專利名稱：從生物和細胞材料分離核酸的方法
相關(guān)申請的交叉參考本申請是申請人的下述共同未決申請的部分繼續(xù)申請2004年12月22日提交的臨時申請序列第60/638,621號和2004年9月16提交的申請序列第10/942,491號，而所述申請序列第10/942,491號是申請人的下述共同未決申請的部分繼續(xù)申請2003年11月17日提交的美國申請序列第10/714,763號和2003年11月17日提交的美國申請序列第10/715,284號。
發(fā)明領域
本發(fā)明涉及用于捕獲和分離核酸的簡化方法，特別地從生物來源，尤其是從血液和細菌培養(yǎng)物的材料捕獲和分離總基因組核酸。本發(fā)明還涉及用于這些方法的、含有固相結(jié)合材料的試劑盒。
背景技術(shù)：
分子診斷學和分子生物學中的現(xiàn)代技術(shù)(包括反轉(zhuǎn)錄、克隆、限制性分析、擴增和序列分析)，要求提取核酸。在其中發(fā)現(xiàn)有目標核酸的復雜的樣品基質(zhì)使得獲取核酸的工藝被復雜化。此類樣品包括例如來自組織的細胞、來自體液的細胞、血液、培養(yǎng)中的細菌細胞、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠或從目標核酸擴增得到的溶液。樣品基質(zhì)經(jīng)常含有顯著量的污染物，在感興趣的核酸被用于分子生物學或分子診斷技術(shù)之前所述污染物必須從所述核酸去除。
從上述細胞和組織產(chǎn)生的混合物中獲得目標核酸的常規(guī)技術(shù)，需要使用有害化學品例如酚、氯仿以及溴化乙錠。酚/氯仿提取被用于此類步驟，以從目標核酸和多種污染物的混合物中抽提掉污染物?？蛇x地，根據(jù)本領域中熟知的方法，使用氯化銫-溴化乙錠梯度。參見例如Molecular Cloning，由Sambrook等編著(1989)，Cold Spring Harbor Press，pp.1.42-1.50。通常，該在后方法之后，通過將乙醇或2-丙醇加入水相以沉淀核酸來沉淀保留在抽提的水相中的核酸物質(zhì)。通常，通過離心從溶液中移出沉淀物，并且在水或緩沖溶液中重懸以作進一步使用之前，允許干燥所得到的沉淀物小球。
已經(jīng)開發(fā)出更簡單和更快的方法，其采用各種類型的固相，以從細胞裂解液或核酸和污染物的其它混合物中分離核酸。此類固相包括各種形狀和形式例如纖維的層析樹脂、聚合物和二氧化硅基或玻璃基物質(zhì)，過濾器以及包被的容器。當為小顆粒的形式時，有時提供磁芯，以幫助實現(xiàn)分離。
從全血DNA提取DNA是指從血中的白細胞提取。通常，處理血液，以選擇性溶解紅細胞，并且在沉淀或離心步驟之后，單獨裂解完整的白細胞以暴露核酸內(nèi)容物。消化蛋白質(zhì)，并且得到的DNA用固相分離，隨后用于序列多態(tài)性的測定、序列分析、RFLP分析、突變檢測或其它類型的診斷試驗。EP0796327B1中公開的方法涉及在特定固相支持物存在下，將含有細胞的樣品如細菌培養(yǎng)物或全血與裂解去污劑混合。相反地，本方法省略了任何去污劑或裂解液的使用。另一方法涉及用抗體-包被的顆粒從全血選擇性地捕獲白細胞，接下來的步驟是裂解捕獲的白細胞和將釋放的核酸捕獲在固體支持物上(美國專利申請公布2003/0180754A1)。
從細菌提取核酸，美國專利5,990,301公開了通過裂解從細菌或病毒分離核酸的方法，然后在陰離子交換劑上分離游離的核酸，用受控離子強度的溶液洗脫，然后用去污劑或?qū)游鲚d體處理，以去除內(nèi)毒素。已經(jīng)開發(fā)出含有固體結(jié)合支持材料的試劑盒，并可以在商業(yè)上獲得，用于從細菌培養(yǎng)物和從人全血分離基因組的方法中。制造商提供的步驟總是詳細說明，在開始核酸的移除和純化之前必須裂解細胞。在使用固體支持物之前，有時也利用額外的沉淀步驟(例如K.Smith等，J.Clin.Microbiol.，41(6)，2440-3(2003)；P.Levison等，J.Chromatography A，827，337-44(1998))。
固相材料，在分離核酸中使用的一種類型的固相包括設計用于高效液相色譜(HPLC)的多孔硅膠顆粒。用陰離子交換劑對多孔硅膠顆粒的表面進行官能化，以在某一鹽和pH條件下與質(zhì)粒DNA交換。參見，例如美國專利4,699,717和5,057,426。在含有高濃度鹽的水溶液中洗脫結(jié)合到這些固相材料的質(zhì)粒DNA。從那里洗脫的核酸溶液在其被用于下游過程之前必須被進一步處理，以除去鹽。
其它硅基固相材料包括可控孔度玻璃(controlled pore glass，CPG)、包埋有二氧化硅顆粒的濾器、硅膠顆粒、硅藻土、玻璃纖維或上述的混合物。在存在離液劑例如碘化鈉(NaI)、硫氰酸胍或氯化胍的情況下，在含有核酸的樣品中，每一硅基固相材料可逆地結(jié)合核酸。參見例如美國專利5,234,809、6,582,922。此類固相結(jié)合并保持核酸物質(zhì)，同時該固相經(jīng)受離心或真空過濾以從殘余樣品成分中分離基質(zhì)和結(jié)合于其上的核酸物質(zhì)。然后，通過用水或低鹽洗脫緩沖液洗脫，從固相釋放出該核酸物質(zhì)。商業(yè)上可得的用于核酸分離的硅基固相材料包括例如WizardTM DNA純化系統(tǒng)產(chǎn)品(Promega，Madison，WI)、QiaPrepTM DNA分離系統(tǒng)(Qiagen，Santa Clarita，CA)、High Pure(Roche)以及GFX Micro Plasmid Kit(Amersham)。
顆粒形式的聚合樹脂也被廣泛用于核酸的分離和純化。羧酸鹽改性的聚合顆粒(Bangs，Agencourt)是已知的。在歐洲專利申請公開第EP 1243649A1中公開了含有季銨首基(head group)的聚合物。該聚合物是具有共價連接的線性非交聯(lián)聚合物的惰性載體顆粒。該類型的聚合固相一般是指觸角樹脂(tentacle resin)。線型聚合物摻入四烷基季銨基團。該烷基基團被指定為甲基或乙基基團(第4欄，第52-55行)。較長的烷基被認為是不期望的。
基于陰離子交換原理的其它用于結(jié)合核酸的固相材料目前正在使用中。這些包括具有DEAE首基(Qiagen)和二氧化硅-NucleoBond AX(Becton Dickinson，Roche-Genopure)的硅基材料，這基于在EP0496822B1中描述的層析載體。具有聚合的三烷基銨基團的聚合物樹脂被描述于EP 1243649(GeneScan)。用于DNA分離的羧基改性聚合物可以從眾多的供應商獲得。在高鹽條件下核酸被吸引，而在低離子強度條件下核酸被釋放。
美國專利5,496,562、5,756,126、6,645,717和6,746,841公開了包括固體基質(zhì)或基底的材料，所述固體基質(zhì)或基底如過濾紙或膜，其用含有導致細胞裂解的去污劑、弱堿和螯合劑的組合物包被。包被層作為溶液施用，然后在基質(zhì)上干燥。該包被層因此是獨立加上去的層，并不是該材料的組成部分。此外，核酸通過隨后的加熱步驟被固定到基質(zhì)。
美國6,214,618中描述了具有陽離子三甲胺外部的聚合微載體珠。該珠具有相對大的直徑(75-225μm)，并可以用作培養(yǎng)中細胞附著和生長的支持物。這些珠并未被報道用于捕獲或結(jié)合核酸。
磁響應性顆粒也已經(jīng)被開發(fā)用作核酸分離中的固相。設計用于核酸分離的若干種不同類型的磁響應性顆粒在本領域中是已知的，并且可以從若干來源商業(yè)獲得。可逆地直接結(jié)合核酸材料的磁性顆粒包括MagneSilTM顆粒(Promega)。也已知，磁性顆粒通過共價連接的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白可逆地結(jié)合mRNA，其中抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白具有用于與mRNA的聚腺苷酸尾雜交的連接的寡dT尾。
已知多種類型的磁響應性硅基顆粒被用作核酸結(jié)合分離法中的固相。一個這樣的類型是磁響應性玻璃珠，優(yōu)選具有受控孔尺寸的磁響應性玻璃珠，其作為Magnetic Porous Glass(MPG)顆粒可以從CPG，Inc.(Lincon Park，NJ)獲得；或者在美國專利第4,395,271、4,233,169、4,297,337或6,255,477號中描述的多孔磁玻璃顆粒。在核酸的結(jié)合和分離中有用的另一類型的磁性顆粒是通過將磁性材料摻入聚合的二氧化硅化合物基質(zhì)中而產(chǎn)生的，例如德國專利DE4307262A1；美國專利5,945,525；6,027,945和6,296,937。包含包埋在具有季銨基的纖維素基質(zhì)中的氧化鐵納米顆粒的磁顆粒由Cortex Biochem(San Leandro，CA)作為MagaCell-QTM商業(yè)化生產(chǎn)。
具有可誘導磁性性質(zhì)的顆?；蛑榘ㄟ^渡金屬的小顆粒，例如鐵、鎳、銅、鈷和錳，以形成金屬氧化物，在磁體存在下可以使該金屬氧化物具有暫時的磁性。這些顆粒被稱為順磁性的或超順磁性的。為形成順磁或超順磁珠，已用在水中相對穩(wěn)定的聚合物包被金屬氧化物。美國專利4,554,088公開了順磁顆粒，其包括被高分子硅烷包被層包圍的金屬氧化物芯。美國專利5,356,713公開了可磁化的微球體，其包括被疏水乙烯基芳族單體外殼包圍的可磁化顆粒芯。美國專利5,395,688公開了已經(jīng)用混合的順磁金屬氧化物-聚合物層包被的聚合物芯。另一種方法采用聚合物芯以吸收金屬氧化物，例如諸如在美國專利第4,774,265號中。包含用順磁金屬氧化物層包被的聚合芯的磁性顆粒被公開于美國專利5,091,206中。然后，用另外的聚合層進一步包被該顆粒，以保護金屬氧化物層并提供反應性包被層。美國專利5,866,099公開了在用于配位金屬鹽并包載(entrap)混合的金屬氧化物的蛋白存在的情況下，通過兩種金屬鹽的混合物共沉淀制備磁性顆粒。許多示例性金屬鹽對被描述。美國專利5,411,730描述了相似的方法，其中沉淀的混合的金屬氧化物被俘獲在葡聚糖——一種寡糖中。
用于不可逆地捕獲DNA和RNA的氧化鋁(alumina)(氧化鋁(aluminumoxide))顆粒被公開于美國專利6,291,166中。用于固相擴增法例如PCR的結(jié)合的核酸是可得的。
在含有高濃度鹽的水溶液中洗脫結(jié)合到這些固相材料的DNA。從那里洗脫的核酸溶液在其可以被用在下游過程之前必須被進一步處理以除去鹽。相反，通過用水或低鹽洗脫緩沖液洗脫，從固相釋放結(jié)合至硅基材料的核酸。美國專利5,792,651描述了用于核酸的色譜分離的組合物，其增強核酸在細胞中轉(zhuǎn)染的能力。該組合物包括含有2-丙醇和任選地含有鹽和緩沖物質(zhì)的水溶液。
