該片段已公布在NCBI GenPept登錄號(hào)AX884746和以下在Genset名下的專利文獻(xiàn)中美國專利US20050106595、美國專利US6822072、日本專利JP2001269182、日本專利JP2002511259、歐洲專利EP1033401、PCT專利WO9953051和美國專利US6783961。具有SEQ ID NO2所示序列的多肽在下文中稱為“INSP201外顯子1多肽”。具有SEQ ID NO4所示序列的多肽在下文中稱為“INSP201外顯子2多肽”。具有SEQ ID NO6所示序列的多肽在下文中稱為“INSP201外顯子3多肽”。具有SEQ ID NO8所示序列的多肽在下文中稱為“全長INSP201多肽”。雖然申請(qǐng)人不希望受此理論的束縛，但假定INSP201多肽的前21個(gè)氨基酸組成了信號(hào)肽。
不含該假定信號(hào)肽序列的INSP201外顯子1多肽如SEQ ID NO10所示。不含該假定信號(hào)肽序列的全長INSP201多肽如SEQ ID NO12所示。
具有SEQ ID NO10所示序列的多肽在下文中稱為“INSP201外顯子1成熟多肽”。具有SEQ ID NO12所示序列的多肽在下文中稱為“INSP201成熟多肽”。
本文預(yù)測(cè)INSP201多肽包含許多可能的N-糖基化位點(diǎn)。因此，包含在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO8的Asn124、Asn156、Asn188、Asn204、Asn220、Asn250和Asn268的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或七個(gè)位點(diǎn)上具有N-糖基化修飾的INSP201多肽或由其組成的糖蛋白都屬于本發(fā)明的范圍。
本文預(yù)測(cè)INSP201多肽在SEQ ID NO8的406-427殘基之間含有一跨膜區(qū)域。因此，INSP201多肽的胞外變體也屬于本發(fā)明的范圍。這些變體所包括的胞外形式優(yōu)選包括如本文所述脫糖基和N-糖基化形式的SEQ ID NO8的1-405氨基酸殘基或SEQ ID NO8的22-405氨基酸殘基，或由它們構(gòu)成。具有SEQ ID NO14所示序列的多肽在下文中稱為“INSP201胞外多肽”。具有SEQ ID NO18所示序列的多肽在下文中稱為“INSP201成熟胞外多肽”，但不包括預(yù)測(cè)的構(gòu)成INSP201多肽信號(hào)肽的氨基酸。
這種類型的多肽變體具體可用于配體篩選試驗(yàn)，例如能與INSP201或該類型中其它蛋白質(zhì)相結(jié)合的分泌性配體的篩選。這種變體還可用于定量測(cè)定這類配體，例如用于診斷這些配體和這種多肽發(fā)揮重要作用的疾病。
INSP201多肽的胞內(nèi)變體也屬于本發(fā)明的一個(gè)方面。該變體是由SEQ IDNO8的428-518氨基酸殘基構(gòu)成的多肽。具有SEQ ID NO16所示序列的多肽在下文中稱為“INSP201胞內(nèi)多肽”。
本文所用術(shù)語“INSP201多肽”包括包含以下的多肽INSP201外顯子1多肽、INSP201外顯子2多肽、INSP201外顯子3多肽、全長INSP201多肽、INSP201外顯子1成熟多肽、INSP201成熟多肽、INSP201胞外多肽、INSP201成熟胞外多肽和INSP201胞內(nèi)多肽。所有這些多肽均屬于本發(fā)明范圍。
本發(fā)明第一方面的上述具體實(shí)施方案的多肽優(yōu)選作為分泌蛋白，尤其是作為細(xì)胞表面糖蛋白家族的成員行使功能。
細(xì)胞表面糖蛋白在人類生物學(xué)、生理學(xué)和健康中倍受關(guān)注。毫無疑問，細(xì)胞膜外表面在裝配和維持組織完整性上起著重要作用。發(fā)育和分化細(xì)胞的外表面含有能識(shí)別系統(tǒng)信號(hào)、配體或激素的受體分子。配體的結(jié)合和解離控制著細(xì)胞的某些分化功能，使其與整個(gè)系統(tǒng)的需求相協(xié)調(diào)。細(xì)胞外表面還覆蓋有糖蛋白和蛋白聚糖。蛋白質(zhì)和多糖的這些大復(fù)合體提供了組織特異性基質(zhì)，功能類似的細(xì)胞在其中作為連接組織共同行使功能。在胚胎發(fā)生時(shí)，通過細(xì)胞的糖蛋白和蛋白聚糖表面的分子特異性，有利于分選和聯(lián)合具有共同功能的細(xì)胞和可能對(duì)其進(jìn)行控制。
糖鏈以N-和O-糖苷鍵連接于糖蛋白而形成復(fù)合體結(jié)構(gòu)。事實(shí)上，N-和O-聚糖鏈?zhǔn)峭ㄟ^服從于特定調(diào)控事件(例如基因表達(dá)水平或酶定位)的受控順序糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶加工反應(yīng)()而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中裝配。這種復(fù)雜的調(diào)控導(dǎo)致產(chǎn)生數(shù)百種(組織)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞/組織類型或發(fā)育/分化狀態(tài)各不相同。
對(duì)糖基化缺陷所導(dǎo)致的疾病和用重組DNA技術(shù)路線生產(chǎn)治療性糖蛋白的興趣日益增長。特別是患病細(xì)胞可能具有與正常細(xì)胞特性不同的這些相關(guān)結(jié)構(gòu)部分，因而可用其來評(píng)估疾病所處階段和診斷疾病?？衫眉膊√禺愋蕴堑鞍椎慕Y(jié)構(gòu)及其功能的知識(shí)進(jìn)行治療、免疫治療、阻斷細(xì)胞粘附、或干擾其它結(jié)合或生物學(xué)過程(Brockhausen I等，Acta Anat.1998；161(1-4)36-78；Bhatia PK和Mukhopadhyay A，Adv Biochem Eng Biotechnol.1999；64155-201)。
例如已研究了糖基化/糖蛋白的表達(dá)與癌發(fā)展/惡變(Dennis JW等，Biochim Biophys Acta.1999年12月6；1473(1)21-34)或遺傳性疾病(DennisJW等，Bioessays，1999年5月；21(5)412-21)之間的關(guān)系。
由于糖蛋白通常表達(dá)為糖形混合物，已開發(fā)了各種技術(shù)來獲得進(jìn)行糖蛋白生物學(xué)研究相關(guān)實(shí)驗(yàn)所需的均一糖肽和糖蛋白物質(zhì)(Grogan MJ等，AnnuRev Biochem.2002；71593-634)。
許多細(xì)胞表面糖蛋白會(huì)受到細(xì)胞蛋白酶的限制性蛋白水解作用。這種水解脫落機(jī)制使胞外結(jié)構(gòu)域得以分泌，而這些胞外結(jié)構(gòu)域可能影響到它們所識(shí)別的其它循環(huán)蛋白的結(jié)合活性。實(shí)際上，脫落的胞外結(jié)構(gòu)域通過改變細(xì)胞對(duì)外源刺激的細(xì)胞應(yīng)答而參與了許多病理生理學(xué)過程，例如炎癥、細(xì)胞退變和凋亡及腫瘤形成，如已在細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體系統(tǒng)中受到廣泛研究的那些胞外結(jié)構(gòu)域(Mullberg J等，Eur Cytokine Netw，2000年5月；11(1)；27-28；Arribas J和Merlos-Suarez A Curr Top Dev Biol，2003；54125-44；DelloSbarba P和Rovida E；Biol Chem，2002年1月；383(1)69-83)。
本發(fā)明第一個(gè)方面所述的多肽還可包含組氨酸標(biāo)記。優(yōu)選組氨酸標(biāo)記位于該多肽的C末端。組氨酸標(biāo)記優(yōu)選包含1-10個(gè)組氨酸殘基(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)殘基)。更優(yōu)選組氨殘基包含6個(gè)組氨酸殘基。
本發(fā)明的“抗原決定簇”可以是本發(fā)明多肽中能與抗體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，或與T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合的部分?；蛘?，“抗原決定簇”可以是本發(fā)明多肽表面上的能與單個(gè)抗體分子結(jié)合的位點(diǎn)。通常，抗原具有多個(gè)或許多不同的抗原決定簇，能與許多不同特異性的抗體反應(yīng)。所述抗體優(yōu)選對(duì)本發(fā)明的多肽(不是融合蛋白的一部分)具有免疫特異性。所述抗體優(yōu)選對(duì)INSP201或其片段具有免疫特異性?？乖瓫Q定簇通常由分子表面的化學(xué)活性分組(例如氨基酸或糖側(cè)鏈)組成，其具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征及特定的電荷特征?！翱乖瓫Q定簇”宜指本發(fā)明多肽上具有抗原性的特殊化學(xué)基團(tuán)，例如其能誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。
本發(fā)明的第二方面提供編碼本發(fā)明第一方面所述多肽的純化核酸分子。
術(shù)語“純化核酸分子”優(yōu)選指如下的本發(fā)明的核酸分子1)當(dāng)從來源細(xì)胞中分離總核酸時(shí)，已去除了天然伴隨存在的至少50％的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類或其它物質(zhì)的本發(fā)明的核酸分子，2)不連接有該“純化核苷酸分子”天然連接的所有多核苷酸或其一部分的本發(fā)明的核酸分子，3)操作性連接于并非其天然連接的多核苷酸的本發(fā)明的核酸分子，或4)不是天然產(chǎn)生的較大多核苷酸序列的一部分的本發(fā)明的核酸分子。本發(fā)明分離的核酸分子優(yōu)選基本上不含其它的污染性核酸分子，或其天然環(huán)境中存在的其它污染物，它們可能干擾本發(fā)明分離的核酸分子在生產(chǎn)多肽中的用途或其在治療、診斷、預(yù)防或研究中的應(yīng)用。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，特別將基因組DNA分子排除在本發(fā)明范圍之外。優(yōu)選將大于10kbp(千堿基對(duì))、50kbp、100kbp、150kbp、200kbp、250kbp或300kbp的基因組DNA排除在本發(fā)明范圍之外?！凹兓怂岱肿印眱?yōu)選只包括cDNA。
所述純化核酸分子優(yōu)選包含如下所示的核酸序列SEQ ID NO1(編碼INSP201外顯子1多肽)、SEQ ID NO3(編碼INSP201外顯子2多肽)、SEQ IDNO5(編碼INSP201外顯子3多肽)、SEQ ID NO7(編碼INSP201多肽)、SEQID NO9(編碼INSP201外顯子1成熟多肽)、SEQ ID NO11(編碼INSP201成熟多肽)、SEQ ID NO13(編碼INSP201胞外多肽)、SEQ ID NO15(編碼INSP201胞內(nèi)多肽)或SEQ ID NO17(編碼INSP201成熟胞外多肽)所示核酸序列或這些序列中任何一條的片段或冗余等價(jià)物。
本發(fā)明還提供由如下所示核酸序列構(gòu)成的純化核酸分子SEQ IDNO1(編碼INSP201外顯子1多肽)、SEQ ID NO3(編碼INSP201外顯子2多肽)、SEQ ID NO5(編碼INSP201外顯子3多肽)、SEQ ID NO7(編碼INSP201多肽)、SEQ ID NO9(編碼INSP201外顯子1成熟多肽)、SEQ IDNO11(編碼INSP201成熟多肽)、SEQ ID NO13(編碼INSP201胞外多肽)、SEQ ID NO15(編碼INSP201胞內(nèi)多肽)或SEQ ID NO17(編碼INSP201成熟胞外多肽)所示的核酸序列，或這些序列中任何一條的片段或冗余等價(jià)物組成的純化核酸分子。
第三方面，本發(fā)明提供能在高嚴(yán)緊條件下與本發(fā)明第二方面所述核酸分子雜交的純化核酸分子。高嚴(yán)緊雜交條件定義為在含50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉))、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×denhardts溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml經(jīng)變性剪切的鮭魚精子DNA的溶液中，于42℃孵育過夜，隨后在約65℃用0.1×SSC洗滌濾膜。
如本文所用，“功能等價(jià)物”指功能或結(jié)構(gòu)特征與本發(fā)明的多肽或核酸分子基本相似的蛋白質(zhì)或核酸分子。蛋白質(zhì)的功能等價(jià)物可含有修飾，這取決于該修飾對(duì)執(zhí)行特定功能的必要性。術(shù)語“功能等價(jià)物”意味著包括該分子的片段、突變體、雜交體、變體、同類物或化學(xué)衍生物。
“功能等價(jià)物”優(yōu)選是顯示具有本發(fā)明多肽的一種或多種功能活性的蛋白質(zhì)或核酸分子。
“功能等價(jià)物”優(yōu)選是在測(cè)定生物學(xué)活性或功能的適當(dāng)試驗(yàn)中與INSP201或及片段相比，具有基本上相似活性的蛋白質(zhì)或核酸分子?！肮δ艿葍r(jià)物”優(yōu)選是在測(cè)定生物學(xué)活性或功能的適當(dāng)試驗(yàn)中與INSP201或及片段相比，具有相同或更高活性的蛋白質(zhì)或核酸分子?！肮δ艿葍r(jià)物”優(yōu)選是在測(cè)定生物學(xué)活性或功能的適當(dāng)試驗(yàn)中與INSP201或其片段相比，具有50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，99％，100％或更高活性的蛋白質(zhì)或核酸分子。
“功能等價(jià)物”優(yōu)選是在體內(nèi)或體外具有與本發(fā)明多肽基本上相似活性的蛋白質(zhì)或多肽?！肮δ艿葍r(jià)物”優(yōu)選是能與其它細(xì)胞或胞外分子以與本發(fā)明的多肽相應(yīng)部分基本上相似的方式相互作用的蛋白質(zhì)或多肽。例如，“功能等價(jià)物”在免疫試驗(yàn)中應(yīng)能阻礙抗體(該抗體是抗本發(fā)明多肽的相應(yīng)肽的抗體)與本發(fā)明多肽的相應(yīng)肽(即該肽的氨基酸序列已經(jīng)修飾而成為“功能等價(jià)物”)結(jié)合、或與本發(fā)明的多肽本身結(jié)合。等摩爾濃度的該功能等價(jià)物可消除上述相應(yīng)肽的結(jié)合至少約5％，優(yōu)選約5-10％，更優(yōu)選約10-25％，還要優(yōu)選約25-45％，最優(yōu)選約40-50％的結(jié)合。
例如功能等價(jià)物可以具有全部功能或缺失一種或多種活性中的功能。因此，在本發(fā)明中，變體可能會(huì)影響反映其身份是細(xì)胞表面糖蛋白的多肽活性的功能(如活性)()。第四方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明第二或第三方面所述核酸分子的載體(例如表達(dá)載體)。
第五方面，本發(fā)明提供一種采用本發(fā)明第四方面所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
第六方面，本發(fā)明提供能與本發(fā)明第一方面所述細(xì)胞表面糖蛋白家族成員特異性結(jié)合的配體。所述配體優(yōu)選能抑制本發(fā)明第一方面所述作為細(xì)胞表面糖蛋白家族成員的多肽的功能。本發(fā)明多肽的配體可以來源于多種形式，包括天然或修飾的物質(zhì)、酶、受體、有機(jī)小分子(例如天然或合成的高達(dá)2000Da的有機(jī)分子，優(yōu)選800Da或更小)、模擬肽、無機(jī)分子、肽、多肽、抗體、及上述物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能模擬物。
第七方面，本發(fā)明提供一種化合物，所述化合物能有效改變編碼本發(fā)明第一方面所述多肽的天然基因的表達(dá)，或調(diào)節(jié)本發(fā)明第一方面所述多肽的活性。這種化合物可用本文所述的試驗(yàn)和篩選方法鑒定。
本發(fā)明第七方面所述的化合物可以增加(激動(dòng))或降低(拮抗)所述基因的表達(dá)水平或所述多肽的活性。
重要的是，INSP201多肽功能的鑒定使設(shè)計(jì)的篩選方法得以鑒定到能有效治療和/或診斷疾病的化合物。在這種性質(zhì)的篩選方法中可能特別有用的是INSP201多肽的胞外或胞內(nèi)形式?？捎眠@類方法鑒定本發(fā)明第六方面和第七方面所述的配體和化合物。本發(fā)明包括這些方法。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是利用INSP210基因或多肽作為靶標(biāo)，來篩選候選的藥物調(diào)節(jié)劑，尤其是對(duì)細(xì)胞表面糖蛋白相關(guān)疾病具有活性的候選藥物。
本發(fā)明還有一個(gè)方面是篩選治療細(xì)胞表面糖蛋白相關(guān)疾病的化合物的方法，包括測(cè)定某化合物結(jié)合INSP210基因或多肽或它們的片段的能力。
本發(fā)明還有一個(gè)方面是篩選治療細(xì)胞表面糖蛋白相關(guān)疾病的化合物的方法，包括測(cè)試(該化合物)調(diào)節(jié)INSP210基因或多肽或它們的片段的活性。
第八方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述多肽，或本發(fā)明第二、三方面所述核酸分子，或本發(fā)明第四方面所述載體，或本發(fā)明第五方面所述宿主細(xì)胞，或本發(fā)明第六方面所述的配體，或本發(fā)明第七方面所述的化合物在治療和診斷細(xì)胞表面糖蛋白家族成員相關(guān)疾病中的應(yīng)用。這類疾病可包括細(xì)胞增殖疾病(包括腫瘤，黑色素瘤，肺、結(jié)腸直腸、乳腺、胰腺、腦、頭頸和其它實(shí)體腫瘤)，骨髓增殖性疾病(如白血病、非何杰金淋巴瘤、白血球減少癥、血小板減少癥、血管新生疾病、卡波齊肉瘤)，自身免疫/炎癥疾病(包括變態(tài)反應(yīng)、炎癥性腸病、關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和呼吸道炎癥、哮喘、器官移植排斥)，心血管疾病(包括高血壓、水腫、心絞痛、動(dòng)脈硬化、血栓、敗血癥、休克、灌注損傷和局部缺血)，神經(jīng)疾病(包括中樞神經(jīng)疾病、阿爾茨海默病、腦損傷、肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化癥和疼痛)，呼吸道疾病(包括慢性阻塞性肺病和囊腫性纖維化)，發(fā)育疾病，代謝疾病(包括糖尿病、骨質(zhì)疏松癥和肥胖)，艾滋病和腎病，感染(包括病毒感染、細(xì)菌感染、真菌感染和寄生蟲感染)和其它病理狀態(tài)。所述疾病優(yōu)選是細(xì)胞表面糖蛋白相關(guān)疾病。這些分子也可用于制造治療這些疾病的藥物。這些分子還可用于節(jié)育，或治療生殖性疾病，包括不育。
本發(fā)明的部分(即本發(fā)明第一方面所述的多肽，本發(fā)明第二、三方面所述的核酸分子，本發(fā)明第四方面所述的載體，本發(fā)明第五方面所述的宿主細(xì)胞，本發(fā)明第六方面所述的配體，本發(fā)明第七方面所述的化合物)具體可用于治療和診斷涉及炎癥、細(xì)胞退變和凋亡及腫瘤發(fā)生等疾病/障礙(本文中這兩個(gè)術(shù)語可互換使用)。
第九方面，本發(fā)明提供一種診斷病人疾病的方法，該方法包括評(píng)估所述病人組織中本發(fā)明第一方面所述多肽的天然編碼基因的表達(dá)水平，或本發(fā)明第一方面所述多肽的活性，并將所述表達(dá)水平或活性與對(duì)照水平作比較，當(dāng)表達(dá)水平與所述對(duì)照水平不同時(shí)，表明患有疾病。這種方法優(yōu)選在體外實(shí)施?？刹捎妙愃品椒▉肀O(jiān)測(cè)對(duì)病人疾病的治療效果，當(dāng)通過一段時(shí)期治療，所述多肽或核酸分子的表達(dá)水平或活性向著對(duì)照水平改變，表明疾病的消退。
檢測(cè)本發(fā)明第一方面所述多肽的方法優(yōu)選包括以下步驟a)在適合形成配體-多肽復(fù)合物的條件下，使本發(fā)明第六方面所述的配體(如抗體)與生物樣品接觸；b)檢測(cè)所述復(fù)合物。
如技術(shù)熟練的讀者所知的那樣，本發(fā)明第九方面所述的方法存在許多可檢測(cè)蛋白水平異常的不同方法，例如核酸與短探針雜交、點(diǎn)突變分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和利用抗體的方法?？捎妙愃品椒ㄔ诙唐诨蜷L期基礎(chǔ)上監(jiān)測(cè)對(duì)病人疾病的治療效果。本發(fā)明還提供可用于這些方法中來診斷疾病的試劑盒。
第十方面，本發(fā)明提供將本發(fā)明第一方面所述的多肽作為細(xì)胞表面糖蛋白的用途。本發(fā)明多肽作為細(xì)胞表面糖蛋白的合適用途，包括用作細(xì)胞生長、代謝或分化的調(diào)節(jié)劑，用作受體/配體對(duì)的一部分，和用作生理或病理狀況的診斷標(biāo)記。
第十一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含與藥物學(xué)上可接受的運(yùn)載體相聯(lián)合的本發(fā)明第一方面所述多肽，或本發(fā)明第二、三方面所述核酸分子，或本發(fā)明第四方面所述載體，或本發(fā)明第五方面所述宿主細(xì)胞，或本發(fā)明第六方面所述配體，或本發(fā)明第七方面所述化合物。
第十二方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述多肽，或本發(fā)明第二、三方面所述核酸分子，或本發(fā)明第四方面所述載體，或本發(fā)明第五方面所述宿主細(xì)胞，或本發(fā)明第六方面所述配體，或本發(fā)明第七方面所述化合物在制造診斷或治療疾病的藥物中的應(yīng)用，這些疾病包括但不限于骨髓增殖性疾病，如白血病、淋巴瘤、骨髓發(fā)育不良綜合癥和癌癥；腫瘤，黑色素瘤、肺、結(jié)腸直腸、乳腺、胰腺、腦、頭頸和其它實(shí)體腫瘤；血液疾病，如巨球蛋白血癥；自身免疫疾病和炎癥疾病，包括變態(tài)反應(yīng)、炎癥腸病、關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、多發(fā)性硬化癥和呼吸道炎癥、哮喘和器官移植排斥、B細(xì)胞疾??；心血管疾?。簧窠?jīng)疾?。话l(fā)育疾??；生殖疾??；代謝疾?。籄IDS；腎?。桓腥竞推渌±頎顩r。
第十三方面，本發(fā)明提供治療病人疾病的方法，該方法包括給予病人本發(fā)明第一方面所述多肽，或本發(fā)明第二、三方面所述核酸分子，或本發(fā)明第四方面所述載體，或本發(fā)明第五方面所述宿主細(xì)胞，或本發(fā)明第六方面所述配體，或本發(fā)明第七方面所述的化合物。
當(dāng)某疾病患者中編碼本發(fā)明第一方面所述多肽的天然基因的表達(dá)水平或本發(fā)明第一方面所述多肽的活性低于健康者的表達(dá)水平或活性時(shí)，給予該病人的所述多肽、核酸分子、配體或化合物應(yīng)為激動(dòng)劑。相反，當(dāng)某疾病患者中編碼本發(fā)明第一方面所述多肽的天然基因的表達(dá)水平或本發(fā)明第一方面所述多肽的活性高于健康者的表達(dá)水平或活性時(shí)，給予該病人的多肽、核酸分子、配體或化合物應(yīng)為拮抗劑。這種拮抗劑的例子包括反義核酸分子、核酸酶和配體(例如抗體)。
INSP201多肽是細(xì)胞表面糖蛋白，因而在許多疾病狀態(tài)中都能發(fā)揮作用。對(duì)INSP201多肽的拮抗劑特別感興趣，因?yàn)樗鼈兲峁┝苏{(diào)節(jié)這些疾病狀態(tài)的方法。
第十四方面，本發(fā)明提供了經(jīng)轉(zhuǎn)化而能表達(dá)較高水平、較低水平或不表達(dá)水平的本發(fā)明第一方面所述多肽的轉(zhuǎn)基因的或基因敲除的非人動(dòng)物。這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是研究疾病的非常有用的模型，并可用于鑒定能有效治療或診斷這類疾病的化合物的篩選方案中。
實(shí)施本發(fā)明時(shí)可采用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和方法總結(jié)如下。應(yīng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法，方案，細(xì)胞系，載體和試劑。也應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語目的是描述具體的實(shí)施方式，不應(yīng)認(rèn)為此術(shù)語要限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的內(nèi)容只受附加權(quán)利要求書的限制。
本說明書中采用了核苷酸和氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)縮寫詞。
除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施將采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的分子生物學(xué)，微生物學(xué)，重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。
這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已有充分解釋。以下為特別適合的參考文獻(xiàn)舉例Sambrook，《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第2版(Molecular CloningA LaboratoryManual，1989)；《DNA克隆》(DNA Cloning)第I和第II卷(D.N Glover編，1985)；《寡核苷酸合成》(Oligonucledtide Synthesis，M.J.Gait編.1984)；《核酸雜交》(Nucleic Acid Hybridization，B.D.Hames&S.H.Higgins編.1984)；《轉(zhuǎn)錄和翻譯》(Transcription and Translation，B.D.Hames&S.H.Higgins編.1984)；《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》(Animal Cell Culture，R.I.Freshney編.1986)；《固定細(xì)胞和酶》(Immobilized Cells and Enzymes，IRLPress，1986)；B.Perbal，《分子克隆實(shí)踐指南》(A Practical Guide to MolecularCloning，1984)；《酶學(xué)系列方法》(the Methods in Enzymology series，Academic Press，Inc.)特刊154&155；《哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體》(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells，J.H.Miller和M.P.Calos編.1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；《細(xì)胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法》(Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology，Mayer和Walker，編.1987，Academic Press，London)；Scopes，(1987)《蛋白質(zhì)純化原理和實(shí)踐》(Protein PurificationPrinciples and Practice，第2版，Springer Verlag，N.Y.)和《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)》(Handbook ofExperimental Immunology，第I-IV卷，D.M.Weir和C.C.Blackwell編.1986)。
本文所用術(shù)語“多肽”包括由兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸通過肽鍵或修飾的肽鍵相連接的任何肽或蛋白質(zhì)，即肽的電子等排物。此術(shù)語指短鏈(肽和寡肽)和長鏈(蛋白質(zhì))。
本發(fā)明的多肽可以是成熟蛋白形式，或可經(jīng)切除其前、原、前原部分后而活化產(chǎn)生活性成熟多肽的前蛋白、原蛋白、前原蛋白形式。這種多肽的前、原、前原序列可以是前導(dǎo)序列或分泌序列，或可利這些序列來純化成熟多肽序列。
本發(fā)明第一方面所述的多肽可形成融合蛋白的一部分。例如，包含一個(gè)或多個(gè)額外的氨基酸通常是有利的，這些氨基酸可包含分泌或前導(dǎo)序列、原序列、有助于純化的序列、或賦予蛋白質(zhì)更高的穩(wěn)定性(例如在重組生產(chǎn)中)的序列?；蛘呋虼送?，成熟多肽可與另一化合物融合，例如，與可延長該多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合。
本發(fā)明第一方面所述多肽的融合蛋白可以包括例如，免疫球蛋白，即此融合蛋白是胞外INSP201(例如INSP201-EC)的全部或片段與免疫球蛋白的全部或一部分融合。制備免疫球蛋白融合蛋白的方法是本領(lǐng)域熟知的，例如見WO 01/03737中所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)明白，本發(fā)明所得的融合蛋白基本上保留了本發(fā)明第一方面所述多肽的生物學(xué)活性，例如IL-2抑制作用，這可用實(shí)施例6所述的體外試驗(yàn)，或?qū)嵤├?所述的癌癥試驗(yàn)，或?qū)嵤├?所述的炎性腸病動(dòng)物模型來檢測(cè)。融合可以是直接融合，或可通過長度短至1-3個(gè)氨基酸殘基或更長一點(diǎn)(如5、7、9、11或13個(gè)氨基酸殘基)的短接頭肽融合。所述接頭可以是例如被導(dǎo)入到本發(fā)明第一方面所述多肽序列與免疫球蛋白序列之間的三肽序列E-F-M(Glu-Phe-Met)，或含Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13個(gè)氨基酸接頭序列。所產(chǎn)生的融合蛋白具有改進(jìn)的性能，例如在體液中的存留時(shí)間(半衰期)延長，特異活性增加，表達(dá)水平提高，或易于對(duì)該融合蛋白進(jìn)行純化。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面所述的多肽與Ig分子的恒定區(qū)融合，例如與免疫球蛋白的Fc部分融合。例如，其優(yōu)選與重鏈區(qū)(如CH2和CH3結(jié)構(gòu)域)融合，任選與人IgG1的絞鏈區(qū)融合。Fc部分可經(jīng)突變以防止不需要的活性，例如與補(bǔ)體結(jié)合，與Fc受體結(jié)合等。
產(chǎn)生包含本發(fā)明第一方面所述多肽和免疫球蛋白一部分的特異性融合蛋白的描述可見，例如WO 99/09063的實(shí)施例11中所述。Ig分子的其它同功型也適合用于產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白，例如同功型IgG2或IgG4，或其它類Ig，例如IgM或IgA。融合蛋白可以是單體或多聚體，異質(zhì)或同質(zhì)多聚體。
本發(fā)明第一方面所述多肽的其它融合蛋白，可通過與分離自能形成或二聚體，三聚體等的其它蛋白的結(jié)構(gòu)域相融合來制備。能使本發(fā)明多肽多聚化的蛋白質(zhì)序列的例子是分離自諸如hCG(WO 97/30161)、膠原X(WO04/33486)、C4BP(WO 04/20639)、Erb蛋白(WO 98/02540)或卷曲螺旋肽(WO01/00814)的結(jié)構(gòu)域。這些多肽可包含除編碼基因的20個(gè)氨基酸以外的氨基酸，它們是通過天然加工(如翻譯后加工)或本領(lǐng)域熟知的化學(xué)修飾技術(shù)來進(jìn)行修飾的。在本發(fā)明多肽中存在的常見已知修飾可以是糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸化、γ羧化(例如谷氨酸殘基的γ羧化)、羥化和ADP-核糖基化。其它可能的修飾包括乙?；Ⅴ；?、氨基化、共價(jià)連接黃素、共價(jià)連接血紅素部分、共價(jià)連接核苷酸或核苷酸衍生物、共價(jià)連接脂質(zhì)衍生物、共價(jià)連接磷脂酰肌醇、交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫鍵、去甲基化、形成共價(jià)交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲?；?、形成GPI錨定、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解、磷酸化、異戊二烯基化、外消旋化、硒化、RNA轉(zhuǎn)移介導(dǎo)的蛋白質(zhì)的氨基酸添加(例如精氨?；?和泛素化。
