專利名稱：多價腦膜炎球菌源性多糖－蛋白質(zhì)綴合物及疫苗的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明總的來說涉及醫(yī)學領(lǐng)域，更具體地說涉及微生物學、免疫學、疫苗以及通過免疫預防細菌病原體感染。
2.相關(guān)領(lǐng)域概述 腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是全球細菌性腦膜炎和膿毒癥的主要病因。在最近的30年中，地方性腦膜炎球菌性疾病的發(fā)病率在發(fā)達國家為每100,000人中有1到5人，而在發(fā)展中國家為每100,000人中有10到25人(Reido，F(xiàn).X.等，(1995)Ped.Infect.Dis.J.14，643-657頁)。流行期間腦膜炎球菌性疾病的發(fā)病率接近每1000,000人中有1,000人。在美國，每年大約有2,600例細菌性腦膜炎病例，而在發(fā)展中國家平均有330,000例。病死率在10到20％之間。
病原性腦膜炎球菌被附著在其生物體外膜表面的多糖莢膜所包被。基于莢膜多糖的免疫學特異性，已鑒別出13個不同的腦膜炎球菌血清群(Frasch，C.E.等，(1985)Rev.Infect.Dis.7，504-510頁)。在這13個血清群中，有5個引起了大多數(shù)的腦膜炎球菌性疾?。凰鼈儼ㄑ迦篈、B、C、W-135和Y。血清群A引起大部分流行性疾病。血清群B、C和Y引起大多數(shù)的地方病和局部爆發(fā)。
人類鼻-口咽粘膜是唯一已知的腦膜炎奈瑟氏球菌的天然貯庫。定居在粘膜細胞的外表面以及鼻咽的上皮下組織均有發(fā)生。腦膜炎球菌的攜帶可持續(xù)數(shù)月。腦膜炎球菌通過直接接觸或通過空氣飛沫傳播。腦膜炎球菌借助于由胞吞作用產(chǎn)生的吞噬泡穿過粘膜上皮而變成侵入性的。宿主對入侵的腦膜炎球菌的防御依賴于補體介導的溶菌作用。負責補體介導溶菌作用的血清抗體大部分針對外部莢膜多糖。
已經(jīng)描述了基于腦膜炎球菌多糖的疫苗，其激發(fā)針對莢膜多糖的免疫應答。這些抗體能引起對血清群特異性腦膜炎球菌的補體介導溶菌作用。業(yè)已表明腦膜炎球菌多糖疫苗對兒童和成人有效(Peltola，H.等，(1997)New Engl.J.Med 297，686-691頁和Artenstein，M.S.等，(1970)New Engl.J.Med.282，417-420頁)，但在嬰兒和幼兒中的效力有限(Reingold，A.L.等，(1985)Lancet 2，114-118頁)。對年幼群體，此多糖的后繼給藥激發(fā)弱加強應答或無加強應答(Goldschneider，I.等，(1973)J.Infect.Diseases 128，769-776頁和Go1d，R.等，(1977)J.Infect.Diseases.136，S31-S35)。腦膜炎球菌多糖疫苗激發(fā)的保護期不能持續(xù)很久，并且已推測出在成人和4歲以上兒童中為3-5年(Brandt，B.L.和Artenstein，M.S.(1975)J.Infect.Diseases.131，S69-S72頁；Kyhty，H.等，(1980)J.Infect.Diseases.142，861-868頁，和Cessey，S.J.等，(1993)J.Infect.Diseases.167，1212-1216頁)。對1-4歲的兒童而言保護期少于3年(Reingold，A.L.等，(1985)Lancet 2，114-118頁)。
多糖不能與主要組織相容性復合物分子結(jié)合，而這是抗原呈遞至T輔助淋巴細胞并刺激T輔助淋巴細胞的前提條件，即它們是非T細胞依賴性抗原。多糖能夠在不借助于T輔助淋巴細胞的情況下刺激B淋巴細胞產(chǎn)生抗體。由于對B淋巴細胞的非T細胞依賴性刺激，在這些抗原免疫后缺乏記憶誘導。多糖抗原能夠在成人中激發(fā)非常有效的非T細胞依賴性應答，但這些非T細胞依賴性應答在嬰兒和幼兒的不成熟免疫系統(tǒng)中卻很弱。
非T細胞依賴性多糖抗原可通過將多糖共價連接至蛋白質(zhì)分子(“載體”或“載體蛋白質(zhì)”)而轉(zhuǎn)變?yōu)門細胞依賴性抗原。與綴合疫苗的多糖組分結(jié)合的B細胞可被對作為綴合載體蛋白質(zhì)一部分的肽特異性的T輔助細胞所活化。對載體蛋白質(zhì)的T輔助細胞應答用來增加針對多糖的抗體產(chǎn)生。
業(yè)已表明，血清群B多糖在人群中具有弱免疫原性至無免疫原性(Wyle，F(xiàn).A.等，(1972)J.Infect.Diseases.126，514-522頁)。此血清群多糖與蛋白質(zhì)的化學連接未顯著改變實驗動物中的免疫應答(Jennings，H.J.和Lugowski，C.(1981)J.Immunol.127，1011-1018頁)。據(jù)認為對此血清群多糖缺乏免疫應答的原因產(chǎn)生于血清群B多糖與多唾液酸化的宿主糖蛋白如神經(jīng)細胞粘附分子之間的結(jié)構(gòu)相似性。
一種基于血清群C多糖的腦膜炎球菌綴合疫苗已有敘述。這種單價疫苗激發(fā)針對相應于血清群C的腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)菌株上存在的莢膜多糖的強功能性抗體應答。這種疫苗僅僅能夠預防由血清群C細菌引起的疾病。
現(xiàn)有的基于腦膜炎球菌多糖的疫苗對幼兒的用途有限，而且不能為成人提供持久保護。已被證實能夠在所有有腦膜炎球菌感染風險的群體(包括兒童)中產(chǎn)生持久保護的唯一的腦膜炎球菌疫苗以腦膜炎奈瑟氏球菌單一血清群的多糖為基礎，不能提供抗其它血清群感染的保護作用。因此，就需要一種能夠在有腦膜炎球菌感染風險的兒童和成人中提供抗腦膜炎球菌性疾病的廣譜、長效保護作用的腦膜炎球菌綴合疫苗。本發(fā)明的多價腦膜炎球菌多糖通過提供疫苗制劑解決了這一需要，在所述制劑中來源于腦膜炎奈瑟氏球菌主要致病血清群的免疫原性多糖已通過與載體蛋白質(zhì)綴合而轉(zhuǎn)變成T細胞依賴性抗原。
FDA頒發(fā)許可證的腦膜炎球菌多糖疫苗一直基于采用幼兔補體的殺菌活性試驗(SBA-BR)，該試驗使用用所許可疫苗免疫的人員的血樣實施。許多政府和專家小組公布了以此類試驗評價腦膜炎球菌多糖疫苗的現(xiàn)行要求和建議，例如 世界衛(wèi)生組織生物制品標準化專家委員會(WHO ExpertCommittee on Biological Standardization)，其證實在用抗腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A和C的腦膜炎球菌疫苗免疫的健康成年受試者中誘導殺菌抗體的產(chǎn)生(WHO 1976)； 國際比較研究中用于確立所述試驗標準化用參數(shù)的CDCSB-BR，使用相同標準參比血清-CDC供體R21654-3430107，該血清是比較研究中質(zhì)量控制血清樣品之一(Maslanka SE等，1997.Clin. Diagn.Lab.Immunol.4156-167)；以及 世界衛(wèi)生組織疫苗和生物制品部專家委員會(WHO ExpertCommittee of the Department of Vaccines and Biologicals)推薦的作為最佳方法的標準化CDC方法(WHO 1999)。
由于已經(jīng)證明人類對腦膜炎球菌性疾病的免疫性與利用血清殺菌活性試驗(SBA)檢測的補體介導的殺菌抗體水平密切相關(guān)，所以同意頒發(fā)許可證(Goldschneider，I等，1969，J.Eep.Med.1291307-1326和Goldschneider，I等，1969，J.Exp.Med.1291327-1348)。已使用人補體在試驗(SBA-H)中確定了抗血清群C的1∶4 SBA效價的替代水平。但是，腦膜炎球菌多糖疫苗的許可要求是基于使用幼兔補體作為該試驗的補體來源(SBA-BR)誘導血清殺菌反應(World HealthOrganization，1976，Requirements for meningococcal polysaccharidevaccine.World Health Organization technical report series，no.594.World Health Organization，Geneva，Switzerland(WHO，1976))。根據(jù)此推薦標準，當針對下列靶菌株或等同菌株對應血清群A的A1、對應血清群C的C11、對應血清群Y的S-1975、對應血清群W-135的S-4383進行測試時，至少90％接種腦膜炎球菌多糖疫苗的受試者的血清抗體效價應在免疫后2-4周表現(xiàn)出4倍以上的升高(WHO 1976，WHO 1981，Bureau of Biologics(生物制品管理署)，F(xiàn)ood and DrugAdministration July 17，1985)。生物制品管理署采納了WHO的推薦標準，并且基于此要求在美國頒發(fā)了血清群A和C組合以及血清群A、C、Y和W-135組合的腦膜炎球菌多糖疫苗的許可證。為有利于各實驗室之間對腦膜炎球菌疫苗誘導的殺菌活性的比較，經(jīng)過多實驗室研究建立了一種利用幼兔補體的標準化SBA(SBA-BR)(Maslanka SE等，1997.Clin.Diagn.Lab.Immunol.4156-167)。
由于C型腦膜炎球菌綴合疫苗的資料開始變得可以得到，所以有關(guān)在測定中使用兔補體可能導致假的高SBA效價的擔心開始出現(xiàn)。在1999年3月澄清和解決關(guān)于用于分析人血清中腦膜炎球菌血清群A和C特異性抗體之實驗室測定法的問題的會議之后，世界衛(wèi)生組織生物制品標準化專家委員會推薦使用采用幼兔補體的SBA來測量針對血清群C的抗體反應(World Health Organization，1999.Standardization and validation of serological assays for the evaluation ofimmune responses to Neisseria meningitides serogroup A/C vaccines.Geneva，WHO/V&B/99.19(WHO 1999))。為努力避免使用幼兔補體高估保護作用，WHO建議開展研究，以便將通過使用幼兔補體的SBA試驗所測定的閾值效價與使用人補體所測定的SBA效價關(guān)聯(lián)起來。召開后續(xù)會議，得出的結(jié)果支持這樣一個總的結(jié)論使用幼兔補體時＜1∶8的SBA效價與缺乏抗血清群C的保護作用相關(guān)聯(lián)，而使用幼兔補體時≥1∶128的SBA效價與使用人補體時的1∶4保護性SBA效價良好關(guān)聯(lián)。未提供有關(guān)其它腦膜炎球菌血清群(如A、Y或W-135)或多糖綴合物的相應關(guān)聯(lián)SBA-BR效價的信息。
使用幼兔補體時1∶8至1∶64之間的SBA效價不一定與使用人補體時1∶4的保護性SBA效價良好關(guān)聯(lián)(Jodar L等，Biologicals2002；30323-329)。WHO專家委員會推薦，1∶8、1∶16、1∶32和1∶64的接種后SBA-BR效價要使用人補體再評價。解決1∶8、1∶16、1∶32和1∶64的SBA-BR效價不確定性的其它措施包括接種前和接種后之間抗體SBA效價升高至4倍的評價。還證明有與保護相關(guān)的記憶，但專家委員會公認可得到的有關(guān)這些替代方法的資料不不充分或者有限。
高于1∶8的SBA-BR效價是人對腦膜炎球菌性疾病免疫性的較好指標，該效價是從免疫前至免疫后約15至約45天的免疫后階段內(nèi)SBA-BR效價的4倍以上升高。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供用多價腦膜炎球菌多糖綴合組合物免疫人類患者的方法，其中人類患者血清SBA-BR效價為1∶16或更高，優(yōu)選為1∶32或更高，更優(yōu)選為1∶64或更高，再更加優(yōu)選為1∶128或更高。在再進一步的實施方案中，本發(fā)明提供用腦膜炎球菌多糖綴合組合物免疫人類患者的方法，其中接種前后人類患者抗體SBA效價有4倍以上的升高。
在再一個實施方案中，本發(fā)明提供通過用多價腦膜炎球菌多糖綴合組合物免疫人類患者來為人類患者提供抗多種血清群腦膜炎奈瑟氏球菌的免疫性的方法，其中所述組合物包含兩種以上多糖，這些多糖選自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A和W-135；Y和W-135；C和Y；C和W-135；A、C和Y；A、C和W-135；C、Y和W-135；A、Y和W-135以及A、C、Y和W-135。
在再進一步的實施方案中，本發(fā)明提供通過用多價腦膜炎球菌(純化的)多糖綴合組合物免疫人類患者來為人類患者提供抗多種血清群腦膜炎奈瑟氏球菌的免疫性的方法，其中所述多糖經(jīng)衍化小于100,000道爾頓。在本發(fā)明的一個實施方案中，純化的多糖被解聚成約5,000至約75,000道爾頓的多糖平均分子量；優(yōu)選為約7,000至約50,000道爾頓的多糖平均分子量；更加優(yōu)選為約8,000至約35,000道爾頓的多糖平均分子量；甚至更加優(yōu)選為約12,000至約25,000道爾頓的多糖平均分子量。在本發(fā)明的一個實施方案中，組合物中的多糖平均分子量在約15,000至約22,000道爾頓之間。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供一種方法，所述方法通過給予腦膜炎球菌多糖-蛋白質(zhì)綴合物的免疫組合物提供針對致病性腦膜炎奈瑟氏球菌所致腦膜炎球菌性疾病的人類免疫性。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述免疫組合物包含兩種以上的蛋白質(zhì)-多糖綴合物，其中每種綴合物均包含綴合至載體蛋白質(zhì)的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖。在一個優(yōu)選實施方案中，所述免疫組合物包含兩種以上不同的蛋白質(zhì)-多糖綴合物，其中每種綴合物均包含綴合至載體蛋白質(zhì)的不同血清群腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖。
本發(fā)明提供一種方法，所述方法提供針對致病性腦膜炎奈瑟氏球菌所致腦膜炎球菌性疾病的人類免疫性，所述方法包括給予含兩種以上不同蛋白質(zhì)-多糖綴合物的免疫組合物，其中每種綴合物均包含綴合至載體蛋白質(zhì)的不同血清群腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖。
本發(fā)明提供一種方法，所述方法提供針對致病性腦膜炎奈瑟氏球菌所致腦膜炎球菌性疾病的人類免疫性，所述方法包括給予腦膜炎球菌多糖-蛋白質(zhì)綴合物。本發(fā)明提供多價腦膜炎球菌疫苗，其包含免疫有效量的2-4種不同蛋白質(zhì)-多糖綴合物，其中每一種綴合物均包含與載體蛋白質(zhì)綴合的不同莢膜多糖，并且其中每一種莢膜多糖均選自血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖。本發(fā)明還提供誘導抗腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖的免疫應答的方法，其包括給予人免疫有效量的本發(fā)明免疫組合物。在一個實施方案中，多價腦膜炎球菌疫苗包含免疫有效量的兩種不同蛋白質(zhì)-多糖綴合物，其中每一種綴合物均包含與載體蛋白質(zhì)綴合的不同莢膜多糖，并且其中每一種莢膜多糖均選自血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖，更優(yōu)選包含莢膜多糖A和W-135、A和Y、C和W-135、C和Y以及W-135和Y。在一個實施方案中，多價腦膜炎球菌疫苗包含免疫有效量的三種不同蛋白質(zhì)-多糖綴合物，其中每一種綴合物均包含與載體蛋白質(zhì)綴合的不同莢膜多糖，并且其中每一種莢膜多糖均選自血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖，更優(yōu)選包含莢膜多糖A、C和W-135；A、C和Y；C、Y和W-135；C、W-135和Y；以及A、W-135和Y。在另一個實施方案中，多價腦膜炎球菌疫苗包含免疫有效量的四種不同蛋白質(zhì)-多糖綴合物，其中每一種綴合物均包含與載體蛋白質(zhì)綴合的不同莢膜多糖，并且其中每一種莢膜多糖均選自血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖。
本發(fā)明還提供誘導抗腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖的免疫應答的方法，其包括給予人或動物免疫有效量的本發(fā)明免疫組合物。
本發(fā)明提供一種多價腦膜炎球菌疫苗，其包含免疫有效量的2-4種不同蛋白質(zhì)-多糖綴合物，其中每一種綴合物均包含與載體蛋白質(zhì)綴合的不同莢膜多糖，并且其中每一種莢膜多糖均選自血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖。
本發(fā)明提供了保護易感染腦膜炎奈瑟氏球菌的人或動物的方法，其包括給予人或動物免疫有效量的本發(fā)明疫苗。
在再一個實施方案中，本發(fā)明提供對第一劑、第二劑、第三劑等腦膜炎球菌疫苗或免疫原性組合物后激發(fā)的應答進行加強的方法。在這些實施方案的某一些實施方案中，第一劑(或更多劑)腦膜炎球菌疫苗或免疫原性組合物包含一個或多個血清群腦膜炎奈瑟氏球菌(血清群A、B、C、Y、W-135等)的莢膜多糖。在某些其它實施方案中，第一劑(或更多劑)腦膜炎球菌疫苗或免疫原性組合物包含一個或多個血清群的腦膜炎奈瑟氏球菌(血清群A、B、C、Y、W-135等)的莢膜多糖，其中莢膜多糖綴合至一種或多種載體(例如載體蛋白質(zhì))。在優(yōu)選實施方案中，所述載體蛋白質(zhì)為免疫原性的，和/或提供額外的治療利益或其它利益。在某些優(yōu)選實施方案中，在一劑或多劑腦膜炎球菌疫苗或免疫原性組合物之后在受試者(例如人)中激發(fā)的初次應答通過隨后的一劑或多劑含1、2、3、4或更多個不同血清群的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖的疫苗或免疫原性組合物來加強。但是，本發(fā)明不限于給予一次或多次初免劑量的、含非綴合莢膜多糖的疫苗或免疫原性組合物，本發(fā)明也無意限于給予一次或多次含綴合的莢膜多糖-載體蛋白質(zhì)免疫原性組合物或疫苗的加強劑量。同樣，本發(fā)明無意受限于初免或加強免疫給藥的時間間隔。
本發(fā)明另外的實施方案提供聯(lián)合疫苗組合物，其包含1、2、3或4種不同蛋白-多糖綴合物和一種或多種得自疫苗組合物(例如已獲頒許可證的疫苗)的抗原或免疫原性組分。在其它實施方案中，本發(fā)明提供含1、2、3或4種不同蛋白-多糖綴合物和得自疫苗(例如已獲頒許可證的疫苗)組合物的一種或多種抗原或抗原性組分的免疫原性組合物。本發(fā)明設想(但不限于)組合1-4種不同的腦膜炎奈瑟氏球菌蛋白質(zhì)-多糖綴合物和用于預防或改善非腦膜炎奈瑟氏球菌所致疾病作用的疫苗的免疫原性組分(例如抗原)。例如，在某些實施方案中，本發(fā)明提供含1、2、3或4種不同蛋白-多糖綴合物和一種或多種得自已獲頒許可證的疫苗之組分的免疫原性組合物，所述已獲頒許可證的疫苗通常給予旅行者，包括但不限于抗傷寒的疫苗(例如TyphimVi_)、抗黃熱病的疫苗(例如YF-VAX_)、抗脊髓灰質(zhì)炎的疫苗等。在其它實施方案中，本發(fā)明提供1-4種不同腦膜炎奈瑟氏球菌蛋白-多糖綴合物和疫苗的免疫原性組合物的組合，所述疫苗用于預防或改善肝炎(例如甲、乙、丙、丁或戊型肝炎)、天花和牛痘、AIDS、結(jié)核、白喉、流感嗜血桿菌、麻疹、流行性腮腺炎、百日咳、肺炎球菌疾病、脊髓灰質(zhì)炎、風疹、破傷風、水痘、腺病毒疾病、炭疽、霍亂、腦炎(例如日本腦炎、蜱傳腦炎等)、鼠疫、狂犬病、傷寒、皰疹、瘧疾、寄生蟲病、痘病毒疾病、呼吸道合胞體病毒疾病、輪狀病毒、甲病毒感染(例如委內(nèi)瑞拉、西方或東方馬腦炎、屈曲病毒(Chikungunyavirus)疾病、羅斯河病毒(Ross River virus)疾病等)、布尼亞病毒疾病(例如裂谷熱、漢坦病毒)、沙粒病毒(例如胡寧病毒(Junin virus)病)、立克次氏體病(例如Q熱)、兔熱病、布魯氏菌病、假單胞菌病、肉毒中毒、西尼羅河病和葡萄球菌感染連同基于其它病毒、細菌和寄生蟲的疾病的作用。在優(yōu)選實施方案中，與本發(fā)明的不同腦膜炎奈瑟氏球菌蛋白質(zhì)-多糖綴合物聯(lián)合(例如共同給予)給予的非腦膜炎奈瑟氏球菌免疫原性組合物來自已獲頒許可證的疫苗。但是，本發(fā)明并不限于這些組合和使用這些組合的方法。實際上，本發(fā)明還提供1-4種不同腦膜炎奈瑟氏球菌蛋白質(zhì)-多糖綴合物和未獲許可(例如實驗性)的非腦膜炎奈瑟氏球菌疫苗或免疫原性組合物之免疫原性組分的組合。