據(jù)報道，還有其它包括含有磁微粒芯的瓊脂糖或纖維素顆粒的磁性固相材料在用含有高濃度鹽和聚亞烷基二醇的組合物處理后結(jié)合并保持核酸(例如美國專利5,898,071，和PCT公開WO02066993)。隨后，通過用水或低離子強度緩沖液處理釋放核酸。
申請人的共同未決美國申請序列第10/714,763、10/715,284、10/891,880、10/942,491和60/638,631公開了新穎的固相核酸結(jié)合材料，包括可切割的材料，和結(jié)合并釋放核酸的方法，這些申請并入本文作為參考。
含有三丁基(tributylphosphonium)首基的聚合珠已經(jīng)被描述用于三相體系中的相轉(zhuǎn)移催化劑。由交聯(lián)的聚苯乙烯制備該珠。(J.Chem.Soc.Perkin Trans.II，1827-1830，(1983))。具有通過亞烷基鏈和亞烷基醚鏈(alkylene ether chain)連接至交聯(lián)的聚苯乙烯樹脂的側(cè)鏈三烷基基的聚合物珠也已被描述(Tomoi，et al.，Makromolekulare Chemie，187(2)，357-65(1986)；Tomoi，et al.，Reactive Polymers，IonExchangers，Sorbents，3(4)，341-9(1985))?；诮宦?lián)的聚苯乙烯樹脂的混合季銨/不溶性聚合物作為催化劑和生物殺傷劑被公開(Davidescu，et al.，Chem.Bull.Techn.Univ.Timisoara，40(54)，63-72(1995)；Parvulescu，et al.，Reactive & FunctionalPolymers，33(2，3)，329-36(1997)。
發(fā)明概述
本發(fā)明的第一個目標是提供從生物和細胞材料捕獲核酸的簡化的、快速的方法。
本發(fā)明的另一個目標是提供從生物和細胞材料分離核酸的簡化的、快速的方法。
本發(fā)明的另一個目標是提供從生物體的全血或血組分捕獲和分離核酸的方法。
本發(fā)明的另一個目標是提供從細胞培養(yǎng)物捕獲和分離核酸的方法。
本發(fā)明的另一個目標是提供在5分鐘內(nèi)從生物和細胞材料捕獲和分離核酸的方法。
附圖簡述
圖1示意性地描述了根據(jù)本發(fā)明的核酸從血樣的分離。
圖2A是凝膠圖像，顯示了使用實施例2的顆粒從人血樣分離的DNA。圖2B是凝膠圖像，顯示了如圖2A中分離的基因組DNA的區(qū)域的擴增。
圖3是凝膠圖像，顯示了根據(jù)本發(fā)明方法分離的基因組DNA的區(qū)域的擴增，使用實施2或?qū)嵤├?的顆粒和各種添加劑。
圖4是凝膠圖像，顯示了使用本發(fā)明的各種顆粒從人血樣分離的DNA。
圖5A是凝膠圖像，顯示了使用實施例2或4的顆粒從人血樣分離的DNA，用各種濃度的NaOH洗脫。圖5B是凝膠圖像，顯示了如5A顯示分離的基因組DNA的區(qū)域的擴增。
圖6是凝膠圖像，顯示了使用本發(fā)明的各種顆粒從人血樣分離的DNA。
發(fā)明詳述
烷基(alkyl)——含有1-20個碳原子的支鏈、直鏈或環(huán)狀烴基團，其可以用除了H以外的1個或多個取代基取代。本文中所使用的低級烷基是指那些含有高達8個碳的烷基基團。
芳烷基(aralkyl)——用芳基取代的烷基基團。
芳基(aryl)——含有1至5個碳環(huán)芳香環(huán)的含芳香環(huán)的基團，其可以用除了H以外的1個或多個取代基取代。
生物材料(biological material)——包括全血、抗凝全血、組織、細胞、細胞內(nèi)含物、胞外核酸、病毒。
細胞材料(cellular material)——完整細胞或材料，包括組織，含有動物、植物或細菌來源的完整細胞。
細胞核酸內(nèi)含物(cellular nucleic acid content)——指在細胞材料內(nèi)發(fā)現(xiàn)的核酸，可以是基因組DNA和RNA，和其他核酸，諸如來自感染源(infectious agents)的核酸，包括病毒和質(zhì)粒。
磁性顆粒(magnetic particle)——微?；蛑?，其對外部的磁場有響應。該顆粒本身可以是磁性的、順磁性的或超順磁性的。如當使用鐵磁材料時，其可以被吸引到外部磁體或被施用磁場。顆?？梢跃哂泄腆w芯部分，該固體芯部分是磁響應性的，并且被一層或多層非磁響應性層包圍。可選地，磁響應性部分可以是周圍的層或者可以是布置在非磁響應性芯內(nèi)的顆粒。
寡聚物、寡核苷酸(oligomer，oligonucleotide)——如本文所使用的，將是指含有核苷酸間磷酸二酯鍵(phosphodiester internucleotide linkage)和5′-端單磷酸基團的化合物。核苷酸可以是正常發(fā)生的核糖核苷酸A、C、G和U或脫氧核糖核苷酸dA、dC、dG和dT。
核酸(nucleic acid)——多核苷酸可以是DNA、RNA或合成的DNA類似物，如PNA。任何這三種鏈的單鏈化合物和雙鏈雜化物也都在該術(shù)語的范圍內(nèi)。
釋放、洗脫(release，elute)——通過與溶液或組合物接觸，除去結(jié)合至固相材料的表面或孔的大部分材料。
樣品(sample)——有或疑似含有核酸的流體?？梢杂迷诒景l(fā)明的方法中的典型的樣品包括體液例如血液——其可以是在收集的血樣品中常見的抗凝血、血漿、血清、尿、精液、唾液、細胞培養(yǎng)物、組織提取液和類似物。其它類型的樣品包括溶劑、海水、工業(yè)水樣、食物樣品和環(huán)境樣品例如土壤或水、植物材料、原核生物來源的細胞、真核生物、細菌、質(zhì)粒和病毒。
固相材料(solid phase material)——具有可以將核酸分子吸引至其上的表面的材料。材料可以是微粒、纖維、珠、膜以及其它支持物例如試管和微孔的形式。
取代的(substituted)——是指用非氫原子置換基團上的至少一個氫原子。應該注意到的是，關(guān)于取代的基團，其意圖是可以存在多點取代，除非明確另外指出。
常規(guī)地，通過各種技術(shù)，從不同的樣品類型提取、分離并另外純化核酸。這些技術(shù)的許多依賴于選擇性吸附到對核酸具有一些親和力的材料的表面上。在除去其它較弱結(jié)合的成分的洗滌步驟之后，用溶液處理固相，以除去或洗脫結(jié)合的核酸(多種核酸)。
從細胞材料的一部分提取和分離基因組核酸常常是必需的。如此獲得的核酸被用于隨后的過程中，包括擴增、診斷試驗、突變分析、基因表達型分析和克隆。通過本發(fā)明的方法從其可以分離出核酸的樣品包括細菌培養(yǎng)物、體液、全血和血液組分、組織提取物、植物材料以及含有細胞材料的環(huán)境樣品。
通過已知的方法，細胞核酸內(nèi)含物的去除需要破裂或穿透細胞膜或細胞壁，以便進入細胞內(nèi)部。對于該目的，現(xiàn)有的方法利用細胞裂解步驟。這些方法中的一種使用導致裂解的試劑。根據(jù)使用的裂解方法，有兩類裂解溶液。一類是高pH的含水溶液，用于堿裂解。另一類利用一種或多種表面活性劑或去污劑來破壞細胞膜。裂解溶液也可以含有消化酶如蛋白酶，以便幫助將細胞的核酸內(nèi)含物釋放出來。其他方法在捕獲步驟之前采用機械破壞細胞的初步步驟，以破壞細胞完整性，所述機械方法是用超聲波破壞或用堅硬顆粒(hard particle)進行受控的振動來破壞細胞。
申請人已經(jīng)開發(fā)出新的方法和新的固相結(jié)合材料，該新的方法和新的固相結(jié)合材料可以用于從生物和細胞材料的樣品快速捕獲和分離核酸，所述生物和細胞材料如病毒、質(zhì)粒、胞外DNA或RNA、全血、抗凝血或細菌，該新的方法和新的固相結(jié)合材料不需要任何初步的裂解步驟。固相結(jié)合材料意料不到地允許細胞的核酸內(nèi)含物在一個步驟中被捕獲。因為免除了對裂解液的使用，該新方法在速度、簡單性、便利和易于自動化方面表現(xiàn)出顯著的提高。
在本發(fā)明的一個方面，提供了從生物或細胞材料的樣品捕獲核酸的方法，包括 a)提供固相結(jié)合材料；和 b)將所述固相結(jié)合材料與含有核酸的生物或細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結(jié)合至所述固相結(jié)合材料。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了從生物或細胞材料的樣品分離核酸的方法，由以下組成 a)提供固相結(jié)合材料； b)將所述固相結(jié)合材料與含有核酸的生物或細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結(jié)合至所述固相結(jié)合材料； c)從所述固相結(jié)合材料分離所述樣品； d)任選地，洗滌所述固相結(jié)合材料；和 e)從所述固相結(jié)合材料釋放結(jié)合的核酸。
不像現(xiàn)有的從生物樣品捕獲或分離核酸的方法，不使用裂解細胞的初步步驟。此外，在將樣品與固相結(jié)合材料接觸之前、之時或之后，不使用或不需要裂解劑、去污劑、表面活性劑或離液劑。所需要的只是將細胞材料的樣品與固相接觸一段短暫的時間。如下面實施例中所證明地，為了捕獲顯著數(shù)量的核酸，接觸時間可以是3分鐘或更短時間，在一些情況下少至30秒鐘。從固相釋放之后，捕獲的數(shù)量可以容易地用常用的技術(shù)如凝膠電泳、熒光染色和PCR擴增進行檢測。
為了方便起見，固相結(jié)合材料可以在水或溶液或已知不引起裂解或細胞降解的緩沖液中加入樣品。然而，固相結(jié)合材料可以作為干固體直接加入到樣品。
在本發(fā)明的優(yōu)選方面，提供了從生物體的全血捕獲核酸的方法，由以下組成 a)提供固相結(jié)合材料；和 b)將所述固相結(jié)合材料與全血的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結(jié)合至所述固相結(jié)合材料。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面，提供了捕獲包含在生物體的全血的白細胞中的核酸的方法，由以下組成 a)提供固相結(jié)合材料；和 b)將所述固相結(jié)合材料與全血的樣品混合一段時間，所述時間足以將來自白細胞的核酸結(jié)合至所述固相結(jié)合材料。
通過進行下面額外的步驟，上述方法可以用于分離捕獲的核酸 c)從所述固相結(jié)合材料分離所述樣品； d)任選地，洗滌所述固相結(jié)合材料；和 e)從所述固相結(jié)合材料釋放結(jié)合的核酸。
