專利名稱：口服有效的大麻素類似物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及外周大麻素受體CB2的口服有效配體，特別是(+)-α-蒎烯衍生物，及其藥物組合物，其可用于預防、減輕或治療自身免疫性神經(jīng)變性疾病，特別是多發(fā)性硬化癥。
背景技術：
大麻歷來用于治療失眠、炎癥、疼痛、各種精神病、消化道疾病、抑郁、偏頭痛、神經(jīng)痛、疲勞、便秘、腹瀉、寄生蟲、感染及食欲障礙。大麻某些可能的醫(yī)學用途已產(chǎn)生了多篇由Pate綜述的科學文獻[Pate D.W.，Journal of the International Hemp Association 2(2)74-6，1995]。有增長量的證據(jù)表明大麻及其個別的生物活性成分大麻素可有效抑制多發(fā)性硬化癥和脊髓損傷的某些癥狀。大麻包括大約60種不同的大麻素，這些大麻素的例子為大麻酚(CBN)、大麻二酚(CBD)、大麻環(huán)萜酚(CBC)和大麻萜酚(CBG)。大麻素為疏水化合物，其經(jīng)由激活特異性G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮它們的最大作用。至今，已克隆并表征了兩種大麻素受體大麻素1型受體(CB1)和大麻素2型受體(CB2)，盡管也可能存在另外的受體。所述CB1受體主要見于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，且為產(chǎn)生大麻素的精神效應的原因，而CB2受體主要在免疫細胞的外周中表達。
大麻的主要精神活性成分是Δ9-四氫大麻酚(THC)，且其為有待批準用于藥物中的一種稀有的大麻素。屈大麻酚是一種包裹(encapsulated)在芝麻油中的合成的THC，其作為第二類目錄(schedule II)中的一種控制藥物以Marinol的商品名銷售。其從1985年起在美國已被作為鎮(zhèn)吐藥接受，用以治療與癌癥化學療法有關的惡心，并從1992年起作為AIDS患者中的食欲刺激劑被接受。大麻素的其他臨床應用已由Robson進行綜述[Robson P.British Journal of Psychiatry 178107-115，2001]。
對少數(shù)患者施行的臨床試驗表明，THC可對下述疾病產(chǎn)生客觀的和/或主觀的緩解作用痙攣、疼痛、震顫、患有MS的患者中的膀胱相關癥狀和夜尿癥。已表明的是THC在MS中可能有效的較重要證據(jù)的缺乏可歸咎于所采用的口服施用途徑。據(jù)信，這些有益的大麻素所誘導的某些活性可通過兩種識別的大麻素受體CB1和CB2介導。然而，不結合任一已知的大麻素受體的非精神活性的大麻二酚(CBD)在MS中的活性顯示，其部分療效可能是通過非受體介導的機理。應被強調(diào)的是，這些臨床試驗的結果已受到某些人的質(zhì)疑[Killestein J.等人，Neurology 581404-7，2002]。
THC目前以口服形式給藥，但當以這種形式攝入時，由于低且不穩(wěn)定的生物利用度，其經(jīng)常是無效的。例如，薈萃分析(meta-analysis)研究揭示了在口服治療的750例患者中，大約65％的患者對THC具有弱反應或僅部分反應。因此，施用高濃度的單劑量，其可引起不期望的副作用，如鎮(zhèn)靜作用、意識錯亂及焦慮?？诜┯肨HC的這樣的弱反應可歸咎于THC有限的水溶性，其在口服施用后廣泛的首過代謝以及THC的低絕對生物利用度結果(平均為13％)。先前的研究也已報道了口服施用THC的另一局限性是在受治療者之間吸收差異大。Russo[Russo E.B.，Neurology 60(4)729，2003]報道了在使用口服攝入的、煙霧狀或蒸汽化的大麻的同時，MS患者經(jīng)歷的癥狀改善是顯著的，而口服Marinol的作用卻受到了質(zhì)疑。
得到具有增加的水溶性的大麻素將是有益的，其可用于制備口服可利用的具有穩(wěn)定和潛在地較高生物利用度的藥物?？诜┯脙?yōu)于其他途徑的優(yōu)點很多，且包括首要的患者依從性和安全性。
多發(fā)性硬化癥(MS)是CNS的炎癥性疾病，其影響腦和脊髓，且其為年輕成人中神經(jīng)失能最常見的原因。突出地，它是由主要在白質(zhì)中的神經(jīng)纖維脫髓鞘引起的一種疾病，所述神經(jīng)纖維脫髓鞘被認為起因于CNS的慢性炎癥，但其他形式的神經(jīng)變性也已被報道。覆蓋軸突并確保神經(jīng)沖動適當傳遞的髓鞘的完整性通過少突膠質(zhì)細胞維持，其屬于稱為神經(jīng)膠質(zhì)細胞的維護細胞(maintenance cell)的大組?？雌饋砩偻荒z質(zhì)細胞是在炎癥之前喪失的。隨著疾病進展，軸突卻很少被炎癥性過程破壞，而更多的是被繼相同軸突的末梢損傷之后的沃勒變性(Wallerian degeneration)所破壞。因此，許多過程在疾病進展期間促成了MS的癥狀，且它們包括炎癥、脫髓鞘、少突膠質(zhì)細胞死亡、膜損傷和軸突死亡。通常認為MS具有兩個病原學階段首先是自身免疫的觸發(fā)，繼之為神經(jīng)變性。
MS的治療一般分為兩類進行癥狀處理的治療，及通過減少發(fā)作的數(shù)目和減輕發(fā)作的嚴重度以及控制疾病的進展來改變疾病進程的治療。自1993年以來，五種不同的產(chǎn)品已通過FDA批準，用作治療MS的疾病緩解劑(disease modifying agent，DMA)。這些包括作為免疫調(diào)節(jié)劑的三種β干擾素(IFN-β)產(chǎn)品(Betaseron、Avonex和Rebif)以及兩種不相關的產(chǎn)品(Copaxone和Novantrone)。
所有現(xiàn)有的緩解疾病的治療引起了執(zhí)業(yè)醫(yī)師所熟知的輕微至嚴重的副作用，包括流行性感冒樣癥狀、肝毒性、一過性面紅(transient flushing)、胸及關節(jié)痛、虛弱、惡心、焦慮、肌強直、心臟毒性和潛在的致白血病性(leukaemogenicity)。更重要地，基于蛋白質(zhì)的治療經(jīng)常引發(fā)中和抗體(NAb)，其最終消減了持續(xù)使用的藥物的效能。更常見的問題是注射部位的反應和許多人自我注射的困難。
用于MS治療中的DMA，為免疫調(diào)節(jié)劑或免疫抑制劑，其對疾病的免疫成分具有靶向性。然而，如前詳述的，MS可產(chǎn)生廣泛的癥狀，這些癥狀可分為以下的類別視覺的、運動的、感覺的、協(xié)調(diào)和平衡、腸、膀胱、性的、認知的及其他。所述癥狀的治療包括施用下述的藥物類固醇、抗驚厥劑、三環(huán)類抗抑郁藥、抗炎藥、非甾體抗炎藥(NSAID)、選擇性5-羥色胺重吸收抑制劑(SSRI)、單胺氧化酶抑制劑(MOI)、抗抑郁藥、苯二氮卓類(BZD)、肌松劑、抗膽堿能藥物、β阻滯劑、緩瀉藥及某些特異性的通道阻滯劑。當前正研究與免疫調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑和神經(jīng)保護藥物的聯(lián)合治療。也正在考慮可能增強損傷部位的髓鞘再生的藥物治療，其可能包括在未來的聯(lián)合治療中。如果單種藥物能解決與MS相關的眾多癥狀的一種以上，并且其自身作為多因素的療法起作用，那么將是有益的。
盡管在過去10年間，MS的治療已發(fā)生了巨變，但上述現(xiàn)有的藥物療法仍然有一些不足之處。DMA全部是注射藥物，其引起了低的患者依從性和頻繁的注射部位反應。中和抗體表現(xiàn)出對抗IFN-β和Copaxone的作用，且它們可降低治療效能。另外還需要復合的治療劑用于解決與MS有關的各種癥狀，且這些藥物自身不可避免地具有副作用。每年用于MS治療的費用可隨著另外的癥狀治療的累積而進一步增加。
為了得到較高的藥物依從性比率，對護理醫(yī)院較低的需求，且由此提高的患者的生活質(zhì)量，獲得口服可施用的藥物將是有益的。如果這樣的藥物將同時緩解或治療多種癥狀，其將更有益。對于制備，小分子通常比肽和蛋白質(zhì)廉價，且即使在長期施用后，其另外對引發(fā)中和抗體具有較低的敏感性。如果現(xiàn)有的生物學的DMA能夠被相對小的、更安全且更廉價的化學實體所取代，那么對于多發(fā)性硬化癥的治療將是另外的一種改進。
已知大麻素具有神經(jīng)保護的特性，且可調(diào)節(jié)谷氨酸釋放和調(diào)節(jié)可另外促成MS的氧化自由基。最近已提出大麻素甚至可預防脫髓鞘和/或促進髓鞘再生[Arevalo-Martin A.等人，Journal of Neuroscience 23(7)2511-6，2003]。此外，已知大麻素具有免疫調(diào)節(jié)劑的特性，且因此它們不僅對MS的癥狀，而且對MS的發(fā)病和發(fā)展可產(chǎn)生作用。由于大麻素廣泛的治療活性，它們可有益地代替目前用于MS治療的現(xiàn)有的昂貴的DMA，以及其他的癥狀治療藥物。近期已綜述了支持在MS中使用大麻素的證據(jù)[AthaMJ.，IDMU Literature Review1-11，2002]。
已知認為據(jù)信具有大麻素的免疫調(diào)節(jié)活性的CB2選擇性大麻素比天然存在的THC具有更低的精神活性。因此，開發(fā)用于治療或緩解MS的CB2選擇性大麻素將是有益的，且如果所述化合物為水溶性的和口服可生物利用的，那么其還將更有益。
許多專利和公開的申請涉及對于多發(fā)性硬化癥的口服有效的治療。在它們中，美國專利4,994,466公開了麻醉拮抗劑通過口服施用治療MS的用途，美國專利5,217,958教導了肌醇六磷酸的用途，美國專利5,869,054公開了一種略微不同的方法，其中所述口服藥物為一種自身抗原，特別是髓磷脂堿性蛋白質(zhì)(MBP)或其片段，而國際專利申請WO 95/27500描述了實現(xiàn)口服耐受的其他藥物。美國專利申請2004/086534公開了IFN-τ通過口服施用治療MS的用途，國際專利申請WO 98/30227公開了COP-1的用途，國際專利申請WO 00/09127公開了Idublast的用途。但是上述藥物無一是大麻素。
其他專利更明確地公開了大麻素激動劑或拮抗劑用于MS治療的用途。例如，對于治療多發(fā)性硬化癥，美國專利5,618,955公開了多不飽和脂肪酸酰胺和它們的衍生物的用途，美國專利申請2004/0186166公開了大麻素類似物如alujemic acid的用途，美國專利申請2004/0157823公開了3-氨基氮雜環(huán)丁烷衍生物的用途，美國專利申請2004/0138293公開了大麻提取物的用途，美國專利申請2004/0132804公開了氨基1，2-二氫化茚衍生物的用途，美國專利申請2004/0116326公開了1，3-噻嗪衍生物的用途，美國專利申請2004/0110827公開了純對映體地塞比諾的用途，美國專利申請2004/0106800公開了4，5-二氫-1H-吡唑衍生物的用途，及美國專利申請2004/0106614公開了1H-1，2，4-三唑-3-羧酰胺衍生物的用途。這些申請中公開的化合物不一定為大麻素激動劑或CB2選擇性，且它們通常與本發(fā)明的α-蒎烯衍生物的結構不同。
美國專利4,208,351公開了光學活性的雙環(huán)化合物，其在制備經(jīng)典的三環(huán)大麻素的立體選擇性過程中作為中間體。然而，沒有治療活性可歸因于所述中間體，且完全沒有提及這樣的化合物與大麻素受體結合的能力，因此，并沒有預想包括這樣的化合物的藥物組合物。
美國專利4,282,248公開了同分異構混合物和蒎烯衍生物的單獨的異構體。所述化合物具有包括鎮(zhèn)痛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制、鎮(zhèn)靜以及安定活性的治療活性，但本公開沒有教導所述化合物可結合至任何大麻素受體。
美國專利5,434,295公開了新型的4-苯基蒎烯衍生物家族，并教導如何使用可用以治療各種與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷有關的病理學情況的藥物組合物中的所述化合物。其公開內(nèi)容既沒有教導也沒有提示那些化合物中的任何一種對于外周大麻素受體具有選擇性。
國際專利申請WO 01/28497公開了新型的雙環(huán)大麻素類似物，其顯示了對于CB2受體的高度親和力。對于本領域技術人員顯而易見的是在所述申請中的化合物為(-)α-蒎烯衍生物，且因此具有立體化學取向，當參考該申請公開內(nèi)容所采用的命名法時，其中C-1、C-4和C-5為R。該申請表明(-)α-蒎烯衍生物可用于MS的治療。所公開的關于該申請唯一的化合物僅有的信息涉及對CB1和CB2的體外結合活性。
國際專利申請WO 01/32169公開了作為CB2的特異性激動劑的(+)α-蒎烯雙環(huán)化合物家族(包括HU-308)，并舉例說明了它們在疼痛與炎癥、自身免疫性疾病、胃腸道病癥的治療中和作為降血壓劑的用途。此申請?zhí)岢?+)α-蒎烯衍生物可用于MS的治療。
國際專利申請WO 03/005960公開了新型的大麻素類似物，其顯示了對于CB2受體的高度親和力，它們中的某些具有雙環(huán)結構。此申請要求保護蒎烯衍生物的(-)對映體和(+)對映體及全部異構體。僅公開的雙環(huán)蒎烯化合物衍生自(-)α-蒎烯，且僅有的生物信息涉及體外結合活性。此申請?zhí)岢鋈魏屋逑┭苌锞捎糜贛S的治療，但其未說明所述化合物在任何的疾病模型中體內(nèi)真正有效。
國際專利申請WO 03/063758公開了新型的(+)α-蒎烯衍生物，其顯示了對于CB2受體的選擇性。此申請公開了某些親水的雙環(huán)大麻素，并表明這些化合物當胃腸外施用時尤其是有效的抗炎劑和止痛劑。此申請公開了該發(fā)明的疏水化合物當靜脈內(nèi)施用時對MS的治療有用，并提出這些化合物中的某些可口服遞送。
當前，用于緩解或治療多發(fā)性硬化癥的藥物具有某些缺陷。開發(fā)具有較好安全性能、患者依從性及較低成本的口服可利用的小分子將是有益的。大麻素提供了用于MS治療的候選藥物。這類化合物具有潛在的另外的優(yōu)勢，既解決疾病的關鍵免疫成分方面的問題且緩解MS相關的癥狀。因此，本發(fā)明提供了針對介入多發(fā)性硬化癥及其他具有自身免疫和神經(jīng)變性病原學的疾病的治療方式的長期未能滿足的醫(yī)療需求的解決方案。
發(fā)明概述本發(fā)明通過提供大麻素克服了背景技術的缺陷，所述大麻素為口服有效的且可預防、減輕或治療具有自身免疫和神經(jīng)變性病原學的疾病，特別是多發(fā)性硬化癥。
本發(fā)明的口服有效的大麻素可用于治療與多發(fā)性硬化癥相關的癥狀。據(jù)信，在神經(jīng)系統(tǒng)的多種疾病中，本發(fā)明口服有效的組合物除了用于治療或預防多發(fā)性硬化癥，還用于治療或預防這些神經(jīng)學的癥狀。因此，所述口服有效的組合物可用于治療或預防震顫、痙攣、肌無力以及任何病原學的協(xié)調(diào)喪失。
特別地，本發(fā)明的大麻素是CB2選擇性(+)α-蒎烯衍生物，其優(yōu)選為水溶性的。本發(fā)明的化合物單獨或與其他大麻素或與其他用于治療所述疾病的藥物療法相結合，可用以緩解或治療多發(fā)性硬化癥或相關的癥狀。
根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了一種預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的方法，其包括向有相應需要的個體施用口服有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括作為活性成分的式(I)的化合物及其可藥用鹽、酯或溶劑合物式I 具有特定的立體化學結構，其中C-4為S，C-1和C-5位的質(zhì)子彼此為順式，且C-4和C-5位的質(zhì)子為反式；且其中R1選自(a)O或S；(b)C(R’)2，其中在各種情況下，R’獨立地選自氫、氰基、-OR”、-N(R”)2、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”或C1-C6烷基-N(R”)2，其中在各種情況下，R”獨立地選自氫、C(O)R”’、C(O)N(R”’)2、C(S)R”’、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”’和C1-C6烷基-N(R”’)2，其中在各種情況下，R”’獨立地選自氫或飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基；及(c)NR”或N-OR”，其中R”如前述所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)-R”、-OR”、-N(R”)2、-SR”、-S(O)(O)NR”，其中在各種情況下，R”如前述所定義；(b)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb，其中Rb選自氫、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”和C1-C6烷基-N(R”)2，其中R”如前述所定義；及(c)由-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或-P(O)(ORe)2封端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，在各種情況下，Re選自氫，且Rd如前述所定義；R4選自(a)R，其中R選自氫、鹵素、OR”’、OC(O)R”’、C(O)OR”’、C(O)R”’、OC(O)OR”’、CN、N(R”’)2、NC(O)R”’、NC(O)OR”’、C(O)N(R”’)2、NC(O)N(R”’)2和SR”’，其中在各種情況下，R”’如前述所定義；(b)飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-R，其中R如前述所定義；(c)芳環(huán)，其可在任何位置被R進一步取代，其中R如前述所定義；及(d)任選地以芳環(huán)封端的飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基，其可如(c)中所定義被進一步取代。
根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明提供了一種預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的方法，其包括向有相應需要的個體施用口服有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括作為活性成分的式(I)的化合物，其中R1為O，R2和R3各自為ORf，其中在各種情況下，Rf獨立地選自氫、-Rd和-C(O)-Rd，其中Rd為以-C(O)ORg封端的飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基鏈，且Rg選自氫和飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，R4選自飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-Rh，其中Rh選自R和芳環(huán)，該芳環(huán)可在任何位置任選地被如前述定義的R進一步取代。
根據(jù)另外的實施方案，本發(fā)明提供了一種預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的方法，其包括向有相應需要的個體施用口服有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括作為活性成分的式(I)的化合物，其中R1為O，R2和R3各自獨立地選自OH、琥珀酸酯、富馬酸酯和亞甲氧羧基，且R1選自1，1-二甲基戊基、1，1-二甲基庚基、1，1-二甲基-6-庚炔基、1，1-二甲基-3-苯基-丙基、1，1，3-三甲基-丁基、1-(4-氯-苯基)-1-甲基-乙基、1-乙基-1-甲基-丙基、5-溴-1，1-二甲基-戊基和1，1-二甲基-戊-4-烯基。
根據(jù)一典型的實施方案，本發(fā)明提供了一種預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的方法，其包括向有相應需要的個體施用口服有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括作為活性成分的式(I)的化合物，其中R1為O，R2為OH，R3為富馬酸酯，R4為1，1-二甲基庚基。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種預防、減輕或治療選自震顫、痙攣、肌無力以及協(xié)調(diào)喪失的神經(jīng)學癥狀的方法，其包括向有相應需要的個體施用口服有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括作為活性成分的如上定義的式(I)的化合物。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)炎癥性介質(zhì)的方法，其包括向有相應需要的個體施用口服有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括作為活性成分的如上定義的式(I)的化合物。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了口服有效的如上定義的式(I)的化合物用于制備預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的藥劑的用途。
根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明提供了口服有效的式(I)的化合物用于制備預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的藥劑的用途，其中R1為O，R2和R3各自為ORf，其中在各種情況下，Rf獨立地選自氫、-Rd和-C(O)-Rd，其中Rd為以-C(O)ORg封端的飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基鏈，且Rg選自氫和飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，R4選自飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-Rh，其中Rh選自R和芳環(huán)，該芳環(huán)可在任何位置任選地被如前述定義的R進一步取代。