此類修飾可發(fā)生在多肽的任何位點(diǎn)，包括肽骨架、氨基酸支鏈和氨基或羧基末端。事實(shí)上，共價(jià)修飾而封閉多肽的氨基或羧基末端或兩末端在天然和合成多肽中常見，這種修飾可存在于本發(fā)明多肽中。
多肽的修飾通常與如何制備該多肽密切相關(guān)。對(duì)于重組制備的多肽，其修飾的性質(zhì)和程度主要取決于具體宿主細(xì)胞的翻譯后修飾能力和所述多肽氨基酸序列之中存在的修飾信號(hào)。例如，糖基化模式在不同類型的宿主細(xì)胞中有所不同。
本發(fā)明的多肽可用任何合適的方式制備。這種多肽包括分離的天然產(chǎn)生的多肽(如從培養(yǎng)細(xì)胞純化)、重組產(chǎn)生的多肽(包括融合蛋白)，合成產(chǎn)生的多肽或這些方法的組合產(chǎn)生的多肽(例如見Bray 2003，Nat Rev DrugDiscov，2(7)587-93)；Casi&Hilvert 2003，Curr Opin Struct Biol，13(15)589-94)。
本發(fā)明第一方面所述多肽的功能等價(jià)物可以是INSP201多肽的同源物。如本文所用術(shù)語，當(dāng)兩條多肽中一條多肽的序列與另一多肽的序列具有足夠高程度的相同性或相似性，就將這兩種多肽稱為“同源”?！跋嗤浴敝竷蓷l多肽序列之間進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)，氨基酸殘基相同的任何特定部位。“相似性”指兩條多肽序列之間進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)，氨基酸殘基類型相似的任何特定部位。不難計(jì)算相同性或相似性程度(《計(jì)算機(jī)分子生物學(xué)》ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.，編，Oxford University Press，NewYork，1988；《生物計(jì)算機(jī)信息學(xué)和基因組方案》Biocomputing.Informaticsand Genome Projects，Smith，D.W.，編.，Academic Press，New York，1993；《序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析》Computer Analysis of Sequence Data，第1部分，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，編，Humana Press，New Jersey，1994；《分子生物學(xué)的序列分析》Sequence Analvsis in Molecular Biology，vonHeinje，G.，Academic Press，1987；和《序列分析引物》Sequence AnalysisPrimer，Gribskov，M.和Devereux，J.編，M Stockton Press，New York，1991)。
因此，同源多肽包括INSP201多肽的天然生物學(xué)變體(例如產(chǎn)生該多肽物種的地理學(xué)變體或等位基因變體)和突變體(如包含氨基酸取代、插入、缺失的突變體)。這些突變可包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基取代(優(yōu)選保守氨基酸殘基取代)的多肽，被取代的氨基酸殘基可以是或不是基因密碼子所編碼。通常這種取代發(fā)生在Ala，Val，Leu和Ile之間；Ser和Thr之間；酸性殘基Asp和Glu之間；Asn和Gln之間；堿性殘基Lys和Arg之間；或芳香殘基Phe和Tyr之間。特別優(yōu)選的是變體中存在幾個(gè)(如5-10之間、1-5之間、1-3之間、1-2之間)或只有1個(gè)氨基酸的任何組合性取代、缺失或添加。尤其優(yōu)選的是不會(huì)改變?cè)摰鞍踪|(zhì)性能和活性的沉默取代、添加和缺失。對(duì)于這點(diǎn)還要特別優(yōu)選的是保守性取代。這種突變體還包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基含有取代基團(tuán)的多肽。
根據(jù)本發(fā)明，任何取代應(yīng)優(yōu)選“保守”或“安全”取代，即通常定義的能導(dǎo)入化學(xué)性質(zhì)充分相似的氨基酸的取代(如堿性陽電荷氨基酸應(yīng)用另一堿性陽電荷氨基酸取代)，以保留該分子的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。根據(jù)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和/或序列的統(tǒng)計(jì)學(xué)和物理化學(xué)研究，文獻(xiàn)提供了許多進(jìn)行選擇性保守氨基酸取代的模式(Rogov SI和Nekrasov AN，2001)。蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)表明，利用氨基酸的特定亞組可產(chǎn)生可折疊的活性蛋白質(zhì)，這有助于氨基酸“同義”取代的分類，這種取代更容易被蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)所容納，可用來檢測(cè)功能和結(jié)構(gòu)同源物及旁系同源物(paralogs)(Murphy LR等，2000)。表1中列出了同義氨基酸的分組和更優(yōu)選的同義氨基酸分組。
出于不同目的，可在本發(fā)明多肽中導(dǎo)入特定的非保守突變。降低細(xì)胞表面糖蛋白親和力的變突能增強(qiáng)該蛋白的重新利用和再循環(huán)能力，還可能提高其治療效力(Robinson CR，2002)。可利用最終存在于本發(fā)明多肽中的免疫原性表位來開發(fā)疫苗(Stevanovic S，2002)，或用已知的選擇性突變方法修飾它們的序列去除免疫原性表位以提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，并對(duì)它們進(jìn)行修正(van denBurg B和Eijsink V，2002；WO 02/05146，WO 00/34317，WO 98/52976)。
表2中列出了模擬肽所含氨基酸衍生物的優(yōu)選另一種同義分組。氨基酸衍生物的未詳盡列表還包括氨基異丁酸(Aib)、羥基脯氨酸(Hyp)、1，2，3，4-四氫異喹啉-3-COOH，二氫吲哚-2-羧酸、4-二氟-脯氨酸、L-四氫噻唑-4-羧酸、L-高脯氨酸、3，4-脫氫-脯氨酸、3，4-二羥基苯丙氨酸、環(huán)己基甘氨酸和苯基甘氨酸。
“氨基酸衍生物”指除了編碼基因的20個(gè)天然氨基酸以外的氨基酸或氨基酸樣化學(xué)存在物。具體說，氨基酸衍生物可包括取代或非取代、線性、分支、或環(huán)狀烷基部分，也可含一個(gè)或多個(gè)雜原子?？蓮念^制備或從商業(yè)來源獲得氨基酸衍生物(Calbiochem-Novabiochem AG，瑞士；Bachem，USA)。
利用體外和體內(nèi)翻譯系統(tǒng)在蛋白質(zhì)中摻入非天然氨基酸衍生物以標(biāo)記探針和/或改進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的各種方法學(xué)見文獻(xiàn)中所述(DoughertyDA，2000))。合成和開發(fā)模擬肽和非模擬肽的技術(shù)也是本領(lǐng)域熟知的(Golebiowski A等，2001；Hruby VJ和Balse PM，2000；Sawyer TK，在《基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)》中所述“Structure Based Drug Design”，Veerapandian P編，Marcel Dekker Inc.，出版.557-663頁，1997)。
兩條多肽之間的相同性大于30％時(shí)，通常認(rèn)為它們是功能等價(jià)物。本發(fā)明第一方面所述的多肽功能等價(jià)物優(yōu)選與INSP201多肽或其活性片段具有大于80％的序列相同性。更優(yōu)選的多肽分別具有大于85％，90％，95％，98％或99％的序列相同性。
本發(fā)明第一方面所述多肽的功能等價(jià)物也可為一種或多種用結(jié)構(gòu)比對(duì)技術(shù)鑒定的多肽。例如，可采用構(gòu)成用于產(chǎn)生BiopendiumTM檢索數(shù)據(jù)庫的檢索工具一方面的Inpharmatica Genome Threader技術(shù)(參見PCT申請(qǐng)WO01/69507)來鑒定與INSP201多肽相比雖然只有低序列相同性的，但預(yù)測(cè)()為細(xì)胞表面糖蛋白家族成員(由于與INSP201序列具有顯著結(jié)構(gòu)同源性)的目前功能未知的多肽?！帮@著結(jié)構(gòu)同源性”指經(jīng)Inpharmatica Genome Threader預(yù)測(cè)兩蛋白質(zhì)之間具有明確的10％和更高的結(jié)構(gòu)同源性。
本發(fā)明第一方面所述多肽還包括INSP201多肽的片段和INSP201多肽功能等價(jià)物的片段，只要這些片段是細(xì)胞表面糖蛋白家族的成員或與INSP201多肽具有共同的抗原決定簇。
本文所用術(shù)語“片段”指()所含氨基酸序列與INSP201多肽或其功能等價(jià)物的氨基酸序列有一部分而非全部相同的多肽。所述片段應(yīng)至少包含該序列的n個(gè)連續(xù)氨基酸，并取決于具體序列，此n個(gè)優(yōu)選7個(gè)或更多個(gè)(例如8，10，12，14，16，18，20個(gè)或更多)。小片段可形成抗原決定簇。
本發(fā)明片段的最小長度優(yōu)選為6、10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500個(gè)氨基酸。
本發(fā)明片段的最大長度優(yōu)選為517、515、510、500、475、450、400、350、300、250、200、150、100或50個(gè)氨基酸。
編碼本發(fā)明片段的核酸分子最小長度優(yōu)選為18、30、75、150、300、450、600、750、900、1050、1200、1350或1500個(gè)核苷酸。
編碼本發(fā)明片段的核酸分子最大長度優(yōu)選為1551、1545、1530、1500、1425、1350、1200、1050、900、750、600、450、300或150個(gè)核苷酸。
本發(fā)明多肽最長優(yōu)選為518、520、550、600、650、700、800、900、1000、1250、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000個(gè)氨基酸。
編碼本發(fā)明多肽的核酸最長優(yōu)選為1554、1560、1750、1800、1950、2100、2400、2700、3000、5000、7500、10000、20000、30000、50000、75000或100000個(gè)核苷酸。
全長INSP201多肽的諸片段可分別由INSP201多肽序列中的2個(gè)或所有3個(gè)相鄰的外顯子序列組合而成。
這種片段可以是“獨(dú)立的”，即不是其它氨基酸或多肽的一部分或不融合于其它氨基酸或多肽，或它們可包含在更大的多肽中構(gòu)成更大多肽的一部分或一區(qū)域。當(dāng)包含在更大的多肽中時(shí)，本發(fā)明的片段最優(yōu)選形成一個(gè)連續(xù)的區(qū)域。例如，某些優(yōu)選實(shí)施方案涉及含有與該片段氨基末端相融合的前和/或原-多肽區(qū)域的片段，和/或含有與該片段羧基末端相融合的附加區(qū)域的片段。然而，幾種片段也可包含在一個(gè)更大的多肽中。
可利用本發(fā)明的多肽或它們的免疫原性片段(包含至少一個(gè)抗原決定簇)來產(chǎn)生對(duì)多肽具有免疫特異性的配體(例如多克隆或單克隆抗體)?？衫眠@種抗體來分離或鑒定表達(dá)本發(fā)明多肽的克隆或用親和層析純化這些多肽。在其它應(yīng)用中，還可將所述抗體用作診斷或治療的輔助，這對(duì)于技術(shù)熟練讀者是很顯而易見的。
術(shù)語“免疫特異性”指所述抗體對(duì)本發(fā)明多肽具有比其對(duì)該領(lǐng)域先前其它相關(guān)多肽高得多的親和力。本文所用術(shù)語“抗體”指能與所討論的抗原決定簇結(jié)合的完整分子及其片段，例如Fab，F(xiàn)(ab′)2和Fy。因此，這種抗體能結(jié)合本發(fā)明第一方面所述的多肽。
“高得多的親和力”指對(duì)本發(fā)明多肽的親和力與對(duì)已知分泌蛋白的親和力相比有可衡量(measurable)的增加。
優(yōu)選對(duì)本發(fā)明多肽的親和力比與對(duì)已知的分泌蛋白(例如細(xì)胞表面糖蛋白家族成員)的親和力高1.5-倍、2-倍、5-倍、10-倍、100-倍、103-倍、104-倍、105-倍、106-倍或更高。
優(yōu)選對(duì)本發(fā)明多肽的親和力和對(duì)已知的細(xì)胞表面糖蛋白的親和力相比有可衡量的增加。
如需要多克隆抗體，可用本發(fā)明第一方面所述多肽來免疫所選的哺乳動(dòng)物，例如小鼠、家兔、山羊或馬。用于免疫動(dòng)物的多肽可用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)或化學(xué)合成。如需要可將該多肽與載體蛋白偶聯(lián)?？苫瘜W(xué)偶聯(lián)多肽的常用載體包括牛血清白蛋白，甲狀腺球蛋白和匙孔血藍(lán)蛋白。然后用偶聯(lián)的多肽來免疫動(dòng)物。收集免疫動(dòng)物血清，按已知方法，例如免疫親和層析處理。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也不難產(chǎn)生抗本發(fā)明第一方面所述多肽的多克隆抗體。眾所周知采用雜交瘤技術(shù)制備多克隆抗體的通用方法(例如參見Kohler，G.和Milstein，C.，Nature 256495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today472(1983)；Cole等，《單克隆抗體和癌癥治療》Monochonal Antibodies andCancer Therapy，77-96頁，Alan R.Liss，Inc.(1985))。
可篩選抗本發(fā)明第一方面所述多肽的諸單克隆抗體的各種性能，例如同種型、表位、親和力等。單克隆抗體在純化它們所針對(duì)的各多肽中尤為有效?；蛘撸捎美绫绢I(lǐng)域已知的PCR技術(shù)從雜交瘤中分離得到編碼感興趣單克隆抗體的基因，將其克隆后在合適的載體中表達(dá)。
也可采用連接了非人可變區(qū)或具有與人恒定區(qū)相融合的非人可變區(qū)的嵌合抗體(例如參見Liu等，Proc Natl.Acad.Sci.USA，84，3489(1987))。
可修飾抗體以降低其在個(gè)體中的免疫原性，例如通過人源化(參見Jones等，Nature，321522(1986)；Verhoeyen等，Science，2391534(1988)；Kabat等，J Immunol，1471709，1991；Queen等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，8610029(1989)；Gorman等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，88，34181(1991)；和Hodgson等，Bio/Techonlogy，9421(1991))。術(shù)語“人源化抗體”本文用于指非人供者抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的CDR氨基酸和所選的其它氨基酸已被人抗體的等價(jià)氨基酸取代的抗體分子。因此人源化抗體分子與人抗體密切相似但具有供者抗體的結(jié)合能力。
還有一種情況，所述抗體可以是“雙特異性抗體”抗體，其具有兩個(gè)不同抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域針對(duì)不同的表位。
可利用噬菌體展示技術(shù)，從PCR擴(kuò)增的人淋巴細(xì)胞(獲自篩選具有相關(guān)抗體的人)V基因庫，或從原初庫中選擇對(duì)本發(fā)明多肽具有結(jié)合活性的抗體編碼基因(McCafferty，J.等，(1990)，Nature 348552-554；Marks，J等，(1992)Biotechonlogy 10779-783)。還可通過鏈改組改進(jìn)這些抗體的親和力(Clackson，T.等，(1991)Nature 352624-628)。
上述技術(shù)產(chǎn)生的抗體，不論是多克隆抗體或單克隆抗體，另一用途是可用作免疫試驗(yàn)、放射性免疫試驗(yàn)(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的試劑。在這些應(yīng)用中，可用可分析檢測(cè)試劑，例如放射性同位素、熒光分子或酶來標(biāo)記的抗體。
通?？赏ㄟ^多次皮下或腹膜內(nèi)注射INSP201多肽和佐劑，在動(dòng)物(例如家兔和小鼠)中產(chǎn)生針對(duì)本發(fā)明多肽的多克隆抗體?？蓪⒈景l(fā)明多肽與在所免疫動(dòng)物種類中具有免疫原性的載體蛋白(如匙孔血藍(lán)蛋白、血清、白蛋白、牛甲狀腺蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)偶聯(lián)后使用。另外，可利用凝聚劑(如明礬)來增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。免疫后，采集動(dòng)物血液，并檢測(cè)抗INSP201抗體的滴度。
可采用連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的任何方法產(chǎn)生針對(duì)本發(fā)明多肽的單克隆抗體。制備單克隆抗體的適合方法的例子包括雜交瘤方法和人B細(xì)胞雜交瘤方法。本發(fā)明還提供可產(chǎn)生能與INSP201多肽反應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
可修飾本發(fā)明的單克隆抗體用于治療。一實(shí)施方案是“嵌合”抗體，此嵌合抗體的重鏈(H)和/或輕鏈(L)的一部分與特定物種所產(chǎn)生抗體的相應(yīng)序列相同或相對(duì)應(yīng)，或?qū)儆谀程囟贵w類型或亞類，而此鏈的其余部分與另一物種所產(chǎn)生抗體的相應(yīng)序列相同或相對(duì)應(yīng)，或?qū)儆诹硪豢贵w類型或亞類。也包括這類抗體的片段，只要它們顯示具有所需的生物學(xué)活性。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體是人源化抗體。通常，人源化抗體含有一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)入的非人類來源的氨基酸殘基。人源化可用本領(lǐng)域已報(bào)導(dǎo)的方法實(shí)施，例如將嚙齒動(dòng)物互補(bǔ)性決定區(qū)的至少一個(gè)部分替換成人抗體的相對(duì)應(yīng)區(qū)域。
術(shù)語“抗體”或“免疫球蛋白”意味包括多克隆抗體和單克隆抗體。優(yōu)選的抗體是能與抗原反應(yīng)的單克隆抗體。術(shù)語“抗體”還意味包括能與抗原反應(yīng)的一種以上抗體的混合物(例如能與抗原反應(yīng)的不同類型單克隆抗體的混合物)。術(shù)語“抗體”還意味包括全抗體，其生物學(xué)功能片段、單鏈抗體，和遺傳改造的抗體(例如其組成部分來自一種以上物種的嵌合抗體)、雙功能抗體、偶聯(lián)抗體、人源化和人抗體。采用的生物學(xué)功能抗體片段也可以是抗體的那些能與抗原充分結(jié)合的肽片段。本文所用的抗體包括全抗體和能結(jié)合表位、抗原或感興趣抗原片段的任何抗體片段(如F(ab)′)2、Fab′、Fab、Fv)。
“純化抗體”指基本上沒有與其天然伴隨的其它蛋白質(zhì)、糖類和脂質(zhì)的抗體。這種抗體能“優(yōu)先結(jié)合”本發(fā)明的INSP201多肽(或其抗原性片段)，即基本上不識(shí)別和結(jié)合其它無關(guān)抗原分子。本發(fā)明的純化抗體優(yōu)選能與特定物種的免疫特異性INSP201具有免疫反應(yīng)性，更優(yōu)選對(duì)天然的人INSP201具有免疫特異性。
“特異性結(jié)合”指抗體能與特定多肽(即INSP201)高親合力(avidity)和/或高親和力結(jié)合?？贵w與該特定多肽上的其表位的結(jié)合，優(yōu)選強(qiáng)于該抗體與其它任何抗原表位的結(jié)合。與INSP201特異性結(jié)合的抗體也可能與其它多肽以微弱但可檢測(cè)的水平結(jié)合(例如為等于或少于與感興趣多肽結(jié)合的10％)。這種微弱結(jié)合或背景結(jié)合，例如可采用適當(dāng)?shù)膶?duì)照，不難與特異性抗體與感興趣化合物或多肽的結(jié)合相區(qū)別。
優(yōu)選(所述抗體)對(duì)本發(fā)明多肽的親和力大于對(duì)INSP201家族其它已知成員的親和力至少1.5-倍、2-倍、5-倍、10-倍、100-倍、103-倍、104-倍、105-倍或106-倍。
術(shù)語“遺傳改造的抗體”指氨基酸序列不同于天然抗體的氨基酸序列的抗體。由于重組DNA技術(shù)與本發(fā)明的相關(guān)性，不需要限制在天然抗體中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列，而可重新設(shè)計(jì)抗體來獲得所需的特性。可能有許多變化，范圍包括從只改變一個(gè)氨基酸或少量氨基酸到完全重新設(shè)計(jì)(例如)可變區(qū)或恒定區(qū)。通常改變恒定區(qū)以改進(jìn)或改變(抗體的)特性，例如補(bǔ)體固定、與膜反應(yīng)和其它效應(yīng)器功能。也可改變可變區(qū)以改進(jìn)其抗原結(jié)合特性。
術(shù)語“人源化抗體”或“人源化免疫球蛋白”指該免疫球蛋白含有一個(gè)人抗體框架，優(yōu)選至少一個(gè)或所有的非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，而其恒定區(qū)與人免疫球蛋白的恒定區(qū)基本相同，即至少約85-90％相同，優(yōu)選至少95％相同。因此除了CDR外，人源化免疫球蛋白的所有部分，與一種或多種天然人免疫球蛋白序列的相應(yīng)部分基本上相同。例如參見Queen等.，美國專利5,5310,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370(各專利內(nèi)容全部納入作參考)。
“完全人源化抗體”指包含人免疫球蛋白可變區(qū)和恒定區(qū)的分子。當(dāng)需要對(duì)慢性和復(fù)發(fā)性疾病(如自身免疫疾病)進(jìn)行重復(fù)治療時(shí)，完全人源化抗體可能具有治療用途。制備完全人抗體的一種方法包括小鼠的體液免疫系統(tǒng)的“人源化”，即通過將人免疫球蛋白(Ig)基因座導(dǎo)入內(nèi)源Ig基因已失活的小鼠來產(chǎn)生能生產(chǎn)人Ig的小鼠品系(異種鼠，Xenomice)。Ig基因座就其最終產(chǎn)生廣泛的免疫應(yīng)答反應(yīng)所必需的物理結(jié)構(gòu)、基因重排和表達(dá)過程而言，非常復(fù)雜?？贵w的多樣性主要是通過Ig基因座中的不同V、D和J基因的重排組合而產(chǎn)生。這些基因座還包含間插的調(diào)控元件，它們控制著抗體的表達(dá)、等位基因排斥、類別轉(zhuǎn)換和親和力成熟。能在小鼠中導(dǎo)入非重排的人Ig轉(zhuǎn)基因證明小鼠的重組機(jī)制與人基因相容。此外，可從抗原免疫的Xenomice小鼠獲得分泌不同同種型抗原特異性人抗體的雜交瘤。
完全人源化抗體和生產(chǎn)它們的方法是本領(lǐng)域知道的(Mendez等.，NatureGenetics 15146-156(1997)；Buggemann等.，Eur.J.Immunol.211323-1326(1991)；Tomizuka等.，Proc.Acad Sci.USA 97722-727(2000)專利WO 98/24893)。
術(shù)語“嵌合抗體“指其恒定區(qū)來自一種物種(通常為人)抗體而可變區(qū)來自另一種物種(通常為嚙齒動(dòng)物)抗體的抗體。因此，嵌合抗體是其不同部分源自不同種動(dòng)物的抗體分子，例如那些具有衍生自鼠單克隆抗體可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體分子。嵌合抗體的主要用途是降低應(yīng)用中的免疫原性和提高產(chǎn)量，例如雜交瘤產(chǎn)生的鼠單克隆抗體產(chǎn)量高，但在人體中免疫原性較強(qiáng)，故采用人/鼠嵌合單克隆抗體。嵌合抗體及其生產(chǎn)方法是本領(lǐng)域眾所周知的(Cabilly等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813273-3277(1984)；Morrison等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984)；Boulianne等.，Nature 312643-646(1984)；Cabilly等.，歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?25023(1984年11月14日公布)；Neuberger等.，Nature 314268-270(1985)；Taniguchi等.，歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?71496(1985年2月19日公布)；Morrison等.，歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?73494(1986年3月5日公布)；Neuberger PCT申請(qǐng)WO8601533(1986年3月13日公布)；Kudo等歐洲專利申請(qǐng)184187(1986年6月11日公布)；Sahagan等.，J.Immunol.1371066-1074(1986)；Robinson等.，國際專利申請(qǐng)?zhí)朩O8702671(1987年5月7日公布)；Liu等.，Proc.Natl.Acad.Sci USA843439-3443(1987)；Sun等.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 84214-218(1987)；Better等.，Science 2401041-1043(1988)；Riechmann等.，Nature 332323-327以及Harlow和Lane，《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》ANTIBODIESA LABORATORYMANUAL，同上。這些參考文獻(xiàn)全部納入本文作參考。
本文所用短語“抗體片段”指含有抗體中能與抗原、抗原決定簇或表位特異性結(jié)合部分的分子。應(yīng)知道，本文所用的Fab、F(ab)′)2和其它抗體片段可按照本文所述全抗體分子的使用方法，用于檢測(cè)和定量它們的抗原。常用酶蛋白水解切割而產(chǎn)生這些片段，如用木瓜蛋白酶產(chǎn)生Fab片段，或用胃蛋白酶產(chǎn)生F(ab)′)2片段。
關(guān)于本文全文所提及的抗體，術(shù)語“單克隆抗體”意味包括單克隆抗體、嵌合抗體、完全人源化抗體、針對(duì)抗獨(dú)特型抗體的抗體(抗-抗-Id抗體)，這些抗體可以溶液或結(jié)合形式標(biāo)記，以及用已知技術(shù)(例如但不限于酶切、肽合成或重組技術(shù))產(chǎn)生的它們的片段。單克隆抗體包含抗原特異性抗體的基本上同類()抗體群，該抗體群含有基本上相似的表位結(jié)合位點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過已知方法獲得單克隆抗體。例如參見Kohler和Milstein，Nature，256495-497(1975)；美國專利4,376,110；Ausubel等編.，Harlow和Lane《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；和Colligan等編.，《免疫學(xué)中的當(dāng)前策略》Current Protocols in Immunology，Greene PublishingAssoc.和Wiley Interscience N.Y.，(1992-1996)，這些文獻(xiàn)全部納入本文參考文獻(xiàn)。這類抗體可以是任何類型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD和它們的亞類?？蓪a(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤在體外、原位或體內(nèi)培養(yǎng)。生產(chǎn)方法優(yōu)選在體內(nèi)或原位產(chǎn)生高滴度的單克隆抗體。術(shù)語“單克隆抗體”還指完整的分子及其片段，例如能與抗原結(jié)合的Fab和F(ab))2。Fab和F(ab)′)2片段因?yàn)闆]有全抗體的Fc片段，在循環(huán)中更快被清除，與全抗體相比其非特異性組織結(jié)合少。(Wahl等，J.Nucl.Med.24316-325(1983))。
單克隆抗體若能與某分子發(fā)生特異性反應(yīng)而使該分子與抗體結(jié)合，就說該單克隆抗體“能結(jié)合”該分子。
“抗原”是抗體能與之結(jié)合的分子或分子的一部分，抗原還能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生能與該抗原某表位結(jié)合的抗體?？乖删哂幸粋€(gè)或多個(gè)表位。上述特異性反應(yīng)意指抗原的某表位與其相應(yīng)抗體以高選擇性方式反應(yīng)，而不與其它抗原所誘導(dǎo)的多種其它抗體發(fā)生反應(yīng)。
本發(fā)明所用的抗體，包括抗體片段，可用來定量或定性檢測(cè)樣品中它們的抗原，或檢測(cè)是否存在表達(dá)它們抗原的細(xì)胞?？赏ㄟ^采用熒光標(biāo)記抗體(見下文)的免疫熒光技術(shù)，結(jié)合熒光顯微鏡、流式細(xì)胞或熒光測(cè)定進(jìn)行這種檢測(cè)。
本發(fā)明所用的抗體(或它們的片段)可用于組織學(xué)以免疫熒光或免疫電鏡原位檢測(cè)它們的抗原。可取得病人的組織標(biāo)本和向該標(biāo)本提供本發(fā)明的標(biāo)記抗體來完成原位檢測(cè)。優(yōu)選將所述抗體(或片段)加到生物學(xué)樣品上或覆蓋以標(biāo)記抗體(片段)。通過采用此法，不僅可以檢測(cè)抗原的存在，還可以檢測(cè)其在所檢測(cè)組織中的分布。普通技術(shù)人員不難明白，可利用本發(fā)明改進(jìn)各種組織學(xué)方法(例如染色程序)來完成這種原位檢測(cè)。
這種抗原檢測(cè)試驗(yàn)通常包括在能鑒定抗原的標(biāo)記抗體存在下，培育生物學(xué)樣本(例如生物液體、組織提取物、新鮮收獲的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞或白細(xì)胞，或組織培養(yǎng)物中的細(xì)胞)，然后用本領(lǐng)域熟知的許多技術(shù)之一來檢測(cè)所述抗體。
可將生物學(xué)樣品與固相支持物或載體(如硝酸纖維)或其它能固定細(xì)胞、細(xì)胞粒子或可溶性蛋白的固體支持物或載體相偶聯(lián)。然后用合適的緩沖液洗滌載體或支持物，再用上述本發(fā)明的標(biāo)記抗體處理。再次用緩沖液洗滌固體支持物或載體以去除未結(jié)合抗體。然后可用常規(guī)方法檢測(cè)結(jié)合于所述固體支持物或載體上的標(biāo)記物的量。
可使本發(fā)明的抗體分子適用于免疫檢測(cè)試驗(yàn)(也稱為“雙位點(diǎn)”和“夾心”試驗(yàn))。在典型的免疫檢測(cè)試驗(yàn)中，使一定量的未標(biāo)記抗體(或抗體片段)與固體支持物或載體結(jié)合，加入一定量的可檢測(cè)的標(biāo)記抗體溶液來檢測(cè)和/或定量固相抗體、抗原和標(biāo)記抗體之間所形成的三重復(fù)合物。
本發(fā)明的抗體可以與免疫親和層析技術(shù)聯(lián)合使用。更具體的說，可將該抗體結(jié)合在層析柱填料的表面。然后使待純化組合物通過該層析柱。如待純化的樣品中含有能結(jié)合所述抗體的INSP201多肽，即可從樣品中取得這些INSP201多肽而純化。
因此，總的來說，診斷方法可采用哺乳動(dòng)物的細(xì)胞樣品(如血液樣品、淋巴結(jié)活檢樣品或組織)在體外實(shí)施，或通過體內(nèi)成像實(shí)施。
可用包含本發(fā)明抗體的組合物來檢測(cè)INSP201的存在，例如通過放射免疫試驗(yàn)、ELISA、FACS等方法。可將一種或多種標(biāo)記分子連接于人源化免疫球蛋白。代表性的標(biāo)記分子包括不透射線的染料、放射性對(duì)照試劑(radiocontrast agents)、熒光分子、自旋標(biāo)記分子、酶或其它有診斷價(jià)值的標(biāo)記分子，尤其是可應(yīng)用于放射學(xué)或磁共振成像技術(shù)中的分子。
本發(fā)明IgG抗體的制備宜采用G蛋白親和純化方法，優(yōu)選通過G蛋白免疫沉淀法從本發(fā)明的抗血清純化。可利用得自免疫動(dòng)物的抗血清，通過蛋白質(zhì)印跡分析、免疫沉淀和ELISA以最佳靈敏度檢測(cè)INSP201多肽。