可共同給予1-4種不同腦膜炎奈瑟氏球菌蛋白-多糖綴合物和非腦膜炎奈瑟氏球菌疫苗或免疫原性組合物之免疫原性組分的組合。在某些實施方案中，在兩個或多個部位使用相似或不相似的給予方法完成1-4種不同腦膜炎奈瑟氏球菌蛋白-多糖綴合物和非腦膜炎奈瑟氏球菌疫苗或免疫原性組合物之免疫原性組分的共同給予。在這些實施方案的另外一些實施方案中，通過將兩種或多種組合物物理組合成單一聚集組合物，然后使用一種或多種給藥途徑在一個或多個部位給予，完成1-4種不同腦膜炎奈瑟氏球菌蛋白-多糖綴合物和非腦膜炎奈瑟氏球菌疫苗或免疫原性組合物之免疫原性組分的共同給予。
可以在時間上以秒、分、小時、天等分隔的兩個不同時間實施1-4種不同腦膜炎奈瑟氏球菌蛋白-多糖綴合物和非腦膜炎奈瑟氏球菌疫苗或免疫原性組合物之免疫原性組分的組合的給予。本發(fā)明無意受限于給予事件的途徑和/或時間。
本文引用的所有專利、專利申請以及其它出版物都全文在此引入作為參考。
附圖描述

圖1-4顯示了本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案。
發(fā)明詳述 本發(fā)明包括具有兩種以上不同蛋白質(zhì)-多糖綴合物的免疫組合物，其中每一種綴合物均包含與載體蛋白質(zhì)綴合的莢膜多糖。因此，本發(fā)明包括含有兩種以上不同的衍化莢膜多糖的組合物，其中所述莢膜多糖與一種或多種載體蛋白質(zhì)綴合。
可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準技術(shù)制備莢膜多糖。在本發(fā)明中，優(yōu)選從腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y制備莢膜多糖。
在優(yōu)選實施方案中，這些腦膜炎球菌血清群綴合物通過單獨的方法制備，并配制成單劑量制劑。例如，從腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y中分別純化莢膜多糖。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，純化的多糖在綴合至載體蛋白質(zhì)前被解聚并活化。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，利用溫和氧化條件將腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖部分解聚。
天然的腦膜炎球菌多糖約為500,000-1,500,000道爾頓。本發(fā)明涉及較小分子量的腦膜炎球菌多糖。在純化天然多糖時，將有一定比例的多糖是較小分子量的。然而，為了獲得更好的收率，通常優(yōu)選將天然腦膜炎球菌多糖解聚或衍生至優(yōu)選的分子量范圍，優(yōu)選小于100,000道爾頓。在本發(fā)明的一個實施方案中，純化的多糖被解聚成約5,000至約75,000道爾頓的多糖平均分子量；優(yōu)選為大約7,000至大約50,000道爾頓的多糖平均分子量；更優(yōu)選為約8,000至約35,000道爾頓的多糖平均分子量；再更優(yōu)選為約12,000至約25,000道爾頓的多糖平均分子量。在本發(fā)明的一個實施方案中，組合物中的多糖平均分子量在約15,000至約22,000道爾頓之間。
多糖解聚或部分解聚之后可接著進行活化步驟。所謂“活化”是指對多糖進行化學處理以提供能夠與載體蛋白質(zhì)反應的化學基團。優(yōu)選的活化方法包括在15-30℃下于pH 5.0±0.1的生理鹽水中使用己二酸二酰肼處理約2小時。美國專利號5,965,714描述了一種用于活化的方法。
莢膜多糖一旦被活化，就可以將其綴合至一種或多種載體蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，每一種莢膜多糖均獨立地與一種載體蛋白物質(zhì)綴合。在優(yōu)選實施方案中，腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖各自獨立地綴合至相同載體蛋白質(zhì)物質(zhì)。
載體蛋白質(zhì)可以包括細菌毒素如白喉毒素、失活的細菌毒素如白喉類毒素、CRM197、破傷風類毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST以及來自銅綠假單胞菌(Pseudornonas aeruginosa)的外毒素A。還可以使用細菌外膜蛋白，例如外膜復合體c(OMPC)、孔蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)或肺炎球菌粘附素蛋白質(zhì)(PsaA)。其它蛋白質(zhì)如卵清蛋白、匙孔_血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(PPD)也可以用作載體蛋白質(zhì)。載體蛋白質(zhì)優(yōu)選無毒和無反應原性并且可以足夠量和足夠純度獲得的蛋白質(zhì)。載體蛋白質(zhì)應經(jīng)得住標準綴合過程。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，從白喉棒桿菌(Corynebacteriadiphtheriae)培養(yǎng)物純化并利用甲醛化學脫毒的白喉毒素被用作載體蛋白質(zhì)。一種備選的載體蛋白質(zhì)是D蛋白，它是流感嗜血桿菌(H.influenza)的外膜表面暴露蛋白。
在本發(fā)明的一個實施方案中，每一種衍生多糖與載體蛋白質(zhì)的平均比率為約1∶1至約1∶20(重量/重量)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，總衍生多糖與載體蛋白質(zhì)的平均比率為約1∶2至約1∶10(重量/重量)，每一種衍生多糖對載體蛋白質(zhì)的再更優(yōu)選的平均比率為約1∶2至約1∶6(重量/重量)。在本發(fā)明的更優(yōu)選的實施方案中，總衍生多糖與載體蛋白質(zhì)的平均比率為約1∶(4±1)，更優(yōu)選為1∶(4±0.5)，再更優(yōu)選為1∶(4±0.25)(重量/重量)。
在莢膜多糖與載體蛋白質(zhì)綴合后，多糖-蛋白質(zhì)綴合物可通過多種技術(shù)純化(就多糖-蛋白質(zhì)綴合物的量而言為富集)。純化步驟的一個目的是從多糖-蛋白質(zhì)綴合物中去除未結(jié)合的多糖。美國專利號6,146,902中描述了一種包括在硫酸銨存在下超濾的純化方法?；蛘?，可以通過任何數(shù)量的標準技術(shù)從未反應的蛋白質(zhì)和多糖中純化出綴合物，所述標準技術(shù)尤其包括大小排阻層析、密度梯度離心、疏水作用層析或硫酸銨分級分離等。參見例如P.W.Anderson等，(1986).J.Immunol.1371181-1186。還可見H.J.Jennings和C.Lugowski(1981)J.Immunol.1271011-1018。
在將多糖和載體蛋白質(zhì)綴合后，可通過組合多種衍化多糖-蛋白質(zhì)綴合物來制備本發(fā)明的免疫組合物。本發(fā)明的免疫組合物包含與一種或多種載體蛋白質(zhì)綴合的兩種以上不同的莢膜多糖。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是二價免疫組合物，其包含分別綴合至白喉毒素或類毒素的腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A和C的衍化莢膜多糖。更優(yōu)選本發(fā)明為四價免疫組合物，其包含分別綴合至白喉毒素或類毒素的腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖。
本發(fā)明部分地涉及多組分、衍化的多糖綴合物的組合物，在所述組合物中，每一種衍化多糖都以每劑約0.5至約15μg存在。因此，所述組合物可包含1-60μg的總衍化多糖。在優(yōu)選實施方案中，組合物中每一種衍化多糖的相對量大約相等，差值范圍在±50％內(nèi)，更優(yōu)選地在±30％內(nèi)；再更優(yōu)選地在±20％內(nèi)。
載體蛋白質(zhì)的制備和使用以及多種可能的綴合方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的。本發(fā)明綴合物可由這些技術(shù)人員使用本發(fā)明所包含的教導以及在普通文獻上可輕易得到的信息來制備。也可以從以下美國專利的任一個或全部中得到指導美國專利號4,356,170、4,619,828、5,153,312、5,422,427和5,445,817，這些專利的教導全文在此引用作為參考。
或者，可通過共同培養(yǎng)兩種以上腦膜炎奈瑟氏球菌血清群并共純化、解聚、活化和綴合多糖，或通過分別培養(yǎng)純化腦膜炎奈瑟氏球菌血清群并在解聚、活化和綴合多糖的任何步驟之前或之后將兩種以上純化多糖混合，制備免疫組合物。
可通過從不同的腦膜炎球菌血清群分別制備多糖-蛋白質(zhì)綴合物然后將綴合物混合而制備本發(fā)明免疫組合物。本發(fā)明的免疫組合物可用作疫苗。本發(fā)明疫苗的配制可利用本領(lǐng)域公知的方法完成。本發(fā)明的疫苗組合物還可包含一種或多種佐劑。作為實例但非限制性地，佐劑包括鋁佐劑(例如鋁鹽，諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁或其組合)、弗氏佐劑(完全佐劑或不完全佐劑)、BAY、DC-chol、pcpp、單磷酰脂質(zhì)A、CpG、QS-21、霍亂毒素和甲酰甲硫氨酰肽。參見例如Vaccine Design，the Subunit and Adjuvant Approach，1995(M.F.Powell和M.J.Newman編，Plenum Press，N.Y.)。佐劑優(yōu)選為鋁佐劑，如氫氧化鋁或磷酸鋁。
備選佐劑包括水包油乳劑制劑，例如PCT公開號WO 90/14837中所描述的MF59、SAF(含10％角鯊烷、0.4％Tween 80、5％pluronic嵌段共聚物L121和thr-MDP)、RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(RibiImmunochem，Hamilton，MT，含2％角鯊烯、0.2％Tween 80以及選自單磷酰脂質(zhì)A(MPL)、海藻糖二霉酚酸酯(TDM)和細胞壁骨架(CWS)的一種或多種細菌細胞壁成分，優(yōu)選MPL+CWS(DetoxTM))；皂苷佐劑，例如可以使用StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，Mass.)或者由其產(chǎn)生的顆粒如ISCOM(免疫刺激復合物)；細胞因子，例如白細胞介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(例如γ干擾素)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，蛋白質(zhì)-多糖綴合物的平均糖基化比率(多糖與蛋白質(zhì)的比率)為約0.05至約2；更優(yōu)選平均比率為約0.08至約1.25；再更優(yōu)選平均比率為約0.1至約0.9。在一個優(yōu)選實施方案中，蛋白質(zhì)-多糖綴合物的平均糖基化比率(多糖與蛋白質(zhì)的比率)為約0.2至約0.8；更優(yōu)選平均比率為約0.2至約0.6；再更優(yōu)選平均比率為約0.3至約0.5。
如下所示，本發(fā)明的疫苗和免疫組合物在各種動物模型中激發(fā)T細胞依賴性樣免疫應答，而多糖疫苗激發(fā)非T細胞依賴性樣免疫應答。因此，本發(fā)明組合物也是研究針對腦膜炎奈瑟氏球菌抗原的T細胞依賴性樣免疫應答中所涉及的生物學途徑和過程的有用研究工具。
可以按照藥學和獸醫(yī)學領(lǐng)域一般技術(shù)人員眾所周知的標準技術(shù)，考慮諸如所用具體抗原、佐劑(如果有的話)、特定動物或患者的年齡、性別、體重、物種和狀況以及給藥途徑之類的因素，確定待給予人或動物的本發(fā)明疫苗的量以及給藥方案。在本發(fā)明中，為提供有效接種劑量對抗腦膜炎奈瑟氏球菌，多糖-蛋白質(zhì)載體的量可為每公斤體重約0.02μg至約5μg。在本發(fā)明的優(yōu)選組合物和方法中，所述劑量為每公斤體重約0.1μg至3μg。例如，如果感染后時間過去的不長，由于細菌增殖的時間較短，則有效劑量就需要較少的抗體。同樣，有效劑量取決于診斷時的細菌載量。對于治療用途，可考慮在幾天的時間段內(nèi)給予多次注射。
本發(fā)明的多價綴合物可以單次劑量或以系列劑量(即有“一次加強”或“數(shù)次加強”)給予。例如，就像目前對預防兒童疾病的其它疫苗所推薦的那樣，兒童可以在生命早期接受單次劑量，接著接受加強劑量一直到10年后。
加強劑量可使敏化B細胞產(chǎn)生抗體，即回憶應答。也就是說，多價綴合物疫苗與獲頒許可證的多糖疫苗相比，在年幼群體中激發(fā)高初次(即在單次疫苗給予后)功能性抗體應答，并能夠激發(fā)回憶應答(即在加強給予后)，這表明由本發(fā)明的多價綴合疫苗所激發(fā)的保護性免疫應答是長效的。
本發(fā)明組合物可包括經(jīng)管口例如口、鼻、肛、陰道、經(jīng)口、胃內(nèi)、粘膜(例如經(jīng)舌、肺泡、齒齦、嗅覺或呼吸道粘膜)等給予用的液體制劑，諸如混懸劑、糖漿劑或酏劑；以及經(jīng)腸胃外、皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈給予(例如注射給予)用的制劑，諸如無菌混懸劑或乳劑。優(yōu)選靜脈內(nèi)和腸胃外給予。此類組合物可以與適當載體、稀釋劑或賦形劑諸如無菌水、生理鹽水、葡萄糖等混合。組合物也可以被凍干。組合物可含諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑、膠凝劑或粘度增強添加劑、防腐劑、調(diào)味劑、著色劑等輔料，這取決于所需的給藥途徑和劑型?？蓞⒖紭藴式炭茣纭癛EMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCE”，第17版，1985(在此并入作為參考)來制備適宜的制劑，而無需過度不當實驗。
在本發(fā)明的一個實施方案中，優(yōu)選的給藥途徑是肌內(nèi)或皮下，優(yōu)選肌內(nèi)途徑?？赏ㄟ^注射或備選的遞送裝置給予。本發(fā)明組合物可作為液體制劑方便地提供，所述液體制劑例如為可被緩沖至選定pH的等滲水溶液、混懸液、乳液或粘性組合物。如果優(yōu)選消化道吸收，則本發(fā)明組合物可以為藥丸、片劑、膠囊、膜片(caplet)等“固體”形式，包括緩釋或具有液體填充物(例如以明膠包裹的液體，由此明膠在胃中溶解，用于遞送至消化道)的“固體”制劑。如果期望鼻腔或呼吸道(粘膜)給予，則組合物可采用某種形式并通過壓力噴霧分配器、泵分配器或氣溶膠分配器分配。氣溶膠通常處于依靠碳氫化合物產(chǎn)生的壓力下。泵分配器優(yōu)選可分配定量劑量或具有特定粒徑的劑量。
液體制劑通常比凝膠、其它粘性組合物和固體組合物更易制備。另外，液體組合物對給予(尤其是通過注射或口服方式)動物、兒童(尤其是幼兒)和其它可能難以吞咽藥丸、片劑、膠囊等的個體或在多劑量給藥情況下稍微更便利。另一方面，可將粘性組合物配制在適當?shù)恼扯确秶鷥?nèi)，以提供更長的粘膜(諸如胃內(nèi)襯或鼻粘膜)接觸期。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，疫苗組合物配制成無菌液態(tài)、無熱原磷酸鹽緩沖的生理鹽水，有或沒有防腐劑。在一個優(yōu)選實施方案中，每劑配方含約0.3至約1.0mg磷酸鈉、約3.5至約6.0mg氯化鈉以及加至1.5mL的水。在一個優(yōu)選實施方案中，每劑配方含約0.6±0.2mg磷酸鈉、4.4±0.2mg氯化鈉以及加至約0.5±0.2mL的水。
顯然，對適當載體和其它添加劑的選擇將取決于確切給藥途徑和特定劑型的性質(zhì)，例如液體劑型(例如組合物配制成溶液、混懸液、凝膠還是另一種液體形式)或固體劑型(例如組合物配制成藥丸、片劑、膠囊、膜片、緩釋型還是液體填充型)。
溶液、混懸液和凝膠除含有活性成分之外通常還含有大量水(優(yōu)選純化水)。還可存在少量的其它成分，例如pH調(diào)節(jié)劑(例如堿，如氫氧化鈉)、乳化劑或分散劑、緩沖劑、防腐劑、濕潤劑、膠凝劑(例如甲基纖維素)、著色劑和/或調(diào)味劑。組合物可為等滲的，即它可以具有與血液和淚液相同的滲透壓。
本發(fā)明組合物的所需等滲性可以利用酒石酸鈉、丙二醇或其它無機或有機溶質(zhì)實現(xiàn)。在一個實施方案中，由磷酸鈉或氯化鈉或其混合物獲得組合物的優(yōu)選等滲性。對于含鈉離子的緩沖液而言，特別優(yōu)選氯化鈉。
組合物的粘度可使用藥學可接受的增稠劑維持在選定水平。由于甲基纖維素可容易且經(jīng)濟地獲得，而且易于配伍，所以優(yōu)選甲基纖維素。其它適宜的增稠劑包括例如黃原膠、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、卡波姆等。增稠劑的優(yōu)選濃度取決于選定試劑。要點是使用可達到所選粘度的量。粘性組合物通常通過添加此類增稠劑而由溶液制備。
可使用藥學可接受的防腐劑來增加組合物的保存期。苯甲醇可能是適宜的，盡管還可使用各種防腐劑，包括例如對羥基苯甲酸酯、硫柳汞、三氯叔丁醇或苯扎氯銨。防腐劑的適宜濃度為總重的0.02％-2％，但根據(jù)所選試劑可顯著變化。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到必須選擇對腦膜炎奈瑟氏球菌多糖-蛋白質(zhì)載體綴合物為化學惰性的組合物組分。
援引下列示例性、非限制性的實施例進一步闡述本發(fā)明，所述實施例詳細闡明了本發(fā)明構(gòu)思的幾個優(yōu)選實施方案。在不背離本發(fā)明精神的情況下，本發(fā)明的其它實施例對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
以下縮寫和商標為ACIP，免疫實施咨詢委員會(AdvisoryCommittee on Immunization Practices)；AE，不良事件CetavalonTM，溴化十六烷基三甲基銨，CTAB；CFR，聯(lián)邦法規(guī)(Code of FederalRegulation)；CRF，病例報告表；DTP，白喉-破傷風-百日咳；ELISA，酶聯(lián)免疫吸附測定；FDA，美國食品藥品管理局；GCP，藥品臨床試驗管理規(guī)范；GMC，幾何平均濃度；GMT，幾何平均效價；IgG，免疫球蛋白G；IgG1，免疫球蛋白G亞類1；IgG2，免疫球蛋白G亞類2；IgM，免疫球蛋白M；ICH，國際協(xié)調(diào)會議；IND，研究用新藥；IRB，機構(gòu)審查委員會；MenA/C-Dt，二價(A和C)腦膜炎球菌多糖-白喉綴合疫苗；MenPS，腦膜炎球菌群特異性多糖；mL，毫升；MenomuneTM，獲頒許可證的腦膜炎球菌A、C、Y和W-135多糖疫苗；OD，光密度；PBS，磷酸緩沖鹽溶液；SAE，嚴重不良事件；SBA，血清殺菌活性；SBA-BR，使用幼兔補體進行的血清殺菌活性試驗；SBA-HC，使用人補體進行的血清殺菌活性試驗；SIDS，嬰兒猝死綜合癥；TetraMenD，四價(A、C、Y和W-135)腦膜炎球菌多糖-白喉綴合疫苗；Td，破傷風和白喉疫苗；UAE，預料外不良事件；URI，上呼吸道感染；μg，微克。