與本發(fā)明的方法一起使用的、用于結(jié)合核酸的固相材料包括基質(zhì)，該基質(zhì)限定了它的尺寸、形狀、孔隙度和機械性能，并可以是顆粒、微粒、纖維、珠、膜以及其它支持物例如試管和微孔的形式。盡管不希望受到任何特定操作理論的限制，但其可以是這樣一種情形固體支持物的表面在本方法中有效地用于將核酸直接固定出樣品。本文中使用的術(shù)語“捕獲核酸(capturing nucleic acid)”通常涵蓋在使用條件下有效地將核酸與固相連接起來的任何方式，并且也考慮固相結(jié)合完整細胞的情形。
固相材料可以是任何合適的物質(zhì)，具有從細胞材料樣品如全血、細菌培養(yǎng)物將核酸直接結(jié)合出來的期望特性。優(yōu)選的固相材料包括二氧化硅、玻璃、燒結(jié)玻璃、可控孔度玻璃、燒結(jié)玻璃、氧化鋁、氧化鋯、氧化鈦、不溶的合成聚合物、不溶的多糖、和選自金屬、金屬氧化物和金屬硫化物的金屬材料，以及用二氧化硅、玻璃、合成的聚合物或不溶性多糖包被的磁響應性材料。示例性的材料包括用共價結(jié)合的表面官能團涂覆或官能化的二氧化硅基材料，所述共價結(jié)合的表面官能團用于破壞細胞并吸引核酸。也包括被合適地表面官能化的碳水化合物基材料，和具有該表面官能度的聚合材料。申請人的共同在審美國申請序列第10/714,763、10/715,284、10/891,880、10/942,491和60/638,631描述了眾多具體的材料和它們的制備。
在一個實施方案中，所述材料在表面或表面附近還包括共價連接的核酸結(jié)合部分，其允許捕獲和結(jié)合變化長度的核酸分子。表面不僅指固相結(jié)合材料的外周，而且指固相結(jié)合材料內(nèi)任何可及的有孔區(qū)域的表面。申請人的共同在審美國申請序列第10/714,763、10/715,284、10/891,880、10/942,491和60/638,631描述了許多具體的材料和它們的制備。
在本發(fā)明的另一方面，提供了從生物或細胞材料的樣品捕獲核酸的方法，由下述組成 a)提供固相包括連接到核酸結(jié)合部分的基質(zhì)； b)將所述固相與含有核酸的生物或細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結(jié)合至所述固相。
在本發(fā)明的另一方面，提供了從生物或細胞材料的樣品分離核酸的方法，由以下組成 a)提供固相，包括連接到核酸結(jié)合部分的基質(zhì)； b)將所述固相與含有核酸的生物或細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結(jié)合至所述固相結(jié)合材料； c)從所述固相分離所述樣品； d)任選地，洗滌所述固相；和 e)從所述固相釋放結(jié)合的核酸。
在另一個實施方案中，所述材料還包括在表面上或表面附近的非共價締合的核酸結(jié)合部分，其允許捕獲并結(jié)合變化長度的核酸分子。該非共價締合的核酸結(jié)合部分通過靜電吸引到表面上帶相反電荷的殘基而與固體基質(zhì)締合，或通過與表面的疏水引力而與固體基質(zhì)締合。
這些攜帶共價或非共價連接的核酸結(jié)合基團的材料的基質(zhì)材料可以是任何合適的物質(zhì)。優(yōu)選的基質(zhì)材料選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物、不溶的多糖、和選自金屬、金屬氧化物和金屬硫化物的金屬材料，以及用二氧化硅、玻璃、合成的聚合物或不溶性多糖包被的磁響應性材料。示例性的材料包括用共價結(jié)合的表面官能團包被或官能化的二氧化硅基材料，所述共價結(jié)合的表面官能團用于破壞細胞并吸引核酸。也包括被合適地表面官能化的碳水化合物基材料，和具有該表面官能度的聚合材料。申請人的共同在審美國申請序列第10/714,763、10/715,284、10/891,880、10/942,491和60/638,631描述了眾多具體的材料和它們的制備。充當核酸結(jié)合基團的表面官能團包括能夠破壞細胞的結(jié)構(gòu)完整性并使核酸吸引到固體支持物上的任何基團。此類基團不受限制地包括羥基、硅烷醇、羧基、氨基、銨、季銨鹽和季鹽和三元锍鹽類材料，如下所述。摻入氨基基團的固相材料在第一低pH中被質(zhì)子化以結(jié)合核酸，在第二較高pH中、在釋放結(jié)合的核酸期間被去質(zhì)子化，例如在歐洲專利說明書EP01036082B1中公開的材料，被認為在本發(fā)明中有用的固相材料的范圍內(nèi)。
對于許多應用而言，優(yōu)選地是，固相材料是顆粒形式。優(yōu)選地，顆粒的尺寸小于約50μm，更優(yōu)選地，少于約10μm。小顆粒更容易分散在溶液中并具有較高的表面/體積比。較大的顆粒和珠在利用重力沉降或離心的方法中也是有用的。固相優(yōu)選還可以包括磁響應部分，其通常將是磁微顆粒的形式——可以被磁場吸引并操作的顆粒。此類磁微顆粒包括磁金屬氧化物或金屬硫化物芯，其通常被吸附性或共價性結(jié)合的層包圍，該吸附性或共價性結(jié)合的層共價結(jié)合核酸結(jié)合基團，從而包覆表面。磁金屬氧化物芯優(yōu)選是氧化鐵或硫化鐵，其中鐵是Fe2+或Fe3+或兩者。如美國4,654,267所述，磁性顆粒也可以通過在多孔聚合物存在下沉淀金屬顆粒以包載磁響應性金屬顆粒而形成?？芍苽涞拇判越饘傺趸飶亩‵e3O4、MnFe2O4、NiFe2O4和CoFe2O4。其它磁性顆粒也可以如美國5,411,730所述通過在寡糖葡聚糖存在下沉淀金屬氧化物顆粒以包載磁響應性金屬顆粒而形成。前述的美國專利5,091,206公開了另一種磁性顆粒。該顆粒包括用順磁性金屬氧化物層包被的聚合芯顆粒以及另外的聚合層，以保護金屬氧化物層并提供反應性包被層。含有氯甲基化的Merrifield樹脂的磁鐵礦(四氧化三鐵，magnetite)的制備被描述于出版物(Tetrahedron Lett.，40(1999)，8137-8140)中。
商業(yè)可得的磁性二氧化硅或磁性聚合顆粒可以被用作制備在本發(fā)明中有用的磁固相結(jié)合材料的原材料。具有表面羧基基團的聚合顆粒的合適類型已知為商品名SeraMagTM(Seradyn)和BioMagTM(Polysciences and Bangs Laboratories)。二氧化硅磁性顆粒的合適類型已知為商品名MagneSilTM(Promega)。在表面上具有羧基或氨基的二氧化硅磁性顆?？梢詮腃hemiceil GmbH(Berlin)獲得。
根據(jù)本發(fā)明，通過將裸露的或包被的金屬芯與有機連接體基團連接，申請人已經(jīng)制備了磁響應性顆粒結(jié)合材料，所述有機連接體基團連接著核酸結(jié)合(nucleic acid binding，NAB)部分。當使用包被的金屬芯時，方便的包被的芯的是硅包被的磁芯或玻璃包被的磁芯。優(yōu)選的磁響應性金屬芯由磁鐵礦Fe3O4提供。磁鐵礦可以在商業(yè)上獲得，或根據(jù)普遍已知的方法通過鐵(II)和鐵(III)鹽在堿溶液中的反應制備而得。
在一個末端含有三烷氧基硅烷基團的連接體基團可以被連接到金屬材料或包被的金屬材料如二氧化硅或玻璃包被的磁顆粒的表面。優(yōu)選的三烷氧基硅烷化合物具有式R1-Si(OR)3，其中R是低級烷基，以及R1是有機基團，選自直鏈、支鏈和環(huán)，并包括1至100個原子。原子優(yōu)選地選自C、H、B、N、O、S、Si、P、鹵素和堿金屬。代表性的R1基團是3-氨丙基、2-氰乙基和2-羧乙基，以及含有可裂解部分的基團，如下面更詳細描述的。在優(yōu)選的實施方案中，三烷氧基硅烷化合物包括可裂解中心部分和反應性基團末端部分，其中，反應性基團通過與叔胺、叔膦或有機硫化物反應在一個步驟中可以轉(zhuǎn)換成四元或三元鹽。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在使用氟化物離子的過程中，此連接體基團可以被安置在金屬顆粒和玻璃或二氧化硅包被的金屬顆粒的表面上。反應可以在有機溶劑中進行，有機溶劑包括低級醇和芳香族溶劑，包括甲苯。合適的氟化物源在這樣的有機溶劑中具有可觀的溶解性，并包括氟化銫和氟化四烷基銨鹽。
包含在可用于本發(fā)明的方法中的固相結(jié)合材料中的NAB基團似乎具有雙重目的。NAB基團吸引并結(jié)合具有各種長度和堿基組成或堿基序列的核酸、多核苷酸和寡核苷酸。它們也具有一些將核酸從細胞包膜中釋放出來的能力。核酸結(jié)合基團包括例如羧基、胺和三元或四元基(ternary or quaternary onium groups)。胺基團可以是NH2、烷基胺以及二烷基胺基團。優(yōu)選的NAB基團是三元或四元基，包括三烷基季銨基團(-QR3+)、基(-QR3+)包括三烷基或三芳基或混合的烷基芳基基團、以及三元锍基(-QR2+)。固相可以含有一種以上類型的核酸結(jié)合基團，如本文中所述。含有其中R基團是具有至少4個碳的烷基的三元或四元基-QR2+或-QR3+的固相材料在結(jié)合核酸中特別有效，但少至1個碳的烷基基團也如芳基那樣有用。此類固相材料以高的韌度保持結(jié)合的核酸并在現(xiàn)有技術(shù)中已知用于洗脫的大多數(shù)條件下阻止核酸的去除或洗脫。大部分已知的低和高離子強度的洗脫條件對于除去結(jié)合的核酸是無效的。不同于含有DEAE和PEI基團的傳統(tǒng)陰離子交換樹脂，三元或四元固相材料保持帶正電，無論反應介質(zhì)的pH如何。
某些優(yōu)選的實施方案利用固相結(jié)合材料，在其中，NAB基團通過可以被選擇性斷裂的鍵連接到基質(zhì)。斷裂該連接有效地將任何結(jié)合的核酸與固相“分開(disconnect)”。連接可以通過任何化學、酶法、光化學或特異性斷裂可裂解接頭中的鍵(許多鍵)但也不破壞感興趣的核酸的其他方法而裂解。此類可裂解固相材料包括固體支持部分(solid support portion)，所述固體支持部分包括選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物、不溶多糖和金屬材料的基質(zhì)，所述金屬材料選自金屬、金屬氧化物和金屬硫化物。用于吸引和結(jié)合核酸的核酸結(jié)合(NAB)部分通過可裂解的連接體部分連接到固體支持物的表面。
在一個優(yōu)選的實施方式中，NAB是式QR2+X-的三元基，或四元基QR3+X-，如上所述。
可裂解連接體部分優(yōu)選選自直鏈、支鏈和環(huán)狀的有機基團，并包括1至100個原子。該原子優(yōu)選選自C、H、B、N、O、S、Si、P、鹵素和堿金屬。示例性的連接體基團是通過水解裂解的水解可裂解基團。羧酸酯和羧酸酐、硫代酸酯、碳酸酯、硫代碳酸酯、氨基甲酸乙酯、二酰亞胺、磺酰胺和磺酰亞胺是代表性的，如同磺酸酯也是代表性的。在一個優(yōu)選的實施方案中，可裂解連接用含水堿性溶液處理。連接體基團的另一個示例性類別是經(jīng)受還原性裂解的那些基團，如二硫(S-S)鍵，所述二硫鍵通過硫醇例如乙硫醇、巰基乙醇和DTT被裂解。另一個代表性基團是含有過氧化物(O-O)鍵的有機基團。過氧化物鍵可以通過硫醇、胺和膦裂解。