總之，與未純化的本發(fā)明制品相比，采用能特異性結(jié)合靶抗原的本發(fā)明純化抗體或抗體片段，對(duì)受益于最佳重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)化或精密度的應(yīng)用而言，通常能獲得最佳結(jié)果。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將知道，采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)可獲得以對(duì)同源抗原的解離常數(shù)高達(dá)10-12為特征的高親和力抗體或抗體片段。
如上所述，該制品的優(yōu)點(diǎn)在于含有能與多種類型可檢測(cè)分子的任何一種相結(jié)合的抗體或抗體片段。
抗體片段的優(yōu)點(diǎn)是比其來源的親本抗體小但基本上保留了同樣的靶抗原結(jié)合特異性，或與親本抗原相同的結(jié)合特異性和結(jié)合親和力。因此，由于抗體片段比親本抗體小，其生物分布和擴(kuò)散特性(如在系統(tǒng)化地在體內(nèi)或分離的組織內(nèi))通常優(yōu)于親本抗體?；旧喜缓現(xiàn)c區(qū)的抗體片段(例如單鏈Fv、Fab′、Fab、F(ab′)2或CDR)在涉及使該制品接觸能特異性結(jié)合(例如)Fc區(qū)的分子的應(yīng)用中時(shí)是很有利的，因?yàn)檫@種結(jié)合是不需要的。通常其包括接觸同源Fc受體或Fc結(jié)合補(bǔ)體成分(例如血清中的補(bǔ)體成分C1q，)的Fc區(qū)的不為所需的結(jié)合。Fc受體分布于多種類型免疫細(xì)胞的表面，包括專職性APC，如樹突狀細(xì)胞；B淋巴細(xì)胞；和粒細(xì)胞，如嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞。因此，抗體片段缺少Fc區(qū)域的特別優(yōu)于避免不需要的Fc受體介導(dǎo)的免疫細(xì)胞活化或補(bǔ)體成分介導(dǎo)的補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，尤其是在將所述制品給予個(gè)體體內(nèi)時(shí)。
F(ab)′)2是含有抗體分子的二價(jià)抗原結(jié)合部分的抗體分子片段。
按本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法用胃蛋白酶處理本發(fā)明的抗體制品(如本發(fā)明的抗血清)可方便地獲得本發(fā)明的F(ab)′)2制品。所得F(ab)′)2產(chǎn)品為5S大小的顆粒。
Fab或Fab′是一種含有抗體的單價(jià)抗原結(jié)合部分的抗體分子片段。
可按EP0585939中所述或Strandberg等(Protein Eng.2001年1月；14(1)67-74)中所述產(chǎn)生CDR。本發(fā)明的CDR可以是經(jīng)修飾后增強(qiáng)了對(duì)INSP201多肽調(diào)節(jié)作用的CDR。修飾活性多肽方法的例子見Sawa等，1999(J.Med.Chem.42，3289-3299)所述。
按本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法用胃蛋白酶處理本發(fā)明抗體制品(如本發(fā)明的抗血清)，然后還原產(chǎn)生的F(ab)′)2可方便地獲得本發(fā)明的Fab′制品?？捎昧虼歼€原劑，和任選用封閉基團(tuán)來封閉二硫鍵斷裂后所產(chǎn)生的巰基，進(jìn)行此還原反應(yīng)。這種處理產(chǎn)生了兩個(gè)單價(jià)3.5S Fab′片段和一個(gè)Fc片段。
按本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法用木瓜蛋白酶處理本發(fā)明的抗體制品(如本發(fā)明的抗血清)產(chǎn)生完整的輕鏈，和由可變區(qū)和CH1區(qū)域組成的一部分重鏈，可方便地獲得本發(fā)明的Fab制品。
本領(lǐng)域文獻(xiàn)中提供了用酶處理抗體產(chǎn)生抗體片段的充分指南(例如，參見Goldenberg，美國專利號(hào)4.036,945和4,331,647；Porter RR.，1959.BiochemJ.73119-126)。
單鏈Fv(本領(lǐng)域也稱為“scFv”)是含有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，通過適當(dāng)?shù)亩嚯慕宇^連接的單鏈分子。
用重組技術(shù)可獲得本發(fā)明的F(ab)′)2、Fab′、或單鏈Fv或CDR制品。
獲得重組抗體片段的方法是，分離用靶抗原免疫動(dòng)物B淋巴細(xì)胞的mRNA，通過RT-PCR從該mRNA產(chǎn)生cDNA，和利用該cDNA構(gòu)建噬菌體抗體片段展示文庫?？煞奖愕貜拿庖邉?dòng)物的脾臟，或者免疫動(dòng)物的血液、骨髓或淋巴結(jié)獲得B淋巴細(xì)胞。
將會(huì)明白，可用上述方法獲得本發(fā)明的基本上具有任何所需靶抗原結(jié)合親和力和/或特異性的單克隆抗體片段制品。該制品可用于各種受益于能夠以所定義的靶抗原結(jié)合特性結(jié)合靶抗原的試劑的用途中。
由于Fab′在結(jié)構(gòu)上與Fab基本相似，當(dāng)Fab′和Fab含有基本上相同的重鏈和輕鏈可變區(qū)時(shí)，含有Fab′的本發(fā)明制品可以與含有Fab的本發(fā)明制品互換使用。常見的情況是，對(duì)于受益于本發(fā)明的含有能以最大親和力與靶抗原結(jié)合的抗體片段的制品的應(yīng)用而言，因?yàn)橐粋€(gè)F(ab)′)2能二價(jià)結(jié)合靶抗原，而單價(jià)抗體片段只能單價(jià)結(jié)合，本發(fā)明的F(ab)′)2制品要優(yōu)于本發(fā)明的Fab，F(xiàn)ab′或scFv制品。
如上所述，依據(jù)應(yīng)用和目的，所述抗體或抗體片段制品可源自任何不同種類的哺乳動(dòng)物。
可從用靶抗原免疫所需種類動(dòng)物的血清獲得來源于該種動(dòng)物的本發(fā)明的抗體或抗體片段制品。
本發(fā)明的人或人源化抗體或抗體片段制品優(yōu)選應(yīng)用于涉及將該制品給予個(gè)體的應(yīng)用中。例如人或人源化抗體或抗體片段在免疫學(xué)上通常易于被最佳耐受，由此在人體內(nèi)顯示最佳的半衰期，因此顯示出最佳效果。下文提供對(duì)人或人源化抗體的生產(chǎn)和利用的進(jìn)一步指導(dǎo)。
本發(fā)明制品本身即可使用，也可作為活性成分配制在藥物組合物中。
因此，本發(fā)明提供了一種包含藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、和作為活性成分的本發(fā)明抗體或抗體片段的藥物組合物。
以下描述將本發(fā)明的抗體或抗體片段作為活性成分配制藥物組合物的方法，和使用這種藥物組合物的方法。
優(yōu)選通過給予含有作為活性成分的本發(fā)明抗體或抗體片段的本發(fā)明藥物組合物，來給予所述抗體或抗體片段。
優(yōu)選給予所述抗體或抗體片段以獲得足夠水平的抗體與靶抗原結(jié)合，從而獲得理想的生物化學(xué)活性調(diào)節(jié)作用。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員，例如醫(yī)師，更優(yōu)選專科醫(yī)師，具有確定合適治療方案所需的專門技術(shù)，包括按照本發(fā)明的教導(dǎo)確定合適的給藥途徑和確定有效治療疾病所需的抗體或抗體片段的合適劑量。
如上所述，可用各種方法獲得所述靶抗原(即INSP201)，其為多肽。
優(yōu)選通過標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)合成方法獲得所述靶抗原。
可用例如標(biāo)準(zhǔn)固相技術(shù)，化學(xué)合成此靶抗原。這類技術(shù)包括全部固相合成(exclusive solid phase synthesis)、部分固相合成方法、片段縮合、經(jīng)典溶液合成。固相多肽合成方法是本領(lǐng)域熟知的[例如參見Stewart等.，《固相肽合成》Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chemical Company，(1984)]。
可用制備型高效液相層析方法純化合成的多肽，例如見Creighton T.[《蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分子原理》Proteins，structures and molecular principles，W.H.Freeman and Co.N.Y.(1983)]中所描述，并可通過標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸測(cè)序方法驗(yàn)證其氨基酸序列。
如上所述，優(yōu)選用靶抗原免疫哺乳動(dòng)物產(chǎn)生所述制品。
可根據(jù)加強(qiáng)()血清中抗體產(chǎn)生的免疫增強(qiáng)方案，給哺乳動(dòng)物反復(fù)注射含佐劑的靶抗原，以有利于在體內(nèi)產(chǎn)生所述制品。如果靶抗原太小()不能誘導(dǎo)足夠的免疫應(yīng)答(本專業(yè)稱為“半抗原”)時(shí)，可將半抗原與抗原中性的載體，如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)或血清白蛋白[例如牛血清白蛋白(BSA)]載體偶聯(lián)(例如參見美國專利號(hào)5,189,178和5,239,078)。可用本領(lǐng)域熟知的各種方法將半抗原與載體偶聯(lián)。例如可有效地采用直接偶聯(lián)于氨基，再任選地還原形成的亞氨基連接鍵。或者，可利用縮合劑(如二環(huán)己基碳二亞胺或其它碳二亞胺脫水劑)與載體偶聯(lián)。也可利用接頭化合物進(jìn)行偶聯(lián)；同質(zhì)雙功能和異質(zhì)雙功能接頭化合物可購自Pierce Chemical Company，Rockford，Ill。然后用獲得的免疫原性復(fù)合物注射合適的哺乳動(dòng)物對(duì)象，如牛、綿羊、小鼠，家兔等。體內(nèi)產(chǎn)生抗體后，不難用本領(lǐng)域熟知的免疫試驗(yàn)方法測(cè)定宿主哺乳動(dòng)物的血清(抗體)滴度。
上述制品優(yōu)選含有人源化抗體或抗體片段。
人源化抗體或抗體片段是經(jīng)基因工程改造的嵌合抗體或抗體片段，優(yōu)選使其中非人類來源的部分最小。人源化抗體包括人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(受體抗體)被非人動(dòng)物的抗體(如具有理想功能的小鼠、大鼠或兔抗體)(供體抗體)的互補(bǔ)決定區(qū)殘基所取代的抗體。在一些例子中，人抗體的Fv框架殘基被相應(yīng)的非人殘基所取代。人源化抗體也可包括在受體抗體中或輸入的互補(bǔ)決定區(qū)或框架序列中未發(fā)現(xiàn)的殘基。通常，人源化抗體基本總體上包括至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變區(qū)，它們所含的所有或基本上所有的互補(bǔ)決定區(qū)對(duì)應(yīng)于非人抗體可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)，其框架區(qū)的所有或基本上所有對(duì)應(yīng)于相關(guān)的人共有序列。人源化抗體也優(yōu)選包含通常衍生自人抗體的人抗體恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，如Fc區(qū)(例如參見Jones等，1986.Nature 321522-525；Riechmann等，1988.Nature 332323-329和Presta，1992.Curr.Op.Struct.Biol.2593-596)。非人源抗體或抗體片段的人源化方法是本領(lǐng)域熟知的。通常人源化抗體中含有導(dǎo)入其中的非人來源的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常稱為輸入殘基，通常取自輸入的可變區(qū)。實(shí)施人源化可按報(bào)道進(jìn)行(例如參見Jones等，1986.Nature 321522-525；Riechmann等，1988.Nature332323-327；Verhoeyen等，1988.Science 2391534-1536；美國專利4,816567)，用相應(yīng)的嚙齒動(dòng)物互補(bǔ)決定區(qū)替代人互補(bǔ)決定區(qū)。因此，這類人源化抗體是嵌合抗體，其整個(gè)人可變區(qū)幾乎已被非人物種的相應(yīng)序列所取代。實(shí)踐中，人源化抗體通常為人抗體，其互補(bǔ)決定區(qū)的一些殘基和可能的一些框架殘基已被來自嚙齒動(dòng)物抗體類似位點(diǎn)的殘基所取代。也可用本領(lǐng)域知道的各種技術(shù)產(chǎn)生人抗體或抗體片段，包括噬菌體展示文庫(例如參見Hoogenboom和Winter，1991.J.Mol.Biol.227381；Marks等，1991.J.Mol.Biol.222581；Cole等，《單克隆抗體和癌癥治療》Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，pp.77(1985)；Boerner等，1991.J.Immunol.14786-95)。還可將編碼人免疫球蛋白基因座的序列導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來制造人源化抗體，例如將已部分或完全滅活的內(nèi)源性免疫球蛋白基因?qū)胄∈笾小Ｔ诳乖ぐl(fā)時(shí)，觀察到該動(dòng)物可產(chǎn)生人抗體，在所有方面均與人體中非常相似，包括基因重排、鏈裝配和抗體譜。本領(lǐng)域文獻(xiàn)提供了實(shí)施此方法的充分指南(例如參見美國專利5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016；Marks等，1992.Bio/Technology 10779-783；Lonberg等，1994.Nature 368856-859；Morrison，1994.Nature 368812-13；Fishwild等，1996.Nature Biotechnology 14845-51；Neuberger，1996.NatureBiotechnology 14826；Lonberg和Huszar，1995.Intern.Rev.Immunol.1365-93)。
可采用能靶向膜結(jié)合INSP201的拮抗性抗體治療炎癥和/或自身免疫病。
可采用靶向膜結(jié)合INSP201的激動(dòng)性抗體治療癌癥、HIV和/或EBV及乙型肝炎病毒感染。
可用實(shí)施例6-8中所述的試驗(yàn)和/或動(dòng)物模型證明靶向INSP201的抗體的活性。
本發(fā)明第二和第三方面所述的優(yōu)選核酸分子是編碼SEQ ID NO2，EQID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16和SEQ ID NO18所示多肽序列和多肽功能等價(jià)物。這些核酸分子可用于本文所述的方法和應(yīng)用。本發(fā)明的核酸分子優(yōu)選至少包含本文所述序列中的n個(gè)連續(xù)核苷酸，這取決于具體序列，n可為10或更多(例如12、14、15、18、20、25、30、35、40或更多)。
本發(fā)明中的核酸分子還包括上述核酸分子的互補(bǔ)序列(例如對(duì)于反義或探針目的)。
本發(fā)明的核酸分子可以是RNA形式(例如mRNA)，或DNA形式(包括例如cDNA、合成的DNA或基因組DNA)?？赏ㄟ^克隆、化學(xué)合成技術(shù)或它們的組合獲得這些核酸分子?？捎弥T如固相亞磷酰胺化學(xué)合成等技術(shù)通過化學(xué)合成，從基因組或cDNA文庫獲得，或從生物體分離來制備這些核酸分子。通?？赏ㄟ^體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄DNA序列而產(chǎn)生RNA分子。
所述核酸分子可以是雙鏈，也可以是單鏈。單鏈DNA可以是編碼鏈(也稱為正義鏈)，或非編碼鏈(也稱為反義鏈)。
術(shù)語“核酸分子”還包括DNA和RNA的類似物，例如含有修飾骨架的那些類似物和肽核酸(PNA)。術(shù)語“PNA”在本文中用于指反義分子或反義基因制劑，其中包含與氨基酸殘基肽骨架相連、長至少5個(gè)核苷的寡核苷酸，且其末端優(yōu)選為賴氨酸。末端賴氨酸可賦予該化合物可溶性?？蒔EG化PNA以延長其在細(xì)胞內(nèi)的壽命，它們能優(yōu)先結(jié)合互補(bǔ)單鏈DNA和RNA而阻止轉(zhuǎn)錄物延伸(Nielsen，P.E.等，(1993)Anticancer Drug Des.853-63)。
編碼本發(fā)明多肽的核酸分子可與本文所述一種或多種核酸分子的編碼序列相同。
由于基因密碼子的簡并性，這些分子可具有不同的序列來編碼如下任一序列所示的多肽SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16或SEQID NO18。這些核酸分子可包括但不限于成熟多肽本身的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和附加的編碼序列，例如編碼前導(dǎo)或分泌序列(如前、原或前原多肽序列)的那些序列；含或不含上述附加編碼序列的成熟多肽編碼序列和其它的附加非編碼序列，包括非編碼5’和3’序列(，例如在轉(zhuǎn)錄、核糖體結(jié)合、mRNA穩(wěn)定性中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄但不翻譯的序列(包括終止信號(hào))。所述核酸分子還可包括編碼能編碼其它氨基酸的附加序列，例如編碼能提供額外功能的氨基酸。
本發(fā)明第二和三方面所述的核酸分子還可編碼本發(fā)明第一方面所述多肽和片段的片段或功能等價(jià)物。這類核酸分子可以是天然產(chǎn)生的變體(例如天然產(chǎn)生的等位基因變體)，或是據(jù)知不是天然產(chǎn)生的變體分子。這種核酸分子的非天然產(chǎn)生的變體可通過誘變技術(shù)，包括用于核酸分子、細(xì)胞或生物體的誘變技術(shù)制備。
此種變體不同于上述通過核苷酸取代、刪除或插入而得到的核酸分子。取代、刪除或插入可涉及一個(gè)或幾個(gè)核苷酸。而這類變體的編碼區(qū)或非編碼區(qū)或兩者均可改變。編碼區(qū)的改變可以是保守或非保守性氨基酸取代、刪除或插入。
出于不同原因，也可用本領(lǐng)域通常所知的方法工程改造本發(fā)明的核酸分子，包括修飾克隆、基因產(chǎn)物(多肽)的加工和/或表達(dá)?？捎冒S機(jī)片段化和PCR重組裝基因片段和合成寡核苷酸進(jìn)行DNA改組在內(nèi)的技術(shù)來工程改造所述核酸序列?？衫枚c(diǎn)誘變插入新的限制性位點(diǎn)、改變糖基化模式、改變密碼子偏愛、產(chǎn)生剪接變體、引入突變等等。
可將編碼本發(fā)明第一方面所述多肽的核酸分子與異源序列相連接，得到可編碼融合蛋白的組合核酸分子。這種組合核酸分子屬于本發(fā)明的第二和第三方面內(nèi)容。例如，為篩選肽文庫中所述多肽活性的抑制劑，可利用這種組合核酸分子來表達(dá)能為商品化購得的抗體所識(shí)別的融合蛋白。融合蛋白也可經(jīng)工程改造在本發(fā)明多肽序列與異源蛋白序列之間含有一切割位點(diǎn)，從而使該多肽可被切斷從異源蛋白中純化出來。
本發(fā)明的核酸分子也包括與編碼本發(fā)明多肽的核酸分子部分互補(bǔ)，并由此可與該編碼核酸分子雜交的反義分子(雜交)。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知，可將這類反義分子(如寡核苷酸)設(shè)計(jì)成能識(shí)別和特異性結(jié)合編碼本發(fā)明多肽的靶核酸，從而阻止編碼本發(fā)明多肽的靶核酸轉(zhuǎn)錄(例如參見Cohen，J.S.，Trends in Pharm.Sci.，10，435(1989)，Okano，J，Neurochem，56，560(1991)；O Connor，J.Neurochem 56，560(1991)；Lee等，Nucleic Acid Res 6，3073(1979)；Cooney等，Science 241，456(1988)；Dervan等，Science 251，1360(1991)。
術(shù)語“雜交”在本文中用于指兩核酸分子通過氫鍵彼此結(jié)合。通常，一個(gè)分子固定于固體支持相上，而另一個(gè)分子游離在溶液中。隨后在有利于氫鍵形成的條件下使兩分子接觸。影響這種結(jié)合的因素包括溶劑的類型和體積；反應(yīng)溫度；雜交時(shí)間；攪拌；阻止液相分子與固相支持物非特異性結(jié)合的試劑(Denhardt’s試劑或BLOTTO)；分子的濃度；是否使用能提高分子結(jié)合率的化合物(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；雜交后洗滌條件的嚴(yán)緊程度(參見Sambrook等，[同上])。
如本領(lǐng)域所知，可用雜交試驗(yàn)(例如參見Sambrook等，[同上])來檢測(cè)是否抑制了完全互補(bǔ)分子與靶分子的雜交。如Wahl，G.M.和S.L.Berger(1987；Methods Enzymol.152399-407)和Kimmel，A.R.(1987；MethodsEnzymol.152507-511)所述，在各種嚴(yán)緊條件下，基本上同源的分子能競爭和抑制完全同源分子與靶分子的結(jié)合。
“嚴(yán)緊性”指雜交反應(yīng)的條件有利于非常類似分子的結(jié)合而不利于不同分子的結(jié)合。高嚴(yán)緊性雜交條件定義為在含50％甲酰胺、5XSSC(150mMNaCl，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5X Denhardts溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml變性剪切鮭魚精子DNA的溶液中，于42℃培育過夜，然后在約65℃用0.1XSSC洗滌濾器()。低嚴(yán)緊性條件包括在35℃進(jìn)行雜交反應(yīng)(參見Sambrook等，[同上])。雜交所用條件優(yōu)選高嚴(yán)緊性條件。
本發(fā)明該方面的實(shí)施方案優(yōu)選所述核酸分子在全長上與編碼INSP201多肽的核酸分子至少70％相同和與該核酸分子基本上互補(bǔ)的核酸分子。本發(fā)明該方面的核酸分子優(yōu)選包含一個(gè)區(qū)域，該區(qū)域的全長與此類編碼序列至少80％相同，或是與其互補(bǔ)的核酸分子。在這點(diǎn)上，特別優(yōu)選所述核酸分子的全長與上述相同分子至少90％，優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少98％、99％或更高相同。本發(fā)明該方面實(shí)施方案所優(yōu)選的是所編碼多肽基本上保留了與INSP201多肽基本上相同的生物學(xué)功能和活性的核酸分子。
本發(fā)明還提供檢測(cè)本發(fā)明核酸分子的方法，該方法包括步驟a)在形成雙鏈體的雜交條件下，使生物學(xué)樣品接觸本發(fā)明的核酸探針；和b)檢測(cè)形成的任何此類雙鏈體。
以下結(jié)合本發(fā)明所用的試驗(yàn)作進(jìn)一步描述，可采用上述核酸分子作為RNA、cDNA或基因組DNA的雜交探針，來分離編碼INSP201多肽的全長cDNA和基因組克隆，和分離與編碼此多肽的基因具有高度序列相似性的同源或定向進(jìn)化同源基因的cDNA和基因組克隆。
就這點(diǎn)而言，可采用本領(lǐng)域已知技術(shù)中的下述技術(shù)，并在下文中處于闡述的目的對(duì)它們進(jìn)行討論。DNA測(cè)序和分析的方法是本領(lǐng)域熟知的和通?？衫玫模⒌拇_可在本文所討論的本發(fā)明的許多實(shí)施方案實(shí)施。這些方法可采用如下的酶，例如(DNA聚合酶I的Klenow片段、測(cè)序酶(US BiochemicalCorp，Cleveland，OH)、Taq聚合酶(Perkin Elmer)、熱穩(wěn)定T7聚合酶(Amersham，chicago，IL)或聚合酶的組合，和校正核酸外切酶(例如Gibco/BRL銷售的ELONGASE擴(kuò)增系統(tǒng)中所用的酶(Gaithersburg，MD))。優(yōu)選用機(jī)器，如Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton，Reno，NV)、Peltier熱循環(huán)儀(PTC200；MJ Research，Watertown，MA)和ABI Catalyst和373和377DNA測(cè)序儀(PerkinElmer)進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序。
一種分離與INSP201多肽具有等價(jià)功能的多肽的編碼核酸分子的方法，是用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法以天然或人工設(shè)計(jì)的探針檢測(cè)基因組或cDNA文庫(例如參見《分子生物學(xué)當(dāng)前策略》“Current Protocols in MolecularBiology”，Ausubel等編.Greene Publishing Association and John WileyInterscience，New York，1989，1992)。特別有用的探針是包含至少15個(gè)、優(yōu)選至少30個(gè)、更優(yōu)選至少50個(gè)與適當(dāng)編碼基因的核酸序列(SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15和SEQ ID NO17)相對(duì)應(yīng)或互補(bǔ)的連續(xù)堿基的探針。這類探針可用分析檢測(cè)試劑標(biāo)記以利于它們的鑒定。所用的試劑包括但不限于放射性同位素，熒光染料和能催化形成可檢測(cè)產(chǎn)物的酶。采用這些探針，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可從人、哺乳動(dòng)物或其它動(dòng)物來源中分離編碼感興趣蛋白質(zhì)的基因組DNA、cDNA或RNA多核苷酸的互補(bǔ)拷貝，和篩選這些來源的相關(guān)序列，例如篩選該家族、類型和/或亞類中的其它成員。
在多種情況下，分離得到的cDNA序列是不完全的，這是由于編碼該多肽的區(qū)域經(jīng)常在5’端被切短。可采用多種方法來獲得全長cDNA序列，或延伸短cDNA序列。延伸這些序列時(shí)可利用部分的核苷酸序列和用本領(lǐng)域已知的各種方法檢測(cè)上游序列(如啟動(dòng)子和調(diào)控元件)。例如，一種可用的方法是cDNA末端的快速擴(kuò)增(RACE，例如參見Frohman等，PNAS USA85，8998-9002，1988)。近年來改進(jìn)了該技術(shù)，例如以MarathonTM技術(shù)(ClontechLaboratories Inc.)為例，顯著簡化了對(duì)較長cDNA序列的搜索。一種略有不同的稱為“限制位點(diǎn)”PCR的技術(shù)，采用通用引物來挽回毗連已知基因座的未知核酸序列(Sarkar，G.(1993)PCR Methods Applic.2318-322)。也可采用已知區(qū)域的分支(divergent)引物進(jìn)行反向PCR來擴(kuò)增或延伸該序列(Triglia，T等，(1998)Nucleic Acids Res.168168)。另一種可用的方法是捕獲PCR，其包括用PCR擴(kuò)增人染色體和酵母人造染色體DNA中毗連已知序列的DNA片段(Lagerstrom，M.等.(1991)PCR Methods Applic.，1，111-119)。另一種可用來挽回未知序列的方法是Parker，J.D.等所述的方法(1991)Nucleic Acid Res，193055-3066)。另外，可采用PCR、巢式引物和PromoterFinderTM文庫步查基因組DNA(Clontech，Palo Alto，CA)。該方法不需要篩選文庫，并可用于發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子/外顯子連接部。
當(dāng)篩選全長cDNA時(shí)，優(yōu)選使用已經(jīng)過大小選擇包含較大cDNA的文庫。另外，優(yōu)選隨機(jī)引物庫，這是因?yàn)樗鼈儼?’區(qū)的更多序列。在寡d(T)庫不能產(chǎn)生全長cDNA的情況下，尤其優(yōu)選用隨機(jī)引物庫?？衫没蚪M庫使序列延伸到5’端非轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)中。
在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，可將本發(fā)明的核酸分子用于染色體定位。在該技術(shù)中，使核酸分子特異性靶向個(gè)人染色體上特定位置并能與之雜交。將本發(fā)明相關(guān)序列在染色體上定位，是驗(yàn)證這些序列與基因相關(guān)疾病的相關(guān)性的重要步驟。一旦將某序列精確定位于某染色體的位點(diǎn)上，可將此序列在該染色體上的物理位置與基因圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這類數(shù)據(jù)可在例如VMcKusick編著的《人孟德爾遺傳》(Mendelian Inheritance in Man)中找到(通過Johns Hopkins大學(xué)welch醫(yī)學(xué)圖書館在線獲得)。然后通過連鎖分析鑒別定位于同一染色體區(qū)域中的基因與疾病之間的相關(guān)性(物理毗連基因的共遺傳性)。這給采用定位克隆或其它基因發(fā)現(xiàn)技術(shù)尋找疾病基因的研究者提供了有價(jià)值的信息。一旦該疾病或綜合征經(jīng)基因連鎖初步定位于某具體基因組區(qū)域，定位于該區(qū)域的任何序列可提供相關(guān)的基因或調(diào)控基因作進(jìn)一步研究。也可利用所述核酸分子來檢測(cè)正常人、攜帶者或受影響個(gè)體該染色體位置中由于轉(zhuǎn)座、倒位等所導(dǎo)致的差異。
本發(fā)明的核酸分子對(duì)組織定位也有價(jià)值。這類技術(shù)通過檢測(cè)編碼所述多肽的mRNA可測(cè)定該多肽在組織中的表達(dá)模式。這些技術(shù)包括原位雜交技術(shù)和核苷酸擴(kuò)增技術(shù)(例如PCR)。這些研究的結(jié)果可表明所述多肽在生物體內(nèi)的正常功能。另外，比較研究mRNA的正常表達(dá)模式與突變基因編碼的mRNA的表達(dá)模式，可為突變多肽在疾病中的作用提供有價(jià)值的深入了解。這種不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)可能是暫時(shí)、空間上的或具有定量性質(zhì)的。
也可采取基因沉默方法來下調(diào)編碼本發(fā)明多肽的基因的內(nèi)源性表達(dá)。RNA干擾(RNAi)(Elbashir，SM等，Nature 2001，411，494-498)是一種可采用的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默方法?？审w外合成短的雙鏈RNA寡核苷酸，并將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。這些雙鏈RNA寡核苷酸的序列的特異性結(jié)合可引發(fā)靶mRNA降解，而減少或消除靶蛋白的表達(dá)。
可通過測(cè)定多肽的表達(dá)(例如蛋白質(zhì)印跡法)和在RNA水平上采用基于TaqMan的方法來評(píng)估上述基因沉默方法的效果。
本發(fā)明的載體包含本發(fā)明核酸分子，可以是克隆載體或表達(dá)載體。用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、或轉(zhuǎn)導(dǎo)的本發(fā)明宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞。
可通過包含在宿主細(xì)胞中的載體內(nèi)編碼本發(fā)明多肽的核酸分子的表達(dá)來制備重組形式的本發(fā)明的多肽。這類表達(dá)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，在Sambrook等(同上)和Fernandez&Hoeffler(1998年編《基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)技術(shù)的使用本質(zhì)》“Gene expression systems.Using nature for the art ofexpression”.Academic Press，San Diego，London，Boston，New York，Sydney，Tokyo，Toronto)中有眾多詳述。
一般可采用適合在所需宿主細(xì)胞中保持、繁殖或表達(dá)核酸分子以產(chǎn)生多肽的任何系統(tǒng)或載體?？蓪⒑线m的核苷酸序列用各種熟知的和常規(guī)的技術(shù)中的任一種(例如Sambrook等(同上)中所述)插入到表達(dá)系統(tǒng)中。通常將編碼基因置于控制元件(如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(細(xì)菌表達(dá))和任選的操縱子)的控制下，以便編碼所需多肽的DNA序列在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄為RNA。