根據(jù)另外的實施方案，本發(fā)明提供了口服有效的式(I)的化合物用于制備預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的藥劑的用途，其中R1為O，R2和R3各自獨立地選自OH、琥珀酸酯、富馬酸酯和亞甲氧羧基，R4選自1，1-二甲基戊基、1，1-二甲基庚基、1，1-二甲基-6-庚炔基、1，1-二甲基-3-苯基-丙基、1，1，3-三甲基-丁基、1-(4-氯-苯基)-1-甲基-乙基、1-乙基-1-甲基-丙基、5-溴-1，1-二甲基-戊基和1，1-二甲基-戊-4-烯基。
根據(jù)一典型的實施方案，本發(fā)明提供了口服有效的式(I)的化合物用于制備預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的藥劑的用途，其中R1為O，R2為OH，R3為富馬酸酯，R4為1，1-二甲基庚基。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了口服有效的如上定義的式(I)的化合物用于制備預防、減輕或治療如前述定義的神經(jīng)學癥狀的藥劑的用途。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了口服有效的如上定義的式(I)的化合物用于制備調(diào)節(jié)炎癥性介質(zhì)的藥劑的用途。
除口服有效的式(I)的化合物外，本發(fā)明的藥物組合物還可包括增稠劑、載體、緩沖劑、稀釋劑、表面活性劑、防腐劑等，所有這些均為本領域所熟知，為用以生產(chǎn)生理學上可接受的和穩(wěn)定的制劑所必需的。
藥物組合物也可包括用于聯(lián)合施用的一種或多種另外的活性成分，例如，但不限于式(I)的化合物、抗炎劑、免疫調(diào)節(jié)劑、免疫抑制劑、類固醇、抗驚厥劑、鎮(zhèn)痛藥、抗抑郁藥、肌松劑等，這些對于執(zhí)業(yè)醫(yī)師為已知的。
在本說明書和隨后的權利要求中，聯(lián)合施用明確地意欲包括分別施用或作為單獨的組合物施用的綜合療法。當分別施用時，分開的治療劑可基本上同時或在分開的用藥方案下施用。
基于患者的方便、舒適和安全起見，本發(fā)明的藥物組合物經(jīng)由口服施用。施用途徑包括但不限于口服，其中所述藥物被吞咽，及通過頰部、牙齦、舌、舌下和口咽(oro-pharyngeal)施用在口腔中經(jīng)粘膜吸收。
所述藥物組合物可為液體、氣霧劑或固體劑型，且可被配制為任何合適的制劑，包括但不限于溶液劑、混懸劑、微膠粒、乳劑、微乳劑、氣霧劑、散劑、顆粒劑、囊劑、軟凝膠劑、膠囊劑、片劑、丸劑、囊片等，這些制劑將為口服施用途徑所需。
在所述藥物組合物作為預防、減輕或治療有相應需要的個體的藥劑使用前，它們可被配制為單位劑量形式。用于人類的活性劑量在一日1-4次的用藥方案中，通常在每kg體重0.05mg至約50mg的范圍。然而，對于本領域技術人員顯而易見的是活性成分的所選劑量取決于期望的治療效果、施用途徑、期望的治療持續(xù)時間、患者的年齡、體重、禁忌癥、聯(lián)合施用以及與其他藥劑組合等。
參考以下的詳細描述并結合附圖和非限制性實施例，本領域的技術人員能夠更好地理解本發(fā)明的這些和另外的益處與特征。
附圖簡述被并入說明書并形成說明書的一部分的


了本發(fā)明的某些實施方案，并與說明書一起用來解釋本發(fā)明的原理。在所述圖中圖1顯示了口服施用化合物18F對MBP誘發(fā)的急性EAE的效應。分圖A顯示了平均組隨著時間的臨床評分。分圖B顯示了每個治療組的平均最大評分。分圖C顯示了每個治療組的曲線下面積。
圖2顯示了口服施用化合物18F對PLP誘發(fā)的復發(fā)-緩解型(remitting-relapsing)EAE的效應。
圖3顯示了口服施用化合物18F對MOG誘發(fā)的慢性進展型EAE的效應。分圖A顯示了不同劑量隨著時間對臨床評分的影響，且分圖B顯示了對照藥物和化合物對疾病進展的影響。
圖4為蛋白質(zhì)印跡的色譜圖，顯示了在活化的巨噬細胞中，化合物18A和18F在不同劑量對iNOS蛋白質(zhì)表達的影響。
圖5顯示了在內(nèi)臟痛模型中通過扭體反應(WR)的數(shù)目表示的止痛活性。分圖A顯示了CB1和CB2拮抗劑對化合物18A和18F的止痛活性的影響。分圖B顯示了綜合療法對止痛活性的影響。分圖C顯示了口服施用不同劑量的化合物18F的效應。
圖6顯示了在內(nèi)臟痛模型中通過扭體反應(WR)的數(shù)目表示的止痛活性。分圖A顯示了口服施用在共溶劑載體中的不同化合物的效應。分圖B顯示了口服施用在水溶性載體中的不同化合物的效應。
圖7顯示了口服施用不同劑量的化合物18F對炎癥性疼痛的效應。分圖A顯示了與載體處理的動物相比，不同劑量對腳爪體積的效應。分圖B顯示了對抗熱痛覺過敏的效應，以及分圖C顯示了對抗機械痛覺過敏的效應。
圖8顯示了口服施用不同劑量的化合物18F對神經(jīng)性疼痛的效應。分圖A顯示了在慢性壓迫誘發(fā)的神經(jīng)性疼痛中疼痛反應的減少。分圖B顯示在Taxol誘發(fā)的神經(jīng)性疼痛中對機械痛覺過敏的影響。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了使用口服有效的非經(jīng)典的大麻素預防、減輕或治療具有自身免疫和神經(jīng)變性病因的疾病的組合物和方法。
特別地，本發(fā)明提供了包括作為活性成分的CB2選擇性大麻素激動劑的藥物組合物，和使用所述藥物組合物用于預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的方法。
本發(fā)明的方法可用于治療MS相關的癥狀，無論是由多發(fā)性硬化癥引起的或由其他疾病或病癥產(chǎn)生的。
典型地，所述CB2選擇性激動劑為植物或動物來源的大麻素或擬大麻類(cannabimimetic)化合物，其選自氨烷基吲哚、花生四烯酸乙醇酰胺、3-芳?；胚?、芳基和雜芳基磺酸酯、芳磺酰胺、苯酰胺、聯(lián)苯樣大麻素、任選地被稠合的或橋接的單環(huán)或多環(huán)進一步取代的大麻素、吡唑-4-羧酰胺、類花生酸類物質(zhì)、二氫異吲哚酮、二氫噁唑、α-蒎烯衍生物、喹唑啉二酮、喹啉羧酸酰胺、間苯二酚衍生物、四嗪、三嗪、噠嗪和嘧啶衍生物，及其類似物和衍生物。更優(yōu)選地，所述CB2選擇性大麻素激動劑為α-蒎烯衍生物，最優(yōu)選的為(+)-α-蒎烯衍生物。
定義為促進理解本發(fā)明，許多術語和短語在下文定義。
如此處所用，術語“中樞神經(jīng)系統(tǒng)”(CNS)指硬膜內(nèi)的全部結構。這些結構包括但不限于腦和脊髓。
如此處所用，術語“CB”指大麻素受體。CB1受體主要可見于CNS，而CB2受體主要可見于外周的免疫細胞。除這兩種受體外，還存在支持未克隆的大麻素受體存在的證據(jù)。
如此處所用，術語“口服有效的”指本發(fā)明的化合物在以合理體積的預期劑量口服施用后，在受治療者中獲得了目標生物活性。
如此處所用，術語“水溶性的”指本發(fā)明的化合物在水溶液中比Δ9-THC好溶解至少1倍，優(yōu)選50倍，更優(yōu)選250倍，且最優(yōu)選1000倍或以上。
在本說明書和權利要求中，“抑制、減少或降低的效應”是將所述的活性減少了至少20％、優(yōu)選40％、更優(yōu)選60％且最優(yōu)選80％或更大的能力。假設活性中可能的最大效應不是100％，則前述的附圖涉及可能的最大效應的百分數(shù)。
在本說明書和權利要求中，“提高或增加的效應”是將所述的活性增加了至少1.5倍、優(yōu)選3倍、更優(yōu)選4倍且最優(yōu)選5倍或以上的能力。
在本發(fā)明中，親和力由IC50值表示，IC50值即將代替50％的放射標記的CB受體激動劑的試驗化合物的濃度。優(yōu)選的化合物顯示對于CB2結合的IC50值為50nM或更低，優(yōu)選30nM或更低，更優(yōu)選10nM或更低且最優(yōu)選1nM或更低?！癈B2特異性或選擇性的”表示為化合物具有的CB2/CB1結合親和力比率，其至少為10，優(yōu)選20，更優(yōu)選30且最優(yōu)選50或更大。優(yōu)選地，將獲得人類CB1和CB2受體的這些比率。對于CB2的選擇性，表示為CB2/CB1親和力，通過用于取代CB2特異性放射配體得到的IC50值的比值除用于取代CB1特異性放射配體的試驗化合物得到的IC50值來計算，即IC50CB1/IC50CB2。本發(fā)明某些優(yōu)選的化合物不一定同時具有兩種性質(zhì)，換句話說，某些化合物對于CB2IC50為約1nM的，但其比率僅為約30。
激動劑是模擬特異性配體的一種物質(zhì)，其能夠結合該種配體的受體并因此產(chǎn)生與天然配體相同的作用，這種激動劑的例子有激素、神經(jīng)遞質(zhì)或在本案中的大麻素。盡管大部分激動劑通過直接結合至相關受體及通過隨后的激活起作用，但某些激動劑卻是通過促進配體結合或增加其在受體上的保留時間，增加每次耦合的概率和效應來起作用的。無論什么作用機理，全都包括在本發(fā)明中，激動劑的凈效應是促進該獨創(chuàng)性化學物質(zhì)作為配體起作用。具有相反的效應并代替促進配體作用而對其進行阻滯的化合物是受體拮抗劑。
盡管本發(fā)明的化合物最可能的作用機理是通過它們選擇性地結合至CB2受體并功能性地耦合至特定的信號轉(zhuǎn)導途徑，但不能排除另外的機理，例如，通過結合至另外的但不確定的大麻素受體或通過非受體介導的方式，或這樣的機理的組合。
多發(fā)性硬化癥如此處所用，術語“多發(fā)性硬化癥”或“MS”指在遺傳易感宿主中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥性疾病。繼發(fā)于自身免疫反應的這種神經(jīng)變性疾病主要由于神經(jīng)纖維的脫髓鞘而主要影響白質(zhì)組織。許多過程在疾病進展期間促成了MS的癥狀，且它們包括炎癥、脫髓鞘、少突膠質(zhì)細胞死亡、膜損傷和軸突死亡。
臨床上，MS很難進行表征，因為其非常不可預知且可變。根據(jù)CNS被影響的區(qū)域和它們被損害的嚴重程度，癥狀的類型和嚴重度可大大不同。視神經(jīng)損傷可引起視力模糊，腦干損傷可引起頭暈，脊髓損傷可引起協(xié)調(diào)和/或平衡問題。總之，患有MS的人可經(jīng)歷由腦和脊髓來控制或通過腦和脊髓傳遞的任何功能的部分或完全喪失。
如同其他假定的自身免疫疾病，MS在女性中更常見，具有約2∶1的性別比例，且臨床癥狀通常在年輕的成年期表現(xiàn)。MS是溫帶地區(qū)和西半球的主要疾病。其主要在歐洲、北美、澳大利亞和新西蘭有報道，且在這些區(qū)域中，其發(fā)病率可為每100,000人中高達250人。盡管MS見于日本、中國和其他溫帶的東部國家，但其比西方的發(fā)病率要少得多。
如神經(jīng)學家的國際調(diào)查中所確定的，MS有四種主要類型[Lubin F.D.和Reingold S.C，Neurology 46(4)907-11，1996]。復發(fā)-緩解型(RRMS)通過復發(fā)(也稱為惡化)表征，在此期間，可出現(xiàn)新的癥狀且老的癥狀也會重新出現(xiàn)或加劇。繼復發(fā)后的是緩解期，在此期間，患者完全或部分地從復發(fā)期間的獲得性缺陷中恢復。復發(fā)可持續(xù)數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月，且恢復可能是緩慢和逐步的或幾乎同時發(fā)生的。呈現(xiàn)多發(fā)性硬化癥的絕大多數(shù)人首先被診斷為復發(fā)-緩解型。
許多已患有復發(fā)-緩解型MS的人在許多年以后將進入該疾病的繼發(fā)進展型階段(SPMS)。這通過疾病在復發(fā)間的逐漸加劇進行表征。在繼發(fā)進展型的早期階段，患者仍可能經(jīng)歷少數(shù)復發(fā)，但在一段時間后，這些復發(fā)并入一個總的進展型階段?；加欣^發(fā)進展型的人可經(jīng)歷好轉(zhuǎn)和惡化數(shù)天或數(shù)周，但除了繼復發(fā)發(fā)作之后的某些緩解之外，并沒有真正的恢復。10年后，50％患有復發(fā)-緩解型MS的人將發(fā)展為繼發(fā)進展型[Weinshenker B.G.等人，Brain 112133-46，1989]。經(jīng)過25至30年，該數(shù)字將上升至90％。
所述疾病的第三種形式被稱為復發(fā)進展型多發(fā)性硬化癥(PRMS)。MS的這種形式從發(fā)作開始經(jīng)歷進展過程，具有復發(fā)特征。繼復發(fā)后立即有明顯的恢復，但在復發(fā)之間有逐步加劇的癥狀。
最后，MS的原發(fā)進展型(PPMS)類型通過從疾病發(fā)作開始完全沒有緩解的逐步進展進行表征。可存在疾病活動停止增加的周期，對于繼發(fā)進展型，可有好轉(zhuǎn)或惡化的數(shù)天或數(shù)周。PPMS與復發(fā)-緩解型和繼發(fā)進展型的不同，因為PPMS的發(fā)作通常在三十歲末或四十歲初，男性和女性的發(fā)病情況相似，且最初的疾病活動是在脊髓中而不是在腦中。原發(fā)進展型MS通常遷移至腦中，但與復發(fā)-緩解型或繼發(fā)進展型相比損害腦部區(qū)域的可能性較小——例如患有原發(fā)進展型的人發(fā)展成認知問題的可能性較小。
所述疾病的所有形式，CNS損傷的部位和所產(chǎn)生的癥狀或疾病的類型意欲包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
多發(fā)性硬化癥的治療至二十世紀九十年代初期以前，長期以來一直無改變所述疾病過程的有效療法。甾類激素治療，盡管在縮短發(fā)作的持續(xù)時間中有效，但從未被證明可影響疾病的最終結果或隨之發(fā)生的失能，且因此被認為是病情加重的癥狀療法。最近十年已證實了疾病緩解治療的發(fā)展和癥狀療法的改進。作為免疫調(diào)節(jié)劑的三種β干擾素(IFN-β)產(chǎn)品(Betaseron、Avonex和Rebif)及兩種不相關的產(chǎn)品(Copaxone和Novantrone)已通過FDA批準。
所有的β干擾素通過不同的機理停止了MS損傷的炎癥，這些機理包括修復血腦屏障和減少損傷中的炎癥性過程。它們被批準用于復發(fā)-緩解型MS。根據(jù)來源，以不同的劑量、按照不同的時間表、從每日到每周的范圍、通過皮下或肌內(nèi)注射施用IFN-β。
長期的研究顯示，對于大部分人，持續(xù)使用β干擾素是持續(xù)有效的。然而，與使用了其他基于蛋白質(zhì)的療法一樣，相當多的一部分患者形成了針對所述藥物的中和抗體(NAb)，其降低了所述藥物的效能。28-47％的患者形成了IFN-β-1b的NAb，且根據(jù)商品來源，2-28％的患者形成了IFN-β-1a的NAb。β干擾素的主要副作用是“流行性感冒樣癥狀”，其可能令人非常的不愉快，且在某些患者中具有輕微的肝毒性。更常見的問題是注射部位的反應以及許多人自我注射時的困難。
Copaxone(醋酸格拉默，glatiramer acetate)在化學結構和作用機理上不同于β干擾素。其由一組合成的多肽組成，所述多肽看起來略微類似于髓磷脂本身。其將發(fā)作的頻率和嚴重度降低至與Betaseron和Rebif相同的程度，但如在磁共振影像學(MRI)上看到的，其對損傷的作用稍小。Copaxone通常比IFN-β產(chǎn)品具有更好的耐受性，其通過皮下注射每日施用，可用于復發(fā)-緩解型MS。由于施用途徑，由患者報告的最常見的問題是注射部位的反應。迄今報道的另外的副作用輕微，包括一過性面紅、胸及關節(jié)痛、虛弱、惡心、焦慮及肌強直。所有上述藥物表明可用于所述疾病的單一形式——復發(fā)-緩解型MS的治療。
Novantrone(米托蒽醌)是一種化學治療劑，其減慢MS的疾病進展并通過其抑制T細胞和B細胞活性的能力來減少復發(fā)的次數(shù)。與先前藥物不同，Novantrone是一種免疫抑制劑。其被批準用于加劇的MS，包括該疾病的繼發(fā)進展型和復發(fā)-緩解型形式，并被認為是在疾病不能被β干擾素或醋酸格拉默控制的患者中的一種救援療法。由于Novantrone的較嚴重的副作用、心臟毒性和潛在的致白血病性，其一般每三個月由靜脈施用一次，持續(xù)不超過兩年的限制時間。
應理解的是本發(fā)明的口服有效的大麻素在下述至少五個方面克服了現(xiàn)有DMA的某些或全部的缺陷(i)作為基于非蛋白質(zhì)的小分子，它們具有較低的生產(chǎn)成本；(ii)它們具有較少的免疫原性，且因此降低了形成NAb的風險；(iii)NAb的不存在確保了多年時間較長的治療作用；(iv)口服施用提高了患者的依從性并消除了注射部位的反應；以及(v)本發(fā)明的化合物具有CB2選擇性，顯示了降低的副作用和毒性。
如前詳述的，MS可產(chǎn)生廣泛的癥狀，其可分為以下的類別視覺的、運動的、感覺的、協(xié)調(diào)和平衡、腸、膀胱、性的、認知的及其他。DMA解決疾病的免疫原因，而包括施用以下藥物的治療針對癥狀類固醇、抗驚厥劑、三環(huán)類抗抑郁藥、抗炎藥、非甾體抗炎藥(NSAID)、選擇性5-羥色胺重吸收抑制劑(SSRI)、單胺氧化酶抑制劑(MOI)、抗抑郁藥、苯二氮卓類(BZD)、肌松劑、抗膽堿能藥物、β阻滯劑、緩瀉藥及某些特異性的通道阻滯劑。除多發(fā)性硬化癥外，這樣的藥物也用于疾病或病癥中的類似癥狀的治療。
類固醇被描述為MS的癥狀療法的一個例子，且為形成DMA前的治療選擇。對于急性惡化，類固醇已被報道通過減少MS損傷中的腫脹和炎癥來縮短急性發(fā)作的持續(xù)時間。然而，它們沒有改變惡化的頻率或MS的進展，且除了在所選的患者中，應避免長期使用。所包括的合成的腎上腺糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)激素)的例子為潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、倍他米松和地塞米松。可的松具有免疫抑制效應且被認為降低了血腦屏障的“滲漏”。類固醇僅為緩解的且不解決所述疾病的原因。某些潛在的嚴重副作用妨礙了類固醇在MS治療中的長期使用。
用于預防、減輕或治療MS相關癥狀的其他類化合物具有執(zhí)業(yè)醫(yī)師熟知的嚴重副作用。
應理解，考慮到先前報道的和當前所公開的作為如下藥劑的效能，本發(fā)明的口服有效的大麻素可有利地代替現(xiàn)有的癥狀療法，所述藥劑為(i)抗炎劑；(ii)免疫調(diào)節(jié)劑；(iii)鎮(zhèn)痛藥；(iv)神經(jīng)保護劑；(v)抗氧化劑；(v)抗痙攣劑；以及(vi)抗震顫劑。因此，鑒于本發(fā)明的口服有效的大麻素的多重活性，可考慮將它們用作多因素治療，事實上其可進一步減少對于多種藥物治療的需求。通過除去多余的藥物來減少治療MS所需的藥物的絕對數(shù)目，或通過將本發(fā)明口服有效的大麻素與現(xiàn)有的MS治療方法一起聯(lián)合施用或組合來降低某些或全部藥物的施用劑量，將減少藥物之間的相互作用及減輕所有的副作用。
因為當其它疾病或病癥中出現(xiàn)相同癥狀時，可使用本發(fā)明的化合物進行治療，所以將對本領域技術人員顯而易見的是本發(fā)明的化合物用于預防與多發(fā)性硬化癥相關的癥狀的能力具有廣泛的治療益處(benefice)。無論是由多發(fā)性硬化癥引起的還是由其他疾病或病癥引起的MS相關癥狀的治療，都被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
例如神經(jīng)性疼痛不僅在MS患者中可以觀察到，也可在經(jīng)受下述疾病的個體中，或者在接受某些抗腫瘤治療的患者中觀察到，其中所述疾病的例子有背痛、糖尿病、癌癥、單神經(jīng)根病、三叉神經(jīng)痛、皰疹后神經(jīng)痛、幻肢痛、復雜性區(qū)域疼痛綜合征及各種外周神經(jīng)病變。例如約30％的接受Taxol治療的患者形成了神經(jīng)性疼痛。如在MS的情況中，神經(jīng)性疼痛的現(xiàn)有治療被認為是不能令人滿意的。
化學定義根據(jù)本發(fā)明的某些化合物可以以立體異構形式存在，所述立體異構形式作為像與鏡像(對映體)，或者不作為像與鏡像(非對映體)。本發(fā)明涉及對映體或非對映體或其各自的混合物。這些對映體和非對映體的混合物可按已知的方式分離為相同的立體異構成分，或首先作為分離的對映體合成。
在本發(fā)明中，發(fā)明人將提及下述在環(huán)結構中的位置編號，其中位置1、4和5為手性中心。本發(fā)明優(yōu)選的(+)-α-蒎烯衍生物的立體化學結構是這樣的C-4為S，在C-1和C-5的質(zhì)子彼此為順式，且在C-4和C-5的質(zhì)子為反式，如式(II)所示式(II) 此命名法等同于備選方案和先前定義的立體化學結構，其提及的手性碳是C-5而不是C-4。也就是，式(II)的化合物也可被描述為具有立體化學結構，其中C-5為S，在C-1和C-5的質(zhì)子彼此為順式，且在C-4和C-5的質(zhì)子為反式。
在本說明書和隨后的權利要求中，本發(fā)明的某些化合物可通過大寫字母而不是它們完整的化學名提及。例如(-)-4-{4-[1，1-二甲基庚基]-2-富馬酸酯-6-羥基-苯基}-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮通常作為化合物18F提及。
烷基取代基可為飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的，且可含有混和的結構，環(huán)狀結構僅當在烷基鏈中的碳原子數(shù)目大于或等于3時存在。當所述烴基為不飽和時，其可具有一個或多個雙鍵并形成烯基，或具有一個或多個三鍵并形成炔基，全部可為直鏈、支鏈或環(huán)狀的。