另一代表性的基團是光化學可裂解連接體基團如硝基取代的芳族醚和酯，具有下式。
其中Rd為H、烷基或苯基。鄰硝基芐基酯根據(jù)下面熟知的反應被紫外光裂解。
另一代表性的可裂解基團是可酶法裂解連接體基團。示例性的基團包括通過酯酶和水解酶裂解的酯、通過蛋白酶和肽酶裂解的酰胺和肽、通過糖苷酶裂解的糖苷基團。
另一代表性的可裂解基團是可裂解的1，2-二氧雜環(huán)丁烷(dioxetane)部分。此類材料包含可以被熱分解或由化學劑或酶劑引發(fā)成片段的二氧雜環(huán)丁烷部分。除去保護基以產(chǎn)生氧陰離子，促進二氧雜環(huán)丁烷環(huán)的分解。根據(jù)熟知的方法，通過裂解過氧化物的O-O鍵以及C-C鍵而發(fā)生斷裂(fragmentation)?？闪呀獾?，2-二氧雜環(huán)丁烷描述于無數(shù)專利和出版物中。代表性的例子包括美國專利4,952,707、5,707,559、5,578,253、6,036,892、6,228,653和6,461,876。
可選地，連接的基可以被結(jié)合到芳基Ar或結(jié)合到可裂解的基團Y。進一步可選地，與固相和三元或四元基的連接從所示出的方向被顛倒。
另一可裂解的連接體基團是可以轉(zhuǎn)化成不穩(wěn)定的1，2-二氧雜環(huán)丁烷部分的多電子的C-C雙鍵。在該雙鍵上的至少一個取代基利用O、S或N原子被結(jié)合到雙鍵上。多電子雙鍵與單態(tài)氧的反應產(chǎn)生不穩(wěn)定的1，2-二氧雜環(huán)丁烷環(huán)基團，其在環(huán)境溫度下自發(fā)斷裂(fragment)，以產(chǎn)生兩個羰基片段。由多電子的雙鍵形成的不穩(wěn)定的1，2-二氧雜環(huán)丁烷描述于無數(shù)專利和出版物中，例子是A.P.Schaap和S.D.Gagnon，J.Am.Chem.Soc.，104，3504-6(1982)；W.Adam，Chem.Ber.，116，839-46，(1983)；美國專利5,780,646。
具有可裂解連接體基團的另一組固相材料具有乙烯酮二硫縮醛(ketenedithioacetal)作為可裂解部分，如在PCT公布WO 03/053934中所公開。乙烯酮二硫縮醛經(jīng)受通過與過氧化物酶和過氧化氫的酶氧化導致的氧化性裂解。
可裂解部分具有所示的結(jié)構(gòu)，包括在9，10-二氫化吖啶環(huán)上具有取代的類似物，其中Ra、Rb和Rc每一個都是有機基團，該有機基團含有1至約50個選自C、N、O、S、P、Si和鹵素原子的非氫原子，并且其中Ra和Rb可以被接合在一起而形成環(huán)。無數(shù)的其他可裂解基團對技術(shù)人員而言將是明顯的。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了從生物或細胞材料的樣品捕獲核酸的方法，由下述組成 a)提供固相，包括通過可選擇性裂解的鍵連接有核酸結(jié)合部分的基質(zhì)； b)將所述固相與含有核酸的生物或細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結(jié)合至所述固相。
還提供了從生物或細胞材料的樣品分離核酸的方法，由以下組成 a)提供固相包括 通過可選擇性裂解的鍵連接有核酸結(jié)合部分的基質(zhì)； b)將所述固相與含有核酸的生物或細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結(jié)合至所述固相； c)從所述固相分離所述樣品；和 d)任選地，洗滌所述固相；和 e)通過選擇性裂解所述連接體，從所述固相釋放結(jié)合的核酸。
在優(yōu)選的實施方案中，所述固相包括選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖的基質(zhì)，和結(jié)合至所述基質(zhì)表面上的基，所述基選自其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式QR2+X-的三元锍基，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式NR3+X-的季銨基，以及其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季基PR3+X-，并且其中X是陰離子。
將固相與含有核酸的生物或細胞材料的樣品混合的步驟，涉及將樣品材料與固相結(jié)合材料混合，和任選地，機械攪拌混合物以將固相均勻分散在樣品體積內(nèi)，所用時間為有效地破壞細胞材料并將核酸結(jié)合至固相。樣品的所有核酸內(nèi)含物不必都結(jié)合至固相，然而盡可能多地結(jié)合是有利的。對樣品/固相混合物的攪拌可以采用任何便利的形式，包括搖動、使用機械振蕩器或搖擺器、旋轉(zhuǎn)、超聲波攪拌和類似形式。在該步驟中結(jié)合核酸所需要的時間通常在幾秒鐘至少數(shù)幾分鐘的水平，但是可通過常規(guī)實驗進行實驗性地檢驗。
從固相分離樣品的步驟可以通過下列方法完成過濾、重力沉降、傾析、磁力分離、離心、真空吸氣、過壓空氣或其它氣體以使液體通過多孔膜或例如過濾氈片(filter mat)。該樣品中除了核酸之外的組分在該步驟被除去。就其它組分的除去不完全而言，可以進行一種或多種洗滌，以幫助它們完全被去除。用于去除樣品組分如鹽、生物或細胞碎片、蛋白質(zhì)和血紅蛋白的洗滌劑包括水和含水緩沖溶液并可以含有表面活性劑。
從固相釋放結(jié)合的核酸的步驟，涉及將所述固相材料與溶液結(jié)合以從所述固相釋放結(jié)合的核酸。溶液應該溶解并充分保護釋放的核酸。該溶液可以是試劑組合物，其包括pH約7-9的含水緩沖液，任選地含有0.1-3M的緩沖鹽、金屬鹵化物或醋酸鹽以及任選地含有0.1-50％的有機助溶劑、或表面活性劑。
用于裂解后從固相釋放核酸的試劑可以選擇性的是強堿含水溶液。濃度至少為10-4M的堿金屬氫氧化物或氫氧化銨的溶液有效地將核酸從裂解的固相切割和洗脫出來。強堿性溶液可用于聯(lián)合固相結(jié)合材料，在其中，核酸結(jié)合部分通過基團被連接到基質(zhì)，所述基團可以通過共價鍵的斷裂(breakage)而被片斷化(fragmented)或裂解(cleaved)。此類材料描述于下和前述共同在審美國專利申請序列第10/714,763、10/715,284和10/891,880中。釋放步驟可以在室溫下進行，但是可以使用任何便利的溫度。洗脫溫度對于本發(fā)明分離核酸的方法的成功并不是至關(guān)重要的。優(yōu)選環(huán)境溫度，但是在一些情況下，高溫可以增加洗脫速度。
固相核酸捕獲的方法可以投入許多用途中。如在下面的特定實施例中顯示地，單鏈和雙鏈核酸都可以被捕獲并釋放。DNA、RNA和PNA可以被捕獲并釋放。
本方法的優(yōu)選用途是從全血分離DNA。如上面背景部分描述，在全血中從白細胞提取DNA通?；蛘呤请y以自動化的繁瑣的、多步驟的過程，或者在裂解條件下利用固體支持物。本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有方法的局限性。該方法操作簡單，僅僅需要將血樣品與固相結(jié)合材料混合一短暫的時間，以將核酸內(nèi)含物捕獲到固相材料。整個過程可以在5分鐘內(nèi)手工進行。當固相材料是顆粒或微粒的形式時，該方法是特別有效和快捷的。盡管簡單且所需的時間短，但是大部分量的核酸被捕獲。
這些方法的重要優(yōu)勢是它們與許多下游的分子生物學過程相容。在很多情況下，通過本方法分離的核酸可以在進一步的過程中被直接使用。擴增反應例如PCR、美國專利5,998,175中描述的多寡聚體連接(Ligation of Multiple Oligomers，LMO)、以及LCR可以采用此類核酸洗脫液。通過常規(guī)技術(shù)、尤其是從細菌培養(yǎng)物或從血樣中分離核酸，采用沉淀步驟，這通過加入高體積百分比的低分子量醇進行。然后，在使用前，沉淀的物質(zhì)必須被分離、收集并重溶于合適的介質(zhì)中。通過使用本方法，從本發(fā)明的固相結(jié)合材料洗脫核酸，這些步驟可以被免除。將含有釋放的核酸的溶液直接用于核酸擴增反應中，從而用聚合酶或連接酶-介導的反應擴增核酸或其片段的量，這是優(yōu)選的實踐。
在前面的部分中已經(jīng)描述了許多不同的固相結(jié)合材料，在隨后的具體實施例的要求保護的方法中示出了眾多具體的示例性材料。本領域技術(shù)人員將能夠通過本文中描述的方法的常規(guī)應用來確定合適的材料。
本發(fā)明還涉及用于上述方法的含有固相結(jié)合材料的試劑盒。試劑盒包括固相結(jié)合材料和用于從固相釋放核酸的試劑。試劑盒也可以包括其他組分，例如洗滌緩沖液、稀釋劑或使用說明書。
所述固相結(jié)合材料能夠在不使用裂解溶液或包被裂解劑的情況下從生物或細胞材料直接捕獲核酸。該捕獲核酸的用途不需要任何初步的裂解步驟，并允許生物或細胞材料的核酸內(nèi)含物在一個步驟中被捕獲。在一個實施方案中，固相材料是微粒材料或磁響應性微粒材料。
實施例
當存在于下面的實施例中時，結(jié)構(gòu)圖旨在僅僅說明固相材料的可裂解連接體部分。所述圖不代表固相材料的完整定義。
實施例1.4′-羥苯基4-氯甲基硫代苯甲酸酯的合成。
將100.9g 4-氯甲基苯甲酸和1.2L的亞硫酰氯裝載入3L瓶中?；亓鞣磻?小時，之后，在減壓下除去亞硫酰氯。通過加入CH2Cl2和減壓下蒸發(fā)，除去殘留的亞硫酰氯。
向含有113.1g的4-氯甲基苯甲酸氯化物的3L瓶中裝載入98.17g 4-羥基苯硫酚和1.5L CH2Cl2。吹掃入(purged in)氬，并加入67.75mL吡啶。在攪拌過夜后，用1L CH2Cl2稀釋反應混合物并用總共5L水萃取。水層用CH2Cl2反萃取。合并的CH2Cl2溶液經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮至固體。用500mL CH2Cl2洗滌該固體，過濾并風干。1H NMR(丙酮-d6)δ4.809(s，2H)，6.946-6.968(d，2H)，7.323-7.346(d，2H)，7.643-7.664(d，2H)，8.004-8.025(d，2H)。
實施例2.用聚甲基丙烯酸酯連接體官能化的、并含有三丁基基和可裂解芳基硫酯鍵(arylthioester linkage)的磁性二氧化硅顆粒的合成。
