專利名稱：含有缺損的鞭毛蛋白基因的革蘭氏陽性菌細(xì)胞、基于鞭毛蛋白的融合蛋白以及從液體中 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組蛋白，更具體而言，涉及由革蘭氏陽性菌制備的重 組蛋白。
背景技術(shù)：
細(xì)菌重組蛋白的制備通常在革蘭氏陰性菌特別是在大腸桿菌中進(jìn) 行。需要開發(fā)在革蘭氏陽性菌中制備重組蛋白和肽的方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明者開發(fā)了保藏號(hào)為NCIMB41348的革蘭氏陽性嗜堿芽孢桿菌 (5fl"7/iw /^/oJwmw) Alk36細(xì)菌菌株，將其轉(zhuǎn)化，使得在其表面生產(chǎn)和 表達(dá)由鞭毛蛋白和位于鞭毛蛋白氨基酸序列內(nèi)的多種任意異源多肽組成 的融合蛋白。這些重組細(xì)菌在重組細(xì)菌細(xì)胞的表面產(chǎn)生高水平的穩(wěn)定和 可溶性的重組蛋白。本發(fā)明者還開發(fā)了含有編碼鞭毛蛋白的核苷酸序列 以及位于編碼鞭毛蛋白的核苷酸序列內(nèi)的位點(diǎn)的基因結(jié)構(gòu)，在這些位點(diǎn) 內(nèi)可以將編碼異源多肽的核苷酸序列插入。本發(fā)明的特征在于修飾的細(xì) 菌系，所述細(xì)菌系適于制備本發(fā)明的基于鞭毛蛋白的融合蛋白(FBFP)、 對(duì)制備融合蛋白有用的結(jié)構(gòu)、FBFP、編碼FBFP的核酸、含有所述核酸 的載體、含有所述載體的細(xì)胞、表達(dá)FBFP的轉(zhuǎn)化細(xì)菌系以及制備和使 用所述FBFP的方法。更具體而言，本發(fā)明的特征在于細(xì)菌細(xì)胞的基本純的培養(yǎng)物，其中 大多數(shù)的細(xì)菌細(xì)胞含有缺損的鞭毛蛋白基因，所述缺損阻止功能鞭毛蛋 白的表達(dá)。本發(fā)明還包括一種分離的、含有缺損的鞭毛蛋白基因的細(xì)菌 細(xì)胞，所述缺損阻止功能鞭毛蛋白的表達(dá)。在上述兩種情況下，所述缺 損可以是通過使用不編碼多肽或者非功能鞭毛蛋白多肽的DNA序列替 代所述大多數(shù)的細(xì)菌細(xì)胞中的內(nèi)源基因。所述細(xì)菌細(xì)胞可以是革蘭氏陽 性菌細(xì)胞，例如芽孢桿菌細(xì)胞，如嗜堿芽孢桿菌細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是BhFCOl (A/^g)菌株。所述非功能鞭毛蛋白多肽可以缺失SEQ ID N0:2的 14-226位氨基酸。除了含有缺損的鞭毛蛋白基因外，大多數(shù)的細(xì)菌細(xì)胞或者分離的細(xì) 菌細(xì)胞可以缺損至少一個(gè)細(xì)胞壁蛋白酶基因，并且所述缺損可以是使用 不編碼多肽或者非功能細(xì)胞壁蛋白酶的DNA序列替代所述大多數(shù)的細(xì) 菌細(xì)胞中的內(nèi)源基因。所述細(xì)菌細(xì)胞可以是如上所列的那些細(xì)胞。所述 的至少一個(gè)細(xì)胞壁蛋白酶基因可以是wr;^基因，所述缺損可以包括缺失 細(xì)胞壁蛋白酶基因的整個(gè)編碼序列。所述細(xì)胞可以是2005年11月23日 在NCIMB以保藏號(hào)_保藏的BhFC04 ( Aflg， w; d)細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面是一種芽孢桿菌屬細(xì)菌的基因工程方法。所述方 法包括在所述細(xì)菌的染色體中缺損/^g基因，所述缺損阻止所述基因?qū)?功能鞭毛蛋白的表達(dá)。所述芽孢桿菌細(xì)菌可以是嗜堿芽孢桿菌細(xì)菌。所述方法還可以包括缺損編碼一個(gè)或者多個(gè)細(xì)胞壁蛋白酶的一個(gè)或 多個(gè)基因，所述缺損阻止所述的一個(gè)或多個(gè)基因?qū)λ龅囊粋€(gè)或者多個(gè) 功能細(xì)胞壁蛋白酶的表達(dá)。所述一個(gè)或者多個(gè)細(xì)胞壁蛋白酶基因可以包 括基因。本發(fā)明還包括一種融合蛋白，其含有全部或者部分細(xì)菌鞭毛蛋白， 所述部分細(xì)菌鞭毛蛋白包含所述鞭毛蛋白的N-端和C-端保守區(qū)；異源多 肽，位于所述鞭毛蛋白的可變區(qū)內(nèi)或者代替所述鞭毛蛋白的可變區(qū)。如 果由細(xì)菌細(xì)胞制備融合蛋白，那么所述融合蛋白具有能在所述細(xì)菌細(xì)胞 表面上表達(dá)的能力。所述異源多肽可以具有能結(jié)合金屬離子能力的多肽。 所述金屬離子可以是鎳、銅、鎘、鉑、鈀、鈦、銀或金，所述異源多肽 可以是聚組氨酸序列。所述聚組氨酸序列可含有六個(gè)組氨酸殘基。此外，所述異源多肽可以是酶或者酶的功能片段。所述酶可以是脂 肪酶，例如喜熱噬油芽孢桿菌(G Aermo/eovora/w)脂肪酶A。所述酶可以 是水解酶，例如淀粉酶、蛋白酶、酯酶或者纖維素酶。此外，所述異源 多肽可以是免疫原。
所述融合蛋白還可以包括所述異源多肽N-端的1-15個(gè)接頭殘基N-端和/或所述異源多肽C-端的1-15個(gè)接頭殘基C-端。其還可以包括所述 異源多肽N-端的N-端切割位點(diǎn)和所述異源多肽C-端的C-端切割位點(diǎn)。本發(fā)明還提供了一種編碼上述融合蛋白的核酸；包含所述核酸序列 的載體，例如，所述核酸序列可操作性地與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(TRE)連接的載 體；以及含有所述載體的分離的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如 細(xì)菌細(xì)胞。所述細(xì)菌細(xì)胞可以是革蘭氏陽性菌細(xì)胞，例如芽孢桿菌屬細(xì) 胞，如嗜堿芽孢桿菌種細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是2005年11月23日在NCIMB 以保藏號(hào)_保藏的BhFC04 (/mg， iw")菌株。本發(fā)明的另一方面包括一種制備融合蛋白的方法。所述方法可以包 括培養(yǎng)含有載體的細(xì)胞以及從培養(yǎng)物中得到所述融合蛋白，其中所述載 體含有編碼上述融合蛋白的核酸，所述核酸可操作性地與TRE連接。本發(fā)明的特征還在于一種DNA結(jié)構(gòu)，其含有用于細(xì)菌鞭毛蛋白多 肽的全部或部分編碼序列，所述部分編碼序列包括編碼所述鞭毛蛋白的 N-端和C-端保守區(qū)的核苷酸；以及含有至少一個(gè)限制性酶位點(diǎn)的核苷酸 序列，其插入到編碼所述鞭毛蛋白多肽的可變區(qū)的序列中或者代替編碼 所述鞭毛蛋白多肽的可變區(qū)的序列。所述細(xì)菌鞭毛蛋白多肽可以是芽孢 桿菌鞭毛蛋白多肽，例如嗜堿芽孢桿菌鞭毛蛋白(SEQIDNO:l)。在所述 結(jié)構(gòu)中，可以將所述核苷酸序列緊鄰SEQ ID NO:l的162-606位核苷酸 之間的任意核苷酸之后插入；將所述核苷酸序列緊鄰SEQ ID N0:1的 441-570位核苷酸之間的任意核苷酸之后插入；或者將所述核苷酸序列緊 鄰SEQ ID N0:1的459-540位核苷酸之間的任意核苷酸之后插入。本發(fā)明還提供一種除去液體中的一種或者多種金屬離子的方法。所 述方法可包括使含有一種或者多種金屬離子的液體與本發(fā)明的融合蛋 白接觸，所述融合蛋白的異源多肽為與所述的一種或者多種金屬離子結(jié) 合的多肽。所述液體可以與表達(dá)所述融合蛋白的細(xì)菌細(xì)胞接觸?；蛘?， 所述融合蛋白可以是無細(xì)胞的多肽。本發(fā)明的另一方法是一種從含有一種或者多種金屬離子的液體中分 離所述的一種或者多種金屬離子的方法。所述方法可包括使含有一種