當R為氫或烷基鏈時，OC(O)R代表酯、OC(O)NR代表氨基甲酸酯、OC(S)R代表硫酯、NR2代表胺、NRC(O)R代表酰胺、NRC(O)NR代表脲、NRC(S)R代表硫代酰胺、SR代表硫醇或硫化物、S(O)R代表亞砜、SC(O)R代表硫酯、SC(O)NR代表硫代氨基甲酸酯、SC(S)R代表二硫酯、S(O)(O)R代表砜、S(O)(O)NR代表磺胺、S(O)(O)NC(O)R代表?；前贰(O)(O)NC(O)NR代表磺酰脲，S(O)(O)NC(S)R代表硫代酰基磺胺，P(O)(OR)2代表磷酸酯，OP(O)(OR)2代表磷酸酯。
“鹵素”(“Halogen”或“halo”)表示氟(-F)、氯(-Cl)、溴(-Br)或碘(-I)，且如果提及一個以上的鹵素(如兩個或更多個可變的基團可為鹵素)，則獨立選擇各鹵素。
術語“取代的”或“任選地取代的”表示在指定原子上的一個或多個氫被取代或任選地被選自指定組的基團所取代，條件是不超過現(xiàn)有情況下的指定原子的正常原子價。取代基和/或可變基團的組合只有在這樣的組合產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物時才被允許?！胺€(wěn)定的化合物”或“穩(wěn)定的結構”表示足夠牢固經(jīng)歷從反應混合物的分離還穩(wěn)定而得到有用的純度，并配制成有效的治療劑的化合物。
本發(fā)明的某些化合物能進一步形成可藥用鹽和酯。“可藥用鹽和酯”表示可藥用的以及具有期望的藥理活性的任何鹽和酯。這樣的例如由存在于分子中的任何羧基或磺基形成的鹽，包括可從無機酸或有機酸，或無機堿或有機堿，包括氨基酸衍生的鹽，其為非毒性的，否則是不可接受的。
本發(fā)明也包括在其范圍中的式(I)的化合物的溶劑合物及其鹽?！叭軇┖衔铩北硎颈景l(fā)明的化合物與一個或多個溶劑分子的物理締合。這種物理締合包括不同程度的離子和共價鍵，包括氫鍵。在某些情況中，所述溶劑合物應能夠分離。“溶劑合物”包括溶液相和可分離的溶劑合物。合適的溶劑合物的非限制性的例子包括乙醇鹽、甲醇鹽等。“水合物”為一種溶劑合物，其中所述溶劑分子為水。
在本說明書中，術語“前藥”代表在體內(nèi)快速轉(zhuǎn)化為式(I)的母體化合物的化合物，例如，通過血液中的水解。前藥常常是有用的，因為在某些情況中，它們可能比母體藥物更易于施用。例如，它們可通過口服施用被生物利用，而母體藥物卻不能。與藥物組合物中的母體藥物相比，所述前藥還具有改善的溶解度。所有這些藥物形式意欲包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
所述化合物的可藥用的酸加成鹽包括從無機酸衍生的鹽，以及從有機酸衍生的鹽，所述無機酸的例子為鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等，所述有機酸的例子為脂肪族的單羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、鏈烷二酸、芳香酸、脂肪族的和芳香族的磺酸等。因此，這樣的鹽包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、重硫酸鹽、亞硫酸鹽、重亞硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸鹽、丙酸鹽、辛酸鹽、異丁酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、延胡索酸鹽、馬來酸鹽、扁桃酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、苯乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽等。還涉及了氨基酸鹽，例如精氨酸鹽等，以及葡萄糖酸鹽或半乳糖醛酸鹽[Berge S.M.等人，J.ofPharmaceutical Science，661-19，1977]。
通過常規(guī)方法，將游離堿形式與足夠量的所需酸接觸生成鹽來制備所述堿性化合物的酸加成鹽。所述游離堿形式可通過常規(guī)方法，將所述鹽形式與堿接觸并分離所述游離堿進行再生。所述游離堿形式與它們各自的鹽形式在某些物理性質(zhì)上略微有些不同，如在極性溶劑中的溶解度，但出于本發(fā)明的多種目的，所述鹽等同于它們各自的游離堿。
通過常規(guī)方法，將游離酸形式與足夠量的所需堿接觸生成鹽來制備所述酸性化合物的堿加成鹽。所述游離酸形式可通過常規(guī)方法，將所述鹽形式與酸接觸并分離所述游離酸進行再生。所述游離酸形式與它們各自的鹽形式在某些物理性質(zhì)上略微有些不同，如在極性溶劑中的溶解度，但出于本發(fā)明的多種目的，所述鹽等同于它們各自的游離酸。
本發(fā)明的方法中使用的某些化合物是已知的且在國際專利申請WO03/063758中公開，該專利申請要求保護顯示對于CB2受體具有選擇性的新型的(+)α-蒎烯衍生物。此申請公開了當靜脈施用時，本發(fā)明的疏水化合物可用于MS的治療，并提出了某些化合物可經(jīng)口服遞送，但未明確地說明水溶性的(+)α-蒎烯衍生物的口服效能。
先前也顯示當使用本發(fā)明的化合物18F口服施用進行預治療時，有效地抵抗了急性疼痛，該化合物18F也被稱為PRS-211,375[Bar-Joseph A.等人，Society For NeuroscienceProgram No.909.5，2003]。然而，這些試驗沒有教導所述化合物可有效地長期施用以治療確定的疾病，如多發(fā)性硬化癥。先前顯示，本發(fā)明的其他化合物中無一口服施用后在體內(nèi)有效。
藥理學在本發(fā)明和隨后的權利要求中，包括口服有效的化合物的組合物意欲包括預防及治療有效的組合物。
術語“預防有效的”意在確定化合物的數(shù)量，該數(shù)量將實現(xiàn)預防、減少或根除疾病發(fā)生的風險，同時避免不利的副作用的目的。術語“治療有效的”意在確定化合物的數(shù)量，一旦所述疾病不能被進一步延緩且患者不再是無癥狀的，該數(shù)量將實現(xiàn)無副作用、緩解疾病、減少疾病的進展或治療的目的，由此提供通過臨床醫(yī)師或其他有資格的觀察者記錄的癥狀的主觀緩解或客觀可識別的改善。
隱匿的神經(jīng)學進展提示可在所述疾病的癥狀發(fā)生前的階段檢測到MS，特別是在具有家族史風險的個體中。已知MS與基因遺傳因素相關，盡管有關的確切基因尚未得到表征。用于診斷MS的試驗包括磁共振影像學(MRI)、計算機體層攝影(CT)掃描、腰椎穿刺和腦脊液分析(CSF)，以及最終的誘發(fā)電位(EP)試驗，其可被細分為視覺誘發(fā)電位(VEP)、腦干聽覺誘發(fā)反應(BAER)和軀體感覺誘發(fā)電位(SSEP)。在癥狀發(fā)生前確認處于風險的個體允許預防性地施用本發(fā)明的組合物以防止疾病的明顯發(fā)作。
出于治療目的，“個體”或“患者”包括被任何疾病侵襲的任何人或動物，其中所述治療具有有益的治療效果。通常，用于確立臨床前數(shù)據(jù)且可通過本發(fā)明的化合物治療的動物為脊椎動物，如靈長類，包括猩猩、猴子和獼猴，嚙齒類，包括小鼠、大鼠、雪貂、家兔和倉鼠，家畜或狩獵動物，包括牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、犬、禽和魚。
在下文中，術語“口服施用”包括但不限于經(jīng)口施用通過胃腸道吸收(經(jīng)口的)，其中所述藥物被吞咽，或通過頰部、牙齦、舌、舌下和口咽施用在口腔中經(jīng)粘膜吸收。用于口服施用的組合物包括粉末或顆粒、在水或非水介質(zhì)中的混懸劑或溶液、囊劑、膠囊或片劑。增稠劑、稀釋劑、矯味劑、分散助劑、乳化劑、粘合劑或防腐劑可以是合乎需求的。
應該理解的是此處的短語或術語是出于描述而非限制的目的，使得本領域普通技術人員可根據(jù)此處提出的教導和指導，結合本領域普通技術人員的知識解釋本說明書的術語或短語。
除活性成分外，所述藥物組合物可含有形成生理學上可接受的且穩(wěn)定的制劑所必需的常規(guī)的可藥用載體、稀釋劑和賦形劑。術語“載體”、“稀釋劑”或“賦形劑”表示與此處公開的組合物的其他成分相容的成分，特別是不與本發(fā)明的化合物反應且對有待施用該制劑的患者或動物不過度有害的物質(zhì)。使得本發(fā)明的化合物治療有效且方便施用是本發(fā)明的一個不可分割的部分。
所述藥物組合物可為液體、氣溶膠或固體劑型，且可被配制為任何合適的制劑，包括但不限于如將為口服施用途徑所需的溶液、混懸劑、微膠粒、乳劑、微乳劑、氣溶膠、膠囊、片劑等。
用于口服施用的固體組合物例如片劑、丸劑、膠囊、軟膠囊等可通過將活性成分與常規(guī)的可藥用成分混合來制備，所述常規(guī)的可藥用成分的例子有玉米淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、環(huán)糊精、右旋糖酐、甘油、聚乙二醇化的甘油酯(polyglycolizedglyceride)、生育酚基聚乙二醇琥珀酸酯、十二烷基硫酸鈉、聚乙氧基蓖麻油、非離子型表面活性劑、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣和作為可藥用稀釋劑的樹膠。所述片劑或丸劑可使用本領域已知的可藥用材料涂布或另外復合，以提供給予長效或緩釋釋放的劑型，所述可藥用材料的例子有微晶纖維素和纖維素衍生物如羥丙基甲基纖維素(HPMC)。可制備用于口服施用的液體形式。所述液體組合物包括含水溶液，有或沒有有機共溶劑，水混懸劑或油混懸劑包括但不限于作為助懸劑的環(huán)糊精，配以食用油、甘油三酯和磷酯的矯味乳劑，以及酏劑及類似的藥用載體。此外，本發(fā)明的組合物可形成為氣霧劑，用于頰部和口咽施用。所述氣霧劑以噴霧劑的包裝規(guī)格的形式從加壓包裝或使用合適的拋射劑的霧化器方便地遞送，所述拋射劑的例子有二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加壓氣霧劑的情況中，可通過提供用于遞送測定量的閥來確定劑量單位。
可通過本領域熟知的工藝來生產(chǎn)本發(fā)明的藥物組合物，如通過常規(guī)的混合、溶解、?；⒀心?、粉碎、制錠、水磨、乳化、包膠、包埋或凍干工藝。
在將所述藥物組合物作為藥劑使用前，通常將它們配制成單位劑量。用于人類的活性劑量可通過標準的臨床技術確定，且在一日1-4次的用藥方案中，一般在每kg體重0.01mg至約50mg的范圍內(nèi)。優(yōu)選的劑量范圍隨著使用的特定化合物而變化，且其一般在每kg體重0.1mg至約20mg的范圍內(nèi)。然而，對本領域技術人員顯而易見的是劑量將由主治醫(yī)師根據(jù)下述的情況進行確定有待治療的疾病或病癥、其嚴重度、施用的方法和頻率、患者的年齡、體重、性別和醫(yī)療狀況、共存的治療、禁忌證(如果有的話)等。
有效劑量可根據(jù)體外或動物模型試驗系統(tǒng)得到的劑量響應曲線外推。例如基于由小鼠或大鼠研究產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，為得到用于人類的估計有效的mg/kg劑量，將小鼠或大鼠中的有效mg/kg劑量分別除以十二或六。
本發(fā)明的藥物組合物也可包括一種或多種另外的活性成分。特別地，本發(fā)明的口服有效的大麻素可聯(lián)合施用或與一種或多種用于MS治療的其他藥物結合使用。
第二種MS治療劑，其可為彼此相同或不同的，獨立地選自免疫調(diào)節(jié)劑、IFN-β、IFN-β-1a、IFN-β-1b、醋酸格拉默、免疫抑制劑、硫唑嘌呤、克拉屈濱、環(huán)磷酰胺、米托蒽醌、類固醇、抗驚闕劑、三環(huán)抗抑郁藥、抗炎藥、非甾體抗炎藥(NSAID)、選擇性5-羥色胺重吸收抑制劑(SSRI)、單胺氧化酶抑制劑(MOI)、抗抑郁藥、苯二氮卓類(BZD)、肌松劑、抗膽堿能藥物、β阻滯劑、緩瀉藥及某些特異性的通道阻滯劑。
另外一方面，本發(fā)明提供了一種用于減輕或治療多發(fā)性硬化癥的方法，其包括與至少一種選自以下的產(chǎn)品相結合向有相應需要的個體施用至少一種式(I)的化合物的步驟，所述產(chǎn)品為Avonex、Betaseron、Rebif、Copaxone、Novantrone及其他表明可用于多發(fā)性硬化癥治療的化合物。
這樣的第二種藥物的施用和劑量是根據(jù)醫(yī)師桌上手冊(PDR)中的批準藥物的產(chǎn)品信息表中所列出的目錄以及本領域中熟知的治療方案確定的。
當施用兩種或更多種活性成分以實現(xiàn)本發(fā)明的治療目標時，可以以用于組合施用的唯一的劑型或以分開的劑型進行聯(lián)合施用。本發(fā)明上下文中的組合施用被定義為表示在協(xié)調(diào)治療期間，施用一種以上的治療方法以獲得改善的臨床結果。這樣的組合施用可同時發(fā)生，且也可為同延的，即，發(fā)生在重疊的時段。
本發(fā)明的又一方面提供了一種預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的方法，其包括向有相應需要的個體施用口服有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括作為活性成分的式(I)的化合物及其可藥用鹽、酯或溶劑合物式I 具有特定的立體化學結構，其中C-4為S，在C-1和C-5的質(zhì)子彼此為順式，在C-4和C-5的質(zhì)子為反式；且其中R1選自(a)O或S，(b)C(R’)2，其中在各種情況下，R’獨立地選自氫、氰基、-OR”、-N(R”)2、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”或C1-C6烷基-N(R”)2，其中在各種情況下，R”獨立地選自氫、C(O)R”’、C(O)N(R”’)2、C(S)R”’、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR和C1-C6烷基-N(R”’)2，其中在各種情況下，R”’獨立地選自氫或飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基，及(c)NR”或N-OR”，其中R”如前述所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)-R”、-OR”、-N(R”)2、-SR”、-S(O)(O)NR”，其中在各種情況下，R”如前述所定義，(b)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb，其中Rb選自氫、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”和C1-C6烷基-N(R”)2，其中R”如前述所定義，及(c)由-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或-P(O)(ORe)2封端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，在各種情況下，Re選自氫，且Rd如前述所定義；R4選自(a)R，其中R選自氫、鹵素、OR”’、OC(O)R”’、C(O)OR”’、C(O)R”’、OC(O)OR”’、CN、N(R”’)2、NC(O)R”’、NC(O)OR”’、C(O)N(R”’)2、NC(O)N(R”’)2和SR”’，其中在各種情況下，R”’如前述所定義，(b)飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-R，其中R如前述所定義，(c)芳環(huán)，其可在任何位置被R進一步取代，其中R如前述所定義，及(d)任選地以芳環(huán)封端的飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基，該芳環(huán)可如(c)中所定義被進一步取代。
根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明提供了一種預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的方法，其包括向有相應需要的個體施用口服有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括作為活性成分的式(I)的化合物，其中R1為O，R2和R3各自為ORf，其中在各種情況下，Rf獨立地選自氫、-Rd和-C(O)-Rd，其中Rd為以-C(O)ORg封端的飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基鏈，且Rg為氫或飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，R4選自飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-Rh，其中Rh選自R和芳環(huán)，該芳環(huán)可在任何位置任選地被如前述定義的R進一步取代。
根據(jù)另外的實施方案，本發(fā)明提供了一種預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的方法，其包括向有相應需要的患者施用口服有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括作為活性成分的式(I)的化合物，其中R1為O，R2和R3各自獨立地選自OH、琥珀酸酯、富馬酸酯和亞甲氧羧基，R4選自1，1-二甲基戊基、1，1-二甲基庚基、1，1-二甲基-6-庚炔基、1，1-二甲基-3-苯基-丙基、1，1，3-三甲基-丁基、1-(4-氯-苯基)-1-甲基-乙基、1-乙基-1-甲基-丙基、5-溴-1，1-二甲基戊基或1，1-二甲基-戊-4-烯基。
根據(jù)一典型的實施方案，本發(fā)明提供了一種預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的方法，其包括向有相應需要的患者施用口服有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括作為活性成分的式(I)的化合物，其中R1為O，R2為OH，R3為富馬酸酯，R4為1，1-二甲基庚基。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種預防、減輕或治療選自震顫、痙攣、肌無力以及協(xié)調(diào)喪失的神經(jīng)學癥狀的方法，其包括向有相應需要的個體施用口服有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括作為活性成分的如上定義的式(I)的化合物。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)炎癥性介質(zhì)的方法，其包括向有相應需要的個體施用口服有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括作為活性成分的如上定義的式(I)的化合物。
本發(fā)明的另一方面提供了口服有效的式(I)的化合物及其可藥用鹽、酯或溶劑合物用于制備預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的藥劑的用途式I
具有特定的立體化學結構，其中C-4為S，在C-1和C-5的質(zhì)子彼此為順式，在C-4和C-5的質(zhì)子為反式；且其中R1選自(a)O或S，(b)C(R’)2，其中在各種情況下，R’獨立地選自氫、氰基、-OR”、-N(R”)2、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”或C1-C6烷基-N(R”)2，其中在各種情況下，R”獨立地選自氫、C(O)R”’、C(O)N(R”’)2、C(S)R”’、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”’和C1-C6烷基-N(R”’)2，其中在各種情況下，R”’獨立地選自氫或飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基，及(c)NR”或N-OR”，其中R”如前述所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)-R”、-OR”、-N(R”)2、-SR”、-S(O)(O)NR”，其中在各種情況下，R”如前述所定義，(b)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb，其中Rb選自氫、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”和C1-C6烷基-N(R”)2，其中R”如前述所定義，及(c)由-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或-P(O)(ORe)2封端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，在各種情況下，Re選自氫，且Rd如前述所定義；R4選自
(a)R，其中R選自氫、鹵素、OR”’、OC(O)R”’、C(O)OR”’、C(O)R”’、OC(O)OR”’、CN、N(R”’)2、NC(O)R”’、NC(O)OR”’、C(O)N(R”’)2、NC(O)N(R”’)2和SR”’，其中在各種情況下，R”’如前述所定義，(b)飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-R，其中R如前述所定義，(c)芳環(huán)，其可在任何位置被R進一步取代，其中R如前述所定義，且(d)任選地以芳環(huán)封端的飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基，該芳環(huán)可如(c)中所定義被進一步取代。