將磁性的羧酸官能化的二氧化硅顆粒(Chemicell，SiMag-TCL，1.0meq/g，1.5g)置于20mL亞硫酰氯中并回流4小時。減壓下除去過量的亞硫酰氯。將該樹脂重懸于25mL CHCl3中并通過超聲分散該懸浮液。蒸發(fā)溶劑并重復超聲洗滌處理。真空下干燥該顆粒，待進一步使用。
?；裙倌芑念w粒與388mg二異丙基乙胺一起被懸于38mL CH2Cl2中。加入4′-羥苯基4-氯甲基-硫代苯甲酸酯(524mg)并將密封的反應瓶置于搖床上過夜。將顆粒轉(zhuǎn)移至50mL塑料管，并用若干份CH2Cl2、CH3OH、1∶1的CH2Cl2/CH3OH，然后用CH2Cl2反復洗滌，伴隨以磁分離。通過TLC監(jiān)測洗滌溶液中未反應的可溶性原材料的去除。在進一步使用前風干該固體。
在氬下，將該樹脂(1.233g)懸于20mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(395mg)并搖動該漿液7天。將顆粒轉(zhuǎn)移至50mL塑料管，并用40mL CH2Cl2洗滌4次，隨后用40mL MeOH洗滌4次以及用40mL CH2Cl2洗滌4次。然后，風干該樹脂，得到1.17g淺棕色固體。
實施例3.用含有三丁基基的可裂解連接體官能化的硅酸鹽連接體體的合成
將3-氨丙基三乙氧基硅烷(13.2mL)在75mL庚烷和13mL乙醇中的溶液置于Ar下，并用5.5g的琥珀酸酐攪拌?；亓鞣磻?.5h，然后冷卻至室溫過夜。除去溶劑，產(chǎn)生酰胺產(chǎn)物，為清澈的油。
將EDC氫氯化物(4.0g)和2.86g上述產(chǎn)物在100mL CH2Cl2中的溶液放置在Ar下，并攪拌1h，然后加入5.5g的4′-羥苯基4-氯甲基硫代苯甲酸酯(實施例1)。反應過夜攪拌。將反應混合物層析到150g的二氧化硅上，用1-2％EtOH/CH2Cl2洗脫，產(chǎn)生1.84g偶聯(lián)的產(chǎn)物，為白色固體。
實施例4.用含有三丁基基的可裂解的連接體官能化的二氧化硅顆粒的合成。
在Ar覆蓋下，將在50mL干燥甲苯中的實施例3的產(chǎn)物(1.84g)通過套管加入到含有3.83g烘箱干燥的二氧化硅的瓶中。反應回流過夜。在冷卻至室溫之后，過濾出二氧化硅，用500mL的CH2Cl2洗滌，真空干燥4h。
將在50mL的CH2Cl2中的具有氯芐基末端基團的衍生化的二氧化硅(2.0g)與8.0g的三丁基膦混合。反應混合物在Ar下攪拌2天。過濾出二氧化硅，用CH2Cl2和己烷洗滌，真空干燥幾小時。
實施例5.用含有三丁基基的可裂解連接體包被的磁性顆粒的合成
通過在Ar下，在回流的甲苯中過夜攪拌，將實施例3的硅酸鹽連接體(0.25g)與0.5g Fe3O4顆粒反應。冷卻之后，將固體和甲苯溶液轉(zhuǎn)移至50mL離心管。將固體吸引到外部磁體上，傾析甲苯，固體用甲苯洗滌三次，用CH2Cl2洗滌3次。
將前面步驟的顆粒(0.40g)懸浮在25mL CH2Cl2中。將三丁基膦(1.6g)加到該懸浮液中，并且在放置在軌道式振蕩器(orbital shaker)1.5天之前，密封容器。固體進行上面描述的“磁法洗滌(magnetic wash)”，產(chǎn)生黑色粉末。
實施例6.含有三丁基基的可裂解連接體包被的磁性二氧化硅顆粒的合成
通過被動地將可裂解的核酸結(jié)合基團吸附到二氧化硅顆粒表面，制備核酸結(jié)合材料。
將硬脂酸(1.33g)在10mL的SOCl2中回流2h。減壓下，去除過量的SOCl2，產(chǎn)生硬脂酰氯，為棕色液體。
將硬脂酰氯溶解在10mL的CH2Cl2中，并加入到于30mL CH2Cl2中的1.0g如實施例1中所述制備的4′-羥苯基4-氯甲基硫代苯甲酸酯和1.56mL二異丙基乙胺的溶液中，并將混合物攪拌過夜。去除溶劑，將殘留物進行柱層析，使用1∶1己烷/CH2Cl2作為洗脫液。分離硬脂酰酯(1.43g)，為白色固體。
在Ar氣氛下，將上面的產(chǎn)物(1.43g)和三丁基膦(1.27mL)在30mL的CH2Cl2中的溶液攪拌2天。除去CH2Cl2之后，殘留物用6×50mL的醚洗滌，重新溶解在CH2Cl2中，并用醚沉淀，產(chǎn)生1.69g的鹽產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)該材料在水中是不溶的。
將鹽(0.6g)溶解在6mL的CH2Cl2中，并伴隨著攪拌加入到6.0g的硅膠中。蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生核酸結(jié)合材料。
實施例7.具有含聚乙烯基芐基三丁基基團的聚合物層的磁性顆粒的合成。
在玻璃瓶中，將磁性Merrifield肽樹脂(Chemicell，SiMag Chloromethyl，100mg)加至2mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(80μL)，并在室溫下?lián)u動漿液3天。在該瓶下放置磁體，并用移液管除去上清液。用2mL CH2Cl2洗滌固體4次(洗滌液也通過磁體/移液管步驟除去)。風干該樹脂(93mg)。
實施例8.含三丁基基團和可裂解芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物顆粒的合成。
將聚(甲基丙烯酰氯)顆粒(1.0meq/g，1.5g)置于含2.45g二異丙基乙胺的75mL CH2Cl2中。加入三乙胺(1.2g)。加入4′-羥苯基4-氯甲基硫代苯甲酸酯(4.5g)，并將密封的反應混合物在室溫下攪拌過夜。過濾該漿液，并用10mL CH2Cl2、200mL丙酮、200mL MeOH、2×100mL 1∶1的THF/CH2Cl2、250mL THF、250mLCH2Cl2、250mL己烷洗滌樹脂。風干該樹脂，待進一步使用。
在氬下，將該樹脂(1.525g)懸于25mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(1.7g)并攪拌該漿液4天。過濾該樹脂，并用225mL CH2Cl2，隨后用175mL己烷洗滌4次。然后，風干該樹脂，得到1.68g固體。
實施例9.含三丁基基的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞(argon pad)下，在200mL CH2Cl2/DMF(50/50)中，攪拌Merrifield肽樹脂(Merrifield peptide resin)(Sigma，1.1meq/g，20.0g)，其為交聯(lián)的氯甲基化聚苯乙烯。加入過量的三丁基膦(48.1g，10當量)，并在室溫下攪拌漿液7天。過濾該漿液，并用200mL CH2Cl2洗滌所得到的固體2次。在真空下干燥樹脂(21.5g)。元素分析觀察到的(Found)P 2.52％，Cl 3.08％；期望的(Expected)P 2.79％，Cl3.19％P/Cl比率為0.94。
實施例10.含三丁基銨基團的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞下，在150mL CH2Cl2中，攪拌Merrifield肽樹脂(Aldrich，1.43meq/g，25.1g)。加入過量的三丁基胺(25.6g，4當量)，并在室溫下攪拌漿液8天。過濾該漿液，并用250mL CH2Cl2洗滌所得到的固體2次。在真空下干燥樹脂(28.9g)。元素分析觀察到的N 1.18％，Cl 3.40％；期望的N 1.58％，Cl 4.01％N/Cl比率為0.88。
實施例11.用三丁基基團官能化的二氧化硅顆粒的合成。
將在Ar下于110℃干燥1小時的硅膠(4.82g)與2.79g的Et3N一起加入到50mL的CH2Cl2中。將混合物攪拌20分鐘，這之后，加入2.56g的3-溴丙基三氯硅烷，引起放熱。將混合物攪拌24h，過濾，并用3×40mL的CH2Cl2、4×40mL的MeOH和2×40mL的CH2Cl2依次洗滌固體。過夜空氣干燥固體，稱重，為6.13g。
將于50mL的CH2Cl2中的上面制備的官能化的二氧化硅(5.8g)與5.33mL的三丁基膦一起攪拌10天。過濾混合物，并用7×50mL的丙酮洗滌固體。風干固體，產(chǎn)生5.88g的產(chǎn)物。
實施例12.在實施例6的NAB材料中的連接體的可控裂解。
將實施例6的包被的二氧化硅材料(70mg)懸浮在1.0mL的D2O中，并通過旋轉(zhuǎn)混合3分鐘。通過1H NMR對水溶液的分析顯示，沒有材料釋放到溶液中。
用40μL的40％NaOD處理二氧化硅懸浮液，旋轉(zhuǎn)3分鐘，并對上清液進行NMR分析，顯示連接體裂解并從二氧化硅釋放到溶液。
實施例13.硅氧烷包被的磁鐵礦的合成
將在100mL無水乙醇中的磁鐵礦1.00g(Alfa Aesar)與3.2mL的TEOS、3.32g的CsF和1.0mL的水在Ar下回流中反應2小時。傾析冷卻的反應混合物，用乙醇磁法洗滌固體4次，用CH2Cl2磁法洗滌5次。在Ar下干燥固體，產(chǎn)生3.14g的固體。1.0g份的該材料用5×50mL的去離子水和5×50mL的甲醇依次洗滌。干燥產(chǎn)生0.67g的固體。
實施例14.含有聚乙烯基芐基三丁基基團的磁性顆粒的合成。
在超聲波浴的幫助下，將1.0g氧化鐵分散在100mL乙醇中。反應容器裝載1.50mL的TEOS、1.65g的p-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷(Gelest)、3.32g的氟化銫和1.0mL的去離子水。在Ar下，在大氣中，反應混合物回流攪拌2小時。將混合物冷卻到室溫，傾析溶劑，用乙醇磁法洗滌固體5次，用CH2Cl2洗滌5次。用Ar蒸汽干燥固體，產(chǎn)生2.96g產(chǎn)物。
將前述步驟的顆粒(0.50g)懸浮在20mL的CH2Cl2中。將三丁基膦(0.5mL)加入到懸浮液，密封容器，然后置于軌道式振蕩器上過夜。固體用CH2Cl2磁法洗滌5次。用Ar蒸汽干燥固體，得到0.48g的產(chǎn)物。
實施例15.官能化的硅氧烷包被的磁鐵礦的合成
將在200mL無水乙醇中的磁鐵礦1.00g(Alfa Aesar)與3.0mL的3-(三乙氧基甲硅烷基)-丙腈、3.32g的CsF和1.0mL的水在Ar下回流中反應2小時。傾析冷卻的反應混合物，用乙醇磁法洗滌固體4次，用CH2Cl2磁法洗滌5次。在Ar下干燥固體，產(chǎn)生2.46g的固體。
實施例16.官能化的硅氧烷包被的可控孔度玻璃的合成
在Ar的覆蓋(blanket)下，將在50mL的干燥甲苯中的實施例2中硅酸鹽連接體(1.84g)通過套管加入到含有3.83g經(jīng)烘箱干燥的可控孔度玻璃PrimeSynthesis native CPG(0.5g)的瓶中。反應過夜回流。在冷卻至室溫后，過濾出玻璃，用500mL CH2Cl2洗滌，真空干燥4h。