實施例 實施例1腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的純化莢膜多糖粉末的制備 粗制膏漿的制備 分別將腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y濕凍種子培養(yǎng)物融化，并在液體Watson Scherp培養(yǎng)基中復蘇，而后接種至含有Mueller Hinton瓊脂培養(yǎng)基的Blake培養(yǎng)瓶中。將Blake培養(yǎng)瓶在CO2氣氛中于35-37℃培養(yǎng)15-19小時。培養(yǎng)期后，將生長物從Blake培養(yǎng)瓶中移出并加至含有Watson Scherp培養(yǎng)基的4 L搖瓶中。搖瓶在水平搖床上于35-37℃培養(yǎng)3-7小時。將4 L搖瓶中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至含有Watson Scherp培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。發(fā)酵罐在35-37℃培養(yǎng)7-12小時，同時控制溶解氧含量和pH，進行補料和消泡劑添加。培養(yǎng)期后，將發(fā)酵罐內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至500 L大罐中，加入CetavlonTM，將材料混合1小時。將CetavlonTM處理的生長物以每小時約30-70升的流速以約15,000-17,000×g離心。利用第二次CetavlonTM沉淀將粗制多糖從上清液中沉淀出來。向上清液中加入CetavlonTM并將材料在室溫下混合至少1小時。將材料于1-5℃貯藏8-12小時。以每分鐘300-400ml的流速以約45,000-50,000×g離心收集沉淀的多糖。將收集的膏漿貯藏于-60℃或更低溫度，直至進一步處理。
純化多糖粉末的制備 將未活化的膏漿融化并轉(zhuǎn)移至攪拌器中。將膏漿于0.9M氯化鈣中攪拌以得到均一懸浮液。懸浮液以約10,000×g離心15分鐘。通過不脫毛墊將上清液傾析入容器中，作為第一次提取物。向膏漿中加入第二份體積的0.9M氯化鈣，攪拌得到均一懸浮液。懸浮液如上所述離心，將上清液與來自第一次提取的上清液混合?？偣策M行4次提取，并將上清液混合。合并的提取物通過使用10-30 kDa MWCO螺旋卷式超濾單元超濾來濃縮。
向濃縮物中加入氯化鎂，并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為7.2-7.5。向濃縮物中加入DNA酶和RNA酶，并在混合下于25-28℃溫育4小時。加乙醇至濃度為30-50％。通過以10,000×g離心2小時除去沉淀的核酸和蛋白質(zhì)。回收上清液，通過加入乙醇至80％并使其于1-5℃靜置過夜使多糖沉淀。虹吸除去乙醇，并將沉淀的多糖以10,000×g離心5分鐘。用乙醇洗滌沉淀的多糖。用丙酮洗滌多糖，以10,000×g離心15-20分鐘。將多糖真空干燥。將初始多糖粉末溶于乙酸鈉溶液中。加入氯化鎂，并用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2-7.5。向溶液中加入DNA酶和RNA酶，并在混合下于25-28℃溫育4小時，以去除殘余核酸。在與這些酶溫育后，向多糖-酶混合物中加入等體積的乙酸鈉-苯酚溶液，并置于1-5℃水平搖床中約30分鐘。將混合物以10,000×g離心15-20分鐘。將上部水層回收并保存。向水層中加入等體積乙酸鈉-苯酚溶液，并如上提取?？偣策M行4次提取，以便從多糖溶液中去除蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素。合并的水相提取物用注射用水稀釋達10倍，并對10倍體積注射用水透析。向透析后的多糖中加入氯化鈣。通過加入乙醇至80％于1-5℃過夜沉淀多糖。移去乙醇上清液，并通過以10,000×g離心15分鐘收集多糖。純化的多糖用乙醇洗滌兩次，并用丙酮洗滌一次。將洗滌后的粉末在干燥器中進行真空干燥。干粉貯藏于-30℃或更低溫度，直至被加工到綴合物上。
實施例2腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的純化 莢膜多糖粉末的解聚 本制備所用材料包括來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的純化莢膜多糖粉末(按照實施例1制備)、無菌的50mM乙酸鈉緩沖液(pH 6.0)、無菌的1N鹽酸、無菌的1N氫氧化鈉、30％過氧化氫以及無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)。
以單獨的反應解聚每種血清群多糖。向一不銹鋼罐中裝入達60克的純化莢膜多糖粉末。向多糖中加入無菌的50mM乙酸鈉緩沖液(pH 6.0)，得到每升2.5g多糖的濃度。在1-5℃下使多糖溶液混合12-24小時，以實現(xiàn)溶解。將反應罐與熱交換器單元相連。加入另外的50mM乙酸鈉緩沖液(pH 6.0)，以稀釋多糖至每升1.25g的反應濃度。將多糖溶液加熱至55℃±0.1℃。向反應混合物中加入等份的30％過氧化氫，獲得1％過氧化氫的反應濃度。
通過隨時間跟蹤多糖分子量的變化來監(jiān)控反應進程。每隔15-20分鐘，從反應混合物中取出等份部分并注射至HPSEC柱，以測量多糖的分子量。當多糖的分子量達到目標分子量時，關(guān)閉加熱器并通過冰水浴循環(huán)將多糖溶液迅速冷卻至5℃。通過將反應罐與配有3000MWCO再生纖維素柱的超濾器連接，將解聚多糖溶液濃縮至每升15g。使?jié)饪s后的解聚多糖溶液對10倍體積無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)透析。將解聚多糖貯存于1-5℃，直至下一處理步驟。
通過流經(jīng)凝膠過濾層析柱以及通過多角度激光光散射確定解聚多糖的分子量，所述凝膠過濾層析柱以商品名“Ultahydrogel.TM.250”售賣，用葡聚糖分子量標準品來校準。使用Bartlet G.R.J(1959)Journalof Biophygical Chemistry，234，466-468頁所述的方法根據(jù)血清群A的磷含量，并使用Svennerholm L.((1955)，Biochimica Biophysica Acta，24，604-611頁所述的方法根據(jù)血清群C、W-135和Y的唾液酸含量，來測定多糖量。通過Hesterin S.(1949)Journalof Biological Chemistry，180，249頁所述的方法測定O-乙?；俊Ｍㄟ^Park J.T.和JohnsonM.J.(1949)Journal of Biological Chemistry，181，149-151頁所述的方法測定還原活性。解聚多糖的結(jié)構(gòu)完整性通過蛋白1H和13C NMR確定。解聚多糖的純度通過測量LAL(內(nèi)毒素)含量和殘余過氧化氫含量來確定。
實施例3腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y解聚多糖的衍生化 本制備所用材料包括過氧化氫解聚的腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y莢膜多糖(按照實施例2制備)、己二酸二酰肼、僅用于血清群A的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDAC)、氰基硼氫化鈉、無菌的1N鹽酸、無菌的1N氫氧化鈉、無菌的1M氯化鈉以及無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)。
以單獨的反應衍化每一種血清群多糖。向一不銹鋼罐中裝入純化的解聚多糖，并用無菌0.85％生理鹽水稀釋，以達到每升6g多糖的終反應濃度。向該溶液中加入溶于無菌0.85％生理鹽水的己二酸二酰肼的濃等分試樣，以達到每升1g的反應濃度。僅對于血清群A，將EDAC作為溶于無菌0.85％生理鹽水的濃等分試樣加入，以達到每升1g的反應濃度。調(diào)節(jié)pH值至5.0±0.1，并利用無菌的1 N鹽酸和無菌的1 N氫氧化鈉在室溫下(15-30℃)維持此pH值達2小時。2小時后，向此反應混合物中加入溶于0.85％生理鹽水的氰基硼氫化鈉濃等分試樣，以達到每升2g的反應濃度。在室溫下(15-30℃)攪動反應物44±4小時，同時維持pH值于5.5±0.5。此反應期后，將pH值調(diào)至6.0±0.1，并通過將反應罐連接至配有3000 MWCO再生纖維素柱的超濾器將衍化的多糖濃縮至每升12g多糖。使?jié)饪s后的衍化多糖對30倍體積的1M氯化鈉透析，接著對10倍體積的0.15M氯化鈉透析。將反應罐與超濾器拆開，并在1-5℃貯藏7天。將反應罐與配有3000 MWCO再生纖維素柱的超濾器重新連接，并對30倍體積的1M氯化鈉透析，接著對10倍體積的0.15M氯化鈉透析。
通過與對解聚多糖所用方法相同的方法測量衍化多糖的分子量、多糖量以及O-乙酰基含量。通過Snyder，S.L.和Sobocinski，P.Z.(1975)Analytical Biochemistry，64，282-288頁的2，4，6-三硝基苯磺酸法測定酰肼含量。衍化多糖的結(jié)構(gòu)完整性通過質(zhì)子1H和13C NMR確定。衍化多糖的純度通過測量未結(jié)合的酰肼水平、LAL(內(nèi)毒素)含量和殘余氰基硼氫化物含量來確定。
實施例4載體蛋白質(zhì)的制備 粗制白喉類毒素蛋白的制備 將凍干的種子培養(yǎng)物復水并培養(yǎng)16-18小時。取一等份培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有生長培養(yǎng)基的0.5升搖瓶中，并將培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)搖床上于34.5-36.5℃培養(yǎng)7-9小時。從培養(yǎng)瓶取一等份轉(zhuǎn)移至含有生長培養(yǎng)基的4升搖瓶中，并將培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)搖床上于34.5-36.5℃培養(yǎng)14-22小時。使用來自4升搖瓶中的培養(yǎng)物接種含生長培養(yǎng)基的發(fā)酵罐。將發(fā)酵罐在34.5-36.5℃培養(yǎng)70-144小時。發(fā)酵罐內(nèi)容物通過深層濾器過濾至收集器中。向收獲物中加入等份的37％甲醛溶液，以達到0.2％的濃度。將pH調(diào)節(jié)至7.4-7.6。將收獲物通過0.2微米過濾柱過濾至無菌的20升瓶中。將瓶子于34.5-36.5℃溫育7天。向每一20升瓶中加入等份的37％甲醛溶液，以達到0.4％的濃度。調(diào)節(jié)混合物pH值至7.4-7.6。將瓶子在搖床上于34.5-36.5℃溫育7天。向每一20升瓶中加入等份的37％甲醛溶液，以達到0.5％的濃度。調(diào)節(jié)混合物pH值至7.4-7.6。將瓶子于34.5-36.5℃溫育8周。對粗制類毒素進行脫毒測試。在測試期間將瓶子貯藏于1-5℃。
粗制白喉類毒素蛋白的純化 將粗制類毒素升溫至室溫，并將20升瓶中的內(nèi)容物合并入純化罐中。調(diào)節(jié)類毒素pH值至7.2-7.4，向粗制類毒素中加入活性炭并混合2分鐘。使活性炭類毒素混合物靜置1小時，然后通過深層過濾柱過濾至第二個純化罐中。向濾液中加入固體硫酸銨，以達到70％飽和度。調(diào)節(jié)pH值至6.8-7.2，并使溶液靜置16小時。經(jīng)過濾收集沉淀的蛋白質(zhì)，并用70％飽和度的硫酸銨溶液(pH 7.0)洗滌。將沉淀溶于無菌蒸餾水中，并將蛋白質(zhì)溶液過濾至不銹鋼收集器中。調(diào)節(jié)pH值至6.8-7.2，并加入硫酸銨至40％飽和度。調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0-7.2，并使溶液靜置16小時。沉淀通過過濾去除并丟棄。向濾液中加入硫酸銨至60％飽和度，并調(diào)節(jié)pH值至7.0-7.2。使混合物靜置16小時，并通過過濾收集沉淀的蛋白質(zhì)。將沉淀溶于無菌蒸餾水中，過濾去除不溶的蛋白質(zhì)，并對0.85％生理鹽水透析。
純化白喉類毒素蛋白的濃縮和除菌過濾 使用10,000 MWCO再生纖維素濾柱，將蛋白質(zhì)溶液濃縮至每升15g，并對10倍體積的0.85％生理鹽水透析。濃縮的蛋白質(zhì)溶液通過0.2微米濾膜過濾除菌。將蛋白質(zhì)溶液貯藏于1-5℃，直至加工到綴合物上。
蛋白質(zhì)濃度通過Lowry，O.H.等(1951)，Journal of BiologicalChemistry，193，265-275頁所述的方法測定。蛋白質(zhì)純度通過無菌性、LAL(內(nèi)毒素)含量和殘余甲醛含量確定。
實施例5腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y多糖與白喉類毒素蛋白的單價綴合物的制備 本制備所用材料包括腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的己二酸衍化多糖(按照實施例3制備)、無菌白喉類毒素蛋白(按照實施例4制備)、EDAC、硫酸銨、無菌的1N鹽酸、無菌的1N氫氧化鈉以及無菌生理鹽水(0.85％)。
以單獨的反應制備每一種血清群多糖綴合物。全部四種綴合物均通過以下方法制備。向一不銹鋼罐中裝入純化的己二酸衍化多糖(反應濃度為700-1000μmole活性酰肼/升)以及純化的白喉類毒素蛋白(反應濃度為3.8-4.0g蛋白質(zhì)/升)。使用0.85％生理鹽水稀釋這些原料至目標反應濃度，并調(diào)節(jié)pH值至5.0±0.1。將等份EDAC加入到多糖蛋白質(zhì)混合物中，以達到2.28-2.4g/L的反應濃度。在15-30℃下將反應pH維持在5.0±0.1達2小時。2小時后，用無菌的1 N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0±0.1，并將反應物在1-5℃儲存16-20小時。
使反應混合物升溫至15-30℃，并將反應罐連接至配有30,000MWCO再生纖維素柱的超濾器。加入固體硫酸銨至60％飽和度(對于血清群A、W-135和Y)和50％飽和度(對于血清群C)。使綴合反應混合物對20倍體積的60％飽和硫酸銨溶液(對于血清群A、W-135和Y)和50％飽和硫酸銨溶液(對于血清群C)透析，接著對20倍體積的0.85％生理鹽水透析。透析后的綴合物先通過含1.2微米和0.45微米濾膜的囊式濾器(filter capsule)過濾，然后通過含0.22微米濾膜的第二個囊式濾器過濾。
通過與對經(jīng)解聚并衍化的多糖所用方法相同的方法測定多糖量和O-乙?；?。蛋白質(zhì)的量通過Lowry法測定。綴合物的分子量通過流經(jīng)凝膠過濾層析柱確定，所述凝膠過濾層析柱以商品名“TSK6000PW”售賣，使用DNA作為外水體積標記物，使用ATP作為總體積標記物，并使用牛甲狀腺球蛋白作為參比標記物。此外，通過多角度激光光散射測量從TSK6000PW柱上洗脫的綴合物的分子量。使用雙夾心ELISA法，通過與抗多糖血清群特異性抗體結(jié)合檢測綴合物的抗原特征。綴合物純度通過測定未結(jié)合(未綴合)多糖的量(通過經(jīng)疏水作用層析柱洗脫)、未綴合蛋白質(zhì)的量(通過毛細管電泳)、無菌性、LAL(內(nèi)毒素)含量、殘余EDAC含量以及殘余銨離子含量來確定。
實施例6多價腦膜炎球菌A、C、W-135和Y多糖白喉類毒素 綴合疫苗的配制 本制備所用材料包括按照實施例5制備的血清群A、C、W-135和Y多糖-白喉類毒素綴合物、無菌的100mM磷酸鈉緩沖的生理鹽水(0.85％氯化鈉)。
向不銹鋼配制罐內(nèi)的生理鹽水(0.85％)中加入等份無菌的100-500mM磷酸鈉緩沖生理鹽水，以得到10mM磷酸鈉的最終疫苗濃度。向含有10mM無菌磷酸鈉生理鹽水的配制罐中加入等份的2-4種無菌單價腦膜炎球菌多糖-白喉類毒素綴合物中的每一種，獲得每毫升緩沖液中每一種血清群多糖各8μg的終濃度。將配制的四價綴合物混合并通過0.2μm濾器過濾至第二個配制罐中。
使用高pH陰離子交換層析和脈沖安培檢測法，通過糖成分分析測定多價制劑中存在的每種血清群多糖的量。蛋白質(zhì)的量通過Lowry法測定。使用與pH計連接的復合電極測定疫苗的pH值。使用雙夾心ELISA方法通過與抗多糖血清群特異性抗體結(jié)合測定多價綴合物的抗原特征。通過疫苗中存在的每種綴合物在動物模型中激發(fā)初次和加強抗多糖IgG免疫應答的能力來確定多價綴合疫苗的免疫原性。多價綴合疫苗的純度通過測定未結(jié)合(未綴合)多糖的量(使用高pH陰離子交換層析和脈沖安培檢測法)、無菌性、LAL(內(nèi)毒素)含量、熱原含量和一般安全性來測定。
實施例7以氫氧化鋁為佐劑的多價腦膜炎球菌多糖白喉類毒素 蛋白綴合物的制備 綴合物制品吸附至氫氧化鋁。本制備所用材料包括按照實施例5制備的血清群A、C、W-135和Y多糖-白喉類毒素綴合物、無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)以及無菌氫氧化鋁的生理鹽水溶液(0.85％氯化鈉)。
向含有生理鹽水的配制罐中加入等份的每種無菌單價腦膜炎球菌多糖白喉類毒素綴合物，以獲得每毫升緩沖液中每種血清群多糖各為8μg的終濃度。向多價綴合疫苗中加入等份的無菌氫氧化鋁的生理鹽水溶液(0.85％氯化鈉)，以達到0.44mg鋁離子/毫升疫苗的終濃度。
實施例8以磷酸鋁為佐劑的綴合物的制備 本制備所用材料包括按照實施例5制備的血清群A、C、W-135和Y多糖-白喉類毒素綴合物、無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)以及無菌磷酸鋁的生理鹽水溶液(0.85％氯化鈉)。
向含有生理鹽水的配制罐中加入等份的每種無菌單價腦膜炎球菌多糖-白喉類毒素綴合物，以獲得每毫升緩沖液中每種血清群多糖各為8μg的終濃度。向多價綴合疫苗中加入等份的無菌磷酸鋁的生理鹽水溶液(0.85％氯化鈉)，以達到0.44mg鋁離子/毫升疫苗的終濃度。
實施例9在人類臨床研究中使用的材料和方法的一般性描述四價衍生綴合疫苗的免疫原性 在多種不同的臨床方案下研究了綴合疫苗激發(fā)人類免疫應答的能力。以下研究總結(jié)了結(jié)果。除非另有說明，否則以下每項研究中所使用的材料和方法都為 TetraMenD TetraMenD疫苗包含四種腦膜炎球菌莢膜多糖血清群A、C、Y和W-135，每種多糖4μg，共價連接至總共48μg的白喉類毒素蛋白。疫苗用無菌的、無熱原的磷酸鹽緩沖生理鹽水配制，不含防腐劑。配方包含0.6mg磷酸鈉、4.4mg氯化鈉以及加至0.5mL的水。
Menomune_ Menomune_在美國和其它國家被許可用于2歲以上的人群。Menomune為凍干制劑，每劑疫苗含各50μg的A、C、Y和W-135多糖作為抗原，用采用硫柳汞防腐的等滲氯化鈉溶液的稀釋液重建，以0.5mL劑量皮下給藥。每0.5mL劑量的疫苗包含2.5-5mg乳糖作為穩(wěn)定劑。對于皮下施用，組合血清群A、C、Y和W-135的腦膜炎球菌多糖疫苗Menomune_-A/C/Y/W-135是一種腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、Y和W-135的血清群特異性多糖抗原的凍干制劑。稀釋劑是無菌、無熱原的蒸餾水。按照標簽指示用稀釋劑將凍干制品重建后，每0.5mL劑量配制成包含各50μg的血清群A、C、Y和W-135的“分離產(chǎn)品”的等滲氯化鈉溶液。
成人用破傷風和白喉類毒素吸附疫苗(Tetanus and DiphtheriaToxoids Adsorbed for Adult Use_)(以下稱作Td)是一種明礬沉淀類毒素在等滲氯化鈉溶液中的無菌混懸劑，所述等滲氯化鈉溶液含有磷酸鈉緩沖液，以控制pH值。此疫苗用于肌內(nèi)注射。通過檢測，每0.5mL劑量配制成包含5 Lf破傷風類毒素、2 Lf白喉類毒素和不超過0.28mg的鋁。在豚鼠效力測試中，破傷風和白喉類毒素分別誘導出至少2單位/毫升和0.5單位/毫升的抗毒素。在第一次隨訪時，用一枚1英寸的25號針通過肌內(nèi)注射入左臂三角肌給予所有參與者0.5mL單劑的Td。每0.5mL劑量包含5 Lf破傷風類毒素和2Lf白喉類毒素。
