專(zhuān)利名稱(chēng)：MyD88同型二聚體化抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肽(peptidic)和擬肽化合物，所述化合物模擬MyD88的特定蛋白部分，阻止其同型二聚體化，以及干擾其與TIR結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。
本發(fā)明提供了制備所述化合物的方法、含有它們的藥物組合物以及它們作為藥劑的用途，特別是用于治療炎性疾病和自身免疫疾病的。
背景技術(shù)：
炎性反應(yīng)通常是防御天性的反應(yīng)，其由活的生物體激活，以區(qū)分以及隨后清除物理化學(xué)傷害導(dǎo)致的損傷以及感染性攻擊。但是，在一些情況下，由于持續(xù)刺激導(dǎo)致的急性炎性事件進(jìn)化為炎性過(guò)激活的狀態(tài)，其趨向于變成慢性，通常導(dǎo)致正常的周?chē)M織的自身毀滅。該過(guò)程是由下述這些導(dǎo)致的對(duì)粘附分子(adhesive molecule)的增加的誘導(dǎo)，炎性細(xì)胞成分在病理傷害位點(diǎn)的遷移以及隨后炎性介體能量的釋放(Shanley，T.P.，et al.；Mol.Med.Today，40-45，1995)。
各種介體的轉(zhuǎn)錄序列和可能的生產(chǎn)處于已知作為轉(zhuǎn)錄因子或TFs的特定蛋白因子的控制之下(Müller， C.W.；Curr.Opin.Struct.Biol.，1126-32，2001)。這些因子一旦被激活，會(huì)與DNA中存在的特定共有區(qū)域結(jié)合，作為分子開(kāi)關(guān)，用于對(duì)炎性試劑的基因表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)或過(guò)調(diào)節(jié)。
最經(jīng)常被研究的轉(zhuǎn)錄因子(由于其參與多種炎性狀況)，毋庸置疑是NF-κB，其識(shí)別針對(duì)編碼前炎性細(xì)胞因子(TNF、IL-1、IL-2、IL-6、IL-11、IL-17、GM-CSF)、趨化因子(IL-8、RANTES、MIP-1α、MCP-2)、粘附分子(ICAM-1、VCAM-1、E-選擇蛋白)和生產(chǎn)炎性介體的酶(iNOS和COX2)的多種基因的增強(qiáng)子的共有序列(Ghosh，S.，et al.；Annu.Rev.Immunol，16225-260，1998)。
應(yīng)答于各種類(lèi)型的損傷刺激，在免疫應(yīng)答涉及的幾乎所有細(xì)胞中都觀察到NF-κB激活嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及內(nèi)皮、上皮及間質(zhì)細(xì)胞。對(duì)NF-κB的即時(shí)短暫激活由此構(gòu)成了對(duì)病原性損傷的正常生理應(yīng)答功能中最為重要的特征。但是，已發(fā)現(xiàn)，對(duì)該精細(xì)機(jī)制的調(diào)節(jié)不良(使其自身處于過(guò)量的、永久的激活形式)與慢性炎性疾病緊密相關(guān)(Barnes，P.J.和Karin，M.；New Engl.J.Med.，3361066-1071，1997)。
NF-κB在導(dǎo)致慢性炎性疾病中的重要作用使得該因子成為定向治療干涉方法的治療靶標(biāo)。
在考慮到“抗NF-κB”療法的安全性的那些情況下，必須在非特異性副作用和直接由對(duì)NF-κB的內(nèi)在抑制導(dǎo)致的副作用加以區(qū)分。因?yàn)楹笳咴陉P(guān)于正常細(xì)胞生理應(yīng)答的方面構(gòu)成多種信號(hào)匯合的關(guān)鍵點(diǎn)，預(yù)測(cè)對(duì)NF-κB的延伸廣泛的、全身性的抑制是否導(dǎo)致不想要的損傷作用是模棱兩可的。就將此類(lèi)拮抗劑用于治療應(yīng)用的目的而言，明顯出現(xiàn)了下述需要確定允許有效治療同時(shí)又盡可能地使得不想要的影響最小化的物質(zhì)。對(duì)設(shè)計(jì)可能的NF-κB拮抗劑的首要重要的參數(shù)因此由對(duì)活性的選擇性構(gòu)成。
此外，人們預(yù)期，能通過(guò)干擾接近的炎性信號(hào)系統(tǒng)來(lái)抑制NF-κB的藥理試劑可能比作用于關(guān)系更遠(yuǎn)的生物化學(xué)事件的那些試劑要安全。
導(dǎo)致IL-1的結(jié)合以及導(dǎo)致對(duì)轉(zhuǎn)錄因子(例如NF-κB和AP-1)的激活的分子事件通過(guò)基于對(duì)多種蛋白因子的順序激活的放大級(jí)聯(lián)發(fā)生。
具體而言，IL-1的結(jié)合誘導(dǎo)了受體異源復(fù)合物IL-1R/1L-1RacP的形成，其隨后吸引進(jìn)銜接(adaptor)蛋白MyD88。通過(guò)置于各自的TIR結(jié)構(gòu)域之間的嗜同型相互作用，IL-1R e IL-1RAcP的細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)域與MyD88發(fā)生的相互作用值得強(qiáng)調(diào)。由于MyD88的羧基末端部分(TIR結(jié)構(gòu)域)對(duì)于使MyD88結(jié)合到受體異源復(fù)合物上有作用，而氨基末端部分(死亡結(jié)構(gòu)域)則通過(guò)與激酶IRAK的死亡結(jié)構(gòu)域之間的相互作用(在本情況下，也是通過(guò)嗜同型相互作用)，允許將后者吸引到異源復(fù)合體上，這是其磷酸化發(fā)生的位置。磷酸化發(fā)生之后，IRAK據(jù)信會(huì)從復(fù)合物上自己脫離下來(lái)，在于蛋白體中被降解之前與銜接蛋白TRAF6發(fā)生相互作用。TRAF6進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)激酶TAK1的激活，該激酶自身磷酸化，隨后激活激酶MAP2K和NIK(NF-κB誘導(dǎo)激酶)。最終結(jié)果是MAP2K和NIK導(dǎo)致了對(duì)參與編碼重要炎性介體的基因的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子AP1和NF-κB分別的激活。
近些年來(lái)進(jìn)行的研究已支持了關(guān)于在IL-1R/TLR超家族中存在共有轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的假設(shè)。有力地說(shuō)，已證實(shí)(O′N(xiāo)eill，LAJ andDinarello，CA；Immunology Today，21(5)206-209，2000)IL-1激活的信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還在IL-18 ed LPS的信號(hào)傳遞中生效。
具體而言，其顯示銜接蛋白MyD88在IL-1、IL-18和LPS誘發(fā)的轉(zhuǎn)導(dǎo)事件中扮演重要角色。事實(shí)上已有報(bào)道MyD88 KO小鼠雖被證明可完美存活，但其缺乏應(yīng)答LPS的刺激的正常能力(Kawai，T，etal.；Immunity，11115-122，1999)。
這些結(jié)果在不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)置中得到證實(shí)，其中，MyD88的點(diǎn)突變，F(xiàn)56N(其阻止MyD88的功能活性二聚體的形成)不會(huì)誘導(dǎo)對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的激活(Burns K et al.，J Biol Chem 273(20)12203-12209，1998)。
此外，還建立了進(jìn)一步的研究(Adachi，O.，et al.；Immunity，9143-150，1998)，MyD88 KO小鼠對(duì)用IL-1或IL-18的刺激沒(méi)有應(yīng)答。事實(shí)上，已觀察到如果用IL-1進(jìn)行刺激，這些KO小鼠的胸腺細(xì)胞和脾細(xì)胞不能激活正常的增殖應(yīng)答。此外，IFN-γ和NK細(xì)胞活性的產(chǎn)生并不作為用IL-18刺激的結(jié)果而增加，這與在野生型小鼠中發(fā)生的不同。
基于上面列出的發(fā)現(xiàn)，明顯地，MyD88在多種不同炎性刺激(例如IL-1，IL-8，IL-1R家族的激動(dòng)劑和TLR家族的激動(dòng)劑，例如，LPS)誘發(fā)的對(duì)NF-κB的激活中扮演關(guān)鍵角色(Takeuchi，O.and Akira，S.；Curr.Top.Microbiol.Immunol.，270155-67，2002)。
目前用于拮抗炎性細(xì)胞因子的信號(hào)傳遞的手段的目的目前是特異性地中和它們中每種的活性，這通過(guò)使用特定的單克隆抗體、受體拮抗劑或可溶性受體來(lái)實(shí)現(xiàn)。明顯的目的是從外界選擇性阻止細(xì)胞因子與相關(guān)膜受體的結(jié)合。
然而，最近來(lái)的文獻(xiàn)暗示，基于對(duì)細(xì)胞原生質(zhì)銜接蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的抑制來(lái)使用實(shí)驗(yàn)手段，可能是一種有效的創(chuàng)新策略(L.A.J. O′N(xiāo)eill and CA.Dinarello；Immunol.Today，21206-209，2000；M.Muzio，et al.；J.Leukoc.Biol，67450-456，2000；J.M. Schuster and P.S.Nelson；J.Leukoc.Biol.，67767.773，2000)。
因此，原理上證明，對(duì)銜接蛋白(例如MyD88)的抑制比對(duì)各個(gè)配體活性的抑制更有效，所述銜接蛋白參與對(duì)NF-κB的激活，這一激活是來(lái)自細(xì)胞膜外表面存在的受體的信號(hào)誘發(fā)的，所述受體識(shí)別不同的配體但共享相同的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
對(duì)受體IL-1R/TLR和MyD88的TIR結(jié)構(gòu)域的初級(jí)序列比對(duì)時(shí)，保守的區(qū)域之一構(gòu)成第二beta鏈和第二alpha螺旋之間的環(huán)(BB環(huán))，其共有序列是RDXΦ1Φ2GX，其中X是任何氨基酸，Φ1Φ2是兩個(gè)疏水氨基酸；具體而言，Φ2是脯氨酸，除了在IL-1RI中其是纈氨酸。已知，TLR4中R677->E、P681->H和G682->V的突變消除了信號(hào)的傳送；此外，對(duì)受體TLR2和突變?yōu)镻681->H的受體TLR2的細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)TIR結(jié)構(gòu)域的結(jié)晶圖坐標(biāo)進(jìn)行比較時(shí)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)影響環(huán)或其鄰近區(qū)域的結(jié)構(gòu)變化(Nature，2000，Vol.408，111)。該區(qū)域因此可能與銜接蛋白/受體相互作用界面有關(guān)。因此假設(shè)，該區(qū)域?qū)τ贛yD88的同型二聚體化也是重要的。
這一聯(lián)系中還已知了Rebek et al..(Bartfai，T.，et al.；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1007971，2003)進(jìn)行的研究，他證實(shí)了能以細(xì)胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域的水平干擾MyD88/IL1-RI相互作用的擬肽化合物的可能可應(yīng)用性；BB環(huán)的中央部分的模擬物，具有(F/Y)-(V/L/I)-(P/G)作為其在不同toll受體以及MyD88同源體中的共有序列，能在體外抑制蛋白激酶p38在用IL-1β刺激的EL4細(xì)胞系中的磷酸化，其還能在體內(nèi)顯著減輕用鼠重組IL-1β注射的小鼠中的發(fā)熱應(yīng)答。但是，該化合物不能抑制MyD88/TLR4相互作用。
該領(lǐng)域的專(zhuān)家將歡迎能不抑制單一的MyD88/受體相互作用，但抑制銜接蛋白的同型二聚體化的化合物，其因此導(dǎo)致對(duì)更大量的前炎性信號(hào)的抑制，并且因此證明更具治療效果。
此外，Yale University，CT，USA(WO02/090520A2)的近來(lái)的發(fā)明要求保護(hù)TIRAP多肽用于拮抗應(yīng)答于TLR4連接(ligation)的不依賴(lài)MyD88的信號(hào)傳遞。
TIRAP是新穎的蛋白，其含有Toll/IL-1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域，其是Medzhitov(Horng，T.，Barton，G.M.，and Medzhitov，R.；Nat.Immunol.2835-841，2001)和O′N(xiāo)eill(Fitzgerald，K.A.，Palsson-McDermott，EM.et al.；Na ture 41378-83，2001)分別鑒定的。盡管最初預(yù)期TIRAP可能參與不依賴(lài)MyD88的NF-κB激活，但后續(xù)研究已揭示，TARAP并不參與不依賴(lài)MyD88的途徑，而是作為銜接蛋白在由TLR2和TLR4初始化的依賴(lài)MyD88的信號(hào)傳遞途徑中發(fā)揮作用(Yamamo to，M.，Sato，S.，Hemmi，H.；Nature 420324-329，2002)。實(shí)際上，同樣是這些研究者發(fā)現(xiàn)，名為T(mén)rif的另一種銜接蛋白，是實(shí)際上參與不依賴(lài)于MyD88的對(duì)NF-κB的激活(Yamamoto，M.，Sato，S.，Hemmi，H.et al.；Science 301，640-643)。目前可獲得的證據(jù)表明，所有TLRs都利用MyD88，TLR3是唯一例外(Takeda，K.and Akira，S.；Int Immunol.171-14，2005)。Dunne et al.對(duì)TIRAP和MyD88與TLR2和TLR4之間的相互作用進(jìn)行了深度研究，顯示，TIRAP和MyD88實(shí)際與TLR2和TLR4的不同區(qū)域結(jié)合(Dunne，A.，Ejdeback，M.，Ludidi，P.L.et al.；J Biol Chem 27841443-41451，2003)。
再一次地，本領(lǐng)域技術(shù)人員將歡迎既非單一抑制的MyD88/受體相互作用也非單獨(dú)抑制參與TLR2和TLR4信號(hào)傳遞的銜接蛋白(TIRAP)的化合物。事實(shí)上，對(duì)參與所有已知TLRs(除TLR3之外)的信號(hào)傳遞的轉(zhuǎn)導(dǎo)的單個(gè)瓶頸銜接蛋白(MyD88)的抑制被預(yù)計(jì)能拮抗更大量的前炎性信號(hào)，由此證明在治療上更有效果。
基于文獻(xiàn)中目前可獲得的信息，我們相信，對(duì)TLR/IL-1R受體系統(tǒng)的信號(hào)傳遞的調(diào)節(jié)不良導(dǎo)致的大量疾病包括但不限于-炎性和自身免疫疾病，例如，關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、慢性炎性腸疾(IBD)、牛皮癬、1型糖尿病、多發(fā)性硬化、哮喘和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(見(jiàn)，例如Sabroe，I.，et al.；J.Immunol；1711630-5，2003；Liu-Bryan R et al.Arthritis Rheum.522936-46，2005；Joosten，LA，et al.；J Immunol.，1716145-53，2003；Sabroe，L.，et al.；Clin.Exp.Allergy，32984-9，2002；Lehnardt，S.；Proc.Natl.Acad.Sci USA，1008514-9，2003；Cboe，JY，et al.，J.Exp.Med.，197537-42，2003；Sabroe，I.；Thorax，5981，2004；Bellou，A.；Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol，3487-94，2003；O′N(xiāo)eill，LA；Curr.Opin.Pharmacol，3396-403，2003；Schon，M.，et al.；Clin.Exp.Immunol，123505-10，2001；Leadbetter，EA et al.；Nature，416603-7，2002；Rifkin，IR etal.；Immunol Rev.20427-42，2005.)。
-心血管和致動(dòng)脈粥樣硬化性疾病，例如，心肌梗塞、病毒性心肌炎、動(dòng)脈粥樣硬化、靜脈移植物動(dòng)脈粥樣硬化(vein graftatherosclerosis)、血栓、再狹窄、由于支架造成的再狹窄以及由于血管成形術(shù)(angioplasty)造成的再狹窄(見(jiàn)，例如de Kleijn，D.，and Pasterkamp G.；Cardiovasc Res.，6058-67，2003；Oyama，J.-I.，et al.；Circulation，109784-789，2004；Satoh，M.，et al.；Lab.Invest，84173-81，2004； Thomas，JA，et al.；Am.I.Physiol.Heart Circ.Physiol.，285H597-606，2003)；Fairweather，D.，et al.；J.Immunol.，1704731-7，2003；Kiechl，S.，et al.；Ann.Med.，35164-71，2003；Edfeldt，K.，et al.；Circulation，1051158-1161，2002；Arditi et al，US20030148986)。
-膿毒癥和休克(見(jiàn)，例如Read，RC，and Wyllie，DH；Curr.Opin.Crit.Care；7371-5，2001；Carrillo-Esper，R.；Cir.Cir.，71252-8，2003；Knuefermann，P.；Chest，1211329-1336，2002；Knuefermann，P.，et al.；Circulation，1062608-2615，2002)。
-移植排斥(見(jiàn)，例如Goldstein，DR.，et al.；J.Clin.Invest.，1111571-1578，2003；Belperio，J.A.；Am.J.Respir.Crit.Care Med.，168623-624，2003)。
-癌癥(見(jiàn)，例如，Huang，B，et al.；Cancer Res.655009-14，2005)。
-病毒感染(見(jiàn)，例如Bafica，A.et al.；J Immunol.1727229-34，2004；Equils，O.，et al.；J Immunol 1705159-5164，2003；Scheller，C.et al.；J Biol Chem 27921897-21902，2004；Sund strom，J.B.et al.；J Immunol 1724391-4401，2004)。
以Cedars-Sinai Medical Center的名義提交的專(zhuān)利申請(qǐng)US20030148986描述了抑制蛋白質(zhì)MyD88的表達(dá)或生物活性的多種方法。這些還包括阻止蛋白質(zhì)信號(hào)傳遞的擬肽劑的使用。該抑制用與TLR-4受體結(jié)合的小的肽(10-20個(gè)氨基酸)來(lái)完成，由此其阻止與MyD88的結(jié)合。MyD88的小的重疊片斷(大約10-20個(gè)氨基酸)可被分離開(kāi)，以檢測(cè)看看其中的哪些能通過(guò)與TLR-4受體結(jié)合來(lái)阻止MyD88細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。分離之后，片斷被復(fù)制，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，以確定該片斷是否包含MyD88的能與TLR-4受體結(jié)合的至少一部分，其將組織MyD88的結(jié)合以及細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。該參考文獻(xiàn)中沒(méi)有給出具體例子。
本發(fā)明的發(fā)明人已進(jìn)行了關(guān)于對(duì)MyD88的同型二聚體化的抑制的初步研究，對(duì)包含BB環(huán)的共有序列的一系列天然肽(在N末端合成為乙酰胺，在羧基末端合成為一級(jí)酰胺)進(jìn)行了共免疫沉淀試驗(yàn)。表1顯示了被證明有活性的肽，以及MyD88同型二聚體中發(fā)現(xiàn)的殘余相互作用，以未經(jīng)處理的蛋白質(zhì)的百分比顯示。蛋白質(zhì)myc-MyD88在HEK293細(xì)胞中暫時(shí)表達(dá)，通過(guò)用抗myc抗體進(jìn)行免疫沉淀將其從細(xì)胞提取物分離出來(lái)。在存在或不存在合成肽(終濃度200μm)的情況下，將免疫沉淀的蛋白與經(jīng)純化的蛋白GST-MyD88TIR一起在4℃孵育60分鐘。合適的洗滌之后，用SDS溶解吸附在用于免疫沉淀的樹(shù)脂上的蛋白質(zhì)，通過(guò)Western雜交印跡試驗(yàn)針對(duì)myc-MyD88和GST-MyD88TIR的存在進(jìn)行分析。針對(duì)兩種肽還給出了對(duì)NF-κB激活的百分比抑制。