在50mL的CH2Cl2中，具有氯芐基末端基團的衍生化的玻璃(2.0g)與8.0g的三丁基膦混合。反應混合物在Ar下攪拌2天。過濾出玻璃，用CH2Cl2和己烷洗滌，真空干燥幾小時。
實施例17A.官能化的磁性聚苯乙烯的合成
獲取在H2O中的胺-官能化的磁性聚苯乙烯珠(Spherotech)懸浮液(4×1mL，每一含有25mg)，并加入到兩個1.5mL管。除去上清液，珠用3×1mL的pH 4.0的0.1M MES緩沖液洗滌。向每一個管加入600μL的MES緩沖液和28mgEDC(0.147mmol)以及50mg 4-氯甲基苯甲酸在300μL DMF(0.174mmol)中的溶液。攪拌一天之后，對管聲波處理1小時，并放置在磁性架(magnetic rack)上。將反應混合物轉(zhuǎn)移到兩個50mL管，并用H2O稀釋至40mL。珠用水(4×40mL)、1∶1CH3OH∶H2O(40mL)和CH3OH(3×40mL)磁法洗滌，并允許在管中干燥。
將上面的固體(90mg)置于1.5mL管中，加入800μL的CH3OH。將30mgPBu3在200μL CH3OH中的溶液加入到該懸浮液。反應混合物超聲波處理30min，并在室溫中攪拌。攪拌9天后，通過保持在磁體上去除上清液。珠用水(4×1mL)、CH3OH(4×1mL)和水(1×1mL)磁法洗滌。然后，將1mL水加入到珠，制備10mg/mL的貯存懸浮液。
實施例17B.官能化的磁性聚苯乙烯的可選合成
將1.00g 4-氯甲基苯甲酸(5.86mmol)和3,00mL三丁基膦(12.0mmol)在30mL丙酮中的溶液在Ar下過夜攪拌，導致形成白色沉淀，經(jīng)1H NMR鑒定為4-羧芐基三丁基氯化物(4-carboxybenzyltributylphosphonium chloride)，過濾收集固體，并用丙酮洗滌，然后用己烷洗滌。產(chǎn)量2.19g，89％。
獲取在H2O中的胺-官能化的磁性聚苯乙烯珠(Spherotech)懸浮液(2×1mL，每一含有25mg)，并加入到兩個1.5mL管中。除去上清液，珠用3×1mL的pH4.0的0.1M MES緩沖液洗滌。向每一個管加入600μL的MES緩沖液和30mg 4-羧芐基三丁基氯化物(80μmol)在200μL DMF/200μL MES緩沖液中的溶液以及EDC(15mg，78μmol)。對管超聲波處理30min，并放置在振蕩器上1天。通過保持在磁體上去除上清液。珠用水(4×1mL)、CH3OH(4×1mL)和水(1mL)磁法洗滌，然后加入水，制備100mg/mL的貯存懸浮液。
實施例18.官能化的磁性聚苯乙烯的合成。
在Ar下，將1.0g 4′-氨苯基4-氯甲基-苯硫代羧酸酯(4′-aminophenyl4-chloromethylbenzenethiocarboxylate)(通過EDC偶聯(lián)4-氯甲基苯甲酸和4-氨基苯硫酚(4-aminothiophenol)而制備)在30mL丙酮中的溶液與2.0g三丁基膦攪拌過夜。過濾出已經(jīng)形成的沉淀，并用丙酮和己烷洗滌。鹽的產(chǎn)量是1.41g，82％。
傾析1mL來自100mg/mL懸浮液的磁性羧化聚苯乙烯樹脂，固體用3×1mL的pH 4.0的0.1M MES緩沖液洗滌。將前面步驟的產(chǎn)物(50mg)溶解在400μL DMF和400μL MES緩沖液中。將該溶液加入到于200μL MES緩沖液中的珠懸浮液。然后加入28mg EDC，對懸浮液超聲波處理30min，并置于振蕩器上。攪拌一天之后，去除反應混合物。珠用4×1mL H2O、4×1mL CH3OH、1×1mL H2O磁法洗滌。將該珠懸浮在H2O(100mg/mL)中。
實施例19.官能化的磁性聚苯乙烯的合成
從1mL 100mg/mL的磁性羧化聚苯乙烯樹脂的懸浮液中去除上清液，固體用3×1mL的pH 4.0的0.1M MES緩沖液()洗滌。將珠懸浮在800μL MES中，加入63mg 1，4-二氨基丁烷在200μL MES緩沖液中的溶液。加入EDC(28mg，0.147mmol)，對珠超聲波處理30min，然后在室溫中攪拌。將反應混合物與珠磁法分開。然后將珠用4×1mL水和4×1mL MES緩沖液磁法洗滌。
將50mg 4-羧芐基三丁基氯化物(4-carboxybenzyitributylphosphoniumchloride)(0.134mmol)溶解在400μL DMF/MES緩沖液的1∶1混合物中，并加入到上述珠在600μL的MES緩沖液的懸浮液中。對管進行超聲波處理30min，并保持在振蕩器中。攪拌一天之后，傾析溶液，珠用水(4×1mL)、CH3OH(4×1mL)和水(1mL)磁法洗滌，并加入水制備100mg/mL貯存緩沖液。
實施例20.與基團靜電締合的磁性聚合物的合成
從1mL 100mg/mL的磁性羧化聚苯乙烯樹脂懸浮液去除上清液。珠與1mL0.1M NaOH攪拌5min。傾析溶液之后，珠用1mL水洗滌。將20mgPlus EnhancerTM(如美國專利5,451,437所述制備)在400μL水中的溶液加入到珠，并將混合物攪拌5分鐘。去除上清液后，珠用3×1mL水洗滌，并加入水，制備100mg/mL貯存緩沖液。
實施例21.官能化的磁性聚合物的合成
在磁體的幫助下，傾析含有25mg固體的等分試樣的珠(Dynal magneticCOOH珠，目錄號G03810))。然后，在過夜干燥之前，用3×1mL水和3×1mL CH3CN洗滌珠。將珠懸浮在800μL的CH2Cl2中，向CH2Cl2加入15mg的EDC(78μmol)。將實施例1化合物(30mg)在200μL DMF中的溶液加入到混合物。對管超聲波處理30分鐘，并振蕩過夜。除去上清液，珠用4×1mL CH2Cl2、1mL 1∶1 MeOH∶CH2Cl2、3×1mL MeOH和4×1mL CH2Cl2磁法洗滌。在空氣中過夜干燥該珠。
將珠懸浮在1mL的CH2Cl2中，向CH2Cl2加入30μL三丁基膦。對反應混合物超聲波處理30分鐘，并振蕩，共5天。通過保持在磁體上，傾析溶劑。珠用4×1mL CH2Cl2、3×1mL CH3OH和2×1mL水磁法洗滌。加入1mL水，制備珠貯存溶液(25mg/mL)。
實施例22.官能化的磁性聚合物的合成。
將等分試樣的Dynal甲苯磺酰基活化珠(Dynal tosyl activated beads)(1mL97.5mg/mL貯存液，目錄號F68710)置于1.5mL管中，使用磁性架去除溶劑。用2×1mL水和5×1mL CH3OH洗滌珠。將三丁基膦(100μL)加入到于1mL CH3OH的懸浮液中的珠。室溫中將管放置在振蕩器上。9天之后，在磁體的幫助下除去上清液。珠用4×1mL水、4×1mL CH3OH和1mL水洗滌。然后，將1mL水加入到珠，制備100mg/mL貯存液。
實施例23.具有含有非共價結(jié)合到顆粒的三丁基基團的可裂解連接體的磁性聚合物顆粒的合成。
從磁性羧化的聚苯乙烯顆粒的貯存液(100mg/mL)中，取500μL放置在架上的1.5mL管中，并除去上清液。珠用3×500μL水和4×500μL MeOH洗滌。將10mg上面所示化合物溶解在100μL CH3OH中，加入到珠，并使溶劑在空氣中蒸發(fā)。
實施例24.用聚甲基丙烯酸酯連接體官能化的、并含有三(羧乙基)基團和可裂解芳基硫酯鍵的磁性二氧化硅顆粒的合成。
除了最后步驟外，如實施例2中所述，對磁性羧酸-官能化的二氧化硅顆粒(Chemicell，SiMAG-TCL，1.0meq/g，1.5g)進行官能化。通過超聲波處理3分鐘，將該材料(116.5mg)懸浮在10mL CH2Cl2中。加入三(2-羧乙基)膦(66.8mg)和32μL三乙胺，振蕩漿液7天。將顆粒轉(zhuǎn)移至瓶中，用20mL CH2Cl2洗滌三次，然后用20mL MeOH洗滌4次，以及用20mL CH2Cl2洗滌2次。然后風干該固體，產(chǎn)生109mg材料。
實施列25.官能化的磁性聚甲基丙烯酸酯顆粒的合成。
磁法收集來自40mL Sera-Mag Magnetic Carboxylate-Modified微顆粒懸浮液(Seradyn)的磁性顆粒，并傾析上清液。顆粒用4×50mL I型水磁法洗滌，然后用4×50mL的乙腈磁法洗滌。最終洗滌之后，干燥顆粒，產(chǎn)生1.93克棕色固體。
100mL的圓底瓶裝載1.02g該顆粒、0.2899克(1.5mmol)EDC、0.5058克實施例1的連接體(1.8mmol)和50ml CH2Cl2?；旌衔锍暡ㄌ幚?0分鐘，并放置在軌道式振蕩器上，攪拌(170rpm)11天，伴隨周期性的超聲波處理5分鐘，以確保均勻。磁法收集產(chǎn)物，固體用4×50mL CH2Cl2、50mL 1∶1 CH2Cl2/MeOH、4×50mL MeOH、50mL 1∶1 CH2Cl2/MeOH和4×50mL CH2Cl2磁法洗滌。干燥固體，產(chǎn)生0.951g棕色固體。
50mL的圓底瓶裝載0.8993g上述材料和20mL CH2Cl2?；旌衔锍暡ㄌ幚?分鐘，加入0.24g(1.2mmol)三丁基膦。加入之后，超聲波處理該混合物另外的15分鐘，在軌道式振蕩器上攪拌7天，伴隨周期性的超聲波處理。然后磁法收集產(chǎn)物，用4×50mL CH2Cl2、50mL 1∶1 CH2Cl2/MeOH、4×50mL MeOH、50mL 1∶1CH2Cl2/MeOH和4×50mL CH2Cl2洗滌。干燥固體，產(chǎn)生0.8801克棕色固體。
實施例26.通過在預形成的聚合物中包含氧化鐵，合成磁性官能化的聚合物
在加入20mL CH2Cl2之前，將1.00g實施例9的聚合物產(chǎn)物和0.2g氧化鐵的混合物混合均勻。對混合物超聲波處理15分鐘，用己烷稀釋至100mL并過濾。收集的固體用200mL丙酮和400mL水洗滌，直到不再出現(xiàn)顏色，然后用200mL丙酮洗滌。用4×40mL丙酮磁法洗滌固體。過濾收集固體，用丙酮洗滌并干燥。有0.7g的固體，當在顯微鏡下檢查時，僅僅顯示極小數(shù)量的游離磁鐵礦。
實施例27.官能化的可控孔度玻璃的制備
將0.5g天然可控孔度玻璃(Prime Synthesis，Aston，PA 18-50目，500孔徑大小)與實施例3的三乙氧基硅烷連接體(0.25g，0.43mmol)和50mL無水甲苯合并。在Ar覆蓋下，混合物回流18h。冷卻至室溫后，通過抽氣過濾分離玻璃顆粒，并用0.2L甲苯和0.2L CH2Cl2洗滌。過夜風干之后，獲得0.52g玻璃顆粒。
將0.450g份的上述玻璃顆粒與10mL CH2Cl2和PBu3(0.91g，4.5mmol)混合。在室溫下，將混合物放置在旋轉(zhuǎn)軌道式振蕩器上，并振蕩3天。通過抽氣過濾分離玻璃顆粒，用0.2L CH2Cl2、0.2L MeOH和0.3L CH2Cl2依次洗滌。過夜風干之后，獲得0.454g玻璃顆粒。