適合的表達(dá)系統(tǒng)的例子包括例如染色體、附加型和病毒來源系統(tǒng)，例如，衍生自下述物質(zhì)的載體細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母附加體、插入元件、酵母染色體元件、病毒如桿狀病毒、乳多空病毒(如SV40)、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，或它們的組合，例如那些源自質(zhì)粒和噬菌體基因元件的載體，包括粘粒和噬菌粒。也可采用人工人染色體(HAC)來遞送大于質(zhì)粒所能包含和表達(dá)的較大DNA片段。適合用于與本發(fā)明INSP201相關(guān)方面的適宜載體的優(yōu)選例子有pCR4-TOPO、pCR4-TOPO-INSP201、pENTR、pENTR_INSP201EC-6HIS、pEAK12d-PAC、pDEST12.2、pEAK12d-PAC_INSP201EC-6HIS和pDEST12.2_INSP201EC-6HIS。
特別適合的表達(dá)系統(tǒng)包括微生物，如用重組噬菌體、質(zhì)粒或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；用酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母菌；用病毒(如桿狀病毒)表達(dá)載體感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒(如花椰菜花葉病毒CaMV、煙草花葉病毒TMV)表達(dá)載體或細(xì)菌表達(dá)載體(如Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。也可采用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)來產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。
將編碼本發(fā)明多肽的核酸分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法在許多實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)中都有描述，例如Davis等，《分子生物學(xué)基本方法》Basic Methods inMolecular Biology(1986)和Sambrook等(同上)。特別合適的方法包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)，刮擦加載(scrape loading)、轟擊導(dǎo)入或感染(參見Sambrook等，1989[同上]；Ausubel等，1991[同上]；Spector，Goldman&Leinwald，1998)。在真核細(xì)胞中，表達(dá)系統(tǒng)根據(jù)對(duì)該系統(tǒng)的需要可以是暫時(shí)性的(如附加型)或永久性的(染色體整合)。
所述編碼核酸分子可以包括或不包括編碼控制序列(例如分泌翻譯的多肽到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、周質(zhì)間隙或胞外環(huán)境所需要的信號(hào)肽或引導(dǎo)序列)的序列。這些信號(hào)可以是所述多肽的內(nèi)源信號(hào)，或異源信號(hào)。引導(dǎo)序列可在翻譯后加工中被細(xì)菌宿主去除。
除控制序列外，可能需要加入調(diào)節(jié)序列來調(diào)節(jié)與宿主細(xì)胞生長相關(guān)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)序列的例子是在對(duì)化學(xué)或物理刺激(包括存在調(diào)節(jié)性化合物或改變溫度或代謝條件)的反應(yīng)中能導(dǎo)致某基因的表達(dá)增加或減少的那些序列。調(diào)節(jié)序列是載體的非翻譯區(qū)，如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和5’與3’非翻譯區(qū)。它們能與宿主細(xì)胞蛋白相互反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些調(diào)節(jié)序列的強(qiáng)度和特異性不同。取決于所用的載體系統(tǒng)和宿主，可采用任何數(shù)目的合適轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型和可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。例如，在細(xì)菌系統(tǒng)中克隆時(shí)，可采用可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，如pSportlTM質(zhì)粒(Gibco BRL)或Bluescript噬菌粒的雜交lacZ啟動(dòng)子(Stratagene，LaJolla，CA)等。昆蟲細(xì)胞中可用桿狀病毒的多角體蛋白啟動(dòng)子?？蓪⒅参锛?xì)胞基因組來源的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子(例如熱激、RUBISCO和貯藏蛋白基因)或植物病毒來源的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子(例如病毒啟動(dòng)子或引導(dǎo)序列)克隆入該載體中。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中優(yōu)選哺乳動(dòng)物基因或哺乳動(dòng)物病毒來源的啟動(dòng)子。如需要產(chǎn)生包含多個(gè)拷貝序列的細(xì)胞系，可采用含合適的可選擇性標(biāo)記的基于SV40或EBV的載體。
構(gòu)建表達(dá)載體以使特定核酸編碼序列位于含有合適調(diào)節(jié)序列的載體中，編碼序列相對(duì)于調(diào)節(jié)序列的位置和方向應(yīng)使該編碼序列能在該調(diào)節(jié)序列的“控制”下轉(zhuǎn)錄，即RNA聚合酶在控制序列上與DNA分子結(jié)合而轉(zhuǎn)錄編碼序列。在某些情況下，可能需要修飾所述序列使其能以合適的取向(即保持閱讀框架)結(jié)合控制序列。
可將控制序列和其它調(diào)節(jié)序列與所述核酸編碼序列相連，然后插入載體中?；蛘?，可將編碼序列直接克隆入已含有控制序列和合適限制性位點(diǎn)的表達(dá)載體中。
為了長期高產(chǎn)地產(chǎn)生重組多肽，優(yōu)選穩(wěn)定表達(dá)。例如，可用其中含有病毒來源復(fù)制子和/或內(nèi)源表達(dá)元件和可選擇標(biāo)記基因的相同或不同表達(dá)載體轉(zhuǎn)化能穩(wěn)定表達(dá)感興趣多肽的細(xì)胞系。導(dǎo)入該載體后，在富集培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-2天后轉(zhuǎn)移至選擇性培養(yǎng)基。可選擇性標(biāo)記的作用是賦予選擇抗性，它的存在使成功表達(dá)導(dǎo)入序列的細(xì)胞得以生長和回收。可用適合該細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)增殖穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抗性克隆。
可用作表達(dá)宿主的已有哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是本領(lǐng)域知道的，可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)得到許多無限增殖細(xì)胞系，其中包括但不限于中國倉鼠卵巢(CHO)、HeLa、幼倉鼠腎(BHK)、猴腎(COS)、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑色素瘤和人肝癌(如Hep G2)細(xì)胞和許多其它細(xì)胞系。
在桿狀病毒系統(tǒng)中，桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)所需材料可從商業(yè)上以試劑盒形式從例如Invitrogen，San Diego CA(“MaxBac”試劑盒)獲得。這些技術(shù)一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，并且在Summers和Smith，TexasAgricultural Experiment Station Bulletin NO.1555(1987)中有全面描述。此系統(tǒng)所用的特別合適的宿主細(xì)胞包括昆蟲細(xì)胞，如果蠅S2細(xì)胞和草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞。
本領(lǐng)域知道有許多種植物細(xì)胞培養(yǎng)物和完整的植物遺傳表達(dá)系統(tǒng)。合適的植物細(xì)胞遺傳表達(dá)系統(tǒng)的例子包括美國專利5,693,506、5,659,122和5,608,143中所述的系統(tǒng)。其它在植物細(xì)胞培養(yǎng)中遺傳表達(dá)的例子見Zenk，Phytochemistry 30，3861-3863(1991)中的描述。
具體說，可利用能分離和培養(yǎng)原生質(zhì)體并培養(yǎng)得到完整的再生植株的所有植物，從而回收含有轉(zhuǎn)移基因的完整植物。實(shí)踐上，所有植物均能從培養(yǎng)細(xì)胞或組織再生，它們包括但不限于甘蔗、甜菜、棉花、水果和其它樹木、豆類和蔬菜的所有主要品種。
細(xì)菌宿主細(xì)胞特別優(yōu)選例子包括鏈球菌(streptococci)，葡萄球菌(staphylococci)，大腸桿菌(E.coli)，鏈霉菌(Streptomyces)和枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)細(xì)胞。
用于真菌表達(dá)的特別適合宿主細(xì)胞的例子包括酵母細(xì)胞(如釀酒酵母菌，S.cerevisiae)和曲霉菌(Aspergillus)細(xì)胞。
本領(lǐng)域知道的任意數(shù)目的選擇系統(tǒng)均可用于回收轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的的。例子包括能分別在tk-或aprt±細(xì)胞中使用的單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler，M等.(1977)Cell 11223-32)和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy，I.等，(1980)Cell22817-23)基因。
還有，可利用抗代謝、抗生素、除草劑抗性作為選擇的基礎(chǔ)；例如能賦予對(duì)氨甲喋呤抗性的二氫葉酸還原酶(DHFR)(Wigler，M.等，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.773567-70)；能賦予對(duì)氨基糖苷新霉素和G-418抗性的npt(Colbere-Garapin，F(xiàn).等，(1981)J.Mol.Biol.1501-14)和能分別賦予對(duì)氯磺隆(chlorsulfuron)和除草劑PPT(phosphinotricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶抗性的als或pat。其它可選擇基因已有敘述，其例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所清楚的。
雖然標(biāo)記基因的表達(dá)存在或不存在可提示感興趣基因也存在，但其存在和表達(dá)仍需要驗(yàn)證。例如，如果將相關(guān)序列插入到一標(biāo)記基因序列中，包含該相應(yīng)序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞可通過標(biāo)記基因功能的缺失來鑒定?；蛘?，可將標(biāo)記基因與編碼本發(fā)明多肽的序列串聯(lián)安置在一個(gè)啟動(dòng)子的控制下。在對(duì)誘導(dǎo)或選擇的反應(yīng)中標(biāo)記基因的表達(dá)常表明該串聯(lián)基因也得到表達(dá)。
或者，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的各種方法鑒定含有編碼本發(fā)明多肽的核酸序列并表達(dá)所述多肽的宿主細(xì)胞。這些方法包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA雜交和蛋白質(zhì)生物試驗(yàn)，如熒光激活細(xì)胞分類法(FACS)或免疫試驗(yàn)技術(shù)(如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)[ELISA]和放射性免疫試驗(yàn)[RIA])，包括用基于膜、溶液、芯片的技術(shù)檢測(cè)和/或定量核酸或蛋白質(zhì)(參見Hampton，R.等.(1990)《血清學(xué)方法，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》Serological Methods，a LaboratoryManual，APS Press，St Paul，MN和Maddox，D.E.等(1983)J.Exp.Med，158，1211-1216)。
多種標(biāo)記和偶聯(lián)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，可用于各種核酸和氨基酸試驗(yàn)。用于產(chǎn)生用于檢測(cè)與編碼本發(fā)明多肽相關(guān)核酸分子的序列的標(biāo)記雜交探針或PCR探針的方法，包括寡聚標(biāo)記、缺口翻譯、用標(biāo)記的多核苷酸進(jìn)行末端標(biāo)記或進(jìn)行PCR擴(kuò)增。或者，可將編碼本發(fā)明多肽的序列克隆入載體中來產(chǎn)生mRNA探針。這種本領(lǐng)域知道的載體是商業(yè)上可獲得的，它們可用于在體外通過加入合適的RNA聚合酶(如T7、T3、或SP6)和標(biāo)記核苷酸，用于合成RNA探針?？捎酶鞣N商業(yè)上購買到的試劑盒(Pharmacia&Upjohn，(Kalamazoo，MI)；Promega(Madison WI)；U.S.Biochemical Corp.，Cleveland，OH))實(shí)施這些方法。
采用合適的報(bào)告分子或標(biāo)記，包括放射性核素、酶和熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑或生色劑、底物、輔因子，抑制劑，磁粒等使檢測(cè)更容易。
也可用本發(fā)明的核酸分子來制造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，尤其是嚙齒動(dòng)物。這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物形成了本發(fā)明的另一個(gè)方面內(nèi)容。這可通過局部修飾體細(xì)胞或通過生殖細(xì)胞系治療摻入遺傳修飾而實(shí)現(xiàn)。這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為對(duì)產(chǎn)生用于鑒定本發(fā)明多肽調(diào)節(jié)劑的有效藥物分子的動(dòng)物模型特別有用。
可通過熟知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化所述多肽，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水反應(yīng)層析、親和層析、羥(基)磷灰石層析和凝集素層析。高性液相層析對(duì)純化特別有用。當(dāng)所述多肽在分離和純化時(shí)變性，可采用熟知的蛋白重折疊技術(shù)來產(chǎn)生活性構(gòu)象。
也可根據(jù)需要采用專門的載體構(gòu)建物來促進(jìn)蛋白質(zhì)的純化，可通過將編碼本發(fā)明多肽的序列連接于編碼能促進(jìn)可溶性蛋白質(zhì)純化的多肽結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。這種有利于純化的結(jié)構(gòu)域的例子包括金屬螯合肽，例如有能通過固定的金屬純化的組氨酸-色氨酸組件；能通過固定的免疫球蛋白純化的蛋白A結(jié)構(gòu)域，和用于FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)(Immunex Corp.Seattle，WA)的結(jié)構(gòu)域。可利用在該純化結(jié)構(gòu)域與本發(fā)明多肽之間加入的可切割接頭序列(如XA因子或腸激酶(Invitrogen，San Diego，CA)的特異性接頭序列)來促進(jìn)純化。一種此類表達(dá)載體能表達(dá)本發(fā)明多肽與幾個(gè)組氨酸殘基相融合的融合蛋白，這些組氨酸殘基前面有硫氧還蛋白或腸激酶切割位點(diǎn)。，這些組氨酸殘基使IMAC(固定化金屬離子親和層析，如Porath，J.等(1992)，Prot.Exp.Purif.3263-281)所述)純化變得容易，而硫氧還蛋白或腸激酶切割位點(diǎn)提供了從融合蛋白中純化該多肽的方法。含融合蛋白的載體在Kroll，D.J.等(1993；DNA cell Biol.12441-453)中已有敘述。
如果要表達(dá)所述多肽用于篩選試驗(yàn)，通常優(yōu)選使其在表達(dá)它的宿主細(xì)胞的表面產(chǎn)生。此時(shí)，收獲宿主細(xì)胞然后用于篩選試驗(yàn)，例如，可采用熒光激活細(xì)胞分類技術(shù)(FACS)或免疫親和技術(shù)。如果所述多肽分泌到培養(yǎng)基中，可收集培養(yǎng)基以回收和純化表達(dá)的多肽。如果多肽產(chǎn)生于細(xì)胞內(nèi)，必須先裂解細(xì)胞再回收該多肽。
如上所示，本發(fā)明還提供篩選候選藥物或前體藥物的新靶標(biāo)和方法。這些篩選方法包括結(jié)合試驗(yàn)和/或功能性試驗(yàn)，這些方法可在體外、細(xì)胞系統(tǒng)中或動(dòng)物中進(jìn)行。
就這點(diǎn)而言，本發(fā)明的特定目標(biāo)是采用INSP201多肽作為靶標(biāo)，來篩選治療或預(yù)防細(xì)胞表面糖蛋白相關(guān)疾病的候選藥物。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供選擇生物學(xué)活性化合物的方法，所述方法包括使候選化合物與INSP201基因或多肽接觸，并選擇能與所述基因或多肽結(jié)合的化合物。
本發(fā)明的再一個(gè)目標(biāo)是提供選擇生物學(xué)活性化合物的方法，所述方法包括使候選化合物與表達(dá)INSP201多肽的重組宿主細(xì)胞相接觸，并選擇能與所述細(xì)胞表面所述INSP201多肽結(jié)合的化合物和/或能調(diào)節(jié)INSP201多肽活性的化合物。
“生物學(xué)活性”化合物指在對(duì)象中具有生物學(xué)活性的任何化合物，優(yōu)選具有治療活性的化合物，更優(yōu)選具有細(xì)胞表面糖蛋白活性的化合物，還要優(yōu)選能用來治療INSP201相關(guān)疾病的化合物，或能指導(dǎo)治療細(xì)胞表面糖蛋白相關(guān)疾病藥物的開發(fā)。“生物學(xué)活性”化合物優(yōu)選能調(diào)節(jié)INSP201活性的化合物。
可利用各種儀器和條件，包括固定試劑在體外實(shí)施上述方法，上述方法還可包括在細(xì)胞表面糖蛋白相關(guān)疾病模型(如動(dòng)物模型)中檢測(cè)所選化合物的活性的額外步驟。
優(yōu)選的化合物是INSP201激動(dòng)劑，即能結(jié)合INSP201并模擬其內(nèi)源配體活性的化合物。
本發(fā)明的還有一個(gè)目標(biāo)是提供選擇生物學(xué)活性化合物的方法，所述方法包括在體外使測(cè)試化合物與本發(fā)明的INSP201多肽接觸，并測(cè)定所述測(cè)試化合物能否調(diào)節(jié)所述INSP201多肽的活性。
本發(fā)明的還有一個(gè)目標(biāo)是提供選擇生物學(xué)活性化合物的方法，所述方法包括在體外使測(cè)試化合物與本發(fā)明的INSP201多肽接觸，并測(cè)定所述測(cè)試化合物調(diào)節(jié)所述INSP201基因表達(dá)的能力，優(yōu)選刺激它的表達(dá)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及篩選、選擇或鑒定活性化合物，尤其是具有調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞退變和凋亡及癌癥發(fā)生活性的化合物的方法，該方法包括使測(cè)試化合物與含有報(bào)告構(gòu)建物的重組宿主細(xì)胞接觸，并選擇能調(diào)節(jié)該報(bào)告基因表達(dá)(例如刺激或降低，優(yōu)選刺激)的測(cè)試化合物，所述報(bào)告構(gòu)建物含有在INSP201基因啟動(dòng)子控制下的報(bào)告基因。
可在各種藥物篩選技術(shù)任意一種中，用本發(fā)明的多肽來篩選化合物庫。這種化合物可激活(激動(dòng))或抑制(拮抗)本發(fā)明所述基因的表達(dá)水平或本發(fā)明多肽的活性，這也形成了本發(fā)明的另一方面內(nèi)容。優(yōu)選的化合物能有效改變編碼本發(fā)明第一方面所述多肽的天然基因的表達(dá)或調(diào)節(jié)本發(fā)明第一方面所述多肽的活性。
可從例如細(xì)胞、無細(xì)胞制品、化學(xué)庫或天然產(chǎn)物混合物中分離激動(dòng)劑或拮抗劑化合物。這些激動(dòng)劑或拮抗劑可以是天然的或修飾的底物、配體、酶、受體或結(jié)構(gòu)模擬物或功能模擬物。這種篩選技術(shù)的合適綜述參見Coligan等，《免疫學(xué)當(dāng)前策略》Current Protocols in Immunology 1(2)第5章(1991)。
能與靶基因或多肽結(jié)合，表明該化合物能調(diào)節(jié)所述靶標(biāo)的活性，從而影響導(dǎo)致對(duì)象細(xì)胞表面糖蛋白相關(guān)疾病的某途徑?？捎酶鞣N技術(shù)，例如通過標(biāo)記候選化合物、通過與標(biāo)記的參照配體競爭等測(cè)定這種結(jié)合。在體外結(jié)合試驗(yàn)中，可采用基本純形式，懸液形式，固定在支持物上，或在膜(完整細(xì)胞、膜制品、脂質(zhì)體等)內(nèi)表達(dá)的所述多肽。
活性的調(diào)節(jié)包括但不限于，刺激INSP201受體的表面表達(dá)，調(diào)節(jié)所述受體的多聚化(例如與其它亞基形成多聚復(fù)合物)等。試驗(yàn)所用的細(xì)胞可以是任何重組細(xì)胞(即含有編碼INSP201多肽的重組核酸的任何細(xì)胞)或表達(dá)內(nèi)源性INSP201多肽的任何細(xì)胞。這種細(xì)胞的例子包括但不限于原核細(xì)胞(如細(xì)菌)和真核細(xì)胞(如酵母細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞等)。具體例子包括大腸桿菌(E.Coli)、巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)、稷酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、克魯維酵母菌(Kluyveromyces yeast)和酵母菌(Saccharomyces yeast)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(如Vero細(xì)胞、CHO細(xì)胞、3T3細(xì)胞、COS細(xì)胞等)和原代或建立的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物(如由成纖維細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞，脂肪細(xì)胞等產(chǎn)生)。
最可能是良好拮抗劑的化合物，是能結(jié)合本發(fā)明多肽而不誘導(dǎo)該多肽發(fā)生結(jié)合所致生物學(xué)作用的分子?？赡艿霓卓箘┌芙Y(jié)合本發(fā)明多肽而抑制或消除其活性的有機(jī)小分子、肽、多肽和抗體。以此方式，可抑制所述多肽與正常細(xì)胞結(jié)合分子的結(jié)合，從而阻止該多肽的正常生物學(xué)活性。
這種篩選技術(shù)中所用的本發(fā)明多肽可以是溶液中的游離多肽、固定于固體支持物、結(jié)合在細(xì)胞表面或定位于細(xì)胞內(nèi)。通常，這種篩選方法可包括使表達(dá)所述多肽的合適細(xì)胞或細(xì)胞膜與測(cè)試化合物接觸，并觀察它們的結(jié)合，或刺激或抑制功能反應(yīng)。然后將接觸測(cè)試化合物的細(xì)胞的功能反應(yīng)與未接觸測(cè)試化合物的對(duì)照細(xì)胞作比較。利用合適的檢測(cè)系統(tǒng)，這種試驗(yàn)可評(píng)價(jià)測(cè)試化合物是否導(dǎo)致激活所述多肽而產(chǎn)生信號(hào)。活性抑制的試驗(yàn)通常在已知激動(dòng)劑存在的情況下進(jìn)行，觀察在測(cè)試化合物存在時(shí)激動(dòng)劑對(duì)活化的效果。
鑒定本發(fā)明多肽的激動(dòng)或拮抗化合物的優(yōu)選方法包括a)在允許所述多肽結(jié)合的條件下，使表達(dá)(任選在該細(xì)胞表面表達(dá))本發(fā)明第一方面所述多肽的細(xì)胞與待篩選的化合物接觸，其中所述多肽與第二組分結(jié)合，該第二組分在化合物與所述多肽結(jié)合的反應(yīng)中能提供可檢測(cè)信號(hào)；b)檢測(cè)該化合物與所述多肽相互反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)水平，確定該化合物是否能結(jié)合所述多肽和活化或抑制該多肽。
在本文所述類型的試驗(yàn)中產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的方法應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。一個(gè)具體例子是將表達(dá)本發(fā)明多肽或其片段(如LBD)并與GAL4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相融合的構(gòu)建物，和含報(bào)告質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，此報(bào)告質(zhì)粒的一個(gè)例子是pFR-Luc(Stratagene Europe，Amsterdam，The Netherlands)。該特定質(zhì)粒含有一個(gè)合成啟動(dòng)子和5個(gè)串聯(lián)重復(fù)的GAL4結(jié)合位點(diǎn)，能控制熒光素酶基因的表達(dá)。當(dāng)在該細(xì)胞中加入某潛在的配體時(shí)，其將結(jié)合GAL4-多肽融合物而誘導(dǎo)熒光素酶基因表達(dá)?？捎冒l(fā)光閱讀儀檢測(cè)其活性來監(jiān)測(cè)熒光素酶的表達(dá)水平(參見例如Lehman等，JBC 27012953，1995；Pawar等.JBC，27739243，2002)。
鑒定本發(fā)明多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑還要優(yōu)選的方法包括a)使標(biāo)記或未標(biāo)記的化合物與固定在任何固相支持物(例如珠、板、基質(zhì)支持物、芯片)上的所述多肽接觸，并通過檢測(cè)該標(biāo)記或化合物本身的存在來檢測(cè)該化合物；b)在允許所述多肽結(jié)合的條件下，使表面表達(dá)有所述多肽的細(xì)胞與待篩選的化合物接觸，該多肽經(jīng)人為錨定于細(xì)胞膜，或通過構(gòu)建連接有第二組分的嵌合受體，在化合物與所述多肽結(jié)合的反應(yīng)中該第二組分能提供可檢測(cè)信號(hào)，和c)比較該化合物與多肽相互反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)水平與無該化合物時(shí)的信號(hào)水平，確定該化合物是否能結(jié)合所述多肽和激活或抑制該多肽。
例如可在肽共激活劑的存在下，采用檢測(cè)配體與所述多肽結(jié)合的FRET方法(Norris等，Science 285744，1999)。
鑒定本發(fā)明多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑還要優(yōu)選的方法包括a)在允許所述多肽結(jié)合的條件下，使表達(dá)(任選在細(xì)胞表面上)所述多肽的細(xì)胞與待篩選的化合物接觸，其中在化合物與所述多肽結(jié)合的反應(yīng)中與所述多肽連接的第二組分能提供可檢測(cè)信號(hào)；b)比較該化合物與所述多肽相互反應(yīng)所產(chǎn)生的信號(hào)水平與無該化合物時(shí)的信號(hào)水平，確定該化合物是否能結(jié)合所述多肽和刺激或抑制該多肽。
在還要優(yōu)選的實(shí)施中，上述的通用方法還包括在所述多肽的標(biāo)記或非標(biāo)記配體存在下鑒定其激動(dòng)劑或拮抗劑。
另一鑒定本發(fā)明多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑方法的實(shí)施方案包括在允許所述多肽結(jié)合的條件下，在候選化合物的存在下，測(cè)定對(duì)配體與表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞(任選該細(xì)胞表面具有本發(fā)明的多肽)或與含該多肽的細(xì)胞膜結(jié)合的抑制作用，和測(cè)定與所述多肽結(jié)合的配體量。能減少配體結(jié)合的化合物認(rèn)為是激動(dòng)劑或拮抗劑。優(yōu)選采用標(biāo)記的配體。
更具體說，篩選多肽拮抗劑或激動(dòng)劑化合物的方法包括以下步驟(a)將標(biāo)記的配體和表達(dá)(任選細(xì)胞表面表達(dá))本發(fā)明多肽的全細(xì)胞，或含有本發(fā)明多肽的細(xì)胞膜一同孵育；(b)檢測(cè)結(jié)合于全細(xì)胞或細(xì)胞膜的標(biāo)記配體量；(c)將候選化合物加入步驟(a)的標(biāo)記配體與全細(xì)胞或細(xì)胞膜的混合物中，使該混合物獲得平衡；(d)測(cè)定步驟(c)后與全細(xì)胞或細(xì)胞膜結(jié)合的標(biāo)記配體量；(e)比較步驟(b)與(d)標(biāo)記配體結(jié)合量的差別，能導(dǎo)致步驟(d)結(jié)合減少的化合物認(rèn)為是激動(dòng)劑或拮抗劑。
類似地，本發(fā)明提供了篩選多肽激拮抗劑或激動(dòng)劑化合物的方法，該方法包括步驟(a)將標(biāo)記配體與固相支持物上的或細(xì)胞表面的本發(fā)明多肽，或含本發(fā)明多肽的細(xì)胞膜一同培育；(b)檢測(cè)固相支持物、全細(xì)胞或細(xì)胞膜上結(jié)合的標(biāo)記配體量；(c)將候選化合物加入步驟(a)的標(biāo)記配體與固定在固相支持物、全細(xì)胞或細(xì)胞膜上多肽的混合物中，使該混合物獲得平衡；(d)測(cè)定步驟(c)后與固定多肽、全細(xì)胞或細(xì)胞膜結(jié)合的標(biāo)記配體量；(e)比較步驟(b)與(d)標(biāo)記配體結(jié)合量的差別，能導(dǎo)致步驟(d)結(jié)合減少的化合物認(rèn)為是激動(dòng)劑或拮抗劑。
本發(fā)明的INSP201多肽可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化。因此可在研究細(xì)胞分化和生長的系統(tǒng)中(例如器官培養(yǎng)試驗(yàn))或在瓊脂糖培養(yǎng)的集落試驗(yàn)系統(tǒng)中，檢測(cè)INSP201的生物學(xué)活性。可用各種試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖的刺激或抑制作用。
例如觀察細(xì)胞生長抑制可采用固體或液體培養(yǎng)基。在固體培養(yǎng)基中，可通過比較所形成集落的大小不難從所研究的細(xì)胞群挑選出生長受抑制的細(xì)胞。在液體培養(yǎng)基中，可通過檢測(cè)培養(yǎng)基的濁度或在DNA中摻入的標(biāo)記胸苷來篩選生長抑制集落。通?？衫脫饺氲叫潞铣蒁NA中的核苷類似物來檢測(cè)細(xì)胞群增殖(如活躍生長的細(xì)胞)。例如可采用溴脫氧尿苷(BrdU)作為DNA標(biāo)記試劑，和抗溴脫氧尿苷的小鼠單克隆抗體作為檢測(cè)試劑。此抗體只結(jié)合含有摻入的溴脫氧尿苷DNA的細(xì)胞。該試驗(yàn)可與許多檢測(cè)方法聯(lián)合使用，包括免疫熒光、免疫組化、ELISA、和比色方法。裝有溴脫氧尿苷(BrdU)和抗BrdU小鼠單克隆抗體的商品化試劑盒為可從BoehringerMannherm(Indianapolis，IN)處購得。
可通過使干細(xì)胞或胚胎細(xì)胞與不同量INSP多肽接觸，觀察其對(duì)干細(xì)胞或胚胎細(xì)胞分化的影響來檢測(cè)INSP201多肽對(duì)細(xì)胞分化的作用。采用組織特異性抗體和顯微鏡來鑒定所分化產(chǎn)生的細(xì)胞。