或者多種金屬離子的液體與本發(fā)明的融合蛋白接觸，所述融合蛋白的異 源多肽為與所述的一種或者多種金屬離子結(jié)合的多肽，所述接觸使得所 述的一種或者多種金屬離子與所述的融合蛋白結(jié)合；以及從所述融合蛋 白分離所述的一種或者多種金屬離子。本發(fā)明的另一方面是一種將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的方法，所述方法包括 使酶底物與本發(fā)明的融合蛋白接觸，所述融合蛋白內(nèi)的異源多肽為用于 酶底物的酶或者所述酶的功能片段，因而將所述底物轉(zhuǎn)化為所述產(chǎn)物。本發(fā)明還延伸至本發(fā)明的融合蛋白在制備用于在哺乳動(dòng)物受試者內(nèi) 產(chǎn)生免疫應(yīng)答的制劑中的用途。本發(fā)明還延伸到一種在哺乳動(dòng)物受試者內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法中使 用的物質(zhì)或者組合物，所述物質(zhì)或者組合物含有本發(fā)明的融合蛋白，所 述方法包括將有效量的所述物質(zhì)或者組合物給予所述的哺乳動(dòng)物受試 者。本發(fā)明還包括一種產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法。所述方法可以包括將本發(fā) 明的融合蛋白給予哺乳動(dòng)物受試者，所述融合蛋白的異源多肽為免疫原。 所述哺乳動(dòng)物受試者例如可以是人。本發(fā)明還提供一種含有表達(dá)載體的試劑盒，所述表達(dá)載體含有本發(fā) 明的DNA結(jié)構(gòu)。所述試劑盒還可以包括至少一種限制性酶；宿主細(xì)胞， 所述宿主細(xì)胞為能在其中復(fù)制所述載體的細(xì)胞；和/或用于將編碼異源多 肽的核酸序列插入所述DNA結(jié)構(gòu)中的說明。"多肽"和"蛋白"可交換使用，是指任意的肽連接的氨基酸鏈， 而不管長(zhǎng)度或者翻譯后的修飾。如本文使用的，用于多肽的術(shù)語"分離的"是指沒有天然存在的配 對(duì)物或已經(jīng)從與之天然共存的組分如微生物的細(xì)胞組分(例如細(xì)菌細(xì)胞 的細(xì)胞組分)中分離或者純化得到的多肽。通常，當(dāng)從蛋白質(zhì)和與之天然 共存的其他天然存在的有機(jī)分子中分離的多肽以干重計(jì)至少為70%時(shí)， 則認(rèn)為所述多肽是"分離的"。優(yōu)選地，以干重計(jì)，本發(fā)明的多肽(或者 其肽片段)制劑中至少含有80%的本發(fā)明的多肽(或者其肽片段)，更優(yōu)選 至少為90%，最優(yōu)選至少為99%，因此，例如以干重計(jì)，多肽x的制劑 至少含有80。/。的多肽x，更優(yōu)選至少為90%，最優(yōu)選至少為99%。由于 化學(xué)合成的多肽是根據(jù)其性質(zhì)從與之天然共存的組分中分離出來的，因 此所述合成的多肽是"分離的"。此外，由于自然界中不存在融合蛋白， 例如本發(fā)明的FBFP，因此其總是"分離的"。本發(fā)明的分離的多肽可以通過例如編碼所述多肽的重組核酸的表達(dá) 得到，或者通過化學(xué)合成得到。在細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的多肽不同于來源于 天然產(chǎn)生的多肽，前者是"分離的"，因?yàn)槠浔厝徊缓信c之天然共存的 成分?？梢酝ㄟ^合適的方法，例如柱色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳或者 HPLC分析法測(cè)定分離度或者純度。"分離的核酸"，例如分離的DNA為(l)含有與天然存在的任意序 列均不同的序列的核酸，或者(2)在含有天然存在的序列(例如cDNA或者 基因組DNA)的核酸附近，不含至少一個(gè)如下基因的核酸，即在天然產(chǎn)生 含有相關(guān)核酸的基因的生物體的基因組中，所述基因位于含有相關(guān)核酸 的基因側(cè)翼。因此該術(shù)語包括將重組的核酸整合到載體中、自主復(fù)制質(zhì) ?；蛘卟《局校蛘咴思?xì)胞或者真核細(xì)胞的基因組DNA中。該術(shù)語還 包括單獨(dú)的分子，例如cDNA，其中相應(yīng)的基因組DNA可包括內(nèi)含子， 因此可具有不同的序列；缺少至少一個(gè)側(cè)翼基因的基因組片段；由聚合 酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的、并且缺少至少一個(gè)側(cè)翼基因的cDNA或者基因組 DNA片段；缺少至少一個(gè)側(cè)翼基因的限制性片段；編碼非天然存在的蛋 白，例如融合蛋白、突變蛋白或者給定蛋白片段的核酸；以及cDNA的 簡(jiǎn)并變種的核酸或者天然存在的核酸。此外，其包括重組的核苷酸序列， 其為部分雜合基因，即編碼非天然存在的融合蛋白的基因。從前述內(nèi)容 可明顯得出，分離的DNA不意味著DNA存在于例如cDNA或者基因組 DNA庫內(nèi)的數(shù)百乃至數(shù)百萬的其他DNA分子、或者在例如限制性內(nèi)切 酶酶切消化反應(yīng)混合物中或電泳凝膠薄片中的基因組DNA限制性內(nèi)切 酶酶切消化物。本文使用的，"可操作性地連接"意思是整合到基因結(jié)構(gòu)中，使得表 達(dá)控制序列(轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控元件)有效地控制相關(guān)編碼序列的表達(dá)。關(guān)于核酸或者基因以及特定細(xì)胞，本文使用的術(shù)語"內(nèi)源的"是指 可以在特定細(xì)胞中產(chǎn)生(以及可以從特定細(xì)胞中得到)如同自然界發(fā)現(xiàn)的
任意核酸或者基因。除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬 技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同含義。在有沖突的情況下，將以包 括上述定義在內(nèi)的本文件為準(zhǔn)。雖然與本文記載的方法和材料相似或者 等同的方法和材料可在實(shí)際中使用或者可用于測(cè)試本發(fā)明，但優(yōu)選的方 法和材料將在下文描述。本文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利以及 其他參考文獻(xiàn)通過引用以其全文并入本文。本文公開的材料、方法以及 實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，而非用于限定本發(fā)明。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)，例如對(duì)生物整治或者生物采礦有用的以 及用作免疫原的FBFP將從下述的說明書、附圖和權(quán)利要求書中清楚獲 知。