血清樣品 于基線期之后指定的天數(shù)抽取血液樣品。例如，如果方案指定3個時間點0天、28天和6個月，則在接種前0天(基線)、接種后28天(為了評價初次免疫應答)和接種后6個月(為了評價免疫應答的持久性)抽取血液樣品。在每個時間點從每位受試者收集大約5mL全血。全血在采集后4小時之內(nèi)離心。取出血清并貯存于-20℃?！?8天”的血液樣品取自0天注射后至少28天但尚未到57天時?！?個月”血液樣品取自0天注射后6個月加或減28天時。因此，28天血清代表取自0天后28天-56天的血清；6個月血清代表取自0天后149天-217天的血清。
測定技術(shù) 本研究使用了多種標準化免疫學測定法。以下描述總結(jié)了文中所用方法。但是，其它相似的測定法(包括本文提到的那些測定法的變更)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，且可以使用。
通過使用幼兔補體的血清殺菌試驗(SBA-BR)進行抗腦膜炎球菌抗體測定 使用血清殺菌試驗測定針對血清群A、C、Y和W-135的抗腦膜炎球菌抗體的功能性抗體活性。在無菌96孔微量滴定板中制備測試血清的2倍稀釋液。將血清群特異性腦膜炎球菌和幼兔補體加入到血清稀釋液中并使其溫育。在該溫育期之后，向血清/補體/細菌混合物中加入瓊脂覆層培養(yǎng)基，使之凝固，然后在37℃、5％CO2下培養(yǎng)過夜。計數(shù)孔中存在的細菌菌落。根據(jù)和補體對照孔的平均值相比達到＞50％殺死的血清稀釋度倒數(shù)確定終點效價。對于使用兔補體的該測定，檢出限度為效價8。
IgG抗腦膜炎球菌抗體的測定 使用間接ELISA測定針對血清群A、C、Y和W-135的抗腦膜炎球菌抗體的IgG抗體活性。該方法涉及使血清中的抗體與通過甲基化人血清白蛋白吸附至塑料微量滴定孔的過量腦膜炎球菌群特異性多糖(MenPs)抗原反應。通過與過氧化物酶標記的小鼠抗人IgG特異性單克隆抗體的反應測定結(jié)合抗體的量。隨后使用過氧化物酶底物的反應產(chǎn)生顯色產(chǎn)物，用分光光度計法測定該產(chǎn)物。所得到的光密度(OD)與結(jié)合到微量滴定板上的腦膜炎球菌多糖的血清中IgG抗體量相關(guān)聯(lián)。然后通過使用4參數(shù)邏輯曲線法與具有指定值的參比品(Lot CDC 1992或等效物)相比較來計算IgG抗體量。
IgM抗腦膜炎球菌抗體的測定 使用間接ELISA測定針對血清群A、C、Y和W-135的抗腦膜炎球菌抗體的IgM抗體活性。該方法涉及使血清中的抗體與通過甲基化人血清白蛋白吸附到塑料微量滴定孔中的過量MenPs抗原反應。通過與過氧化物酶標記的小鼠抗人IgM特異性單克隆抗體的反應來測定結(jié)合抗體的量。隨后使用過氧化物酶底物的反應產(chǎn)生顯色產(chǎn)物，用分光光度計法測定該產(chǎn)物。所得到的OD與結(jié)合到微量滴定板上的腦膜炎球菌多糖的血清中IgM抗體量相關(guān)聯(lián)。然后通過使用4參數(shù)邏輯曲線與具有指定值的參比品(Lot CDC 1992或等效物)相比較來計算IgM抗體量。
高親和力抗腦膜炎球菌IgG抗體的測定 在Aventis Pasteur Inc.使用改良型ELISA法測定針對血清群A、C、Y和W-135的抗腦膜炎球菌抗體的高親和力IgG抗體活性。該測定法目前處于Aventis Pasteur Inc.研發(fā)中，并且將在臨床樣品測試之前取得資格。簡言之，就是用MenPs抗原包被96孔微量滴定板。吸出并洗滌包被板后，使用包含75 mM硫氰酸銨的磷酸緩沖鹽水(PBS)血清稀釋緩沖液在板中直接制備臨床血清的系列稀釋液，并使其過夜溫育。通過與過氧化物酶標記的小鼠抗人IgG特異性單克隆抗體的反應測定結(jié)合抗體量。隨后使用過氧化物酶底物的反應產(chǎn)生顯色產(chǎn)物，用分光光度計法測定該產(chǎn)物。所得到的OD與結(jié)合到微量滴定板上的腦膜炎球菌多糖的血清中高親和力IgG抗體量相關(guān)聯(lián)。然后通過使用4參數(shù)邏輯曲線與參比品(Lot CDC 1992或等效物)相比較來計算高親和力IgG抗體的量。
IgG1和IgG2亞類腦膜炎球菌抗體的測定 使用ELISA檢測針對血清群A、C、Y和W-135的抗腦膜炎球菌抗體的IgG1和IgG2亞類抗體分布。血清連續(xù)稀釋液中存在的抗體與吸附至微量滴定板孔的MenPs抗原反應。使用抗人IgG1 Fc或IgG2 Fc特異性試劑，測定結(jié)合抗體量。隨后與酶底物的反應產(chǎn)生顯色產(chǎn)物，用分光光度計法測定該產(chǎn)物。所得到的OD與結(jié)合到微量滴定板上的腦膜炎球菌多糖的血清中IgG1或IgG2抗體量相關(guān)聯(lián)?？贵w量將以血清樣品中的IgG1∶IgG2比率報告，或者，如果可得到適宜的參比品，則將以樣品中IgG1或IgG2的濃度報告。
通過VERO細胞的代謝抑制進行抗白喉抗體測定 通過測試血清保護VERO細胞免受白喉毒素攻擊的能力檢測抗白喉抗體反應。使用無菌的96孔微量滴定板，用白喉毒素攻擊測試血清的2倍稀釋液(以1∶4稀釋度開始)，并使其溫育。然后加入VERO細胞，用無菌礦物油密封孔并溫育6-8天。然后通過觀察由細胞代謝副產(chǎn)物引起的培養(yǎng)基中pH指示劑的顏色變化來確定抗體水平。結(jié)果通過與校準過的WHO參考血清對比以國際單位/毫升報告，并以存在攻擊劑量的白喉毒素時允許細胞代謝的最高血清稀釋度來確定。檢測下限可通過參考血清的最小可檢測抗毒素水平以及測試血清的起始稀釋度來確定，通常為0.005IU/mL。
通過ELISA測定抗破傷風抗體 通過間接酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來測定抗破傷風抗體水平。該方法涉及使測試血清中的抗體與吸附到塑料微量滴定孔的破傷風類毒素反應。通過與綴合至堿性磷酸酶的山羊抗人IgG特異性抗體的反應測定結(jié)合抗體量。隨后與堿性磷酸酶底物的反應產(chǎn)生顯色產(chǎn)物，用分光光度計法測定該產(chǎn)物。OD(光密度)與血清稀釋液中結(jié)合到抗原包被的微量滴定板的抗體量相關(guān)聯(lián)。通過使用平行線分析法與具有指定單位量的國際人類參比品(WHO Lot TE-3)相比較，計算出抗體濃度。結(jié)果以國際單位/毫升(IU/mL)報告?？蛊苽LIgG ELISA的最低定量水平為0.01IU/mL，所獲值低于此水平的樣品報告為＜0.01IU/mL。
本文使用的“不良事件”、“嚴重不良事件”和“預料外不良事件”均為疫苗行業(yè)內(nèi)被充分理解的術(shù)語。依據(jù)標準臨床實驗規(guī)范總結(jié)和分析安全性資料，包括評價接種疫苗的所有參與者的臨床研究持續(xù)時間。一般來說，每個術(shù)語均理解為具有以下含義。
不良事件(AE)定義為“在給予藥品的患者或臨床研究受試者中出現(xiàn)的任何不幸醫(yī)療事件，其不一定與該治療存在因果關(guān)系。因此，不良事件可以是在時間上與醫(yī)藥(研究)產(chǎn)品的使用相關(guān)的任何不利的和非故意的病征(包括異常實驗室結(jié)果)、癥狀或疾病，而不管其是否與醫(yī)藥(研究)產(chǎn)品相關(guān)?！?ICH guidelines，GCP(E6)§1.2)。
嚴重不良事件(SAE)是“在任何劑量出現(xiàn)的導致任何下列后果的任何不良藥物體驗死亡、威脅生命的不良藥物體驗、病人住院或現(xiàn)有住院期延長、持久或明顯的失能/無能或先天性異常/出生缺陷。根據(jù)適當?shù)尼t(yī)療鑒定，可能不導致死亡、威脅生命或需要住院的重大醫(yī)療事件可能危害到病人或受試者并可能需要藥物或外科介入避免發(fā)生本定義所列后果之一，此時可將這些事件認作嚴重不良藥物體驗。此類醫(yī)療事件的實例包括需要在急診室或家中進行精心治療的過敏性支氣管痙攣、未導致病人住院的血惡夜質(zhì)或驚厥或者出現(xiàn)藥物依賴或藥物濫用?！?21 CFR Ch.I，§312.32(a))。
預料外不良事件(UAE)是“任何不良的藥物體驗，其特異性或嚴重性與現(xiàn)行研究者手冊不一致；或者，經(jīng)修正的，在不需要或者得不到研究者手冊的情況下，其特異性或嚴重性與當前應用的總體研究計劃或其它地方描述的風險信息不一致?！?21 CFR Ch.I，§312.32(a))。
本研究依據(jù)標準臨床實驗規(guī)范開展，并且研究中患者入選或排除的標準如下 患者的入選標準 1.據(jù)醫(yī)療史和身體檢查確定，參與者是健康的。
2.接種時參與者至少11歲而未到19歲。
3.在需要辦理的情況下，父母/監(jiān)護人或參與者已簽署了機構(gòu)審查委員會(IRB)批準的知情同意書。
4.在需要辦理的情況下，參與者已簽署了機構(gòu)審查委員會(TRB)批準的同意書。
患者的排除標準 1.患有嚴重慢性病(即心臟病、腎病、神經(jīng)病、代謝疾病、風濕病等)。
2.已知或懷疑免疫功能損傷。
3.在最近的72小時內(nèi)有伴隨或未伴隨發(fā)熱的急性內(nèi)科疾病或者在入選時口腔溫度≥38℃(100.4_)。
4.具有文件證實的侵入性腦膜炎球菌性疾病史或以前進行過腦膜炎球菌接種。
5.在最近的3個月內(nèi)給予過免疫球蛋白、其它血液制品，或者在研究疫苗的6周內(nèi)口服或注射過皮質(zhì)類固醇或進行過其它免疫調(diào)節(jié)治療。處于持續(xù)時間＜7天的口服類固醇遞減劑量程序中的個體可入選試驗，只要他們在入選前2周內(nèi)沒有接受過超過1個療程的治療。
6.在接種前的72小時內(nèi)接受過抗生素治療。
7.在入選前28天的時間段內(nèi)接種過任何疫苗，或在入選后28天的時間段內(nèi)計劃接種本研究指明的附加疫苗之外的任何疫苗。
8.懷疑或已知對任何疫苗成分過敏。
9.無法參與整個研究階段或者不能參加預定隨訪或不遵守研究規(guī)程。
10.入選另一個臨床試驗。
11.在研究者看來，對參與者應具有健康危險或者干擾疫苗評價的任何情況。
12.在接種時尿妊振試驗陽性或可疑陽性的女性。
實施例10 研究A-劑量研究 研究A是向3個年齡組的參與者給予三個劑量水平TetraMenD疫苗的非盲的、開放標記的、劑量遞增的試驗。90個健康成人(18-55歲)入選I期試驗，并接受TetraMenD疫苗單次注射。30個健康兒童(12-22月齡)入選II期試驗，并接受單劑水平TetraMenD疫苗的兩次注射。90個健康嬰兒(6-12周齡)入選III期試驗，并接受單劑水平TetraMenD疫苗的三次注射。
在18-55歲成人中的I期劑量研究 此臨床試驗是給予3個年齡組的參與者三個劑量水平TetraMenD疫苗的非盲的、開放標記的、劑量遞增的試驗。在I期中，90個健康成人(18-55歲)接受TetraMenD疫苗的單次注射。
對于成人參與者，在TetraMenD給予前的基線期(0天)和TetraMenD給予后28天獲取用于血清學分析的血清樣品。分析所有可得到樣品的抗腦膜炎球菌多糖血清群A、C、Y和W-135的SBA，并通過ELISA分析抗這些相同血清群的IgG抗體。下文總結(jié)了所有血清群的SBA和IgG ELISA結(jié)果。
一個關(guān)鍵的免疫原性終點是從基線起具有≥4倍升高的參與者比例。為了確定基線SBA效價對SBA有≥4倍升高的比例有何作用，對于其對各個具體抗原的基線效價小于1∶64的成人和其對該具體抗原的基線效價至少為1∶64的成人進行亞組分析。
TetraMenD的安全性與Menomune_的安全性相當。該研究的結(jié)果總結(jié)于下表。
表A-3I期(成人)-按照TetraMenD劑量水平的基線期和注射后28天達到SBA閾值的比例(符合方案人群) N在每一時間點(0天；28天)的可評價參與者的數(shù)量 表A-4I期(成人)-按照TetraMenD劑量水平的基線期和注射后28天的SBA和IgG ELISA結(jié)果(符合方案人群) 表A-4I期(成人)-按照TetraMenD劑量水平的基線期和注射后28天的SBA和IgG ELISA結(jié)果(符合方案人群) 表A-4I期(成人)-按照TetraMenD劑量水平的基線期和注射后28天的SBA和IgG ELISA結(jié)果(符合方案人群) 0天在接種前抽取的基線期血樣。
28天在接種后28天抽取的血樣。
≥4倍升高的％與0天相比接種后28天GMT值具有≥4倍升高的的成人的百分率。
N可評價參與者的數(shù)量。
*對SBA數(shù)據(jù)計算GMT；對IgG ELISA數(shù)據(jù)計算GMC。
表A-5列出了按照劑量、患者年齡和血清群的GMT值。
II期 在12月齡至22月齡的學步兒童中的劑量研究 此臨床試驗是給予3個年齡組的參與者三個劑量水平TetraMenD疫苗的非盲、開放標記的、劑量遞增的試驗。在II期中，30個健康兒童(12-22月齡)接受單劑水平TetraMenD疫苗的兩次注射。
對于學步兒童參與者，在三個時間點獲取用于血清學分析的血清樣品第一次注射TetraMenD之前的基線期(0天)、入選后60天(第一次注射后60天并剛好在第二次注射TetraMenD之前)和入選后90天(第二次注射之后30天)。分析所有可得樣品的抗腦膜炎球菌多糖血清群A、C、Y和W-135的SBA，并通過ELISA分析抗這些血清群的IgG抗體。下文總結(jié)了所有血清群的SBA和IgG ELISA結(jié)果。結(jié)果總結(jié)于下表。
表A-10II期(學步兒童)-按照TetraMenD劑量水平在基線期、第一次注射后60天和第二次注射后30天學步兒童中的SBA和IgG ELISA結(jié)果(符合方案人群) 表A-10II期(學步兒童)-按照TetraMenD劑量水平在基線期、第一次注射后60天和第二次注射后30天學步兒童中的SBA和IgG ELISA結(jié)果(符合方案人群) 表A-10II期(學步兒童)-按照TetraMenD劑量水平在基線期、第一次注射后60天和第二次注射后30天學步兒童中的SBA和IgG ELISA結(jié)果(符合方案人群) 0天在第1次注射前抽取的基線期血樣。
60天在第1次注射后60天并在第2次注射前抽取的血樣。
90天在第2次注射后30天抽取的血樣。
≥4倍升高的％第1次注射后與0天相比在60天時GMT具有≥4倍升高的學步兒童的百分比；第2次注射后與0天相比在90天時GMT具有≥4倍升高的學步兒童的百分比。
N可評價參與者的數(shù)量 *對SBA數(shù)據(jù)計算GMT；對IgG ELISA數(shù)據(jù)計算GMC。
表A-11總結(jié)了按照劑量、患者年齡和血清群的GMT。
III期在嬰兒中的劑量研究 此臨床試驗是給予3個年齡組的參與者三個劑量水平TetraMenD疫苗的非盲的、開放標記的、劑量遞增的試驗。在III期中，90個健康嬰兒(6-12周齡)接受單劑水平TetraMenD疫苗的三次注射。
嬰兒參與者分別在2月齡(第1次注射)、4月齡(第2次注射)和6月齡(第3次注射)時接受TetraMenD注射。在兩個時間點抽取用于血清學分析的血清樣品6月齡(第2次注射后2個月)和7月齡(第3次注射后1個月)。分析所有可得樣品的抗腦膜炎球菌多糖血清群A、C、Y和W-135的SBA，并通過ELISA分析抗相同血清群的IgG抗體。下文總結(jié)了所有血清群的SBA和IgG ELISA結(jié)果。結(jié)果總結(jié)于下表。
表A-14III期(嬰兒)-按照TetraMenD劑量水平在6月齡(第3次注射前)和7月齡(第3次注射后)時達到SBA閾值的比例(符合方案人群) N在每一時間點(6月齡；7月齡)可評價參與者的數(shù)量。
表A-15III期(嬰兒)-按照TetraMenD劑量水平在6月齡(第3次注射前)和7 月齡(第3次注射后)嬰兒中的SBA和IgG ELISA結(jié)果(符合方案人群) 表A-15III期(嬰兒)-按照TetraMenD劑量水平在6月齡(第3次注射前)和7月齡(第3次注射后)嬰兒中的SBA和IgG ELISA結(jié)果(符合方案人群) 表A-15III期(嬰兒)-按照TetraMenD劑量水平在6月齡(第3次注射前)和7月齡(第3次注射后)嬰兒中的SBA和IgG ELISA結(jié)果(符合方案人群) N可評價參與者的數(shù)量 *對SBA數(shù)據(jù)計算GMT；對IgG ELISA結(jié)果計算GMC。
表A-16列出了按照患者年齡和血清群的GMT總結(jié)。
表A-16按照患者年齡和血清群的GMT總結(jié) 在嬰兒中與TetraMenD共同給予的兒科疫苗 目前，按照現(xiàn)行ACIP推薦和當?shù)匾?guī)范，嬰兒接受常規(guī)兒科疫苗接種。在本研究中，嬰兒接受TetraMenD和兒科疫苗接種。在2、4和6月齡時給予DTacP(Tripedia_)和Hib(ActHIB_)?？山o予IPV或OPV；IPV在第一次和第二次注射TetraMenD時(在2月齡和4月齡時)給予。按照當?shù)匾?guī)范接種乙肝疫苗；乙肝疫苗在2月齡時給予一些參與者，但在4月齡或6月齡時不給予任何參與者。在進行該試驗的嬰兒期期間，RotaShield_得到許可并且ACIP推薦用于常規(guī)用途。在本試驗中一個參與者在4月齡和6月齡時接受RotaShield_。
在6月齡和7月齡時評價對常規(guī)給予的兒科疫苗抗原的抗體反應。結(jié)果總結(jié)于各表中。
該試驗中的嬰兒參與者在2、4和6月齡時接受DTacP和PRP疫苗；在第3次注射這些疫苗后一個月抽取7月齡血液。對于這些疫苗抗原(白喉、破傷風、百日咳FHA、百日咳PT和PRP)的每一種，所觀察到的抗體水平在3個TetraMenD劑量組中未顯示出統(tǒng)計學顯著差異(所有p值均＞0.05)。(見表A-17) 在本試驗當中，在2月齡和4月齡時給予IPV。在第2次注射IPV后3個月抽取7月齡血液。對于1型和2型脊髓灰質(zhì)炎，所觀察到的GMT、NA≥1∶4的比例以及NA≥1∶8的比例在3個TetraMenD劑量組中未顯示出統(tǒng)計學顯著差異(所有p值均＞0.05)。根據(jù)NA≥1∶8的比例，全部3個TetraMenD劑量組有至少95.0％表現(xiàn)出抗1型和2型脊髓灰質(zhì)炎的保護作用。對于3型眷髓灰質(zhì)炎，1μg、4μg和10μg組的GMT分別為562.7、164.0和113.3。3型眷髓灰質(zhì)炎各組間GMT的差異是統(tǒng)計學顯著的(p＝0.001，ANOVA)。但是，依據(jù)NA≥1∶8的比例(分別為100.0％[22/22]、100.0％[21/21]和94.1％[16/17])，全部3個TetraMenD劑量組中都表現(xiàn)出抗3型脊髓灰質(zhì)炎的保護作用。這些比例沒有統(tǒng)計學差異(p＝0.283，F(xiàn)isher恰當檢驗)。而且，在本試驗所用IPV接種程序2月齡和4月齡的兩劑IPV之后，對這三種脊髓灰質(zhì)炎血清型所觀察到的GMT完全處于所公開的范圍之內(nèi)。
在最近一次乙肝疫苗接種后的最少5個月時抽取7月齡血液。通過GMT和≥10mIU/mL的比例所觀察到的乙肝表面抗體水平在3個TetraMenD劑量組中未顯示出統(tǒng)計學顯著差異(兩個的p值均≥0.649)。值得注意的是，本試驗中沒有嬰兒在6個月隨訪時接受乙肝疫苗，6個月是第3劑乙肝疫苗的最早推薦時期。這可以解釋為什么乙肝表面抗體效價≥10mIU/mL的7月齡嬰兒比例與首劑乙肝疫苗后產(chǎn)生的可檢測抗體的公開范圍一致，但低于預期在完整的三次接種系列后應具有保護性抗體水平的嬰兒比例。本研究結(jié)果總結(jié)于下表。
表A-17III期(嬰兒)-按照TetraMenD劑量水平在7月齡嬰兒中的共同給予疫苗的免疫原性(符合方案人群) 表A-17III期(嬰兒)-按照TetraMenD劑量水平在7月齡嬰兒中的共同給予疫苗的免疫原性(符合方案人群) 表A-17III期(嬰兒)-按照TetraMenD劑量水平在7月齡嬰兒中的共同給予疫苗的免疫原性(符合方案人群) *GMT比較使用F-檢驗。百分比的比較使用Fisher恰當檢驗。
_p-值＜0.05 實施例11研究B 在2-10歲兒童中的1個月和6個月研究 本研究是對2-10歲健康兒童進行的隨機化的、陽性對照的研究，比較了單劑TetraMenD和單劑Menomune。分別在接種前D0、D0后28天和6個月抽取血液樣品。TetraMenD的總體安全性與Menomune相比是相當?shù)?。本研究的結(jié)果總結(jié)于下表。
SBA-BR抗體效價分布 表B-1顯示了對于每一血清群的基線期、28天和6個月SBA-BR抗體效價的頻率分布。
表B-2總結(jié)了按照受試者年齡和TetraMenD血清群的幾何平均效價(GMT)。