表1

此外，與果蠅(Drosophila)的Antennapaedia(Ap)蛋白片段接合的(Ap-MyD88＝ST2345)肽ST2348具有序列RQIKIWFQNRRMKWKK(穿膜肽)(Gari，J.，and Kawamura，K.；TRENDS in Biotechnology，19；21-28，2001)被證明能在用IL-1α刺激的HeLa細(xì)胞中抑制NF-κB激活，而相應(yīng)的雜亂的(scrambled)肽(ST2403 Ap-PTDLVRG-NH2)是沒(méi)有活性的。
本發(fā)明的目的是鑒定出MyD88的特定蛋白部分的模擬物，所述模擬物能通過(guò)干擾該蛋白與TIR結(jié)構(gòu)域的相互作用來(lái)阻止的其同型二聚體的形成。該手段使得避免將MyD88吸引到每個(gè)IL-1R/TLR受體處作為銜接蛋白發(fā)揮作用成為可能。
本發(fā)明的分子可用作為藥劑，用于治療慢性炎性疾病，并能調(diào)節(jié)IL-1R/TLR受體介導(dǎo)的NF-κB激活。
用于構(gòu)建MyD88的TIR結(jié)構(gòu)域共有肽的模擬物的策略將在下文中描述MyD88的TIR結(jié)構(gòu)域的共有肽的H-Arg-Asp-Val-Leu-Pro-Gly-Thr-OH結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步分為三個(gè)不同的部分，其由a)由氨基酸Arg-Asp構(gòu)成的帶電荷部分，b)由氨基酸Val-Leu構(gòu)成的疏水部分，c)由氨基酸Leu-Pro-Gly-Thr構(gòu)成的β-轉(zhuǎn)角部分構(gòu)成。
對(duì)于這些部分的每一個(gè)來(lái)說(shuō)，選擇某種類(lèi)型的類(lèi)似物，在共有肽序列中交替地或同時(shí)被取代，同時(shí)保留酰胺鍵作為三個(gè)基團(tuán)之間的功能性接頭基團(tuán)a)更考慮Arg基團(tuán)，其被擬精氨酸基團(tuán)取代，其中，擬精氨酸表示下述化學(xué)結(jié)構(gòu)，當(dāng)精氨酸被其取代時(shí)，調(diào)節(jié)該功能性基團(tuán)的堿度為從精氨酸的堿度到零堿度。
b)考慮精氨酸和脯氨酸之間的距離，用間隔基(spacer)對(duì)其進(jìn)行填充，間隔基表示下述疏水化學(xué)結(jié)構(gòu)，其具有有限數(shù)量的旋轉(zhuǎn)自由度，其含有被各種取代的、官能團(tuán)化的芳香族接頭環(huán)、僅一個(gè)羧酸基團(tuán)和僅一個(gè)一級(jí)胺，參與酰胺鍵。
c)考慮Pro-Gly的β-轉(zhuǎn)角的中央部分，其被β-轉(zhuǎn)角模擬物取代，其中，β-轉(zhuǎn)角模擬物表示下述化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過(guò)模擬Pro-Gly β-轉(zhuǎn)角的中央部分，其允許該分子采用有利于與蛋白質(zhì)MyD88形成鍵的構(gòu)象。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，下文所述的肽和/或擬肽化合物能模擬MyD88的特定蛋白部分，阻止其同型二聚體化，以及干擾其與TIR結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。
本發(fā)明的主題是結(jié)構(gòu)式(I)的肽和/或擬肽化合物(X-)AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7(I)其中X是可藥用的陰離子，或者不存在；基團(tuán)AA1-AA7中的每一個(gè)(可以是相同的或不同的)，是具有下述含義的氨基酸或氨基酸模擬物AA1＝L-精氨酸(Arg)、D-精氨酸(arg)、L-組氨酸(His)、D-組氨酸(his)或擬精氨酸基團(tuán)的殘基，或不存在，其中，所謂擬精氨酸表示下述化學(xué)結(jié)構(gòu)，其取代精氨酸，并調(diào)節(jié)該功能性基團(tuán)的堿度從精氨酸的堿度到零堿度，其具有結(jié)構(gòu)式(II)、(III)和(IV)
AA2＝L-天冬氨酸(Asp)、D-天冬氨酸(asp)、L-天冬酰胺(Asn)、D-天冬酰胺(asn)、甘氨酸(gly或Gly)，或不存在；AA3＝L-纈氨酸(Val)、D-纈氨酸(val)、氮雜纈氨酸(AzaVal)、氮雜甘氨酸(Azagly)、氮雜亮氨酸(AzaLeu)；AA4＝L-亮氨酸、D-亮氨酸、L-纈氨酸(Val)、D-纈氨酸(val)、L-半胱氨酸(Cys)、D-半胱氨酸(cys)、氮雜亮氨酸(AzaLeu)、氮雜纈氨酸(AzaVal)、氮雜甘氨酸(Azagly)；AA2-AA3-AA4可共同被間隔基取代，其中，間隔基表示下述疏水化學(xué)結(jié)構(gòu)，其具有有限數(shù)量的旋轉(zhuǎn)自由度，其含有被多樣取代的、官能化的芳香族接頭環(huán)、僅一個(gè)羧酸基團(tuán)和僅一個(gè)一級(jí)胺基團(tuán)，參與酰胺鍵，其具有結(jié)構(gòu)式(V) AA5＝L-脯氨酸(Pro)、D-脯氨酸(pro)、順-4，5-(亞甲基)-L-脯氨酸(cMe-Pro)、順-(4，5)-(亞甲基)-D-脯氨酸(cMe-pro)、反-4，5-(亞甲基)-L-脯氨酸(tMe-Pro)、反-(4，5)-(亞甲基)-D-脯氨酸(tMe-pro)；AA6＝甘氨酸(gly或Gly)、肌氨酸(Sar)、氮雜甘氨酸(Azagly)；AA5-AA6可共同被β-轉(zhuǎn)角模擬物取代，其中，β-轉(zhuǎn)角模擬物表示下述化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過(guò)模擬Pro-Gly β-轉(zhuǎn)角的中央部分，其允許該分子采用有用于與蛋白質(zhì)MyD88形成鍵的構(gòu)象，其具有結(jié)構(gòu)式(VI)和(VII)
n＝0，1，2m＝0，1，2p＝0，1*＝外消旋物以及純的對(duì)映異構(gòu)體 X＝CO，SO2Y＝H，OH*＝外消旋物以及純的對(duì)映異構(gòu)體(VII)AA7＝甘氨酸(gly或Gly)、氮雜甘氨酸(Azagly)、L-蘇氨酸(Thr)、D-蘇氨酸(thr)、L-半胱氨酸(Cys)、D-半胱氨酸(cys)的殘基，或不存在；當(dāng)AA4＝AA7＝Cys或cys時(shí)，兩個(gè)半胱氨酸之間存在二硫橋；當(dāng)AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6和AA7中的一些或全部是氨基酸時(shí)，它們可以是L或D，序列可以是反向的或不是反向的；AA1-AA7之間的鍵總是酰胺類(lèi)型的；末端氨基可以是游離的，或用有用于轉(zhuǎn)運(yùn)該分子的可藥用基，例如乙?；⒓柞；⒈郊柞；⒈；?、環(huán)己基、肉豆蔻?；；?；末端羧基可以是羧酸或一級(jí)酰胺的形式。
各自的對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體、其混合物以及它們的可藥用鹽；當(dāng)如下條件時(shí)
AA1-AA7中的至少一個(gè)不是上面指出的天然氨基酸，或者如果AA1-AA7全部都是上面指出的天然氨基酸，所述AA1-AA7是反向的。
結(jié)構(gòu)式(I)的化合物可用作藥劑，特別是用于制備用于治療疾病的藥劑，所述疾病源自對(duì)TLR/IL-R1受體系統(tǒng)的信號(hào)傳遞的調(diào)節(jié)不良，以及特別地，炎性和自身免疫疾??；心血管和致動(dòng)脈粥樣硬化性疾??；膿毒癥和休克；以及移植排斥。
因此，本發(fā)明的主題是結(jié)構(gòu)式(I)的化合物、含有它們的藥物組合物以及它們作為藥劑的用途。
發(fā)明詳述末端氨基可以是游離的，或用有用于轉(zhuǎn)運(yùn)該分子的可藥用基，例如乙?；?、甲酰基、苯甲?；?、丙?；?、環(huán)己基、肉豆蔻?；；?；末端羧基可以是羧酸或一級(jí)酰胺的形式。
可藥用酸的陰離子的例子是Cl-、Br-、I-、CH3COO-和CF3COO-。其它可藥用陰離子可由本領(lǐng)域的專(zhuān)家按照用于本領(lǐng)域的通常標(biāo)準(zhǔn)加以選擇，所述標(biāo)準(zhǔn)例如無(wú)毒或者實(shí)質(zhì)上無(wú)毒或者任何可接受的毒性，或者制劑優(yōu)點(diǎn)，例如溶解度或晶型?？伤幱玫柠}表示下述任何鹽，它們不產(chǎn)生毒性或不想要的影響，或者從臨床角度來(lái)看此類(lèi)影響使得它們?nèi)砸钥山邮艿男问酱嬖凇３怂蛩钠胀ㄖR(shí)之外，具有平均經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員可容易地參考文獻(xiàn)，例如，European Pharmacopoeia(歐洲藥典)或United States Pharmacopeia(美國(guó)藥典)。
假設(shè)對(duì)擬精氨酸基團(tuán)的定義如上文所述，優(yōu)選例子是下面這些
其中，A是直鏈或帶支鏈的C1-C4烷基；AL是選自F、Cl、Br和I的鹵素基團(tuán)。
假設(shè)對(duì)間隔基團(tuán)的定義如上文所述，該基團(tuán)的優(yōu)選例子具有結(jié)構(gòu)式(SPX)n，其中n＝0-3，其如下表中所定義

其中，A是直鏈或支鏈的C1-C4烷基；AL是選自F、Cl、Br和I的鹵素基團(tuán)。
假設(shè)對(duì)間隔基團(tuán)的定義如上文所述，該基團(tuán)的優(yōu)選例子是如下這些 對(duì)化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)部分描述的三種生物初級(jí)篩選試驗(yàn)a)雙雜交試驗(yàn)，b)NF-κB抑制試驗(yàn)和c)RGA試驗(yàn)。在三種生物試驗(yàn)中的任何一種中提供活性的化合物被認(rèn)為是活性化合物。
結(jié)構(gòu)式(I)代表的化合物可被分入下述的類(lèi)
1.按照流程9制備的直到結(jié)構(gòu)式IV或結(jié)構(gòu)式IVI的肽化合物。
優(yōu)選的化合物是ST2565 Ac-thr-gly-pro-leu-val-asp-arg-NH22.按照流程9制備的直到結(jié)構(gòu)式III或結(jié)構(gòu)式IIII的擬肽化合物優(yōu)選的化合物是 ST2793PAM8-SP20-Beta3-NH2 ST2806AM8-SP38-Beta6 ST2825PAM4-SP19-Beta8-NH2 ST2826PAM6-SP20-Beta8-NH2
ST2828SP32-Beta3-NH2 ST3324PAM11-SP19-Beta8-NH2
ST3374PAM10-SP6-Beta8-NH2 ST3375PAM3-SP30-Beta8-NH23.按照流程9制備的直到結(jié)構(gòu)式III、IIII、IIV和IV的部分肽化合物，其被分入下述亞類(lèi)-其中AA5-AA6被β-轉(zhuǎn)角模擬物取代的部分肽化合物，其是按照流程9制備的直到結(jié)構(gòu)式IIV和IV。
優(yōu)選的化合物是 ST2799Ac-arg-asp-val-leu-Beta1-NH2-其中AA2-AA3-AA4被間隔基取代并且AA5-AA6被β-轉(zhuǎn)角模擬物取代的部分肽化合物，其是按照流程9制備的直到結(jié)構(gòu)式III和IIII。
優(yōu)選的化合物是
ST2804Ac-Arg-SP02-Beta2-Gly-NH2 ST2801Ac-Arg-SP12-Beta2-Thr-NH2 ST2805NH2-arg-SP02-Beta5-其中AA1是擬精氨酸并且AA5-AA6被β-轉(zhuǎn)角模擬物取代的部分肽化合物，其是按照流程9制備的直到結(jié)構(gòu)式IIV和IV。
優(yōu)選的化合物是 ST2794PAM9-Asp-Val-Val-Beta2-NH2.
-其中AA1是擬精氨酸并且AA2-AA3-AA4被間隔基取代的部分肽化合物，其是按照流程9制備的直到結(jié)構(gòu)式IIII和IIV。
優(yōu)選的化合物是 ST2807PAM9-(SP31)3-Pro-Gly-NH2 ST2796AM9-SP02-Pro-Gly-NH2 ST2797PAM8-SP15-Pro-Gly-NH2 ST2798PAM9-SP38-Pro-Gly-NH2.
ST2863AM9-SP17-Pro-Gly-NH2
其中chiral表示“手性”-其中AA1是擬精氨酸，AA2-AA3-AA4被間隔基取代，AA5-AA6被β-轉(zhuǎn)角模擬物取代并且AA7是氨基酸的部分肽化合物，其是按照流程9制備的直到結(jié)構(gòu)式IIII。
優(yōu)選的化合物是 ST2792PAM9-SP02-Beta2-Thr-NH2.
-其中AA2-AA3-AA4被間隔基取代的部分肽化合物，其是按照流程9直到結(jié)構(gòu)式IIII制備的。
優(yōu)選的化合物是 ST2864Ac-Gly-Pro-SP30-Arg-NH2，其中chiral表示“手性”其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被一個(gè)或多個(gè)氮雜-氨基酸取代的部分肽化合物，其是按照流程9制備的直到結(jié)構(gòu)式IV和IVI。
優(yōu)選的化合物是ST2926 H-Arg-Gly-AzaVal-Val-Pro-Gly-NH2ST3032 Ac-Azagly-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH2ST2927 Ac-Arg-Asp-Azagly-Val-Pro-Gly-NH2ST2930 Ac-thr-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH2ST2920 Ac-Arg-Asp-Val-Aza Val-Pro-Gly-NH2
ST2928 Ac-Arg-Asp-AzaLeu-Val-Pro-Gly-NH2根據(jù)本發(fā)明的化合物可通過(guò)本領(lǐng)域?qū)＜沂煜さ膫鹘y(tǒng)合成方法來(lái)制備。一般性的肽合成技術(shù)能很好地適用于本發(fā)明的目的。指導(dǎo)性的參考文獻(xiàn)例如Norbert Sewald，Hans-Dieter Jakubke，PeptidesChemistry and Biology，Wiley VCH(2002)；Miklos Bodanszky，Principles of Peptide Synthesis(Sec.Ed.)，Springer-Verlag(1993)；John Jones，Amino Acid and Peptide Synthesis(OxfordChemistry Primers)，Oxford Science Publications(2000)。
下文示出的流程9中描述了一般性的合成流程，讀者應(yīng)將其看作一般性的描述。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的化合物含有非肽部分時(shí)，對(duì)它們的合成需要先構(gòu)建合成塊(building block)，然后在其上完成對(duì)肽分子的構(gòu)造。
在下文描述的流程中，對(duì)合成塊舉例了若干的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)理解，它們?cè)谄渫耆纳舷挛闹兄皇顷P(guān)于本發(fā)明實(shí)施方式的對(duì)本領(lǐng)域?qū)＜业闹笇?dǎo)。事實(shí)上，關(guān)于沒(méi)有被闡釋性示例出來(lái)的那些，本領(lǐng)域?qū)＜乙材芡ㄟ^(guò)他們自己的一般性知識(shí)來(lái)獲得，例如，通過(guò)在市場(chǎng)上可獲得的那些中尋找起始化合物，或者通過(guò)與例子中列出的那些的類(lèi)似性來(lái)制備它們。
對(duì)合成塊的合成使用按照下文實(shí)施例所述的合成方法合成的合成塊，來(lái)合成被稱(chēng)為β-轉(zhuǎn)角模擬物的擬肽化合物的部分。
(以下流程中，“silica gel”表示“硅膠”，“chiral”表示“手性”)按照流程1合成合成塊ST2364(11)，其可用于合成含有β-轉(zhuǎn)角模擬物Beta2的擬肽化合物，其中使用R.L.Johnson及其同事(Genin，M.J.；et al.；J.Org.Chem.；1993，58，2334-2337)描述的經(jīng)R.DLong and K.D.Moeller(Long，R.D.；et al.；J.Am.Chem.Soc；1997，119，12394-1239)改進(jìn)的方法，至中間體8，再使用下文實(shí)施例1描述的方法來(lái)進(jìn)行。
流程1ST2364的合成 試劑(a)t-Bu-CHO，cat.CF3COOH，(b)1.LDA，2.CH2＝CH-CH2-Br，(c)Silica gel，MeOH/H2O(d)(Boc)2O，(e)Gly-OMe.HCl，DCC，HOBt，NEt3，(f)OsO4，NalO4，MeOH/H2O，(g)NaBH3CN，(h)K2CO3，(i)TFA，(l)1.NaHCO3，2.Fmoc-OSu，3.HCl實(shí)施例1{(5R)-1-[(9H-芴-9-基-甲氧基)-羰基]-6-氧代-1，7-二氮雜螺[4，4]壬-7-基}-乙酸ST2364(11)的制備中間體[(5R)-1-(叔丁氧羰基)-6-氧代-1，7-二氮雜螺[4，4]壬-7-基]-乙酸(9)的制備將8.5g(0.027mol)(5R)-7-(2-甲氧基-2-氧基-乙基)-6-氧基-1，7-二氮雜螺[4，4]壬-1-羧酸叔丁基酯(8)溶解于140ml H2O和140ml di MeOH中。向溶液中加入7.48g(0.054mol)K2CO3，在室溫下攪拌混合物過(guò)夜。然后用2N HCl將其酸化至pH 5，在減壓下蒸發(fā)。獲得的殘余物溶解于H2O中，pH被降低至2-3，用CH2Cl2進(jìn)行萃取。用無(wú)水Na2SO4對(duì)有機(jī)相脫水，在減壓下使其至干，獲得6.5g玻璃狀固體(收率81％)。
TLCCHCl38/MeOH2/AcOH 0.1；RF0.54。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ1.30-1.60(2s，9H)，1.80-2.20(m，4H)，2.20-2.40(m，2H)，2.40-2.60(m，2H)，3.30-3.70(m，4H)，3.85(d，1H)，3.20-4.20(sa，1H)，4.50(d，1H)。
中間體(5R)-7-(羧甲基)-6-氧代-7-氮雜-1-氮-螺[4，4]壬烷-三氟乙酸鹽(10)的制備將6g(0.02mol)[(5R)-1-(叔丁氧羰基)-6-氧代-1，7-二氮雜螺[4，4]壬-7-基]-乙酸(9)溶解于100ml CH2Cl2和100ml三氟乙酸中。在室溫下對(duì)溶液攪拌1小時(shí)，之后在減壓下使其干燥，向殘余物中加入水，再在減壓下蒸發(fā)，以除去任何痕量的三氟乙酸。用油泵干燥獲得的油，產(chǎn)生6.2g油狀產(chǎn)物(收率100％)。
TLCCHCl360/MeOH 40/H2O 15/iPrOH 10/AcOH 15；RF0.33。
1HNMR(300MHz，DMSOd6)δ2.10(m，4H)，2.30(m，2H)，3.35(m，2H)，3.50(m，2H)，4.05(2d，2H)，9.25(sa，1H)，9.35(sa，1H)。
{(5R)-1-[(9H-芴基-9-基-甲氧基)-羰基]-6-氧-1，7-二氮雜螺[4，4]壬-7-基}-乙酸ST2364(11)的制備將6.2g(0.02mol)(5R)-7-(羧甲基)-6-氧-7-氮雜-1-氮-螺[4，4]壬烷-三氟乙酸鹽(10)和4g(0.047mol)NaHCO3溶解于200ml H2O中。然后向溶液中加入溶解于300ml丙酮中的7.0g(0.021mol)Fmoc-N-OSu，在室溫下將溶液攪拌20小時(shí)。向反應(yīng)混合物中加入H2O，然后用Et2O洗三次。用HCl 2N令水相至pH2-3，用CHCl3進(jìn)行萃取。用無(wú)水Na2SO4對(duì)有機(jī)相脫水，在減壓下使其蒸發(fā)。用CHCl3使獲得的瀝青狀固體結(jié)晶，產(chǎn)生了6.1g白色固體(收率73％)。
TLCCHCl38/MeOH 2/AcOH 0.1；RF0.55。
MP144°-146℃。
D-12.6；濃度0.5％MeOH溶液。
HPLC柱μBondapack C18 3.9×150mm；流動(dòng)相KH2PO450mM./CH3CN 75/25；流速1.0ml/min.室溫；R.T.10.9min。
1HNMR(300MHz，DMSOd6)δ1.50(m，1H)，1.60-2.00(m，4H)，2.40(q，1H)，2.60，3.02(2m，1H)，3.30(m，2H)，3.40(m，2H)，3.70，4.10(2d，2H)，4.15，4.20(2m，1H)，4.35，4.75(2dd，1H)，7.25-7.45(m，4H)，7.55-7.70(m，2H)，7.83(d，2H)12.70(sa，1H)。
按照流程1來(lái)合成可用于合成含β-轉(zhuǎn)角模擬物Beta1的擬肽化合物的合成塊ST2201，這通過(guò)使用與用于合成ST 2364相同的方法(實(shí)施例1)，從作為起始物的D-脯氨酸(而不是L-脯氨酸)開(kāi)始。對(duì)ST2201的分析數(shù)據(jù)被描述于下文的實(shí)施例2中。
實(shí)施例2{(5S)-1-[(9H-芴基-9-基-甲氧基)-羰基]-6-氧代-1，7-二氮雜螺[4，4]壬-7-基}-乙酸ST2201的制備TLCCHCl38/MeOH 2；RF0.33。
MP138°-141℃。
D+15.1；濃度0.5％MeOH溶液。
HPLC柱μBondapack C18 3.9×150mm；流動(dòng)相KH2PO450mM/CH3CN 65/35；流速1.0ml/min.室溫；R.T.8.2min.