還發(fā)現(xiàn)INSP201多肽在上述試驗(yàn)中能以劑量依賴方式調(diào)節(jié)免疫和/或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的增殖和分化。因此，INSP201多肽的“功能等價(jià)物”包括在上述試驗(yàn)中顯示能以劑量依賴方式調(diào)節(jié)任何相同細(xì)胞生長和分化活性的多肽。雖然其劑量依賴活性(調(diào)節(jié)的)水平不需要與INSP201多肽相同，但優(yōu)選的“功能等價(jià)物”在給定的活性試驗(yàn)中與INSP201多肽相比，應(yīng)顯示基本上相似的的劑量依賴活性。
在上述某些實(shí)施方案中，可采用一種結(jié)合試驗(yàn)，該試驗(yàn)中通過標(biāo)記物直接或間接與某測(cè)試化合物的結(jié)合或與標(biāo)記的競爭試劑競爭，來檢測(cè)該測(cè)試化合物與含所述多肽表面的粘附。在另一實(shí)施方案中，采用藥物競爭篩選試驗(yàn)，該試驗(yàn)中能結(jié)合所述多肽的中和抗體與測(cè)試化合物競爭結(jié)合。以此方式，可利用抗體來檢測(cè)所存在的對(duì)所述多肽具有特異性結(jié)合親和力的任何測(cè)試化合物。
還可設(shè)計(jì)試驗(yàn)來檢測(cè)加入的測(cè)試化合物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生編碼所述多肽mRNA的影響。例如，可用單克隆或多克隆抗體以本領(lǐng)域所知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行ELISA，來檢測(cè)該多肽的分泌水平或細(xì)胞結(jié)合水平，可用此法來尋找能抑制或增強(qiáng)合適的細(xì)胞或組織產(chǎn)生所述多肽的化合物。然后檢測(cè)所述多肽與測(cè)試化合物之間形成的結(jié)合復(fù)合物。
提供了另一種可用于高通量篩選對(duì)感興趣多肽具有合適結(jié)合親和力化合物的藥物篩選技術(shù)(參見國際專利申請(qǐng)WO 84/03564)。此方法中，在固體基質(zhì)上合成許多不同的小分子測(cè)試化合物，然后使其與本發(fā)明多肽反應(yīng)并洗滌。一種固定所述多肽的方法是利用非中和抗體。然后可用本領(lǐng)域熟知的方法檢測(cè)結(jié)合的多肽。也可用純化的多肽直接包被板用于上述藥物篩選技術(shù)。
此種類型的其它技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。參見例如Adessi C.&Soto C.Curr.Med.Chem.2002.9(9)963-78；Strand F.L.Prog.Drug Res，2003，611-37；Hruby V.J.Nat.Rev，Drug Discov，2002，1(11)847-58。
可利用本發(fā)明多肽通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)受體結(jié)合技術(shù)，例如配體結(jié)合和交聯(lián)試驗(yàn)來鑒定膜結(jié)合或可溶性受體，這些試驗(yàn)中，將用放射性同位素標(biāo)記的所述多肽經(jīng)化學(xué)修飾，或與有利于檢測(cè)或純化的一種肽序列融合后，與推測(cè)的受體來源成分(如細(xì)胞組分、細(xì)胞膜、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織提取液或體液)一起培育。結(jié)合效率可用生物物理技術(shù)檢測(cè)，如表面等離子共振和分光光度法檢查?？捎媒Y(jié)合試驗(yàn)來純化和克隆受體，但也可用于鑒定所述多肽的與其受體競爭結(jié)合的激動(dòng)劑和拮抗劑。本領(lǐng)域熟知實(shí)施篩選試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及INSP201多肽或及片段在分離或產(chǎn)生治療免疫相關(guān)疾病的INSP201多肽激動(dòng)劑或刺激劑中的用途，其中，所述片段優(yōu)選INSP201基因特異性片段，所述激動(dòng)劑或刺激劑選自1.其特異抗體性或片段，包括a)嵌合抗體，b)人源化抗體，c)完全的人抗體，及2.雙特異性或多特異性抗體，3.單鏈抗體(如scFv)，或4.單域抗體，或5.源自所述抗體的肽或非肽模擬物6.抗體模擬物，如a)抗運(yùn)載蛋白(anticalin)，或b)纖連蛋白結(jié)合分子(如trinectin或adnectin)。
從抗體產(chǎn)生肽或非肽模擬物的(方法)是本領(lǐng)域知道的(Saragovi等，1991和1992)。
Anticalins(抗肽)也是本領(lǐng)域知道的(Vogt等，2004)。纖連蛋白結(jié)合分子見美國專利6818418和WO2004029224中的描述。
此外，測(cè)試化合物可以是不同來源、性質(zhì)和組成，例如小分子化合物、核酸、脂質(zhì)、肽、多肽(包括抗體，如嵌合、人源化或完全人抗體)或抗體片段、它們產(chǎn)生的肽或非肽模擬物，及雙特異性或多特異性抗體、單鏈抗體(如scFv)、或單域抗體、或抗體模擬物(如anticalin)、或纖連蛋白結(jié)合分子(如trinectin或adnectin)等的分離形式或混合形式或組合形式。
本發(fā)明還包括鑒定上述激動(dòng)劑、拮抗劑、配體、受體、底物、酶等方法中所用的篩選試劑盒。
本發(fā)明包括用上述方法發(fā)現(xiàn)的激動(dòng)劑、拮抗劑、配體、受體、底物、酶和其它能調(diào)節(jié)本發(fā)明多肽活性或抗原性的化合物。
如上所述，設(shè)想可利用本發(fā)明的各種物質(zhì)(即本發(fā)明第一方面所述多肽、本發(fā)明第二和第三方面所述核酸分子、本發(fā)明第四方面所述載體，本發(fā)明第五方面所述宿主細(xì)胞、本發(fā)明第六方面所述配體、本發(fā)明第七方面所述化合物)治療和診斷疾病。為評(píng)估本發(fā)明各物質(zhì)治療或診斷疾病的用途，可進(jìn)行以下一種或多種試驗(yàn)。注意，雖然以下試驗(yàn)中的測(cè)試化合物是蛋白質(zhì)/多肽，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易改進(jìn)以下試驗(yàn)，從而將本發(fā)明的其它分子也用作“測(cè)試化合物”。
本發(fā)明還提供了含有與合適的藥物運(yùn)載體組合的本發(fā)明多肽、核酸、配體或化合物的藥物組合物。這些組合物適合用作治療或診斷試劑，作為疫苗，或作為其它免疫原組合物，下文中將有詳細(xì)描述。
根據(jù)本文所用的術(shù)語，當(dāng)某組合物中X+Y的總量為至少85％為X時(shí)，含多肽、核酸、配體或化合物[X]的該組合物即是“基本上無”雜質(zhì)[在此稱為Y]，優(yōu)選X占該組合物中X+Y的總量至少約90％，更優(yōu)選至少占總量的至少約95重量％、98重量％、甚至99重量％。
所述藥物組合物宜含有治療有效量的本發(fā)明多肽、核酸分子、配體或化合物。本文所用的術(shù)語“治療有效量”指治療、改善或預(yù)防目標(biāo)疾病或病況所需的治療劑的用量，或顯示可檢測(cè)的治療或預(yù)防效果所需的治療劑用量。對(duì)于任何化合物的治療有效量可先用細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)估計(jì)，例如用腫瘤細(xì)胞，或在動(dòng)物模型(常用小鼠、家兔、狗或豬)估計(jì)。也可用動(dòng)物模型來測(cè)定給藥的合適濃度范圍和途徑。然后利用這些信息確定人體給藥的劑量和途徑。
人的精確有效用量取決于疾病的嚴(yán)重程度、對(duì)象的總體健康狀況、年齡、體重、對(duì)象的性別、飲食；給藥的時(shí)間和頻率；藥物聯(lián)用、反應(yīng)的靈敏度和對(duì)治療的耐受/反應(yīng)性。此用量可用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定，屬于臨床醫(yī)師的判斷范圍內(nèi)。通常有效劑量為0.01mg/kg-50mg/kg，優(yōu)選0.05mg/kg-10mg/kg?？蓡为?dú)給予病人此組合物，也可與其它制劑、藥物或激素組合給藥。
對(duì)于治療制劑的給藥，藥物組合物還可包含藥物學(xué)上可接受的運(yùn)載體。這些運(yùn)載體包括抗體和其它多肽、基因和其它治療劑(如脂質(zhì)體)，只要這些載體本身不誘導(dǎo)接受該組合物的個(gè)體產(chǎn)生有害的抗體，且給予的這些運(yùn)載體沒有不適當(dāng)毒性。合適的運(yùn)載體可以是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚羥乙酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和滅活的病毒顆粒。
這里也可采用藥物學(xué)上可接受的鹽，例如，無機(jī)酸鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；和有機(jī)酸鹽，如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。藥物學(xué)上可接受運(yùn)載體的全面論述可見《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)。
治療組合物中的藥物學(xué)上可接受運(yùn)載體還可包含液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，此類組合物中可存在輔佐物質(zhì)，如保濕劑或乳化劑、pH緩沖劑等。這些運(yùn)載體可使該藥物組合物配制成片劑、藥丸、糖衣丸、膠囊、液體、膠體、糖漿、膏劑、懸浮液等供病人攝取。
一旦配制后，可將本發(fā)明的組合物直接給予對(duì)象。治療的對(duì)象可以是動(dòng)物，尤其是人。
可通過多種途徑給予本發(fā)明所用的藥物組合物，包括但不限于口服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)內(nèi)或透皮應(yīng)用(例如參見專利WO98/20734)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸內(nèi)、局部、舌下含服、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)途徑。也可用基因槍或無針注射器給予本發(fā)明的藥物組合物。通常，將該治療組合物制成可注射制劑，如液體溶液或懸浮液；也可制成適合于注射前可用液體運(yùn)載體配成溶液或懸浮的固體形式。
該組合物的直接輸送常通過皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)注射完成，或輸送到組織間空隙處。也可在病灶處給予該組合物。治療劑量可以是單次劑量方案，或多次劑量方案。
如果對(duì)某特定疾病本發(fā)明多肽的活性過度，有幾種方法可使用。一種方法包括給予對(duì)象有效量的上述抑制化合物(拮抗劑)和藥物學(xué)上可接受的運(yùn)載體，以抑制該多肽的功能(例如阻斷配體、底物、酶、受體的結(jié)合，或通過抑制第二信號(hào))從而緩解異常情況。優(yōu)選的這種拮抗劑為抗體。最優(yōu)選這種抗體為上述嵌合性和/或人源化抗體，以使它們的免疫原性降到最低。
另一種方法是給予保留了對(duì)配體、底物、酶、受體結(jié)合親和力的所述多肽的溶液。通常給予保留了相關(guān)(活性)部分的所述多肽片段。
另一種方法，可利用表達(dá)阻斷技術(shù)，如使用內(nèi)源產(chǎn)生的或分別給予的反義核酸分子(如上所述)來抑制所述多肽編碼基因的表達(dá)。通過設(shè)計(jì)的與所述多肽編碼基因的控制、5’端或調(diào)節(jié)區(qū)(信號(hào)序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和內(nèi)含子)互補(bǔ)的序列或反義分子(DNA、RNA或PNA)，可調(diào)節(jié)該基因的表達(dá)。類似地，可用“三螺旋”堿基配對(duì)方法達(dá)到抑制效果。三螺旋配對(duì)有用是因?yàn)樗种屏穗p螺旋的充分打開并足以與聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)分子結(jié)合的能力。近年利用三螺旋DNA的治療進(jìn)展見文獻(xiàn)描述(Gee，J.E等(1994)InHuber，B.E和B.I.Carr，《分支和免疫方法》Molecular and Immunologic Approaches，F(xiàn)utura Publishing Co.，Mt.Kisco，NY)。也可設(shè)計(jì)互補(bǔ)序列或反義分子來防止轉(zhuǎn)錄物與核糖體的結(jié)合從而阻斷mRNA的翻譯?？山o予或在體內(nèi)表達(dá)原位生成這些寡核苷酸。
另外，可利用核酶對(duì)其編碼mRNA序列的特異性來防止本發(fā)明多肽的表達(dá)。核酶是有催化活性的RNA序列，可以是天然產(chǎn)生的或合成的(例如參見Usman，N等，Curr，Opin.Struct.Biol(1996)6(4)，527-33)?？稍O(shè)計(jì)合成的核酶在所選位點(diǎn)特異性切割mRNA從而防止mRNA翻譯成功能性多肽。可合成具有RNA分子中常見的天然核糖磷酸骨架和天然堿基的核酶?；蛘撸珊铣删哂蟹翘烊还羌艿暮嗣?，如2’-O-甲基RNA的核酶，以保護(hù)不受核糖核酸酶的降解，且其還可含修飾的堿基。
可修飾RNA分子以提高其細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性和半衰期。可能的修飾包括但不限于在該分子的5’端和/或3’端添加側(cè)接序列或使用硫代磷酸酯或2’-O-甲基連接的分子骨架而不是磷酸二酯鍵骨架。這個(gè)觀點(diǎn)源于PNA的產(chǎn)生，并可擴(kuò)展到所有包含非傳統(tǒng)堿基的那些分子，如次黃苷、queosine和butosine，以及乙?；?、甲基、硫代和具有類似修飾的形式的腺嘌呤，胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的，它們不易被內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶識(shí)別。
對(duì)于治療因本發(fā)明所述多肽異常表達(dá)低下或活性不足的相關(guān)疾病，也有幾種方法。一種方法包括給予對(duì)象治療有效量的能激活所述多肽的化合物(即上述激動(dòng)劑)以緩解異常狀況?；蛘?，聯(lián)合給予治療量的所述多肽和合適的藥學(xué)運(yùn)載體以恢復(fù)該多肽的相關(guān)生理學(xué)平衡。
可采用基因治療方法來影響對(duì)象的相關(guān)細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生所述多肽。基因治療通過用正確的治療基因替代缺陷基因可永久性治療所述多肽的不適當(dāng)產(chǎn)生。
本發(fā)明的基因治療可以是體內(nèi)或體外。離體基因治療需要分離和純化病人的細(xì)胞，在其中導(dǎo)入治療基因，再將遺傳改造的細(xì)胞輸回病人體內(nèi)。相反，體內(nèi)基因治療不需要分離和純化病人的細(xì)胞。
給予病人的治療性基因通常要“包裝”?；蜻f送運(yùn)載體可以是非病毒，如脂質(zhì)體，或復(fù)制缺陷型病毒，例如Berkner，K.L.，in Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，39-66(1992)中所述的腺病毒，或Muzyczka，N.，in Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，97-129(1992)和美國專利No.5,252,479中所述的腺相關(guān)病毒(AAV)載體。例如，可工程改造編碼本發(fā)明多肽的核酸分子使其能在復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中表達(dá)。然后分離該表達(dá)構(gòu)建物并導(dǎo)入已用含有編碼所述多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的包裝細(xì)胞中，從而使得該包裝細(xì)胞能產(chǎn)生含有感興趣基因的感染型病毒顆粒?？蓪⑦@些生產(chǎn)細(xì)胞給予對(duì)象來進(jìn)行體內(nèi)的細(xì)胞工程改造并在體內(nèi)表達(dá)所述多肽(參見《基因治療和其它分子遺傳基礎(chǔ)上的治療方法》Gene Therapy and other MulecularGenetic-based Therapeutic Approaches，第20章及其中引用的參考文獻(xiàn))，此文刊登在Human Molecular Genetics中(1996)，T Strachan and A P Read，BIOSScientific Publishers Ltd)。
另一方法是給予“裸DNA“，該方法將治療基因直接注射入血流或肌肉組織。
在本發(fā)明的多肽或核酸分子是致病因素的病例中，本發(fā)明提出可將其作為疫苗使用以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗該致病因素的抗體。
本發(fā)明的疫苗可以是預(yù)防性的(如預(yù)防感染)或治療性的(如治療感染后的疾病)。這種疫苗包括免疫抗原、免疫原、多肽、蛋白質(zhì)或核酸疫苗，它們通常與上述藥物學(xué)上可接受的運(yùn)載體混合，這些運(yùn)載體包括本身不誘導(dǎo)接受該組合物的個(gè)體產(chǎn)生有害抗體的任何運(yùn)載體。這些運(yùn)載體還可具有免疫刺激劑的功能(“佐劑”)。此外，可將所述抗體或免疫原與細(xì)菌類毒素(如白喉、破傷風(fēng)、霍亂、幽門螺桿菌和其它病原體的類毒素)相偶聯(lián)。
因?yàn)槎嚯脑谖钢锌山到?，所以?yōu)選經(jīng)胃腸道外給予(例如皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、或皮內(nèi)注射)含多肽的疫苗。胃腸道外給藥的合適制劑包括水性和非水性滅菌注射液，其可含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和能賦予該制劑與血液等滲壓的溶質(zhì)，和可含懸浮劑或增稠劑的水性和非水性滅菌懸液。
本發(fā)明的疫苗制劑可貯藏在單次或多次劑量的容器中。例如密封在安瓿和小瓶中，并在只需在臨用前加入滅菌運(yùn)載液的冷凍干燥條件下貯藏。劑量取決于該疫苗的比活性，這用常規(guī)實(shí)驗(yàn)不難確定。
也可用遺傳方法遞送能結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體，例如見國際專利申請(qǐng)WO98/55607中所述。
此疫苗組合物制劑也可采用稱為射流噴射(例如參見www.powderject.com)的技術(shù)制備。
許多合適的疫苗接種和疫苗遞送系統(tǒng)在國際專利申請(qǐng)WO 00/29428中已有描述。
本發(fā)明還涉及采用本發(fā)明的核酸分子作為診斷試劑。檢測(cè)到以與功能障礙相關(guān)的本發(fā)明核酸分子為特征的基因的突變形式，將提供加入或明確疾病的診斷或?qū)镜囊赘行缘脑\斷工具，由于所述基因表達(dá)低下、表達(dá)過度或表達(dá)的空間或時(shí)間上改變所導(dǎo)致疾病的診斷或?qū)膊〉囊赘行浴？捎酶鞣N技術(shù)在DNA水平上檢測(cè)攜帶所述基因突變的個(gè)體。
用于診斷的核酸分子可獲自對(duì)象的細(xì)胞，例如血液、尿液、唾液、組織活檢、尸體解剖材料中的細(xì)胞?？芍苯永没蚪MDNA進(jìn)行檢測(cè)，或在分析前用PCR、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)或其它擴(kuò)增技術(shù)對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶式擴(kuò)增后進(jìn)行檢測(cè)(參見Saiki等，Nature，324，163-166(1986)；Bej等，Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.，26，301-334(1991)；Birkenmeyer等，J.Virol.Meth.，35，117-126(1991)；Van Brunt，J.，Bio/Technology，8，291-294(1990))。
在一實(shí)施方案中，本發(fā)明此方面提供一種診斷病人疾病的方法，包括評(píng)估編碼本發(fā)明多肽的天然基因表達(dá)水平，和將所述表達(dá)水平與對(duì)照水平作比較，若與所述對(duì)照水平相比有差異，表明患病。該方法包括以下步驟a)在允許本發(fā)明的核酸分子與探針之間形成雜交復(fù)合物的嚴(yán)緊條件下，使病人組織樣品與核酸探針接觸；b)在與a)所用的相同條件下，使對(duì)照樣品與所述探針接觸；c)檢測(cè)所述樣品中是否存在雜交復(fù)合物；當(dāng)在病人樣品中檢測(cè)到的雜交復(fù)合物水平與對(duì)照樣品中檢測(cè)到的雜交復(fù)合物水平不同時(shí)，表明患病。
本發(fā)明的還有一個(gè)方面包括一種診斷方法，該方法包括步驟a)獲得待測(cè)試病人的組織樣品；b)分離所述組織樣品中本發(fā)明的核酸分子；c)檢測(cè)該核酸分子中疾病相關(guān)突變的存在而診斷病人的疾病。
為幫助上述方法檢測(cè)核苷酸分子，可包括擴(kuò)增步驟，如使用PCR。
可通過與正?；蛐捅容^而言擴(kuò)增產(chǎn)物的大小變化檢測(cè)缺失和插入?？墒箶U(kuò)增的DNA與本發(fā)明的標(biāo)記RNA雜交或與本發(fā)明的標(biāo)記反義DNA序列雜交，來鑒定點(diǎn)突變。可通過RNA酶消化或評(píng)估解鏈溫度的差異，來區(qū)別完全匹配的序列與錯(cuò)配的雙鏈體。檢測(cè)病人是否存在突變的方法是在形成雜交雙鏈體的嚴(yán)緊條件下使DNA與能雜交該DNA的核酸探針接觸，所述雜交雙鏈分子中的核酸探針鏈在任何與疾病相關(guān)突變相對(duì)應(yīng)的部位不雜交；檢測(cè)該探針鏈?zhǔn)欠翊嬖诓浑s交部位，可表明該DNA鏈相應(yīng)部位是否存在疾病相關(guān)突變。
該診斷對(duì)產(chǎn)前檢測(cè)，甚至新生后檢測(cè)特別有用。
參比基因和“突變”基因之間的點(diǎn)突變和其它序列差異可用其它熟知的技術(shù)，例如直接DNA測(cè)序或單鏈構(gòu)象多態(tài)性(參見Orita等，Genomics，5874-879，1989)鑒定。例如，測(cè)序引物可與改良PCR產(chǎn)生的單鏈模板分子或雙鏈PCR產(chǎn)物聯(lián)用。序列測(cè)定可用放射標(biāo)記核苷酸的常規(guī)方法進(jìn)行，或用熒光標(biāo)記的自動(dòng)測(cè)序方法進(jìn)行。也可利用克隆的DNA片段作為探針來檢測(cè)特定的DNA片段。與PCR連用時(shí)，此法的靈敏度大幅提高。此外，可如上所述檢測(cè)點(diǎn)突變和其它序列變化(如多態(tài)性)，例如將等位基因特異性寡核苷酸用于區(qū)別單個(gè)核苷酸的PCR序列擴(kuò)增。
DNA序列差異還可通過用或不用變性劑時(shí)DNA片段在凝膠中的電泳遷移變化檢測(cè)，或直接DNA測(cè)序(例如Myers等，Science(1985)2301242)。在也可用核酸酶保護(hù)試驗(yàn)(如用RNA酶和S1保護(hù))或化學(xué)剪切方法顯示特定位點(diǎn)的序列改變(參見Cotton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)4397-4401)。
除了常規(guī)凝膠電泳和DNA測(cè)序外，也可原位分析檢測(cè)突變，例如微缺失、非整倍性、易座、倒位(參見例如Keller等，《DNA探針》DNA Probes，第2版.，Stockton Press，New York，N.Y，USA(1993)，即無須分離細(xì)胞中的DNA或RNA序列和/或固定于膜上即可對(duì)其進(jìn)行突變分析。目前原位熒光雜交(FISH)是最常用的方法，并已發(fā)表了關(guān)于FISH的許多綜述(參見例如Trachuck等，Science，250559-562(1990)，和Trask等，Trends，Genet.，7149-154，1991)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可構(gòu)建含本發(fā)明核酸分子的寡核苷酸探針陣列來有效篩檢基因變體、突變和多態(tài)性。陣列技術(shù)方法是熟知的并已獲廣泛應(yīng)用，可用于解答分子遺傳學(xué)中包括基因表達(dá)、遺傳連鎖和遺傳變異等各種問題(參見例如M.Chee等，Science(1996)，卷274第610-613頁)。
在一實(shí)施方案中，制備此種陣列并如PCT申請(qǐng)WO 95/11995(Chee等)；Lockhart，D.J.等(1996)Nat.Biotech.141675-1680)；和Schena，M.等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.9310614-10619所述的方法使用。寡核苷酸對(duì)的數(shù)量可從2對(duì)到1,000,000對(duì)以上。用光指導(dǎo)化學(xué)方法在基材的指定區(qū)域合成寡聚物?；目梢允羌?、尼龍或其它類型的膜、濾膜、芯片、載玻片或其它合適的固體支持物。另一方面，可用PCT申請(qǐng)WO 95/25116(Baldeschweiler等)中所述的化學(xué)偶聯(lián)方法和噴墨施加設(shè)備，在基材表面合成寡核苷酸。在另一方面中，采用真空系統(tǒng)、熱、UV、機(jī)械或化學(xué)結(jié)合方法，以類似于點(diǎn)(或槽)的“網(wǎng)格”(gridded)陣列將cDNA片段或寡核苷酸排列和連接于基材表面?？捎檬止げ僮?，或可利用的裝置(狹縫印染或點(diǎn)印染儀)、材料(任何合適的固體支持物)、機(jī)械(包括機(jī)器人工具)產(chǎn)生上述陣列，該陣列可含8、28、96、384、1536或6144個(gè)寡核苷酸，或介于2-1,000,000個(gè)之間的其它數(shù)目的寡核苷酸，使它們用商品化可購買到的儀器可有效使用。
除上述方法外，還可通過包括測(cè)定對(duì)象樣品中所述多肽或mRNA水平的異常減少或增加的方法來診斷疾病。用本領(lǐng)域熟知的定量測(cè)定多核苷酸的方法，例如有核酸擴(kuò)增(如PCR，RT-PCR)、RNA酶保護(hù)、RNA印跡法和其它雜交方法檢測(cè)RNA水平上的表達(dá)減少和增加。
用于測(cè)定宿主樣品中本發(fā)明多肽水平的試驗(yàn)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并已在上文有所詳述(包括放射免疫試驗(yàn)、競爭結(jié)合試驗(yàn)、蛋白質(zhì)印跡分析和ELISA試驗(yàn))。本發(fā)明的這方面內(nèi)容提供了一種診斷方法，其包括步驟a)在適合形成配體-多肽復(fù)合物的條件下，使上述配體與生物樣品接觸；和b)檢測(cè)所述復(fù)合物。
ELISA、RIA和FACS等檢測(cè)多肽水平的方法還可提供診斷多肽表達(dá)水平改變或異常的基礎(chǔ)。在適合形成復(fù)合物的條件下，將取自正常哺乳動(dòng)物對(duì)象(優(yōu)選人類)的體液或細(xì)胞提取物與所述多肽的抗體混合，確立所述多肽表達(dá)的正?；驑?biāo)準(zhǔn)值?？捎枚喾N方法，如光度法，定量測(cè)定形成的標(biāo)準(zhǔn)復(fù)合物量。
可利用能特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體來診斷以該多肽表達(dá)為特征的病況或疾病，或用試驗(yàn)監(jiān)測(cè)使用本發(fā)明的多肽、核酸分子、配體和其它化合物治療的病人?？捎门c上述用于治療的相同方式制備診斷用抗體。所述多肽的診斷試驗(yàn)方法包括利用抗體和標(biāo)記檢測(cè)人體液或細(xì)胞或組織抽提物中的所述多肽。可采用修飾的或不修飾的抗體，可將它們與報(bào)告分子共價(jià)或非共價(jià)連接?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的各種報(bào)告分子，其中幾種在上面已有描述。
將對(duì)象、對(duì)照和疾病活檢組織樣品中表達(dá)的多肽量與標(biāo)準(zhǔn)值作比較。標(biāo)準(zhǔn)值與對(duì)象值之間的差異構(gòu)成了疾病診斷參數(shù)。用診斷試驗(yàn)區(qū)別所述多肽是否缺乏、存在和過度表達(dá)，和監(jiān)測(cè)治療干預(yù)期間多肽水平的調(diào)節(jié)。也可用這類試驗(yàn)評(píng)價(jià)動(dòng)物研究、臨床試驗(yàn)中特定治療方案的效果，或監(jiān)測(cè)各病人的治療效果。
本發(fā)明的診斷試劑盒可裝有a)本發(fā)明的核酸分子；b)本發(fā)明的多肽；c)本發(fā)明的配體。
在本發(fā)明的一個(gè)方面中，診斷試劑盒可包括裝有在嚴(yán)緊條件下能與本發(fā)明核酸分子雜交的核酸探針的第一容器；裝有用于擴(kuò)增核酸分子的引物的第二容器；和使用這些探針和引物以便于疾病診斷的說明書。該試劑盒還可包括裝有用于消化未雜交RNA的試劑的第三容器。
本發(fā)明的另一個(gè)方面中，診斷試劑盒可包括核酸分子陣列，陣列中至少有一個(gè)是本發(fā)明的核酸分子。
為檢測(cè)本發(fā)明的多肽，診斷試劑盒可包括一種或多種能結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體；和用于檢測(cè)該抗體與所述多肽之間結(jié)合反應(yīng)的試劑。
這種試劑盒可以用于診斷細(xì)胞表面糖蛋白家族成員相關(guān)疾病或?qū)Υ瞬〉囊赘行浴＿@些疾病可包括細(xì)胞增殖疾病(包括腫瘤、黑色素瘤、肺、結(jié)腸直腸、乳腺、胰腺、腦、頭頸和其它實(shí)體腫瘤)；骨髓增殖疾病(如白血病、非何杰金淋巴瘤、白血球減少癥、血小板減少癥、血管發(fā)生疾病、卡波齊氏肉瘤)；自身免疫/炎癥疾病(包括變態(tài)反應(yīng)、炎性腸病、關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和呼吸道炎癥、哮喘、器官移植排斥)；心血管疾病(包括高血壓、水腫、心絞痛、動(dòng)脈硬化、血栓、敗血癥、休克、再灌注損傷和局部缺血)；神經(jīng)疾病(包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、阿爾茨海默病、腦損傷、肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化和疼痛)；呼吸道疾病(包括慢性阻塞性肺病、囊腫性纖維化)；發(fā)育疾??；代謝疾病(包括糖尿病、骨質(zhì)疏松癥和肥胖、艾滋病和腎病)；感染(包括病毒感染、細(xì)菌感染、真菌感染和寄生蟲感染)和其它病理?xiàng)l件。優(yōu)選所述疾病為淋巴細(xì)胞抗原相關(guān)疾病。該試劑盒還可用于檢測(cè)包括不育等生殖疾病。
現(xiàn)通過關(guān)于INSP201多肽的具體實(shí)施例，更詳細(xì)描述本發(fā)明的各個(gè)方面和實(shí)施方案。
應(yīng)知道，可不背離本發(fā)明的范圍對(duì)本發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)修改。
可將本發(fā)明的可溶性INSP201的拮抗劑(如INSP20I-EC)或膜結(jié)合INSP201的激動(dòng)劑(如激動(dòng)性抗體)單獨(dú)給藥或與其它幾種治療方案或抗癌劑聯(lián)用(如多種藥物治療方案)以獲得對(duì)癌癥、HIV和/或EBV和乙肝病毒感染的累加或協(xié)同治療和/或預(yù)防效果。
抗癌劑可選自鉑化合物(如順鉑和卡鉑)，長春花生物堿(如長春瑞賓、長春新堿和長春堿)，紫杉?jí)A(如多西他賽和紫杉醇)，各種拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，IL-2和干擾素α。
可將本發(fā)明的可溶性INSP201的激動(dòng)劑(如INSP201-EC)或膜結(jié)合INSP201的拮抗劑(如拮抗性抗體抗體)單獨(dú)給藥或與其它幾種治療方案或制劑聯(lián)用(如多種藥物治療方案)以獲得治療和/或預(yù)防炎癥和/或自身免疫疾病的累加或協(xié)同治療效果。
抗炎制劑可選自干擾素β，環(huán)孢霉素A，他克莫司和西羅莫司斯。
附圖的簡要說明

圖1用NetNGlyc1.0預(yù)測(cè)的INSP201的糖基化位點(diǎn)。
圖2INSP201的cDNA和蛋白質(zhì)序列。箭頭所指為用于克隆的PCR引物位置。預(yù)計(jì)的胞外結(jié)構(gòu)域用深灰色表示。
圖3核苷酸序列和INSP201EC PCR產(chǎn)物的翻譯。
圖4主要組織收集物的INSP201-EC Taqman分析。
圖5相比較組織的INSP201-EC Taqman分析。
圖6各種炎性腸病(IBD)活檢組織的INSP201-EC Taqman分析。
圖7INSP201-EC對(duì)ConA激活的PBMC的IL-2分泌的抑制作用。X-軸代表AS902132/2濃度(μg/ml)。Y-軸代表分泌的細(xì)胞因子(IL-2)濃度。