表B-3顯示了對于血清群A、C、Y和W-135從基線期到28天SBA-BR效價具有≥4倍升高的參與者數(shù)量和比例。對于每一血清群，TetraMenD組中的這些百分比高于Menomune_組中的百分比。對于血清群A、C、Y和W-135，比例的差異分別為-0.0397、-0.0452、-0.1092和-0.0562。
表B-3符合方案人群的主要(primary hypothesis)假設檢測的總結(jié) n從基線效價起具有≥4倍升高的參與者數(shù)量。
N所使用群體中的參與者總數(shù)。
Pt和Pm分別為TetraMenD和Menomune_組中接種后SBA效價具有≥4倍升 高的參與者比例。
表B-3總結(jié)了接種后28天SBA抗體效價≥32的參與者比例。
％n/N。
_n接種后28天效價≥32的參與者數(shù)量。
_N該組中在28天時具有有效血液樣品的參與者總數(shù)。
表B-4總結(jié)了接種后28天SBA抗體效價≥128的參與者比例。
表B-4接種后28天SBA-SR抗體效價≥128的參與者的百分比和數(shù)量(符合方案人群)。
％n/N。
_n接種后28天效價≥128的參與者數(shù)量。
_N該組中在28天時具有有效血液樣品的參與者總數(shù)。SBA-BR抗體效價具有至少4倍升高的參與者比例 表B-5顯示了在28天和6個月時SBA抗體效價由基線起具有≥4倍升高的參與者比例。在接受TetraMenD后的28-56天，大多數(shù)參與者體驗了針對疫苗中所含的每種血清群的SBA-BR抗體效價的≥4倍升高。
表B-5在28天和6個月時SBA-BR抗體效價由基線起具有≥4倍升高的參與者百分比和數(shù)量(符合方案人群) ％n/N。
_n由基線效價起具有≥4倍升高的參與者數(shù)量。
_N所用群體中的參與者總數(shù)。
在0天檢測不到效價(＜8)的參與者在28天時SBA-BR抗體效價得到 ≥4倍升高的比例 在兩個處理組中并對于所有疫苗血清群，在基線期檢測不到SBA-BR效價(＜8)的大部分參與者在28天時獲得了SBA效價的≥4倍升高(表B-6)。在TetraMenD組中，在0天時SBA效價＜8的參與者在28天時由基線起具有≥4倍升高的比例在86.21％-98.57％的范圍內(nèi)；在Menomune_組中，該比例在75.00-94.64的范圍內(nèi)。
表B-6在0天檢測不到效價(＜8)的參與者在28天時SBA抗體效價得到≥4倍升高的數(shù)量和百分率。
*n＝每一血清群中在0天時效價＜8而在28天時效價≥32的參與者數(shù)量。
N＝每一血清群中在0天時效價＜8的參與者數(shù)量。
_百分比的確切95％置信區(qū)間。
SBA-BR抗體GMT和平均升高倍數(shù) 表B-7顯示了基線期、接種后28天和6個月時的SBA GMT以及SBA GMT的升高倍數(shù)。
表B-7基線期、接種后28天和6個月時SBA-BR血清學結(jié)果(符合方案人群) *效價或升高倍數(shù)，其中升高倍數(shù)＝28天時的效價/0天時的效價 _N計算所用的參與者總數(shù)。
血清群A、C、W-135和Y的ELSIA IgG 表B-8顯示了基線期、接種后28天和6個月時的IgG GMC以及IgG GMC的升高倍數(shù)。
表B-8基線期、接種后28天和6個月的IgG血清學結(jié)果(符合方案人群) 表B-8基線期、接種后28天和6個月的IgG血清學結(jié)果(符合方案人群) *效價或升高倍數(shù)，其中升高倍數(shù)＝28天時的效價/0天時的效價 _N計算所用的參與者總數(shù)。
接受本研究接種TetraMenD后28-56天，大多數(shù)參與者都體驗到對疫苗中所包含的每一血清群的SBA-BR抗體效價的≥4倍升高。總體來說，有77％的TetraMenD接受者體驗到抗所有血清群的抗體效價的4倍升高。觀察到對血清群Y的接種前抗體水平高于對血清群C或W-135的接種前抗體水平。這可能與這樣一種事實相關(guān)即在此年齡對血清群Y的天然暴露可能比先前預想的更普遍。較高的循環(huán)抗體水平反映了近期天然暴露的情況，并可能降低呈現(xiàn)出4倍以上抗體反應的疫苗接種者比例。與其它血清群相比，這種現(xiàn)象看起來明顯是血清群Y反應的情況。對于血清群Y，4倍升高為56.6％，相比之下血清群C為73.4％，血清群A為87.7％，血清群W-135為91.0％。還觀察到對血清群A的高接種前抗體水平。這可能是在延長的時間段內(nèi)間斷性接觸幾種天然交叉反應抗原的結(jié)果。
為了進一步評價既存效價的影響并研究血清陽轉(zhuǎn)率(定義為當對任一血清群的接種前效價＜1∶8時抗體效價獲得4倍升高的疫苗接受者比例)，對疫苗所含4種血清群中的任一種的接種前抗體效價＜1∶8的參與者進行單獨分析。就使用幼兔作為補體源的SBA測定法來說，＜1∶8的抗體效價被認為是代表不可檢測的循環(huán)抗體水平。當用此標準來評價參與者時，在接種TetraMenD后觀察到對血清群A的血清陽轉(zhuǎn)率為98.6％，對血清群C為87.9％，對血清群W-135為96.0％，對血清群Y為86.2％。
根據(jù)對軍隊新兵的觀測結(jié)果，Goldschneider提出，使用采用人補體源的SBA測定法得到的≥1∶4的最小效價與抗血清群C的、免遭侵襲性疾病的保護作用相關(guān)聯(lián)。但是，由于測定標準化的需要以及缺乏可靠的人類補體源，所以建議將幼兔補體作為備選來源。腦膜炎球菌似乎對幼兔補體比對人補體更敏感，產(chǎn)生更高的檢測抗體效價。一些作者建議，在使用幼兔補體測定時≥1∶128的效價預示著具有保護作用，而＜1∶8的效價預示著至少對血清群C有易感性。盡管該水平在評價多糖疫苗時可能是適合的，但其可能不適用于綴合疫苗。Borrow指出，在接受單價C綴合疫苗、表現(xiàn)出接種后SBA效價在8-64之間的受試者中，幾個月后使用降低劑量(10μg)的腦膜炎球菌多糖疫苗給予表現(xiàn)出記憶應答，這表明這些個體也受到了保護，抗體水平達到≥1∶128。對于接種TetraMenD疫苗并且針對每種血清群的SBA-BR效價≥1∶128的受試者結(jié)果列于表中。當對疫苗中所包含的每一種血清群都使用這些標準時，總體來說，接種TetraMenD的參與者有96.2％獲得≥1∶32的接種后SBA-BR效價，有90.5％獲得≥1∶128的效價。此臨床研究中的一部分血清還用于評價使用幼兔補體和人補體的SBA測定法間的關(guān)聯(lián)，結(jié)果在隨后的研究中提供。
在Menomune_組中抗血清群C、Y和W-135的總IgG反應明顯高于TetraMenD接種組。但是，在TetraMenD組中抗血清群A、C、Y和W-135的接種后SBA GMT水平明顯較高。
表B-9提供了依據(jù)血清群的GMC和GMT效價的比較。
綴合物產(chǎn)生的較低水平IgG卻產(chǎn)生了比多糖疫苗更高的殺菌活性水平，此觀察結(jié)果強有力地表明，綴合疫苗抗體反應的質(zhì)量和親和性優(yōu)于非綴合多糖疫苗產(chǎn)生的抗體反應。高親和性抗體與功能活性和記憶應答相關(guān)。該作用在一些已公開的研究中也可以見到。這些資料證實TetraMenD在2-10歲的兒童中是高免疫原性的，對于四個血清群中的每一種，在TetraMenD組中所觀察到的GMT均優(yōu)于Menomune組中所觀察到的GMT，并且所獲得的效價預示著具有保護作用。最后，看起來TetraMenD產(chǎn)生了針對疫苗中所包含的每一種血清群的更高親和性抗體反應。
在試驗過程中，在4個特定時間點監(jiān)測安全性報告即時反應(接種后30分鐘內(nèi))、接種后的前7天中訴求的局部和全身反應、接種后的28天時間內(nèi)的所有不良事件以及由0天至接種后6個月的持續(xù)AE(0-28天)和嚴重不良事件。
對于所有參與者，兩個處理組中所報告的大多數(shù)訴求的局部反應是輕微的，在接種3天內(nèi)消退。每一處理組的局部反應的頻率是相似的。在TetraMenD接受組中有58.8％報告了至少1種局部反應，而Menomune_接受組有58.3％報告了至少1種局部反應。此外，對青少年肌內(nèi)給予單價C CRM197綴合疫苗的經(jīng)驗表明，局部反應的比率與本研究中對TetraMenD所觀察到的局部反應比率非常相似。
大多數(shù)報告的AE是不嚴重的、可逆的并且與接種無關(guān)的。本研究中沒有報告新發(fā)支氣管哮喘、糖尿病或自身免疫病。
實施例12 研究C 對11-18歲的兒童進行1個月的研究 研究C是對0天接受單劑TetraMenD與單劑Menomune_的11-18歲健康兒童進行的隨機化陽性對照研究。在0天(接種前)和28天抽取血清并分析，如結(jié)果中所描述進一步評價一部分患者血清。
對于所有參與者，兩個處理組中報告的大多數(shù)訴求的局部反應是輕微的，在接種2天內(nèi)消退。TetraMenD接受組的局部反應頻率(72.4％)比Menomune_接受組(34.7％)更普遍。此結(jié)果可能是由于綴合疫苗(白喉載體蛋白質(zhì))的性質(zhì)而不是由于給藥途徑(肌內(nèi)給予)造成的。該研究的結(jié)果總結(jié)于下表。
表C-1顯示了基線期和28天時對每一血清群的SBA-BR抗體效價的頻率分布。
表C-2總結(jié)了按照受試者年齡及TetraMenD血清群的GMT水平。
表C-3顯示了從基線到28天時對血清群A、C、Y、W-135的SBA-BR效價具有≥4倍升高的參與者數(shù)量和百分比。對于每一種血清群，在TetraMenD組中的這些百分比都高于Menomune_組。
表C-3從基線到28天時SBA-BR效價具有≥4倍升高的參與者數(shù)量和百分比 SBA-BR抗體效價≥32的頻率 接種后28天時SBA抗體效價≥32的參與者比例總結(jié)于表C-4。
表C-4接種后28天SBA抗體效價≥32的參與者百分比和數(shù)量(符合方案人群) ％n/N。
_n接種后28天效價≥32的參與者數(shù)量。
_N該組中在28天時具有有效血樣的參與者總數(shù)。
SBA-BR抗體效價≥128的頻率 接種后28天SBA抗體效價≥128的參與者比例總結(jié)于表C-5。
表C-5接種后28天SBA抗體效價≥128的參與者百分比和數(shù)量(符合方案人群) ％以百分率表示的n/N。
_n接種后28天效價≥128的參與者數(shù)量。
_N該組中在28天具有有效血樣的參與者總數(shù)。
SBA-BR抗體效價具有≥4倍升高的參與者百分比 表C-6顯示了28天時SBA抗體效價由基線起具有≥4倍升高的參與者比例。
表C-628天時SBA抗體效價由基線起具有≥4倍升高的參與者百分比和數(shù)量 ％以百分率表示的n/N。
_n由基線效價起具有≥4倍升高的參與者數(shù)量。
_N所使用群體中的參與者總數(shù)。
在0天無法檢測到效價(＜8)的參與者在28天時SBA-BR效價獲得≥4倍升高的百分比 在兩個處理組以及對于所有疫苗血清群，在基線期具有不可檢測的SBA效價(＜8)的大部分參與者在28天時SBA效價獲得≡4倍升高。在0天SBA效價＜8的參與者從基線期到28天SBA效價具有≥4倍升高的比例在98.17％-100.0％的范圍內(nèi)(表C-7)。
表C-7在0天具有不可檢測效價(＜8)的參與者在28天時SBA-BR抗體效價獲得≥4倍升高的數(shù)量和百分比 *n＝在每一種血清群中0天時效價＜8且28天時效價≥32的參與者數(shù)量。
N＝在每一血清群中0天時效價＜8的參與者數(shù)量。
_百分比的確切95％置信區(qū)間 SBA-BR抗體GMT和平均升高倍數(shù) 表C-8顯示了基線期和接種后28天的SBA GMT以及SBA GMT的升高倍數(shù)。
表C-8基線期和接種后28天的SBA血清學結(jié)果(符合方案人群) *效價或升高倍數(shù)，其中升高倍數(shù)＝28天時效價/0天時效價。
_N計算所用的參與者總數(shù)。
血清群A、C、W-135和Y的ELISA IgG 表C-9顯示了基線期和接種后28天的IgG GMC(μg/mL)以及IgGGMC的升高倍數(shù)。
表C-9基線期和接種后28天的IgG血清學結(jié)果(符合方案人群) *效價或升高倍數(shù)，其中升高倍數(shù)＝28天時效價/0天時效價。
_N計算所用的參與者總數(shù)。
血清群A、C、Y和W-135的ELISA IgM 表C-10顯示了基線期和接種后28天時的IgM GMC以及IgMGMC的升高倍數(shù)。
表C-10基線期和接種后28天的IgM血清學結(jié)果(符合方案人群) 表C-10基線期和接種后28天的IgM血清學結(jié)果(符合方案人群) *效價或升高倍數(shù)，其中升高倍數(shù)＝28天時的效價/0天時的效價 _N計算所用的參與者總數(shù)。
接受本研究疫苗TetraMenD后28-56天，大多數(shù)參與者均經(jīng)歷了對疫苗中所含的每種血清群的SBA-BR抗體效價的≥4倍升高?？傮w來說，有90.7％的TetraMenD接受者經(jīng)歷了抗所有血清群的抗體效價的4倍升高。觀察到對血清群Y的接種前抗體水平高于對血清群C或W-135的接種前抗體水平。這可能與這樣一種事實相關(guān)即血清群Y是目前在美國與該年齡組中的侵襲性腦膜炎球菌性疾病相關(guān)的最常見血清群，對該血清群的天然暴露可能更普遍。較高的循環(huán)抗體水平反映了近期天然暴露的情況，并可能降低表現(xiàn)出4倍或更高抗體反應的疫苗接種者的比例。與其它血清群相比，這種現(xiàn)象看起來是血清群Y反應的情況。對于血清群Y，4倍升高的比例為81.8％，相比之下血清群C為91.7％，血清群W-135為96.7％。對血清群A也觀察到高接種前抗體水平。這可能是在延長的時間內(nèi)間斷性接觸幾種天然交叉反應抗原的結(jié)果。
為了進一步評價既存效價的影響并研究血清陽轉(zhuǎn)率(定義為當對任一血清群的接種前效價＜1∶8時抗體效價獲得4倍升高的疫苗接受者比例)，對疫苗中所含的4種血清群中的任一種的接種前抗體效價＜1∶8的參與者進行單獨分析。就使用幼兔作為補體源的SBA測定來說，＜1∶8的效價被認為是代表不可檢測的循環(huán)抗體水平。當用此標準評價參與者時，在接種TetraMenD后觀察到對血清群A的血清陽轉(zhuǎn)率為100％，對血清群C為98.1％，對血清群W-135為98.1％，對血清群Y為98.3％。
如先前在另一個研究中所討論的一樣，根據(jù)在軍隊新兵中的觀測結(jié)果，Goldschneider提出，使用采用人補體源的SBA測定得到的≥1∶4的最小效價與抗血清群C的、免遭侵襲性疾病的保護作用相關(guān)聯(lián)。但是，由于測定標準化的需要以及缺乏可靠的人類補體源，所以建議將幼兔補體作為備選來源。腦膜炎球菌似乎對幼兔補體比對人補體更敏感，產(chǎn)生更高的檢測抗體效價。一些作者提出，使用幼兔補體測定時≥1∶128的效價預示著具有保護作用，而＜1∶8的效價預示著至少對血清群C有易感性。盡管該水平在評價多糖疫苗時可能適合，但可能不適于綴合疫苗。Borrow指出，在顯示出8-64的接種后SBA效價的單價C綴合疫苗接受受試者中，幾個月后使用降低劑量(10μg)的腦膜炎球菌多糖疫苗給予表現(xiàn)出記憶應答，這表明這些個體也受到了保護，抗體水平達到≥1∶128。對每種血清群的SBA-BR效價≥1∶128的TetraMenD疫苗接受受試者的結(jié)果列于表中。當對疫苗中所含的每種血清群使用這些標準時，總體來說，接種TetraMenD的參與者有99.2％獲得了≥1∶128的接種后SBA-BR效價。
使用標準ELISA測定評價部分參與者的IgG和IgM反應。接種后，TetraMenD接種者對每一血清群的平均IgG抗體水平均＞2μg。在兩個處理臂中對每一血清群的IgM反應非常相似。Menomune_組中對血清群C、Y和W-135的IgG反應一般高于TetraMenD接受組。然而，對血清群C、Y和W-135的接種后SBA GMT水平在各個處理組中非常相似，表C-11。
表C-11IgG和IgM對總殺菌活性的相對貢獻 *GMC單位是μg/mL。
綴合物產(chǎn)生的較低水平IgG產(chǎn)生了與多糖疫苗相似水平的殺菌活性，此觀察結(jié)果強有力地表明，對綴合疫苗的抗體反應的質(zhì)量和親和性優(yōu)于多糖產(chǎn)生的抗體反應。正是高親和性抗體與功能活性和記憶應答相關(guān)。該作用在一些已公開的研究中也可以見到。
這些數(shù)據(jù)表明TetraMenD在青少年群體中是高免疫原性的。對于兩種疫苗中四個血清群中的每一個，GMT都基本相同，所達到的效價預示著存在保護作用，并且似乎TetraMenD針對疫苗中所含的每一種血清群都產(chǎn)生了較高親和性的抗體反應。
研究D 研究D是對0天接受單劑TetraMenD與單劑Menomune_的18-55歲健康成人進行的隨機化陽性對照研究。在0天(接種前)和28天抽取血清并分析。
一般來說，TetraMenD的安全性模式與Menomune相當，具體地說，報告的訴求局部反應(0-7天)、訴求全身反應(0天-)、未訴求的不良事件(0-28天)、未訴求的明顯不良事件和SAE(29天-6個月)以及嚴重不良事件(0天-6個月)的百分率均在Menomune所報告百分率的2-3％之內(nèi)。本研究的結(jié)果提供于下表。
SBA-BR抗體效價的分布 表D-1顯示了基線期和28天時各血清群的SBA-BR抗體效價的頻率分布。
表D-2提供了按照受試者年齡及TetraMenD血清群的幾何平均效價(GMT)的總結(jié)。
表D-3顯示了由基線期到28天時對血清群A、C、Y和W-135的SBA-BR效價具有≥4倍升高的參與者數(shù)量和百分比。在TetraMenD組中針對血清群A(1028/1278，80.4％)、C(1131/1278，88.5％)、Y(941/1278，73.6％)和W-135(1142/1278，89.4％)的數(shù)量和百分比與Menomune_組中針對血清群A(929/1099，84.5％)、C(985/1099，89.6％)、Y(872/1099，79.3％)和W-135(1036/1099，94.3％)的數(shù)量和百分比相當。
表D-3按照血清群*SBA-BR效價由基線起具有≥4倍升高的參與者數(shù)量和百分比 *檢定虛假設H0PMenomune_-PTetraMenD≥0.10對HaPMenomune_-PTetraMenD＜0.10 _n/Nn＝從基線效價起具有≥4倍升高的參與者數(shù)量/N＝符合方案人群的參與者總數(shù)。
_PTetraMenDTetraMenD組中SBA-BR接種后效價由基線起具有≥4倍升高的參與者百分比。
§PMenomune_Menomune_組中SBA-BR接種后效價由基線起具有≥4倍升高的參與者百分比。
SBA-BR抗體效價≥32的頻率 接種后28天SBA抗體效價≥32的參與者比例總結(jié)于表D-4。
表D-4接種后28天SBA抗體效價≥32的參與者百分比和數(shù)量(符合方案人群) *％＝n/N _n接種后28天時效價≥32的參與者數(shù)量/N該組在28天時具有有效血樣的參與者總數(shù)。
SBA-BR抗體效價≥128的頻率 接種后28天SBA抗體效價≥128的受試者比例總結(jié)于表D-5。
表D-5接種后28天SBA抗體效價≥128的參與者百分比和數(shù)量(符合方案人群) *％n/N。
_n接種后28天效價≥128的參與者數(shù)量。
_N該組在28天時具有有效血樣的參與者總數(shù)。
表D-6對通過基線共變量調(diào)整的GMT的處理作用的分析從0天到28天的效價差值的反應(符合方案人群)* *處理作用的反對數(shù)以2的所述處理作用(Menomune_-TetraMenD)次冪來計算。SBA-BR抗體效價具有至少4倍升高的參與者比例 表D-7顯示了在28天時SBA抗體效價由基線起具有≥4倍升高的參與者比例。
表D-7在28天時SBA抗體效價由基線起具有≥4倍升高的參與者的數(shù)量和百分比 *％n/N。
_n由基線效價起具有≥4倍升高的參與者數(shù)量。
_N各血清群中抽取血液的參與者數(shù)量。
在0天未檢測到效價(＜8)的參與者在28天時SBA-BR抗體效價獲得≥4倍升高的比例 表D-8顯示了在0天未檢測到效價(＜8)的參與者在28天時SBA-BR抗體效價獲得≥4倍升高的比例。在兩個處理組中并且對于所有疫苗血清群，大部分在基線期具有不可檢測(＜8)的SBA效價的參與者在28天時SBA效價獲得了≥4倍升高。在0天時SBA效價＜8的參與者從基線期到28天具有≥4倍升高的比例在TetraMenD組中為90.7％-100.0％，在Menomune_組中為96.9％-99.3％。