1HNMR(300MHz，DMSOd6)δ1.50(m，1H)，1.60-2.00(m，4H)，2.40 q，1H)，2.60，3.02(2m，1H)，3.30(m，2H)，3.40(m，2H)，3.70，4.10(2d，2H)，4.15，4.20(2m，1H)，4.35，4.75(2dd，1H)，7.25-7.45(m，4H)，7.55-7.70(m，2H)，7.83(d，2H)12.70(sa，1H)。
按照流程2合成合成塊ST2451(22)，其可用于合成含有β-轉(zhuǎn)角模擬物Beta3的擬肽化合物，其中使用R.L.Johnson及其同事(Genin，M.J.；et al.；J.Med.Chem.；1999，42，628-637)描述的方法至中間體16，再使用下文實(shí)施例3描述的方法來(lái)進(jìn)行。
流程2ST2451的合成
試劑(a)t-Bu-CHO，cat.CF3COOH，(b)1.LDA，2.CH2＝CH-CH2-CH2-Br，(c)Silica gel，MeOH/H2O，(d)(Boc)2O.
(CH3)NOH.5H2O(e)Gly-OMe.HCl，DCC，HOBt，NEt3(f)OsO4，NalO4，MeOH/H2O(g)NaBH3CN，(h)K2CO3(i)TFA，(l)1.NaHCO3，2.Fmoc-OSu，3.HCl實(shí)施例3{(5S)-1-[(9H-芴基-9-基-甲氧基)-羰基]-6-氧代-1，7-二氮雜螺[4，5]癸-7-基}-乙酸ST2451(22)的制備中間體2-丁-3-烯-1-基-1-(叔丁氧羰基)-L-脯氨酰甘氨酸甲酯(17)的制備將8.0g(0.297mol)2-丁-3-烯-1-基-1-(叔丁氧羰基)-L-脯氨酸(16)、3.7g(0.0297mol)鹽酸甘氨酸甲酯和4.0g(0.0297mol)羥基苯并三唑溶解于100ml無(wú)水CHCl3中。向溶液中加入4.1ml(0.0297mol)TEA，然后加入溶解于100ml pf無(wú)水CHCl3中的6.1g(0.0297mol)DCC。在N2氣氛下，室溫下攪拌反應(yīng)混合物過(guò)夜。過(guò)濾形成的二環(huán)己脲(DCU)，將濾液在減壓下處理至干。用Et2O振蕩由此獲得的殘余物，對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾以除去任何DCU，用NaHCO31M、鹽水以及10％檸檬酸洗液相，然后再用鹽水洗。用無(wú)水Na2SO4對(duì)有機(jī)相脫水，在減壓下使其至干，獲得13g黃色的油，使用硅膠層析柱對(duì)其進(jìn)行純化，用正己烷/AcOEt 2∶1洗脫。純化產(chǎn)生了9.4g的白色固體(收率93％)。
TLC己烷2/AcOEt 1；RF0.27。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ1.54，1.60(2s，9H)，1.75(m，3H)，2.10(m，4H)，2.75(m，1H)，3.35(m，1H)，3.58(m，1H)，3.75(s，3H)，4.05(m，2H)，5.00(m，2H)，5.82(m，1H)，6.50，8.32(2sa，1H)。
中間體(5S)-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-6-氧代-1，7-二氮雜螺[4，5]癸烷-1-羧酸叔丁酯(19)的制備將9.15g(0.027mol)2-丁-3-烯-1-基-1-(叔丁氧羰基)-L-脯氨酰甘氨酸甲酯(17)溶解于300ml di MeOH/H2O 2∶1中。向溶液中加入0.33g(0.0013mol)OsO4，然后在鼓入N2氣泡后攪拌10分鐘，同時(shí)將17.1g(0.08mol)NaIO4分部分加入。從黑色溶液中形成白色沉淀，在室溫下攪拌24小時(shí)。向反應(yīng)混合物中加入H2O，直到獲得溶液，用AcOEt對(duì)該溶液萃取若干次。用H2O洗收集合并的有機(jī)相，用無(wú)水Na2SO4對(duì)其進(jìn)行脫水，在減壓下至干，獲得9.2g的深色油狀(5R)-8-羥基-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-6-氧代-1，7-二氮雜螺[4，5]癸烷-1-羧酸叔丁酯(18)，其未經(jīng)進(jìn)一步純化直接進(jìn)行反應(yīng)。
TLCAcOEt；RF0.39和0.52(非對(duì)映異構(gòu)體)。
將9.0g(0.026mol)(5R)-8-羥基-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-6-氧-1，7-二氮雜螺[4.5]癸烷-1-羧酸叔丁酯(18)溶解于180ml無(wú)水THF中。向溶液中加入18ml三氟乙酸，用冰浴冷卻溶液，加入4.68g(0.074mol)的NaBH3CN。在氮?dú)夥諊?，在室溫下?duì)反應(yīng)混合物攪拌20小時(shí)，然后用K2CO3堿化。通過(guò)過(guò)濾將溶液與殘余物分開(kāi)，減壓下令濾液至干。將獲得的無(wú)定形物質(zhì)溶解于H2O中，用CH2Cl2萃取若干次。用無(wú)水Na2SO4對(duì)有機(jī)相脫水，在減壓下使其至干。獲得9g黑色的油，使用硅膠柱層析對(duì)其進(jìn)行純化，用AcOEt/正己烷3∶1洗脫。獲得了4.5g的淺色油(收率53％)。
TLCAcOEt；RF0.5。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ1.40，1.60(2s，9H)，1.60-2.15(m，6H)，2.15-3.80(m，2H)，3.30(m，1H)，3.30-3.80(m，4H)，3.75，3.76(2s，3H)，4.70，4.78(2d，1H)。
中間體[(5S)-1-(叔丁氧羰基)-6-氧-1，7-二氮雜螺[4.5]癸-7-基]-乙酸(20)的制備將4g(0.012mol)(5S)-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-6-氧代-1，7-二氮雜螺[4.5]癸烷-1-羧酸叔丁酯(19)溶解于60ml MeOH和60mlH2O中；然后加入3.32g(0.024mol)的K2CO3。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌20小時(shí)，然后用HCl 2N令其pH為5，在減壓下令其至干。將獲得的殘余物溶解于H2O中，令其至pH 2-3，并用CH2Cl2萃取若干次。在無(wú)水Na2SO4上對(duì)有機(jī)相脫水，在減壓下使其至干，獲得3.2g白色固體(收率86％)。
TLCCHCl38/MeOH 2/CH3COOH 0.1；RF0.59。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ1.43(s，9H)，1.60-2.15(m，6H)，2.15-2.50(m，2H)，3.25(m，1H)，3.30-3.80(m，4H)，4.43，4.98(2d，1H)。
中間體(5R)-7-(羧甲基)-6-氧代-7-氮雜-1-氮螺[4，5]癸烷-三氟乙酸鹽(21)的制備將3.1g(0.01mol)[(5S)-1-(叔丁氧羰基)-6-氧代-1，7-二氮雜螺[4，5]癸-7-基]-乙酸(20)溶解于60ml CH2Cl2以及60ml三氟乙酸中；在室溫下對(duì)反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)。然后在30℃在減壓下令其至干，殘留物中加入水，再次在減壓下至干，用油泵徹底干燥。由此獲得3.1g淺色的油(收率95％)。
TLCCHCl360/MeOH 40/H2O 15/isoPrOH/10/AcOH 15；RF0.4。
1H-NMR(200MHz，D2O)δ1.85-2.30(m，8H)，3.20-3.60(m，4H)，4.05(d，2H)。
{(5S)-1-[(9H-芴-9-基-甲氧基)-羰基]-6-氧代-1，7-二氮雜螺[4，5]癸-7-基}-乙酸ST2451(22)的制備將3.2g(0.01mol)(5R)-7-(羧甲基)-6-氧代-7-氮雜-1-氮螺[4.5]癸烷-三氟乙酸(21)溶解于100ml H2O中；向溶液中加入1.7g(0.02mol)NaHCO3，然后加入溶解于150ml丙酮中的3.7g(0.011mol)Fmoc-N-OSu。在室溫下對(duì)反應(yīng)混合物攪拌24小時(shí)，在減壓下蒸發(fā)丙酮，接著用H2O稀釋?zhuān)肊t2O洗。用HCl 2N令水相至pH2-3，用CHCl3進(jìn)行萃??；用無(wú)水Na2SO4對(duì)有機(jī)相脫水，在減壓下使其蒸發(fā)。用CH2Cl2和Et2O使產(chǎn)物結(jié)晶，獲得1.4g白色固體(收率32％)。
TLCCHCl38/MeOH 2/CH3COOH 0.1；RF0.62。
MP122℃。
D-26.4(MeOH中的0.5％)。
E.A.理論值C69.10；H6.03；N6.44；實(shí)測(cè)值C67.81；H5.90；N6.31。
HPLC柱Symmetry C18(5μ)3.9×150mm；流動(dòng)相KH2PO450mM pH 3/CH3CN 65/35；流速1,0ml/min.室溫；R.T.5.2min。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ1.20，1.38，1.62(3m，1H)，1.78-2.20(m，5H)，2.22-2.50(m，2H)，2.80，3.45(2m，1H)，3.25(m，1H)，3.60(dd，1H)，3.65(m，1H)，3.80，3.85(2d，1H)，4.15，5.2(2m，1H)，4.2-4.35(m，1H)4.40(m，1H)，4.60(m，1H)，7.20-7.45(m，8H)，7.58(m，2H)，7.75(d，2H)。
按照流程3合成合成塊ST2535(34)，其可用于合成含有β-轉(zhuǎn)角模擬物Beta4的擬肽化合物，其中使用R.L.Johnson及其同事(Genin，M.J.；et al.；J.Med.Chem.；1999，42，628-637)描述的方法至中間體31，再使用下文實(shí)施例4描述的方法來(lái)進(jìn)行。
流程3ST2535的合成 試劑(a)t-Bu-CHO，cat，CF3COOH，(b)1.LDA，2.CH2＝CH-CH2-Br，(c)Silica gel，MeOH/H2O(d)(Boc)2O，(CH3)NOH·5H2O(e)K2CO3，(f)OsO4，NalO4，MeC，-1/H2O(g)D-Cys-OH.HCl，NaOH，H2O/EtOH，(h)1.NEt3，DMF，2.CH3l，KHCO3，(i)K2CO3(l)TFA，(m)Fmoc-OSu，NaHCO3.
實(shí)施例4(2R，3’S，7a’R)-1-[(9H-芴-9-基-甲氧基)-羰基]-5’-氧代四氫螺-[吡咯烷-2，6’-吡咯并-[2，1-b][1，3]噻唑-3’-羧酸ST2535(34)的制備中間體(2R，3’S，7a’R)-1-(叔丁氧羰基)-5’-氧代四氫螺-[吡咯烷-
2，6’-吡咯并-[2，1-b][1，3]噻唑-3’-羧酸(32)的制備將5g(0.014mol)(2R，3’S，7a’R)-5’-氧代四氫-1H-螺-[吡咯烷-2，6’-吡咯并-[2，1-b][1，3]噻唑-1，3’-二羧酸1-叔丁酯-3’-甲酯(31)溶解于65ml H2O以及65ml MeOH中。向溶液中加入3.87g(0.028mol)K2CO3。在室溫下對(duì)懸浮液攪拌20小時(shí)，用HCl 2N令混合物pH為5，在減壓下令混合物至干。獲得的殘余物放置于H2O，pH被降低至2-3，用CHCl3進(jìn)行萃取。用水洗有機(jī)相，用無(wú)水Na2SO4干燥，在減壓下使其至干，用Et2O對(duì)玻璃狀殘余物進(jìn)行結(jié)晶，得到3g的白色固體(收率64％)。
TLCCHCl38/MeOH 2/CH3COOH 0，1；RF0.56。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ1.45(s，9H)1.75-2.45(m，5H)，2.85(dd，1H)3.50(m，4H)4.98(m，1H)，5.20，5.30(d和dd，1H)，5.00-6.00(sa，1H)。
中間體(2R，3’S，7a’R)-3’-羧基-5’-氧代四氫螺-[吡咯烷-2，6’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻唑]三氟乙酸鹽(33)的制備將3.0g(0.0087mol)(2R，3’S，7a’R)-1-(叔丁氧羰基)-5’-氧代四氫螺-[吡咯烷-2，6’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻唑-3’-羧酸(32)溶解于60ml CH2Cl2以及60ml三氟乙酸中。在室溫下對(duì)整體攪拌2小時(shí)，在30℃蒸發(fā)；用油泵干燥獲得的油，直到獲得瀝青狀物質(zhì)，用CHCl3對(duì)其進(jìn)行結(jié)晶，得到了2.4g白色固體(收率80％)。
TLCCHCl360/MeOH 40/H2O 15/isoPrOH 10/AcOH 15；RF0.57。
1H-NMR(200MHz，D2O)δ1.95-2.40(m，4H)，2.45(dd，1H)，2.90(dd，1H)，3.25-3.35(m，3H)3.45(dd，1H)，4.93(dd，1H)，5.22(t，1H)。
(2R，3’S，7a’R)-1-[(9H-芴基-9-基-甲氧基)-羰基]-5’-氧代四氫螺-[吡咯烷-2，6’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻唑-3’-羧酸ST2535(34)的制備將2.3g(0.0064mol)(2R，3’S ，7a’R)-羧基-5’-氧代四氫螺-[吡咯烷-2，6’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻唑]三氟乙酸鹽(33)溶解于100mlH2O中；向溶液中加入1.1g(0.013mol)NaHCO3，然后加入溶解于150ml丙酮中的4.4g(0.013mol)Fmoc-N-OSu。在室溫下對(duì)整體進(jìn)行20小時(shí)的攪拌，在減壓下蒸發(fā)丙酮。加入更多的水，用Et2O洗水相，再使pH至2-3，用CHCl3進(jìn)行萃取。分離出有機(jī)相，用無(wú)水Na2SO4脫水，在減壓下至干。用乙酸乙酯對(duì)由此獲得的玻璃狀固體進(jìn)行結(jié)晶，獲得2.3g可過(guò)濾白色固體(收率80％)。
TLCCHCl38/MeOH 2/CH3COOH 0.1；RF0.67。
MP110℃.分解。
E.A.理論值+8.4％H2O＝C59.21；H5.71；N5.52 S6.32；實(shí)測(cè)值＝C57.11；H4.87；N5.21S5.43。
D+121.9。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ1.60-2.20(m，4H)，2.30(m，1H)，2.80(m，1H)，3.30，3.35-3.60(3m，4H)，4.05，4.20(2m，1H)，4.40(m，2H)，4.60，4.98(2m，1H)，5.05，5.15(2m，1H)，6.00-7.20(s a，1H)，7.20-7.45(m，8H)，7.58(m，2H)，7.75(d，2H)。
HPLC柱Symmetry C18(5μ)3.9×150mm；流動(dòng)相KH2PO450mM/CH3CN 65/35；流速1.0ml/min.室溫；R.T.12.1min。
按照流程4合成合成塊ST2304(40)，其可用于合成含有β-轉(zhuǎn)角模擬物Beta6的擬肽化合物，其中使用M.R.Pena和J.K.Stille(J.Am.Chem.Soc；1989，111，5417-5424)描述的方法至中間體37，再使用下文實(shí)施例5描述的方法來(lái)進(jìn)行。
流程4ST2304的合成 試劑(a)DMSO-120℃，5h，(b)TBDPSCl，lm，DMF，(c)NaH，BCH2COO-tBu，(d)TFA.