遵照進行類似的步驟，獲得具有120-200目的尺寸和500或1000孔徑大小的CPG。
實施例28.官能化的燒結(jié)玻璃的制備
四個小的燒結(jié)玻璃過濾器(約35mg ea，R & H Filter Co.)依次用20％含水NaOH、1N HCl、水和MeOH預處理。干燥之后，將玻璃料與實施例3的三乙氧基硅烷(0.32g.0.55mmol)、10mL甲苯和10μL H2O混合。在Ar覆蓋下，混合物回流16小時。冷卻至室溫之后，移出玻璃料，并依次用CH2Cl2、MeOH和CH2Cl2洗滌。
將上述玻璃過濾物與10mL CH2Cl2和PBu3(0.20g，0.99mmol)混合。在室溫中，將混合物放置在旋轉(zhuǎn)軌道式振蕩器上，振蕩7天。移出過濾物，用CH2Cl2、MeOH和CH2Cl2依次洗滌。
實施例29.吖啶酰胺(acridinium amide)官能化的硅膠的制備
3-氨丙基硅膠或者從商業(yè)上獲得(Silicycle，Quebec，Canada)，或者通過在甲苯中用過量的3-氨丙基三乙氧基硅烷過夜回流“硅膠60(silica gel 60)”而制備。在Ar覆蓋下，將3-氨丙基衍生化的硅膠(1.00g，裝載約1mmol/g)懸浮在CH2Cl2(15mL)中。通過注射器加入N，N-二異丙基乙胺(1.5mL，8.61mmol)，然后加入吖啶9-?；?360mg，1.49mmol)。將混合物放置在旋轉(zhuǎn)軌道式振蕩器上，室溫中振蕩2小時。在燒結(jié)玻璃漏斗上抽氣過濾深棕色反應產(chǎn)物，并依次用CH2Cl2(0.2L)、20％(v/v)MeOH∶CH2Cl2(0.2L)和CH2Cl2(0.25L)洗滌。風干后，獲得1.16g粉末狀固體。將上面制備的材料(1.00g)懸浮在CH2Cl2(15mL)中，并旋轉(zhuǎn)以分散固體。
將如上制備的材料(1.00g)懸浮在CH2Cl2(15mL)中，并回蕩(swirl)以分散固體。加入三氟甲基磺酸甲酯(0.17mL，1.5mmol)，用橡膠隔膜密封反應。將混合物放置在旋轉(zhuǎn)軌道式振蕩器上，并在室溫下振蕩16小時。在燒結(jié)玻璃漏斗上抽氣過濾所得的混合物，并用CH2Cl2(0.2L)、MeOH(0.2L)和CH2Cl2(0.25L)依次洗滌。風干之后，獲得1.02g粉末狀固體。
實施例30.官能化的硅膠的制備
室溫中，2.00g 2-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)琥珀酸酐((triethyoxysilylpropyl)succinic anhydride)和1.82g 4′-氨苯基4-氯甲基苯硫代羧酸酯在30mL CH2Cl2中的溶液過夜攪拌。蒸發(fā)溶劑，得到3.8g的蠟狀固體。將該固體與在170mL甲苯中的1.0g二氧化硅混合，伴隨著攪拌，在70℃加熱16小時。冷卻之后，過濾黃色固體，用丙酮(5×50mL)、CH2Cl2(5×50mL)、MeOH(5×50mL)和CH2Cl2(2×50mL)依次洗滌。風干之后，獲得3.02g黃色固體。
將2.00g上述物質(zhì)在100mL CH2Cl2中的懸浮液超聲波處理5分鐘，放置在氬的掩蔽下，用1.40mL三丁基膦處理。該混合物攪拌7天，過濾，并依次用CH2Cl2(4×50mL)、MeOH(4×50mL)和CH2Cl2(4×50mL)洗滌。風干之后，獲得2.04g黃色的固體。
實施例31.從人全血捕獲DNA
在管中，將10mg份的顆粒與70μL的人全血混合。旋轉(zhuǎn)該管15秒，在室溫中放置5分鐘，并再次旋轉(zhuǎn)15秒。用300μL pH 8.0的10mM tris緩沖液稀釋混合物，并且當利用磁響應性顆粒時，在磁體的幫助下，從顆粒去除液體。用DynalMPC-5磁性架進行磁分離。
實施例32.從人全血分離DNA
根據(jù)前面實施例的程序、捕獲在固相結(jié)合材料上的核酸用500μL pH 8.0的10mM tris緩沖液洗滌三次，每次丟棄上清液。通過在37℃，用100μL的0.1MNaOH洗脫5分鐘，從顆粒移去核酸。NaOH的其他濃度也有效。
實施例33.快速分離方案
在管中，將1mg份的顆粒與100μL的人全血混合。旋轉(zhuǎn)該管30秒。用300μL pH 8.0的10mM tris緩沖液稀釋混合物，并且當利用磁響應性顆粒時，在磁體的幫助下從顆粒去除液體。根據(jù)前面的實施例的程序捕獲在固相結(jié)合材料上的核酸用500μL pH 8.0的10mM tris緩沖液洗滌三次，每次丟棄上清液。通過在室溫中用50μL 0.05M NaOH洗脫30秒，從顆粒移去核酸。
實施例34.熒光試驗方案
使用PicoGreenTM染色DNA，通過熒光試驗分析上清液和洗脫液的DNA含量。簡而言之，將含有或疑似含有DNA的10μL等分試樣的溶液與190μL熒光DNA“染色”溶液溫育。熒光染料是PicoGreen(Molecular Probes)，用0.1M tris，pH7.5、1mM EDTA以1∶400稀釋。在溫育樣品至少5分鐘之后，在微量板熒光計(microplate fluorometer)(Fluoroskan，Labsystems)中測量熒光。濾波器組為480nm和535nm。同時進行含有已知數(shù)量的同樣的DNA的陽性對照、以及陰性對照。對于在100μL 0.1M NaOH中洗脫核酸的實驗，使用10μL等分試樣。對于在50μL 0.05M NaOH中洗脫核酸的實驗，使用5μL等分試樣。
實施例35.凝膠電泳方案
或者0.75％或者1.5％的瓊脂糖凝膠被制備，用于分析核酸洗脫物。通過煮沸2分鐘，將合適數(shù)量的瓊脂糖溶解在10mL TAE緩沖液中。一旦冷卻至50-60℃，加入1mg/mL溴化乙錠溶液(20μL)，并傾倒凝膠。將每一樣品(約12μL)與2μL 6×加樣緩沖液混合，所述加樣緩沖液含有0.25％溴酚藍、0.25％二甲苯腈藍和30％丙三醇。在70V跑膠。
實施例36.基因組DNA的PCR擴增
使用一對24個堿基的引物PCR擴增DNA，產(chǎn)生200bp的擴增子；所述DNA通過用實施例2、4-11和13-30中的每一實施例的固相結(jié)合材料(1或2μL)將本發(fā)明方法施用于全血而洗脫在0.05M或0.1M NaOH中。PCR反應混合物含有下表列出的組分。
陰性對照用1μL水替換反應混合物中的模板。一個另外的反應使用1μL的、以1∶10稀釋于水中的模板。反應混合物經(jīng)受30個循環(huán)94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，30秒。在1.5％瓊脂糖凝膠上分析的反應產(chǎn)物，顯示了期望的擴增子。
在獨立的實驗中，使用實施例2的顆粒分離的DNA被用于若干不同的染色體的區(qū)域擴增反應，如下面所列的。結(jié)果證明，由該分離程序獲得的DNA是整個基因組的代表。
實施例37.用不同量的顆粒從全血捕獲和分離核酸
將來自70μL人全血的DNA結(jié)合到不同量的實施例2的顆粒上，并根據(jù)實施例33的快速方案分離。也檢驗了在洗脫液中不同濃度的NaOH的影響。通過熒光對洗脫的DNA的數(shù)量進行定量，并與標準的DNA參考樣品比較。
實施例38.用不同量的顆粒從全血捕獲和分離核酸
根據(jù)實施例31和32的方案，將來自70μL人全血的DNA結(jié)合到不同量的各種顆粒上并分離。通過凝膠電泳分析洗脫液，如圖4所示。為了比較，顯示了大小范圍為500bp至40,000bp的大小標記物(size marker)梯。
另外的樣品示出于圖6中。
實施例39.用不同量的顆粒從不同體積的全血捕獲和分離核酸
根據(jù)實施例31和33的方案，將來自1mL人全血的DNA結(jié)合到5mg的實施例2的顆粒上并分離。通過熒光對重復樣品(replicate sample)的洗脫液(100μL)的分析表明，產(chǎn)量為17-24μg DNA。用10mg同樣類型的顆粒從70μL血分離DNA，用100μL 0.1M NaOH洗脫30秒鐘或1分鐘得到的洗脫液，對之進行類似的分析，分別產(chǎn)生6.5μg和7.3μg。通過方案31、32，使用實施例5的顆粒從70μL血產(chǎn)生2.8μg DNA。
實施例40.用不同的固相材料從全血捕獲和分離核酸
根據(jù)實施例33的快速方案，采用本發(fā)明的方法，來自100μL人全血的DNA結(jié)合至1mg不同的固相材料，并用50μL 50mM NaOH溶液洗脫。通過熒光對洗脫的DNA的量進行定量，并與標準DNA參考樣品比較。
除了在離心而不是在磁分離之后從固體除去液體之外，也如上面所述，測試實施例27的非磁性可控孔度玻璃顆粒(10mg)和重量為10mg的實施例28的燒結(jié)玻璃料。
27-A18-50目，500孔徑大小 27-B100-200目，1000孔徑大小 27-C100-200目，500孔徑大小
權(quán)利要求
1.從生物或細胞材料的樣品捕獲核酸的方法，由以下組成
a)提供固相結(jié)合材料；和
b)將所述固相結(jié)合材料與含有核酸的生物或細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結(jié)合至所述固相結(jié)合材料。
2.從生物或細胞材料的樣品分離核酸的方法，由以下組成
a)提供固相結(jié)合材料；
b)將所述固相結(jié)合材料與含有核酸的生物或細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結(jié)合至所述固相結(jié)合材料；
c)從所述固相結(jié)合材料分離所述樣品；
d)任選地，洗滌所述固相結(jié)合材料；和
e)從所述固相結(jié)合材料釋放結(jié)合的核酸。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物或細胞材料選自胞外核酸，動物、植物或細菌來源的完整細胞，和含有動物、植物或細菌來源的完整細胞的組織。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其在5分鐘內(nèi)進行。
5.從生物體的全血捕獲核酸的方法，由以下組成
a)提供固相結(jié)合材料；和
b)將所述固相結(jié)合材料與全血的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結(jié)合至所述固相結(jié)合材料。
6.權(quán)利要求5所述的方法，還包括下述步驟
c)從所述固相結(jié)合材料分離所述樣品；
d)任選地，洗滌所述固相結(jié)合材料；和
e)從所述固相結(jié)合材料釋放結(jié)合的核酸。