表D-8在0天時具有不可檢測效價(＜8)的參與者在28天時SBA-BR抗體效價獲得≥4倍升高的比例 *％n/N。
_n在每一血清群中0天時效價＜1∶8、28天時效價≥1∶32的參與者數(shù)量。
_N在每一血清群中0天時效價＜1∶8的參與者數(shù)量。
表D-9顯示了基線期和接種后28天的SBA GMT以及SBA GMT的升高倍數(shù)。
表D-9按照血清學的幾何平均抗體效價(GMT)和GMT升高倍數(shù)的總結(jié)(符合方案人群) *效價或升高倍數(shù)，其中升高倍數(shù)＝28天時效價/0天時效價。
_N每一血清群中抽取血液的參與者數(shù)量。注意有一個參與者沒有第二次血樣進行分析。
_根據(jù)正常分布的近似值計算GMT的95％CI。
接種本研究疫苗TetraMenD后28-56天，大多數(shù)參與者經(jīng)歷了對疫苗中所含每一血清群的SBA-BR抗體效價的≥4倍升高。對于血清群A、C、Y和W-135，抗體效價獲得≥4倍升高的TetraMenD接種者比例分別是80.4％、88.5％、73.6％和89.4％。觀察到對血清群Y的接種前抗體水平比對血清群C或W-135的接種前抗體水平高。這可能與這樣一種事實相關(guān)即血清群Y是目前在美國與該年齡組中的侵襲性腦膜炎球菌性疾病相關(guān)的最常見血清群，對該血清群的天然暴露可能更普遍。較高的循環(huán)抗體水平反映了近期天然暴露的情況，并可能降低表現(xiàn)出4倍或更高抗體反應的疫苗接種者的比例。與其它血清群相比，這種現(xiàn)象看起來是血清群Y反應的情況。針對血清群Y的4倍升高比例為73.6％，相比之下血清群C為88.5％，血清群W-135為89.4％。對血清群A也觀察到高接種前抗體水平。這可能是在延長的時間段內(nèi)間斷性接觸幾種天然交叉反應抗原的結(jié)果。
為了進一步評價既存效價的影響并研究血清陽轉(zhuǎn)率(定義為當對任一血清群的接種前效價＜1∶8時抗體效價獲得4倍升高的疫苗接種者比例)，對疫苗中所含的4種血清群中任一種的接種前抗體效價＜1∶8的參與者進行單獨分析。就使用幼兔作為補體源的SBA測定來說，＜1∶8的抗體效價被認為是代表不可檢測的循環(huán)抗體水平。當用此標準來評價參與者時，在接種TetraMenD后觀察到對血清群A的血清陽轉(zhuǎn)率為100％，對血清群C為99.4％，對血清群W-135為96.5％，對血清群Y為90.7％。
如先前在本文另一個研究中所討論的一樣，根據(jù)對軍隊新兵的觀測結(jié)果，Goldschneider提出，使用采用人補體源的SBA測定得到的≥1∶4的最小效價與抗血清群C的、免于感染侵襲性疾病的保護作用相關(guān)聯(lián)。建議將幼兔補體作為備選來源，但腦膜炎球菌似乎對幼兔補體比對人補體更敏感，產(chǎn)生更高的檢測抗體效價。一些作者建議，在使用幼兔補體測定時≥1∶128的效價預示著具有保護作用，而＜1∶8的效價預示著至少對血清群C有易感性。盡管該水平在評價多糖疫苗時可能適合，但可能不適于綴合疫苗。Borrow指出，在接受單價C綴合疫苗、表現(xiàn)出接種后SBA效價在8-64之間的受試者中，幾個月后使用降低劑量(10μg)的腦膜炎球菌多糖疫苗給予表現(xiàn)出記憶應答，這表明這些個體也受到了保護，抗體水平達到≥1∶128。當對疫苗中所含的所有血清群應用此標準時，針對血清群A、C、Y和W-135，接種后SBA-BR效價達到≥1∶128的TetraMenD接受參與者的百分率分別是99.8％、98.7％、96.9％和97.1％。
實施例13 研究E 在10-18歲兒童中進行的Td加強免疫研究 以就各自的破傷風和白喉效價而言具有可接受反應的參與者比例進行的測定為依據(jù)，本研究比較了在接受試驗性四價腦膜炎球菌白喉綴合疫苗TetraMenD并共同接受Td的組中的破傷風和白喉類毒素(Td)加強反應與在接受Td和安慰劑的組中的該反應。可接受反應定義為在接種后28天，在具有預定低接種前效價的參與者中由基線起至少4倍升高，在具有預定高接種前效價的參與者中由基線起至少2倍升高。
為了比較TetraMenD和Td共同給予時對血清群A、C、Y和W-135的抗體反應與Td疫苗給予后28天給予TetraMenD時的反應，測定了針對每一血清群的效價具有至少4倍升高的參與者比例。
本實驗是隨機、改良雙盲、陽性對照的多中心試驗，將總共1024位參與者隨機分入兩個處理組A和B之一。
選擇11-17歲的年齡范圍，以獲得那些一般應接受Td疫苗作為常規(guī)兒童免疫接種程序一部分的個體。此外，該年齡范圍人群已經(jīng)被確認為發(fā)生侵襲性腦膜炎球菌性疾病的高危人群，并會是腦膜炎球菌綴合疫苗一經(jīng)許可后最可能接種的候選人群。為了正確評價安全性，利用使用安慰劑對照的改良雙盲設計。第一次隨訪時，接種護士是非盲的，按照方案在每一手臂給予疫苗；TetraMenD(IM)或安慰劑接種于右臂，Td接種于左臂。第二次隨訪時，每一處理組均左臂接種疫苗。監(jiān)測局部和全身反應和不良事件的評價護士是不知情的。
選擇11-17歲的年齡范圍，以獲得那些一般應接受Td疫苗作為常規(guī)兒童免疫接種程序一部分的個體。此外，此年齡范圍人群已經(jīng)被確認為發(fā)生侵襲性腦膜炎球菌性疾病的高危人群，并會是腦膜炎球菌綴合疫苗一經(jīng)許可后最可能接種的候選人群。
在接種前0天(基線期)和第1次接種后28天，抽取用于血清學檢驗的血液樣品(至少5mL全血)。在第二次隨訪后28天從參與者第3次取血。在這些時間點中的每個時間點，分析血清的腦膜炎球菌血清群A、C、Y和W-135、抗白喉抗體以及抗破傷風抗體。
為了評價TetraMenD接種者的抗體功能，對所有可得樣品進行針對每一疫苗血清群的利用幼兔補體的SBA(SBA-BR)測定。一個免疫學終點是每一處理組中SBA-BR效價具有≥4倍升高的參與者比例。通過測試血清保護Vero細胞免受白喉毒素攻擊的能力來測定抗白喉抗體水平。通過間接酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)測量抗破傷風抗體水平。
本研究依據(jù)對GMT的檢測，對比了接受一劑TetraMenD的早前研究(研究C)參與者對TetraMenD血清群A、C、Y和W-135的抗體反應與接種Td后28天接受與Td共同給予的TetraMenD的參與者的反應。
用于血清學分析的血清樣品得自接種前基線期(0天)、接種后28天(窗口期+28天)和6個月。在接種前以及接種后28天檢測針對破傷風類毒素和白喉類毒素(Td)疫苗的抗體效價。
測定接種前和接種后28天所有可得血液樣品中抗腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、Y和W-135的SBA-BR抗體效價?？傮w上，組A和組B的安全性模式是相當?shù)?。該研究的結(jié)果總結(jié)于下表。
表E-1按照受試者年齡和血清群總結(jié)了GMT水平。
表E-2顯示了在28天時破傷風和白喉抗體具有至少4倍或2倍升高的參與者的數(shù)量和比例。
破傷風和白喉抗體效價以及抗血清群A、C、Y和W-135的SBA抗體效價 表E-2顯示了在28天時破傷風和白喉抗體具有至少4倍或2倍升高的參與者的數(shù)量和比例。對于破傷風和白喉，比例差異分別為2.78和-2.73。
表E-3顯示了28天時抗血清群A、C、Y和W-135的抗體效價具有至少4倍升高的參與者的數(shù)量和比例。
表E-4顯示了在基線期具有高白喉和破傷風效價的參與者數(shù)量以及在28天時具有2倍升高的參與者數(shù)量和比例。
表E-5顯示了在基線期具有低白喉和破傷風效價的參與者數(shù)量以及在28天時具有4倍升高的參與者數(shù)量和比例。
表E-6顯示了與TetraMenD或安慰劑共同給予破傷風和白喉接種后28天時破傷風和白喉抗體效價≥1.0 IU/ml的參與者的數(shù)量和比例。
表E-7顯示了在破傷風和白喉接種(與TetraMenD或安慰劑共同給予)后28天時對破傷風和白喉的幾何平均抗體效價(GMT)。
表E-8顯示了接種TetraMenD后28天時對血清群A、C、Y和W-135的SBA-BR的幾何平均抗體效價(GMT)。對于血清群A、C、Y和W-135，GMT比率分別是0.92、0.42、0.39和0.32。
表E-9顯示了在Td+TetraMenD，安慰劑組接種TetraMenD后28天時對血清群A、C、Y和W-135的SBA-BR的幾何平均抗體效價(GMT)，以及研究MTA02中的相應結(jié)果。對于血清群A、C、Y和W-135，GMT比率分別為0.48、0.38、0.34和0.39。
表E-10顯示了在Td+安慰劑，TetraMenD組接種TetraMenD后28天時對血清群A、C、Y和W-135的SBA-BR的幾何平均抗體效價(GMT)和研究MTA02中的相應結(jié)果。對于血清群A、C、Y和W-135，GMT比率分別是0.53、0.90、0.99和1.05。
表E-11顯示了符合方案人群中按照血清群的TetramenD接種后0天和28天時的SBA-BR抗體效價分布(SBA-BR效價＜8至1024)。
表E-12顯示了符合方案人群中按照血清群的TetramenD接種后0天和28天時的SBA-BR抗體效價分布(SBA-BR效價2048至524288)。
為了獲取與獲頒許可的Td疫苗同時給予的MCV-4疫苗的安全性和免疫原性，在健康的10-17歲青少年中進行相關(guān)研究。簡而言之，在多中心隨機試驗中，健康的10-17歲(平均年齡12.9歲)青少年同時(n＝509)或在相隔一個月的單獨隨訪時(n＝512)接種TetraMenD(MCV-4)+Td。在接種后8天和28天收集對分別給予和同時給予的這兩種疫苗的安全評價。通過抗白喉和破傷風的抗體效價以及抗腦膜炎球菌血清群的血清殺菌活性(SBA)，來評價接種前和接種后4周的免疫應答。對僅給予Td的受試者的安全性與給予Td+TetraMenD的受試者中的安全性相似。Td+TetraMenD的共同給予并不干擾對破傷風或者白喉類毒素的免疫應答。對四種血清群的SBA反應總結(jié)于下示表E-14。
表E-14對四種血清群的SBA反應 該研究表明，同時給予Td和TetraMenD是安全的，在所測試受試者中被良好耐受。同時給予TetraMenD+Td不會對針對破傷風和白喉類毒素的免疫應答產(chǎn)生不利影響。MCV-4與Td共同給予時增強對血清群C、Y和W-135多糖的免疫應答。該研究中所觀察到的增強免疫應答是令人驚訝和出乎意料的。
實施例14 對腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C、W-135和Y進行的用幼兔補體和用人補體的血清殺菌活性測定的比較 來自研究A中III期的一部分血清樣品用于本研究，以對比用針對血清群C、W-135和Y的SBA-BR效價所獲結(jié)果與SBA-HC效價所獲結(jié)果。入選本試驗的受試者至少為2歲，但尚不滿11歲，將每位受試者隨機指定入兩個疫苗組之一。在基線期(接種疫苗前)和接種后28天從每位受試者收集約5mL全血。在收集后4小時內(nèi)，將來自受試者的血液樣品離心。從血凝塊中取出血清，轉(zhuǎn)移至標記過的冷凍管并貯存于-20℃或更冷的溫度監(jiān)視冰箱中。本報告分析中使用的所有樣品均來自由入選臨床研究的第一批受試者所獲并具有足夠的血清量來完成全部計劃測試的成對血清。除了一個樣品來自一名4歲的受試者以外，其余所有樣品均來自2歲至3歲的受試者。有兩個受試者為意向治療類。其中一個來自TetraMenD疫苗組(接種后28天的血液樣品在24天時就收集了)，另一個來自Menomune_疫苗組(接種后28天的血液樣品在9天時就收集了)。
預篩選幼兔補體(Pel-Freez_，Clinical Systems LLC，Brown Deer，WI，產(chǎn)品編號31038)對每一血清群特異性測定的適宜性。適宜性標準包括與使用先前合格批次的兔補體對所限定部分的血清樣品(兩倍稀釋度內(nèi))獲得的SBA-BR檢測結(jié)果相一致。也可以使用滿足參考血清和對照樣品的預先確定效價的標準。將等份的2.5ml兔補體貯存于-70℃或更低溫度，直至準備使用。等份試樣一旦融化就要使用，否則廢棄。
通過ELISA篩選入選受試者血清的抗腦膜炎球菌多糖的IgG和IgM水平，并用SBA-BR測試功能性抗體，以鑒定用于SBA-H的潛在補體源。建立的選擇人類來源補體的標準如下(1)當以SBA-BR測定法測定時無可檢測抗體；(2)當在測定法中用作補體源時缺乏內(nèi)在殺菌活性；(3)當用作補體源與一組陰性對照一起使用時結(jié)果可接受，所述陰性對照使用之前由Ray Borrow博士在獨立外部實驗室確定的具有陰性測試結(jié)果的血清，和(4)用一組24個樣品測試時重現(xiàn)性可以接受。用于每一血清群特異性測定法的外源補體源來自不同受試者。沒有一種補體源用于超過一種血清群的測定。同樣，在SBA測定中使用的三個補體源對每一血清群而言來自單一供體。
血清群C 來自具有可接受的低ELISA值(對于IgG和IgM都小于0.5μg/ml)的幾個受試者的血清證實了殺菌活性。
血清群Y 用于血清群Y SBA-H的補體源選自入選收集方案的受試者。來自補體源的血清通過ELISA顯示出低水平的血清群YIgG和IgM抗體，在SBA-BR測定中是陰性的。當該來源的血清用于SBA時未顯示出內(nèi)在殺菌活性。
血清群W-135 用于血清群W-135 SBA-H的補體源選自入選收集方案的受試者。來自補體源的血清通過ELISA顯示出低水平的血清群W-135 IgG和IgM抗體，在SBA-BR測定中是陰性的。當該來源的血清用于SBA時未顯示出內(nèi)在殺菌活性。
血清殺菌測定 簡而言之，腦膜炎球菌血清群C、Y和W-135菌株得自美國疾病控制中心(Centers for Disease Control，Atlanta，GA(CDC))。由剛剛?cè)诨难迦篊、Y和W-135工作種子批料小瓶制備用于測定的細菌靶菌株。每瓶用于劃線接種Thayer Martin平板，于37℃±0.5℃、5％CO2條件下培養(yǎng)過夜。第二天，用無菌拭子收獲分離的菌落，并用于接種已預熱至室溫的新鮮Thayer Martin平板的整個表面。將平板于37℃±0.5℃、5％CO2下培養(yǎng)4小時，以獲取細菌生長匯合的亮菌幕，用無菌拭子收集亮菌幕，并懸浮于Dulbecco PBS+0.1％葡萄糖緩沖液中，直至規(guī)定的光密度(600nm吸光度)。用Dulbecco PBS+0.1％葡萄糖緩沖液制備含規(guī)定濃度細菌的工作液，工作液維持于室溫，在制備后30分鐘內(nèi)使用。
將測試樣品于56℃熱處理30分鐘，以失活內(nèi)源性補體。向96孔微量滴定板的所有孔中加入Dulbecco PBS+0.1％葡萄糖緩沖液，然后將測試血清以2倍連續(xù)稀釋度分配于板內(nèi)，留下最后兩列孔作為補體和血清對照孔。每塊板中的列都包括一個補體列([第11列]-血清/+補體)和一個血清對照列([第12列]+血清/-補體)。
將剛剛?cè)诨难a體與工作濃度的細菌混合，并將混合物分配入微量滴定板除血清對照孔之外的所有孔中。將未添加補體的細菌分配入血清對照孔中。蓋上滴定板，置于板振蕩器上1分鐘，然后轉(zhuǎn)移至37℃±0.5℃的CO2培養(yǎng)箱。對于血清群A測定板，培養(yǎng)時間是90分鐘，而對于血清群C、Y和W-135測定板，培養(yǎng)時間是60分鐘。培養(yǎng)后，向所有孔中小心加入100μl的50℃±1℃的瓊脂糖覆層培養(yǎng)基，避免形成氣泡。在室溫下將微量滴定板蓋板微微敞開(避免形成水蒸汽)10分鐘后，蓋上平板并轉(zhuǎn)移到干的(未加濕)5％CO2培養(yǎng)箱中，于37℃±0.5℃培養(yǎng)20±4小時。在此培養(yǎng)后，計數(shù)每孔中細菌菌落數(shù)。計算每個補體對照孔的菌落平均數(shù)，除以2得到T0時的50％存活率。
每一未知血清的殺菌效價表示為與T0時的50％存活率值相比產(chǎn)生≥50％致死的最末血清稀釋度的倒數(shù)。在SBA-BR中，樣品的起始稀釋度為1∶8稀釋度。對于SBA-H，如原測定法中所述，起始稀釋度降低至1∶4稀釋度。
表14-1提供了本文描述的用于血清群A測定的SBA-BR法與標準化的SBA法(CDC)以及Manchester Public Health Laboratory Services，Meningococcal Reference Unit，Manchester，UK(PHLS)所執(zhí)行的SBA法的對比。
表14-1血清殺菌活性測定方法比較 參考血清(CDC供體-R21654-3430107)得自CDC的GeorgeCarlone博士，為瓶裝凍干粉末，貯存于2-8℃，直至使用。需要時，每瓶用0.5ml無菌水再水化，并以100μl工作等份貯存于-80℃至-40℃。在這些條件下重新配制的參考血清效價是1∶256±1，這在針對血清群A、C、Y和W-135的標準化SBA-BR中為兩倍稀釋度。參考血清樣品在每天測定中的一組板的不同板中測定兩次。
對于血清群A、C、Y和W-135的群特異兔抗血清從Difco購得，為瓶裝凍干粉末，使用前貯存于2-8℃。需要時，每瓶用1ml無菌水再水化，并以50μl等份貯存于-80℃至-40℃，以用作SBA中的質(zhì)量控制樣品。
本文提供的使用幼兔補體的血清殺菌活性測定(SBA-BR)用于測定臨床血清樣品中對腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C、Y和W-135的補體介導型抗多糖殺菌活性，該血清殺菌活性測定的結(jié)果在精度、可稀釋性(線性)、特異性和檢測限度方面是完全有效的。為確立該測定的精度，使用同一組血清樣品在連續(xù)5天內(nèi)重復進行SBA-H測定(針對血清群C)。
SBA＝BR靈敏度和特異性的計算 使用1∶4和1∶8的SBA-H基準效價，將在SBA-BR中得到的效價分成真陽性(TP)(和假陽性[FP])以及真陰性(TN)(和假陰性[FN])。靈敏度按照TP/(TP+FN)來計算，特異性按照TN/(TN+FP)來計算。這些計算的結(jié)果以百分數(shù)表示。
SBA＝BR對SBA-H的SBA效價分布比較 免疫前和免疫后28天的SBA效價示于表1和表4(針對血清群C)、表2和表5(針對血清群Y)以及表3和表6(針對血清群W-135)。對比兩種補體源(BR對H)所獲得的結(jié)果分析免疫前和免疫后的SBA效價，該分析總結(jié)于下面的小節(jié)中。
血清群C的SBA效價分布 在101個免疫前血清樣品中，有63個依據(jù)＜1∶4的SBA＝H效價和＜1∶8的SBA-BR效價而被定義為陰性。有27個免疫前樣品用SBA-H測定時為陰性(＜1∶4)，但用SBA-BR測定時為陽性(≥1∶8)。使用＜1∶8的SBA-BR截止效價時假陽性率為30％。在較高SBA-BR截止效價時假陽性率降低，在1∶128的截止效價時降低至小于20％，在1∶512的截止效價時降低至小于10％。有7個樣品SBA-H測定陽性(≥1∶4)，而SBA-BR測定陰性(＜1∶8)。
在免疫后血清中，48個樣品為SBA-H陰性，僅有11個為SBA-BR陰性。SBA-BR測定為陰性的11個樣品中，有3個為SBA-H陽性。在綴合物組中的51個免疫后樣品中有17個(32％)為SBA-H陰性，但為SBA-BR測定陽性(≥1∶8)。對于多糖組，50個免疫后樣品中有23個(46％)為SBA-H陰性但SBA-BR效價為陽性(≥1∶8)。根據(jù)免疫后血清的陽性反應，101個樣品中有90個(89％)為SBA-BR陽性(≥1∶8)，但是101個中只有53個(52％)為SBA-H陽性(≥1∶4)。當比較得自兩個疫苗組的SBA效價(BR對H)時，發(fā)現(xiàn)它們的陽性反應率具有明顯差異。對于綴合物組中的51個免疫后樣品，51個中的33個(65％)為SBA-H陽性(≥1∶4)且SBA-BR陽性(≥1∶8)。在SBA-BR閾值效價為≥1∶64或更高時，SBA效價間(BR對H)的一致性提升。在多糖組的50個免疫后樣品中，50個中的17個(34％)為SBA-H陽性(≥1∶4)且SBA-BR陽性(≥1∶8)。當SBA-BR閾值效價為≥1∶512或更高時，SBA效價間(BR對H)的一致性提升。