實(shí)施例5(2R，11a S)-2-{[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]-氧基}-5，11-二氧代-2，3，11，11a-四氫-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮雜-10(5H)-基)-乙酸ST2304(40)的制備中間體(2R，11a S)-2-{[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]-氧基}-2，3-二氫-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮雜-5，11(10H，11a H)-二酮(38)的制備將2.3g(0.01mol)(2R，11aS)-2-羥基2，3-二氫-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮雜-5，11(10H，11aH)-二酮(37)溶解于30mlDMF中；加入3.4g(0.05mol)咪唑，在攪拌下向該溶液中逐滴加入5.6ml(0.022mol)叔丁基-二苯基-甲硅烷基氯。在室溫下攪拌該溶液3.5小時(shí)，然后加入100ml H2O，用100ml CH2Cl2進(jìn)行萃取，用H2O洗有機(jī)相。用無(wú)水Na2SO4對(duì)有機(jī)相脫水，在減壓下使其至干，還是用機(jī)械泵，獲得濃稠的油，其被熱溶解于正己烷/AcOEt中，重復(fù)沉淀若干次。用機(jī)械泵干燥之后，獲得3.9g無(wú)定形固體(收率83％)。
TLC正己烷1/AcOEt1；RF0.5。
E.A.理論值C71.45；H6.42；N5.95；實(shí)測(cè)值C70.47；H6.67；N5.53。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ1.03(s，9H)，2.20(m，1H)，2.78(m，1H)，3.55，3.60(2d，1H)，3.85，3.90(2d，1H)，4.25(m，1H)，4.55(m，1H)，7.00(d，1H)，7.25-7.55(m，8H)，7.60-7.80(m，4H)，8.02(d，1H)，8.65(s，1H)。
中間體(2R，11a S)-2-{[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]-氧基}-5，11-二氧代-2，3，11，11a-四氫-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮雜-10(5H)-基)-乙酸叔丁基酯(39)的制備用THF洗若干次后，將330mg(0.008mol)的60％NaH懸浮于6ml無(wú)水THF中。將懸浮液冷卻至-40℃，逐滴加入溶解于18ml THF中的3.45g(0.0073mol)(2R，11a S)-2-{[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]-氧基}-2，3-二氫-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮雜-5，11(10H，11aH)-二酮(38)，保持溶液處于攪拌下。45分鐘后，還逐滴加入1.2ml(0.008mol)的溴乙酸叔丁基酯，讓混合物在攪拌下反應(yīng)2小時(shí)，令溫度升高至室溫。然后將懸浮液傾倒入50ml H2O，用30ml CH2Cl2萃取兩次，用H2O和鹽對(duì)收集匯合的有機(jī)相洗若干次，用無(wú)水Na2SO4脫水。在減壓下令溶液至干，獲得油，用石油醚洗以及用機(jī)械泵干燥之后，得到3.6g的無(wú)定形固體(收率84％)。
TLC正己烷7/AcOE t3；R.F.0.5。
E.A.理論值C69.83；H6.89；N4.79；實(shí)測(cè)值C68.87；H7.37；N4.01.
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ1.03(s，9H)，1.45(s，9H)，2.15(m，1H)，2.80(m，1H)， 3.55，3.60(2d，1H)，3.75，3.82(2d，1H)，4.30(m，1H)，4.05-4.60(dd，2H)，4.62(m，1H)，7.20(d，1H)，7.30-7.60(m，8H)，7.60-7.80(m，4H)，8.00(d，1H)。
(2R，11a S)-2-{[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]-氧}-5，11-二氧-2，3，11，11a-四氫-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯-二氮雜-10(5H)-基)-乙酸ST2304(40)的制備將3.6g(0.0061mo1)(2R，11aS)-2-{[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]-氧基}-5，11-二氧代-2，3，11，11a-四氫-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮雜-10(5H)-基)-乙酸叔丁基酯(39)懸浮于30ml CH2Cl2中，15℃時(shí)攪拌下逐滴加入25ml三氟乙酸。令溫度升高至室溫，然后攪拌溶液45分鐘。在用機(jī)械泵減壓下令反應(yīng)溶液至干；將殘余物溶解于乙醚中，通過(guò)冷卻沉淀，形成2.6g的白色固體(收率81％)。
TLCCHCl38/MeOH2/CH3COOH0.1；RF0.51。
M.P.191-193℃。
E.A.理論值+0.6％H2O(TG)C67.74；H6.13；N5.26；實(shí)測(cè)值C67.12；H6.09；N5.28。
20D+246.2；濃度1％CHCl3。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ1.03(s，9H)，2.05(m，1H)，2.75(m，1H)，3.50，3.55(2d，1H)，3.75，3.78(2d，1H)，4.25(m，1H)，4.20-4.57(dd，2H)，4.60(m，1H)，7.10(d，1H)，7.20-7.50(m，8H)，7.60(m，4H)，7.90(d，1H)。
HPLC柱Inertsil ODS 3(5μ)4.6×250mm；流動(dòng)相CH3CN/KH2PO450mM 70/30；pH 3(H2PO485％)；流速1.0ml/min，t＝30℃；R.T.10.79min。
按照流程5合成合成塊ST2393(45)，其可用于合成含有β-轉(zhuǎn)角模擬物Beta5的擬肽化合物，其中使用M.R.Pena和J.K.Stille(J.Am.Chem.Soc；1989，111，5417-5424)描述的方法，使用靛紅酸酐(41)和L-脯氨酸(42)作為起始產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行。在下文實(shí)施例6中對(duì)合成進(jìn)行了描述。
流程5
ST2393的合成 試劑(a)DMSO-120℃，5h，(b)NaH，BrCH2COO-tBu，(d)TFA，實(shí)施例6[(11a S)-5，11-二氧-2，3，11，11a-四氫-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮雜-10(5H)-基)-乙酸ST2393(45)的制備中間體(11a S)-2，3-二氫-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮雜-5，11(10H，11aH)-二酮(43)的制備在N2氣氛下，將2.67g(0.0164mol)靛紅酸酐(41)溶解于20ml無(wú)水DMSO中，在攪拌下加入1.72g L-脯氨酸(0.0149mol)(42)。然后在攪拌下將溶液加熱至120℃，持續(xù)2.5小時(shí)，然后冷卻，攪拌下傾倒進(jìn)130ml冷水中。對(duì)水溶液形成的沉淀進(jìn)行過(guò)濾，再用冷水洗，真空烘干3小時(shí)。獲得了2.6g(收率80％)。
TLCAcOEt；RF0.5。
20D+528(0.5％CH3OH)。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ2.05(m，3H)，2.80(m，1H)，3.65(m，1H)3.82(m，1H)4.12(d，1H)，7.00(d，1H)，7.30(t，1H)，7.52(t，1H)，8.03(d，1H)，8.25(sa，1H)。
中間體[(11a S)-5，11-二氧代-2，3，11，11a-四氫-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮雜-10(5H)-基)-乙酸叔丁基酯(44)的制備用THF洗若干次后，將518mg(0.0127mol)的60％NaH懸浮于5ml無(wú)水THF中。將懸浮液冷卻至-40℃，逐滴加入溶解于25ml無(wú)水THF中的2.5g(0.0115mol)(11a S)-2，3-二氫-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮雜-5，11(10H，11aH)-二酮(43)，保持溶液處于攪拌下。45分鐘后，逐滴加入1.87ml(0.0127mol)的溴乙酸叔丁基酯，讓混合物在攪拌下反應(yīng)2小時(shí)，令溫度升高至室溫。然后將懸浮液傾倒入150ml H2O，用100ml CH2Cl2萃取兩次，用H2O和鹽對(duì)收集匯合的有機(jī)相洗若干次，用無(wú)水Na2SO4脫水。在減壓下令溶液至干，獲得油，用石油醚洗以及用機(jī)械泵干燥之后，得到3.7g的無(wú)定形固體(收率97％)。
TLC正己烷1/AcOEt1；RF0.4。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ1.50(s，9H)，2.05(m，3H)，2.68(m，1H)，3.60(m，1H)， 3.83(m，1H)， 4.15(m，1H)， 4.15(d，1H)，4.59(d，1H)，7.18-7.40(m，2H)，7.55(dt，1H)，7.97(dd，1H)。
[1，4]苯并二氮雜-10(5H)-基)-乙酸ST2393(45)的制備將3.5g(0.01mol)[(11a S)-5，11-二氧代-2，3，11，11a-四氫-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮雜-10(5H)-基)-乙酸叔丁基酯(44)溶于30ml CH2Cl2中，10℃時(shí)攪拌下逐滴加入25ml三氟乙酸。令溫度升高至室溫，然后攪拌溶液1.5小時(shí)。在用機(jī)械泵減壓下令反應(yīng)溶液至干；用乙醚處理殘余物，其由此固化，在真空烘干2小時(shí)后得到2.65g的白色固體(收率96％)。
TLCCHCl360/MeOH 40/H2O 15/IprOH 10/CH3COOH15；RF0.8。
M.P.267-269℃。
E.A.理論值+1.9％H2O(TG)C60.14；H5.26；N10.02；實(shí)測(cè)值C60.31；H5.36；N9.70。
20D+408(0.7％CHCl3)。
1H-NMR(300MHz，MeOD)δ2.07(m，3H)，2.61(m，1H)3.55(m，1H)，3.77(m，1H)，4.25(m，IH)，4.48(d，1H)，4.60(d，1H)，7.38(m，2H)，7.60(m，1H)，7.83(m，1H)。
HPLC柱Symmetry C18(3.5μ)；流動(dòng)相KH2PO450mM/CH3CN；梯度從100％至30％KH2PO450Mm；流速1.0mL/min.，室溫；R.T.10.85min按照流程6合成合成塊ST2590(52)，其可用于合成含有β-轉(zhuǎn)角模擬物Beta7的擬肽化合物，這從商業(yè)產(chǎn)品(46)和(47)開(kāi)始。在下文實(shí)施例7中對(duì)合成進(jìn)行了描述。
流程6ST2590的合成 試劑(a)TFA，CH2Cl2，(b)Nl-Raney，(c)HCl，Toluene/Riflusso，(d)1.NaH，2.BrCH2COOC(CH3)3，(θ)TFA.
實(shí)施例7 [1，2，5]苯并噻二氮雜-10(1H)-基)-乙酸ST2590(52)的制備中間體1-[(2-硝基苯基)磺?；鵠-L-脯氨酸甲酯(48)的制備將5.0g(30mmol)L-脯氨酸甲酯(47)懸浮于30ml CH2Cl2中，在攪拌下加入8.5ml(60mmol)三乙胺。在N2下，5℃時(shí)，將30ml di CH2Cl2中的6.75g(30mmol)2-硝基-苯磺酰氯(46)逐滴加入，N2氣氛下，令混合物在攪拌下反應(yīng)1.5小時(shí)。用冷水對(duì)反應(yīng)溶液洗兩次，分離有機(jī)相，在無(wú)水Na2SO4上脫水，令其在真空下至干，獲得油狀粗產(chǎn)物，用正己烷/乙酸乙酯6∶4作為洗脫劑在硅膠上進(jìn)行層析之后，得到3.5g的產(chǎn)物(收率37％)。
TLC正己烷1/AcOEt1；R.F.0.56。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ1.90-2.20(m，3H)，2.20-2.45(m，1H)，3.45-3.85(m，1H)，3.70(s，3H)，4.65(dd，1H)，7.70(m，3H)，8.17(m，1H)。
中間體1-[(2-氨基苯基)-磺酰基]-L-脯氨酸甲酯(49)的制備將3.95g(12.5mmol)1-[(2-硝基苯基)磺?；鵠-L-脯氨酸甲酯(48)溶解于55ml甲醇中，在甲醇中活化之后以50％水分散液加入過(guò)量的Ni-Raney，對(duì)溶液攪拌2.5小時(shí)。加入更多的活化的Ni-Raney，然后再對(duì)溶液進(jìn)行45分鐘的攪拌，用硅藻土過(guò)濾，用乙酸乙酯和甲醇的混合物洗，不使Ni-Raney殘余物干。在無(wú)水Na2SO4上對(duì)甲醇過(guò)濾溶液進(jìn)行脫水，令其在真空下至干，得到3.1g足夠純凈的產(chǎn)物(收率87％)。
TLC正己烷1/AcOEt 1；R.F.0.45。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ1.80-2.35(m，4H)，3.40(t，2H)，4.55(dd，1H)，5.05-5.40(sa，1H)，6.74(t，2H)，7.30(t，1H)，7.72(d，1H)。
中間體[(11a S)-2，3，11，11a-四氫吡咯并[1，2-b][1，2，5]苯并噻二氮雜-11(10H)-基)-酮5，5-二氧化物(50)的制備將3.1g(10.9mmol)1-[(2-氨基苯基)-磺?；鵠-L-脯氨酸甲酯(49)與50mg對(duì)甲苯磺酸(0.268mmol)一起溶解于250ml甲苯中，在回流溫度下加熱三天，通過(guò)Dean-Stark脫水器除去水。然后用NaHCO3的飽和溶液以及用水在中性pH下對(duì)溶液洗兩次，用無(wú)水Na2SO4脫水，過(guò)濾，在減壓下至干。用己烷和乙酸乙酯對(duì)褐色粗制固體結(jié)晶，獲得1-1g產(chǎn)物。使用正己烷/AcOEt 55∶45作為洗脫劑， 通過(guò) 快速色譜來(lái)處理在減壓下至干的母液，由此獲得另外的550mg。由此獲得總共1.65g產(chǎn)物(收率60％)。
TLC正己烷/AcOEt 1；R.F.0.25。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ1.75-2.15(m，2H)，2.15-2.38(m，1H)，2.38-2.63(m，1H)，3.05(q，1H)，3.55(q，1H)，4.65(t，1H)，7.00-7.40(m，2H)，7.55(t，1H)，7.95(d，1H)，8.80(sa，1H)。
中間體[(11aS)-5，5-二氧化-11-氧代-2，3，11，11a-四氫吡咯并[1，2-b][1，2，5]苯并噻二氮雜-11(10H)-基)-乙酸叔丁基酯(51)的制備在氮?dú)鈿饬飨拢?40℃的15ml無(wú)水THF中的200mg NaH(0.0087mol)中加入25ml無(wú)水THF中的2.0g[(11aS)-2，3，11，11a-四氫吡咯并[1，2-b][1，2，5]苯并噻二氮雜-11(10H)-基)-酮5，5-二氧化物(50)。-40℃下45分鐘后，加入1.17ml(0.0087mol) 溴乙酸叔丁基酯，令溫度升高至20℃(室溫)，對(duì)溶液攪拌2小時(shí)。用冷水稀釋溶液，收集匯合用水和鹽洗過(guò)的有機(jī)相。用無(wú)水Na2SO4對(duì)有機(jī)溶液脫水，過(guò)濾，在減壓下令其至干。然后用己烷和乙酸乙酯對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)晶，獲得1.76g的產(chǎn)物(收率61％)。
TLC正己烷/AcOEt 1∶1；R.F.0.55。
1H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ2.52 和2.58(2s，9H)，2.80-2.22(m，3H)，2.45(m，1H)，3.45(m，2H)，3.88(t，1H)，4.05(d，1H)，4.70(d，1H)，7.45 (t，2H)，7.68(t，1H)，8.03(d，1H)。
[1，2，5]苯并噻二氮雜-10(1H)-基)-乙酸ST2590(52)的制備向0℃的20ml CH2Cl2中的1.75g(0.00478mol)[(11aS)-5，5-二氧化-11-氧代-2，3，11，11a-四氫吡咯并[1，2-b][1，2，5]苯并噻二氮雜-11(10H)-基)-乙酸叔丁基酯(51)溶液中逐滴加入13mlTFA，在室溫下對(duì)溶液攪拌2小時(shí)。
TLC 監(jiān)控(硅膠，CHCl39/MeOH)之后，蒸發(fā)溶液，殘余物加入CH2Cl2中，用Na2CO3的飽和溶液處理有機(jī)相，其被分離出來(lái)。
然后用乙酸乙酯洗兩次，用濃縮的HCl溶液處理。從溶液中沉淀出產(chǎn)物，用CH2Cl2對(duì)其進(jìn)行萃取，用無(wú)水Na2SO4脫水，令其在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上至干，得到1-1g 98％純的終產(chǎn)物(收率74％)。
M.P.149-152℃. D20+210.1；濃度0.47％Me-OH.