根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明提供了口服有效的式(I)的化合物用于制備預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的藥劑的用途，其中R1為O，R2和R3各自為ORf，其中在各種情況下，Rf獨立地選自氫、-Rd和-C(O)-Rd，其中Rd為以-C(O)ORg封端的飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基鏈，且Rg為氫或飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，R4選自飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-Rh，其中Rh選自R和芳環(huán)，該芳環(huán)可在任何位置任選地被如前述定義的R進一步取代。
根據(jù)另外的實施方案，本發(fā)明提供了口服有效的式(I)的化合物用于制備預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的藥劑的用途，其中R1為O，R2和R3各自獨立地選自OH、琥珀酸酯、富馬酸酯和亞甲氧羧基，R4選自1，1-二甲基戊基、1，1-二甲基庚基、1，1-二甲基-6-庚炔基、1，1-二甲基-3-苯基-丙基、1，1，3-三甲基-丁基、1-(4-氯-苯基)-1-甲基-乙基、1-乙基-1-甲基-丙基、5-溴-1，1-二甲基戊基或1，1-二甲基-戊-4-烯基。
根據(jù)一典型的實施方案，本發(fā)明提供了口服有效的式(I)的化合物用于制備預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的藥劑的用途，其中R1為O，R2為OH，R3為富馬酸酯，R4為1，1-二甲基庚基。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了口服有效的如上定義的式(I)的化合物用于制備預防、減輕或治療如前定義的神經(jīng)學癥狀的藥劑的用途。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了口服有效的如上定義的式(I)的化合物用于制備調(diào)節(jié)炎癥性介質(zhì)的藥劑的用途。
通過參考下述實施例，本發(fā)明的原理將得到更充分地理解，所述實施例說明了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，且以非限定的方式進行解釋。
實施例提供下述實施例以解釋和進一步說明本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案以及方面，且將不解釋為限制其范圍。用于制備體外或體內(nèi)模型的大部分技術、化合物的測試和結果的分析是本領域中廣泛實踐的，且大部分從業(yè)者熟悉描述特定條件和操作的標準來源材料。然而，為方便起見，下述描述可起到指導的作用。
在隨后的實驗公開內(nèi)容中，應用了下述縮寫N(正常)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；μM(微摩爾)；mmol(毫摩爾)；kg(千克)；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(納克)；pg(皮克)；ml(毫升)；μl(微升)；mm(毫米)；μm(微米)；h(小時)；min(分鐘)；℃(攝氏度)；i.p.(腹腔注射)；i.v.(靜脈注射)；p.o.(口服)；s.c.(皮下地)；AUC(曲線下面積)；SD(標準差)；SEM(平均值的標準誤)；nr(非相關的)和ns(非顯著的)。
為了方便和更好的理解，實施例部分被分為兩個小部分化學部分描述了本發(fā)明的化合物的合成、它們的某些理化性質(zhì)及它們的制劑；生物學部分描述了所述化合物的生物活性。
化學部分之前在國際專利申請WO 03/063758中公開了本發(fā)明的某些化合物的合成。為方便起見，下文再現(xiàn)了這些方法。之前化合物18A至18F在WO03/063758中分別公開為A、R、S、T、Y和Z?；衔?8G至18I為使用類似的起始物料或合成路線的新型的衍生物。對大麻素化合物領域的技術人員顯而易見的是存在備選的合成方法。
實施例1化合物18A的合成(-)-4-[4-(1，1-二甲基庚基]-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮路線1描述了化合物18A的合成，其中，間苯二酚化合物的R部分是1，1-二甲基庚基。
路線1 在-78℃于氮氣氛下，向含有正丁基鋰(196ml，2M)和44g叔丁醇鉀的三頸瓶中滴加50ml(+)-α-蒎烯(1)。使反應物升至室溫并持續(xù)攪拌48小時。接著冷卻反應物至-78℃。加入在80ml乙醚中的三甲基硼酸酯(113ml)，且使所述反應物升至室溫并再另外攪拌一小時。分離有機層，并用正己烷(3×80ml)萃取水層。用鹽水洗滌合并的有機相，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥以得到化合物(2)——(+)-β-蒎烯。此步驟根據(jù)Brown等人的方法[Brown H.C.等人，J.Org.Chem.541764-6，1989]。向(+)-β-蒎烯(2)(30.8g)中加入RuCl3(0.470g)和溶解在250ml乙酸乙酯中的芐基三丁基氯化銨(2.12g)。向此混合物中，滴加溶于1.3L水中的高碘酸鈉(145.5g)，室溫攪拌3個小時并放置過夜。向反應混合物中加入250ml乙酸乙酯。分離有機相，用500ml鹽水、500ml 10％的亞硫酸鈉洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，在減低的壓力下過濾、蒸發(fā)得到化合物(3)——(-)-諾蒎酮。此步驟根據(jù)Yuasa等人的方法[Yuasa Y.等人，J.Essent.Oil.Res.1039-42，1998]。將(-)-諾蒎酮(3)(14.86g)和對甲苯磺酸(1.48g)溶解在異戊二烯乙酸酯(148ml)中。使用Dean-Stark裝置在回流下加熱反應混合物5小時以除去丙酮。在減低的壓力下除去溶劑，將殘留物收入400ml乙醚中，用水洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾并濃縮得到化合物(4)——(+)-諾蒎酮烯醇乙酸酯。此步驟基于由Archer等人研發(fā)的用于相對的對映體的方法[Archer R.A.等人，J.Org.Chem.422277-84，1977]。向16.17g(+)-諾蒎酮烯醇乙酸酯(4)的202ml無水甲苯溶液中加入62.2g Pb(OAc)4(預先在真空中經(jīng)P2O5/KOH干燥過夜)。在80℃加熱此反應混合物3.5小時，冷卻、過濾、用飽和碳酸氫鈉洗滌。分離有機層，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，并在減低的壓力下蒸發(fā)得到(+)-6，6-二甲基-2，4-二乙酰氧基-2-諾蒎烯(5)和(-)-6，6-二甲基-2，2-二乙酰氧基-3-諾蒎烯(6)。使得5和6(1.18g，5mmol)、其中R為1，1-二甲基庚基的間苯二酚(7)(1.18g，5mmol)及在氯仿(50ml)中的對甲苯磺酸(0.95g，5mmol)的混合物在室溫反應4小時。接著加入乙醚(30ml)，并用飽和碳酸氫鈉、水洗滌有機相，接著經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)。使得殘留物在乙腈中結晶以得到0.5g晶體。將母液經(jīng)硅膠柱層析以進一步得到0.7g純化合物18A。
實施例2化合物18B的合成(-)-4-{4-(1，1-二甲基庚基]-2-琥珀酸酯-6-羥基-苯基}-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮化合物18B的合成于路線2中描述。
實施例3化合物18C的合成(-)-4-{4-(1，1-二甲基庚基]-2，6-二琥珀酸酯-苯基}-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮化合物18C的合成于路線2中描述。
在氮氣氛下，將無水吡啶(10ml)中的化合物18A(227mg，0.61mmol)和琥珀酸酐(731mg，7.31mmol)的混合物加熱至50℃。加入叔丁醇鉀并將得到的混合物攪拌過夜(50℃)。將所述混合物倒入1N HCl中，并用乙酸乙酯萃取。用1N HCl和鹽水洗滌合并的有機相，并對其進行干燥(Na2SO4)和蒸發(fā)。通過柱層析(石油醚中20％的乙酸乙酯，+0.1％乙酸)分離兩種產(chǎn)物，得到220mg的化合物18B和150mg的化合物18C。
路線2 實施例4化合物18D的合成(-)-4-{4-(1，1-二甲基庚基]-2，6-雙-二乙基磷酸酯-苯基}-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮化合物18D的合成于路線3中描述。
路線3
反應在氮氣氛下進行。向化合物18A(1.97g，5.29mmol)在新鮮蒸餾的THF中的良好攪拌的溶液加入叔丁醇鉀(1.54g，13.75mmol)，并將該混合物攪拌10分鐘。接著加入氯磷酸二乙酯并將反應混合物攪拌過夜。加入水并用乙酸乙酯萃取水相。使用鹽水洗滌合并的有機層，并對其進行干燥(Na2SO4)和蒸發(fā)。在硅膠上使用25％-70％的乙酸乙酯-石油醚作為洗脫劑通過層析純化得到2.2g的純化合物18D。
實施例5化合物18E的合成(-)-4-{4-(1，1-二甲基戊基]-2-琥珀酸酯-6-羥基-苯基}-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物18E的合成類似于描述于路線2中的化合物18B的合成。僅有的不同在于起始物料，雖然化合物18A產(chǎn)生化合物18B，但當間苯二酚化合物的R部分為1，1-二甲基戊基而不是1，1-二甲基庚基時，使用同18A的合成步驟制備化合物18E的起始物料。
實施例6化合物18F的合成(-)-4-{4-[1，1-二甲基庚基]-2-富馬酸酯-6-羥基-苯基}-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物18F的合成于路線4中描述。
路線4
將化合物18A(600mg，1.6mmol)溶解于100ml的無水乙醚中。接著加入0.21ml的三乙胺(1.6mmol)和0.18ml的富馬酰氯(1.7mmol)。攪拌約15分鐘后，過濾三甲基氯化銨鹽并蒸發(fā)濾液。然后向殘留物中加入乙酸乙酯并用水洗滌三次直至pH高于4。再用飽和氯化鈉洗滌有機相，經(jīng)硫酸鈉干燥，并過濾和濃縮。化合物18F接著在硅膠上使用20％的乙酸乙酯和石油醚作為洗脫劑通過柱層析純化。
實施例7化合物18G的合成(-)-4-{4-[1，1-二甲基庚基]-2，6-二富馬酸酯-苯基}-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物18G的合成于路線5中描述。
路線5 將化合物18A(2g，5.37mmol)溶解于100ml的無水乙醚中并冷卻至-40℃。接著加入1.9ml三乙胺(13.71mmol)和1.5ml富馬酰氯(13.73mmol)。在-40℃攪拌該混合物約15分鐘后，加入100ml水并在室溫另外攪拌15分鐘。接著，將此反應混合物轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，且水層用乙酸乙酯萃取三次，每次用300ml乙酸乙酯。接著用水繼之以飽和氯化鈉洗滌有機相，經(jīng)硫酸鈉干燥，并過濾和在減低的壓力下濃縮。然后在硅膠上使用10∶90比例的石油醚和乙酸乙酯作為洗脫劑，通過快速層析法純化化合物18G，得到0.68g純化合物18G(收率24％)。
實施例8化合物18H的合成(-)-4-{4-[1，1-二甲基戊基]-2-富馬酸酯-6-羥基-苯基}-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物18H的合成類似于描述于路線4中的化合物18F的合成。僅有的不同在于起始物料，雖然化合物18A產(chǎn)生化合物18F，但當間苯二酚化合物的R部分為1，1-二甲基戊基而不是1，1-二甲基庚基時，使用同18A的合成步驟制備化合物18H的起始物料。
實施例9化合物18I的合成(-)-4-{4-[1，1-二甲基庚基]-2-(亞甲氧羧基)-6-羥基-苯基}-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物18I的合成于路線6中描述。
路線6 室溫下，將化合物18A(374mg，1mmol)溶解于20ml的二氯甲烷中并加入20mg溴化銅(溶液A)。在分離容器中，向10ml二氯甲烷中加入148mg(1.01mM)的二偶氮乙酸叔丁酯(diazotertbutylacetate)。經(jīng)5分鐘的時間向溶液A滴加第二種溶液。在室溫攪拌得到的反應混合物3小時。接著過濾此反應混合物并在減低的壓力下濃縮濾液至干燥。在二氯甲烷∶三氟乙酸TFA(10∶1)中溶解殘留物并在室溫攪拌2小時。在減低的壓力下濃縮得到的溶液至干燥，并在硅膠上使用6∶1比例的石油醚和乙酸乙酯作為洗脫劑通過柱層析純化殘留物，得到7mg的純化合物18I。
實施例10理化性質(zhì)繼化合物18A的活性的發(fā)現(xiàn)先前公開在國際專利申請WO 03/063758中之后，已努力合成更具水溶性或在體內(nèi)水解為母體化合物的相關化合物，化合物18B至18I是這種方法的非限制性的實施例。
優(yōu)選地結合至CB2且具有優(yōu)于Δ9-THC的水溶性的化合物包括(-)-4-[4-(1，1-二甲基-6-庚炔基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮、(-)-4-[4-(1，1-二甲基-3-苯基-丙基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮、(-)-4-[2，6-二羥基-4-(1，1，3-三甲基-丁基)-苯基]-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮、(-)-4-{4-[1-(4-氯-苯基)-1-甲基-乙基]-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮、(-)-4-[4-(1，1-二甲基-戊基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮、(-)-4-[4-(1-乙基-1-甲基-丙基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮、(-)-4-[4-(5-溴-1，1-二甲基戊基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮、(-)-4-{4-[1，1-二甲基庚基]-2-琥珀酸酯-6-羥基-苯基}-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮、(-)-4-{4-[1，1-二甲基庚基]-2，6-二琥珀酸酯-苯基}-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮、(-)-4-[4-(1，1-二甲基-戊-4-烯基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮、(-)-4-{4-[1，1-二甲基戊基]-2-琥珀酸酯-6-羥基-苯基}-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮、(-)-4-{4-[1，1-二甲基庚基]-2-富馬酸酯-6-羥基-苯基}-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮、(-)-4-{4-[1，1-二甲基庚基]-2，6-二富馬酸酯-苯基}-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮、(-)-4-{4-[1，1-二甲基戊基]-2-富馬酸酯-6-羥基-苯基}-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮和(-)-4-{4-[1，1-二甲基庚基]-2-(亞甲氧羧基)-6-羥基-苯基}-6，6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
關于某些這樣的化合物的某些理化性質(zhì)的信息被示于下表中。使用高級化學開發(fā)軟件(ACD labs，版本4.04)計算在pH 7的期望的水溶性、logP和logD。THC和大麻隆都是可商購獲得的大麻素，在此報道作為參考。
表1所選擇的理化性質(zhì)
在含水緩沖液中評估本發(fā)明的某些化合物的實際溶解度，并使用HPLC和分光光度法測定化合物的最終濃度。應注意，發(fā)現(xiàn)根據(jù)計算應顯示約0.57mg/ml水溶性的化合物18F溶解在pH 7.8、80mM磷酸鹽緩沖液中的濃度高達12mg/ml，比期望值高出約20倍。作為比較，根據(jù)相同的計算，應顯示約24μg/ml水溶性的化合物18B在高于95μg/ml的濃度時，不能溶解在含水檸檬酸緩沖液(pH 7.1)中，表明與預測值相比具有少于4倍的偏離。因此，按照同一原理設計的化合物產(chǎn)生了意想不到的不同結果，如與水溶液中的溶解度相關的結果。
應注意的是下列凍干的化合物18F甚至能夠更有效地溶解在pH 6.9、80mM的磷酸鹽緩沖液中，濃度高達60mg/ml，約高出預期值兩個數(shù)量級。
實施例11凍干凍干是一種通過真空升華從凍結的產(chǎn)物中除去水或溶劑混合物的干燥方法。該方法適用于在含水溶液中相對不穩(wěn)定的藥物。凍干方法的其他優(yōu)點是能夠顯著改善合成藥品的水溶性。因此，對本發(fā)明的一種優(yōu)選化合物進行了凍干方法的可行性評價。
為了獲得用于溶解化合物18F最好的溶劑混合物，進行了幾項實驗并且發(fā)現(xiàn)叔丁醇和水以62.5∶32.5(v/v)的比例組合是在有機潛溶劑溶液中溶解最高達80mg/ml化合物18F的最優(yōu)比例。
發(fā)現(xiàn)了一種快速凍結的方法，即將制備好的溶液沉在干冰中，由于通過這種方法獲得了更疏松的物質(zhì)，因此其優(yōu)于低溫冰箱(-30℃)中的緩慢凍結。在一個凍干循環(huán)中將約11g的化合物18F進行凍干。將一種含有38.6％w/v的化合物18F的潛溶劑混合物分裝在幾個皿中，使之適合凍干室。由于凍干，獲得了物理性質(zhì)(如流動性和較小的粘性)有所改善的干燥產(chǎn)物。增溶實驗表明如果用0.5N的NaOH持續(xù)滴定pH至約6.9或以上，凍干的化合物18F可以在80mM的磷酸鹽緩沖液中溶解至約60mg/ml，相比之下，非凍干的物質(zhì)可溶解約10mg/ml，計算的預期值約為0.6mg/ml。
實施例12在含水溶液中的穩(wěn)定性比較了本發(fā)明的化合物在含水溶液中的穩(wěn)定性。將化合物溶解在磷酸鹽緩沖液中，并使用HPLC和分光光度法監(jiān)測它們的濃度。化合物18F在磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中的濃度為2mg/ml時，可以在4℃穩(wěn)定至少3個月，而化合物18B在檸檬酸鹽緩沖液(pH7.1)中的濃度為95μg/ml時，在4℃時不到24小時即水解。因此，按照同一原理設計的化合物產(chǎn)生了意想不到的不同結果，例如與在含水溶液中的穩(wěn)定性相關的結果。
在一系列實驗體系中評價了本發(fā)明口服生物活性的大麻素的治療效果，以支持這些藥物做為免疫調(diào)節(jié)劑、抗炎劑、止痛劑和神經(jīng)保護劑的應用。對這些效果進行了體外和體內(nèi)評價，并使用下面描述的系統(tǒng)證實。除非另有說明，否則按照下述方法制備受試化合物進行體外試驗時，首先將化合物溶解在DMSO中，然后用試驗緩沖液(一般為組織培養(yǎng)培養(yǎng)基)逐步稀釋，直到DMSO的終濃度為0.1％。進行體內(nèi)試驗時，(i)首先用CREMOPHOR EL:乙醇(分別為70％和30％w/w)溶解受試化合物，然后用生理緩沖液(一般為鹽水)以1∶20的比例進一步稀釋，到達適當?shù)膭┝?；?ii)用pH7.8(將2mg/ml母液的最終pH調(diào)節(jié)到pH6.4，以進一步增強長期穩(wěn)定性)的80mM磷酸鹽緩沖液溶解化合物。達到最優(yōu)溶解和穩(wěn)定性的磷酸鹽緩沖液制劑的最終摩爾濃度為68.1mM HNa2PO4·7H2O、5.5mM H2NaPO4·2H2O(用于緩沖性質(zhì))和35.5mM NaCl(用于等滲)。根據(jù)藥物濃度加入HCl以達到期望的pH。因此，對照載體是以適當緩沖液稀釋的原始“溶劑”(在CREMOPHOR EL:乙醇的情況中以CE表示)或pH6.4的磷酸鹽緩沖液(以PB表示)。
根據(jù)以色列動物保護法案(動物實驗，1994年)，所有的動物實驗在人道的條件下施行。所有研究都經(jīng)國內(nèi)倫理委員會評審，且由國家負責機構(National responsible authority)批準。
生物學部分實施例13對CB1和CB2受體的結合親和力按照國際專利申請WO 03/063758中的描述施行CB1和CB2的結合試驗，結果在下表中報告，以IC50表示，單位為nM。DMH代表1，1-二甲基庚基，DMP代表1，1-二甲基戊基，DEP代表磷酸二乙酯。
表2式(I)化合物的取代基和IC50(nM)
*給出THC的結合值用于比較，且指的是Ki值(nM)。
實施例14對MBP誘發(fā)的急性EAE的效應實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)也稱為實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎，是一種多發(fā)性硬化癥的動物模型。根據(jù)誘發(fā)方法、動物品系和用于誘發(fā)該疾病的抗原，本領域已知多種EAE模型。EAE是一種急性或慢性復發(fā)的、獲得性炎癥和脫髓鞘的自身免疫性疾病。EAE的不同形式在很多方面非常類似MS的各種形式和階段。