血清群Y的SBA效價分布 與血清群C免疫前血清不同，血清群Y免疫前樣品僅有9個依據(jù)＜1∶4的SBA-H效價和＜1∶8的SBA-BR效價而被定義為陰性。在61個免疫前樣品中有52個為SBA-H陰性(＜1∶4)但SBA-BR陽性(≥1∶8)。使用＜1∶8的SBA-BR截止效價時假陽性率為85％。在較高的SBA-BR截止效價時假陽性率降低，在1∶256的截止效價時降低至小于15％，在1∶512時降低至小于2％。2個樣品為SBA-H陽性(≥1∶4)但SBA-BR陰性(＜1∶8)。
沒有SBA-H效價＜1∶4且SBA-BR效價＜1∶8的免疫后血清樣品。19個SBA-H陰性(＜1∶4)樣品為SBA-BR陽性(≥1∶8)。如對于血清群C所指出的，假陰性結(jié)果的比例有差異。在綴合物組中，48個樣品中有5個(9％)為SBA-H陰性(＜1∶4)但SBA-BR陽性。在多糖組中，52個樣品中有14個(27％)為SBA-H陰性(＜1∶4)但SBA-BR陽性。
免疫后血清對血清群Y的陽性反應的兩種SBA效價(BR對H)具有良好的一致性。對于整組的100個樣品，所有100個免疫后樣品均具有≥1∶8的SBA-BR效價，100個樣品中有81個具有≥1∶4的SBA-H效價。如對于血清群C的SBA反應所指出的，與多糖組所獲得的SBA效價(BR對H)相比，綴合物組的SBA效價(BR對H)間具有更好的相關(guān)性。在綴合物組的48個免疫后樣品中，有43個(90％)為SBA-H陽性(≥1∶4)且SBA-BR陽性(≥1∶8)。在48個樣品中只有一個具有小于1∶32的SBA-BR效價，且該樣品為SBA-H陽性(≥1∶4)。多糖組中SBA效價間(BR對H)的一致性沒有那么好。52個樣品中只有38個(73％)具有≥1∶4的免疫后SBA-H效價和≥1∶8的免疫后SBA-BR效價。在SBA-BR效價≥1∶128時，多糖組中免疫后血清的SBA效價間(BR對H)的一致性得到改善。
血清群W-135的SBA效價分布 對于血清群W-135，100個樣品中有54個(54％)為SBA-H效價＜1∶4且SBA-BR效價＜1∶8的陰性。在81個免疫前樣品中，有27個為SBA-H陰性(＜1∶4)但SBA-BR陽性(≥1∶8)。使用＜1∶8的SBA-BR截止效價時假陽性率為33％。在較高的SBA-BR截止效價時假陽性率降低，在1∶128的截止效價下降至小于15％，在1∶256的截止效價下降至小于5％。11個樣品為SBA-H陽性(≥1∶4)但SBA-BR陰性(＜1∶8)。
3個免疫后樣品為SBA-H陰性(＜1∶4)且SBA-BR陰性(＜1∶8)。39個免疫后樣品為SBA-H陰性(＜1∶4)但SBA-BR陽性(≥1∶8)。在綴合物組中，47個樣品中有11個(23％)為SBA-H陰性但SBA-BR陽性。在多糖組中，53個樣品中有28個(53％)為SBA-H陰性但SBA-BR陽性。
免疫后SBA-BR和SBA-H效價間的一致性與血清群C相當，但不如血清群Y好。如同血清群C和血清群Y這二者一樣，在比較兩個疫苗組時，兩種SBA效價間(BR對H)的一致性有顯著差異。與多糖組相比，綴合物組中兩種SBA效價間(BR對H)的一致性較好。在綴合物組的免疫后SBA效價中，47個樣品中有36個(77％)具有≥1∶4的SBA-H效價，并且全部樣品均為SBA-BR陽性(≥1∶8)。綴合物組所有樣品都具有≥1∶32的接種后SBA-BR效價。對于多糖組的免疫后效價，兩種效價間的相關(guān)性沒有那么好，53個樣品中僅有22個(42％)具有≥1∶4的SBA-H效價，53個中有50個(94％)具有≥1∶8的SBA-BR效價。
表1.對于血清群C，通過SBA-H測定為陽性和陰性的血清中的SBA-BR效價的比較 表2.對于血清群Y，通過SBA-H測定為陽性和陰性的血清中的SBA-BR效價的比較 表3.對于血清群W-135，通過SBA-H測定為陽性和陰性的血清中的SBA-BR效價的比較 表4.通過SBA-BR和SBA-H檢測的血清群C效價分布的總結(jié) 1樣品總數(shù)為101。
表5.通過SBA-BR和SBA-H檢測的血清群Y效價分布的總結(jié) 1樣品總數(shù)為100。
表6.通過SBA-BR和SBA-H檢測的血清群W-135效價分布的總結(jié) 1樣品總數(shù)為100。
SBA-BR和SBA-H效價的靈敏度和特異性比較 在進行兩組效價間的靈敏度和特異性評價時，將SBA-BR效價與1∶4和1∶8的SBA-H保護效價進行比較。在該分析中使用免疫前和免疫后兩種血清。使用1∶4和1∶8的SBA-H基準效價，計算對全部3個血清群的特異性和靈敏度，并總結(jié)于表7、9和10。依次討論對每一血清群的靈敏度和特異性的分析。
對于血清群C，相對于1∶4和1∶8兩個SBA-H效價，1∶8、1∶16和1∶32的SBA-BR閾值效價的靈敏度大于80％。但是，這些SBA-BR效價的特異性低于60％，在1∶64的SBA-BR效價時特異性增加超過60％，在1∶128的SBA-BR效價時特異性超過70％。對于后面的這兩個SBA-BR效價，其特異性開始降低。在1∶64的SBA-BR閾值效價時，靈敏度在75-78％之間，但在1∶128的SBA-BR效價時靈敏度降至62-65％之間。在SBA-BR效價＞1∶64時特異性繼續(xù)提升，范圍分別從1∶128時的73％升至1∶256時的83％。但是，靈敏度由43％降至不足20％。對于血清群C，在靈敏度和特異性間達到最佳平衡的SBA-BR效價在1∶32至1∶128的SBA-BR效價范圍內(nèi)。發(fā)現(xiàn)血清群C的靈敏度和特異性結(jié)果與Santos GF等，2001.Clin.Diagn.Lab.Immunol.8616-623通過不同組的血清樣品和試劑得到的結(jié)果(表8)相當近似。就Santos的結(jié)果而言，相對于1∶4和1∶8這兩個SBA-H效價，在1∶64至1∶128的SBA-BR效價之間觀察到靈敏度和特異性的最佳平衡。
表7.對于血清群C，在SBA-H保護效價時SBA-BR的靈敏度和特異性 表8.Santos等，2001.Clin.Diagn.Lab.Immunol.8616-623中所報道的，對于血清群C，在SBA-H保護效價時SBA-BR的靈敏度和特異性 對于血清群Y，當SBA-BR閾值效價在1∶8至1∶64的范圍內(nèi)時靈敏度最高，但正如所料，在更高的SBA-BR閾值效價時靈敏度降低。血清群Y的特異性結(jié)果開始時遠比血清群C的結(jié)果低，直到SBA-BR閾值效價為1∶128時特異性才達到高于50％的水平。對于血清群Y，靈敏度和特異性達到最佳平衡的SBA-BR效價處于1∶64至1∶256之間。在1∶256時，靈敏度降至大約55％，但特異性從30％區(qū)間的中段升至約82-83％。
表9.對于血清群Y，在SBA-H保護效價時SBA-BR的靈敏度和特異性 對于血清群W-135，靈敏度值更接近于血清群C所獲值，但對于所有三種血清群而言總體模式相同。靈敏度在1∶8的SBA-BR閾值效價時開始高，在效價≥1∶128時下降。同樣，特異性在1∶8的SBA-BR效價時開始低，在1∶256的效價時開始穩(wěn)定。如對血清群Y所觀察到的，對于血清群W-135，靈敏度和特異性之間達到最佳平衡的SBA-BR處于1∶64和1∶256之間。
表10對于血清群W-135，在SBA-H保護效價時SBA-BR的靈敏度和特異性 表11總結(jié)了使用幼兔補體或人補體時針對血清群C、Y和W-135的SBA效價相對于免疫后SBA效價升高達4倍的比例。分別對綴合物組(TetraMenD)和多糖組(Menomune_)進行該分析，兩組分析都納入表11中。當比較兩個疫苗組中所誘導的針對三個血清群的殺菌反應時，在四-四升高模式中存在一些可觀察到的差異。依次討論對于每一血清群和兩個疫苗組的反應模式. 表11通過SBA-BR和SBA-H測定的腦膜炎球菌多糖效價升高4倍的分層比較比率1 1此表顯示為SBA效價升高達4倍的比率(和百分比)，所述SNA效價以SBA-BR效價、疫苗和血清群分層次進行的每一測定(來自免疫前和免疫后28天的成對樣品)來測定。
對于血清群C，綴合物組SBA-BR對SBA-H之間的4倍升高密切一致。在此疫苗組內(nèi)似乎有這樣一種趨勢在低免疫后效價如1∶32-1∶128時，SBA-H的4倍升高滯后于SBA-BR中的4倍升高。但是，當免疫后SBA-BR效價≥1∶256時，SBA-H獲得4倍升高的受試者數(shù)量看起來多于SBA-BR獲得4倍升高的受試者數(shù)量。對比兩種補體源，升高倍數(shù)的這種差異較小，這可能歸因于較高免疫前SBA-BR效價，這改變了SBA-BR獲得4倍升高的百分率。對于多糖組，SBA-BR和SBA-H間4倍升高的一致性不如綴合物組那樣相近。另外，沒有明顯趨勢表明在較高免疫后SBA-BR效價時SBA-H的4倍升高變得比綴合物組所觀察到的更為靈敏。
對于血清群Y，兩個疫苗組中SBA-H和SBA-BR的4倍升高間的一致性非常接近。對于血清群C，與免疫后SBA-BR效價相比，兩個疫苗組中任一個的免疫后SBA-BR效價很少低于1∶32。因為該原因，與血清群C相比，對于血清群Y達到SBA-BR和SBA-H均升高達4倍的受試者比例出現(xiàn)在較高的免疫接種后SBA-BR效價。對于血清群Y，免疫后SBA-BR效價為1∶128時綴合物組的4倍升高比例增加至≥50％，而對于血清群C，綴合物組的SBA-BR閾值效價是1∶32。
與其它兩種血清群相比，對于血清群W-135，SBA-H和SBA-BR的4倍升高之間的一致性不夠接近。如對血清群Y所觀察到的，對于兩個疫苗組中的任一個，只有有限數(shù)量受試者的免疫后SBA-BR效價小于1∶32。在SBA-BR效價≥1∶256時，SBA效價4倍升高(BR對H)間存在一致性。如對血清群C所提到的，兩個疫苗組之間4倍升高(BR對H)的比例存在差異，這種差異對血清群Y不太明顯。與多糖疫苗所獲其它兩種血清群的SBA效價(BR對H)的4倍升高相比，多糖組中血清群W-135 SBA效價(BR對H)中4倍升高間的一致性是最差的。
為了測定用獲頒許可的四價腦膜炎球菌多糖疫苗(Menomune_)或者用試驗性四價腦膜炎球菌多糖綴合疫苗(TetraMenD)接種的2-3歲受試者血清樣品的效價，將使用幼兔補體的血清殺菌活性測定(SBA-BR)與相應的使用人補體的SBA(SBA-H)相比較。對用于血清群C、Y和W-135的人補體源進行鑒定過，并將其用于支持SBA中的該比較。通過2種方法分析該比較研究的SBA結(jié)果。在一種方法中，通過測定兩個疫苗組的免疫前和免疫后效價得到SBA-BR和SBA-H數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)合并用于分析。在第二種方法中，對來自兩個疫苗組的免疫前和免疫后效價分別進行分析。該研究的目標之一是描述與陰性SBA-H血清效價具有最佳相關(guān)性的SBA-BR血清效價。第二個目標是確定與測定中使用人補體的陽性效價具有最佳相關(guān)性的使用幼兔補體的效價，作為抗血清群C的保護作用之相關(guān)物，并外推至對于血清群Y和W-135的保護性殺菌效價。其它實驗室已經(jīng)公布了嘗試建立針對血清群C的SBA-BR之保護性閾值相關(guān)物的結(jié)果。本研究的結(jié)果將與那些公布的結(jié)果相對比。最后，針對兩種補體源，對比在免疫前和免疫后血清中檢測的SBA效價的4倍升高。
僅僅針對血清群C建立了SBA效價與對抗疾病的保護作用之間的關(guān)聯(lián)。在SBA測定中使用人補體確定針對血清群C的保護作用的SBA關(guān)聯(lián)性。對于其它血清群，假設針對血清群C的保護作用的SBA-H關(guān)聯(lián)性(SBA效價為1∶4)對其它血清群同樣適用。對與1∶4的抗血清群C SBA效價相關(guān)聯(lián)的SBA-BR效價的確定在血清群間可能有差異。就確定與陰性SBA-H血清效價最佳關(guān)聯(lián)的SBA-BR效價來說，＜1∶8的SBA-BR效價好比是免疫前和免疫后血清中＜1∶4的SBA-H效價。使用＜1∶8的SBA-BR效價部分地基于WHO/CDC的血清群C SBA效價(BR對H)比較研究的結(jié)果，以及部分地基于以下最新研究結(jié)果＜1∶4的SBA-BR效價與英國大學爆發(fā)的血清群C疾病的易感性相關(guān)(Jones，G.R.等，2000.J.Infect.1811172-1175)。
根據(jù)本研究得到的SBA效價(BR對H)，對于血清群C使用＜1∶8的SBA-BR截止效價的假陽性率為30％。使用較高的SBA-BR截止效價如下改善了假陽性率在≥1∶16時假陽性率降至26％，在≥1∶32時假陽性率降至24％，在≥1∶64時假陽性率降至22％，在≥1∶128時假陽性率降至18％，在≥1∶256時假陽性率降至14％，在≥1∶512時假陽性率降至2％。升高SBA-BR截止效價的確可用于改善確定對應于＜1∶4的SBA-H效價的陰性效價的準確性，但是當使用較高的SBA-BR截止效價時，區(qū)分陽性反應和陰性反應的靈敏度低得多。本報告的資料表明，當截止效價為1∶8、1∶16或1∶32時，SBA-BR的靈敏度最高(81-84％)。SBA-BR效價大于1∶32時，其靈敏度降至低于80％。但是，當截止效價為1∶8、1∶16和1∶32時，該測定法的特異性為最低，范圍在51-58％之間。在選擇與人補體測定中的陰性效價相關(guān)聯(lián)的截止效價時，要在靈敏度、特異性和假陽性率之間取得平衡。指定1∶32作為SBA-BR截止效價將導致不必要地舍棄真陽性應答者。該研究結(jié)果表明，≥1∶16的SBA-BR效價可能是更合適的截止效價。根據(jù)WHO/CDC的研究分析(＜1∶8)和英國大學爆發(fā)分析(＜1∶4)，該效價之上至少2倍稀釋度被看作是保護性的。
用于血清群W-135和Y的測定法中的保護性截止效價的鑒別來自這樣一種假設殺菌抗體保護作用類似于血清群C疾病和對應于人補體測定中陰性效價的殺菌效價。對于血清群Y，使用＜1∶8的SBA-BR截止效價的假陽性率相當高，達到85％，相比之下對血清群C為30％。但是，和血清群C一樣，增加SBA-BR截止效價可降低假陽性率。SBA-BR截止效價為1∶16時假陽性率降至84％，在1∶32時假陽性率是75％，在1∶64時假陽性率是61％，在1∶128時假陽性率是38％，在1∶256時假陽性率是13％，在1∶512時假陽性率是2％。盡管血清群Y的假陽性率在開始時比血清群C高很多，但是當截止效價≥1∶128時，兩種血清群測定中的假陽性率就變得相當接近了。然而，如此高的截止效價可能夸大了陽性反應的閾值效價。根據(jù)靈敏度和特異性分析，當SBA-BR截止效價為1∶8-1∶32時靈敏度最大化，其中靈敏度在95-98％的范圍內(nèi)。但是，和血清群C一樣，在這些SBA-BR效價時特異性相應地較低，范圍為11-18％。當SBA-BR效價為次高(1∶64)時，靈敏度從95％降至88％，但特異性急劇升至35％。在血清群Y測定中＜1∶64的截止效價與人補體測定中的陰性效價似乎最相當。
對于血清群W-135，在＜1∶8的SBA-BR截止效價時假陽性率為33％，這與血清群C相似。就像對血清群C和Y這二者所提到的一樣，在較高的SBA-BR截止效價時，假陽性率降至較低水平。當SBA-BR截止效價為1∶16時假陽性率降至32％，在1∶32時假陽性率降至28％，在1∶64時假陽性率降至26％，在1∶128時假陽性率降至12％，在1∶256時假陽性率降至4％，在1∶512時假陽性率最小，為0％。SBA-BR效價范圍在1∶8-1∶64之間時靈敏度最高(86％-81％)。正如所料，在此SBA-BR效價范圍內(nèi)特異性最低(46％-52％)。盡管血清群W-135的假陽性率開始時比血清群Y低很多，但是與人補體測定的陰性效價最相當?shù)慕刂剐r是＜1∶64。
對于三個血清群，已經(jīng)確定了對應于人補體測定中陰性效價的效價，對超過這些水平的SBA-BR效價進行了認作陽性反應的閾值效價分析。對于血清群C，陽性反應的閾值效價是≥1∶16，對于血清群Y，陽性反應的閾值效價是≥1∶64，對于血清群W-135，陽性反應的閾值效價是≥1∶64?？雌饋韺τ谘迦篊來說，≥1∶128的SBA-BR閾值效價提供了良好保證，即相對于1∶4或1∶8的SBA-H效價獲得了保護性效價，并且保護性效價與血清群C的1∶4的有效SBA-H效價相關(guān)聯(lián)。此閾值效價與對血清群C的WHO/CDC數(shù)據(jù)集和Santos的數(shù)據(jù)集進行的分析非常相近。就象這兩個研究中提到的那樣，效價≥1∶128高度預示著具有保護作用，但是SBA-BR效價小于1∶128可能也具有保護性。對于WHO/CDC和Santos的數(shù)據(jù)集，1∶8、1∶16、1∶32、1∶64的SBA-BR效價被稱為不確定效價。因為對于本文提出的血清群C的數(shù)據(jù)集而言，小于1∶16的SBA-BR效價被視為陰性，該分析的不確定效價為1∶16-1∶64，而1∶16-1∶64的效價是另外兩個研究的一部分。在所有的這些分析中，正在對SBA-BR效價與二十世紀60年代所收集的天然保護性數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)的SBA-H效價(1∶4或1∶8)進行比較。
最近，人們一直努力將單價血清群C綴合物的英國效力數(shù)據(jù)同SBA-BR效價直接聯(lián)系起來(Miller E等，2002，Vaccine 20S58-S67)。在此分析中，發(fā)現(xiàn)≥1∶8和≥1∶128的SBA-BR效價與迄今針對接種該單劑單價血清群C綴合物的15-17歲受試者所收集的效力數(shù)據(jù)有很好的相關(guān)性。但是，當Miller及其同事對幼兒組(12-30月齡)進行相同分析時，他們發(fā)現(xiàn)≥1∶8的SBA-BR效價與效力之間有很好的一致性，但是當SBA-BR效價≥1∶128時沒有如此接近的一致性。Miller于2002年9月1-6日在挪威奧斯陸舉行的第13屆國際致病性奈瑟菌屬(Neisseria)大會(the 13th International Pathogenic Neisseria Conference)上提供了另外的數(shù)據(jù)，其中在接種后一個月達到SBA-BR效價≥1∶64的受試者的預測效力處于對該年齡組所觀察到的效力的95％置信區(qū)間之外。這些數(shù)據(jù)有助于支持這樣一種觀點1∶8-1∶64的不確定區(qū)域內(nèi)的SBA-BR效價可保證有保護作用。根據(jù)該研究的分析，1∶16-1∶64的SBA-BR效價同樣可為抗血清群C的保護作用提供保證。
在1∶64的SBA-BR效價時，血清群Y測定的特異性僅為35％，但是當截止效價升高到1∶128和1∶256時，特異性分別升高至59％和84％?！?∶256的閾值效價為在人補體測定中有1∶4和1∶8的保護性效價提供了良好保證。但是，對于血清群Y，在1∶128的閾值效價時，靈敏度和特異性達到了較好的平衡。與已和SBA-H保護效價相關(guān)聯(lián)的血清群C的1∶16-1∶64 SBA-BR效價的相應范圍相比，血清群Y的1∶64-1∶128 SBA-BR效價范圍代表了效價的不確定范圍。
在1∶64的SBA-BR效價時，血清群W-135測定具有的特異性為52％，但是當效價升高到1∶128和1∶256時，特異性分別升高至64％和77％。和血清群Y一樣，≥1∶256的閾值效價為人補體測定中1∶4和1∶8的保護性效價提供了良好保證。與血清群Y一樣，當對于血清群W-135閾值效價為1∶128時，靈敏度和特異性達到了較好平衡。與和本研究中的SBA-H保護效價相關(guān)聯(lián)的血清群C的1∶1 6-1∶64SBA-BR效價范圍相比，血清群W-135的1∶64-1∶128 SBA-BR效價范圍代表了效價的不確定范圍。
對每一血清群計算了殺菌效價的4倍升高，并且使用兩種測定法按照疫苗組分別進行分析。一般來說，有跡象表明，對于全部三種血清群，當免疫后SBA-BR效價較高時，檢測到較高的SBA效價(BR和H)的4倍升高比例。依照血清群和疫苗組計，SBA效價(BR對H)的4倍升高比例皆有差異。對于血清群C，當免疫后SBA-BR效價較低時，與使用幼兔補體之測定中的效價相比，使用人補體測定中的4倍升高比例似乎較低。然而，當免疫后SBA-BR效價較高時，使用人補體之測定中的效價4倍升高比例看起來較高。該模式似乎提示，在免疫后SBA-BR效價低時，使用人補體時的測定靈敏度低于使用幼兔補體的情況，但在免疫后SBA-BR效價高時，情況相反，也就是說，使用人補體的測定法變得更靈敏。當測定樣品來自多糖疫苗組時，這種模式不明顯。當在測定中使用人補體時，這些樣品中效價的4倍升高比例似乎較低。盡管還無法解釋樣品類型間出現(xiàn)的這種觀察結(jié)果，但這的確表明對于含低效價殺菌活性的血清樣品，使用人補體進行的測定缺乏靈敏度。