圖1為考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳) 凝膠照片，顯示在不同生長(zhǎng)階段采樣的由嗜堿芽孢桿菌Alk36產(chǎn)生的胞 外(EX)和細(xì)胞結(jié)合(CB)蛋白的蛋白圖譜。條帶l， CB(6小時(shí))；條帶2， CB(24小時(shí))；條帶3， CB(48小時(shí))；條帶4， CB (72小時(shí))；條帶5， 分子量標(biāo)準(zhǔn)；條帶6， EX(24小時(shí))；條帶7， EX(72小時(shí))。照片右邊顯 示各種分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)的位置。照片左邊的箭頭指示過表達(dá)的34kDa蛋 白的位置。圖2表示 34kDa嗜堿芽孢桿菌Alk36蛋白的前22個(gè)N-端氨基酸 (SEQ ID NO:3)與嗜堿芽孢桿菌C-125的鞭毛蛋白的相應(yīng)的前22個(gè)氨 基酸(SEQ ID NO:4)的序列對(duì)比。相同的位置用+號(hào)以及有關(guān)氨基酸的對(duì) 應(yīng)字母表示。圖3表示從嗜堿芽孢桿菌Alk36克隆的推斷力ag編碼區(qū)域(SEQ ID NO:l)與從芽孢桿菌印.C-125的/^g基因的編碼區(qū)域(SEQ ID NO:l)的相 應(yīng)核苷酸序列對(duì)比。圖4為用各種限制性酶消化的嗜堿芽孢桿菌Alk36染色體DNA的 DIG標(biāo)記Southern印跡照片。該印跡用DIG標(biāo)記的800bp的嗜堿芽孢桿 菌Alk36 /zag編碼片段探測(cè)。條帶1，用^Z al/5flmHI消化的800bp的嗜 堿芽孢桿菌Alk36力flg基因片段；條帶2-7，用各種限制性核酸內(nèi)切酶消 化的嗜堿芽孢桿菌Alk36染色體DNA:條帶2， ^ccl;條帶3，五coRI; 條帶4，條帶5，尸M;條帶6， C7al;條帶7， Pwl。條帶8， 分子量標(biāo)準(zhǔn)。照片右邊顯示分子量標(biāo)準(zhǔn)(Kb)的位置，照片左邊的箭頭指 示1.70Kb和1.47Kb片段在印跡上的位置。圖5為溴化乙錠染色的瓊脂糖(1%)電泳凝膠照片，顯示從嗜堿芽孢 桿菌Alk36染色體消化產(chǎn)物得到的反向PCR產(chǎn)物。條帶1，分子量標(biāo)準(zhǔn)； 條帶2，」ccl消化產(chǎn)物(l(Htl);條帶3，歷7^m消化產(chǎn)物(l(Hil);條帶4， 陽性對(duì)照OScaI消化的含有鞭毛蛋白DNA片段的質(zhì)粒)。照片左側(cè)顯示分 子量標(biāo)準(zhǔn)(Kb)的位置，照片右邊的箭頭指示1.157Kb和0.925Kb片段在 印跡上的位置。圖6表示含有編碼序列側(cè)翼區(qū)域的嗜堿芽孢桿菌Alk36 /mg基因的 核苷酸全序列(SEQIDNO:5)。框內(nèi)的核苷酸代表推斷的啟動(dòng)子區(qū)域和潛 在的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。其中白色區(qū)域的核苷酸為不同于來自嗜堿芽孢桿 菌C125的/^g基因的核苷酸。陰影區(qū)域的核苷酸顯示從反向PCR得到 的所有新序列?；虻木幋a區(qū)域(SEQIDNO:l)以粗體表示。圖7表示包括上游和下游區(qū)域的嗜堿芽孢桿菌Alk36 /^g基因的核 苷酸序列(SEQIDNO:5)?？騼?nèi)的核苷酸代表推斷的啟動(dòng)子區(qū)域。帶有下 劃線的核苷酸代表潛在的核糖體結(jié)合(Shine-Dalgarno)位點(diǎn)。還顯示了嗜 堿芽孢桿菌Alk36鞭毛蛋白的氨基酸全序列(SEQ ID NO:2)。圖8A表示pSE194 (4.313 kb)質(zhì)粒圖。圖8B表示pSEC194 (5.496 kb)質(zhì)粒圖。圖9A表示具有其上游和下游區(qū)域的嗜堿芽孢桿菌Alk36/^g基因的 核苷酸序列(SEQIDNO:6)，表示如何構(gòu)建有缺陷的Aag基因。黑色區(qū)域 的序列表示Hag開放閱讀框的缺失區(qū)域，灰色陰影區(qū)域的序列表示兩個(gè) 片段，即從PCR反應(yīng)得到的N-端和C-端(含有數(shù)位編碼區(qū)域以及上游和 下游序列)，連接在一起得到在構(gòu)建pSECFlg-中使用的有缺陷的/^g基因。 對(duì)應(yīng)于PCR引物的序列為白色區(qū)域。
所述序列表示在構(gòu)建pSECFlg-中，開放閱讀框和序列的缺失區(qū)域和該開放閱讀框的剩余序列。所使用的引物帶有下劃線。圖9B表示pSEC194Flg-質(zhì)粒圖。圖10表示溴化乙錠染色的瓊脂糖(0.8%)電泳凝膠照片，表示嗜堿芽 孢桿菌Alk36染色體中pSEC194Flg-的整合事件(integration event)的PCR 的確定結(jié)果。不同的引物對(duì)(A， B， C和D)用于測(cè)試不同的整合事件。 條帶1， sco，突變體49;條帶2， sco，突變體50;條帶3， dco，不動(dòng) 型突變體-BhFCOl (源自49);以及條帶4，嗜堿芽孢桿菌Alk36染色體 DNA。引物對(duì)B和引物對(duì)C之間的條帶具有分子量標(biāo)準(zhǔn)。照片右側(cè)顯示 分子量標(biāo)準(zhǔn)(Kb)的位置。圖11表示使用PSI-Pred軟件預(yù)測(cè)的由NC1、 NC2、 NC3、 NC5以及 NC6編碼的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的比較結(jié)果。該程序用于獲得每種蛋白質(zhì) 的3態(tài)預(yù)測(cè)。圖中表示出a-螺旋(H)、延伸的P-鏈(E)以及巻曲(C)的二級(jí) 結(jié)構(gòu)。氨基酸插入表示在粗體且灰色的塊中。圖12A表示NC2肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)以及編碼該序列的 核苷酸序列(SEQ ID NO:8)。圖12B表示NC3肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)以及編碼該序列的 核苷酸序列(SEQ ID NO: 10)。圖12C表示NC5肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:ll)以及編碼該序列的 核苷酸序列(SEQ ID NO:12)。圖12D表示NC6肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)以及編碼該序列的 核苷酸序列(SEQ ID NO: 14)。圖13A為考馬斯藍(lán)染色的含有細(xì)胞表面蛋白部分的SDS-PAGE凝膠 照片。條帶l-7，用各種基因結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的嗜堿芽孢桿菌菌株BhFCOl。條 帶1， NC1;條帶2， NC2;條帶3， NC3;條帶4， NC3sco;條帶5， NC5;條帶6， FliC;條帶7， BhFC01;條帶8，嗜堿芽孢桿菌Alk3 WT (野生型)；條帶9,分子量標(biāo)準(zhǔn)。照片右邊顯示各種分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)的 位置。照片右邊的箭頭指示過表達(dá)的34kDa蛋白的位置。
圖13B為考馬斯藍(lán)染色的含有從以下菌株提取的CS蛋白的SDS-PAGE凝膠照片條帶1，嗜堿芽孢桿菌Alk36;條帶2， BhFCOl pSEC194NC3菌株；條帶3， BhFCOl pSEC194NC6菌株；以及條帶4， 分子量標(biāo)準(zhǔn)。照片右邊顯示各種分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)的位置。圖13C為如圖13A描述的蛋白部分的SDS-PAGE凝膠的Western印 跡照片。該Western印跡使用多克隆的鞭毛蛋白特異性抗體染色。照片 左邊顯示各種分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)的位置。照片左邊的箭頭指示過表達(dá)的 34kDa蛋白的位置。圖14各種嗜堿芽孢桿菌Alk36菌株的游動(dòng)性平板照片。A:菌落(l)， 嗜堿芽孢桿菌Alk36 WT;菌落(2)， BhFCOl (Mag);菌落(3)， BhFCOl (A/wg)+pSEC194FliC。 