HPLC柱Symmetry C18(3.5μ)4.6×150mm；流動(dòng)相KH2PO450mM pH3/CH3CN 80/20；流速1.0ml/min；室溫；R.T.10.51min。
1H-NMR(300 MHz，CDCl3)δ1.8-2.2(3H，m，CH2CH2)；2.4-2.6(1H，m，CH2CH2)；3.4-3.6(2H，m，CH2N)；3.8-3.9(1H，m，CHN)；4.25和4.75(2H，2d，CH2COOH)；5.6-6.6(1H，bs，COOH)；7.45(2H，t，Ar)；7.7(1H，t，Ar)；8.0(1H，d，Ar)。
E.A.(C14H14N2O4)理論值C50.31；H4.54；N9.02；S10.33；實(shí)測(cè)值C50.03 H4.45；N8.78；S10.13。
按照下面的流程7合成合成塊ST2610(64)，其可用于合成含有β-轉(zhuǎn)角模擬物Beta8的擬肽化合物，其中使用Ehab M.Khalil及其同事，J.Med.Chem.；1999，42，628-637描述的方法進(jìn)行至中間體61，再使用下文實(shí)施例8描述的方法來(lái)進(jìn)行。
流程7ST2610的合成 試劑(a)t-Bu-CHO，cat，CF3COOH，(b)1.LDA，2.CH2＝CH-CH，-Br，(c)Silica gel，MeOH/H2O，(d)(Boc)2O，(e)K2CO3，(f)O8O4，NalO4，MeOH/H2O，(g)D-Homocys-OH，HCl，NaOH，H2O/EtOH，(h)1.NEt3，DMF，2.CH3l，KHCO3，(i)1.K2CO3，(l)TFA，(m)Fmoc-OSu，NaHCO3實(shí)施例8(2R，4’R，8a’R)-1-[(9H-芴-9-基-甲氧基)羰基]-6’-氧代四氫-2’H-螺[吡咯烷-2，7’-吡咯并[2，1-b][[1，3]噻嗪]-4’-羧酸ST2610(64)的制備中間體(2R，4’R，8a’R)-1-(叔丁氧-羰基]-6’-氧代四氧-2’H-螺[吡咯烷-2，7’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻嗪]-4’-羧酸ST2610(62)的制備將2.55g(0.0069mol)(2R，4’R，8a’R)-6’-氧代四氫-1H，2’H-螺[吡咯烷-2，7’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻嗪]-1，4’-二羧酸1-叔丁基4’-甲酯(61)溶解于45ml MeOH和45ml H2O中；向溶液中加入1.9g(0.0138mol)K2CO3。攪拌下將溶液在室溫下保持20小時(shí)，然后通過(guò)將pH降至5以及在減壓下使其至干來(lái)對(duì)進(jìn)行處理。將獲得的殘余物加入H2O中，令其至pH 2-3，用CHCl3萃取。在無(wú)水Na2SO4上對(duì)有機(jī)相脫水，接著蒸發(fā)至干。用乙酸乙酯對(duì)瀝青狀物質(zhì)進(jìn)行結(jié)晶，獲得2.4g可過(guò)濾白色固體(收率97％)。
TLCCHCl38/MeOH 2/CH3COOH 0.1；RF0.65；1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ1.40，1.45(2d，9H)，2.70-2.05(m，4H)，2.00-2.30(m，1H)，2.25-2.55(m，1H)，2.55-2.80(m，1H)，2.75-3.15(m，1H)，3.50(m，2H)，3.70(t，2H)，4.98(dd，1H)，5.10(d，1H)。
中間體(2R，4’R，8a’R)-4’-羧基-6’-氧代四氫-2’H-螺[吡咯烷-2，7’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻嗪]三氟乙酸酯(63)的制備將2.1g(0.0058mol)(2R，4’R，8a’R)-1-(叔丁氧羰基]-6’-氧代四氫-2’H-螺[吡咯烷-2，7’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻嗪]-4’-羧酸ST2610(62)溶解于45ml三氟乙酸中。在室溫下對(duì)混合物攪拌3小時(shí)，在30℃減壓下蒸發(fā)至干。獲得的殘余物溶解于少量CHCl3中，用二乙醚沉淀，迅速過(guò)濾形成的固體。該操作進(jìn)行兩次，獲得1.55g非常吸濕的白色固體(收率；74％)。
TLC(CHCl360/MeOH 40/H2O 15/IsoPrOH 10/AcOH 15)；RF0.68。
1H-NMR(300MHz，D2O)δ1.75-2.00(m，1H)，2.00-2.38(m，5H)，2.45(dd，1H)，2.70(dt，1H)，2.77-3.05(m，2H)，3.25-3.55(m，2H)，3.96(d，1H)，5.18(d，1H)。
(2R，4’R，8a’R)-1-[(9H-芴-9-基-甲氧基)羰基]-6’-氧代四氫-2’H-螺[吡咯烷-2，7’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻嗪]-4’-羧酸ST2610(64)的制備將1.48g(0.004mol)(2R，4’R，8a’R)-4’-羧基-6’-氧代四氫-2’H-螺[吡咯烷-2，7’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻嗪]三氟乙酸酯(63)溶解于50ml H2O中。向溶液中加入0.67g(0.008mol)NaHCO3，再加入溶解于75ml丙酮中的1.42g(0.0042mol)Fmoc-N-OSu。在室溫下攪拌反應(yīng)溶液20小時(shí)，然后在減壓下除去丙酮，加入H2O，用Et2O洗溶液。用HCl 2N使水溶液pH為3，用CHCl3進(jìn)行萃取。在無(wú)水Na2SO4上干燥有機(jī)相，進(jìn)行蒸發(fā)，獲得1.9g玻璃狀白色固體(收率98％)。
M.P.108°-115℃。
D20+70.1。
E.A.(C26H26N2O5S).
理論值，7.47％H2OC60.38；H5.90；N 5.41；S6.20；實(shí)測(cè)值，C56.77；H4.85；N5.06；S5.26。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ1.85(m，1H)，1.94(dd，1H)，2.05(m，1H)，2.15(m，1H)，2.42(m，1H)，2.67(d，1H)，2.82(m，2H)，3.00(m，1H)，3.58(dd，2H)，4.20(t，1H)。
HPLC柱Symmetry C18(5μ)3.9×150mm；流動(dòng)相KH2PO450mM/CH3CN 65/35；流速1.0ml/min；室溫；R.T.12.19min。
按照流程8合成合成塊ST2775(78)，其可用于合成含有β-轉(zhuǎn)角模擬物Beta9的擬肽化合物，其中使用Ehab M.Khalil及其同事，J.Med.Chem.；1999，42，628-637描述的方法進(jìn)行至中間體75，再使用下文實(shí)施例9描述的方法來(lái)進(jìn)行。
流程8ST2775的合成 試劑(a)t-Bu-CHO，cat.CF3COOH，(b)1.LDA，2.CH2＝CH-CH2-CH2-Br，(c)Silica gel，MeOH/H2O，(d)(Boc)2O，(e)BnBr，DBU，Benzene，(f)OsO4，NalO4，MeOH/H2O，(g)10％Pd/C，H2，Benzene，(h)Dcys-OMe.HCl，NaHCO3，H2O/EtOH，(i) NEt3，CH2Cl2，(l)K2CO3，MeOH/H2O，(m)1.TFA，CH2Cl2，(n)Fmoc-OSu，NaHCO3實(shí)施例9(2R，3’S，8a’R)-1-[(9H-芴-9-基-甲氧基)羰基]-5’-氧代四氫-7’H-螺[吡咯烷-2，6’-[1，3]-噻唑并[3，2-a]吡啶]-3’-羧酸ST2775(78)的制備中間體(2R，3’S，8a’R)-1-(叔丁氧羰基]-5’-氧代四氫-7’H-螺[吡咯烷-2，6’-[1，3]-噻唑并[3，2-a]吡啶]-3’-羧酸(76)的制備將1.5g(0.004mol)(2R，3’S，8a’S)-5’-氧代四氫-1H，7’H-螺[吡咯烷-2，6’-[1，3]-噻唑并[3，2-a]吡啶]-1，3’二羧酸1-叔丁基3’-甲酯(75)溶解于80ml MeOH和50ml H2O中；向溶液中加入1.1g(0.008mol)K2CO3，在室溫下對(duì)反應(yīng)混合物攪拌20小時(shí)。
通過(guò)用HCl將pH降至5以及在減壓下使其至干來(lái)對(duì)溶液進(jìn)行處理。將獲得的殘余物加入H2O中，令其至pH 2-3，用CHCl3萃取。在無(wú)水Na2SO4上對(duì)有機(jī)相脫水，接著蒸發(fā)至干，獲得1.4g玻璃狀白色固體(收率100％)。
TLCCHCl38/MeOH 2/CH3COOH 0.1；RF0.7。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ1.45，1.50(2s，9H)，1.60-2.18(m，6H)，2.20-2.50(m，2H)，3.20-3.80(m，4H)，4.95(dd，1H)，4.38(dd，1H)，7.35(sa，1H)。
中間體(2R，3’S，8a’R)-3-羧酸-5’-氧代-四氫-7’H-螺[吡咯烷-2，6’-[1，3]-噻唑并[3，2-a]吡啶]-三氟乙酸鹽(77)的制備將1.4g(0.004mol)(2R，3’S，8a’R)-1-(叔丁氧羰基]-5’-氧代四氫-7’H-螺[吡咯烷-2，6’-[1，3]-噻唑并[3，2-a]吡啶]-3’-羧酸(76)溶解于25ml CH2Cl2和25ml三氟乙酸中。在室溫下對(duì)混合物進(jìn)行攪拌；2小時(shí)后在30℃下蒸發(fā)。獲得的殘余物溶解于少量CHCl3中，用Et2O沉淀，迅速過(guò)濾形成的沉淀。該操作重復(fù)兩次，獲得1.07g非常吸濕的白色固體(收率；70％)。
TLCCHCl360/MeOH 40/H2O 15/IPrOH 10/AcOH 15；RF0.5。
1H-NMR(300MHz，D2O)δ1.70-2.50(m，8H)，3.15(dd，IH)，3.22-3.60(m，3H)，4.60-5.00(m，2H)。
(2R，3’S，8a’R)-1-[(9H-芴-9-基-甲氧基)羰基]-5’-氧代四氫-7’H-螺[吡咯烷-2，6’-[1，3]-噻唑并[3，2-a]吡啶]-3’-羧酸ST2775(78)的制備將1.00g(0.0027mol)(2R，3’S，8a’R)-3-羧酸-5’-氧代四氫-7’H-螺[吡咯烷-2，6’-[1，3]-噻唑并[3，2-a]吡啶]-三氟乙酸鹽(77)溶解于50ml水中。向獲得的溶液中加入0.45g(0.0054mol)NaHCO3，5分鐘后加入溶解于75ml丙酮中的0.94g(0.0028mol)Fmoc-N-OSu。向形成的懸浮液中加入更多丙酮，直到獲得溶液，在室溫下攪拌溶液。24小時(shí)后，蒸發(fā)丙酮，重新加入水，用Et2O洗。再用HCl 2N使水溶液pH為3，用CHCl3萃取水相。有機(jī)相在無(wú)水Na2SO4上脫水，在減壓下使其至干，獲得1.2g玻璃狀白色固體(收率90％)。
M.P.95°-100℃.
E.A.(C26H26N2O5S).
理論值(含3.76％H2O)C62.80；H5.69；N5.63；S6.44。
實(shí)測(cè)值C57.27；H4.89；N4.97；S5.25。
20D+108.6；濃度在MeOH中0.5％。
TLCCHCl38/MeOH 2；RF0.64。
1H-NMR(CDCl3300MHz)δ1.60-2.20(m，5H)，2.25-2.45(m，2H)，2.80，3.05(2dd，1H)，3.30-3.50(m，2H)，3.50-3.70(m，2H)，4.07，4.17-4.35(s，m，2H)，4.37-4.50(m，1H)，4.73，4.92(t，dd，1H)，5.35，5.65(2dd，1H)，5.00-6.40(sa，IH)，7.22-7.45(m，4H)，7.50-7.65(m，2H)，7.65-7.80(m，2H)。
HPLC柱Symmetry C18(5μ)3.9×150mm；流動(dòng)相KH2PO450mM/CH3CN 60/40；流速1.0ml/min.室溫；R.T.7.38min；
合成最終化合物流程9(以下流程中“ammide”為“酰胺”) R1＝AA1或AA6或AA7或AA5-AA6(beta)如果R1＝AA1，R2＝AA2或AA2-AA3-AA4(SP)如果R1＝AA5-AA6(beta)，R2＝AA4或AA2-AA3-AA4(SP)如果R1＝AA6，R2＝AA5如果R1＝AA7，R2＝AA6如果R2＝AA2，R3＝AA3如果R2＝AA6，R3＝AA5如果R2＝AA5，R3＝AA4或AA2-AA3-AA4(SP)
如果R2＝AA4，R3＝AA3如果R2＝AA2-AA3-AA4(SP)，R3＝AA1或AA5-AA6(beta)如果R3＝AA3，R4＝AA4或AA2如果R3＝AA5，R4＝AA4如果R3＝AA4，R4＝AA3如果R3＝AA2-AA3-AA4(SP)，R4＝AA1如果R4＝AA4，R5＝AA5或AA3如果R4＝AA3，R5＝AA2如果R4＝AA2，R5＝AA1如果R5＝AA5，R6＝AA6如果R5＝AA3，R6＝AA2如果R5＝AA2，R6＝AA1如果R6＝AA6，R7＝AA7如果R6＝AA2，R7＝AA1A.典型的脫保護(hù)程序。
B.用于將第一種氨基酸或β-轉(zhuǎn)角模擬物(AA5-AA6)與胺偶聯(lián)的典型程序。
C.用于將隨后的氨基酸或間隔基(AA2-AA3-AA4)或β-轉(zhuǎn)角模擬物(AA5-AA6)與羧基偶聯(lián)的典型程序。
D.用于將擬精氨酸基團(tuán)與羧基偶聯(lián)的典型程序。
E.典型的乙?；绦?。
F.典型的切割程序
G.用于形成氮雜丙氨酸的典型程序。
H.用于形成氮雜纈氨酸或氮雜亮氨酸的典型程序。
I.用于將擬精氨酸與胍基形成的典型程序。
J.對(duì)末端胺基進(jìn)行胍基化的典型程序。
所有分子都在由氨基甲基NovaGelTM構(gòu)成的聚合物支持體上合成，其具有經(jīng)修飾的Rink接頭(0.74mmol/g)，擬肽序列按照基于Fmoc化學(xué)的方案合成。反應(yīng)通常在DMF中進(jìn)行，用HOBt-TBTU作為酰化反應(yīng)中的活化劑，DIPEA作為質(zhì)子清除劑(scavenger)。當(dāng)必須要對(duì)羧基官能團(tuán)進(jìn)行更猛烈的活化時(shí)，例如，在對(duì)芳香族胺進(jìn)行?；瘯r(shí)，反應(yīng)在70℃進(jìn)行，或者通過(guò)用二氯亞砜(SOCl2)將受Fmoc保護(hù)的酰化劑的羧基官能團(tuán)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的?；萚1]來(lái)進(jìn)行。在這種情況下，反應(yīng)在70℃于四氫呋喃中進(jìn)行，其中使用DIPEA或三甲基吡啶作為質(zhì)子清除劑。
用于合成的保護(hù)天然氨基酸、溶劑和試劑購(gòu)自Chem-Impex；被取代的氨基苯甲酸(間隔基)購(gòu)自Sigma-Aldrich，按照文獻(xiàn)所述，用芴甲基氧羰基氯(Fmoc-Cl)對(duì)其進(jìn)行保護(hù)。
在Thermofinnigan LCQ-Duo質(zhì)譜系統(tǒng)上進(jìn)行對(duì)合成中間體和反應(yīng)產(chǎn)物的LC/MS和MS信息分析，其中使用H2O-乙腈梯度系統(tǒng)(溶劑B)，其具有0.1％TFA緩沖過(guò)的pH，用于運(yùn)行HPLC-RP，梯度1

在Luna(Phenomenex)C18柱；50×2mm；3μm中，流速為0.5mL/min(梯度1)或在Jupiter(Phenomenex)C18柱；250×4.6mm；5μm中，流速為1.0mL/min(梯度2)，所有都應(yīng)當(dāng)被理解為是在通過(guò)用由TFA/H2O/Tis/(95∶2.5∶2.5)(300μL)構(gòu)成的切割混合物對(duì)干燥樹(shù)脂樣品(5-10mg)進(jìn)行3小時(shí)處理獲得的材料上開(kāi)發(fā)的。
在Jupiter-Proteo(Phenomenex)C柱；250×21.2mm；10μm；90埃上，使用H2O-MeCN-TFA(97∶3∶0.1)梯度系統(tǒng)[溶劑A]和MeCN∶H2O∶TFA(80∶20∶0,1)[溶劑B]來(lái)進(jìn)行半制備性HPLC純化時(shí)間 3 20 10 10 10 5 3％B 8 30 40 60 98 98 8縮寫(xiě)AAA 氨基酸(普通指代)Ac20 乙酸酐DMF 二甲基甲酰胺DIPEA二異丙基乙胺DIPEAabs純二異丙基乙胺Fmoc 9-芴甲基氧羰基HOBt 1-羥基-1-H-苯并三唑MeCN 乙腈min 分鐘TBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-脲四氟硼酸鹽THF 四氫呋喃TFA 三氟乙酸Tis 三異丙基硅烷典型反應(yīng)程序(見(jiàn)流程9)典型程序A 從Rink酰胺MBHA樹(shù)脂的接頭的胺官能團(tuán)，或從錨定到樹(shù)脂上的擬肽序列除去Fmoc在裝備有蓋和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板(porous frit)的聚丙烯反應(yīng)器中，用亞甲基氯(15mL/g樹(shù)脂)和二甲基甲酰胺(15mL/g樹(shù)脂)進(jìn)行樹(shù)脂膨脹。然后用二甲基甲酰胺中的25％哌啶溶液(15mL/g樹(shù)脂)對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行處理，以從接頭的胺官能團(tuán)或從錨定到樹(shù)脂上的擬肽序列除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)，以及生長(zhǎng)(growing)。對(duì)混合物攪拌20分鐘。指定的時(shí)間過(guò)后，排出脫保護(hù)混合物，用二甲基甲酰胺(15mL/g樹(shù)脂，重復(fù)5次，每次5分鐘)洗樹(shù)脂。
典型程序B-在Rink酰胺MBHA上加載第一個(gè)氨基酸或β-轉(zhuǎn)角模擬物在裝備有蓋和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反應(yīng)器中，使用標(biāo)準(zhǔn)程序，用?；瘎?相對(duì)樹(shù)脂而言5當(dāng)量的)對(duì)按照A節(jié)所述獲得的樹(shù)脂接頭的游離胺官能團(tuán)進(jìn)行處理，以加載第一個(gè)氨基酸或β-轉(zhuǎn)角模擬物，以形成典型程序C所述的肽鍵。針對(duì)未反應(yīng)的胺，用Kaiser測(cè)試來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)趨勢(shì)。陽(yáng)性的Kaiser測(cè)試的情況下，將樹(shù)脂從反應(yīng)混合物排出，用二甲基甲酰胺洗(15mL/g樹(shù)脂，重復(fù)5次，每次洗5分鐘)。
典型程序C-在肽-氨基酰基-樹(shù)脂或β-轉(zhuǎn)角模擬物-樹(shù)脂上加載氨基酸或疏水間隔基在裝備有蓋和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反應(yīng)器中，使用標(biāo)準(zhǔn)程序，用?；N類(lèi)(相對(duì)樹(shù)脂而言5當(dāng)量的)對(duì)按照典型程序B所述的錨定到樹(shù)脂的Fmoc-脫保護(hù)擬肽序列進(jìn)行處理，將其溶解于溶液HOBt以及二甲基甲酰胺中的TBTU 0.5M(相對(duì)樹(shù)脂而言5當(dāng)量的)和二甲基甲酰胺中的DIPEA 1.0M(相對(duì)樹(shù)脂而言10當(dāng)量的)中。對(duì)混合物進(jìn)行攪拌，只要可以，就通過(guò)Kaiser測(cè)試對(duì)偶聯(lián)趨勢(shì)加以監(jiān)測(cè)。不超過(guò)120分鐘的時(shí)間內(nèi)，將樹(shù)脂從反應(yīng)混合物排出，用二甲基甲酰胺洗(15mL/g樹(shù)脂，重復(fù)5次，每次5分鐘)。
典型程序D-氨基酸或擬精氨酸與疏水間隔基芳香胺官能團(tuán)的偶聯(lián)在具有螺帽的玻璃反應(yīng)器中，向錨定到樹(shù)脂上的擬肽序列加入來(lái)源于Fmoc-氨基酸或擬精氨酸的酰基氯(相對(duì)樹(shù)脂而言5當(dāng)量的，用于下文描述的典型制備)以及溶解于四氫呋喃中的質(zhì)子清除劑DIPEA(或三甲基吡啶)(500μL)。在70℃對(duì)混合物攪拌2小時(shí)，陽(yáng)性的Kaiser測(cè)試的情況下，將樹(shù)脂從反應(yīng)混合物排出，用二甲基甲酰胺洗(15mL/g樹(shù)脂，重復(fù)5次，每次5分鐘)。
擬精氨酸?；鹊闹苽洹５湫统绦蛟诓ＡХ磻?yīng)器中，在磁力攪拌下，將二氯亞砜(5mL)加入到二乙醚中的擬精氨酸或受Fmoc保護(hù)的擬精氨酸(20mL中16mmol)中。將獲得的懸浮液加熱至回流條件(75-80℃)，2小時(shí)。期間混合物變得清澈。當(dāng)轉(zhuǎn)化完成(甲醇分解作用產(chǎn)物的，IPCTLC在硅膠60F254Merck板上，洗脫劑為正己烷-AcOEt 70∶30)，將反應(yīng)混合物冷卻至環(huán)境溫度，蒸發(fā)溶液。油狀殘余物與正己烷(4×50mL)共蒸發(fā)，在高真空下干燥，最終產(chǎn)生了預(yù)期的產(chǎn)物。