在本研究中，通過注射髓磷脂堿性蛋白(MBP)誘發(fā)EAE，這是一種已知的建立MS急性期模型的方法。在這種模型中，在誘發(fā)后約第10天時通過臨床癥狀的出現(xiàn)觀察到疾病的發(fā)作。在疾病誘發(fā)后第23天左右，觀察到疾病的進展、臨床評分增加、第15天左右的高峰期以及自發(fā)恢復。
從皮下向雌性Lewis大鼠(平均體重130-180g，以色列Harlan)的后爪中注射25μg純化的、以0.1ml弗氏完全佐劑(Difco)乳化的豚鼠髓磷脂堿性蛋白(MBP，sigma)。根據(jù)12小時光照/12小時黑暗的方案飼養(yǎng)動物，溫度恒定為22℃，自由進食、進水。從誘發(fā)后第8天開始，每天對動物進行追蹤觀察。將結果記錄為臨床評分；0分表示動物正常，無臨床癥狀，0.5分表示尾部遠端失去緊張性，1分表示整個尾部麻痹，1.5分表示一條后腿無力，2分表示兩條后腿無力，2.5分表示一條前腿麻痹，3分表示四條腿全部麻痹，4分表示整個身體麻痹，處于瀕死狀態(tài)，5分表示死亡。疾病發(fā)作后記錄動物的臨床評分約15天，直到誘發(fā)后第25天時研究結束，且計算這段時間的曲線下面積(AUC)。
對于表現(xiàn)出疾病癥狀，臨床評分在0.5和1之間的動物，從疾病發(fā)作開始連續(xù)三天(約為疾病誘發(fā)后的第9-11天)使用受試化合物或?qū)φ蛰d體進行治療。評價了幾種施用途徑，且通過靜脈施用(載體為CE)或以5mg/kg的體積劑量經(jīng)由灌胃口服施用(載體為PB)來進行治療。
在研究的最后一天(第25天)通過腹腔注射100mg/kg的戊巴比妥鈉對動物施行安樂死。
結果以平均值±SEM表示，且先后通過方差分析(ANOVA)和杜凱氏事后比較檢驗分析治療組之間的差異。認為p＜0.05時具有統(tǒng)計學意義，并在圖上通過給相關治療組加星號表示。
使用甲基潑尼松龍作為陽性對照證實模型的有效性。從MBP注射誘發(fā)疾病的那天開始，每天靜脈注射施用30mg/kg的類固醇，連續(xù)5天，據(jù)報道AUC減少了34％。因為據(jù)報道類固醇在本模型的此類條件下無效，所以在這項研究中未證實甲基潑尼松龍在疾病發(fā)作后的生物活性。
結果表明化合物18A以劑量相關的方式導致AUC臨床評分減少，當以0.5-1mg/kg的低劑量靜脈注射時顯著減少30-35％。因此，在疾病臨床發(fā)作后連續(xù)3天施用本發(fā)明的化合物與疾病臨床發(fā)作前從誘發(fā)時開始連續(xù)5天施用甲基潑尼松龍同樣有效。此外，應該注意到達到相同效應所需的劑量顯著不同。用甲基潑尼松龍預防性治療時，動物的劑量為5×30mg/kg，而在臨床發(fā)作后僅使用3×1mg/kg的化合物18A就可以達到相似的結果。
結果還表明從治療組動物中取出腦和脊髓，固定、切片并用蘇木精和伊紅染色，結果顯示浸潤病灶顯著減少。這些觀察結果證明了在這種模型中，功能性臨床結果的改善與神經(jīng)系統(tǒng)組織學水平的神經(jīng)保護作用之間存在相關性。
將化合物18A溶解在CREMOPHOR EL:乙醇中，并在靜脈注射施用前用生理緩沖液進一步稀釋。目前發(fā)現(xiàn)化合物18F能夠直接溶解在80mM的磷酸鹽緩沖液(pH6.4)中，并可口服施用。通過灌胃口服將化合物18F施用至表現(xiàn)出疾病臨床癥狀的動物，劑量為20、30、40、50和60mg/kg。每個治療組至少包括10只發(fā)病的動物。在某些劑量，重復實驗達4次。
本研究中觀察到了低的死亡率(低于10％)，且在不同的治療組之間關于這個參數(shù)并無差異。8％的載體(PB)治療動物在研究完成前死亡，而口服60mg/kg化合物18F的動物死亡率為7％。此外，重復施用化合物18F后未觀察到CB1介導的副作用。這一觀察結果證實了本發(fā)明化合物的安全性。
在圖1中描述了結果。分圖A顯示了疾病的時程，和以每個研究日的組評分平均值(MGS)表示的口服施用不同劑量化合物的效果。雖然口服20mg/kg的化合物18F不顯著影響臨床結果，但劑量為30mg/kg時已經(jīng)觀察到明確的評分減少趨勢，且劑量為40-60mg/kg時似乎表現(xiàn)出相似的效應。認為將臨床評分的峰值降低至接近一分時具有顯著的治療意義，應特別注意的是未治療動物的最大臨床評分約為2.2。
可選地，通過計算由給定治療組個體疾病最嚴重時(通常為施用MBP后的第13-16天左右)獲得的最大評分的平均值(MMS)來分析結果。在分圖B中描述了這項信息，其中可以清楚地看到口服20mg/kg的劑量時僅觀察到改善的趨勢，而劑量為30-60mg/kg時MMS至少顯著減少30％。最后，通過第三個參數(shù)AUC分析結果，它不僅考慮了疾病最嚴重時的治療效果，還考慮了疾病全程直到自發(fā)緩解時的效果。分圖C顯示了不同治療組的曲線下面積，且通過這一方法最佳地記錄了與劑量相關的效應。最佳的活性劑量為50和60mg/kg，它們分別將AUC減少42％和43％。與載體治療組相比，這些效應具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。40mg/kg的劑量將AUC減少33％(p＜0.05)，且30mg/kg的劑量可見中度活性，其將AUC減少20％以上(ns)。
總而言之，這些結果證明化合物18F做為一種治療藥物施用(3-4次，從表現(xiàn)臨床疾病的那天開始)，可以減少Lewis大鼠急性EAE模型的疾病嚴重程度。這種活性以其降低疾病嚴重程度(圖1的分圖A)、最大評分平均值(圖1的分圖B)和AUC(圖1的分圖C)的能力來表示。此外，初步結果顯示其具有抑制EAE相關疼痛的趨勢(通過機械痛覺增敏測定)。在這項研究中口服60mg/kg劑量的化合物18F增加了痛閾，與載體治療的動物相比增加25％。
有文獻報道了IFN-β在此類動物模型中的效應。例如，施用IFN-β(Rebif，劑量為300,000IU，每天一次，從MBP注射開始連續(xù)3天)將疾病的嚴重程度降低約30％。Van Der Meide等人[Van Der Meide等人，J.Neuroimmunol.84(1)14-23，1998]表明用IFN-β做為預防藥物治療(從MBP注射前2天開始，在疾病發(fā)作前總共連續(xù)10天)可以在疾病最嚴重時將疾病嚴重程度減少1分。這些數(shù)據(jù)與本發(fā)明的化合物達到的效應相似，但是應該強調(diào)兩個關鍵點在這些報告中，IFN-β是以注射施用的，而且是在疾病完全發(fā)作前施用。已報道在晚期開始使用IFN-β治療是無效的[Ruuls等人，Immunol.Cell.Biol.76(1)65-73，1998]。
為與口服施用的大麻素進行比較，已經(jīng)報道在使用自體脊髓接種產(chǎn)生EAE的大鼠中，Δ8-THC減少了神經(jīng)缺陷的發(fā)生率且降低了其嚴重程度[Wirguin I.等人，Immunopharmacology 28(3)209-14，1994]。作者報道平均疾病嚴重程度從載體治療動物的5.5±0.8降低到Δ8-THC治療動物的4.4±0.8，其降低了20％，具有統(tǒng)計學意義。但是，應該注意到Δ8-THC是更穩(wěn)定的、對神經(jīng)影響更小的Δ9-THC類似物，在疾病誘發(fā)開始時、疾病臨床發(fā)作前，以40mg/kg的劑量口服施用，持續(xù)每天施用，連續(xù)21天即可表現(xiàn)出這種有益的作用。因此，參照物大麻素THC達到效應所需的累積劑量比本化合物高得多。
因此，本發(fā)明的化合物在治療疾病的急性高峰期時比IFN-β(代表本療法)和Δ8-THC(代表用于這種適應癥的可商購獲得的大麻素藥物)都有優(yōu)勢，因為與前者相比，本發(fā)明的大麻素甚至在口服施用時也是有效的；與后者相比，在重復施用次數(shù)少得多的情況下它們也有效。此外，甚至在疾病臨床癥狀出現(xiàn)后僅施用3-4次時，本發(fā)明的化合物也是有效的，而兩個前面提到的對照IFN-β和Δ8-THC，在此類模型中僅在接近疾病誘發(fā)開始時頻繁施用且經(jīng)常重復施用持續(xù)至21天時才有效。
實施例15對PLP誘發(fā)的復發(fā)-緩解型EAE的效應如上述解釋，不同的誘導劑在不同的動物種類中形成的EAE模型略有不同。雖然實施例14中使用的MBP產(chǎn)生了其中復制疾病單次復發(fā)急性期的模型，但蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)誘發(fā)了復發(fā)-緩解型疾病，其與MS患者中神經(jīng)缺陷結果的最初模式更相似。
在三個區(qū)域(側腹和頸背)通過皮下給每只SJCLF1雌性小鼠(6周齡，以色列Harlan)施用0.2ml乳化的含有50μg PLP和200μg結核分支桿菌的弗氏佐劑。此后立即給每只小鼠靜脈注射施用0.1ml含有130ng百日咳毒素的磷酸鹽緩沖液(PBS)。48小時后重復這個誘導過程。根據(jù)12小時光照/12小時黑暗方案飼養(yǎng)動物，溫度恒定為22℃，自由進食、進水。每周給動物稱一次體重，并根據(jù)下列評分系統(tǒng)進行臨床評價和評分0分表示動物正常，無臨床癥狀，0.5分表示尾部遠端失去緊張性，1分表示整個尾部麻痹，1.5分表示一條后腿無力，2分表示兩條后腿無力，2.5分表示一條前腿麻痹，3分表示四條腿全部麻痹，4分表示整個身體麻痹，處于瀕死狀態(tài)，5分表示死亡。
第一個高峰期被定義為至少一個分值單位的增加，該分值單位在動物已注射疾病誘導劑后，至少連續(xù)維持兩天。當動物證明最大分數(shù)的峰值降低至少50％并已穩(wěn)定至新的分數(shù)至少2天時，即獲得好轉(zhuǎn)。在首次復發(fā)的高峰期(在第25天)開始治療，且通過灌胃，以5ml/kg的體積劑量進行載體(PB)或化合物的每日施用，持續(xù)25天。第三組由未治療的動物組成。各治療組包括13只小鼠。跟蹤觀察動物達兩個月，且在這期間，在最初的第一次疾病高峰期，觀察到兩至三次小的復發(fā)。
在研究末期，向小鼠進行腹腔注射100mg/kg的戊巴比妥鈉，施行安樂死。在進行組織學評價前，取出脊髓和腦，并在4％的甲醛溶液中固定。
結果表示為平均值±SEM，且依次通過方差分析(ANOVA)和杜凱氏事后檢驗來分析治療組間的差異。認為p＜0.05時具有統(tǒng)計學意義。
化合物18F以40mg/kg的劑量口服施用25天。在此期間沒有觀察到副作用，這證實了本發(fā)明的化合物的安全性。隨時間的臨床評分結果描述于圖2中。因為動物在首次復發(fā)的高峰被分入治療組，所以在此研究中，對比的參數(shù)是復發(fā)后的時間以及高峰出現(xiàn)后的增幅。用載體治療的動物顯示出基本類似于未治療的動物的模式。第二次復發(fā)起始于第35天和第33天，且第二次復發(fā)的平均臨床評分分別為0.7和0.8。因此，將這兩組的平均結果作為對照描述于圖2中。用化合物18F治療的動物表現(xiàn)與對照不同。第二次高峰的臨床評分僅為0.5(與約為1分的第一次高峰相比)，且與對照相比，復發(fā)延遲了5-7天。當將結果與對照組相比，并作為使用化合物18F治療獲得的臨床評分的降低百分數(shù)進行分析時，可明顯看到從治療開始后的第13天(第38天)起直到研究末期，化合物18F平均減少了28％的臨床評分。在復發(fā)高峰最佳地觀察到了此現(xiàn)象，例如在第二次復發(fā)高峰(第42-43天)，化合物18F引起臨床評分35％至52％的顯著降低。最終，當計算從第一次緩解期間的第35天開始至研究結束(第58天)的跨度期間的AUC時，可見與對照相比，化合物18F引起了AUC的74％的高度顯著的減少(AUC對照＝8.1vs.AUC化合物18F＝2.1；p＝0.0025)。
總而言之，這些結果說明在PLP誘發(fā)的復發(fā)-緩解型EAE中，化合物18F作為一種治療劑從疾病的高峰期開始施用，降低了疾病的嚴重程度。這種活性通過其下述能力表現(xiàn)(a)延遲隨后復發(fā)的反復，(b)降低隨后復發(fā)高峰的平均臨床評分并(c)減少AUC。這項研究顯示本發(fā)明的化合物可有效抵抗各階段的MS。通過增強顳窗(temporal window)，還可進一步加強本發(fā)明的化合物的效能，在該顳窗中的施用具有有益的效果。先前在臨床癥狀發(fā)作時施用化合物，而現(xiàn)在是在疾病的高峰期施用。應緊記的是，某些顯示效能的現(xiàn)有的MS治療僅當預防性或伴隨疾病的誘發(fā)同時施用時，才屬于類似的模式。
實施例16對MOG誘發(fā)的慢性進展型EAE的效應在顯示了本發(fā)明的化合物于模擬MS的急性階段和復發(fā)緩解型的EAE模型中的效能后，建立了第三種模型，其中髓鞘少突膠質(zhì)糖蛋白(MOG)被用于誘發(fā)該疾病的慢性進展形式。
在每只C57/BL雌性小鼠(6周大，以色列Harlan)側腹的兩個區(qū)域，皮下施用0.2ml含有200μg MOG和200μg結核分支桿菌的乳化的弗氏佐劑。在一周后重復此誘導過程。根據(jù)12小時光照/12小時黑暗的方案飼養(yǎng)動物，溫度恒定為22℃，自由進食、進水。動物每周稱重一次并根據(jù)下列評分系統(tǒng)進行臨床評價和評分0分表示動物正常，沒有臨床癥狀，0.5分表示尾部的遠端部分喪失緊張性，1分表示整個尾部麻痹，1.5分表示一條后腿無力，2分表示兩條后腿無力，2.5分表示一條前腿麻痹，3分表示四條腿全部麻痹，4分表示整個軀體麻痹且處于瀕死狀態(tài)，5分表示死亡。
在疾病發(fā)作后的第13天，動物達到為0.8的平均臨床評分時開始治療。每天經(jīng)灌胃口服施用載體(PB)或化合物(20、40和60mg/kg的化合物18F)，體積劑量為5ml/kg，共19天。另外的一組由未治療的動物組成。每個治療組包括13只小鼠。第一次注射MOG后對動物進行追蹤觀察，為期兩個月。在研究結束時，通過腹腔注射100mg/kg的戊巴比妥鈉對小鼠施行安樂死。在進行組織學評價前，取出脊髓和腦，并在4％的甲醛溶液中固定。
結果以平均值±SEM表示，且先后以方差分析(ANOVA)和杜凱氏事后檢驗分析治療組之間的差異。認為p＜0.05時具有統(tǒng)計學意義。
施用化合物后的前10分鐘內(nèi)觀察到在高劑量時有輕度和一過性的副作用。這些癥狀隨著長期治療快速地消失，并從第4天開始全部消除，所述癥狀包括輕度減少的運動活動。
由于用載體治療的動物的表現(xiàn)模式與未治療的動物基本相似，因此收集了這兩組的結果，并在后面以平均對照表示。結果表示在圖3的分圖A中，其中隨時間標繪了每個治療組的臨床評分。疾病發(fā)作后口服施用20mg/kg的化合物18F具有最小的效果，且將從第14天到第25天的首次高峰期的臨床評分減少約12％。在同一時期內(nèi)，40mg/kg和60mg/kg的劑量顯著且相似程度地將臨床評分結果分別減少43％和44％。治療阻止了疾病的進展且沒有觀察到明顯的高峰期。在疾病進展的后期(約為治療開始后的20天以及第31天治療停止后)，化合物18F兩個劑量的效果差異變得明顯。第36天時，在已經(jīng)阻止了疾病進展，并保持臨床評分約為0.6的平高線水平(與對照的約1.2相比)之后，60mg/kg的化合物18F引起疾病臨床評分結果的進一步顯著降低。經(jīng)約1周，使用60mg/kg治療的動物表現(xiàn)出的臨床評分僅約為0.2，與同一時間段的對照相比減少了80％。使用40mg/kg化合物治療的動物可以保持對疾病進展和臨床評分平高線水平的控制，但卻沒有引起臨床癥狀如此顯著的減輕。似乎在治療停止后，以40mg/kg治療的動物逐漸失去保護，而先前以60mg/kg治療的動物可以維持一定水平的保護作用有明顯更長的時間。在研究結束時，即治療停止后20天，以60mg/kg治療的動物臨床評分平均為0.65，其仍然比此時的對照(0.95)低30％。
分析的另一個參數(shù)是口服施用本發(fā)明的化合物后，在疾病進展的任意時間點完全恢復的動物數(shù)目。對照組動物(未治療的或用載體治療的)都沒有從本模型誘發(fā)的疾病中恢復。在每組的13只動物中，20mg/kg、40mg/kg和60mg/kg劑量中分別有1只(8％)、3只(23％)和4只(31％)動物的臨床評分達到0。此外，至少有1只動物出現(xiàn)康復的時間點也具有劑量依賴性。在最高劑量中，于第16天(即治療開始后僅3天)觀察到首例完全康復。在中間劑量中，于第17天觀察到首例完全康復，而在最低劑量中則于第22天出現(xiàn)首例完全康復。
在一項單獨的研究中，將口服40mg/kg化合物18F的效果與現(xiàn)有治療進行比較。COP-1(以色列Teva)以25mg/kg皮下注射施用，IFN-β(Betaferon，德國Schering)以每只小鼠10,000IU皮下注射施用。未治療的動物和載體治療的動物作為陰性對照。按照以前描述的方法誘發(fā)疾病，且當動物達到平均臨床評分1時將動物分成不同的治療組。從那時起(第13天)開始治療，此后每天施用。對動物進行為期1個月的追蹤觀察。在研究結束時，通過腹腔注射100mg/kg的戊巴比妥鈉對動物施行安樂死。取出脊髓和腦，并在進行組織學評價前，在4％的甲醛溶液中固定。
由于用載體治療的動物的表現(xiàn)模式與未治療的動物基本相似，因此收集了這兩組的結果，且在后面以平均對照表示。結果表示在圖3的分圖B中，其中隨時間標繪了每個治療組的臨床評分。本研究中誘發(fā)的疾病是嚴重的，且其慢性進展明顯，在開始治療的第13天平均臨床評分為1，及在最后一天未治療或載體治療的對照動物組平均評分高于2.4。當現(xiàn)有的對照藥作為確定疾病的治療劑皮下注射施用時，在這種模型中是無效的。每天使用10,000IU IFN-β治療的動物病程表現(xiàn)與對照組極為相似，而用25mg/kg COP-1治療的動物明顯表現(xiàn)出更嚴重的結果，在研究結束時組平均評分高于3.5。在這項研究中，口服施用40mg/kg的化合物18F可以明顯阻止疾病進展，在研究結束時組平均臨床評分僅為1.25。這一效應給人留下非常深刻的印象，且從第15天(即首次治療后2天)起具有統(tǒng)計學意義。以AUC分析結果時，對照組的AUC為24.14單位，IFN-β組的AUC為23.08單位，及COP-1組的AUC為27.01單位，均驚人地相似?；衔?8F顯著地減少了這一參數(shù)，AUC的數(shù)值為15.47單位，與對照組相比相當于減少了36％。
總而言之，實施例14到實施例16的結果證明當口服施用本發(fā)明的化合物時，在三個代表人類MS不同階段的EAE模型中有效。與MS治療中使用的現(xiàn)有的可注射藥物相比，當在已確定的疾病的臨床癥狀出現(xiàn)后(疾病發(fā)作時或高峰期)施用本發(fā)明的化合物有效。這些結果證明了本發(fā)明的化合物在治療具有自身免疫性和神經(jīng)變性病因?qū)W的疾病特別是多發(fā)性硬化癥中的實用性。
實施例17對Biozzi小鼠EAE模型的效應Biozzi小鼠提供最接近人類MS的嚙齒類EAE模型。在這項研究中，通過注射小鼠脊髓組織誘導Biozzi小鼠形成EAE。在這個模型中，不僅可以檢測到炎癥性浸潤，還可以檢測到脫髓鞘。此外，這個模型允許對震顫和痙攣進行評價。
在第0天和第7天給Biozzi ABH小鼠注射1mg/kg的以弗氏完全佐劑乳化的小鼠脊髓組織。在第二次誘導注射后，每天追蹤觀察動物出現(xiàn)的臨床癥狀。所誘發(fā)的疾病臨床癥狀在第15-20天出現(xiàn)，并按照先前描述的方法評分。根據(jù)Baker[Baker D.等人，Nature 40484-7，2000]的方法以盲分析目測評價痙攣和震顫。
結果以平均值±SEM表示，且先后以方差分析(ANOVA)和杜凱氏事后檢驗分析治療組之間的差異。認為p＜0.05時具有統(tǒng)計學意義。
實施例18對MOG誘發(fā)的EAE的CNS中基因表達的影響本研究的目的是評價經(jīng)由CB2結合本發(fā)明的化合物顯示的免疫調(diào)節(jié)活性的可能機制。已知本發(fā)明的化合物在免疫系統(tǒng)的活化細胞中(體外或體內(nèi))調(diào)節(jié)炎癥性因子的分泌。在這項研究中，通過下述兩種方法評價對基因表達調(diào)節(jié)的影響(a)實時RT-PCR和(b)基因陣列分析。
A-實時RT-PCR使用SV總RNA純化系統(tǒng)(Promega)制備總RNA。在MOG誘發(fā)的EAE研究中，于第31天從5只使用載體處理(即未治療的)或口服40mg/kg化合物18F(即治療的)的動物中取出腦和脊髓，用裂解緩沖液勻漿。將裂解物轉(zhuǎn)移到RNA分離柱，根據(jù)試劑盒說明書用DNAse處理、清洗和洗脫。用GeneQuant II(Pharmacia-Amersham)測定RNA濃度。用SUPERSCRIPT II逆轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies)由總RNA合成互補DNA(cDNA)。根據(jù)試劑盒說明書，將2μg總RNA與oligo(dT)15引物、0.5mMdNTP混合物、8單位逆轉(zhuǎn)錄酶和其他反應組分混合，達到20μl的終體積。將反應混合物在42℃溫育45分鐘，并在70℃滅活15分鐘。定量實時RT-PCR包括1μl cDNA，300nM適當?shù)恼蚝头聪蛞?根據(jù)檢測的基因確定)，7.5μl含有緩沖液、核苷酸、Taq多聚酶和SYBER綠(SYBER綠標準混合物，Applied Biosystems)的反應混合物，總反應體積為15μl。用GeneAmp 5700序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)獲得基因擴增。擴增包括一個在95℃的10分鐘的階段，隨后是下述2步驟的40次循環(huán)95℃20秒和60℃1分鐘。在每個退火階段(annealing step)，通過雙鏈DNA結合染料(SYBER綠)的熒光測定擴增的產(chǎn)物量。測定每個產(chǎn)物的循環(huán)閾值(CT)，它代表可首次檢測到高于基線信號的熒光增強的PCR循環(huán)。將CT中一個PCR循環(huán)的延遲轉(zhuǎn)換成起始模板分子的2倍下降，且反之亦然。以親環(huán)蛋白(cyclophilin)基因做為參比基因，將特異性基因產(chǎn)物CT的變化對前者的變化進行標準化。以治療組或未治療組動物基因表達高于首次用于實驗的動物的倍數(shù)表示結果。在下面的列表中，字母f和r分別代表正向引物和反向引物。
使用的引物序列