B:菌落(l)，嗜堿芽孢桿菌Alk36 WT;菌落2-6， (2)用pSECNCl轉(zhuǎn)化的BhFCOl、 (3)用pSECNC2轉(zhuǎn)化的BhFCOl 、 (4)用 pSECNC3轉(zhuǎn)化的BhFCOl 、 (5)用pSECNC5轉(zhuǎn)化的BhFCOl 、 (6)用 pSECNC6轉(zhuǎn)化的BhFCOl 。圖15A為完整的wp"-編碼區(qū)域的示意圖。A中的白色區(qū)域顯示構(gòu) 建pSECwpM-中缺失的編碼區(qū)域的部分，如B所示。隨后該結(jié)構(gòu)用于敲 除嗜堿芽孢桿菌BhFCOl染色體上的vv/^4基因。圖15B表示pSEC194w;^v4-質(zhì)粒圖。圖16為考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠照片，用于分析BhFCOl和 BhFC04菌株的胞外OEX)和細(xì)胞表面(CS)部分中的蛋白酶。通過 SDS-PAGE凝膠電泳分離EX和CS部分的等分試樣，使用考馬斯藍(lán)染色， 顯示蛋白條帶(條帶2-5)或者用于復(fù)性處理后蛋白酶活性(條帶7-10)。條 帶1和6，分子量標(biāo)準(zhǔn)；條帶2和7， BhFC04的胞外部分；條帶3和8， BhFCOl的胞外部分；條帶4和9， BhFC04的細(xì)胞表面部分；條帶5和 10， BhFCOl的細(xì)胞表面部分。照片左邊顯示各種分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)的位 置。箭頭指示BhFC04的細(xì)胞壁部分中缺失的蛋白帶(條帶4)。條 帶9中顯示在相同部分中蛋白酶活性成功喪失。圖17表示聚組氨酸肽的氨基酸序列和編碼該聚組氨酸肽的核苷酸序 列。該核苷酸序列包括pSEC194NHisC6結(jié)構(gòu)中保留的部分MCS，得到
整合肽的全長(zhǎng)。插入的肽的總長(zhǎng)為13個(gè)氨基酸。圖18為下列菌株的CS部分的考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠照片: 條帶1 ，嗜堿芽孢桿菌Alk36 WT;條帶2，含有pSEC194NC6的BhFC04; 條帶3，含有pSEC194NHisC6的BhFC04;以及條帶4，分子量標(biāo)準(zhǔn)。照 片右邊顯示各種分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)的位置。圖19為考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠照片，顯示在含有 pSEC194NHisC6的BhFC04菌株的CS部分上的展示的聚組氨酸標(biāo)記物 與金屬結(jié)合。條帶l，分子量標(biāo)準(zhǔn)；條帶2， pSEC194NHisC6(洗脫的)； 條帶3， pSEC194NC6(洗脫的)；條帶4， pSEC194NC6 (微球)；條帶5， pSEC194NHisC6 (微球)；條帶6， pSEC194NHisC6 (流過的)；條帶7， pSEC194NC6 (流過的)。照片左邊顯示分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)的位置。箭頭指 示鞭毛蛋白融合蛋白的位置。注意由于聚組氨酸標(biāo)記物的存在， pSEC194NHisC6融合蛋白(條帶2)的結(jié)合成功。圖20表示HIV gpl20肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)以及編碼該肽 的核苷酸序列(SEQ ID NO:16)。該核苷酸序列包括在pSEC194NHivC6結(jié) 構(gòu)中保留的部分MCS。 圖21為各種菌株的CS部分的考馬斯藍(lán)染色的10% SDS-PAGE凝膠 照片，顯示攜帶HIV gpl20抗原肽的鞭毛蛋白融合蛋白。條帶l，含有 pSEC194HivNC6的BhFC04;條帶2， WT (野生型)嗜堿芽孢桿菌Alk36; 以及條帶3，分子量標(biāo)準(zhǔn)。照片右邊顯示各種分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)的位置。圖22為使用鞭毛蛋白特異性多克隆抗體染色的Western印跡照片。 條帶l， BhFC04+pSECNHivC6;條帶2， BhFC04+pSECNHisC6;條帶3， BhFC04+pSECNC6;條帶4， BhFC04;條帶5，嗜堿芽孢桿菌Alk36;條 帶6，分子量標(biāo)準(zhǔn)。照片右邊顯示分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)的位置。照片右邊的 箭頭指示過表達(dá)的鞭毛蛋白(34kDa)蛋白的位置。圖23表示編碼成熟脂肪酶的喜熱噬油芽孢桿菌(Geo5fl"7/w Ae，o/eovoraw)的A基因的區(qū)域的核苷酸序列(SEQ ID NO: 17)以及該 成熟脂肪酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:18)。圖24為從攜帶有pSEC194NLipC3結(jié)構(gòu)的BhFC04分離的各種蛋白
部分中的脂肪酶活性的酶譜照片。顯示了EX(條帶1)， CS(條帶2和條 帶3)， CW(條帶4)和IC (條帶5)部分。注意EX部分沒有顯示脂肪酶 活性。條帶6，分子量標(biāo)準(zhǔn)。照片右邊顯示各種分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)的位置。 照片左邊的箭頭指示具有約76kDa分子量的鞭毛蛋白(FIiC):脂肪酶(Lip)融合蛋白的位置。圖25顯示在生長(zhǎng)8、 24和48小時(shí)后，含有pSEC194NC6 (脂肪酶陰 性對(duì)照)或者pSEC194NLipC的BhFC04細(xì)胞的胞外和整個(gè)細(xì)胞脂肪酶活 性(以單位OJ)/mg蛋白表示)的柱狀圖。圖26表示嗜堿芽孢桿菌vvp^細(xì)胞壁蛋白酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)。
具體實(shí)施方式
下面描述本發(fā)明的各個(gè)方面?；诒廾鞍椎娜诤系鞍?FBFP)本發(fā)明的特征在于有廣泛用途的FBFP。 FBFP含有全部或部分細(xì)菌 鞭毛蛋白，以及代替鞭毛蛋白可變區(qū)或位于鞭毛蛋白可變區(qū)內(nèi)的異源多 肽序列。FBFP能被轉(zhuǎn)運(yùn)到產(chǎn)生FBFP細(xì)菌細(xì)胞的表面上并在其上進(jìn)行表 達(dá)。本文使用的"在細(xì)菌細(xì)胞的表面上進(jìn)行表達(dá)"的蛋白是指直接或間 接附著到細(xì)菌細(xì)胞壁的蛋白(例如作為細(xì)菌鞭毛組分的蛋白)或者位于細(xì) 胞壁內(nèi)的蛋白。在任一種情況下，全部或部分蛋白暴露在細(xì)菌細(xì)胞外部， 并可以與細(xì)菌細(xì)胞外面的適宜物質(zhì)相互作用，這些物質(zhì)例如是金屬離子、 酶底物、免疫系統(tǒng)細(xì)胞上的受體(例如B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞(CD4+和/ 或CD8+)、自然殺傷(NK)細(xì)胞或者抗原呈遞細(xì)胞(APC)例如巨噬細(xì)胞、單 核細(xì)胞、交指樹突狀細(xì)胞(本文稱為樹突細(xì)胞)以及B淋巴細(xì)胞。FBFP的鞭毛蛋白部分可以是任意的細(xì)菌鞭毛蛋白，但優(yōu)選革蘭氏陽 性菌鞭毛蛋白。相關(guān)的革蘭氏陽性菌屬包括但不限于梭菌屬 (C7ostrW謂)、葡萄球菌屬(&—_y/ococc—、乳酸乳球菌屬(丄a"ococ面)、 乳桿菌屬(丄a"oZ)ac"/w)、 鏈球菌屬(&reWococcw)和f連霉菌屬 C^"印tomj;c^)。