典型程序E-對(duì)錨定到樹(shù)脂的擬肽的N-末端胺官能團(tuán)進(jìn)行乙?；瓿蓪?duì)擬肽的合成以及按照典型程序A去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)后，在裝備有蓋和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反應(yīng)器中，用Ac2O/DIPEA/DMF[15∶45∶40](10mL/g樹(shù)脂，重復(fù)兩次，每次30分鐘)的混合物對(duì)錨定到樹(shù)脂的序列加以處理，用于對(duì)擬肽序列的N-末端氨基酸的α-胺官能團(tuán)進(jìn)行乙?；?。用Kaiser測(cè)試來(lái)監(jiān)測(cè)乙?；厔?shì)。陽(yáng)性的Kaiser測(cè)試結(jié)果的情況下，將樹(shù)脂從反應(yīng)混合物排出，用二甲基甲酰胺(15mL/g樹(shù)脂，重復(fù)5次，每次洗5分鐘)、二氯甲烷(15mL/g樹(shù)脂，重復(fù)3次，每次洗5分鐘)、二乙醚(15mL/g樹(shù)脂)洗，通過(guò)經(jīng)歷氮?dú)饬鱽?lái)干燥。
典型程序F-從Rink酰胺MBHA樹(shù)脂解離擬肽序列在裝備有蓋和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反應(yīng)器中，用二乙醚和氮?dú)饬飨催^(guò)樹(shù)脂之后，用TFA-TiS-H2O[95∶2,5∶2.5]的混合物(10mL/g樹(shù)脂)對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行處理，用于解離擬肽。對(duì)混合物攪拌2小時(shí)。指定的時(shí)間過(guò)后，從樹(shù)脂過(guò)濾出混合物，向?yàn)V液中加入二乙醚(15mL)。獲得的溶液在-20℃冷卻12小時(shí)。沉淀與溶液分離時(shí)，對(duì)混合物進(jìn)行離心，以回收固體。后者不存在時(shí)，在減壓下蒸發(fā)溶液以回收殘余物。
典型程序G-在樹(shù)脂上形成氮雜甘氨酸對(duì)該程序而言，使用的方案是Kessler在文章J.Org.Chem.；1999，64，7388-7394中描述過(guò)的，其中，在按照典型程序A中所述處理之后，使用受Fmoc保護(hù)的Rink酰胺MBHA，代替文章中描述的樹(shù)脂在裝備有蓋和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反應(yīng)器中，用無(wú)水CH2Cl2(3×1mL)去洗Fmoc脫保護(hù)的Rink酰胺MBHA樹(shù)脂或Fmoc脫保護(hù)的擬肽序列(錨定到樹(shù)脂的，按照典型程序B制備的)，加入無(wú)水CH2Cl2(1mL)中的5-(9H-芴基-9-基甲氧)-1，3，4-氧二氮雜茂-2(3H)-酮(相對(duì)樹(shù)脂而言5當(dāng)量的)溶液。反應(yīng)混合物在室溫下振蕩90分鐘，將樹(shù)脂從反應(yīng)混合物排出，用無(wú)水CH2Cl2(3×1mL)和二甲基甲酰胺(3×1mL)洗。
典型程序H-在樹(shù)脂上形成氮雜纈氨酸和氮雜亮氨酸對(duì)該程序而言，使用的方案是Kessler在文章J.Org.Chem.；1999，64，7388-7394中描述過(guò)的用于在樹(shù)脂2-(氯羰基)-1-Fmoc-2-異丙基-肼或2-(氯羰基)-1-Fmoc-2-異丁基-肼(代替2-(氯羰基)-1-Fmoc-2-甲基-肼)上形成氮雜丙氨酸的，其中，在按照典型程序A中所述處理之后，使用受Fmoc保護(hù)的Rink酰胺MBHA，代替文章中描述的樹(shù)脂在裝備有蓋和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反應(yīng)器中，用無(wú)水二甲基甲酰胺(3×1mL)去洗Fmoc脫保護(hù)的Rink酰胺MBHA樹(shù)脂或Fmoc脫保護(hù)的擬肽序列(錨定到樹(shù)脂的，按照典型程序B制備的)，加入1mL無(wú)水二甲基甲酰胺中的2-(氯羰基)-1-Fmoc-2-異丙基-肼或2-(氯羰基)-1-Fmoc-2-異丁基-肼(相對(duì)樹(shù)脂而言5當(dāng)量的)和47μL DIPEA。反應(yīng)混合物在室溫下振蕩15小時(shí)，將樹(shù)脂從反應(yīng)混合物排出，用無(wú)水二甲基甲酰胺(3×1mL)洗。
典型程序I-制備擬精氨酸AM8。在Rink酰胺MBHA樹(shù)脂上通過(guò)Fmoc-異硫氰酸鹽合成胍基(guanidylic group)在裝備有蓋和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反應(yīng)器中，將溶解于二甲基甲酰胺(4.0mL/g)中的Fmoc-異硫氰酸鹽(相對(duì)樹(shù)脂而言10當(dāng)量的)加入按照典型程序A所述處理過(guò)的Rink酰胺MBHA樹(shù)脂。對(duì)混合物攪拌12小時(shí)。這段時(shí)間過(guò)后，排出樹(shù)脂，用二甲基甲酰胺(5mL×5)去洗，用二甲基甲酰胺(10mL)中的CH3I(相對(duì)樹(shù)脂而言10當(dāng)量的)和DIPEA(相對(duì)樹(shù)脂而言30當(dāng)量的)溶液進(jìn)行處理。在室溫下對(duì)混合物攪拌2小時(shí)，然后排出，用二甲基甲酰胺(5×5mL)洗。向該材料中加入1，4-二氨基丁烷(相對(duì)樹(shù)脂而言10當(dāng)量的)在二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液。在室溫下對(duì)混合物攪拌12小時(shí)。這段時(shí)間過(guò)后，排出樹(shù)脂，用二甲基甲酰胺(5×5mL)洗。
典型程序J-對(duì)錨定到Rink酰胺MBHA樹(shù)脂的擬肽序列的末端胺官能團(tuán)進(jìn)行胍基化在裝備有蓋和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反應(yīng)器中，用二氯甲烷(15mL/g)中的1，3-二-Boc-2-(三氟甲磺?；?胍(3.0當(dāng)量)的溶液，通過(guò)對(duì)N-末端胺官能團(tuán)的胍基化，對(duì)錨定有不含F(xiàn)moc的擬肽序列的樹(shù)脂進(jìn)行處理。對(duì)混合物攪拌24小時(shí)。正的測(cè)試結(jié)果的情況下，將樹(shù)脂從反應(yīng)混合物排出，用二氯甲烷(15mL/g樹(shù)脂，重復(fù)5次，每次洗5分鐘)和二乙醚(15mL/g樹(shù)脂)洗，通過(guò)氮?dú)饬鱽?lái)干燥。
實(shí)施例10
ST2565[Ac-thr-gly-pro-leu-val-asp-arg-NH2，MW＝797.41]的制備在裝備有蓋和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反應(yīng)器中，向按照典型程序A所述處理過(guò)的Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)中加入Fmoc-(D)Arg(pbf)-OH(250μmol)，用于按照上文所述加載第一個(gè)氨基酸。對(duì)混合物攪拌45分鐘。指定的時(shí)間過(guò)后，用二甲基甲酰胺(2mL×5)洗樹(shù)脂，對(duì)其進(jìn)行處理以去除Fmoc(典型程序A)。重復(fù)所述合成循環(huán)，以加載第一個(gè)之后的氨基酸。向生長(zhǎng)中的擬肽依次加入Fmoc-(D)Asp(Ot-Bu)-OH(250μmol)、Fmoc-(D)Val-OH(250μmol)、Fmoc-(D)Leu-OH(250μmol)、Fmoc-(D)Pro-OH(250μmol)、Fmoc-Gly-OH(250μmol)和Fmoc-(D)Thr(OtBu)-OH(250μmol)。通過(guò)Kaiser測(cè)試監(jiān)控偶聯(lián)。完成序列并且按上文所述去除Fmoc之后，按上文所述，用Ac2O/DIPEA/DMF[15∶45∶40](2mL×2×30分鐘)的混合物對(duì)擬肽加以處理，用于最后一個(gè)氨基酸的α-胺官能團(tuán)進(jìn)行乙酰化。用Kaiser測(cè)試來(lái)監(jiān)控乙酰化趨勢(shì)。陽(yáng)性的測(cè)試結(jié)果的情況下，將樹(shù)脂從反應(yīng)混合物排出，用二甲基甲酰胺(2mL×5)、二氯甲烷(2mL×3)和二乙醚(2mL)洗，通過(guò)氮?dú)饬鱽?lái)干燥。
按照上文所述，通過(guò)用TFA-TiS-H2O[95∶2.5∶2.5]的混合物(1mL，2小時(shí))對(duì)肽進(jìn)行切割來(lái)處理干的樹(shù)脂。指定時(shí)間過(guò)后，過(guò)濾混合物，向?yàn)V液加入二乙醚(15mL)。作為該操作的結(jié)果，沉淀與溶液分離。將懸浮液在-20℃保持12小時(shí)，然后離心。將獲得的固體溶解于H2O/乙腈/TFA[50∶50∶0.1](5mL)中，凍干，產(chǎn)生預(yù)期的肽[13.5mg；LC(梯度1)保留時(shí)間＝5.70分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例11ST2792[PAM9-SP02-Beta2-Thr-NH2，MW＝552.11]的制備在裝備有蓋和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反應(yīng)器中，向按照典型程序A所述處理過(guò)的Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)中加入Fmoc-Thr(OtBu)-OH(250μmol)，用于按照典型程序B和C所述加載第一個(gè)氨基酸。對(duì)混合物攪拌45分鐘。該時(shí)間過(guò)后，從反應(yīng)混合物排出樹(shù)脂，用二甲基甲酰胺(2mL×5)洗，對(duì)其進(jìn)行處理以去除Fmoc(典型程序A)。
重復(fù)所述合成循環(huán)，以加載Fmoc-[Beta2]-OH(250μmol)和Fmoc-SP02-OH(250μmol)。除去Fmoc后，按照典型程序D所述，向獲得的擬肽序列中加PAM9-C1(250μmol)，其中在PAM9-C1和SP02的胺官能團(tuán)的偶聯(lián)反應(yīng)中使用DIPEA作為清除劑。在70℃對(duì)混合物攪拌2小時(shí)。正的測(cè)試結(jié)果的情況下，將樹(shù)脂從反應(yīng)混合物排出，用二甲基甲酰胺(2mL×5)、二氯甲烷(2mL×3)和二乙醚(2mL×3)洗，通過(guò)氮?dú)饬鱽?lái)干燥。最后，按照典型程序F所述，通過(guò)對(duì)肽進(jìn)行切割來(lái)處理干的樹(shù)脂。對(duì)來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物進(jìn)行HPLC-RP純化，并凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[9.1mg；LC(梯度1)保留時(shí)間＝5.55分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例12ST2864[Ac-Gly-Pro-SP30-Arg-NH2，MW＝502.61]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[19.0mg；LC(梯度2)保留時(shí)間＝17.31分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例13ST2794[PAM9-Asp-Val-Val-Beta2-NH2，MW 615.21]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[19.0mg；LC(梯度1)保留時(shí)間＝6.20分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例14ST2796[AM9-SP02-Pro-Gly-NH2，MW＝433.21]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列。完成序列以及除去Fmoc之后，通過(guò)按照典型程序J所述對(duì)β-丙氨酸的末端胺官能團(tuán)進(jìn)行胍基化，對(duì)仍在樹(shù)脂上的擬肽進(jìn)行處理。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[10.0mg；LC(梯度2)保留時(shí)間＝19.12分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例15ST2863[AM9-SP17-Pro-Gly-NH2，MW＝460.51]的制備按照實(shí)施例13所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[12.5mg；LC(梯度2)保留時(shí)間＝18.12分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例16ST2797[PAM8-SP15-Pro-Gly-NH2，MW 492.11]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[8.3mg；LC(梯度2)保留時(shí)間＝29.03分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例17ST2807[PAM9-(SP31)3-Pro-Gly-NH2，MW＝675.51]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列，重復(fù)三次典型程序C。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[4.4mg；LC(梯度2)保留時(shí)間＝22.54分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例18ST2798[PAM9-SP38-Pro-Gly-NH2，MW＝445.31]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[11.8mg；LC(梯度2)保留時(shí)間＝18.83分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例19ST2799[Ac-arg-asp-val-leu-Betal-NH2，MW 722.31]的制備按照實(shí)施例10所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[11.9mg；LC(梯度2)保留時(shí)間＝6.3分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例20ST2801[Ac-Arg-SP12-Beta2-Thr-NH2，MW＝629.31]的制備按照典型程序A、B、C和D所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列(在這種情況下，在Fmoc-Arg(pbf)-C1與間隔基12胺官能團(tuán)的偶聯(lián)反應(yīng)以及典型程序E和F中，三甲基吡啶用作為清除劑)。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[2.9mg；LC(梯度2)保留時(shí)間＝18.16分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例21ST2804[Ac-Arg-SP02-Beta2-Gly-NH2，MW601.01]的制備按照實(shí)施例21所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[2.7mg；LC(梯度2)保留時(shí)間＝18.22分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例22ST2806[AM8-SP38-Beta6-NH2，MW＝571.31]的制備在裝備有蓋和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反應(yīng)器中，按照典型程序I所述，對(duì)Rink酰胺MBHA(135mg，約100μmol)進(jìn)行處理。按照典型程序B、C和F所述，在樹(shù)脂上構(gòu)建的G8上完成對(duì)擬肽序列的合成。從對(duì)樹(shù)脂切割獲得的物質(zhì)經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的產(chǎn)物
。
實(shí)施例23ST2805[NH2-arg-SP02-Beta5，MW＝578.31]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子
。
實(shí)施例24ST2825[PAM4-SP19-Beta8-NH2，MW＝591.01]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[9.3mg；LC(梯度1)保留時(shí)間＝12.28分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例25ST2828[H-SP32-Beta3-NH2，MW＝384.11]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[33.3mg；LC(梯度1)保留時(shí)間＝7.62分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例26ST3324[PAM11-SP19-Beta8-NH2，MW＝572.71]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[9.4mg；LC(梯度1)保留時(shí)間＝17.30分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例27ST3374[PAM10-SP6-Beta8-NH2，MW＝514.991]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[1.6mg；LC(梯度1)保留時(shí)間＝10.15分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例28ST3375[PAM3-SP30-Beta8-NH2，MW＝557.071]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子
。
實(shí)施例29ST2793[PAM8-SP20-Beta3-NH2，MW＝569.21]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[3.5mg；LC(梯度1)保留時(shí)間＝10.02分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例30ST2941[PAM3-SP33-beta8-NH2，MW＝533.01]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[1.3mg；LC(梯度1)保留時(shí)間＝10.08分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例31ST2826[PAM6-SP20-Beta8-NH2，MW＝565.21]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[5.5mg；LC(梯度1)保留時(shí)間＝8.87分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例32ST2926[H-Arg-Gly-AzaVal-Val-Pro-Gly-NH2，MW＝583.71]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列，例外之處在于，按照典型程序H所述來(lái)形成氮雜纈氨酸。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[4.9mg；LC(梯度1)保留時(shí)間＝4.98分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例33ST3032[Ac-Azagly-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH2，MW＝755.81]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列，例外之處在于，按照典型程序G所述來(lái)形成氮雜甘氨酸。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[10.0mg；LC(梯度1)保留時(shí)間＝8.25分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例34ST2927[Ac-Arg-Asp-Azagly-Val-Pro-Gly-NH2，MW＝641.71]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列，例外之處在于，按照典型程序G所述來(lái)形成氮雜甘氨酸。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[18.2mg；LC(梯度1)保留時(shí)間＝5.17分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例35ST2930[Ac-thr-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH2，MW＝798.91]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列，例外之處在于，按照典型程序G所述來(lái)形成氮雜甘氨酸。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[19.1mg；LC(梯度1)保留時(shí)間＝6.20分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例36ST2920[Ac-Arg-Asp-Val-AzaVal-Pro-Gly-NH2，MW＝681.81]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列，例外之處在于，按照典型程序H所述來(lái)形成氮雜甘氨酸。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[11.7mg；LC(梯度1)保留時(shí)間＝5.88分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