小鼠CB1f5’-AGACGGTGTTTGCCTTCTGTAGT-3’ (SEQ ID NO1)小鼠CB1r5’-GCGGAAAGCATGTCTCAGGT-3’ (SEQ ID NO2)小鼠CB2f5’-GCCTGGGATAGCTCGGATG-3’ (SEQ ID NO3)小鼠CB2r5’-TGAGAGCCAGTGCAGGGAAC-3’ (SEQ ID NO4)小鼠F4/80f 5’-TTCATCTTGGGCTGCTCCTG-3’ (SEQ ID NO5)小鼠F4/80r 5’-ATTCATCCCGTACCTGACGG-3’ (SEQ ID NO6)小鼠IFN-γf 5’-TGAAAATCCTGCAGAGCCAGAT-3’ (SEQ ID NO7)小鼠IFN-γr 5’-TGATTCAATGACGCTTATGTTGTTG-3’(SEQ ID NO8)小鼠IL-1βf 5′-ACACTCCTTAGTCCTCGGCCA-3′(SEQ ID NO9)小鼠IL-1βr 5′-CCATCAGAGGCAAGGAGGAA-3′ (SEQ ID NO10)小鼠iNOSf5′-TTCCAGGTGCACACAGGCTA-3′ (SEQ ID NO11)小鼠iNOSr5′-GCACGCTGAGTACCTCATTGG-3′(SEQ ID NO12)小鼠MCP-1f 5′-TCACAGTTGCCGGCTGG-3′(SEQ ID NO13)小鼠MCP-1r 5′-TCTTTGGGACACCTGCTGCT-3′ (SEQ ID NO14)小鼠TNF-αf 5′-AAGGACTCAAATGGGCTTTCC-3′(SEQ ID NO15)小鼠TNF-αr 5′-CCTCATTCTGAGACAGAGGCAAC-3′ (SEQ ID NO16)小鼠 親環(huán)蛋白 Af 5′-TCGCCATTGCCAAGGAGTAG-3′ (SEQ ID NO17)小鼠 親環(huán)蛋白 Ar 5′-GGTCACCCCATCAGATGGAA-3′ (SEQ ID NO18)結果在下表中顯示，以基因表達高于首次用于實驗的動物的倍數(shù)表示(對親環(huán)蛋白基因標準化之后)。將首次用于實驗的動物在所有情況下的值定義為1。通過不成對的雙尾t檢驗來分析統(tǒng)計學意義，一個星號(*)表示p＜0.05時具有統(tǒng)計學意義，而**表示p＜0.01時具有統(tǒng)計學意義。
表3 MOG誘發(fā)的EAE中基因表達倍數(shù)
從上表可以看出，MOG注射后進展型EAE的誘發(fā)影響了首次注射后第31天時記錄的基因表達。在這個模型中CB1的表達沒有改變，但是檢測的其他所有基因的表達都成倍地變化，范圍是比未治療動物(載體)減少13倍到增加19倍。盡管一般認為CB2的表達可能在疾病狀態(tài)下有所增加，但是在本研究中觀察到未治療動物的腦中，CB2的表達減少了13倍。更另人驚訝的是，口服施用化合物18F顯著地防止了這一現(xiàn)象，并使CB2表達維持在如于首次用于實驗的正常動物中觀察到的正常水平。相似地，未治療動物腦中IFN-γ基因表達的水平減少了9倍，且化合物18F顯著地防止了這種作用，并將表達維持在正常的水平。在未治療動物的腦和脊髓中，IL-1β的基因表達增加5到11倍。使用化合物18F對動物進行口服治療顯著地降低了該結果，使表達水平接近正常，僅過表達3-4倍。未治療動物的腦和脊髓中的MCP-1基因表達水平均有所增加。最顯著地，化合物18F將脊髓中的過表達從19倍進一步增加到68倍。單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)是C-C家族的一種趨化因子，主要負責募集并活化單核細胞、巨噬細胞、嗜堿粒細胞、肥大細胞、T細胞和天然殺傷(NK)細胞。活化的單核細胞被募集到損傷部位，進而分泌炎癥性因子，如TNF-α、IL-1β、一氧化氮和前列腺素，它們在某種程度上具有有益的作用。嗜中性粒細胞是神經(jīng)再生所需的重要因子。它們在外周神經(jīng)組織中大量表達，但在CNS中卻幾乎不存在，其與神經(jīng)細胞存活以及損傷后這些組織各自的再生能力有關。此外，表明嗜中性粒細胞保護胚胎運動神經(jīng)元，使之免受TNF-α和IFN-γ的不利影響[Hammarberg H.等人，Journal of Neuroscience 20(14)5283-91，2000]。免疫細胞能夠產(chǎn)生神經(jīng)生長因子，因此，在T細胞和NK細胞中神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達可為保護CNS神經(jīng)元免受高水平致炎細胞因子潛在毒性影響的重要機制。
如近來Kotter等人[Kotter M.R.等人，Neurobiology of Disease 18166-75，2005]所強調(diào)的，盡管巨噬細胞是CNS脫髓鞘的介質(zhì)，但是它們也參與髓鞘再生。MS組織的死后(post-mortem)證據(jù)以及實驗結果表明髓鞘再生通常與強炎癥區(qū)域和存在大量的巨噬細胞有關。巨噬細胞可能以兩種方式促進髓鞘再生。一方面，它們是負責吞噬性清除髓鞘碎片(影響前體細胞少突膠質(zhì)細胞向促髓鞘再生細胞分化)的主要細胞類型。另一方面，巨噬細胞能夠分泌多種直接參與或通過信號傳導參與髓鞘再生的因子。實際上，最初的炎癥性反應觸發(fā)了級聯(lián)事件，其最終創(chuàng)造了一種促髓鞘再生的信號傳導環(huán)境。在這種情況下，口服施用化合物18F后于此項研究中觀察到MCP-1表達的增加，表明了接受治療的動物中單核細胞得以更好地募集，且可能構成了CNS中的免疫反應對神經(jīng)細胞沒有不利影響的保護機制。特別地，這種對炎癥性分子的調(diào)節(jié)作用和它們對免疫細胞的影響可能創(chuàng)造了一種有益的促髓鞘再生的環(huán)境。
總之，這些結果首次表明本發(fā)明的化合物通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中炎癥性介質(zhì)的基因表達來保護動物免受進展型EAE。自第13天疾病發(fā)作后每天施用治療以后，在疾病誘發(fā)后的第31天觀察到了這種調(diào)節(jié)作用。本發(fā)明口服有效的大麻素對炎癥性介質(zhì)的這種作用表明這些化合物甚至可促進髓鞘再生。這個過程不僅對慢性神經(jīng)變性(無論是否由MS引起)有益，還對脫髓鞘的急性形式(例如脊髓損傷后)有益。
B-基因陣列分析在另一個研究中，使用SuperArray生物科學公司的400基因陣列系列試劑盒，按照生產(chǎn)商的試驗方案進行了基因表達分析，并按照上述方法從治療的或未治療的動物的脊髓中提取RNA。將掃描的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為mRNA表達水平，并用兩種軟件進行分析，所述兩種軟件即SanAlayze和GEArrayAnalyzer?；蜿嚵邪◣讉€對照基因，如PUC 18、GAPDH、親環(huán)蛋白A和β肌動蛋白，結果發(fā)現(xiàn)所有的對照基因在載體或化合物18F治療的動物中的表達都相似。在所檢測的400個基因中，發(fā)現(xiàn)治療可以將20個基因上調(diào)或下調(diào)1.5倍以上。將使用實時RT-PCR在疾病進展過程中的其他時間點對這樣鑒定的基因進一步分析。有意思的是用本發(fā)明的化合物治療MOG誘發(fā)的EAE動物后表達改變的基因廣義上編碼了參與免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，例如參與多種細胞因子和生長因子信號轉(zhuǎn)導的STAT蛋白、JAK激酶、β2微球蛋白、TNF受體超家族、鈣調(diào)素和細胞周期素依賴性激酶。
第二項研究證實本發(fā)明的化合物通過改變基因表達減慢EAE的進展。該活性證實本發(fā)明的化合物可在廣譜疾病中有效，其中對相似的炎癥性介質(zhì)的基因調(diào)節(jié)是有益的。
實施例19對活化巨噬細胞中基因和蛋白質(zhì)表達的影響設計本研究以評價先前報道的基因調(diào)節(jié)活性與蛋白質(zhì)表達和/或分泌修飾的相關性。此外，本研究提供了另外一種實驗體系，其中證明了本發(fā)明化合物的抗炎活性。
RAW 264.7巨噬細胞是一種小鼠細胞系(ATCC#TIB 71)，其生長于杜爾貝可氏改良的依格爾氏培養(yǎng)基(DMEM)，其中使用4mM L-谷氨酸調(diào)節(jié)至含有1.5g/L的碳酸氫鈉、4.5g/L的葡萄糖和10％熱滅活的胎牛血清。細胞在組織培養(yǎng)瓶中生長，且以合適的密度將其接種于6孔組織培養(yǎng)板中。用1μg/ml脂多糖E.coli 055B5(DIFCO實驗室)刺激0.5ml中的4,000,000個Raw細胞。用對照物或10μM受試化合物預處理小鼠巨噬細胞1小時，此后以LPS活化?；罨?小時從細胞中提取RNA樣品，并如前所述用實時RT-PCR分析iNOS基因表達水平。進行western blot分析時，以1、5和10μM的濃度對化合物進行實驗，并在LPS刺激24小時后收獲細胞。收集上清液，并用ELISA法分析NO分泌。用冰冷的PBS洗滌細胞3次，刮下，并在100μl含有下述物質(zhì)的細胞裂解緩沖液中進行裂解pH7.6的20mM HEPES、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、0.2mM EDTA、0.1％TritonX-100、10％甘油、1mM DTT、1mM PMSF、10μg/ml抑肽酶、5μg/ml亮肽素、10mM磷酸對硝基苯酯、100mM β-磷酸甘油、1mM氟化鈉和0.1μM原釩酸鈉。將細胞在冰上溶解10分鐘，然后再進一步處理。
這項實驗的結果以對親環(huán)蛋白A表達標準化后iNOS超過未活化巨噬細胞的活化倍數(shù)表示。化合物18A將iNOS的基因表達抑制63％，化合物18B、18E和18F分別抑制55％、25％和100％。應該注意到化合物18A的抑制活性可以被CB1或CB2拮抗劑(分別為5μM SR-141716和SR-144528)的聯(lián)合施用逆轉(zhuǎn)，但主要被CB1拮抗劑逆轉(zhuǎn)，而化合物18F的抑制活性僅被CB2拮抗劑阻斷。這個另人驚訝的觀察結果增強了下述事實本發(fā)明的化合物雖然化學結構相關，但是具有不同的、預料之外的性質(zhì)。
本發(fā)明化合物的iNOS基因表達抑制活性與活化細胞上清液中NO含量的減少有良好的相關性?；衔?8A和18F以劑量相關的方式抑制NO分泌，且在10μM時產(chǎn)生了63％和61％的抑制作用。
為了評價基因表達和蛋白質(zhì)表達之間的相關性，從不同處理的活化巨噬細胞中制備了蛋白質(zhì)提取物。將14,000g的細胞裂解物在4℃離心10分鐘。收集上清液，并根據(jù)標準試驗方案將其準備用于在丙烯酰胺凝膠上上樣。電泳約進行約2小時。將凝膠點至尼龍膜上，封閉后用特異性一抗雜交，然后與HRP標記的二抗反應。使用抗親環(huán)蛋白A的一抗作為對照(Upstate，Cat#07-313)，并用在室溫雜交2小時的NOS2(C11)Santa Cruz抗體(Cat# SC-7271)評價iNOS的數(shù)量。將二抗(用于iNOS的抗小鼠HRP和用于親環(huán)蛋白A的抗家兔HRP)在室溫再溫育一個小時。雜交后沖洗尼龍膜，用ECL顯影，并曝光膠片進行放射自顯影。
在圖4中描述western blot結果，其中對于化合物18F和化合物18A都觀察到了明顯的iNOS蛋白質(zhì)條帶消失，其具有劑量依賴性。總而言之，這些結果證明本發(fā)明的化合物可能通過與蛋白質(zhì)水平變化相關的基因調(diào)節(jié)來提供其部分免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護活性。
實施例20對內(nèi)臟痛的止痛效應除了復發(fā)-緩解型神經(jīng)學損傷外，MS患者還出現(xiàn)其他的癥狀，如痙攣和疼痛。在本研究中，在內(nèi)臟痛模型中評價了本發(fā)明化合物的止痛活性。內(nèi)臟痛由內(nèi)部器官的疾病引起，這些內(nèi)部器官例如胃、腎、膽囊、膀胱、腸和其他器官。內(nèi)臟痛在本質(zhì)上是一種傷害性疼痛，且認為是由腹膜固有細胞例如肥大細胞和巨噬細胞介導的。內(nèi)臟痛通常對阿片樣物質(zhì)和NSAIDS有反應。在本研究中，通過腹腔注射乙酸誘發(fā)小鼠內(nèi)臟痛。
通過靜脈注射體積劑量為5ml/kg的載體、對照和不同劑量的受試化合物來對雄性ICR小鼠(平均體重25g，以色列Harlan)進行預處理。在研究的靜脈注射部分，將化合物溶解在CREMOPHOR:乙醇中，且在注射前(誘發(fā)疼痛前15分鐘)用鹽水以1∶20的比例稀釋。當口服遞送化合物時，如前所述將其溶解在磷酸鹽緩沖液或CREMOPHOR:乙醇中，且在疼痛誘發(fā)前1小時施用。除對照組包括至少30只動物外，每個治療組包括至少6只動物。15分鐘或60分鐘后(根據(jù)所選的藥物施用途徑確定)，給小鼠腹腔注射10ml/kg 0.6％的乙酸，并計數(shù)乙酸施用后的起始5分鐘內(nèi)與內(nèi)臟痛有關的行為(扭體、伸展、腹部收縮伴有身體伸長，后肢伸展)的次數(shù)。廣義上將這些與內(nèi)臟痛有關的行為定義為扭體反應(WR)。結果以扭體反應的平均次數(shù)±SEM表示。先后用方差分析(ANOVA)和事后Fisher檢驗來分析數(shù)據(jù)。認為p＜0.05時具有統(tǒng)計學意義，并在圖上通過給相關治療組加星號表示。
下述結果由靜脈注射2mg/kg受試化合物獲得，或在使用大麻素受體拮抗劑進行的研究中由靜脈注射1mg/kg受試化合物或單獨注射拮抗劑以及1mg/kg受試化合物+1mg/kg拮抗劑獲得。在一項單獨的研究中，結果表明本發(fā)明化合物的止痛活性呈劑量相關性。
未治療的動物表現(xiàn)出平均為28.3±2.5的扭體反應，僅給予載體的動物沒有受到影響，觀察到的扭體反應次數(shù)為27.6±1.2。下述結果以與載體治療組相比扭體反應的抑制百分數(shù)表示。2mg/kg的化合物18A具有高度止痛作用，且產(chǎn)生扭體運動的完全抑制，而化合物18B、18F和18G也產(chǎn)生了另人印象深刻的高顯著性抑制作用，分別為95％、94％和91％?；衔?8H使扭體反應次數(shù)減少38％，而化合物18D和18E以受試劑量施用時表現(xiàn)出的效應最小，且劑量高達5mg/kg的富馬酸在該模型中無活性。劑量高達200mg/kg的加巴噴丁和劑量高達10mg/kg的塞來考昔在該模型中無效。
靜脈注射施用1mg/kg的本發(fā)明化合物，或同時分別施用1mg/kg的CB1或CB2拮抗劑，即SR141716A和SR144528。分別施用同樣劑量的拮抗劑做為對照。在圖5的分圖A中描述結果，其中標繪了每個治療組的扭體反應的平均次數(shù)(+SEM)。與未治療的動物相比，對照組，即載體(CE)和單獨施用CB1或CB2拮抗劑對觀察到的扭體反應的次數(shù)沒有影響?；衔?8A和18F在靜脈注射劑量為1mg/kg時高度有效，且分別將扭體反應的次數(shù)抑制90％和71％。加入CB1拮抗劑完全阻斷化合物18A的活性，而化合物18F的活性僅被部分逆轉(zhuǎn)，且不顯著。然而，加入CB2拮抗劑不影響化合物18A的活性，而化合物18F的活性被顯著逆轉(zhuǎn)。該觀察結果進一步證實了本發(fā)明化學相關的化合物具有意料之外的不同的作用機制。
在第二項研究中，使用內(nèi)臟痛模型評價本發(fā)明的化合物是否能夠與其他化合物協(xié)同作用。Capsazepine(CPZ)是一種具有止痛活性的1型香草酸(vanilloid)受體(VR1)拮抗劑。以0.5、1和2mg/kg的劑量靜脈注射施用Capsazepine和化合物18F。檢測了兩個綜合療法的樣品，它們都含有0.5mg/kg的CPZ和0.5或1mg/kg的化合物18F。在圖5的分圖B中描述結果。CPZ和化合物18F顯示了與劑量相關的扭體反應次數(shù)的減少。在0.5mg/kg時，CPZ沒有活性，而與載體治療的動物相比，化合物18F已經(jīng)將結果顯著地減少64％。在2mg/kg時，CPZ將扭體反應的次數(shù)顯著減少67％，而化合物18F將這個參數(shù)減少98％，幾乎完全消除了疼痛反應。當將無活性劑量0.5mg/kg的CPZ和0.5或1mg/kg的化合物18F結合施用時，有止痛活性明顯增強的趨勢。將上述兩種藥物以0.5mg/kg的劑量組合施用時，將扭體反應次數(shù)從10減少到6(40％)，而結合1mg/kg的化合物18F使用時增強了混合物的活性，使扭體反應次數(shù)從9減少到2.2(75％)。這些觀察結果證明聯(lián)合施用或?qū)⒈景l(fā)明的化合物與其他藥物組合在一起具有增加的益處?？蛇x地，本發(fā)明的化合物可用于進一步增強其他藥物在安全劑量時的活性，或?qū)⑵渌幬锏膭┝繙p少到安全、且副作用少的水平，同時維持其他藥物以前高劑量時的最初治療活性。
在第三項研究中，口服施用溶于磷酸鹽緩沖液的本發(fā)明化合物，劑量逐漸增加，范圍是5到60mg/kg。在圖5的分圖C中描述結果?；衔?8F以劑量依賴性方式減少了扭體反應的次數(shù)，從10mg/kg開始明顯，在受試的最高劑量達到93％的抑制作用。
最后，在確定口服10mg/kg已經(jīng)明顯有效后，以這個單一劑量采用口服施用途徑對本發(fā)明不同的化合物進行了試驗。在研究的第一部分，將化合物溶解在CREMOPHOR:乙醇中，與Δ8-THC進行比較，后者在含水緩沖液中不溶解。結果在圖6的分圖A中描述。盡管與未治療組相比，10mg/kg的Δ8-THC將扭體反應次數(shù)減少了47％，但是由于變異性，與載體治療的動物相比，該減少不具有統(tǒng)計學意義。另一方面，本發(fā)明口服有效的大麻素在相同劑量時已顯著地減少了疼痛反應，在使用化合物18A和18F治療的動物中對扭體反應的抑制分別為70％和71％。
已經(jīng)確定使用潛溶劑載體口服施用本發(fā)明口服有效的大麻素優(yōu)于THC對照之后，將水溶性的化合物溶解在磷酸鹽緩沖液中。在圖6的分圖B中描述結果。6個受試化合物中，口服施用10mg/kg后4個有顯著的止痛作用。與未治療的動物相比，化合物18B、18C、18F和18G分別將疼痛反應抑制88％、93％、61％和56％?；衔?8E和18H在受試劑量無效。有意思的是，當靜脈內(nèi)施用時，先前發(fā)現(xiàn)化合物18H有效。這些觀察結果證明在當前作為止痛劑的情況中，本發(fā)明的大麻素口服施用后是有效的化合物。
實施例21對炎癥性疼痛的止痛作用本研究的目的是檢測化合物的抗炎癥性疼痛的活性。炎癥性疼痛實際上是一種傷害性疼痛反應，其中的痛覺通常長于急性疼痛(如實施例20中說明的疼痛)。在內(nèi)臟痛中，估計化合物的預防性止痛活性約為1小時，而在本模型中估計化合物抗急性疼痛的預防活性約為3小時。通過在動物后爪中注射2％λ角叉菜膠誘發(fā)炎癥性疼痛和爪水腫。
在注射過程中，將雄性Sprague Dawley大鼠(平均體重200g，以色列Harlan)放置在干冰上進行短暫鎮(zhèn)靜。在大鼠一只爪(右)的跖肌下區(qū)域皮下注射0.1ml溶于無菌鹽水的2％w/vλ角叉菜膠。因為發(fā)明人自身經(jīng)驗證實的文獻數(shù)據(jù)表明注射0.1ml的正常鹽水不影響以后的止痛測定結果，所以不給對側爪(左)進行注射。注射角叉菜膠預治療后立即通過灌胃口服施用受試化合物。將載體(PB)治療的動物做為對照。誘發(fā)炎癥性疼痛之前和注射后3個小時，在兩個系統(tǒng)中檢測動物對疼痛刺激的反應。第一種刺激為熱刺激，根據(jù)Hargreaves的方法，使用Ugo Basile 7370型用跖肌試驗評價。將范圍設置為50個任意單位強度。對于發(fā)炎和未發(fā)炎的后爪，將直到動物抬起一只爪的等待時間做為對熱刺激的反應進行記錄。第二種刺激為機械(觸覺)刺激，使用動力跖肌計量儀(Dynamic plantarSesthesiomether)(Ugo Basile 73400-002型)評價。將系統(tǒng)設置為最大力50g，且使用的力以10g/秒的速度逐漸增加。最后，評價對爪水腫的影響。用刻度盤式測厚儀(彈力刻度盤，恒定低壓計，Mitutoyo，TG/L-1，0.01mm)測量爪的厚度，以及使用器官充盈度測量器(7150型，意大利Ugo Basile)測定爪的體積。研究結束時，腹腔注射100mg/kg的戊巴比妥對動物施行安樂死。
測定0小時和3小時兩只后爪之間的差異結果，兩者在研究的熱刺激部分均以ΔLT表示等待時間，在研究的機械刺激部分以Δ力表示。將爪體積表示為載體治療動物的百分比。結果以每個治療組的平均值±SEM表示，且先后以方差分析(ANOVA)和事后杜凱氏檢驗分析各組之間的差異。認為p＜0.05時具有統(tǒng)計學意義，并在圖上通過給相關治療組加星號表示。
施用2％的λ角叉菜膠誘發(fā)局部和一過性爪部炎癥，其以腳爪的腫脹和發(fā)紅為特征。結果顯示注射角叉菜膠后立即通過口服灌胃口服施用劑量為10、20和30mg/kg的化合物18F，表現(xiàn)出預防性的止痛活性。誘發(fā)疼痛3小時后，使用載體治療的動物在熱刺激后后爪之間僅顯示出約為7.5秒的ΔLT。在圖7的分圖A中描述結果。在口服施用化合物18F后，這個結果以劑量相關的方式減少。10mg/kg劑量組的動物顯示的ΔLT為7.5秒(即無減少)，而20和30mg/kg時等待時間減少到2.3和0.9秒(即分別減少69％和88％)。使用的刺激為觸覺刺激時，使用載體治療的動物僅顯示腳爪之間的Δ力為31g。在圖7的分圖B中描述結果。當口服施用10mg/kg的化合物18F時，使大鼠抬起腳爪所需的力以劑量依賴的方式減少7g(即減少23％)，更高劑量時減少18和19g(即口服20和30mg/kg時痛域約減少60％)。最后，通過測量不同治療組的腳爪體積來評價對模型中局部炎癥性組分的影響。將載體治療的動物定義為具有100％的最大腳爪體積。在圖7的分圖C中描述結果。這個參數(shù)也呈劑量相關性，且10mg/kg的化合物18F使腳爪體積略下降6％，而20mg/kg減少18％，30mg/kg顯著減少52％。
這些結果證明，在誘發(fā)急性疼痛的同時口服施用時，化合物18F是有效的預防性止痛劑和局部抗炎劑。