特別相關(guān)的是芽胞桿菌屬的細(xì)菌。有用的種類包括枯草芽孢桿菌CSac〃/w w6"fe)、嗜堿芽孢桿菌(Bacz'〃ws a汰a/o/7/n7w)、淀粉液 化芽孢桿菌(5flc/〃tw纖盧/一e/flc/ews)、 短芽孢桿菌(5fl"'〃w51 6rev")、環(huán) 太芽孢桿菌C5鏡'〃w c/簡(jiǎn)/應(yīng))、克勞氏芽孢桿菌(5鏡'腸c/謹(jǐn)")、凝結(jié) 芽孢桿菌(5(2"'〃z^ coagw/fl"力、堅(jiān)固芽孢桿菌(5fl"'〃1^力Ymw)、 Bflc〃/"s /aw&s 、 緩慢芽胞桿菌C5a"'〃w /e"/i^)、 地衣芽孢桿菌C8acz'〃w //cAem/orm^)、巨大芽子包桿菌(5acZ〃iw mega"r,m附)、失豆小芽子包豐干菌(5(3"7/w51 ; mw〃mjO、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(5flc〃/w51 5^ara^^rmo/ /n7w力或者蘇蕓金芽孢 桿菌(5"z7/ms ,/mn'wg,e"&);或者鏈霉菌屬菌株例如變鉛青鏈霉菌，或者乳酸乳球菌株例如乳酸乳球菌乳亞種(/^"OCOCCM /flC他)。特別有用的種類是嗜堿芽孢桿菌，鞭毛蛋白可以是具有圖7所示的 氨基酸序列(SEQ ID NO:2)和圖3所示的編碼序列(SEQ ID NO:l)的鞭毛 蛋白。FBFP的鞭毛蛋白部分可以包括整個(gè)鞭毛蛋白分子或者部分鞭毛蛋 白分子。如實(shí)施例2所記載的那樣，來源于不同細(xì)菌的鞭毛蛋白分子具 有相對(duì)較高同源性的區(qū)域，其包括N-端和C-端保守區(qū)和內(nèi)部可變區(qū)。通 過將任意相關(guān)的細(xì)菌鞭毛蛋白的氨基酸序列與實(shí)施例2所引用的一種或 多種細(xì)菌鞭毛蛋白或者SEQIDNO:2進(jìn)行序列對(duì)比，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以確定在相關(guān)的鞭毛蛋白中這三個(gè)區(qū)域的位置。例如，F(xiàn)BFP可以缺少全部或者部分蛋白可變區(qū)。在嗜堿芽孢桿菌鞭 毛蛋白(SEQ ID NO:2)中，為具有272個(gè)氨基酸的多肽，其可變區(qū)位于 54-202位氨基酸，對(duì)應(yīng)于其編碼序列(SEQ ID NO:l)的162-606位核苷酸， 保守的N和C端區(qū)域位于可變區(qū)兩端(g卩，SEQ ID NO:2的1-53位氨基 酸和203-272位氨基酸，分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:l的1-161位核苷酸和 607-816位核苷酸)。在對(duì)鞭毛蛋白序列進(jìn)行這些修飾時(shí)，如果在細(xì)菌細(xì) 胞中進(jìn)行修飾，那么所需要的是FBFP能被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌細(xì)胞表面上并在 其上進(jìn)行表達(dá)?？捎糜诒景l(fā)明的FBFP的異源多肽可以是任意多肽，除了 (a)從中 獲得FBFP的鞭毛蛋白衍生部分的特殊鞭毛蛋白；或者(b)該特殊鞭毛蛋 白的一部分。其可以代替全部或者部分相關(guān)的鞭毛蛋白可變區(qū)，或者其 可以被插入到完整的可變區(qū)內(nèi)。當(dāng)代替部分可變區(qū)時(shí)，可缺失的可變區(qū) 氨基酸達(dá)148個(gè)(例如145、 140、 135、 130、 125、 120、 115、 110、 105、
100、 95、 90、 85、 80、 75、 65、 60、 55、 50、 45、 40、 35、 30、 25、 20、 15、 12、 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3或2個(gè))。所述異源多肽可以為任意 長(zhǎng)度，優(yōu)選長(zhǎng)度為5-450位氨基酸(例如，5-450、 5-200、 5-150、 5-100、 5-50、 5-40、 5-30、 5-20、 5-15、 5-10、 10-450、 10-200、 10-150、 10-100、 10-50、 10-40、 10-30、 10-20、 10-15、 20-450、 20-200、 20-150、 20-100、 20-50、 20-40或者20-30)。此外，在所述異源多肽的N-端或C-端或者這兩端，可具有將該異源 多肽從鞭毛蛋白衍生序列分離的"接頭"氨基酸?？梢詫⑦@些氨基酸作 為切割位點(diǎn)插入(參見下文)，或者作為使異源多肽呈現(xiàn)適宜三維結(jié)構(gòu)的部 分插入，和/或這些氨基酸表現(xiàn)出將適宜的限制性位點(diǎn)包含在用于可重組 地獲得FBFP的基因結(jié)構(gòu)中(參見下文)。這些接頭長(zhǎng)度可以為1-20位氨 基酸(例如，1-15、 1-12、 1-10、 1-9、 1-8、 1-7、 1-6、 1-5、 1-4、 1-3或者 1-2)。在FBFP中位于所述異源多肽每端的切割位點(diǎn)將使得任選包含來自 接頭的殘基的異源多肽從FBFP上切離并以其切離形式使用。當(dāng)所述 FBFP是化學(xué)方法得到時(shí)，許多可切割交聯(lián)接頭(例如，雙功能的可切割 交聯(lián)接頭)在本領(lǐng)域中是公知的，并且可以包括在其中?？蛇x擇的是，如 果所述FBFP是重組獲得時(shí)，可以將其他的切割位點(diǎn)"設(shè)計(jì)"在FBFP中。 化學(xué)切割方法的例子是利用在所述異源多肽任一端的一個(gè)甲硫氨酸殘基插入(緊鄰N端和C端或者被一個(gè)或多個(gè)接頭殘基從末端隔離)。隨后使 用溴化氰可容易地切割異源多肽。第二個(gè)例子是利用在所述異源多肽任 一端的一個(gè)半胱氨酸殘基(對(duì)甲硫氨酸殘基所述的位置)，隨后使用NTCB (2-硝基-5-氰硫基苯甲酸酯)進(jìn)行切割。酶切割是利用具有酶活性的能識(shí)別 特異氨基酸序列的內(nèi)切蛋白酶。 一個(gè)例子是內(nèi)切精氨酸C半胱氨酸蛋白 酶，其識(shí)別氨基酸序列Arg-X，其中X可以是任意氨基酸。因此，這種 方法需要在異源多肽的每一端加入兩種氨基酸。另一例子是內(nèi)切賴氨酸 C絲氨酸蛋白酶，其識(shí)別Lys-X序列，其中X可以是任意氨基酸。同樣， 需要在異源多肽的每一端加入兩種氨基酸?？梢允褂貌煌拿负突瘜W(xué)切 割方法的不同組合以確保除去所有不期望的氨基酸?？梢詫愒炊嚯?，或者當(dāng)使用一個(gè)或多個(gè)接頭時(shí)，可以將異源多肽 和接頭緊鄰SEQ ID N0:2的54-202位氨基酸之間的任意核苷酸之后插 入、SEQIDNO:2的147-190位氨基酸之間的任意核苷酸之后插入、SEQ ID NO:2的150-184位氨基酸之間的任意核苷酸之后插入或者SEQ ID NO:2的153-180位氨基酸之間的任意氨基酸之后插入。例如可以將異源 多肽緊鄰SEQ ID NO:2的153或者180位氨基酸之后插入。當(dāng)相關(guān)的鞭 毛蛋白具有不同于SEQ ID NO:2的氨基酸序列(嗜堿芽孢桿菌的氨基酸序 列)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過將相關(guān)的氨基酸序列與SEQIDNO:2進(jìn)行序 列對(duì)比，將能預(yù)測(cè)所述的鞭毛蛋白中與上面所列的SEQ IDNO:2的氨基 酸相應(yīng)的氨基酸，并因此能預(yù)測(cè)插入異源多肽的適宜位置，或者當(dāng)使用 一個(gè)或多個(gè)接頭時(shí)，將插入相關(guān)的異源多肽和接頭的適宜位置。