7.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述核酸包含在所述全血的白細胞內(nèi)。
8.權(quán)利要求6所述的方法，其在5分鐘內(nèi)進行。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸選自DNA和RNA。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸是生物體的基因組DNA。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相材料選自二氧化硅、玻璃、燒結(jié)玻璃、可控孔度玻璃、燒結(jié)玻璃、氧化鋁、氧化鋯、氧化鈦、不溶的合成聚合物、不溶的多糖和選自金屬、金屬氧化物和金屬硫化物的金屬材料。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相還包括磁響應部分。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相包括共價連接的核酸結(jié)合部分。
14權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相包括非共價連接的核酸結(jié)合部分。
15.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相包括選自下述的基團羥基、硅烷醇、羧基、氨基、銨、三元锍基、季銨基和季基。
16.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述共價連接的核酸結(jié)合部分包括季基。
17.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述共價連接的核酸結(jié)合部分包括羧基基團。
18.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述核酸結(jié)合部分通過可以被選擇性地裂解的鍵連接到所述材料。
19.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述結(jié)合的核酸在強堿性溶液中從所述固相釋放。
20.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述結(jié)合的核酸在溶液中從所述固相釋放，所述溶液可直接用于下游分子生物學過程。
21.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述結(jié)合的核酸在溶液中從所述固相釋放，所述溶液可直接用于下游分子生物學過程。
22.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述下游分子生物學過程是核酸擴增反應。
23.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述下游分子生物學過程是核酸擴增反應。
24.從生物或細胞材料的樣品捕獲核酸的方法，由下述組成
a)提供固相，包括連接有核酸結(jié)合部分的基質(zhì)；
b)將所述固相與含有核酸的生物或細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結(jié)合至所述固相。
25.從生物或細胞材料的樣品分離核酸的方法，由以下組成
a)提供固相，包括連接有核酸結(jié)合部分的基質(zhì)；
b)將所述固相與含有核酸的生物或細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結(jié)合至所述固相；
c)從所述固相分離所述樣品；
d)任選地，洗滌所述固相結(jié)合材料；和
e)從所述固相釋放結(jié)合的核酸。
26.從生物或細胞材料的樣品捕獲核酸的方法，由以下組成
a)提供固相，包括通過可選擇性裂解的鍵連接有核酸結(jié)合部分的基質(zhì)；
b)將所述固相與含有核酸的生物或細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結(jié)合至所述固相。
27.從生物或細胞材料的樣品分離核酸的方法，由以下組成
a)提供固相，包括通過可選擇性裂解的鍵連接有核酸結(jié)合部分的基質(zhì)；
b)將所述固相與含有核酸的生物或細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結(jié)合至所述固相；
c)從所述固相分離所述樣品；
d)任選地，洗滌所述固相結(jié)合材料；和
e)通過選擇性裂解該連接體，從所述固相釋放結(jié)合的核酸。
28.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述固相包括選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖的基質(zhì)，和結(jié)合至所述基質(zhì)表面上的基，所述基選自其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式QR2+X-的三元锍基，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式NR3+X-的季銨基，以及其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季基PR3+X-，并且其中X是陰離子。
29.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述固相包括選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖的基質(zhì)，和結(jié)合至所述基質(zhì)表面上的基，所述基選自其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式QR2+X-的三元锍基，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式NR3+X-的季銨基，以及其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季基PR3+X-，并且其中X是陰離子。
30.從生物或細胞材料的樣品捕獲核酸的方法，由以下組成
a)提供顆粒結(jié)合材料；和
b)將所述顆粒結(jié)合材料與含有核酸的生物或細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結(jié)合至所述顆粒結(jié)合材料。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述核酸在3分鐘內(nèi)被捕獲。
32.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述核酸在30秒內(nèi)被捕獲。
33.從生物或細胞材料的樣品分離核酸的方法，由以下組成
a)提供顆粒結(jié)合材料；
b)將所述顆粒結(jié)合材料與含有核酸的生物或細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結(jié)合至所述顆粒結(jié)合材料
c)從所述顆粒結(jié)合材料分離所述樣品；
d)任選地，洗滌所述顆粒結(jié)合材料；和
e)從所述顆粒結(jié)合材料釋放結(jié)合的核酸。
34.權(quán)利要求33所述的方法，在5分鐘內(nèi)進行。
35.從生物或細胞材料的樣品捕獲核酸的方法，包括
a)提供顆粒結(jié)合材料；和
b)將所述顆粒結(jié)合材料與含有核酸的生物或細胞材料的樣品混合不超過3分鐘的一段時間，以將所述核酸結(jié)合至所述顆粒結(jié)合材料。
36.從生物或細胞材料的樣品分離核酸的方法，包括
a)提供顆粒結(jié)合材料；
b)將所述顆粒結(jié)合材料與含有核酸的生物或細胞材料的樣品混合一段時間，所述時間足以將所述核酸結(jié)合至所述顆粒結(jié)合材料；
c)從所述顆粒結(jié)合材料分離所述樣品；
d)任選地，洗滌所述顆粒結(jié)合材料；和
e)從所述顆粒結(jié)合材料釋放結(jié)合的核酸，其中所述方法在5分鐘內(nèi)進行。
37.試劑盒，包括
a)用于從生物或細胞材料直接捕獲核酸的固相結(jié)合材料，其在不使用裂解液或包被裂解劑的情況下，具有從生物或細胞材料直接捕獲核酸的能力；和
b)用于從所述固相釋放核酸的試劑。
38.權(quán)利要求37所述的試劑盒，其中所述固相結(jié)合材料是顆粒材料。
39.權(quán)利要求38所述的試劑盒，其中所述顆粒材料是磁響應性的。
40.權(quán)利要求37所述的試劑盒，其中所述固相材料選自二氧化硅、玻璃、燒結(jié)玻璃、可控孔度玻璃、燒結(jié)玻璃、氧化鋁、氧化鋯、氧化鈦、不溶的合成聚合物、不溶的多糖和選自金屬、金屬氧化物和金屬硫化物的金屬材料。
41.權(quán)利要求37所述的試劑盒，其中所述固相包括共價連接的核酸結(jié)合部分。
42.權(quán)利要求41所述的試劑盒，其中所述核酸結(jié)合部分通過可以被選擇性地裂解的鍵連接到所述材料。
43.權(quán)利要求41所述的試劑盒，其中所述用于從所述固相釋放核酸的試劑是強堿性溶液。
44.權(quán)利要求37所述的試劑盒，其中所述固相包括選自下述基團羥基、硅烷醇、羧基、氨基、銨、三元锍基、季銨基和季基。
45.權(quán)利要求41所述的試劑盒，其中所述共價連接的核酸結(jié)合部分包括季基。
46.權(quán)利要求42所述的試劑盒，其中所述共價連接的核酸結(jié)合部分包括季基，并且所述用于從所述固相釋放核酸的試劑是強堿性溶液。
全文摘要
公開了從生物或細胞材料的樣品分離核酸的方法，該方法使用固相結(jié)合材料并避免使用任何裂解溶液或包被層。固相結(jié)合材料的使用出人意料地允許細胞的核酸內(nèi)含物被釋放并直接被捕獲，而且是在一個步驟中。相對于現(xiàn)有方法，該新方法表現(xiàn)出明顯的簡化。核酸可以以適于下游工藝的形式在5分鐘以內(nèi)被捕獲并釋放。用于本發(fā)明的方法和組合物的優(yōu)選的固相材料包括季核酸結(jié)合部分。
文檔編號C07H21/04GK101076603SQ200580036629
公開日2007年11月21日 申請日期2005年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月16日
發(fā)明者H·阿哈萬-塔夫第 申請人:魯米根公司