目前公開并強調(diào)了當以20mg/kg的單一劑量口服施用時，化合物18G在本模型中無活性，其與化合物18F的不同之處在于用富馬酸酯進一步取代保留的酚羥基。以20mg/kg劑量施用時，使用化合物18F治療的動物的腳爪體積是載體對照的82％，而使用化合物18G治療的動物的腳爪體積卻不受治療影響，其為對照腳爪體積的96％。使用熱刺激時，化合物18F使ΔLT減少69％，而化合物18G在降低這一參數(shù)上無效。最后，使用機械刺激時，使用化合物18F治療的動物Δ力顯示減少58％，而化合物18G僅略微且不明顯地影響這項參數(shù)(降低8％)。預料之外的是，與活性單取代對映物相比，酚羥基的雙取代對化合物并沒有進一步改善。相反，在該急性疼痛模型中，酚羥基雙取代似乎有害，其進一步證明這個與本發(fā)明優(yōu)選化合物有關的化合物作用并不明顯。
實施例22對神經(jīng)性疼痛的止痛效應在MS患者出現(xiàn)的不同類型疼痛癥狀中，神經(jīng)性疼痛是最主要的。神經(jīng)性疼痛與慢性疼痛有關，其不同于以前評價的與急性疼痛有關的內(nèi)臟痛和炎癥性疼痛。急性疼痛與慢性疼痛在病因、病理生理、診斷和治療方面不同。急性疼痛實際上是一種傷害性疼痛反應，且繼發(fā)于對A-Δ和C-多覺性疼痛受體的化學、機械和熱刺激。急性疼痛是自身限制性的，且將在最初的損傷后短期內(nèi)消失。而慢性疼痛則是持續(xù)性的，且可在最初的損傷后持續(xù)數(shù)年。它是由外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或病理變化產(chǎn)生的。神經(jīng)性疼痛對阿片樣物質(zhì)治療趨向于僅有部分反應性。因此，具有對抗某些類型急性疼痛(如內(nèi)臟痛和炎癥性疼痛)活性的藥物不一定能夠有效對抗神經(jīng)性疼痛。
在下述兩個神經(jīng)性疼痛模型中評價了本發(fā)明化合物的止痛活性(a)慢性壓迫誘發(fā)的神經(jīng)性疼痛(CCI)和(b)Taxol誘發(fā)的神經(jīng)性疼痛。
A-慢性壓迫誘發(fā)的神經(jīng)性疼痛根據(jù)Bennet等人的方法[Bennet，G.J.和Xie，Y-K.，Pain 3387-107，1988]，在慢性壓迫坐骨神經(jīng)后誘發(fā)了大鼠右后肢的外周單病。使用已經(jīng)建立的行為試驗(Von Frey纖維)監(jiān)測機械性痛覺超敏(allodyna)的發(fā)生。
以兩個術前值的平均值確定術前基線值。一旦確定了基線值，即可通過使用4條鉻制腸線松緊來壓迫動物的右側坐骨神經(jīng)來外科制備神經(jīng)性疼痛模型。手術后第11天，根據(jù)術前值，將出現(xiàn)機械性痛覺超敏的動物任意分配到不同的治療組。
設計是隨機的，在對給予的是藥物還是載體為盲態(tài)的情況下進行。試驗前，使雄性Sprague-Dawley大鼠(平均體重240-290g，以色列Harlan)適應行為試驗儀器。在試驗當天，給每個治療組至少6只動物灌胃口服不同劑量的化合物18F，體積為5ml/kg。研究包括載體(PB)治療的陰性對照和嗎啡治療的(皮下注射5mg/kg)陽性對照。十五分鐘后，在后爪下方的跖肌表面使用一系列Von Frey纖維(試驗前預校正)。從最弱的力開始按照上升的順序使用纖維，并評價同側和對側后爪的退縮閾值。將每條纖維壓在足的中跖肌表面至恰好開始彎曲的點上；每條纖維重復約8-10次，頻率約為1Hz。將退縮閾值定義為兩條或更多連續(xù)Von Frey纖維引起反射性退縮反應(即短暫的爪輕彈)所需的最小力，以克測定。
結果以每個治療組的平均值±SEM表示，先后以方差分析(ANOVA)和杜凱氏事后檢驗分析各組之間的差異。認為p＜0.05時具有統(tǒng)計學意義，并在圖上通過給相關治療組加星號表示。
在圖8的分圖A中描述結果?？诜?0mg/kg的化合物18F對神經(jīng)性疼痛具有很小的效應。但是與給藥前的反應相比，口服施用更高劑量可顯著減輕手術肢的疼痛反應?？诜?0mg/kg的化合物18F與皮下施用5mg/kg的嗎啡產(chǎn)生同樣強的作用。此后用疼痛反應的抑制百分數(shù)分析結果，計算公式為(ΔLT載體-ΔLT治療藥物)/ΔLT載體。
B-Taxol誘發(fā)的神經(jīng)性疼痛Taxol(紫杉醇)是一種最有效和最常用的抗腫瘤藥物，用于治療實體瘤。它有兩種嚴重的副作用髓鞘抑制和外周神經(jīng)病變。粒細胞集落刺激因子可有效地對抗多數(shù)患者的神經(jīng)病變。但是還沒有可取的療法能夠預防或?qū)⑸窠?jīng)損傷降至最低程度，使神經(jīng)毒性成為明顯的劑量限制性副作用。臨床上，紫杉醇誘發(fā)的神經(jīng)毒性表現(xiàn)為感覺神經(jīng)病，最常見的癥狀是麻木、麻刺感和灼痛。這些癥狀通常從腿部開始，且以后可見于手部。臨床上，Taxol誘發(fā)的神經(jīng)病變發(fā)生率平均為30％。在本研究中，根據(jù)Polomano等人的方法[Polomano R.C.等人，Pain 94293-304，2001]使用Taxol誘發(fā)神經(jīng)性疼痛。
每隔一天給雄性Sprague Dawley大鼠(平均體重150-200g，以色列Harlan)腹腔注射施用一次劑量為6mg/kg的Taxol(美國百時美施貴寶)，共9天。在第13天，測定基線痛域。一小時后，僅給動物腹腔注射施用5ml/kg的載體(PB)，并再次確定痛域。再過一小時后，腹腔注射施用劑量范圍為0.5mg/kg到10mg/kg的不同劑量的化合物18F治療動物，腹腔注射5mg/kg的嗎啡和100mg/kg的加巴噴丁做為陽性對照。每個治療組包括至少8只動物。藥物施用后1小時，用如前描述的熱刺激和機械刺激監(jiān)測痛域。研究結束時，腹腔注射100mg/kg的戊巴比妥鈉對大鼠施行安樂死。然后用鹽水和肝素化的4％甲醛溶液給取樣大鼠輸液。取脊髓的L4-L5區(qū)和坐骨神經(jīng)進行組織病理學評價。
先后使用單向ANOVA(方差分析)和鄧肯氏事后檢驗比較不同治療組熱痛覺增敏的等待時間和誘發(fā)疼痛所需的力。認為p＜0.05時具有統(tǒng)計學意義，并在圖上通過給相關治療組加星號表示。
在圖8的分圖B中以每個治療組的Δ力顯示結果。Taxol誘發(fā)的神經(jīng)病變在第13天將痛閾從首次用于實驗動物的15gm基線數(shù)值減少到未治療動物的5gm。腹腔注射施用5ml/kg的載體不影響痛域。使用化合物18F治療以劑量相關的方式增加了痛域。結果證明1、5和10mg/kg劑量的數(shù)值與載體治療的動物相比，具有統(tǒng)計學意義。10mg/kg的劑量將痛域增加到施用Taxol前的基線值。兩個陽性對照，100mg/kg的加巴噴丁和5mg/kg的嗎啡都表現(xiàn)出增加痛域的趨勢。它們誘發(fā)的效應都沒有統(tǒng)計學意義(與載體治療組比較)。腹腔注射10mg/kg的化合物18F引起的痛域增加與加巴噴丁或嗎啡產(chǎn)生的效應相比，具有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。
如前面解釋的情況，神經(jīng)性疼痛是由外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷、或病理變化造成的，且發(fā)現(xiàn)其不僅與MS有關，還與其他多種病理有關，特別是涉及慢性非惡性疼痛的情況。因此，本發(fā)明化合物減少神經(jīng)性疼痛的能力具有廣泛的有益影響，且證明其可有利地取代現(xiàn)有療法或作為其補充。
此外，可以給接受具有神經(jīng)性副作用的抗腫瘤治療劑如Taxol的患者施用本發(fā)明的化合物。本研究已清楚證明本發(fā)明的化合物具有神經(jīng)保護性作用，且可以防止Taxol化療的神經(jīng)性副作用。
實施例23安全性盡管大麻素具有令人印象深刻的治療潛能，但是主要由于法律考慮難以在醫(yī)學上使用。雖然精神活性的大麻類似效應是不成癮的，且在某些情況下其治療效果強于前者，但是對大多數(shù)立法者而言，大麻是一種藥物，其生物活性成分或衍生產(chǎn)物應該被禁止。因此，開發(fā)大麻素藥物伴隨附加的安全性考慮。精神活性大麻類似效應是由CB1受體介導的，因此CB2選擇性化合物是一種更安全的候選藥物。比較而言，已經(jīng)批準的Δ9-THC具有的CB2/CB1親和力比值為0.89，而本發(fā)明化合物的親和力至少高10倍，對CB2的選擇性一般約高30倍。在Tetrad試驗中評價殘留的CB1的相關活性(如果有的話)，其中測定化合物對體溫、自發(fā)的和被動的活動能力以及木僵的影響。
給ICR雄性小鼠(平均體重25g，以色列Harlan)灌胃口服施用體積劑量為5ml/kg的不同劑量化合物18F，即30、60、80和100mg/kg。給藥前進行下列測定以確定基線值，并在施用后30分鐘、3小時和24小時時進行測定。使用熱敏電阻探針(YSI 400型，美國)監(jiān)測直腸溫度。使用開放野方法學評價自發(fā)活動。使用連接到計算機系統(tǒng)上的攝像機記錄并分析三分鐘內(nèi)的動物行走距離和速度。在每個開放野試驗結束時，檢測動物的木僵癥狀。當動物的前爪抓住升高的柱子時，小心地迫使動物以其后爪站立，以進行木僵癥狀檢測。記錄動物從柱子上退下的時間(秒)。正常動物立即從柱子上退下，而木僵動物傾向于呆在柱子上。動物在柱子上停留的時間越長，動物的木僵越嚴重。為計算每組木僵動物的百分數(shù)，確定了一個5秒的截止值(即認為靠在柱子上超過5秒的動物為木僵動物)。使用加速旋轉(zhuǎn)試驗評價在被迫狀態(tài)下動物的協(xié)調(diào)和運動活動。在實驗開始前對動物進行4天的訓練。它們的任務是停留在加速竿上維持12分鐘不掉下來(每一速度3分鐘)。試驗的速度為15、19、23和27轉(zhuǎn)/分。按照下述方法對動物在竿上的表現(xiàn)評分如果每一速度時都能在竿上完全行走則每只動物就可以獲得最高的3分(每分鐘1分)。因此，每只動物最高能得12分(每一速度3分)。抓住竿上旋轉(zhuǎn)的柱子而不走動的話，則從這只動物每三個循環(huán)中減0.5分。前三個循環(huán)不影響評分。
研究結束時注射100mg/kg的戊巴比妥處死動物。
口服化合物18F對所監(jiān)測的下述三個與運動有關的參數(shù)沒有影響木僵和自發(fā)或被迫的運動活動，最高受試劑量達100mg/kg。唯一受影響的參數(shù)是體溫，其中施用化合物18F造成一過性低體溫。正常體溫以劑量依賴性形式恢復。以較低的劑量30和60mg/kg施用時，動物在24小時內(nèi)恢復正常體溫，而以較高的劑量80和100mg/kg施用時，追蹤觀察期結束時動物的體溫仍然比基線值低2℃。總之，在研究過程中未觀察到行為性副作用，且發(fā)現(xiàn)當化合物高達60mg/kg的治療有效劑量時，是安全的。
盡管僅出于說明的目的就所提供的不同特定實施方案描述了本發(fā)明，但不能認為這樣專門公開的實施方案具有限制性。本領域技術人員可根據(jù)此處申請人的公開內(nèi)容想到許多其他這樣的實施方案，因此申請人建議僅由如所附的權利要求中定義的他們的發(fā)明的主旨和范圍來進行限制。
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<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>18ggtcacccca tcagatggaa 20
權利要求
1.一種預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的方法，其包括向有相應需要的個體施用口服有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括作為活性成分的式(I)的化合物及其可藥用鹽、酯或溶劑合物式I 具有特定的立體化學結構，其中C-4為S，C-1和C-5位的質(zhì)子彼此為順式，且C-4和C-5位的質(zhì)子為反式；且其中R1選自(a)O或S，(b)C(R’)2，其中在各種情況下，R’獨立地選自氫、氰基、-OR”、-N(R”)2、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”或C1-C6烷基-N(R”)2，其中在各種情況下，R”獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR和C1-C6烷基-N(R)2，其中在各種情況下，R獨立地選自氫或飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基，及(c)NR”或N-OR”，其中R”如前述所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)-R”、-OR”、-N(R”)2、-SR”、-S(O)(O)NR”，其中在各種情況下，R”如前述所定義，(b)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb，其中Rb選自氫、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”和C1-C6烷基-N(R”)2，其中R”如前述所定義，及(c)由-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或-P(O)(ORe)2封端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，在各種情況下，Re選自氫，Rd如前述所定義；R4選自(a)R，其中R選自氫、鹵素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2和SR，其中在各種情況下，R如前述所定義，(b)飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-R，其中R如前述所定義，(c)芳環(huán)，其可在任何位置被R進一步取代，其中R如前述所定義，及(d)任選地以芳環(huán)封端的飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基，其可如(c)中所定義被進一步取代。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中R1為O，R2和R3各自為ORf，其中在各種情況下，Rf獨立地選自氫、-Rd和-C(O)-Rd，其中Rd為以-C(O)ORg封端的飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基鏈，且Rg選自氫和飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，R4選自飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-Rh，其中Rh選自R和芳環(huán)，所述芳環(huán)可在任何位置任選地被如前述定義的R進一步取代。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中R1為O，R2和R3各自獨立地選自OH、琥珀酸酯、富馬酸酯和亞甲氧羧基，R4選自1，1-二甲基戊基、1，1-二甲基庚基、1，1-二甲基-6-庚炔基、1，1-二甲基-3-苯基-丙基、1，1，3-三甲基-丁基、1-(4-氯-苯基)-1-甲基-乙基、1-乙基-1-甲基-丙基、5-溴-1，1-二甲基戊基和1，1-二甲基-戊-4-烯基。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中R1為O，R2為OH，R3為富馬酸酯，R4為1，1-二甲基庚基。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述藥物組合物還包括可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述式(I)的活性成分在一日1-4次的用藥方案中，按每kg體重約0.05至約50mg/kg的每日劑量施用。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述藥物組合物通過口服、粘膜、頰部、牙齦、舌、舌下或口咽施用進行口服施用。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述藥物組合物按液體、氣霧劑或固體單位劑型施用，所述劑型選自溶液劑、混懸劑、微膠粒、乳劑、微乳劑、氣霧劑、散劑、顆粒劑、囊劑、軟凝膠劑、片劑、丸劑、囊片和膠囊劑。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其還包括所述式(I)的化合物與一種或多種其他藥物的聯(lián)合施用，所述其他藥物可獨立地選自式(I)的化合物、免疫調(diào)節(jié)劑、免疫抑制劑、類固醇、抗驚闕劑、鎮(zhèn)痛藥、抗抑郁藥、肌松劑、抗痙攣劑、抗震顫劑、三環(huán)抗抑郁藥、非甾體抗炎藥(NSAID)、選擇性5-羥色胺重吸收抑制劑(SSRI)、單胺氧化酶抑制劑(MOI)、抗抑郁藥、苯二氮卓類(BZD)、抗膽堿能藥物、β阻滯劑、緩瀉藥及特異性的通道阻滯劑。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中所述治療劑的聯(lián)合施用以選自下述的用藥方案進行單獨組合的組合物，基本上同時施用的分開的單個組合物和在分開的時間下施用的分開的單個組合物。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中所述其他藥物可獨立地選自IFN-β、IFN-β-1a、IFN-β-1b、醋酸格拉默、硫唑嘌呤、克拉屈濱、環(huán)磷酰胺、米托蒽醌、潑尼松和甲基潑尼松龍。
12.一種預防、減輕或治療神經(jīng)學癥狀的方法，所述神經(jīng)學癥狀選自震顫、痙攣、肌無力和協(xié)調(diào)喪失，所述方法包括向有相應需要的個體施用口服有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括作為活性成分的式(I)的化合物及其可藥用鹽、酯或溶劑合物式I 具有特定的立體化學結構，其中C-4為S，C-1和C-5位的質(zhì)子彼此為順式，且C-4和C-5位的質(zhì)子為反式；且其中R1選自(a)O或S，(b)C(R’)2，其中在各種情況下，R’獨立地選自氫、氰基、-OR”、-N(R”)2、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”或C1-C6烷基-N(R”)2，其中在各種情況下，R”獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR和C1-C6烷基-N(R)2，其中在各種情況下，R獨立地選自氫或飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基，及(c)NR”或N-OR”，其中R”如前述所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)-R”、-OR”、-N(R”)2、-SR”、-S(O)(O)NR”，其中在各種情況下，R”如前述所定義，(b)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb，其中Rb選自氫、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”和C1-C6烷基-N(R”)2，其中R”如前述所定義，及(c)由-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或-P(O)(ORe)2封端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，在各種情況下，Re選自氫，Rd如前述所定義；R4選自(a)R，其中R選自氫、鹵素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2和SR，其中在各種情況下，R如前述所定義，(b)飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-R，其中R如前述所定義，(c)芳環(huán)，其可在任何位置被R進一步取代，其中R如前述所定義，及(d)任選地以芳環(huán)封端的飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基，所述芳環(huán)可如(c)中所定義被進一步取代。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中R1為O，R2和R3各自為ORf，其中在各種情況下，Rf獨立地選自氫、-Rd和-C(O)-Rd，其中Rd為以-C(O)ORg封端的飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基鏈，且Rg選自氫和飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，R4選自飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-Rh，其中Rh選自R和芳環(huán)，所述芳環(huán)可在任何位置任選地被如前述定義的R進一步取代。
14.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中R1為O，R2和R3各自獨立地選自OH、琥珀酸酯、富馬酸酯和亞甲氧羧基，R4選自1，1-二甲基戊基、1，1-二甲基庚基、1，1-二甲基-6-庚炔基、1，1-二甲基-3-苯基-丙基、1，1，3-三甲基-丁基、1-(4-氯-苯基)-1-甲基-乙基、1-乙基-1-甲基-丙基、5-溴-1，1-二甲基戊基和1，1-二甲基-戊-4-烯基。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中R1為O，R2為OH，R3為富馬酸酯，R4為1，1-二甲基庚基。
16.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中所述藥物組合物還包括可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。