此外， 如果結(jié)構(gòu)中含有短于整個(gè)蛋白編碼序列的序列時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容 易地確定與上述SEQ ID NO:2的那些位置相應(yīng)的位置。本發(fā)明的特征還在于FBFP的鞭毛蛋白部分或異源多肽部分具有保 守性替換的FBFP。保守性替換通常包括以下組的替換甘氨酸和丙氨酸； 纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酸鹽、 絲氨酸和蘇氨酸；賴氨酸、組氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。 每部分含有不超過30個(gè)(例如，不超過25、 20、 15、 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2或者1個(gè))保守性替換。如上所述，在進(jìn)行上述任意的序列修飾時(shí)，如果在細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行 修飾，所需要的是FBFP能被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌細(xì)胞表面上并在其上進(jìn)行表達(dá)。相關(guān)的異源多肽包括但不限于那些對(duì)下列方面有用的異源多肽生 物整治、生物采礦、酶介導(dǎo)的底物轉(zhuǎn)變、在多種哺乳動(dòng)物的任意一種中 作為用于激活免疫應(yīng)答的免疫原、用于制備免疫原制劑、作為在治療或 者預(yù)防方法以及治療應(yīng)用的方法中使用的物質(zhì)或者組合物。生物整治是這樣一種方法，當(dāng)液體(例如飲用水)流過固體底物時(shí)，通 過將有毒物質(zhì)結(jié)合到固體底物上而將有毒物質(zhì)(例如重金屬離子或者原 子)從該液體中除去，使得該液體對(duì)于動(dòng)物(例如人)飲用是安全的。生物 采礦涉及在液體中將有用的和/或貴金屬離子或者原子結(jié)合到固體底物 上，然后從該固體底物回收金屬原子或者離子。為了達(dá)到這些目的，可 以使用特定的金屬結(jié)合多肽。下面將更詳細(xì)地描述這些方法。可以作為 異源多肽并入本發(fā)明FBFP的相關(guān)多肽包括那些己知的結(jié)合到多種重金 屬離子、有用金屬離子、貴金屬離子和/或有毒金屬離子上的多肽，相關(guān)的金屬包括但不限于鎳(Ni)、鎘(Cd)、金(Au)、鉑(Pt)、鈀(Pd)、鈦(Ti)、 銅(Cu)和銀(Ag)。因此，己經(jīng)顯示例如聚組氨酸(例如六聚組氨酸)多肽結(jié) 合到Cd、Ni和Cu。此外，已經(jīng)顯示Ag結(jié)合到具有NPSSLFTYLPSD (SEQ ID NO:20)氨基酸序列的多肽。已經(jīng)顯示Pd結(jié)合到具有CSVTQNKYC (SEQ ID NO:21)、 CSPHPGPYC (SEQ ID NO:22)以及CHAPTPMLC (SEQ ID NO:23)氨基酸序列的多肽。已經(jīng)顯示Pt結(jié)合到具有CDRTSTWRC (SEQ ID NO:24)、 CQSVTSTKC (SEQ ID NO:25)禾卩CSSSHLNKC (SEQ ID NO:26)氨基酸序列的多肽。已經(jīng)顯示Ti結(jié)合到具有RKLPDAPGMHTW (SEQ ID NO:27)氨基酸序列的多肽(Kriplani和Kay (2005)， Curr Opinion Biotechnol， 16:470-475)。因此，所有這些多肽均可用作本發(fā)明FBFP中 的異源多肽。對(duì)特定底物的大容量轉(zhuǎn)變(例如在發(fā)酵槽中)得到期望產(chǎn)物的有用的 許多酶(或者這些酶的功能片段)也可以作為異源多肽插入本發(fā)明的 FBFP。相關(guān)的酶包括但不限于例如淀粉酶、蛋白酶、酯酶以及纖維素酶 等水解酶。特別相關(guān)的是如實(shí)施例8所述的脂肪酶。酶的"功能片段" 是酶的片段，其比成熟酶的全長(zhǎng)更短，其將底物轉(zhuǎn)變?yōu)橄嚓P(guān)產(chǎn)物的能力 為全長(zhǎng)野生型酶的至少20%(例如，至少30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 98%、 99%、 100%或更高)。在哺乳動(dòng)物內(nèi)，對(duì)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答有用的免疫原多肽(參見下文)也可用 作異源多肽。這些多肽可以是全長(zhǎng)的成熟多肽或者這些多肽的肽片段。 免疫原多肽可來源于例如任意的多種感染性的(例如，細(xì)菌、真菌(包括酵 母)病毒或者寄生蟲(例如原生寄生蟲))微生物或者癌細(xì)胞。相關(guān)微生物的 例子包括但不限于結(jié)核分枝桿菌(M少coZ a"eha加Z)en^/o&)、腸炎沙門氏 菌(Sfl/mo"e〃a e"&nWto)、 單核細(xì)胞增生李斯特菌(h'We〃》 mo"oc,ge"es)、麻風(fēng)分枝桿菌(M /印麼)、金黃色葡萄球菌OSVa/ A;;/ococ面 a"retw)、 大腸桿菌(￡^cAen'c/n'a 、 月市炎鏈球菌(&re;^ococciw; "ewmo"/ae)、伯氏疏螺旋體C8o玎e/^ Z wgfifor/en〕、胸膜肺炎放線桿菌 (^cri"o6ac/〃"s / /ewra/ "e謹(jǐn)cw'ae)、 幽門螺桿菌(//6//006 3"￡廠p_y/on.)、 腦膜 炎奈瑟菌(A^&en力mem'wg"/flfc)、小腸結(jié)腸炎耳卩爾森氏菌(&"Zm'a ew&raco/"/ca)、 百日咳桿菌C8ora e&〃a / eW"M&)、牙齦B卜啉單胞菌 (尸o^7 A^ro附owfl51 g/wg/va//"、 支原{本(m少cop/flsmfl)、 莢膜纟且纟只胞槳菌 (7f/加/ /fl纖a ca/ 5^toMm)、 新型隱球菌(0，tococcM51 "eo/o，fl"5")、砂目艮披 衣菌(C7z/(3m;^/fl Zrac/ oma//5)、 白色念珠菌(Cam/Z(ifl fl/6/ca7w)、惡性癥疾原 蟲(尸/as7MO(i/wm/a/";parw附)、溶組織內(nèi)阿米巴CfiV^amoe^; AfWo(y"'ca)、布氏 弓開》蟲(7b義o/ /ayma Z n/ce/)、剛地弓形蟲(7b;co; /flsma！ go"A7)、碩大利什曼 原蟲(丄e^Amam'a mq/or)、人類免疫缺陷病毒1和2、流感病毒、麻疹病毒、 狂犬病病毒、肝炎病毒A， B和C、輪狀病毒、乳頭狀瘤病毒、呼吸道 融合瘤病毒、貓免疫缺陷病毒、貓白血病毒以及猿猴免疫缺陷病毒。相 關(guān)的微生物蛋白的例子包括但不限于大腸桿菌不耐熱腸毒素的B亞單元 [Konieczny等人(2000) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 27(4):321-332]、 熱休克蛋白，例如小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌熱休克蛋白60 [Konieczny等人 (2000)，同上；Mertz等人(2000) J. Immunol. 164(3):1529-1537]、結(jié)核分 枝桿菌熱休克蛋白hsp60和hsp70、砂眼披衣菌外膜蛋白[Ortiz等人(2000) Infect. Immun. 68(3):1719-1723]、伯氏疏螺旋體外膜蛋白[Chen等人(1999) Arthritis Rheum. 