實(shí)施例37ST2928[Ac-Arg-Asp-AzaLeu-Val-Pro-Gly-NH2，MW＝697.81]的制備按照實(shí)施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，約50μmol)上合成指出的擬肽序列，例外之處在于，按照典型程序H所述來(lái)形成氮雜甘氨酸。來(lái)自樹(shù)脂的切割產(chǎn)物經(jīng)HPLC-RP純化，并被凍干，最終產(chǎn)生預(yù)期的分子[12.00mg；LC(梯度1)保留時(shí)間＝5.18分鐘；Ms(m+1)＝在給定范圍內(nèi)]。
根據(jù)本發(fā)明的化合物可用作為藥物以及作為工具(means)用于生物試驗(yàn)。
它們的活性由對(duì)蛋白質(zhì)MyD88同型二聚體化的抑制構(gòu)成，由此能抑制更大量的前炎性信號(hào)，組成更有效的治療劑。
在其普通應(yīng)用中，本發(fā)明提供了結(jié)構(gòu)式(I)的化合物用于制備藥劑的用途，所述藥劑用于治療源自對(duì)TLR/IL-R1受體系統(tǒng)的信號(hào)傳遞系統(tǒng)調(diào)節(jié)不良的疾病。
本領(lǐng)域知識(shí)能使專(zhuān)家基于上面提到的分子生物學(xué)機(jī)制確定可被治療的疾病。
根據(jù)本發(fā)明可治療的疾病選自炎性和自身免疫疾病；心血管和致動(dòng)脈粥樣硬化性疾病；膿毒癥和休克；以及移植排斥構(gòu)成的組。
炎性和自身免疫疾病的例子是關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、慢性炎性腸疾(IBD)、牛皮癬、1型糖尿病、多發(fā)性硬化、哮喘和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
心血管和致動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的例子是心肌梗塞、病毒性心肌炎、動(dòng)脈硬化、移植靜脈硬化、血栓、再狹窄、由于支架造成的再狹窄以及由于血管成形術(shù)造成的再狹窄。
非炎性疾病的例子包括癌癥和AIDS。
根據(jù)本發(fā)明的藥物將含有有效量的結(jié)構(gòu)式(I)的化合物，這根據(jù)正常臨床試驗(yàn)確定。然后，初級(jí)保健醫(yī)師將根據(jù)待治療疾病種類(lèi)、患者狀況以及任何伴隨的療法來(lái)確定劑量。
生物試驗(yàn)對(duì)作為本發(fā)明主題的化合物進(jìn)行生物性質(zhì)的測(cè)試，以鑒定它們部分或完全抑制MyD88的同型二聚體化以及由此調(diào)節(jié)對(duì)NF-κB的激活的能力。為達(dá)到此目的，使用三種類(lèi)型的試驗(yàn)a)雙雜交試驗(yàn)，在酵母中進(jìn)行，下文提供了對(duì)其的簡(jiǎn)單描述，b)NF-κB抑制試驗(yàn)，在下文中描述，以及c)熒光素酶活性的報(bào)告基因試驗(yàn)，在下文中描述。被認(rèn)為有活性的化合物是在三種生物試驗(yàn)中任意一種中被發(fā)現(xiàn)有活性的。
a)雙雜交試驗(yàn)釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae中的雙雜交系統(tǒng)基于體外重構(gòu)(reconstitute)轉(zhuǎn)錄因子GAL4的能力，GAL4可被分為兩個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域激活結(jié)構(gòu)域(AD)和結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(Field，S.；Song，O.；Naturee，1989，340245-247；Chien，CT.；et al.；Proc.Nat.Acad.ScL USA；1991，889578-9582)。如果，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可以和能相互作用的兩個(gè)蛋白融合的話，結(jié)果將是GAL4的功能性重構(gòu)，這將激活處于其自身上游激活序列(UAS)控制下的大量報(bào)告基因。處于GAL4的UAS控制下的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄將允許對(duì)對(duì)于在選擇性培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)重要的酶進(jìn)行合成。該試驗(yàn)用384孔板來(lái)進(jìn)行，其底部存在加入了熒光底物的硅氧烷基質(zhì)，該熒光底物的發(fā)射光對(duì)氧的水平敏感(Wodnicka，M.；et al.；J.Biomol.Screen；1995，5141-152)。在雙雜交系統(tǒng)中，當(dāng)與GAL4的BD和AD結(jié)構(gòu)域分別融合的兩個(gè)蛋白之間發(fā)生相互作用時(shí)，酵母將能在選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并且將消耗氧，發(fā)射出熒光，這將隨著時(shí)間進(jìn)程增加，可用合適的熒光測(cè)讀計(jì)(Fusion，Perkin Elmer)探測(cè)到。如果酵母被放置于存在能抑制該相互作用的分子的地方，報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄將減少，因此，在最小限度培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的能力將降低并伴隨熒光信號(hào)的減少。
用于表達(dá)與結(jié)構(gòu)域AD和BD融合的MyD88的載體(pGBKT7和pGADT7)由Clontech提供，用于共轉(zhuǎn)化的酵母菌株AH109(MATa，trp1-901 leu2-3 112 ura3-52 his3-200 gal4Δ gal80Δ和最小限度培養(yǎng)基SGd/-Leu/-Trp e SGd/-Ade/-His/-Leu/-Trp也一樣。用于該試驗(yàn)的384孔板由BD Biosciences(Oxygen BioSensor Plates)提供，用于測(cè)量熒光的儀器是Perkin Elmer Fusion設(shè)備。經(jīng)兩種基因融合體(AD-MyD88和BD-MyD88)共轉(zhuǎn)化過(guò)的菌株AH109被預(yù)接種于2mL SGd/-Leu/-Trp中，在30℃于200rpm攪拌下培養(yǎng)過(guò)夜；然后，在存在待試分子(終濃度100mM)的情況下，針對(duì)384孔板的每個(gè)孔，在100mL SGd/-Ade/-His/-Leu/-Trp中對(duì)預(yù)接種物加以稀釋(1/20)。在30℃于Fusion中溫育平板，使用485nm的熒光團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)來(lái)測(cè)定各個(gè)孔發(fā)射的熒光，每90分鐘，從平板底物讀取630nm的發(fā)射，總共25個(gè)讀數(shù)。熒光強(qiáng)度是任意單位(arbitrary unit)，因此必須進(jìn)行歸一化一個(gè)孔在時(shí)間n的熒光強(qiáng)度必須除以同一個(gè)孔的初始熒光強(qiáng)度。
對(duì)熒光增加曲線的分析通過(guò)針對(duì)這種類(lèi)型的研究特別制作的系統(tǒng)(Chrysallis s.a.s.software-house精心制作的軟件，無(wú)限使用許可授予TecnogenS.C.p.A.)，對(duì)通過(guò)雙雜交試驗(yàn)產(chǎn)生的熒光增加曲線加以分析。
曲線分析能直接涉及數(shù)據(jù)獲取儀器產(chǎn)生的文件，而無(wú)須對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)先處理，由此能立即進(jìn)行定量類(lèi)型的分析。
舉例而言，

圖1/4展示了從含有大多數(shù)第2類(lèi)化合物的一塊平板獲得的曲線。關(guān)于熒光增加的曲線表示為NRF(相對(duì)于時(shí)間0的歸一化相對(duì)熒光)，其是時(shí)間的函數(shù)。
軟件提供了定量參數(shù)，其能描述各曲線的特征，如圖所示，其展示了非常不同的方面。具體而言，使用了七種不同的描述符斜率(平臺(tái)的斜率)、水平(平臺(tái)的高度)、范圍(平臺(tái)的范圍)、ΔT(生長(zhǎng)時(shí)間)、t1/2(生長(zhǎng)至平臺(tái)高度的50％的時(shí)間)、 因子(“駝峰(hump)”因子)和Tau(sigmoidalτ)。通過(guò)這些定量參數(shù)，可能獲得對(duì)實(shí)驗(yàn)曲線組的多維示意圖。由此開(kāi)始，使用用于主要組分的提取技術(shù)，構(gòu)建對(duì)數(shù)據(jù)的二維示意圖，以盡可能清楚地強(qiáng)調(diào)出曲線之間的差別。后面的階乘平面(factorial plane)“解釋了”在從研究的平板獲得的曲線(由不同符號(hào)代表)間鑒定出的變異性，將它們歸因于多種參數(shù)或其組合(圖2/4)。
前兩個(gè)階乘軸(axes)解釋的變異性為77.6％+13.7％＝91.3％，因此，第一個(gè)階乘平面上的二維圖完全足以以良好程度來(lái)展示曲線空間分散近似值。第一個(gè)階乘軸趨向于將具有高平臺(tái)水平的曲線(我們發(fā)現(xiàn)處于該軸右邊的)與具有較低平臺(tái)水平的那些(相反地，其將在軸的左邊)分開(kāi)。后者還展示出下述特征較之位于右邊的曲線而言，具有更高ΔT、Tau、VA、范圍和斜率。這些描述符的值越高，它們就離兩軸交點(diǎn)越遠(yuǎn)。
這種類(lèi)型的示意圖允許鑒定出具有相似情況的曲線的“組”(具有相同符號(hào)的曲線對(duì)應(yīng)于具有相似特征的曲線)，以及清楚鑒定出哪些曲線是影響氧消耗進(jìn)而影響酵母生長(zhǎng)的化合物產(chǎn)生的。
因此從該平板(其提供了該示意圖(圖3/4))選出的是圖2/4中以符號(hào)x表示的曲線，其較之該平板上存在的化合物產(chǎn)生的曲線的平均值，展示出較低的平臺(tái)水平以及較高的生長(zhǎng)時(shí)間(ΔT)和tau值，如下述統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)所報(bào)告的ΔT＝36.001±0.0(14.615±10.252)水平＝2.884±0.667(4.763±1.131)斜率＝0.263±0.077(0.125±0.096)范圍＝0.801±0.279(0.364±0.294)Tau＝30.005±0.0(8.805±12.146)t1/2＝33.006±0.012(25.142±4.738)因子＝0.006±0.002(0.402±0.258)
括號(hào)中的值是針對(duì)在分析的平板中該參數(shù)獲得的平均值。
此外，圖2/4中以符號(hào)·表示的曲線組選自該平板，盡管它們展示出比平均值高的因子，低于平均值的ΔT值，但它們展示出高于從平板上存在的化合物產(chǎn)生的曲線的平均值的t1/2、范圍和斜率，如下述統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)所報(bào)告的(圖4/4)ΔT＝22.687±1.577(14.615±10.252)水平＝4.044±0.377(4.763±1.131)斜率＝0.261±0.071(0.125±0.096)范圍＝0.746±0.201(0.364±0.294)Tau＝30.005±0.003(8.805±12.146)t1/2＝33.004±0.0(25.142±4.738)因子＝0.619±0.056(0.402±0.258)上述分析系統(tǒng)以同樣的方式用于所使用的所有平板，以選出根據(jù)本發(fā)明的化合物，產(chǎn)生了下述結(jié)果第1類(lèi)名稱(chēng) 序列ST2402Ac-arg-asp-val-leu-pro-gly-NH2ST2565Ac-thr-gly-pro-leu-val-asp-arg-NH2ST2842Arg-Asn-Val-Cys-Pro-Gly-Cys-NH2|-------------|ST2946Ac-arg-asn-val-leu-pro-gly-NH2ST2947Ac-arg-asp-val-val-pro-gly-NH2第2類(lèi)名稱(chēng) 序列ST2793PAM8-SP20-Beta3-NH2ST2806AM8-SP38-Beta6
ST2825 PAM4-SP19-Beta8-NH2ST2826 PAM6-SP20-Beta8-NH2ST2827 PAM6-(SP39)2-Beta3-NH2ST2828 SP32-Beta3-NH2ST2848 AM8-SP12-Beta7ST2849 PAM8-SP33-Beta4-NH2ST2851 PAM3-SP39-Beta3-NH2ST2852 PAM6-(SP39)4-BETA3-NH2ST2935 PAM8-SP12-Beta3-NH2ST2936 PAM10-SP19-Beta3-NH2ST2937 AM8-SP33-Beta5ST2938 PAM3-SP39-Beta4-NH2ST2940 AM4-SP33-Beta3-NH2ST2941 PAM3-SP33-Beta8-NH2ST3374 PAM10-SP6-Beta8-NH2第3類(lèi)名稱(chēng)序列ST2791 PAM8-SP2-Beta1-Thr-NH2ST2795 PAM6-SP18-Pro-Gly-NH2ST2796 AM9-SP2-Pro-Gly-NH2ST2797 PAM8-SP15-Pro-Gly-NH2ST2853 AM1-GLY-SP30-Pro-Gly-NH2ST2854 Beta7-SP2-arg-NH2ST2855 Ac-AKG-SP12-Beta1-THK-NH2ST2856 PAM8-ASP-VAL-VAL-Pro-Gly-Gly-NH2ST2857 PAM10-SP18-Pro-Gly-NH2ST2858 PAM3-SP18-Pro-Gly-NH2ST2859 PAM6-SP12-Pro-Gly-NH2
ST2862 AM9-SP15-Pro-Gly-NH2ST2863 AM9-SP17-Pro-Gly-NH2ST2864 Ac-Gly-PK07-SP30-Arg-NH2ST2867 Beta6-val-val-asp-arg-NH2ST2868 Ac-Gly-Pro-SP2-Arg-NH2ST2869 Ac-Pro-Gly-SP2-ARG-NH2ST2870 PAM8-(SP31)4-Pro-Gly-NH2ST2942 Beta5-SP38-His-OHST2943 PAM10-SP2-Pro-Gly-NH2ST2944 PAM6-SP14-Pro-Gly-NH2ST2945 PAM9-(SP17)2-Pro-Gly-NH2b)NF-κB抑制試驗(yàn)對(duì)NF-κB的激活是發(fā)生于MyD88同型二聚體化以及其與大量受體復(fù)合物的胞質(zhì)內(nèi)部分結(jié)合下游的事件。因此，對(duì)本發(fā)明的主題的化合物抑制對(duì)NF-κB的激活的能力加以評(píng)估，對(duì)NF-κB的激活是IL1α誘發(fā)的信號(hào)放大級(jí)聯(lián)下游的。
用MTT細(xì)胞存活力測(cè)試對(duì)所有分子進(jìn)行了檢驗(yàn)，驗(yàn)證了用于NF-κB抑制試驗(yàn)中的化合物的劑量低于毒性劑量。
將HeLa*細(xì)胞培養(yǎng)于EMEM(EBSS)培養(yǎng)集中，其中補(bǔ)充有2mM谷氨酰胺+1％非必要氨基酸+7.5％FBS(胎牛血清)+10ml/1青霉素-鏈霉素溶液(10,000單位/ml青霉素和10mg/ml鏈霉素)。
(所有細(xì)胞培養(yǎng)基和多種組分都購(gòu)自Sigma-Aldrich。*HeLa細(xì)胞系，尼格羅人宮頸上皮癌Human，來(lái)自SIGMA ALDRICH ECACC，編號(hào)93021013。IL1α*＝SIGMA 12778白細(xì)胞介素-1-alpha IL1a Human，其是E.coli中重組表達(dá)的)。
所有細(xì)胞都在經(jīng)歷了次數(shù)在14至35范圍內(nèi)的細(xì)胞傳代之后使用。
以300,000細(xì)胞/孔的密度，將細(xì)胞接種于6孔板，完全培養(yǎng)基中，在37℃，5％CO2培養(yǎng)過(guò)夜。
大約18小時(shí)后，除去完全培養(yǎng)基，用PBS 1x洗細(xì)胞兩次，向每個(gè)孔中加入1ml不含PBS的培養(yǎng)基。
隨后將待測(cè)試分子以100μM的濃度加入到培養(yǎng)基中。然后在37℃ ，5％CO2對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)6小時(shí)。
試驗(yàn)的所有分子都溶解于DMSO中。
將等體積的DMSO加入到陰性對(duì)照中，即，沒(méi)有用分子處理過(guò)的細(xì)胞中。
在用分子處理的末尾，用5ng/ml的IL1α*對(duì)細(xì)胞進(jìn)行30分鐘的刺激，在37℃，5％CO2培養(yǎng)。
將等體積的PBS/BSA 0.4％(用于溶解IL1α的溶液)加入到陰性對(duì)照中，即，未受刺激的細(xì)胞。
用IL1α刺激之后，用PBS 1x對(duì)細(xì)胞洗兩次，通過(guò)刮取來(lái)收集細(xì)胞。
然后在800rpm，4℃對(duì)細(xì)胞離心10分鐘。
除去上清液。將沉淀重新懸浮于裂解緩沖液**中，在4℃培養(yǎng)10分鐘，以最大速度在4℃離心。除去沉淀，上清液冷凍于-80℃。
隨后通過(guò)Bradford試驗(yàn)來(lái)測(cè)量總蛋白含量，其中以已知濃度的BSA作為標(biāo)準(zhǔn)，其用于下文所述的ELISA試驗(yàn)中。
使用Trans AM#(Active Motif)試劑盒來(lái)評(píng)估對(duì)NF-κB的激活/抑制。
I1 Trans AM試劑盒允許對(duì)IL1α誘導(dǎo)的對(duì)NF-κB的激活進(jìn)行探測(cè)，這通過(guò)在常規(guī)ELISA試驗(yàn)最后獲得的比色反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
該試劑盒提供了96孔板，其被含有NF-κB的共有位點(diǎn)(5，-GGGACTTT-CC-3’)的寡核苷酸進(jìn)行過(guò)衍生化。該寡核苷酸僅特異結(jié)合NF-κB的活性形式，這是用IL1α刺激后釋放的。提供來(lái)探測(cè)NF-κB的第一抗體識(shí)別p65抗原決定簇(這僅在轉(zhuǎn)錄因子具有活性時(shí)才可利用)，并且結(jié)合其靶DBNA序列。
提供的次級(jí)抗體與馬辣根過(guò)氧化物酶橋聯(lián)，加入發(fā)色底物時(shí)，該酶使得人們可以獲得比色反應(yīng)，這可在450nm的波長(zhǎng)處通過(guò)分光光度方法來(lái)評(píng)估。
對(duì)樣品進(jìn)行一式兩份的重復(fù)試驗(yàn)，每種提取物取10μg上樣到每個(gè)孔中。
在試驗(yàn)?zāi)┪?，通過(guò)對(duì)分光光度讀數(shù)獲得的值進(jìn)行加工來(lái)計(jì)算％抑制，如下所述IL*-C*/IL-C＝對(duì)NF-κB的％激活I(lǐng)L*＝經(jīng)過(guò)刺激，并且用研究分子處理過(guò)的細(xì)胞的A450。
C*＝?jīng)]有經(jīng)過(guò)刺激，但用研究分子處理過(guò)的細(xì)胞的A450。
IL＝用ILlα刺激過(guò)但是沒(méi)有用分子處理過(guò)的細(xì)胞的A450。
C＝?jīng)]有經(jīng)過(guò)刺激和處理的細(xì)胞的A450。
NF-κB激活越高，所測(cè)試的分子的活性就越低。
用于進(jìn)行細(xì)胞裂解和ELISA試驗(yàn)的所有試劑都由所使用的試劑盒提供。
在NF-κB抑制試驗(yàn)中被認(rèn)為是陽(yáng)性的化合物是給出了≥15％的百分比抑制的那些。
第1類(lèi)名稱(chēng)序列NF-κB％抑制ST2565 Ac-thr-gly-pro-leu-val-asp-arg-NH230第2類(lèi)名稱(chēng)序列NF-κB％抑制ST3375 PAM3-SP30-Beta8-NH233ST2828 SP32-Beta3-NH227ST2825 PAM4-SP19-Beta8-NH226ST2806 AM8-SP38-Beta6 24ST2826 PAM6-SP20-Beta8-NH223ST2793 PAM8-SP20-Beta3-NH218ST2863 AM9-SP17-Pro-Gly-NH217