表1

表2

實(shí)施例1INSP201的鑒定和硅分析如上所述，預(yù)計(jì)INSP201多肽作為細(xì)胞表面糖蛋白發(fā)揮功能。INSP201的信號(hào)P-NN輸出顯示此蛋白質(zhì)含有一前導(dǎo)序列，可在該序列的21位與22位之間切斷此序列(Nielsen，H等，1997，《蛋白質(zhì)工程》Protein Engineering，10，1-6；Nielsen H和Krogh A″用Markov的隱蔽模式預(yù)測(cè)信號(hào)肽和信號(hào)錨著點(diǎn)″，Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markovmodel，登載于《分子生物學(xué)智能系統(tǒng)第6屆國際大會(huì)(ISMB6)論文集》Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology(ISMB6)，AAAI Press，Menlo Park，Califorina，122-130頁，1998)。存在前導(dǎo)序列與INSP201蛋白作為分泌性蛋白的功能相一致。
INSP201的TMHMM結(jié)果表明，該多肽在殘基406-428之間含有一跨膜結(jié)構(gòu)域。TMHMM是根據(jù)已知的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域的數(shù)據(jù)庫。
圖1顯示INSP201的NetNGlyc(版本1.0)(http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetNGlyc/)結(jié)果。NetNGlyc是一種基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法的程序，經(jīng)訓(xùn)練可用于鑒定N-連接糖蛋白、Asn-Xaa-Ser/Thr(其中Xaa不是脯氨酸)和周圍序列上下中的共有序列，以區(qū)分受者與非受者序列子(sequons)。糖基化是一種重要的翻譯后修飾，已知它可影響蛋白質(zhì)的折疊、定位、運(yùn)送、蛋白質(zhì)溶解性、抗原性、生物學(xué)活性和半衰期及細(xì)胞間相互作用。
在本文所提供的這些實(shí)驗(yàn)和INSP201序列信息的基礎(chǔ)上，現(xiàn)已能設(shè)計(jì)出檢測(cè)各種人組織類型中INSP201轉(zhuǎn)錄物存在的實(shí)驗(yàn)，以測(cè)定其組織表達(dá)。此外，將有可能設(shè)計(jì)出檢測(cè)各種正常和患病組織中INSP201轉(zhuǎn)錄物存在的實(shí)驗(yàn)，以確定INSP201蛋白與疾病病理發(fā)展更具體的相關(guān)性。
同時(shí)，從人基因組中克隆INSP201基因?qū)⒖稍谠撕驼婧吮磉_(dá)系統(tǒng)中高水平表達(dá)INSP201蛋白及其隨后的純化和特征鑒定。例如，可利用重組INSP201來產(chǎn)生INSP201特異性單克隆抗體或多克隆抗體，將其用于INSP201的進(jìn)一步生化特征分析?；蛘撸蓪⒅亟MINSP201廣泛用于各種篩選試驗(yàn)，包括上述的那些試驗(yàn)。
實(shí)施例2目前正在克隆編碼INSP201蛋白的基因。這可包括，利用例如酶(如SuperscriptlI RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen))從各種正常人組織總RNA樣品(可購自Clontech，Stratagene，Ambion，Biochain Institute和自制)制備人cDNA模板?？蓮腃lontech，Invitrogen購賣人cDNA庫(在噬菌體λ載體中)或在λGT10載體中自制人cDNA庫。采用軟件，如引物設(shè)計(jì)軟件(Scientific&Educational Software，PO Box 72045，Durham，NC 27722-2045，USA)設(shè)計(jì)特異性PCR引物對(duì)來擴(kuò)增真實(shí)cDNA的整個(gè)編碼序列。也可利用相同的軟件設(shè)計(jì)特異性PCR引物對(duì)來擴(kuò)增各預(yù)計(jì)外顯子的DNA序列。將這些分離的DNA片段用克隆載體、PCR反應(yīng)和/或DNA限制/連接反應(yīng)按所需順序裝配在一起。優(yōu)化PCR引物使其Tm接近55+10℃和GC含量為40-60％。選擇對(duì)靶序列(IHSP201)選擇性高而非特異性引導(dǎo)作用小或無的引物。然后可用PCR擴(kuò)增感興趣的基因序列。本領(lǐng)域知道克隆該序列所必需的程序，例如PCR產(chǎn)物的亞克隆、菌落PCR(colony PCR)、質(zhì)粒PCR的制備和測(cè)序，及最終的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建(見例如WO 03/055913)。
根據(jù)本文所述的核苷酸和氨基酸序列可進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來測(cè)定INSP201多肽的體內(nèi)組織分布和表達(dá)水平。
例如，可對(duì)不同人組織的cDNA進(jìn)行PCR以研究INSP201轉(zhuǎn)錄物的存在。所測(cè)試樣品中的INSP201轉(zhuǎn)錄物水平可能很低。因此，設(shè)計(jì)用于測(cè)定各種人組織中該轉(zhuǎn)錄物存在的實(shí)驗(yàn)需要特別小心，因?yàn)镽NA制品中存在的小量基因組污染物將導(dǎo)致假陽性結(jié)果。故所有的RNA應(yīng)用DNA酶處理后再用于逆轉(zhuǎn)錄。此外，對(duì)于各組織應(yīng)設(shè)置不會(huì)發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄的對(duì)照反應(yīng)(-ve RT對(duì)照)。
例如，用多重轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄酶(Multiscript reverse transcriptase，ABI)和隨機(jī)六聚引物以1微克的各組織總RNA來產(chǎn)生cDNA。對(duì)于各組織，在設(shè)置的對(duì)照反應(yīng)中，加入除逆轉(zhuǎn)錄酶以外的所有組分(-ve RT對(duì)照)。各組織設(shè)置對(duì)逆轉(zhuǎn)錄RNA樣品和負(fù)RT對(duì)照的PCR反應(yīng)。根據(jù)本文提供的序列信息不難設(shè)計(jì)INSP201的特異性引物。在逆轉(zhuǎn)錄樣品中存在分子量正確的產(chǎn)物且不含負(fù)RT對(duì)照產(chǎn)物即可證明該組織中存在轉(zhuǎn)錄物。不僅如上所述那樣產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物，也可利用任何合適的cDNA庫篩選INSP201轉(zhuǎn)錄物。
INSP201多肽的組織分布方式將進(jìn)一步提供與這些多肽功能相關(guān)的有用信息。
此外，可利用這些多肽在諸細(xì)胞系中的過度表達(dá)或敲除表達(dá)，來測(cè)定其對(duì)宿主細(xì)胞基因組轉(zhuǎn)錄活性的影響?？捎妹庖叱恋砺?lián)合蛋白質(zhì)印跡法，和免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜來鑒定INSP201多肽的二聚體伴侶、協(xié)同激活劑和協(xié)同抑制劑。
實(shí)施例3INSP201胞外結(jié)構(gòu)域的克隆預(yù)計(jì)INSP201是一種單次跨膜蛋白質(zhì)，具有一個(gè)尚未弄清楚的胞外結(jié)構(gòu)域(N-端)和一個(gè)保守的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(可能參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))。預(yù)計(jì)其全長是在3個(gè)外顯子中編碼的518個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)(1554bp)。其胞外結(jié)構(gòu)域預(yù)計(jì)由前405個(gè)氨基酸(1215bp)編碼。預(yù)計(jì)該胞外結(jié)構(gòu)域除3’-最遠(yuǎn)端32bp外均由外顯子1編碼。
設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物(INSP201-CP1/1NSP201-CP2)(圖2)來擴(kuò)增預(yù)計(jì)含有整個(gè)預(yù)計(jì)的胞外結(jié)構(gòu)域的1215bp產(chǎn)物。INSP201-CP2反向PCR引物長51bp，其中19bp與外顯子1的3’端相重疊，以及該胞外域的32bp由外顯子2編碼。在PCR中這些引物與作為模板的基因組DNA一起應(yīng)用。INSP201-CP2引物可擴(kuò)增外顯子1，同時(shí)將外顯子2的32bp加到該P(yáng)CR產(chǎn)物上。在凝膠上觀察PCR產(chǎn)物，純化預(yù)計(jì)大小的條帶將其克隆入pCR4-TOPO克隆載體中。
通過序列分析鑒別了含有INSP201胞外結(jié)構(gòu)域的克隆。該克隆是質(zhì)粒pCR4-TOPO-INSP201-EC。
3.1PCR的基因特異性克隆引物用引物設(shè)計(jì)軟件(Scientific&Educational Software，PO Box72045，Durham，NC 27722-2045，USA)設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物(INSP201-CP1和INSP201-CP2，表3)來擴(kuò)增含有真實(shí)cDNA的預(yù)計(jì)編碼序列的1215bp產(chǎn)物。所選的引物對(duì)靶序列(INSP201)具有高選擇性。
3.2基因組DNA中INSP201胞外結(jié)構(gòu)域的PCR預(yù)計(jì)INSP201胞外結(jié)構(gòu)域的大部分由一個(gè)外顯子組成，因此可從基因組DNA擴(kuò)增。在外顯子2中編碼的該胞外結(jié)構(gòu)域的32bp包含在INSP201-CP2反向PCR引物中，此引物還含有與外顯子1的3’末端相重疊的19bp。用基因特異性克隆引物INSP201-CP1/INSP201-CP2，和作為模板的基因組DNA，在最終體積50微升含1x PlatinumTaq高保真(HiFi)緩沖液、2mM MgSO4、200μM dNTPs、0.2μM各克隆引物、1單位PlatinumTaq高保真DNA聚合酶(HiFi)(Invitrogen)、100ng基因組DNA(Novagen，Inc.)和0X、1X或2X PCRx增強(qiáng)子溶液(Invitrogen)中進(jìn)行PCR。用MJ Research DNAEngine儀進(jìn)行循環(huán)，程序如下94℃，2分鐘；35輪94℃，30秒、68℃，1分30秒；然后一輪68℃，78分鐘；4℃維持循環(huán)。
在1X TAE緩沖液(Invitrogen)中的0.8％瓊脂糖凝膠上觀察擴(kuò)增產(chǎn)物。用MinElute DNA純化系統(tǒng)(Qiagen)和10微升EB緩沖液(10mMTris.Cl，pH8.5)洗脫，純化預(yù)計(jì)分子量(1215bp)的PCR產(chǎn)物，直接亞克隆。
3.3PCR產(chǎn)物的亞克隆用購白Invitrogen公司的TA克隆試劑盒在廠商指定的條件下將PCR產(chǎn)物亞克隆入經(jīng)拓?fù)洚悩?gòu)酶I修飾的克隆載體(pCR4-TORO)中。簡而言之，取4微升凝膠純化PCR產(chǎn)物室溫與1微升TOPO載體和1微升鹽溶液一起培育15分鐘。然后如下將該反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen)在冰上融化50微升一等份的One Shot TOP10細(xì)胞，加入2微升TOPO反應(yīng)液。冰上培育該混合物15分鐘，42℃精確培育30秒使之熱激。將樣品返回冰上加入250微升溫?zé)?室溫)的SOC培養(yǎng)基。37℃振搖(220rpm)培育樣品1小時(shí)。將所有體積的轉(zhuǎn)化混合物接種在含氨芐青霉素(100μg/ml)的肉湯(LB)平板上37℃培養(yǎng)過夜。
3.4菌落PCR將菌落用滅菌牙簽接種在50微升滅菌水中。取10微升一等份接種物用MJResearch DNA Engine儀進(jìn)行PCR，反應(yīng)總體積20微升，含1X AmpliTaqTM緩沖液、200μM dTNPs、20pM T7引物、20pM T3引物和1單位AmpliTaqTM酶(Applied Biosystems)。循環(huán)條件如下94℃，2分鐘；30輪94℃，30秒、48℃，30秒和72℃，1分30秒；進(jìn)一步分析前將樣品維持在4℃(維持循環(huán))。
在1X TAE緩沖液中的1％瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物。37℃在含氨芐青霉素(100μg/ml)的5ml L-肉湯(LB)中220轉(zhuǎn)/分搖動(dòng)培養(yǎng)產(chǎn)生接近預(yù)計(jì)分子量(1215bp+105bp，由于有多個(gè)克隆位點(diǎn)(MCS))PCR產(chǎn)物的菌落。
3.5質(zhì)粒DNA的制備和測(cè)序用Biorobot 8000robotic系統(tǒng)(Qiagen)或Wizard Plus SV Minipreps試劑盒(Promega目錄號(hào)1460)按照廠商說明從5ml培養(yǎng)物中制備微量DNA質(zhì)粒。以80微升滅菌水洗脫質(zhì)粒DNA。用Spectramax 190光度計(jì)(MolecularDevices)測(cè)定DNA濃度。用BigDye Terminator系統(tǒng)(Applied Biosystems目錄號(hào)4390246)按照廠商說明，以T7和T3引物及基因特異性引物INSP201-SP1和INSP201-SP2對(duì)質(zhì)粒DNA(200-500ng)進(jìn)行DNA測(cè)序。引物的序列見表3。用Dye-Ex柱(Qiagen)或Montage SEQ 96清潔板(Millipore目錄號(hào)LSKS09624)純化測(cè)序列反應(yīng)物，然后在Applied Biosystems3700測(cè)序儀上分析。
序列分析鑒定到在氨基酸水平有一個(gè)克隆含有與預(yù)計(jì)的INSP201胞外結(jié)構(gòu)域100％相匹配的序列。此克隆的cDNA片段的序列見圖3。該克隆的PCR產(chǎn)物在質(zhì)粒pCR4-TOPO-INSP201-EC中。
3.6INSP201-EC哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建將質(zhì)粒pCR4-TOPO-INSP201-EC用作PCR模板，采用GatewayTM克隆法(Invitrogen)，產(chǎn)生含有INSP201-EC ORF序列和編碼6HIS標(biāo)記物的3’序列的pEAK12d和pDEST12.2表達(dá)克隆。
3.7產(chǎn)生與6HIS標(biāo)記物序列融合的Gateway相容性INSP201-EC ORFGateway克隆過程第一階段包括二步PCR反應(yīng)產(chǎn)生5’端側(cè)接attB1重組位點(diǎn)和Kozak序列、3’端側(cè)接編碼框內(nèi)6組氨酸(6HIS)標(biāo)記物、終止密碼子和attB2重組位點(diǎn)的INSP201-EC ORF(Gateway相容性cDNA)。
第一PCR反應(yīng)(終體積50微升)各含1μl(30ng)質(zhì)粒pCR4-TOPO-INSP201-EC、1.5μldNTPs(10mM)、10μl 10XPfx聚合酶緩沖液、1μlMgSO4(50mM)、0.5μl各基因特異性引物(100μM)(INSP201EC-EX1和INSP201EC-EX2)及0.5μlPlatinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)。如下進(jìn)行PCR反應(yīng)先95℃變性2分鐘；然后12輪94℃，15秒、55℃，30秒和68℃，2分鐘；4℃維持。用Wizard PCR Preps DNA純化系統(tǒng)(Promega)按照廠商說明書，直接純化擴(kuò)增產(chǎn)物，回收在50微升滅菌水中。
第二PCR反應(yīng)(終體積50微升)含10μl純化的PCR1產(chǎn)物、1.5μldNTPs(10mM)、5μl 10XPfx聚合酶緩沖液、1μl MgSO4(50mM)、0.5μl各Gateway轉(zhuǎn)變引物(100μM)(GCP正向和GCP反向)及0.5μl Platinum PfxDNA聚合酶(Invitrogen)。第二PCR反應(yīng)條件如下先95℃，1分鐘；4輪94℃，15秒、50℃，30秒和68℃，2分鐘；25輪94℃，15秒、55℃，30秒和68℃，2分鐘；然后4℃維持。取10微升一等份在1X TAE緩沖液中的0.8％瓊脂糖凝膠(Invitrogen)電泳觀察，驗(yàn)證具有預(yù)計(jì)分子量(1215+70＝1285bp)的產(chǎn)物。將其余的40微升加到1X TAE緩沖液中的0.8％瓊脂糖凝膠上，用Wizard PCR Preps DNA純化系統(tǒng)(Promega)按照廠商說明書，純化條帶回收到50微升滅菌水中。
3.8將Gateway相容的INSP201-EC ORF亞克隆到Gateway全載體pDONR221和表達(dá)載體pEAK12d-PAC及pDEST12.2中。
Gateway克隆過程第二階段包括如下將Gateway修飾的PCR產(chǎn)物亞克隆到Gateway全載體pDONR221(Invitrogen)中取5μl純化的PCR2產(chǎn)物與1.5μl pDONR221載體(0.1μg/μl)、2μl BP緩沖液和1.5μl BP克隆酶混合物(Invitrogen)混合，終體積10μl，室溫培育1小時(shí)。加入1μl(2μg/μl)蛋白酶K終止反應(yīng)，在37℃再培育10分鐘。取1等份(1μl)該反應(yīng)物如下經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B在冰上融化25μl電穿孔DH10B感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)，加入1μl BP反應(yīng)混合物。將該混合物移入一預(yù)冷的0.1cm電穿孔小杯中，用BioRad Gene-PulserTM(電脈沖儀)按廠商推薦的方法使細(xì)胞電穿孔。電穿孔后立即加入室溫預(yù)熱的SOC培養(yǎng)液(0.5ml)。將混合液移入雷管式(snap-cap)15ml試管中37℃搖動(dòng)(220rpm)培養(yǎng)1小時(shí)。取等份轉(zhuǎn)化混合物(10μl和50μl)接種在含卡那霉素(40μg/ml)的L-肉湯(LB)平板，37℃培養(yǎng)過夜。
用Qiaprep BioRobot 8000系統(tǒng)(Qiagen)從得到的8個(gè)菌落的5ml培養(yǎng)物中制備微量質(zhì)粒DNA。采用BigDye Terminator系統(tǒng)(Applied Biosystems目錄號(hào)4336919)按廠商說明書，用21M13和M13Rev引物及上述基因特異性測(cè)序引物INSP201-319F-SP1和INSP201-570F-SP1測(cè)定質(zhì)粒DNA(150-200ng)的DNA序列。引物序列見表3。用Montage SEQ 96清潔板(Millipore目錄號(hào)LSKS09624)純化測(cè)序反應(yīng)物，然后在Applied Biosystems 3700測(cè)序儀上分析。
然后用從含有INSP201-EC-6HIS插入物(pENTR_INSP201-EC-6HIS)的克隆得到的質(zhì)粒洗脫液(2μl或大約150ng)進(jìn)行重組反應(yīng)，該反應(yīng)物包含1.5μl pEAK12d-PAC載體或pDEST12.2載體(0.1μg/μl)、2μl LR緩沖液和1.5μl LR克隆酶(Invitrogen)，終體積10μl。室溫培育該混合物1小時(shí)，加入1μl(2μg/μl)蛋白酶K終止反應(yīng)，37℃再培育10分鐘。取1等份(1μl)如下經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B細(xì)胞在冰上融化25μl電穿孔感受態(tài)DH10B細(xì)胞(Invitrogen)，加入1μl LR反應(yīng)混合物。將該混合物移入一預(yù)冷的0.1cm電穿孔小杯中，用BioRad Gene-PulserTM按廠商推薦的方法使細(xì)胞電穿孔。電穿孔后立即加入室溫預(yù)熱的SOC培養(yǎng)液(0.5ml)。將混合液移入雷管式15ml試管中，37℃搖動(dòng)(220rpm)培養(yǎng)l小時(shí)。然后取等份轉(zhuǎn)化混合物(10μl和50μl)接種在含氨芐青霉素(100μg/ml)的L-肉湯(LB)平板，37℃培養(yǎng)過夜。
用Qiaprep BioRobot 8000系統(tǒng)(Qiagen)從得到的克隆中的6個(gè)的5ml培養(yǎng)物制備微量質(zhì)粒DNA。如上所述用pEAK12F和pEAK12R引物及基因特異性測(cè)序引物INSP201-319F-SP1和INSP201-570F-SP1測(cè)定pEAK12d-PAC載體的質(zhì)粒DNA(200-500ng)的DNA序列。用21M13和M13Rev引物及上述基因特異性測(cè)序引物測(cè)定pDEST12.2載體的質(zhì)粒DNA(200-500ng)的DNA序列。引物序列見表3。
用Sambrook J等，1989(《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》Molecular Cloning，aLaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述方法，從序列經(jīng)過驗(yàn)證的克隆(pEAK 12d-PAC_INSP201-EC-6HIS)的500ml培養(yǎng)物制備CsCl梯度純化的大抽提DNA(maxi-prep)。用滅菌水(或10mMTris-HCl pH8.5)重懸質(zhì)粒DNA至1μg/μl濃度，-20℃保存。
用EndoFree Plasmid Mega試劑盒(Qiagen)，按照廠商說明書從序列經(jīng)過驗(yàn)證的克隆(pDEST12.2_INSP201-EC-6HIS)的500ml培養(yǎng)物制備無內(nèi)毒素的大抽提DNA。將純化的質(zhì)粒DNA用無內(nèi)毒素的TE緩沖液重懸至最終濃度至少3μg/μl，-20℃保存。
表3INSP201克隆和測(cè)序引物 下劃線序列＝Kozak序列。粗體＝終止密碼子。斜體字序列＝His標(biāo)記物。
實(shí)施例4克隆的含His標(biāo)記的質(zhì)粒pEAK12d-PAC INSP201-EC-6HIS在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的功能性基因組表達(dá)和純化將表達(dá)非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒(epstein-barr virus，EB病毒)核抗原(HEK293-EBNA，Invitrogen)的人胚腎293細(xì)胞懸浮維持培養(yǎng)在Ex-cell VPRO無血清培養(yǎng)基中(種畜，維持培養(yǎng)基，JRH)。將細(xì)胞以1×106個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種到添加有1％FCS的250ml FEME(DMEM/Ham’s F-12 1∶1 19mMHEPES，5g/L葡萄糖、7.5mM L-谷氨酰胺、4ml/L ITS-X)(均購自Invitrogen-Life Technologies)培養(yǎng)基中。為了轉(zhuǎn)染，將500μg DNA(pEAK12d-PAC_INSP201-EC-6HIS)加10μg報(bào)告基因DNA的混合物用50ml FEME 1％FCS稀釋。然后加入1ml PEI(1mg/l Polysciences，USA)。室溫培育該混合物10分鐘。10分鐘后將該轉(zhuǎn)染混合物加入細(xì)胞，將培養(yǎng)物在培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)90分鐘。最后在該體積上部加入其余200ml FEME 1％FCS(含2.5mlPen-Strep)以防止未除菌DNA的污染。第6天經(jīng)定量熒光檢測(cè)(Axiovert 10Zeiss)證實(shí)陽性轉(zhuǎn)染。第6天(收獲日)離心(4℃，400g)收集上清液(500ml)，置于帶獨(dú)特標(biāo)記的罐中。
4.1純化方法將含C-末端6HIS標(biāo)記的重組蛋白的500ml培養(yǎng)液樣品，用一倍體積冷緩沖液A(50mM NaH2PO4、600mM NaCl、8.7％(w/v)甘油、pH7.5)稀釋至最終體積1000ml。通過0.22μm滅菌濾膜(Millipore，500ml過濾單元)過濾此樣品，4℃保存在1升方形培養(yǎng)瓶(Nalgene)中。
4℃在連接有自動(dòng)化加樣器(Labomatic)的VISION工作站(AppliedBiosystems)上進(jìn)行純化。純化過程包括連續(xù)的二步驟在結(jié)合有Ni離子的Poros 20MC(Applied Biosystems)柱(10×50mm，3.93ml)進(jìn)行金屬離子親和層析，然后在Sephadex G-25介質(zhì)(Amersham Pharmacia)凝膠過濾柱(1.0×15cm)上進(jìn)行緩沖液交換。
對(duì)于第一層析步驟，用30倍柱體積的EDTA液(100mM EDTA，1MNaCl，pH8.0)再生該金屬離子親和柱，再用15倍柱體積的100mM NiSO4溶液洗滌重新加載Ni離子，用10倍柱體積的緩沖液A洗滌、然后用7倍柱體積的緩沖液B(50mM NaH2PO4、600mM NaCl、8.7％(w/v)甘油、400mM咪唑、pH7.5)洗滌、最后用15倍柱體積含15mM咪唑的緩沖液A平衡。用Labomatic加樣器將樣品轉(zhuǎn)移到200ml樣品環(huán)路中，然后加到Ni金屬親和柱上，流速20ml/分鐘。重復(fù)此加樣過程5次將全部樣品(1000ml)加到Ni柱上。然后用12倍柱體積緩沖液A、28倍柱體積含20mM咪唑的緩沖液A洗滌此柱。20mM咪唑可使吸附的污染蛋白質(zhì)松弛而從柱上洗脫。最后用10倍柱體積的緩沖液B以2ml/分鐘流速洗脫含His標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)，收集在2.7ml組分中洗脫的蛋白質(zhì)。
對(duì)于第二層析步驟，用2ml緩沖液D(1.137M NaCl，2.7mM KCl、1.5mMKH2PO4、8mM NaH2PO4、pH7.2)再生G-25凝膠過濾柱，然后用4倍柱體積緩沖液C(137mM NaCl，2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4、8mM NaH2PO4、20％(w/v)甘油、pH7.2)平衡。通過VISION上集成組裝的加樣器將Ni柱洗脫峰組分自動(dòng)加到Sephadex G-25柱上，用緩沖液C以2ml/分鐘的流速洗脫蛋白質(zhì)。回收2.7ml組分中的脫鹽樣品。通過0.22μm滅菌離心過濾器(Millipore)過濾此組分，分成等份，-80℃凍存。取一份樣品作SDS-PAGE(4-12％NuPAGE凝膠；Novex)分析，考馬斯蘭染色，用抗-His抗體作蛋白質(zhì)印跡。
4.2考馬斯蘭染色用0.1％考馬斯蘭R250染色液(30％甲醇、10％乙酸)室溫染色NuPAGE凝膠1小時(shí)，然后用20％甲醇、7.5％乙酸脫色直到背景清亮且蛋白質(zhì)條帶清晰可見。
4.3蛋白質(zhì)印跡電泳后在4℃下以290mA 1小時(shí)將蛋白質(zhì)從凝膠電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。室溫下用5％奶粉的緩沖液E(137mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4，8mMNaH2PO4，0.1％Tween20、pH7.4)封閉此膜1小時(shí)，然后4℃與兩種兔多克隆抗-His抗體(G-18和H-15，各0.2μg/ml；Santa Cruz)的2.5％奶粉的緩沖液E溶液混合培育過夜。室溫再培育1小時(shí)后，用緩沖液E洗滌此膜(3×10分鐘)，再與用2.5％奶粉的緩沖液E以1/3000稀釋偶聯(lián)HRP的抗兔第二抗體(DAKO，HRP 0399)一起室溫培育2小時(shí)。用緩沖液E洗滌(3×10分鐘)后，用ECL試劑盒(Amersham)顯色此膜1分鐘。然后使此膜暴光到Hyperfilm(Amersham)膠片，觀察分析膜顯色和蛋白質(zhì)印跡。
實(shí)施例5用TaqMan分析法分析INSP201基因的表達(dá)水平采用SYBR綠(熒光)化學(xué)物質(zhì)在ABI PRISM 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。設(shè)計(jì)的引物對(duì)可產(chǎn)生跨越待分析序列內(nèi)含子的產(chǎn)物。測(cè)定用隨機(jī)引物從RNA樣品制備的一組RT-PCR產(chǎn)物的表達(dá)水平。
用Superscript III第一鏈RT-PCR合成系統(tǒng)(Invitrogen，目錄號(hào)18080-051)逆轉(zhuǎn)錄各樣品的總RNA，最終反應(yīng)體積20微升。取2μl總RNA與50ng隨機(jī)六聚體引物、dATP、dGTP、dCTP和dTTP各10mM、和DEPC處理水混合，體積共10μl。65℃培育此混合物5分鐘，冰上冷卻1分鐘。在不同試管中制備以下10μl cDNA合成混合物2μl 10xRT緩沖液、4μl 25mMMgCl2、2μl 0.1M DTT、1μl RnaseOUTTM(40單位/μl)和1μl SuperScriptTMIII RT酶(200單位/μl)。將該cDNA合成混合物加入RNA/引物混合物中，25℃輕輕攪拌培育10分鐘，然后50℃培育50分鐘。然后在85℃培育5分鐘滅活RT酶。冰上冷卻該混合物，加入1μl大腸桿菌RNA酶H(2單位/μl)，37℃培育此混合物20分鐘。冰上冷卻此混合物后用滅菌水作1/250稀釋。將逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的各稀釋液在TaqMan儀(PE Biosystems 7700)上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。
用PE Biosystems的引物表達(dá)軟件設(shè)計(jì)人INSP201-EC和甘油醛3-磷酸脫氫酶GAPDH(持家對(duì)照物)的SYBR綠(熒光)實(shí)時(shí)PCR引物，其序列如下INSP201-EC(有一對(duì)跨越外顯子1和2邊界的引物)反向5’-TCGCCCCACCAGAGTCAC-3’，正向5’-CCGAGGTGAGGGAGTCAACA-3’GAPDH反向5’-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3’，正向5’-CCACCCATGGCAAATTCC-3’；內(nèi)含子-GAPDH反向5’-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3’正向5’-CTGTGCTCCCACTCCTGATTTC-3’測(cè)試了質(zhì)粒pCR4-TOPO-INSP201-EC的特異性和最優(yōu)引物濃度。用特異性GAPDH內(nèi)含子引物進(jìn)行PCR反應(yīng)以排除可能的基因組DNA污染。在3.5％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳分析來證實(shí)沒有非特異性擴(kuò)增，以確保只產(chǎn)生一條預(yù)計(jì)分子量的條帶。
用AmpErase Uracil N-糖基化酶(UNG)(0.5單位/孔)和20μl引物(300nM)，以5μl/孔的RT-產(chǎn)物、25μl/孔的SYBR綠(熒光)PCR主混合物(master mix)(PE Biosystems)進(jìn)行SYBR綠(熒光)實(shí)時(shí)PCR。在ABI PRISM7700檢測(cè)系統(tǒng)上如下進(jìn)行PCR50℃，2分鐘(用AmpErase UNG培育以去除任何摻入cDNA中的尿苷)，95℃，10分鐘(活化AmpliTaq Gold)，然后40輪的95℃，15秒、60℃，1分鐘。由此擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄的cDNA樣品，測(cè)定其Ct值(循環(huán)域值)。將所有Ct值按持家基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化。采用凝膠電泳分析INSP201-EC和GAPDH只觀察到一條特異性DNA條帶。用SYBR綠(熒光)PCR主混合物實(shí)時(shí)檢測(cè)的原理，是依據(jù)測(cè)定SYBR綠色染料與雙鏈DNA結(jié)合所導(dǎo)致熒光增強(qiáng)來直接檢測(cè)PCR產(chǎn)物。各cDNA樣品中GAPDH與INSP201-EC之間表達(dá)水平的差異表示為Ct值的差異，即Delta(δ)Ct＝Ct(GAPDH)-Ct(INSP201-EC)。