42(9):1813-1823]、碩大利什曼原蟲GP63 [White等人 (1999) Vaccine 17(17):2150-2161(公開在Vaccine 17(20-21):2755)的勘誤 表]、腦膜炎奈瑟菌腦膜炎球菌血清型15PorB蛋白[Delvig等人(1997) Clin. Immunol. Immunopathol. 85(2);134-142]、牙齦葉啉單胞菌菌毛蛋白[Ogawa， (1994) J. Med. Microbiol. 41 (5):349-358]、大腸桿菌外膜蛋白F [Williams 等人(2000) Infect. Immun. 68(5):2535-2545]、流感病毒凝血素類和唾液酸 苷酶類、逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如HIV)、表面糖蛋白類(例如HIVgp160/120/41) 或者逆轉(zhuǎn)錄病毒tat或gag蛋白。此外，腫瘤相關(guān)抗原(TAA)或者TAA的肽片段可用作異源多肽。如 本文使用的"TAA"是由腫瘤細(xì)胞表達(dá)的分子(例如蛋白分子)，其(a)在 性質(zhì)上不同于在正常細(xì)胞中表達(dá)的配對(duì)物，或者(b)在腫瘤細(xì)胞中比在正 常細(xì)胞中得到更高水平的表達(dá)。因此，腫瘤抗原可以(例如，當(dāng)分子是蛋 白時(shí)，通過一個(gè)或者多個(gè)氨基酸殘基)不同于或者其可以與其在正常細(xì)胞 中表達(dá)的配對(duì)物相同。其優(yōu)選不被正常細(xì)胞表達(dá)?；蛘?，其可在腫瘤細(xì) 胞中以比在腫瘤細(xì)胞的正常配對(duì)物中高出至少2倍(例如高出2倍、3倍、 5倍、10倍、20倍、40倍、100倍、500倍、l，OOO倍、5,000倍或者15,000 倍)的水平進(jìn)行表達(dá)。相關(guān)癌癥的例子包括但不限于血液癌癥例如白血病 和淋巴瘤、神經(jīng)腫瘤例如星細(xì)胞瘤或者膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、乳腺 癌、肺癌、頭癌和頸癌、胃腸腫瘤例如胃癌或結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、 泌尿生殖系腫瘤例如卵巢癌、陰道癌、膀胱癌、睪丸癌、前列腺癌或陰 莖癌、骨腫瘤和血管腫瘤。相關(guān)的TAA包括但不限于癌胚抗原(CEA)、 前列腺特異性抗原(PSA)、 MAGE (黑色素瘤抗原)1-4、 MAGE 6以及 MAGE12、 MUC(粘蛋白)(例如MUC-1、 MUC-2等)、酪氨酸酶、MART (黑色素瘤抗原)、Pmel 17(gpl00)、 GnT-V基因內(nèi)區(qū)V序列(N-乙酰葡糖 胺轉(zhuǎn)移酶V基因內(nèi)區(qū)V序列)、前列腺Ca psm、 PRAME (黑色素瘤抗原)、 (3-連環(huán)蛋白、MUM-1-B(黑色素瘤普遍存在的變異基因產(chǎn)物)、GAGE(黑 色素瘤抗原)l、 BAGE(黑色素瘤抗原)2-10、 C-ERB2 (Her2/neu)、 EBNA (Epstein-Barr病毒核心抗原)1-6、 gp75、人類乳頭瘤病毒(HPV) E6和E7、 p53、肺耐藥蛋白(LRP)、 Bcl-2以及Ki-67?？勺鳛楫愒炊嚯牟⑷氡景l(fā)明FBFP的治療性多肽包括但不限于人生 長(zhǎng)激素(HGH)、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物(例如FUZEON和NEUPOGEN)、抗菌 肽(例如indolicidin、 buforin、乳鏈菌肽和trichogin)、對(duì)治療心血管疾病 有用的多肽(例如奈西立肽(nesiritide))以及對(duì)治療糖尿病有用的多肽(例 如liraglutide和促胰島素分泌'肽(insulinotropin))。通常，但不是必需的， 將這些異源多肽從FBFP切離，并在特定情況下，在給予適宜的哺乳動(dòng) 物受試者(例如人受試者或者患者)之前制成制劑。本發(fā)明的FBFP可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法合成。 此外，可以通過標(biāo)準(zhǔn)的體外重組DNA技術(shù)和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，使用編 碼適宜FBFP的核苷酸序列制備FBFP (例如下面實(shí)施例描述的那些技 術(shù))。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法構(gòu)建含有相關(guān)的編碼序列和適宜 的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。參見例如Sambrook等人，Mo/ecw/ar C7o/n'wg,爿丄a60raf07 Mfl肌fl/ (第二版)[Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.， 1989]以及Ausubel等人，Cw/rewZ /Vofoco/s / Mo/ecw/aT A'o/ogy [Green Publishing Associates and Wiley Interscience， N. Y.， 1989]中記載 的技術(shù)。
本發(fā)明的FBFP還包括上面描述的、但通過加入阻滯劑在氨基和/或羧基端進(jìn)行修飾以促進(jìn)相關(guān)FBFP存活的那些。這對(duì)于那些肽端易于被蛋白酶降解的情況(例如在哺乳動(dòng)物受試者內(nèi))很有用。這些阻滯劑可包括 但不限于其他相關(guān)的或者不相關(guān)的可被連接到被給予的肽的'氨基和/或羧基端殘基的肽序列。這可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的肽的化學(xué)合成過 程或者重組DNA技術(shù)完成?；蛘?，可以將阻滯劑例如焦谷氨酸或者本領(lǐng)域已知的其他分子連接 至氨基和/或羧基端殘基，或者在氨基端的氨基或在羧基端的羧基可以使 用不同的部分代替。同樣地，在給予之前，所述肽可共價(jià)或者非共價(jià)地 連接至藥學(xué)可接受的"載體"蛋白。其他相關(guān)的是基于FBFP的氨基酸序列設(shè)計(jì)的擬肽化合物。擬肽化 合物為具有基本與選擇的多肽的三維構(gòu)象相同的三維構(gòu)象(例如"肽基 序")的合成化合物。多肽基序提供了可以按照需求發(fā)揮功能的擬肽化合 物。擬肽化合物可具有其他增強(qiáng)其治療效果的特征，例如增加的細(xì)胞滲 透性和延長(zhǎng)的生物半衰期。擬肽通常具有部分或者完全非肽的骨架，但具有與該擬肽所基于的 肽中的氨基酸殘基的側(cè)基相同的側(cè)基。幾種類型的化學(xué)鍵，例如酯鍵、 硫酯鍵、硫代酰胺鍵、逆酰胺(retroamide)鍵、還原的羰基、二亞甲基和 酮亞甲基(ketomethylene)鍵是本領(lǐng)域已知的在構(gòu)建抗蛋白酶擬肽時(shí)對(duì)肽 鍵通常有用的取代基。核酸分子本發(fā)明的特征還在于編碼本發(fā)明的上述FBFP的核酸分子。在這些 核酸分子中，編碼FBFP的鞭毛蛋白衍生部分的序列、編碼異源多肽部 分的序列以及編碼任選接頭的那些序列被組合在一起，使得所有部分位 于適宜的開放閱讀框內(nèi)，從而在核酸分子編碼的FBFP中，每個(gè)部分具 有對(duì)應(yīng)于蛋白部分的氨基酸序列，由此產(chǎn)生所述蛋白，或者包括沒有進(jìn) 行任何特意修飾的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道如何構(gòu)建適宜的"框內(nèi)" 核酸分子。本發(fā)明的核酸分子還包括對(duì)于使用任意相關(guān)的異源多肽制備FBFP