ST2941 PAM3-SP33-BETA8-NH217第3類(lèi)名稱(chēng)序列 NF-κB％抑制ST2804 Ac-Arg-SP2-Beta2-Gly-NH234ST2807 PAM9-(SP31)3-Pro-Gly-NH233ST2794 PAM9-Asp-Val-Val-Beta2-NH225ST2799 Ac-arg-asp-val-leu-Beta1-NH223ST2792 PAM9-SP2-Beta2-Thr-NH222ST2797 PAM8-SP15-Pro-Gly-NH220ST2798 PAM9-SP38-Pro-Gly-NH218ST2796 AM9-SP2-Pro-Gly-NH217ST2801 Ac-Arg-SP12-Beta2-Thr-NH217ST2864 Ac-Gly-Pro-SP30-Arg-NH216ST2805 NH2-arg-SP2-Beta5 15c)在用IL-1刺激過(guò)的人類(lèi)腸CaCo2上皮細(xì)胞中對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行的報(bào)告基因試驗(yàn)這基于用報(bào)告基因質(zhì)粒對(duì)CaCo2人類(lèi)腸上皮細(xì)胞的瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染，該質(zhì)粒的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)處于IL-1-應(yīng)答性人IL-8啟動(dòng)子基因區(qū)域的控制下。共轉(zhuǎn)染中的第二種質(zhì)粒是編碼對(duì)照Renilla熒光素酶報(bào)告基因的載體，其組成性表達(dá)用于估計(jì)測(cè)試的化合物的非特異性細(xì)胞毒性。該試驗(yàn)結(jié)果被定義為針對(duì)螢火蟲(chóng)和Renilla熒光素酶的相對(duì)應(yīng)答比例(Relative Response Ratio，RRR)，如下所述 其中，實(shí)驗(yàn)樣品是以實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因熒光的每秒濃度(cps)表示的值，其是針對(duì)任何未知樣品定義的。陽(yáng)性對(duì)照是以報(bào)告基因熒光的cps表示的值，其是針對(duì)下述樣品定義的，所述樣品鑒定了在不存在參照抑制化合物時(shí)IL-1的最大誘導(dǎo)。陰性對(duì)照是以報(bào)告基因熒光的cps表示的值，其是針對(duì)下述樣品定義的，所述樣品鑒定了IL-1誘導(dǎo)的不存在。對(duì)于非誘導(dǎo)型的Renilla熒光素酶，RRR按照如下來(lái)定義 RGA是上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其按照下文所述來(lái)進(jìn)行將6×106個(gè)粘附CaCo2細(xì)胞涂布到10cm平板上。18-24小時(shí)之后，更換培養(yǎng)基，使用9mL D-MEM+谷氨酰胺580mg/L，不加FBS和抗生素。對(duì)于每塊平板，然后將26μgIL-1-應(yīng)答性報(bào)告基因載體DNA(pGL2-NA-INT)和4μg對(duì)照?qǐng)?bào)告基因載體DNA溶解于500μLOptimem(Invitrogen)中；在室溫下對(duì)該后一種反應(yīng)混合物進(jìn)行5分鐘溫育。然后將DNA混合物逐滴加入到Lipofectamine 2000混合物中。在室溫下對(duì)得到的DNA/Lipofectamine混合物溫育20分鐘，通過(guò)輕柔搖晃平板，將其逐滴加到培養(yǎng)平板上。然后在37℃和5％CO2對(duì)培養(yǎng)平板進(jìn)行6小時(shí)溫育。然后按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶處理，將其以5×104個(gè)細(xì)胞/孔轉(zhuǎn)移進(jìn)96孔板的100μL培養(yǎng)基(D-MEM，具有FBS1％+谷氨酰胺580mg/L)中。之后，在37℃ 和5％CO2對(duì)細(xì)胞溫育16-18小時(shí)，按照下文所述進(jìn)行處理從每個(gè)孔取出培養(yǎng)基。
向?qū)φ占?xì)胞孔中加入60μL新鮮的培養(yǎng)基。
向IL-1處理孔中加入40μL新鮮的培養(yǎng)基。
向抑制劑物質(zhì)的孔中加入40μL新鮮的培養(yǎng)基以及20μL以100μM的濃度存在的物質(zhì)和0.4％DMSO。
在IL-1處理孔和對(duì)照細(xì)胞孔中加入20μL新鮮的培養(yǎng)基，其中補(bǔ)充有0.4％DMSO。
在37℃和5％CO2溫育4小時(shí)。
2小時(shí)后，在37℃和5％CO2用20μL IL-1(500pg/mL)刺激額外的兩小時(shí)。
在另外一些試驗(yàn)孔中加入合適的量的熒光素酶標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
每個(gè)孔中加入80μL螢火蟲(chóng)熒光素酶底物(Dual-GIoLuciferase Assay System試劑)。
在室溫溫育10分鐘。
在Veritas lumenometer(Turner BioSystems)上讀取螢火蟲(chóng)熒光素酶的結(jié)果。
向每個(gè)孔中立即加入80μL Renilla熒光素酶底物(Dual-GIoLuciferase Assay System試劑)。
在室溫溫育10分鐘。
在Veritas lumenometer(Turner BioSystems)上讀取Renilla熒光素酶的結(jié)果。
在RGA試驗(yàn)中被認(rèn)為是陽(yáng)性的化合物是給出了≥20％的百分比抑制的那些。
第2類(lèi)名稱(chēng)序列 ％抑制ST2828 SP32-Beta3-NH224ST2825 PAM4-SP19-Beta8-NH271ST2793 PAM8-SP20-Beta3-NH220ST3324 PAM11-SP19-Beta8-NH251(80μM)第3類(lèi)名稱(chēng)序列 ％抑制ST2926 H-Arg-Gly-AzaVal-Val-Pro-Gly-NH220ST3032 Ac-Azagly-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH221ST2927 Ac-Arg-Asp-Azagly-Val-Pro-Gly-NH222ST2930 Ac-thr-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH224
ST2920 Ac-Arg-Asp-Val-AzaVal-Pro-Gly-NH225ST2928 Ac-Arg-Asp-AzaLeu-Val-Pro-Gly-NH229ST2797 PAM8-SP15-Pro-Gly-NH231根據(jù)本發(fā)明，藥物組合物含有至少一種活性成分，其含量為能產(chǎn)生顯著療效的量。本發(fā)明包括的組合物是傳統(tǒng)的，通過(guò)屬于制藥工業(yè)的常規(guī)實(shí)踐的方法來(lái)獲得，例如通過(guò)Remington′s PharmaceuticalScience Handbook，Mack Pub.N.Y.——最新版本中闡述的那些。根據(jù)選擇的施予途徑，組合物將是固體或液體形式的，它們適合用于口服、腸胃外或靜脈內(nèi)施予。根據(jù)本發(fā)明的組合物含有活性成分以及至少一種可藥用載體或賦形劑。配方佐劑可能是特別有用的，例如，增溶劑、分散劑、懸浮劑或乳化劑。
考慮到根據(jù)本發(fā)明的化合物的肽性本質(zhì)，具有本領(lǐng)域平均經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員將能確定對(duì)藥物組合物中的化合物加以配制，用于以胃保護(hù)或受控釋放形式口服施予的適用性(advisability)。
序列表<110>希格馬托制藥有限公司<120>MYD88同型二聚體化抑制劑<130>EPI-8803<140>EP04425929.9<141>2005-01-14<160>14<170>PatentIn Ver.3.3<210>1<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>人工合成序列的描述合成肽<400>1Arg Asp Val Leu Pro Gly Thr1 5<210>2<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>人工合成序列的描述合成肽<400>2Arg Asp Val Val Pro Gly Gly1 5<210>3<211>16<212>PRT
<213>果蠅Drosophila melanogaster<400>3Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Ash Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys1 5 10 15<210>4<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>人工合成序列的描述合成肽<400>4Pro Thr Asp Leu Val Arg Gly1 5<210>5<211>4<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>人工合成序列的描述合成肽<400>5Leu Pro Gly Thr1<210>6<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>人工合成序列的描述合成肽<400>6Thr Gly Pro Leu Val Asp Arg1 5
<210>7<211>4<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>人工合成序列的描述合成肽<400>7Arg Asp Val Leu1<210>8<211>6<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>人工合成序列的描述合成肽<400>8Arg Asp Val Leu Pro Gly1 5<210>9<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>人工合成序列的描述合成肽<400>9Arg Asn Val Cys Pro Gly Cys1 5<210>10<211>6<212>PRT
<213>人工合成序列<220>
<223>人工合成序列的描述合成肽<400>10Arg Asn Val Leu Pro Gly1 5<210>11<211>6<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>人工合成序列的描述合成肽<400>11Arg Asp Val Val Pro Gly1 5<210>12<211>6<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>人工合成序列的描述合成肽<400>12Asp Val Val Pro Gly Gly1 5<210>13<211>4<212>PRT<213>人工合成序列<220>
<223>人工合成序列的描述合成肽
<400>13Val Val Asp Arg1<210>14<211>10<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>人工合成序列的描述合成寡核苷酸<400>14gggactttcc 10
權(quán)利要求
1.結(jié)構(gòu)式(I)的肽和/或擬肽化合物(X-)AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7(I)其中X是可藥用的陰離子，或者不存在；基團(tuán)AA1-AA7中的每一個(gè)(可以是相同的或不同的)，是具有下述含義的氨基酸或氨基酸模擬物AA1＝L-精氨酸(Arg)、D-精氨酸(arg)、L-組氨酸(His)、D-組氨酸(his)或擬精氨酸基團(tuán)的殘基，或不存在，其中，擬精氨酸表示下述化學(xué)結(jié)構(gòu)，其取代精氨酸，并調(diào)節(jié)功能性基團(tuán)的堿度，從精氨酸的堿度至零堿度，其具有結(jié)構(gòu)式(II)、(III)和(IV) Y＝Cl，F(xiàn)，Br，lZ＝Alk C1-C4(III) AA2＝L-天冬氨酸(Asp)、D-天冬氨酸(asp)、L-天冬酰胺(Asn)、D-天冬酰胺(asn)、甘氨酸(gly或Gly)，或不存在；AA3＝L-纈氨酸(Va )、D-纈氨酸(val)、氮雜纈氨酸(AzaVal)、氮雜甘氨酸(Azagly)、氮雜亮氨酸(AzaLeu)；AA4＝L-亮氨酸、D-亮氨酸、L-纈氨酸(Val)、D-纈氨酸(val)、L-半胱氨酸(Cys)、D-半胱氨酸(cys)、氮雜亮氨酸(AzaLeu)、氮雜纈氨酸(AzaVal)、氮雜甘氨酸(Azagly)；AA2-AA3-AA4可共同被間隔基取代，其中，間隔基表示下述疏水化學(xué)結(jié)構(gòu)，其具有有限數(shù)量的旋轉(zhuǎn)自由度，其含有被各種取代的、官能化的芳香族接頭環(huán)、僅一個(gè)羧酸基團(tuán)和僅一個(gè)一級(jí)胺基，參與酰胺鍵，其具有結(jié)構(gòu)式(V) Y＝O-AlkC1-C4，COO-Alk C1-C4，Cl，F(xiàn)，Br，l(V)AA5＝L-脯氨酸(Pro)、D-脯氨酸(pro)、順-4，5-(亞甲基)-L-脯氨酸(cMe-Pro)、順-(4，5)-(亞甲基)-D-脯氨酸(cMe-pro)、反-4，5-(亞甲基)-L-脯氨酸(tMe-Pro)、反-(4，5)-(亞甲基)-D-脯氨酸(tMe-pro)；AA6＝甘氨酸(gly或Gly)、肌氨酸(Sar)、氮雜甘氨酸(Azagly)；AA5-AA6可共同被β-轉(zhuǎn)角模擬物取代，其中，β-轉(zhuǎn)角模擬物表示下述化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過(guò)模擬Pro-Gly β-轉(zhuǎn)角的中央部分，其允許該分子采用有利于與蛋白質(zhì)MyD88形成鍵的構(gòu)象，其具有結(jié)構(gòu)式(vI)和(VII) n＝0，1，2m＝0，1，2p＝0，1*＝外消旋物以及純的對(duì)映異構(gòu)體(VI) X＝CO，SO2Y＝H，OH*＝外消旋物以及純的對(duì)映異構(gòu)體(VII)AA7＝甘氨酸(gly或Gly)、氮雜甘氨酸(Azagly)、L-蘇氨酸(Thr)、D-蘇氨酸(thr)、L-半胱氨酸(Cys)、D-半胱氨酸(cys)的殘基，或不存在；當(dāng)AA4＝AA7＝Cys或cys時(shí)，兩個(gè)半胱氨酸之間存在二硫橋；當(dāng)AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6和AA7中的一些或全部是氨基酸時(shí)，它們可以是L或D，序列可以是反向的或不是反向的；AA1-AA7之間的鍵總是酰胺類(lèi)型的；末端氨基可以是游離的，或用有用于轉(zhuǎn)運(yùn)該分子的可藥用基，例如乙酰基、甲?；⒈郊柞；?、丙酰基、環(huán)己基、肉豆蔻?；；?；末端羧基可以是羧酸或一級(jí)酰胺的形式。各自的對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體、其混合物以及它們的可藥用鹽；滿(mǎn)足如下條件AA1-AA7中的至少一個(gè)不是上面指出的天然氨基酸，或者如果AA1-AA7全部都是上面指出的天然氨基酸時(shí)，所述AA1-AA7是反向的。
2.權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述擬精氨酸是下述化學(xué)結(jié)構(gòu)，其取代精氨酸，并調(diào)節(jié)功能性基團(tuán)的堿度，從精氨酸的堿度至零堿度。
3.權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述間隔基表示下述疏水化學(xué)結(jié)構(gòu)，其具有有限數(shù)量的旋轉(zhuǎn)自由度，其含有被各種取代的、官能化的芳香族接頭環(huán)、僅一個(gè)羧酸基團(tuán)和僅一個(gè)一級(jí)胺基，參與酰胺鍵。
4.權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述β-轉(zhuǎn)角模擬物表示下述化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過(guò)模擬Pro-Gly β-轉(zhuǎn)角的中央部分，其允許該分子采用有用于與蛋白質(zhì)MyD88形成鍵的構(gòu)象。
5.權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中，在AA1中，擬精氨酸選自下述結(jié)構(gòu)構(gòu)成的組 其中，A是直鏈或支鏈的C1-C4烷基；Al是選自F、Cl、Br和I的鹵素原子。
6.權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的化合物，其中，當(dāng)AA2-AA3-AA4被其中n＝0-3的間隔基(SPX)n取代，其選自如下結(jié)構(gòu)構(gòu)成的組 其中，A是直鏈或支鏈的C1-C4烷基；AL是選自F、Cl、Br和I的鹵素原子。
7.權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的化合物，其中，所述β-轉(zhuǎn)角模擬物選自由下述結(jié)構(gòu)構(gòu)成的組。
8.權(quán)利要求1的化合物，其具有結(jié)構(gòu)式Ac-thr-gly-pro-leu-Val-asp-arg-NH2。
9.權(quán)利要求1的化合物，其選自下述結(jié)構(gòu)構(gòu)成的組
10.權(quán)利要求1的化合物，其中AA5-AA6被β-轉(zhuǎn)角模擬物取代。
11.權(quán)利要求10的化合物，其具有結(jié)構(gòu)式。
12.權(quán)利要求1的化合物，其中AA2-AA3-AA4被間隔基取代并且AA5-AA6被β-轉(zhuǎn)角模擬物取代。
13.權(quán)利要求12的化合物，其選自如下結(jié)構(gòu)構(gòu)成的組
14.權(quán)利要求1的化合物，其中AA1是擬精氨酸并且AA5-AA6被β-轉(zhuǎn)角模擬物取代。
15.權(quán)利要求14的化合物，其具有結(jié)構(gòu)式。
16.權(quán)利要求1的化合物，其中AA1是擬精氨酸并且AA2-AA3-AA4被間隔基取代。
17.權(quán)利要求16的化合物，其選自如下結(jié)構(gòu)構(gòu)成的組 其中chiral表示手性。
18.權(quán)利要求1的化合物，其中AA1是擬精氨酸，AA2-AA3-AA4被間隔基取代，AA5-AA6被β-轉(zhuǎn)角模擬物取代并且AA7是氨基酸。
19.權(quán)利要求18的化合物，其具有結(jié)構(gòu)式
20.權(quán)利要求1的化合物，其中AA2-AA3-AA4被間隔基取代。
21.權(quán)利要求20的化合物，其具有結(jié)構(gòu)式
22.權(quán)利要求1的化合物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被一個(gè)或多個(gè)氮雜氨基酸取代。
23.權(quán)利要求16的化合物，其選自如下結(jié)構(gòu)構(gòu)成的組H-Arg-Gly-AzaVal-Val-Pro-Gly-NH2Ac-Azagly-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH2Ac-Arg-Asp-Azagly-Val-Pro-Gly-NH2Ac-thr-Azagly-pro-leu-V8l-asp-arg-NH2Ac-Arg-Asp-Val-AzaVal-Pro-Gly-NH2Ac-Arg-Asp-AzaLeu-Val-Pro-Gly-NH2
24.權(quán)利要求1-23的化合物作為MyD88的特定蛋白部分模擬物的用途，其阻止所述蛋白的同型二聚體化，通過(guò)干擾其與TlR結(jié)構(gòu)域的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。
25.作為藥物的根據(jù)權(quán)利要求1-23的化合物。
26.權(quán)利要求1-23的化合物用于制備可用于治療下述疾病的藥劑的用途，所述疾病源自對(duì)TLR/IL-R1受體系統(tǒng)的信號(hào)傳遞系統(tǒng)的調(diào)節(jié)不良。
27.如權(quán)利要求26所述的用途，其中所述疾病選自炎性疾病和自身免疫疾病、心血管和致動(dòng)脈粥樣硬化性疾病、膿毒癥和休克、移植排斥、癌癥和病毒感染構(gòu)成的組。
28.如權(quán)利要求26所述的用途，其中所述疾病選自關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、慢性炎性腸疾(IBD)、牛皮癬、1型糖尿病、多發(fā)性硬化、哮喘和系統(tǒng)性紅斑狼瘡構(gòu)成的組。
29.如權(quán)利要求26所述的用途，其中所述心血管和動(dòng)脈粥樣硬化疾病選自心肌梗塞、病毒性心肌炎、動(dòng)脈硬化、移植靜脈硬化、血栓、再狹窄、由于支架造成的再狹窄以及由于血管成形術(shù)造成的再狹窄構(gòu)成的組。
30.藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-23的至少一種化合物，所述化合物處于與至少一種可藥用載體和/或賦形劑的混合物中。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有結(jié)構(gòu)式(X－)AA
文檔編號(hào)C07K14/715GK101084240SQ200580043762
公開(kāi)日2007年12月5日 申請(qǐng)日期2005年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月20日
發(fā)明者P·卡米納蒂, G·加洛, N·范托, V·魯格吉洛, M·薩斯薩諾, D·馬斯特羅雅尼 申請(qǐng)人:希格馬托制藥工業(yè)公司