各樣品的結(jié)果表示為與GAPDH相比，檢測(cè)到INSP201-EC表達(dá)所需的循環(huán)次數(shù)的倍數(shù)差異，按照公式差異倍數(shù)＝2(-δCt)計(jì)算。
最后各cDNA樣品中的INSP201-EC表達(dá)水平表示為GAPDH基因表達(dá)的水平(其中GAPDH表達(dá)水平＝100％)除以100乘以INSP201-EC的差異倍數(shù)的相對(duì)值。其結(jié)果見表4-9。
表4

表5


表6

表7

表8


表9


INSP201-EC表達(dá)水平域值定義為相對(duì)于GAPDH表達(dá)的0.3，TaqMan表達(dá)結(jié)果顯示INSP163的表達(dá)出乎意料地僅限于在一種胰腺組織(表4和圖4)、一種肺腫瘤組織(表5和圖5)，和各種炎性腸病組織中高水平表達(dá)(表9和圖9)。在正常肺組織中未見INSP201-EC表達(dá)(INSP201-EC的表達(dá)水平相對(duì)于GAPDH低于0.03)。該肺腫瘤是支氣管癌，更體說是鱗狀細(xì)胞癌。
由這種特殊模式的表達(dá)得到的結(jié)論是INSP201-EC涉及肺癌和炎性腸病。本發(fā)明的多核苷酸和相應(yīng)的多肽這些令人驚奇的特性特別適合制備藥物或藥物組合物。因此出乎意料地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的多核苷酸或相應(yīng)的多肽顯示其僅在胰腺組織、肺腫瘤組織和各種炎性腸病組織中限制性表達(dá)。
實(shí)施例6用細(xì)胞計(jì)數(shù)珠(Cytometry Beads)陣列(CBA)測(cè)定經(jīng)ConA激活的人PBMC所產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平6.1概述此項(xiàng)研究的目的是利用有絲分裂原伴刀豆球蛋白A(ConA)激活的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子分泌的新型調(diào)節(jié)劑。
蛋白質(zhì)INSP201-EC能抑制ConA激活的人PBMC分泌IL-2，其Emax＝80％，EC50＝8μg/ml，對(duì)IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5和IL-10水平?jīng)]有作用。
6.2設(shè)備和軟件96孔微滴定板光度儀EX(Labsystem)Graph Pad Prism軟件Excel軟件流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀Becton-DickinsonCBA分析軟件細(xì)胞培養(yǎng)空氣凈化柜細(xì)胞培養(yǎng)箱離心機(jī)移液器6.3材料和試劑白細(xì)胞層DMEM GIBCO Ref21331-020AB型人血清SIGMA RefH1513L-谷氨酰胺GIBCO Ref250 030-020青霉素-鏈霉素GIBCO Ref150 070-063Ficoll PHARMACIA Ref17-1440-03細(xì)胞培養(yǎng)用96孔微滴定板COSTAR Ref3596伴刀豆球蛋白A SIGMA RefC0412地塞米松水溶液SIGMA RefD2915人Th1/Th2細(xì)胞因子CBA試劑盒，Becton-Dickinson Ref550749PBS GIBCO Ref14190-094FALCON 50ml無菌離心管Becton-Dickinson Ref2070甘油MERCK Ref1-04092-250096孔錐底微滴定板NUNC Ref2495706.4方法白細(xì)胞層中的人PBMC的純化用DMEM將白細(xì)胞層1∶2稀釋。
將稀釋的血緩慢加到50ml Falcon離心管中的15ml聚蔗糖層上。離心該試管(室溫?zé)o驟停(brake)，2000rpm，20分鐘)。
收集介面層(環(huán)形)，細(xì)胞用25ml DMEM洗滌，然后離心(1200rpm，5分鐘)。重復(fù)三次。一份白細(xì)胞層大約可得到總共600×106個(gè)細(xì)胞。
活性試驗(yàn)將用DMEM+2.5％人血清+1％L-谷氨酰胺+1％青霉素-鏈霉素液稀釋的80μl的1.25×106/ml細(xì)胞，加入96孔微滴板中。
每孔加入10μl(每孔一種條件)用PBS+20％甘油配的INSP201-EC(起始濃度50μg/ml)。
每孔加入10μl ConA 50μg/ml(ConA終濃度為5μg/ml)。
48小時(shí)后，收集細(xì)胞上清液用人Th1/Th2細(xì)胞因子CBA試劑盒BectonDickinson檢測(cè)人細(xì)胞因子。
CBA分析按以下供應(yīng)商說明書(CBA試劑盒，Becton-Dickinson Ref550749)制備人Th1/Th2捕獲珠混合物，簡而言之-確定此實(shí)驗(yàn)所需的試管數(shù)-混合前強(qiáng)烈振蕩各捕獲珠懸液數(shù)秒鐘-對(duì)于各待分析試驗(yàn)，加入10μl等份各捕獲珠到一個(gè)標(biāo)有“混合捕獲珠”的試管中-充分振蕩該珠混合物測(cè)試樣品的準(zhǔn)備-用試驗(yàn)稀釋液1∶5稀釋上清液(20μl上清液+60μl試驗(yàn)稀釋液)-混合樣品稀釋液將樣品轉(zhuǎn)移到96孔錐底微滴定板(Nunc)中人Th1/Th2細(xì)胞因子CBA試驗(yàn)程序-在96孔錐底微滴定板(Nunc)孔中加入50微升稀釋的上清液-加入50μl混合的捕獲珠-加入50μl人Th1/Th2PE檢測(cè)試劑-室溫培育微滴定板3小時(shí)，防止直接接觸光線-1500rpm離心5分鐘-小心吸棄上清液-各孔加入200μl洗滌緩沖液，1500rpm離心5分鐘-小心吸棄上清液
-各孔加入200μl洗滌緩沖液，1500rpm離心5分鐘-小心吸棄上清液-各孔加入130μl洗滌緩沖液重懸沉淀的珠-在流式細(xì)胞儀上分析樣品-用CBA應(yīng)用軟件、活性基礎(chǔ)軟件和微軟Excell軟件分析數(shù)據(jù)，-結(jié)果表示為與ConA激活(100％)和非激活細(xì)胞(0％)相比較所達(dá)到的細(xì)胞因子水平相比的細(xì)胞因子分泌百分率6.5結(jié)果-INSP201-EC給藥對(duì)ConA激活人PBMC的影響結(jié)果顯示，存在的INSP201-EC以劑量反應(yīng)方式抑制了IL-2分泌。EC50為8μg/ml時(shí)，獲得了80％的最大抑制(Emax)。未見到對(duì)IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5或IL-10水平有作用。因此該抑制是IL-2特異性的。
考慮到人外周血單核細(xì)胞IL-2的下調(diào)，和在炎性腸病、癌癥及胰腺組織中INSP201-EC的表達(dá)，表明INSP201-EC參與了炎癥、IL-2相關(guān)疾病、癌癥、炎性腸病和/或胰腺疾病。
已知IL-2的激動(dòng)劑。例如Abbott開發(fā)的治療癌癥的IL-2融合蛋白。Amgen開發(fā)的治療癌癥的IL-2激動(dòng)劑。AntiCancer公司開發(fā)的治療肺腫瘤IL-2激動(dòng)劑(AC-9401)。AplaGen GmbH開發(fā)的治療癌癥的IL-2激動(dòng)劑(IL-2模擬肽)。Avectin開發(fā)的治療乳腺腫瘤的IL-2激動(dòng)劑(avectin)。Aventis Pharma開發(fā)的治療癌癥的IL-2激動(dòng)劑。Bayer公司開發(fā)的治療HIV感染、腎細(xì)胞癌和黑色素瘤的IL-2激動(dòng)劑(BAY-50-4798)。Baylor醫(yī)學(xué)院開發(fā)的治療慢性淋巴細(xì)胞白血病的的L-2激動(dòng)劑(表達(dá)IL-2/CD40L的白血病疫苗)。Biogen開發(fā)的治療肉瘤、獲得性免疫缺陷綜合征、癌癥、結(jié)腸腫瘤和腎腫瘤的IL-2調(diào)節(jié)劑替西白介素(teceleukin)。Biomira USA開發(fā)的治療非小細(xì)胞肺癌、HIV感染、肺腫瘤和腎腫瘤的IL-2激動(dòng)劑(脂質(zhì)體制劑，肽)。Boehringer Ingelheim開發(fā)的治療黑色素瘤、癌癥的BIWB-2(疫苗)。Chiron公司開發(fā)的治療HIV感染、腎細(xì)胞癌、白血病、黑色素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、癌癥、肺腫瘤、卵巢腫瘤的阿地白介素(aldeseukin)。Chiron公司也開發(fā)了治療HIV感染和頭頸腫瘤的PEG-白介素-2。EMD Lexigen Research開發(fā)的治療黑色素瘤和神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的EMD-273063(單克隆抗體-融合蛋白)。EMD LexigenResearch開發(fā)的治療癌癥的NHS-IL-2(D20T)(偶聯(lián)免疫球蛋白)。FlamelTechnologies開發(fā)的治療癌癥的IL-2激動(dòng)劑。Immunex開發(fā)的治療乙肝病毒感染、黑色素瘤和癌癥的重組肽。癌癥研究所開發(fā)的治療癌癥的疫苗。McMaster大學(xué)開發(fā)的治療黑色素瘤、乳腺腫瘤和癌癥的疫苗(腺病毒基因治療)South Carolina醫(yī)科大學(xué)開發(fā)的治療癌癥的肽-GN CSF/IL-2治療疫苗。國立衛(wèi)生研究院開發(fā)的治療腎細(xì)胞癌、黑色素瘤和結(jié)腸腫瘤的IL-2基因療法。Pivotal BioSciences開發(fā)的治療癌癥的IL-2激動(dòng)劑(PB-1)。Scripps研究所開發(fā)的治療非小細(xì)胞肺癌、前列腺腫瘤、乳腺腫瘤、癌癥、腦瘤、卵巢瘤、結(jié)腸直腸瘤和腎腫瘤的KS-IL-2(單克隆抗體偶聯(lián)-融合蛋白)。Seragen開發(fā)的治療HIV感染、癌癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和胰島素依賴糖尿病的DAB-486-IL-2(蛋白質(zhì)融合毒素)。Seragen也開發(fā)了治療非小細(xì)胞肺癌、脫發(fā)、HIV感染、慢性淋巴細(xì)胞白血病、皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、淋巴瘤、牛皮癬、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、非何杰金氏淋巴瘤、移植物抗宿主疾病、頭頸腫瘤、肺腫瘤和皮炎的地尼白介素-毒素連接物(denileukin diftitox)(蛋白質(zhì)融合毒素)。SkyePharma開發(fā)的治療感染的IL-2激動(dòng)劑(肽)。St Jude兒童研究醫(yī)院開發(fā)的治療神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的IL-2激動(dòng)劑(疫苗)。病毒學(xué)和生物技術(shù)VECTOR州立研究中心開發(fā)的治療癌癥的IL-2激動(dòng)劑(肽)。Takeda Pharmaceutical開發(fā)的治療乙肝病毒感染和癌癥的西莫白介素(celmoleukin)。Transgene SA開發(fā)的治療黑色素瘤和實(shí)體瘤的TG-1024(基于腺病毒的基因療法)。Transgene SA開發(fā)的治療非小細(xì)胞肺癌、胰腺腫瘤、前列腺腫瘤、乳腺瘤和卵巢瘤的TG-1031和TG-4010(基于痘病毒的基因治療)。Cell Therapy開發(fā)的治療間皮瘤、腎細(xì)胞癌、肉瘤、黑色素瘤和乳腺癌的TG-2001。Transkaryotic Therapies開發(fā)的治療腎細(xì)胞癌的IL-2，TKT。加尼福利亞大學(xué)開發(fā)的治療黑色素瘤、前列腺腫瘤和結(jié)腸腫瘤的UCLA。辛辛那提大學(xué)開發(fā)的治療頭頸腫瘤和癌癥的痘苗病毒療法。匹茲堡大學(xué)開發(fā)的治療癌癥的IL-2激動(dòng)劑(肽)。德克薩斯大學(xué)開發(fā)的治療HIV感染的INGN-301。Valentis/Roche開發(fā)的治療頭頸腫瘤的IL-2，cLipid基因治療。Valentis開發(fā)的治療黑色素瘤的IL-2/超抗原-B，cLipid基因治療。Velentis也開發(fā)了治療肺腫瘤的VLTS-587。Vical開發(fā)的治療黑色素瘤的IL-2激動(dòng)劑(基因治療，質(zhì)粒)。Vical開發(fā)的治療腎細(xì)胞癌、肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤和前列腺腫瘤的leuvectin。Virogenetics公司開發(fā)的治療癌癥的ALVAC-hIL-2(基于痘病毒的基因治療)。Yead Research開發(fā)的治療神經(jīng)退變性疾病的IL-2激動(dòng)劑。
已知IL-2的拮抗劑。例如，Affymax/Aventis開發(fā)的治療內(nèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫疾病和心血管疾病的免疫抑制性IL-2拮抗劑。Hybritech公司開發(fā)的治療癌癥的單克隆抗體。Immunotech開發(fā)的治療移植物排斥抗宿主疾病的單克隆抗體。Sunesis Pharmaceutical開發(fā)的治療移植物抗宿主疾病的IL-2拮抗劑。
Graffen和Liu(Cytokine，28(2004)第109-123頁)綜述了白介素-2的功能、生產(chǎn)和應(yīng)用。
IL-2相關(guān)疾病例如有腫瘤、肺腫瘤、癌癥、乳腺瘤、HIV感染、腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病、肉瘤、獲得性免疫缺陷綜合征、結(jié)腸瘤、腎腫瘤、非小細(xì)胞肺癌、白血病、非何術(shù)金氏淋巴瘤、卵巢瘤、頭頸腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乙肝病毒感染、前列腺瘤、腦瘤、結(jié)腸直腸腫瘤、腎腫瘤、脫發(fā)、皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、淋巴瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、實(shí)體瘤、胰腺腫瘤、間皮瘤、貧血、潰瘍性結(jié)腸炎、胃癌、硬皮病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、慢性乙肝病毒感染、高γ球蛋白血癥、EB病毒介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖疾病、急性髓細(xì)胞白血病、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、關(guān)節(jié)炎、白細(xì)胞細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、新生血管疾病、卡波濟(jì)肉瘤、胰腺疾病或多發(fā)性硬化癥。
“癌癥”宜選自血液和淋巴系統(tǒng)癌癥、皮膚癌、消化系統(tǒng)癌癥、泌尿系統(tǒng)癌、乳腺癌、卵巢癌、婦科癌癥、絨毛膜癌、肺癌、腦瘤、骨瘤、類癌瘤、鼻咽癌、腹膜后肉瘤、軟組織腫瘤、甲狀腺癌或未知原發(fā)部位的癌癥。
本文中可互換使用的“肺腫瘤”或“肺癌”宜選自良性或惡性原發(fā)腫瘤，或從其它許多器官和組織原發(fā)癌癥轉(zhuǎn)移的瘤。
肺癌宜選原發(fā)肺腫瘤，包括支氣管癌、支氣管類癌、軟骨錯(cuò)構(gòu)瘤(良性)、孤立性淋巴瘤、肉瘤(惡性)或多灶性淋巴瘤。
支氣管癌宜選鱗狀細(xì)胞癌、未分化性小細(xì)胞癌、未分化性大細(xì)胞癌、腺癌、細(xì)支氣管肺泡癌。
支氣管癌宜選鱗狀細(xì)胞癌或非小細(xì)胞肺癌。
肺癌宜選皮膚、乳腺、結(jié)腸、前列腺、腎、甲狀腺、胃、宮頸、直腸、睪丸、骨和黑色素瘤原發(fā)癌癥的轉(zhuǎn)移癌。
“支氣管類癌”或“支氣管腺瘤”可互換使用，可以是良性或惡性，在兩種性別中同等發(fā)生。其病程長。該腫瘤的支氣管內(nèi)側(cè)部分可阻塞主要?dú)夤艿膬?nèi)腔。常發(fā)生粘膜下急性出血(brisk bleeding)。常見同一肺區(qū)域內(nèi)發(fā)生反復(fù)性肺炎和局部窒息性胸膜痛。轉(zhuǎn)移不常見但可發(fā)生在局部淋巴結(jié)中。
胰腺疾病宜選急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌，包括腺泡細(xì)胞癌或混合細(xì)胞群胰腺癌。
炎性腸病宜選克羅恩(Crohn)病或潰瘍性結(jié)腸炎。
優(yōu)選采用膜結(jié)合INSP201(不論糖基化或非糖基化)的細(xì)胞外部分，其片段、其激動(dòng)劑或膜結(jié)合INSP201的拮抗劑來治療炎癥、IL-2相關(guān)疾病和/或炎性腸病，及實(shí)體器官和骨髓移植。實(shí)體器官和骨髓移植中可聯(lián)用環(huán)孢菌素A、他克莫司(tacrolimus)或西羅莫司(sirolimus)。
膜結(jié)合INSP201的拮抗劑優(yōu)選中和抗體。
優(yōu)選用缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域的INSP201多肽治療炎癥、IL-2相關(guān)疾病和/或炎性腸病。
所述跨膜結(jié)構(gòu)域優(yōu)選跨越SEQ ID NO8或SEQ ID NO24的氨基酸406-428。
優(yōu)選用膜結(jié)合INSP201的激動(dòng)劑治療癌癥(如肺癌、RCC或黑色素瘤)和/或IL-2相關(guān)疾病如HIV、EBV或乙肝病毒感染。
膜結(jié)合INSP201的激動(dòng)劑宜選激動(dòng)性抗體。
膜結(jié)合INSP201的細(xì)胞外部分優(yōu)選包含SEQ ID NO14、SEQ ID NO18、SEQ ID NO22或SEQ ID NO28或由它們組成。膜結(jié)合INSP201胞外部分片段優(yōu)選包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO10、SEQ ID NO20或SEQ IDNO26，或由它們組成。
膜結(jié)合INSP201優(yōu)選包含SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO24、SEQ ID NO30或外顯子1和外顯子2(即SEQ ID NO2、SEQ ID NO10、SEQID NO20或SEQ ID NO26聯(lián)合SEQ ID NO4)的聯(lián)合，或由它們組成。
實(shí)施例7檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)中IKK2活性的試驗(yàn)?zāi)[瘤壞死因子-α(TNF-α)是具有多種功能的多效細(xì)胞因子，包括細(xì)胞活化、分化和凋亡。TNF-α以細(xì)胞類型特異性方式發(fā)揮凋亡和抗凋亡作用。TNF-α的抗凋亡作用看來是由NF-κB活性上調(diào)所介導(dǎo)。TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化提高了幾種抗凋亡蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而保護(hù)細(xì)胞免于死亡。但當(dāng)此通路受到抑制時(shí)，TNF-α可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。IKK復(fù)合物介導(dǎo)了NF-κB的活化。
以下檢測(cè)A549細(xì)胞(一種人肺癌細(xì)胞)中IKK2活性的試驗(yàn)，顯示INSP201-EC、其融合物或靶向INSP201抗體的活性。因?yàn)門NF-α可誘導(dǎo)促凋亡和抗凋亡二條通路，用放線菌酮阻斷抗凋亡基因表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。一旦細(xì)胞經(jīng)歷凋亡，它們即從培養(yǎng)物表面脫落。用結(jié)晶紫固定細(xì)胞然后洗滌時(shí)，只有活細(xì)胞才染色，這可在540nm讀取。因此可用此法來測(cè)定A549細(xì)胞中的細(xì)胞死亡。存在放線菌酮時(shí)用TNF-α處理A 549細(xì)胞可導(dǎo)致凋亡。用IL-1β或TNF-α預(yù)處理細(xì)胞誘導(dǎo)IKK通路，由此上調(diào)抗凋亡基因時(shí)，其可保護(hù)細(xì)胞避免TNF-α+放線菌酮處理所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。以IL-1β作預(yù)處理步驟期間，用特異性抑制劑阻斷IKK的活性，可消除IL-1β對(duì)TNF-α+放線菌酮介導(dǎo)細(xì)胞死亡的保護(hù)作用。因此可利用TNF-α信號(hào)傳導(dǎo)的此種性能來監(jiān)測(cè)A549細(xì)胞中的IKK活性。在A549細(xì)胞中IKK抑制劑能以劑量依賴方式阻斷IL-1β介導(dǎo)的保護(hù)作用，而用EGF無保護(hù)作用。監(jiān)測(cè)IKK活性的方案如下1)接種A549細(xì)胞(50000個(gè)細(xì)胞/孔)培養(yǎng)過夜，2)用IL-1β(1ng/ml)或TNF-α預(yù)處理細(xì)胞，加或不加化合物(即INSP201-EC、其融合物或靶向INSP201的抗體)，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。所述化合物是IKK活性的特異性抑制劑。
3)用TNF-α和放線菌酮處理細(xì)胞8小時(shí)，和4)用結(jié)晶紫監(jiān)測(cè)細(xì)胞死亡。
實(shí)施例8動(dòng)物模型證明INSP201-EC、其融合物或靶向INSP201的抗體的活性可采用癌癥模型，如Kamb和Lassota(Drug Discovery TodayDisease Models第1卷第一期，31-36頁，2004)綜述的癌癥模型，Lahm和Fischer(Drug DiscoveryTodayDisease Models第1卷第一期，25-30頁，2004)綜述的肺癌模型，或Borm et Bouma(Drug Discovery TodayDisease Models第1卷第4期，437-443頁，2004)綜述的炎性腸病模型。此外，可在以下至少一種試驗(yàn)中驗(yàn)證本發(fā)明多肽的活性a.INSP201-EC、其融合物或靶向INSP201的抗體可調(diào)節(jié)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的增殖或存活，或b.INSP201-EC、其融合物或靶向INSP201的抗體在ConA試驗(yàn)中可調(diào)節(jié)IL-2分泌(實(shí)施例6)，或c.INSP201-EC、其融合物或靶向INSP201的抗體可調(diào)節(jié)A549細(xì)胞(一種人肺癌細(xì)胞)中的IKK2活性(實(shí)施例7)。
序列表<110>阿雷斯貿(mào)易股份有限公司(ARES TRADING S.A.)<120>細(xì)胞表面糖蛋白<130>P038518WO<150>GB0417887.7<151>2004-08-11<160>30<170>SeqWin99，version 1.02<210>1<211>1183<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atgaaatcat tcagccggat cctcttcctc gtcttcctcc tcgccggcct gaggtccaag 60gccgctccct cagcccctct gcctttgggc tgtggctttc cggacatggc ccacccctct 120gagacttccc ctctgaaggg tgcttctgaa aattccaaac gagatcgcct taacccagaa 180tttcctggga ctccttaccc tgagccttcc aagctacctc atacggtttc cctggaaacc 240ttcccacttg acttcactga gcccctcaac cctgacctcc gagaaacccc gcacccagag 300tctcctgaga cccccaaagc tgactcactc acaacctcaa tatcagaatc cctggacatg 360cccaaaacta acctctccaa aatggcacac ccagagtctt ctgagacccc cacacctggc 420ccaactgaaa tgccacaccc aggatcccct gagaccccca aacctaactt ctccaaaact 480tcacgcccag aatttcctga gaccccaaac actgacctta tgcaaactac accccaagaa 540tccccagaga ttctgcagct taatgccact gaagtctcac aggcagaact ccccgagacc 600tcaaacacta accctaccaa gacccctgac cccaaatccc cagaaaagca tgacctcaac 660tccactgaga ccccaaactc tgaatttctc caagctctcc atcctgaccc ttctaaaacc 720ccccacccag aatcccatgt gacccacaat cccagcccca ccgaaatttc ccaaacagaa 780ttccccacaa cctactacca aaatgcaaca gatgtaccca ggacctccga ccctcaaatc 840tccactagtc tctacccaga aacacctgtg cccttcaagg atgacgccac tgctctaaat 900gagctgtccc tgaatcccaa accaggaaca cctgcagcca tccagcccga ctccccaaaa 960ttgcccactt cagattctcc aggaatggtt gagctgaagg ccccccagaa ctctggccct 1020aaggagtcca acgtccctcc tccctcagcc cggattgcag gtccccctgc tcttccaggg 1080cgccccagtc agttggcccc tgccactctg cgggcacccc agaggcacag ccgaggtgag 1140ggagtcaaca ccatcatcgt ggtggagcga gtgaaggaga ccg1183<210>2<211>395<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Lys Ser Phe Ser Arg Ile Leu Phe Leu Val Phe Leu Leu Ala Gly1 5 10 15Leu Arg Ser Lys Ala Ala Pro Ser Ala Pro Leu Pro Leu Gly Cys Gly20 25 30Phe Pro Asp Met Ala His Pro Ser Glu Thr Ser Pro Leu Lys Gly Ala35 40 45Ser Glu Asn Ser Lys Arg Asp Arg Leu Asn Pro Glu Phe Pro Gly Thr50 55 60Pro Tyr Pro Glu Pro Ser Lys Leu Pro His Thr Val Ser Leu Glu Thr65 70 75 80Phe Pro Leu Asp Phe Thr Glu Pro Leu Asn Pro Asp Leu Arg Glu Thr85 90 95
Pro His Pro Glu Ser Pro Glu Thr Pro Lys Ala Asp Ser Leu Thr Thr100 105 110Ser Ile Ser Glu Ser Leu Asp Met Pro Lys Thr Asn Leu Ser Lys Met115 120 125Ala His Pro Glu Ser Ser Glu Thr Pro Thr Pro Gly Pro Thr Glu Met130 135 140Pro His Pro Gly Ser Pro Glu Thr Pro Lys Pro Asn Phe Ser Lys Thr145 150 155 160Ser Arg Pro Glu Phe Pro Glu Thr Pro Asn Thr Asp Leu Met Gln Thr165 170 175Thr Pro Gln Glu Ser Pro Glu Ile Leu Gln Leu Asn Ala Thr Glu Val180 185 190Ser Gln Ala Glu Leu Pro Glu Thr Ser Asn Thr Asn Pro Thr Lys Thr195 200 205Pro Asp Pro Lys Ser Pro Glu Lys His Asp Leu Asn Ser Thr Glu Thr210 215 220Pro Asn Ser Glu Phe Leu GlnAla Leu His Pro Asp Pro Ser Lys Thr225 230 235 240Pro His Pro Glu Ser His Val Thr His Asn Pro Ser Pro Thr Glu Ile245 250 255Ser Gln Thr Glu Phe Pro Thr Thr Tyr Tyr Gln Asn Ala Thr Asp Val260 265 270Pro Arg Thr Ser Asp Pro Gln Ile Ser Thr Ser Leu Tyr Pro Glu Thr275 280 285Pro Val Pro Phe Lys Asp Asp Ala Thr Ala Leu Asn Glu Leu Ser Leu290 295 300Asn Pro Lys Pro Gly Thr Pro Ala Ala Ile Gln Pro Asp Ser Pro Lys305 310 315 320Leu Pro Thr Ser Asp Ser Pro Gly Met Val Glu Leu Lys Ala Pro Gln325 330 335Asn Ser Gly Pro Lys Glu Ser Asn Val Pro Pro Pro Ser Ala Arg Ile340 345 350Ala Gly Pro Pro Ala Leu Pro Gly Arg Pro Ser Gln Leu Ala Pro Ala355 360 365Thr Leu Arg Ala Pro Gln Arg His Ser Arg Gly Glu Gly Val Asn Thr370 375 380Ile Ile Val Val Glu Arg Val Lys Glu Thr Gly385 390 395<210>3<211>174<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>3gcgtgactct ggtggggcga ccacgtggcg cagcaggcgg ggccctctgc ctgttcttcg 60cggggaccgc gctgctgatc ggcatctttg tgctgctgtg gtgtctttac cgccgggcag 120ctagacagcg gcccttcgca catcaccggc ttccggacga cggagatgaa ccgg174
<210>4<211>58<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Val Thr Leu Val Gly Arg Pro Arg Gly Ala Ala Gly Gly Ala Leu Cys1 5 10 15Leu Phe Phe Ala Gly Thr Ala Leu Leu Ile Gly Ile Phe Val Leu Leu20 25 30Trp Cys Leu Tyr Arg Arg Ala Ala Arg Gln Arg Pro Phe Ala His His35 40 45Arg Leu Pro Asp Asp Gly Asp Glu Pro Val50 55<210>5<211>197<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5ttctgcattt ggacgccccg aaagacccct acgacctcta cttttatgct ccggatacct 60gggtcccttc ccacatcgcc accaagcagc ccccgcccac acctcctctg ccaccaaagc 120tgcccccgcc gccccgcggg ggtcgcccgc agcgtctgga ggccctgtcc cccgccacgc 180tccccaacaa cttcgtg 197<210>6<211>65<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>6Leu His Leu Asp Ala Pro Lys Asp Pro Tyr Asp Leu Tyr Phe Tyr Ala1 5 10 15Pro Asp Thr Trp Val Pro Ser His Ile Ala Thr Lys Gln Pro Pro Pro20 25 30Thr Pro Pro Leu Pro Pro Lys Leu Pro Pro Pro Pro Arg Gly Gly Arg35 40 45Pro Gln Arg Leu Glu Ala Leu Ser Pro Ala Thr Leu Pro Asn Asn Phe50 55 60Val65<210>7<211>1554<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>7atgaaatcat tcagccggat cctcttcctc gtcttcctcc tcgccggcct gaggtccaag 60gccgctccct cagcccctct gcctttgggc tgtggctttc cggacatggc ccacccctct 120gagacttccc ctctgaaggg tgcttctgaa aattccaaac gagatcgcct taacccagaa 180tttcctggga ctccttaccc tgagccttcc aagctacctc atacggtttc cctggaaacc 240ttcccacttg acttcactga gcccctcaac cctgacctcc gagaaacccc gcacccagag 300tctcctgaga cccccaaagc tgactcactc acaacctcaa tatcagaatc cctggacatg 360cccaaaacta acctctccaa aatggcacac ccagagtctt ctgagacccc cacacctggc 420ccaactgaaa tgccacaccc aggatcccct gagaccccca aacctaactt ctccaaaact 480tcacgcccag aatttcctga gaccccaaac actgacctta tgcaaactac accccaagaa 540