對于血清群Y，在對比兩種補體源時發(fā)現(xiàn)SBA效價的4倍升高有良好一致性。與多糖組相比，綴合物組中SBA效價(BR和H)的4倍升高比例稍高，但是這種差異不如血清群C所示的大。
對于血清群W-135，在針對兩個疫苗組中任一個的測定中，使用人補體或幼兔補體時SBA效價4倍升高之間的一致性不如用其它兩種血清群測定獲得的結(jié)果好。這兩個疫苗組的SBA-BR效價的4倍升高非常好，但是SBA-H效價4倍升高的比例比其它兩個血清群低。在多糖組中SBA-H的4倍升高比例相當?shù)停⑶冶容^而言比其它兩個血清群SBA-H效價的4倍升高比例都低。
使用BR補體的SBA效價4倍升高已經(jīng)成為注冊腦膜炎球菌多糖疫苗的基準。最近，人們已努力將SBA-BR效價的4倍升高與臨床效力結(jié)合起來，此臨床效力來自英國對單價血清群C綴合物注冊后的監(jiān)視資料(Borrow R等，2001，Infect.Immun.691568-1573)。根據(jù)本分析，單價血清群C綴合物在12-30月齡幼兒中的效力在第一劑后的16個月內(nèi)估計為88％(69-95％)。對于該年齡組，在單劑單價C綴合疫苗后，SBA-BR效價獲得4倍升高的受試者比例為89-100％。
文中提供的SBA-BR資料提供了殺菌效價值，其與使用人補體作為針于血清群C的測定法中的補體源所獲值相當。因此，這些SBA-BR效價與確定對血清群C腦膜炎球菌性疾病的保護性免疫的替代物的初步研究相關(guān)，并支持將文中提供的臨床結(jié)果外推至保護作用，對血清群C的SBA-BR效價與其它實驗室報道的那些結(jié)果相當。通過與血清群C模型的類比，使用人補體的SBA在確定針對血清群Y和W-135莢膜多糖的血清群特異性反應中的表現(xiàn)，支持SBA-BR在測定抗血清群Y和W-135殺菌效價方面的相關(guān)性。
實施例15 TetraMenD(MenomuneTM)和Typhim Vi_在成人中的共同給予 本實施例描述了在美國的18-55歲健康人中進行的、單獨給予或與已獲頒許可的Typhim Vi_疫苗共同給予TetraMenD的改良雙盲安全性和免疫原性2b期研究中獲得的結(jié)果。
Typhim Vi_在美國可商購。每0.5ml劑量的Typhim Vi_含25μg純化的Vi多糖、等滲的磷酸緩沖鹽水和加入作為防腐劑的0.25％苯酚。Typhim Vi_疫苗還包含殘留的聚二甲基硅氧烷或脂肪酸酯消泡劑。共有945名參與者入選該研究。簡單地講，將研究參與者隨機分入兩個治療組中的任一個；A組在第一次隨訪時共同接受MenactraTM和Typhim Vi_，在28天后的第二次隨訪時接受鹽水安慰劑；B組在第一次隨訪時接受Typhim Vi_和安慰劑，在28天后的第二次隨訪時接受MenactraTM。共有469名參與者入選A組，476名參與者入選B組。
在本研究中有兩個主要的免疫原性目標。第一個目標是描述和對比各個研究組中接種后28天給予1劑Typhim Vi_后的抗體反應。如果B組達到抗體水平＞1.0mg/mL的接受者比例減去A組的該比例的差值低于10％，則A組參與者中針對Typhim Vi_的抗體反應應被看作類似于B組針對Typhim Vi_的抗體反應。選擇＞1.0μg/mL的抗Vi抗體水平作為初免血清學終點，因為該抗體水平被看作是保護性的。兩個主要目標中的第二個是描述和對比接種后28天MenactraTM接受者中針對4個血清群中每一個的SBA抗體反應。參與者按照年齡、性別和人種在兩個研究組之間平均分配。69％的參與者為女性，全部受試者的平均年齡為31歲。符合方案人群在A組中有432人(92.1％)滿足納入符合方案人群(per protocol population)的標準，B組為439人(92.2％)。
1.免疫原性結(jié)果 用Typhim Vi_疫苗接種后28天，A組81.6％的參與者和B組78.5％的參與者獲得＞1.0μg/mL的抗體水平。結(jié)果概述于下表1。
表1 在Typhim Vi_接種后28天時Typhoid Vi抗體效價＞1.0μg/mL的參與者百分率(符合方案人群體) 在使用雙側(cè)I型誤差率α＝0.05和10％界限的情況下，Typhim Vi_當與MenactraTM共同給予時，針對Typhim Vi_的抗體反應類似于單獨給予Typhim Vi_時的對應反應(圖1)。這些結(jié)果與基于Typhim Vi_單獨給予或連同其它普通的四價疫苗(包括多糖腦膜炎球菌和甲肝疫苗)一起給予時文獻中報告的血清陽轉(zhuǎn)率的預期值一致。圖1顯示了來自這些研究的結(jié)果在成人中于第28天時用＞1.0μg/ml的TyphimVi抗體效價測試時差值百分率的95％CI(％Typhim Vi+安慰劑，Menactra-％Typhim Vi+Menactra，安慰劑)。
圖2表明，Menactra與Typhim Vi_共同給予時A組SBA抗體效價獲得4倍升高的參與者比例，與在Typhim Vi_接種后1個月給予Menactra時在B組表現(xiàn)出的比例相當(符合方案人群)。在使用雙側(cè)I型誤差率α＝0.05和10％界限的情況下，當MenactraTM與TyphimVi_共同給予時針對MenactraTM的抗體反應類似于單獨給予MenactraTM時的對應反應(圖3)。
2.GMT 加入觀察目標，以比較入選健康成人的獨立安全性和免疫原性試驗的參與者中對MenactraTM反應的GMT和本實驗中兩個研究組的Menactra接受者的GMT。將在第二個(secondary)免疫原性假設中使用的相同標準應用于此比較。在每種情況下，有利地將在安全性和免疫原性研究(MTA09)參與者中針對各個血清群的GMT與本試驗中A組或B組中任一組的MenactraTM接受者的GMT相比較。對任一血清群而言，GMT比率的97.5％置信上限(其等同于雙側(cè)95％置信上限)決沒有超過2。另外，對于全部4個血清群來說，兩個研究組中95％以上的參與者都表現(xiàn)出高于保護水平的抗體效價(圖4)。
監(jiān)視研究參與者接種后30分鐘的即時反應以及接種后7天中的局部和系統(tǒng)性反應原性。事先確定的不良事件包括局部反應(例如紅斑、腫脹、硬化和疼痛)和系統(tǒng)癥狀(例如通過口部溫度檢測的發(fā)熱、頭疼、疲勞、寒戰(zhàn)、關(guān)節(jié)痛、厭食、嘔吐、腹瀉、癲癇發(fā)作、不適和皮疹)，其在每次接種后評價。這些事件每天記錄在日記卡上，還通過每次接種后8天的電話訪問由研究人員收集。如果報告有皮疹，則提醒研究人員在單獨的病例記錄表上記錄額外的細節(jié)。其它的非嚴重的、預料外不良事件通過在每次接種后8天和20天的電話訪問獲得。在整個研究過程中報告和記錄嚴重不良事件。研究表明，與其它疫苗如Typhim Vi_共同給予MenactraTM是安全的，不會使嚴重不良反應率顯著增加。
這些數(shù)據(jù)表明，MenactraTM在單獨給予或與旅行疫苗Typhim Vi_共同給予時在成年人群中是高度免疫原性的。當這些數(shù)據(jù)應用于主要假設時，滿足所有標準。
權(quán)利要求
1.一種多糖-蛋白質(zhì)綴合物，其中綴合物包含綴合至一種或多種載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清群A、C、W-135或Y的莢膜多糖，組合物包含平均大小低于100,000道爾頓的0.5-15μg/ml的每種英膜多糖。
2.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述莢膜多糖衍化至5,000-75,000道爾頓的平均大小。
3.權(quán)利要求2的綴合物，其中所述莢膜多糖衍化至7,000-50,000道爾頓的平均大小。
4.權(quán)利要求3的綴合物，其中所述莢膜多糖衍化至8,000-35,000道爾頓的平均大小。
5.權(quán)利要求4的綴合物，其中所述莢膜多糖衍化至12,000-25,000道爾頓的平均大小。
6.權(quán)利要求5的綴合物，其中所述莢膜多糖衍化至15,000-22,000道爾頓的平均大小。
7.權(quán)利要求1的綴合物，其中衍生多糖與載體蛋白的平均比率為約1∶1至約1∶20(重量/重量)。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中衍生多糖與載體蛋白的平均比率為約1∶2至約1∶10(重量/重量)。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中衍生多糖與載體蛋白的平均比率為約1∶2至約1∶6(重量/重量)。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中衍生多糖與載體蛋白的平均比率為約1∶(4±1)(重量/重量)。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中衍生多糖與載體蛋白的平均比率為約1∶(4±0.5)(重量/重量)。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中衍生多糖與載體蛋白的平均比率為約1∶(4±0.25)(重量/重量)。
13.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述載體蛋白包含細菌毒素或類毒素或細菌外膜蛋白。
14.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述載體蛋白包含白喉毒素、白喉類毒素、CRM197、破傷風類毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST、外毒素A、外膜復合體c(OMPC)、孔蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附素蛋白質(zhì)(PsaA)、卵清蛋白、匙孔_血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(PPD)。
15.權(quán)利要求14的綴合物，其中所述載體蛋白包含白喉毒素、白喉類毒素、CRM197、破傷風類毒素、外毒素A或外膜復合體c(OMPC)。
16.權(quán)利要求15的綴合物，其中所述載體蛋白包含白喉毒素、白喉類毒素或CRM197。
17.權(quán)利要求16的綴合物，其中所述載體蛋白包含白喉毒素或白喉類毒素。
18.權(quán)利要求17的綴合物，其中所述莢膜多糖衍化至8,000-35,000道爾頓的平均大小。
19.權(quán)利要求17的綴合物，其中衍生多糖與載體蛋白的平均比率為約1∶2至約1∶10(重量/重量)。
20.權(quán)利要求19的綴合物，其中衍生多糖與載體蛋白的平均比率為約1∶(4±1)(重量/重量)。
21.一種含多糖-蛋白質(zhì)綴合物的組合物，其中綴合物包含綴合至一種或多種載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的兩種或多種莢膜多糖，所述組合物包含平均大小低于100,000道爾頓的0.5-15μg/ml的每種莢膜多糖。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中所述莢膜多糖衍化至5,000-75,000道爾頓的平均大小。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中所述莢膜多糖衍化至7,000-50,000道爾頓的平均大小。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述莢膜多糖衍化至8,000-35,000道爾頓的平均大小。
25.權(quán)利要求24的組合物，其中所述莢膜多糖衍化至12,000-25,000道爾頓的平均大小。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述莢膜多糖衍化至15,000-22,000道爾頓的平均大小。
27.權(quán)利要求21的組合物，其中每種衍生多糖與載體蛋白的平均比率為約1∶1至約1∶20(重量/重量)。
28.權(quán)利要求27的組合物，其中每種衍生多糖與載體蛋白的平均比率為約1∶2至約1∶10(重量/重量)。
29.權(quán)利要求28的組合物，其中每種衍生多糖與載體蛋白的平均比率為約1∶2至約1∶6(重量/重量)。
30.權(quán)利要求29的組合物，其中每種衍生多糖與載體蛋白的平均比率為約1∶(4±1)(重量/重量)。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中每種衍生多糖與載體蛋白的平均比率為約1∶(4±0.5)(重量/重量)。
32.權(quán)利要求31的組合物，其中每種衍生多糖與載體蛋白的平均比率為約1∶(4±0.25)(重量/重量)。
33.權(quán)利要求31的組合物，其中所述組合物為液體。
34.權(quán)利要求33的組合物，所述組合物在每毫升液體中包含約0.5至約15μg血清群A、C、W-135或Y的腦膜炎奈瑟氏球菌衍生多糖。
35.權(quán)利要求33的組合物，所述組合物在每毫升液體中包含約0.5至約15μg血清群W-135或Y的腦膜炎奈瑟氏球菌衍生多糖。
36.權(quán)利要求31的組合物，其中所述載體蛋白為白喉毒素或類毒素。
37.權(quán)利要求36的組合物，所述組合物進一步包含佐劑。
38.權(quán)利要求37的組合物，其中所述佐劑包括氫氧化鋁、磷酸鋁或其組合。
39.權(quán)利要求31的組合物，其中所述組合物包含磷酸鈉、氯化鈉或其組合。
40.免疫人類患者以對抗腦膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括給予所述人類患者權(quán)利要求21-39的組合物。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述組合物包含白喉、破傷風、百日咳FHA、百日咳PT或PRP的抗原。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述權(quán)利要求21的組合物是第一組合物，在給予第一組合物后的6個月內(nèi)給予第二組合物，所述第二組合物包含白喉、破傷風、百日咳FHA、百日咳PT或PRP的抗原。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述包含白喉、破傷風、百日咳FHA、百日咳PT或PRP的抗原的第二組合物在給予所述第一組合物后的3個月內(nèi)給予人類患者。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述包含白喉、破傷風、百日咳FHA、百日咳PT或PRP的抗原的第二組合物與所述第一組合物的給予一起共同給予給予人類患者。
45.權(quán)利要求40的方法，其中所述人類患者在60歲以下。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述人類患者在35-60歲之間。
47.權(quán)利要求45的方法，其中所述人類患者在35-60歲之間。
48.權(quán)利要求45的方法，其中所述人類患者在18-35歲之間。
49.權(quán)利要求45的方法，其中所述人類患者在18-25步之間。
50.權(quán)利要求45的方法，其中所述人類患者在15-18歲之間。
51.權(quán)利要求45的方法，其中所述人類患者在10-15歲之間。
52.權(quán)利要求45的方法，其中所述人類患者在11歲以下。
53.權(quán)利要求45的方法，其中所述人類患者在2-10歲之間。
54.權(quán)利要求45的方法，其中所述人類患者在2歲以下。
55.權(quán)利要求45的方法，其中所述人類患者在6周齡至1歲之間。
56.權(quán)利要求21的組合物，其中所述莢膜多糖選自A和W-135；Y和W-135、C和Y、C和W-135；A、C和Y，A、C和W-135，(7)C、Y和W-135，A、Y和W-135以及A、C、Y和W-135。
57.在人類患者中誘導抗腦膜炎球菌A的免疫應答的方法，其中所述方法包括給予所述人類患者含多糖-蛋白質(zhì)綴合物的疫苗組合物，其中所述綴合物包含衍化至平均大小低于100,000道爾頓的0.5-15μg/ml腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A的莢膜多糖。
58.在人類患者中誘導抗腦膜炎球菌C的免疫應答的方法，其中所述方法包括給予所述人類患者含多糖-蛋白質(zhì)綴合物的疫苗組合物，其中所述綴合物包含衍化至平均大小低于100,000道爾頓的0.5-15μg/ml腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C的莢膜多糖。
59.在人類患者中誘導抗腦膜炎球菌Y的免疫應答的方法，其中所述方法包括給予所述人類患者含多糖-蛋白質(zhì)綴合物的疫苗組合物，其中所述綴合物包含衍化至平均大小低于100,000道爾頓的0.5-15μg/ml腦膜炎奈瑟氏球菌血清群Y的莢膜多糖。
60.在人類患者中誘導抗腦膜炎球菌W-135的免疫應答的方法，其中所述方法包括給予所述人類患者含多糖-蛋白質(zhì)綴合物的疫苗組合物，其中所述綴合物包含衍生至平均大小低于100,000道爾頓的0.5-15μg/ml腦膜炎奈瑟氏球菌血清群W-135的莢膜多糖。
61.權(quán)利要求57-60中任一項的方法，其中所述疫苗組合物不包含佐劑。
62.免疫人類患者以對抗腦膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括給予含權(quán)利要求1-20的綴合物的疫苗組合物，由此和免疫前血清GMT或IgG效價相比，所述人類患者的血清GMT或IgG效價在接種的28天內(nèi)增至4倍以上。
63.免疫人類患者以對抗腦膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括給予含權(quán)利要求1-20的綴合物的疫苗組合物，由此和免疫前SBA-BR效價相比，所述人類患者在接種的20-40天內(nèi)具有1∶32或更高的血清SBA-BR效價。
64.免疫人類患者以對抗腦膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括給予含權(quán)利要求1-20的綴合物的疫苗組合物，由此和免疫前SBA-BR效價相比，所述人類患者在接種的20-40天內(nèi)具有1∶64或更高的血清SBA-BR效價。
65.免疫人類患者以對抗腦膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括給予含權(quán)利要求1-20的綴合物的疫苗組合物，由此和免疫前SBA-BR效價相比，所述人類患者在接種的20-40天內(nèi)具有1∶128或更高的血清SBA-BR效價。
66.免疫人類患者以對抗腦膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括與一種或多種非腦膜炎球菌疫苗一起共同給予所述人類患者權(quán)利要求21-39的組合物。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述非腦膜炎球菌疫苗包含抗傷寒疾病的疫苗。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述抗傷寒疾病的疫苗為TyphimVi_。
全文摘要
本發(fā)明描述了衍生的多糖－蛋白質(zhì)綴合物、含一種或多種此類衍生的多糖－蛋白質(zhì)綴合物的組合物以及用其免疫人類患者的方法。衍生的多糖－蛋白質(zhì)綴合物是得自腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)血清群A、C、W－135和Y的純化的莢膜多糖，其是化學衍生活化的，并利用共價化學鍵選擇性連接至載體蛋白，形成能夠激發(fā)針對各種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的長期持續(xù)的免疫性的多糖－蛋白質(zhì)綴合物。
文檔編號C07H1/00GK101072586SQ20058003980
公開日2007年11月14日 申請日期2005年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月21日
發(fā)明者R·P·賴亞爾 申請人:圣諾菲·帕斯圖爾公司