17.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中所述式(I)的活性成分在一日1-4次的用藥方案中，按每kg體重約0.05至約50mg/kg的每日劑量施用。
18.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中所述藥物組合物通過口服、粘膜、頰部、牙齦、舌、舌下或口咽施用進行口服施用。
19.根據(jù)權利要求18所述的方法，其中所述藥物組合物按液體、氣霧劑或固體單位劑型施用，所述劑型選自溶液劑、混懸劑、微膠粒、乳劑、微乳劑、氣霧劑、散劑、顆粒劑、囊劑、軟凝膠劑、片劑、丸劑、囊片和膠囊劑。
20.根據(jù)權利要求12所述的預防、減輕或治療神經(jīng)學癥狀的方法，其還包括所述式(I)的化合物與一種或多種其他藥物的聯(lián)合施用，所述其他藥物可獨立地選自式(I)的化合物、抗驚闕劑、鎮(zhèn)痛藥、抗抑郁藥、肌松劑、抗痙攣劑、抗震顫劑、三環(huán)抗抑郁藥、非甾體抗炎藥(NSAID)、選擇性5-羥色胺重吸收抑制劑(SSRI)、單胺氧化酶抑制劑(MOI)、抗抑郁藥、苯二氮卓類(BZD)、抗膽堿能藥物、β阻滯劑、緩瀉藥及特異性的通道阻滯劑。
21.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中所述治療劑的聯(lián)合施用以選自下述的用藥方案進行單獨組合的組合物，基本上同時施用的分開的單個組合物和在分開的時間下施用的分開的單個組合物。
22.一種調(diào)節(jié)炎癥性介質(zhì)的方法，其包括向有相應需要的個體施用口服有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括作為活性成分的式(I)的化合物及其可藥用鹽、酯或溶劑合物式I 具有特定的立體化學結構，其中C-4為S，C-1和C-5位的質(zhì)子彼此為順式，且C-4和C-5位的質(zhì)子為反式；且其中R1選自(a)O或S，(b)C(R’)2，其中在各種情況下，R’獨立地選自氫、氰基、-OR”、-N(R”)2、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”或C1-C6烷基-N(R”)2，其中在各種情況下，R”獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR和C1-C6烷基-N(R)2，其中在各種情況下，R獨立地選自氫或飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基，及(c)NR”或N-OR”，其中R”如前述所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)-R”、-OR”、-N(R”)2、-SR”、-S(O)(O)NR”，其中在各種情況下，R”如前述所定義，(b)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb，其中Rb選自氫、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”和C1-C6烷基-N(R”)2，其中R”如前述所定義，及(c)由-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或-P(O)(ORe)2封端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，在各種情況下，Re選自氫，Rd如前述所定義；R4選自(a)R，其中R選自氫、鹵素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2和SR，其中在各種情況下，R如前述所定義，(b)飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-R，其中R如前述所定義，(c)芳環(huán)，其可在任何位置被R進一步取代，其中R如前述所定義，及(d)任選地以芳環(huán)封端的飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基，所述芳環(huán)可如(c)中所定義被進一步取代。
23.根據(jù)權利要求22所述的方法，其中所述被調(diào)節(jié)的炎癥性介質(zhì)選自炎癥相關的基因、細胞因子、趨化因子、大麻素受體、STAT信號轉(zhuǎn)導蛋白、JAK激酶、微球蛋白、TNF-α及受體超家族、鈣調(diào)蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶、CB2、IL-1β、IFN-γ、iNOS和MCP-1。
24.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中R1為O，R2和R3各自為ORf，其中在各種情況下，Rf獨立地選自氫、-Rd和-C(O)-Rd，其中Rd為以-C(O)ORg封端的飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基鏈，且Rg選自氫和飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，R4選自飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-Rh，其中Rh選自R和芳環(huán)，所述芳環(huán)可在任何位置任選地被如前述定義的R進一步取代。
25.根據(jù)權利要求24所述的方法，其中R1為O，R2和R3各自獨立地選自OH、琥珀酸酯、富馬酸酯和亞甲氧羧基，R4選自1，1-二甲基戊基、1，1-二甲基庚基、1，1-二甲基-6-庚炔基、1，1-二甲基-3-苯基-丙基、1，1，3-三甲基-丁基、1-(4-氯-苯基)-1-甲基-乙基、1-乙基-1-甲基-丙基、5-溴-1，1-二甲基戊基和1，1-二甲基-戊-4-烯基。
26.根據(jù)權利要求25所述的方法，其中R1為O，R2為OH，R3為富馬酸酯，R4為1，1-二甲基庚基。
27.一種藥物組合物用于預防、減輕或治療多發(fā)性硬化癥的用途，所述藥物組合物包括作為活性成分的口服有效的式(I)的化合物及其可藥用鹽、酯或溶劑合物式I 具有特定的立體化學結構，其中C-4為S，C-1和C-5位的質(zhì)子彼此為順式，且C-4和C-5位的質(zhì)子為反式；且其中R1選自(a)O或S，(b)C(R’)2，其中在各種情況下，R’獨立地選自氫、氰基、-OR”、-N(R”)2、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”或C1-C6烷基-N(R”)2，其中在各種情況下，R”獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR和C1-C6烷基-N(R)2，其中在各種情況下，R獨立地選自氫或飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基，及(c)NR”或N-OR”，其中R”如前述所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)-R”、-OR”、-N(R”)2、-SR”、-S(O)(O)NR”，其中在各種情況下，R”如前述所定義，(b)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb，其中Rb選自氫、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”和C1-C6烷基-N(R”)2，其中R”如前述所定義，及(c)由-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或-P(O)(ORe)2封端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，在各種情況下，Re選自氫，Rd如前述所定義；R4選自(a)R，其中R選自氫、鹵素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2和SR，其中在各種情況下，R如前述所定義，(b)飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-R，其中R如前述所定義，(c)芳環(huán)，其可在任何位置被R進一步取代，其中R如前述所定義，及(d)任選地以芳環(huán)封端的飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基，所述芳環(huán)可如(c)中所定義被進一步取代。
28.根據(jù)權利要求27所述的用途，其中R1為O，R2和R3各自為ORf，其中在各種情況下，Rf獨立地選自氫、-Rd和-C(O)-Rd，其中Rd為以-C(O)ORg封端的飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基鏈，且Rg選自氫和飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，R4選自飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-Rh，其中Rh選自R和芳環(huán)，所述芳環(huán)可在任何位置任選地被如前述定義的R進一步取代。
29.根據(jù)權利要求28所述的用途，其中R1為O，R2和R3各自獨立地選自OH、琥珀酸酯、富馬酸酯和亞甲氧羧基，R4選自1，1-二甲基戊基、1，1-二甲基庚基、1，1-二甲基-6-庚炔基、1，1-二甲基-3-苯基-丙基、1，1，3-三甲基-丁基、1-(4-氯-苯基)-1-甲基-乙基、1-乙基-1-甲基-丙基、5-溴-1，1-二甲基戊基和1，1-二甲基-戊-4-烯基。
30.根據(jù)權利要求29所述的用途，其中R1為O，R2為OH，R3為富馬酸酯，R4為1，1-二甲基庚基。
31.根據(jù)權利要求27所述的用途，其中所述藥物組合物還包括可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。
32.根據(jù)權利要求27所述的用途，其中所述式(I)的活性成分在一日1-4次的用藥方案中，按每kg體重約0.05至約50mg/kg的每日劑量施用。
33.根據(jù)權利要求27所述的用途，其中所述藥物組合物通過口服、粘膜、頰部、牙齦、舌、舌下或口咽施用進行口服施用。
34.根據(jù)權利要求33所述的用途，其中所述藥物組合物按液體、氣霧劑或固體單位劑型施用，所述劑型選自溶液劑、混懸劑、微膠粒、乳劑、微乳劑、氣霧劑、散劑、顆粒劑、囊劑、軟凝膠劑、片劑、丸劑、囊片和膠囊劑。
35.根據(jù)權利要求27所述的用途，其還包括所述式(I)的化合物與一種或多種其他藥物的聯(lián)合施用，所述其他藥物可獨立地選自式(I)的化合物、免疫調(diào)節(jié)劑、免疫抑制劑、類固醇、抗驚闕劑、鎮(zhèn)痛藥、抗抑郁藥、肌松劑、抗痙攣劑、抗震顫劑、三環(huán)抗抑郁藥、非甾體抗炎藥(NSAID)、選擇性5-羥色胺重吸收抑制劑(SSRI)、單胺氧化酶抑制劑(MOI)、抗抑郁藥、苯二氮卓類(BZD)、抗膽堿能藥物、β阻滯劑、緩瀉藥及特異性的通道阻滯劑。
36.根據(jù)權利要求35所述的用途，其中所述治療劑的聯(lián)合施用以選自下述的用藥方案進行單獨組合的組合物，基本上同時施用的分開的單個組合物和在分開的時間下施用的分開的單個組合物。
37.根據(jù)權利要求36所述的用途，其中所述其他藥物可獨立地選自IFN-β、IFN-β-1a、IFN-β-1b、醋酸格拉默、硫唑嘌呤、克拉屈濱、環(huán)磷酰胺、米托蒽醌、潑尼松和甲基潑尼松龍。
38.一種藥物組合物用于預防、減輕或治療神經(jīng)學癥狀的用途，所述神經(jīng)學癥狀選自震顫、痙攣、肌無力和協(xié)調(diào)喪失，所述藥物組合物包括作為活性成分的口服有效的式(I)的化合物及其可藥用鹽、酯或溶劑合物式I 具有特定的立體化學結構，其中C-4為S，C-1和C-5位的質(zhì)子彼此為順式，且C-4和C-5位的質(zhì)子為反式；且其中R1選自(a)O或S，(b)C(R’)2，其中在各種情況下，R’獨立地選自氫、氰基、-OR”、-N(R”)2、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”或C1-C6烷基-N(R”)2，其中在各種情況下，R”獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR和C1-C6烷基-N(R)2，其中在各種情況下，R獨立地選自氫或飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基，及(c)NR”或N-OR”，其中R”如前述所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)-R”、-OR”、-N(R”)2、-SR”、-S(O)(O)NR”，其中在各種情況下，R”如前述所定義，(b)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb，其中Rb選自氫、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”和C1-C6烷基-N(R”)2，其中R”如前述所定義，及(c)由-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或-P(O)(ORe)2封端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，在各種情況下，Re選自氫，Rd如前述所定義；R4選自(a)R，其中R選自氫、鹵素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2和SR，其中在各種情況下，R如前述所定義，(b)飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-R，其中R如前述所定義，(c)芳環(huán)，其可在任何位置被R進一步取代，其中R如前述所定義，及(d)任選地以芳環(huán)封端的飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基，所述芳環(huán)可如(c)中所定義被進一步取代。
39.根據(jù)權利要求38所述的用途，其中R1為O，R2和R3各自為ORf，其中在各種情況下，Rf獨立地選自氫、-Rd和-C(O)-Rd，其中Rd為以-C(O)ORg封端的飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基鏈，且Rg選自氫和飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，R4選自飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-Rh，其中Rh選自R和芳環(huán)，所述芳環(huán)可在任何位置任選地被如前述定義的R進一步取代。
40.根據(jù)權利要求39所述的用途，其中R1為O，R2和R3各自獨立地選自OH、琥珀酸酯、富馬酸酯和亞甲氧羧基，R4選自1，1-二甲基戊基、1，1-二甲基庚基、1，1-二甲基-6-庚炔基、1，1-二甲基-3-苯基-丙基、1，1，3-三甲基-丁基、1-(4-氯-苯基)-1-甲基-乙基、1-乙基-1-甲基-丙基、5-溴-1，1-二甲基戊基和1，1-二甲基-戊-4-烯基。
41.根據(jù)權利要求40所述的用途，其中R1為O，R2為OH，R3為富馬酸酯，R4為1，1-二甲基庚基。
42.根據(jù)權利要求38所述的用途，其中所述藥物組合物還包括可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。
43.根據(jù)權利要求38所述的用途，其中所述式(I)的活性成分在一日1-4次的用藥方案中，按每kg體重約0.05至約50mg/kg的每日劑量施用。
44.根據(jù)權利要求38所述的用途，其中所述藥物組合物通過口服、粘膜、頰部、牙齦、舌、舌下或口咽施用進行口服施用。
45.根據(jù)權利要求44所述的用途，其中所述藥物組合物按液體、氣霧劑或固體單位劑型施用，所述劑型選自溶液劑、混懸劑、微膠粒、乳劑、微乳劑、氣霧劑、散劑、顆粒劑、囊劑、軟凝膠劑、片劑、丸劑、囊片和膠囊劑。
46.根據(jù)權利要求38所述的用于預防、減輕或治療神經(jīng)學癥狀的用途，其還包括所述式(I)的化合物與一種或多種其他藥物的聯(lián)合施用，所述其他藥物可獨立地選自式(I)的化合物、抗驚闕劑、鎮(zhèn)痛藥、抗抑郁藥、肌松劑、抗痙攣劑、抗震顫劑、三環(huán)抗抑郁藥、非甾體抗炎藥(NSAID)、選擇性5-羥色胺重吸收抑制劑(SSRI)、單胺氧化酶抑制劑(MOI)、抗抑郁藥、苯二氮卓類(BZD)、抗膽堿能藥物、β阻滯劑、緩瀉藥及特異性的通道阻滯劑。
47.根據(jù)權利要求46所述的用途，其中所述治療劑的聯(lián)合施用以選自下述的用藥方案進行單獨組合的組合物，基本上同時施用的分開的單個組合物和在分開的時間下施用的分開的單個組合物。
48.一種藥物組合物用于調(diào)節(jié)炎癥性介質(zhì)的用途，所述藥物組合物包括作為活性成分的口服有效的式(I)的化合物及其可藥用鹽、酯或溶劑合物式I 具有特定的立體化學結構，其中C-4為S，C-1和C-5位的質(zhì)子彼此為順式，且C-4和C-5位的質(zhì)子為反式；且其中R1選自(a)O或S，(b)C(R’)2，其中在各種情況下，R’獨立地選自氫、氰基、-OR”、-N(R”)2、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”或C1-C6烷基-N(R”)2，其中在各種情況下，R”獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR和C1-C6烷基-N(R)2，其中在各種情況下，R獨立地選自氫或飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基，及(c)NR”或N-OR”，其中R”如前述所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)-R”、-OR”、-N(R”)2、-SR”、-S(O)(O)NR”，其中在各種情況下，R”如前述所定義，(b)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb，其中Rb選自氫、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”和C1-C6烷基-N(R”)2，其中R”如前述所定義，及(c)由-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或-P(O)(ORe)2封端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，在各種情況下，Re選自氫，Rd如前述所定義；R4選自(a)R，其中R選自氫、鹵素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2和SR，其中在各種情況下，R如前述所定義，(b)飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-R，其中R如前述所定義，(c)芳環(huán)，其可在任何位置被R進一步取代，其中R如前述所定義，及(d)任選地以芳環(huán)封端的飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基，所述芳環(huán)可如(c)中所定義被進一步取代。
49.根據(jù)權利要求48所述的用途，其中所述被調(diào)節(jié)的炎癥性介質(zhì)選自炎癥相關的基因、細胞因子、趨化因子、大麻素受體、STAT信號轉(zhuǎn)導蛋白、JAK激酶、微球蛋白、TNF-α及受體超家族、鈣調(diào)蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶、CB2、IL-1β、IFN-γ、iNOS和MCP-1。
50.根據(jù)權利要求49所述的用途，其中R1為O，R2和R3各自為ORf，其中在各種情況下，Rf獨立地選自氫、-Rd和-C(O)-Rd，其中Rd為以-C(O)ORg封端的飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基鏈，且Rg選自氫和飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的C1-C6烷基，R4選自飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C12烷基-Rh，其中Rh選自R和芳環(huán)，所述芳環(huán)可在任何位置任選地被如前述定義的R進一步取代。
51.根據(jù)權利要求50所述的用途，其中R1為O，R2和R3各自獨立地選自OH、琥珀酸酯、富馬酸酯和亞甲氧羧基，R4選自1，1-二甲基戊基、1，1-二甲基庚基、1，1-二甲基-6-庚炔基、1，1-二甲基-3-苯基-丙基、1，1，3-三甲基-丁基、1-(4-氯-苯基)-1-甲基-乙基、1-乙基-1-甲基-丙基、5-溴-1，1-二甲基戊基和1，1-二甲基-戊-4-烯基。
52.根據(jù)權利要求51所述的用途，其中R1為O，R2為OH，R3為富馬酸酯，R4為1，1-二甲基庚基。
全文摘要
本發(fā)明涉及外周大麻素受體CB
文檔編號C07C69/00GK101076324SQ200580042801
公開日2007年11月21日 申請日期2005年2月24日 優(yōu)先權日2004年10月22日
發(fā)明者艾威?！ぱ趴巳f, 艾維·拜爾約瑟夫, 西格爾·梅林, 希蒙·艾姆薩勒姆 申請人:法瑪氏公司