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Asp Asp Ala Thr Ala Leu Asn Glu Leu Ser Leu Asn Pro Lys Pro Gly275 280 285Thr Pro Ala Ala Ile Gln Pro Asp Ser Pro Lys Leu Pro Thr Ser Asp290 295 300Ser Pro Gly Met Val Glu Leu Lys Ala Pro Gln Asn Ser Gly Pro Lys305 310 315 320Glu Ser Asn Ala Pro Pro Pro Ser Ala Arg Ile Ala Gly Pro Pro Ala325 330 335Leu Pro Gly Arg Pro Ser Gln Leu Ala Pro Ala Thr Leu Arg Ala Pro340 345 350Gln Arg His Ser Arg Gly Glu Gly Val Asn Thr Ile Ile Val Val Glu355 360 365Arg Val Lys Glu Thr Gly370<210>27<211>1152<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>27gctccctcag cccctctgcc tttgggctgt ggctttccgg acatggccca cccctctgag 60acttcccctc tgaagggtgc ttctgaaaat tccaaacgag atcgccttaa cccagaattt 120cctgggactc cttaccctga gccttccaag ctacctcata cggtttccct ggaaaccttc 180ccacttgact tcactgagcc cctcaaccct gacctccgag aaaccccgca cccagagtct 240cctgagaccc ccaaagctga ctcactcaca acctcaatat cagaatccct ggacatgccc 300aaaactaacc tctccaaaat ggcacaccca gagtcttctg agacccccac acctggccca 360actgaaatgc cacacccagg atcccctgag acccccaaac ctaacttctc caaaacttca 420cgcccagaat ttcctgagac cccaaacact gaccttatgc aaactacacc ccaagaatcc 480ccagagattc tgcagcttaa tgccactgaa gtctcacagg cagaactccc cgagacctca 540aacactaacc ctaccaagac ccctgacccc aaatccccag aaaagcatga cctcaactcc 600actgagaccc caaactctga atttctccaa gctctccatc ctgacccttc taaaaccccc 660cacccagaat cccatgtgac ccacaatccc agccccaccg aaatttccca aacagaattc 720cccacaacct actaccaaaa tgcaacagat gtacccagga cctccgaccc tcaaatctcc 780actagtctct acccagaaac acctgtgccc ttcaaggatg acgccactgc tctaaatgag 840ctgtccctga atcccaaacc aggaacacct gcagccatcc agcccgactc cccaaaattg 900cccacttcag attctccagg aatggttgag ctgaaggccc cccagaactc tggccctaag 960gagtccaacg cccctcctcc ctcagcccgg attgcaggtc cccctgctct tccagggcgc 1020cccagtcagt tggcccctgc cactctgcgg gcaccccaga ggcacagccg aggtgaggga 1080gtcaacacca tcatcgtggt ggagcgagtg aaggagaccg gcgtgactct ggtggggcga 1140ccacgtggcg ca 1152<210>28<211>384<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>28Ala Pro Ser Ala Pro Leu Pro Leu Gly Cys Gly Phe Pro Asp Met Ala1 5 10 15His Pro Ser Glu Thr Ser Pro Leu Lys Gly Ala Ser Glu Asn Ser Lys20 25 30Arg Asp Arg Leu Asn Pro Glu Phe Pro Gly Thr Pro Tyr Pro Glu Pro35 40 45Ser Lys Leu Pro His Thr Val Ser Leu Glu Thr Phe Pro Leu Asp Phe50 55 60
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<400>29gctccctcag cccctctgcc tttgggctgt ggctttccgg acatggccca cccctctgag 60acttcccctc tgaagggtgc ttctgaaaat tccaaacgag atcgccttaa cccagaattt 120cctgggactc cttaccctga gccttccaag ctacctcata cggtttccct ggaaaccttc 180ccacttgact tcactgagcc cctcaaccct gacctccgag aaaccccgca cccagagtct 240cctgagaccc ccaaagctga ctcactcaca acctcaatat cagaatccct ggacatgccc 300aaaactaacc tctccaaaat ggcacaccca gagtcttctg agacccccac acctggccca 360actgaaatgc cacacccagg atcccctgag acccccaaac ctaacttctc caaaacttca 420cgcccagaat ttcctgagac cccaaacact gaccttatgc aaactacacc ccaagaatcc 480ccagagattc tgcagcttaa tgccactgaa gtctcacagg cagaactccc cgagacctca 540aacactaacc ctaccaagac ccctgacccc aaatccccag aaaagcatga cctcaactcc 600actgagaccc caaactctga atttctccaa gctctccatc ctgacccttc taaaaccccc 660cacccagaat cccatgtgac ccacaatccc agccccaccg aaatttccca aacagaattc 720cccacaacct actaccaaaa tgcaacagat gtacccagga cctccgaccc tcaaatctcc 780actagtctct acccagaaac acctgtgccc ttcaaggatg acgccactgc tctaaatgag 840ctgtccctga atcccaaacc aggaacacct gcagccatcc agcccgactc cccaaaattg 900cccacttcag attctccagg aatggttgag ctgaaggccc cccagaactc tggccctaag 960gagtccaacg cccctcctcc ctcagcccgg attgcaggtc cccctgctct tccagggcgc 1020cccagtcagt tggcccctgc cactctgcgg gcaccccaga ggcacagccg aggtgaggga 1080gtcaacacca tcatcgtggt ggagcgagtg aaggagaccg gcgtgactct ggtggggcga 1140ccacgtggcg cagcaggcgg ggccctctgc ctgttcttcg cggggaccgc gctgctgatc 1200ggcatctttg tgctgctgtg gtgtctttac cgccgggcag ctagacagcg gcccttcgca 1260catcaccggc ttccggacga cggagatgaa ccggttctgc atttggacgc cccgaaagac 1320ccctacgacc tctactttta tgctccggat acctgggtcc cttcccacat cgccaccaag 1380cagcccccgc ccacacctcc tctgccacca aagctgcccc cgccgccccg cgggggtcgc 1440ccgcagcgtc tggaggccct gtcccccgcc acgctcccca acaacttcgt g 1491<210>30<211>497<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>30Ala Pro Ser Ala Pro Leu Pro Leu Gly Cys Gly Phe Pro Asp Met Ala1 5 10 15His Pro Ser Glu Thr Ser Pro Leu Lys Gly Ala Ser Glu Asn Ser Lys20 25 30Arg Asp Arg Leu Asn Pro Glu Phe Pro Gly Thr Pro Tyr Pro Glu Pro35 40 45Ser Lys Leu Pro His Thr Val Ser Leu Glu Thr Phe Pro Leu Asp Phe50 55 60Thr Glu Pro Leu Asn Pro Asp Leu Arg Glu Thr Pro His Pro Glu Ser65 70 75 80Pro Glu Thr Pro Lys Ala Asp Ser Leu Thr Thr Ser Ile Ser Glu Ser85 90 95Leu Asp Met Pro Lys Thr Asn Leu Ser Lys Met Ala His Pro Glu Ser100 105 110Ser Glu Thr Pro Thr Pro Gly Pro Thr Glu Met Pro His Pro Gly Ser115 120 125Pro Glu Thr Pro Lys Pro Asn Phe Ser Lys Thr Ser Arg Pro Glu Phe130 135 140Pro Glu Thr Pro Asn Thr Asp Leu Met Gln Thr Thr Pro Gln Glu Ser145 150 155 160Pro Glu Ile Leu Gln Leu Asn Ala Thr Glu Val Ser Gln Ala Glu Leu165 170 175
Pro Glu Thr Ser Asn Thr Asn Pro Thr Lys Thr Pro Asp Pro Lys Ser180 185 190Pro Glu Lys His Asp Leu Asn Ser Thr Glu Thr Pro Asn Ser Glu Phe195 200 205Leu Gln Ala Leu His Pro Asp Pro Ser Lys Thr Pro His Pro Glu Ser210 215 220His Val Thr His Asn Pro Ser Pro Thr Glu Ile Ser Gln Thr Glu Phe225 230 235 240Pro Thr Thr Tyr Tyr Gln Asn Ala Thr Asp Val Pro Arg Thr Ser Asp245 250 255Pro Gln Ile Ser Thr Ser Leu Tyr Pro Glu Thr Pro Val Pro Phe Lys260 265 270Asp Asp Ala Thr Ala Leu Asn Glu Leu Ser Leu Asn Pro Lys Pro Gly275 280 285Thr Pro Ala Ala Ile Gln Pro Asp Ser Pro Lys Leu Pro Thr Ser Asp290 295 300Ser Pro Gly Met Val Glu Leu Lys Ala Pro Gln Asn Ser Gly Pro Lys305 310 315 320Glu Ser Asn Ala Pro Pro Pro Ser Ala Arg Ile Ala Gly Pro Pro Ala325 330 335Leu Pro Gly Arg Pro Ser Gln Leu Ala Pro Ala Thr Leu Arg Ala Pro340 345 350Gln Arg His Ser Arg Gly Glu Gly Val Asn Thr Ile Ile Val Val Glu355 360 365Arg Val Lys Glu Thr Gly Val Thr Leu Val Gly Arg Pro Arg Gly Ala370 375 380Ala Gly Gly Ala Leu Cys Leu Phe Phe Ala Gly Thr Ala Leu Leu Ile385 390 395 400Gly Ile Phe Val Leu Leu Trp Cys Leu Tyr Arg Arg Ala Ala Arg Gln405 410 415Arg Pro Phe Ala His His Arg Leu Pro Asp Asp Gly Asp Glu Pro Val420 425 430Leu His Leu Asp Ala Pro Lys Asp Pro Tyr Asp Leu Tyr Phe Tyr Ala435 440 445Pro Asp Thr Trp Val Pro Ser His Ile Ala Thr Lys Gln Pro Pro Pro450 455 460Thr Pro Pro Leu Pro Pro Lys Leu Pro Pro Pro Pro Arg Gly Gly Arg465 470 475 480Pro Gln Arg Leu Glu Ala Leu Ser Pro Ala Thr Leu Pro Asn Asn Phe485 490 495Val
權(quán)利要求
1.一種多肽，其特征在于，該多肽(i)含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ IDNO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28和/或SEQ ID NO30所示的氨基酸序列；(ii)是細(xì)胞表面糖蛋白家族成員的片段，或含有與(i)所述多肽共同的抗原決定簇；或(iii)是(i)或(ii)所述多肽的功能性等價(jià)物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其含有SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO24和/或SEQ ID NO30所示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的多肽，其含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ IDNO26和/或SEQ ID NO28所示的氨基酸序列或由它們所組成。
4.如權(quán)利要求1或2所述的多肽，其由SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ IDNO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28和/或SEQ ID NO30所示的氨基酸序列組成。
5.一種多肽，所述多肽是以上任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述多肽的(iii)部分所述的功能等價(jià)物，其特征在于，其與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQID NO16或SEQ ID NO18所示序列同源，并且是所述細(xì)胞表面糖蛋白家族的成員。
6.一種多肽，所述多肽是權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述多肽的片段或功能等價(jià)物，其特征在于，其序列與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQID NO16或SEQ ID NO18所示氨基酸序列或其活性片段的序列相同性大于80％，優(yōu)選大于85％、90％、95％、98％或99％。
7.一種多肽，所述多肽是權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)所述多肽的功能等價(jià)物，其特征在于，該多肽與具有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16或SEQ ID NO18所示氨基酸序列的多肽在結(jié)構(gòu)上具有顯著同源。
8.一種多肽，所述多肽是權(quán)利要求1-3和權(quán)利要求6之一所述多肽的片段，其特征在于，該多肽具有與權(quán)利要求1-3之一的部分(i)所述多肽共同的抗原決定簇，該抗原決定簇由SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ IDNO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28或SEQ ID NO30所示氨基酸序列的7個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基組成。
9.一種編碼以上權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述多肽的純化核酸分子。
10.如權(quán)利要求9所述的純化核酸分子，其特征在于，其含有SEQ IDNO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ IDNO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27和/或SEQ IDNO29所示核酸序列，或其冗余等價(jià)物或片段。
11.如權(quán)利要求10所述的純化核酸分子，其特征在于，其由SEQ IDNO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ IDNO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27和/或SEQ IDNO29所示核酸序列組成，或是其冗余等價(jià)物或片段。
12.一種純化核酸分子，其在高嚴(yán)緊條件下與權(quán)利要求9-11中任何一項(xiàng)所述核酸分子雜交。
13.一種載體，其含有權(quán)利要求9-12中任何一項(xiàng)所述核酸分子。
14.一種宿主細(xì)胞，其是用權(quán)利要求13所述載體轉(zhuǎn)化的。
15.一種配體，其特異性結(jié)合權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述細(xì)胞表面糖蛋白。
16.如權(quán)利要求15所述的配體，所述配體是一種抗體。
17.一種化合物，其提高或降低權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述多肽表達(dá)水平或活性。
18.如權(quán)利要求17所述的化合物，所述化合物結(jié)合權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述的多肽但不誘導(dǎo)該多肽的任何生物學(xué)作用。
19.如權(quán)利要求18所述的化合物，所述化合物是天然或經(jīng)修飾的底物、配體、酶、受體、或結(jié)構(gòu)或功能模擬物。
20.一種融合多肽，其特征在于，其包含與異源性氨基酸序列相融合的權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述多肽。
21.如權(quán)利要求20所述的融合多肽，其特征在于，所述異源性氨基酸序列是IgG的恒定區(qū)或其片段，或hCG結(jié)構(gòu)域或其片段。
22.用于疾病治療或診斷的權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述多肽、權(quán)利要求9-12中任何一項(xiàng)所述核酸分子、權(quán)利要求13所述載體、權(quán)利要求15或16所述配體、權(quán)利要求17-19中任何一項(xiàng)所述化合物、或權(quán)利要求20或21所述融合多肽。
23.一種診斷病人所患疾病的方法，所述方法包括評(píng)估所述病人組織中編碼權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述多肽的天然基因的表達(dá)水平、或評(píng)估權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述多肽的活性，并將所述表達(dá)水平或活性與對(duì)照的水平作比較，其中該水平與所述對(duì)照的水平不同，表明患病。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，所述方法在體外進(jìn)行。
25.如權(quán)利要求23或24所述的方法，所述方法包括以下步驟(a)在適于形成配體-多肽復(fù)合物的條件下使權(quán)利要求15或16所述的配體接觸生物學(xué)樣品；和(b)檢測(cè)所述復(fù)合物。
26.如權(quán)利要求23或24所述的方法，所述方法包括以下步驟a)使病人的組織樣品在嚴(yán)緊條件下與核酸探針接觸，所述條件使權(quán)利要求9-12中任何一項(xiàng)所述的核酸分子與所述探針之間形成雜交復(fù)合物；b)使對(duì)照樣品在步驟a)所用的相同條件下與所述探針接觸；和c)檢測(cè)所述樣品中存在的雜交復(fù)合物，其中病人樣品中檢測(cè)到的雜交復(fù)合物水平與對(duì)照樣品中該雜交復(fù)合物的水平不相同，表明患病。
27.如權(quán)利要求23或24所述的方法，所述方法包括a)使病人組織樣品中的核酸在嚴(yán)緊條件下與核酸引物接觸，所述條件使權(quán)利要求9-12任何一項(xiàng)所述的核酸分子與所述引物之間形成雜交復(fù)合物；b)使對(duì)照樣品在步驟a)所用的相同條件下與所述引物接觸；和c)擴(kuò)增所述樣品中的核酸；和d)檢測(cè)病人和對(duì)照樣品中被擴(kuò)增的核酸水平，其中病人樣品中檢測(cè)到的擴(kuò)增核酸水平與對(duì)照樣品中該擴(kuò)增的核酸的水平顯著不同，表明患病。
28.如權(quán)利要求23或24所述的方法，所述方法包括a)獲得待檢測(cè)疾病病人的組織樣品；b)分離所述組織樣品中權(quán)利要求9-12中任何一項(xiàng)所述的核酸分子；和c)通過檢測(cè)核酸分子中與疾病相關(guān)突變的存在作為疾病的指征來診斷病人的疾病。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括擴(kuò)增核酸分子形成擴(kuò)增產(chǎn)物，和檢測(cè)該擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在突變。
30.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其特征在于，檢測(cè)病人中是否存在所述突變，是通過使所述核酸分子與核酸探針接觸，所述核酸探針與所述核酸分子在嚴(yán)緊條件下雜交形成雙鏈雜交分子，該雙鏈雜交分子在對(duì)應(yīng)于疾病相關(guān)突變的任何部分含有與所述核酸探針鏈的未雜交部分；和檢測(cè)是否存在所述探針鏈的未雜交部分，從而表明有無疾病相關(guān)突變。
31.如權(quán)利要求23-30中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述疾病包括但不限于炎癥、癌癥、結(jié)腸癌、炎性腸病、胰腺疾病和/或IL-2相關(guān)疾病。
32.如權(quán)利要求23-30中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述疾病是涉及淋巴細(xì)胞抗原的疾病。
33.權(quán)利要求1-8之一所述多肽作為細(xì)胞表面糖蛋白的用途。
34.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述多肽、權(quán)利要求9-12中任何一項(xiàng)所述核酸分子、權(quán)利要求13所述載體、權(quán)利要求14所述宿主細(xì)胞、權(quán)利要求15或16所述配體、權(quán)利要求17-19中任何一項(xiàng)所述化合物、或權(quán)利要求20或21所述融合多肽。
35.一種疫苗組合物，其包含權(quán)利要求1-7中任何一項(xiàng)所述多肽或權(quán)利要求9-12中任何一項(xiàng)所述核酸分子。
36.權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述的多肽、權(quán)利要求9-12中任何一項(xiàng)所述的核酸分子、權(quán)利要求13所述的載體、權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求15或16所述的配體、權(quán)利要求17-19中任何一項(xiàng)所述的化合物、或權(quán)利要求20或21所述的融合多肽、或權(quán)利要求34所述的藥物組合物在制造用于治療炎癥、癌癥、炎性腸病、胰腺疾病和/或IL-2相關(guān)疾病的藥物中的用途。
37.權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述多肽、權(quán)利要求9-12中任何一項(xiàng)所述核酸分子、權(quán)利要求13所述載體、權(quán)利要求14所述宿主細(xì)胞、權(quán)利要求15或16所述配體、權(quán)利要求17-19中任何一項(xiàng)所述化合物、或權(quán)利要求20或21所述融合多肽、或權(quán)利要求34所述藥物組合物在制造用于治療涉及淋巴細(xì)胞抗原的疾病的藥物中的用途。
38.一種治療病人疾病的方法，所述方法包括給予病人權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述的多肽、權(quán)利要求9-12中任何一項(xiàng)所述的核酸分子、權(quán)利要求13所述的載體、權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求15或16所述的配體、權(quán)利要求17-19中任何一項(xiàng)所述的化合物、如權(quán)利要求20或21所述的融合多肽、或權(quán)利要求34所述的藥物組合物。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中當(dāng)與健康人中所述多肽的表達(dá)水平或活性相比，病人中該多肽天然基因的表達(dá)水平或活性較低時(shí)，給予該病人的所述多肽、核酸分子、載體、配體、化合物或組合物是激動(dòng)劑。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，其中當(dāng)與健康人中所述多肽的表達(dá)水平或活性相比，病人中該多肽天然基因的表達(dá)水平或活性較高時(shí)，給予該病人的所述多肽、核酸分子、載體、配體、化合物或組合物是拮抗劑。
41.一種監(jiān)測(cè)病人疾病治療的方法，所述方法包括監(jiān)測(cè)一段時(shí)期內(nèi)所述病人組織中權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述多肽的表達(dá)水平或活性，或權(quán)利要求9-12中任何一項(xiàng)所述核酸的表達(dá)水平，其中在該段時(shí)期內(nèi)所述表達(dá)水平或活性向著對(duì)照水平發(fā)生改變，表明所述疾病消退。
42.一種鑒定有效治療和/或診斷疾病的化合物的方法，所述方法包括使權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述的多肽、或權(quán)利要求9-12中任何一項(xiàng)所述的核酸分子與懷疑對(duì)所述多肽或核酸分子具有結(jié)合親和力的一種或多種化合物接觸，和選擇特異性結(jié)合所述核酸分子或多肽的化合物。
43.一種用于診斷疾病的試劑盒，所述試劑盒包括裝有能在嚴(yán)緊條件下與權(quán)利要求9-12中任何一項(xiàng)所述核酸分子雜交的核酸探針的第一容器；裝有用于擴(kuò)增所述核酸分子的引物的第二容器；和使用該探針和引物以便于疾病診斷的說明書。
44.如權(quán)利要求41所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括裝有用于消化未雜交RNA的第三容器。
45.一種試劑盒，其裝有核酸分子陣列，這些核酸分子中的至少一種是權(quán)利要求9-12中任何一項(xiàng)所述的核酸分子。
46.一種試劑盒，其裝有能結(jié)合權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述多肽的一種或多種抗體；和用于檢測(cè)所述抗體與所述多肽之間結(jié)合反應(yīng)的試劑。
47.一種轉(zhuǎn)基因或基因敲除的非人動(dòng)物，其特征在于，該動(dòng)物經(jīng)轉(zhuǎn)化以較高、較低水平表達(dá)權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述的多肽，或不表達(dá)該多肽。
48.一種篩選能有效治療疾病的化合物的方法，其特征在于，該方法是使權(quán)利要求47所述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與候選化合物接觸，并檢測(cè)該化合物對(duì)動(dòng)物疾病的作用。
49.權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述多肽、權(quán)利要求9-12中任何一項(xiàng)所述核酸分子、權(quán)利要求13所述載體、權(quán)利要求14所述宿主細(xì)胞、權(quán)利要求15或16所述配體、權(quán)利要求17-19中任何一項(xiàng)所述化合物、權(quán)利要求20或21所述融合多肽、或權(quán)利要求34所述藥物組合物在IVF或作為避孕藥的用途。
50.權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述多肽、權(quán)利要求9-12中任何一項(xiàng)所述核酸分子、權(quán)利要求13所述載體、權(quán)利要求14所述宿主細(xì)胞、權(quán)利要求15或16所述配體、權(quán)利要求17-19中任何一項(xiàng)所述化合物、權(quán)利要求20或21所述融合多肽、或權(quán)利要求34所述藥物組合物在制造避孕藥中的用途。
51.INSP201多肽的用途，其用作篩選治療或預(yù)防細(xì)胞表面糖蛋白相關(guān)疾病候選藥物的靶標(biāo)。
52.一種選擇生物學(xué)活性化合物的方法，所述方法包括(i)使候選化合物與表達(dá)INSP201多肽的重組宿主細(xì)胞接觸；(ii)選擇結(jié)合所述細(xì)胞表面的INSP201多肽和/或調(diào)節(jié)所述INSP201多肽活性的化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種稱為INSP201的新型蛋白質(zhì)，在本文中將其鑒定為細(xì)胞表面糖蛋白，還涉及該蛋白質(zhì)和源自其編碼基因的核酸序列在診斷、預(yù)防和治療疾病中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/705GK101039956SQ200580034426
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2005年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月11日
發(fā)明者S·菲茲杰拉德, R·法根, J·比恩科沃斯卡, C·鮑爾, M·優(yōu)克-史密斯 申請(qǐng)人:阿雷斯貿(mào)易股份有限公司