有用的基因(DNA)結(jié)構(gòu)。該基因結(jié)構(gòu)含有全部或者部分前述任意鞭毛蛋 白的編碼序列，將該基因結(jié)構(gòu)插入編碼鞭毛蛋白可變區(qū)的編碼序列的區(qū) 域(在此也稱為"鞭毛蛋白編碼序列的可變區(qū)")，其是一種接頭核酸序列。作為接頭核酸接頭序列特別有用的是含有至少一個(gè)(例如2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 15、 17、 20或者甚至30個(gè))連續(xù)和/或重疊的限 制性酶識(shí)別/切割位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)(MCS)。限制性酶及其識(shí)別/切割序列 是本領(lǐng)域已知的，包括那些在下面實(shí)施例中記載的那些。這些MCS用于 插入編碼異源多肽的核苷酸序列。應(yīng)當(dāng)理解可以插入MCS，使得其核苷 酸序列的"下游"在適宜的框內(nèi)可讀或者不可讀。在編碼異源多肽的序 列插入后，所需要的是整個(gè)FBFP編碼序列位于正確的開放閱讀框內(nèi)。當(dāng)所述的鞭毛蛋白(或者部分鞭毛蛋白)為嗜堿芽孢桿菌鞭毛蛋白時(shí)， 可以將所述的接頭核酸序列(包括MCS)緊鄰SEQ ID NO:l的162-606位 核苷酸之間的任意核苷酸之后插入，例如緊鄰SEQ ID NO:l的441-570 位核苷酸之間的任意核苷酸之后插入，緊鄰SEQ ID N0:1的450-552位 核苷酸之間的任意核苷酸之后插入，緊鄰SEQ ID N0:1的459-540位核 苷酸之間的任意核苷酸之后插入?？梢詫⑺龅慕宇^核酸序列(包括MCS) 緊鄰例如SEQ ID N0:1的459或者540位核苷酸之后插入。當(dāng)相關(guān)的鞭 毛蛋白具有不同于SEQ ID N0:2的氨基酸序列(芽孢桿菌Ao/o^raw的 氨基酸序列)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過將相關(guān)的氨基酸序列與SEQ ID NO:2進(jìn)行序列對(duì)比，能夠預(yù)測(cè)該鞭毛蛋白的編碼序列中對(duì)應(yīng)于上面所列 的SEQ ID NO:l的那些核苷酸的核苷酸，因此可以預(yù)測(cè)插入相關(guān)的接頭 核酸序列的適宜位置。此外，如果所述結(jié)構(gòu)中包含短于整個(gè)鞭毛蛋白編 碼序列的序列時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定與上述SEQ ID NO:l的 那些位置相應(yīng)的位置。本發(fā)明還提供包含一個(gè)或多個(gè)(例如2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 或更多個(gè))本發(fā)明的基因(DNA)結(jié)構(gòu)的試劑盒。所述結(jié)構(gòu)通常作為并入表 達(dá)載體的成分。為了將編碼異源多肽的核苷酸序列插入所述結(jié)構(gòu)，該試 劑盒還含有一種或多種用于消化所述結(jié)構(gòu)的限制性酶。該試劑盒還可以 含有用于相關(guān)的限制性酶消化反應(yīng)的輔助試劑例如緩沖液、鹽溶液和/或 任意的其他試劑。此外，該試劑盒可以含有用于將編碼異源多肽的核苷 酸序列連接到所述結(jié)構(gòu)的連接酶(和如上所述的輔助試劑)。此外，該試劑 盒還含有對(duì)表達(dá)所述基因結(jié)構(gòu)有用的宿主細(xì)胞(本文所述的任意的宿主 細(xì)胞)。該試劑盒還可包括(例如在包裝材料上或者包裝插入物內(nèi))的關(guān)于 如何使用一種或多種適宜的限制性酶消化所述結(jié)構(gòu)、如何將編碼異源多 肽的核苷酸序列連接到所述結(jié)構(gòu)和/或在進(jìn)行上述連接后如何使用所述 基因結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的書面說明。本發(fā)明的編碼FBFP的核酸分子可以是cDNA、基因組DNA、合成 DNA或者RNA，可以是雙鏈或者單鏈的(即，正義鏈或反義鏈)。并且認(rèn) 為這些分子片段也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，這些分子片段可以通過例如 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備或者使用一種或多種限制性核酸內(nèi)切酶處理生 成?？梢酝ㄟ^體外轉(zhuǎn)錄制備核糖核酸(RNA)分子。不論編碼多肽的核酸 分子長(zhǎng)度如何，優(yōu)選為在正常的生理?xiàng)l件下可溶的核酸分子。本發(fā)明的核酸分子可含有天然存在的序列，或者與天然存在的序列 不同、但卻由于基因編碼的簡(jiǎn)并仍編碼同一多肽的序列。此外，這些核 酸分子不限于編碼序列，例如其還可以包括全部或部分位于編碼序列上 游或者下游的非編碼序列。本發(fā)明的核酸分子可通過合成(例如基于亞磷酰胺的合成)得到或者 通過生物細(xì)胞例如原核生物細(xì)胞(例如芽孢桿菌細(xì)菌或者大腸桿菌等細(xì) 菌)得到。還包括這些類型的核酸內(nèi)的核苷酸的組合或修飾。本發(fā)明的分離的核酸分子包括在天然狀態(tài)不存在的片段。因此，本 發(fā)明包括并入載體(例如質(zhì)?；蛘卟《据d體)或者并入異源細(xì)胞的基因組 (或者同源細(xì)胞的基因組，在不同于天然染色體位點(diǎn)的位置)的重組核酸分 子。重組核酸分子以及由此產(chǎn)生的用途將在下文討論。本發(fā)明還包括(a)載體(參見下文)，其含有前述的任意序列(包括編 碼序列片段)和/或其組分(即"反義"序列)；(b)表達(dá)載體，其含有任意的 可操作性地與一種或多種對(duì)編碼序列直接表達(dá)所需要的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯 調(diào)控元件(TRE;其例子將在下文給出)連接的前述序列(包括編碼序列片 段)；(c)編碼除FBFP之外的、與FBFP無關(guān)的序列的表達(dá)載體，而與FBFP 無關(guān)的序列例如是融合到FBFP的報(bào)告子、標(biāo)記物或者信號(hào)肽；以及(d) 基因工程設(shè)計(jì)的宿主細(xì)胞(參見下文)，其含有前述的任意表達(dá)載體并由此 表達(dá)本發(fā)明的核酸分子。上文所述的以及下文進(jìn)一步描述的TRE包括但不限于可誘導(dǎo)的和不 可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱子和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并驅(qū)動(dòng)或以其 他方式調(diào)控原核生物中基因表達(dá)的其他元件。這些調(diào)控元件包括但不限于由芽孢桿菌溫和噬菌體SP02 (5fl"'〃w temperature phage SP02)克隆的 啟動(dòng)子片段(Schoner等人，(1983) Gene 22: 47-57)、蔗糖可誘導(dǎo)的^cS 啟動(dòng)子(Lee等人，(2000)， Appl Environ Microbiol 66: 476-480)、來自枯 草芽孢桿菌的veg/啟動(dòng)子(Lam等人，(1998)， J Biotechnol 63: 167-177)、 a/^E啟動(dòng)子(Olmos Soto禾P Contreras-Flores ， (2003) Appl Microbiol Biotechnol 62: 369-373)、來自淀粉液化芽孢桿菌的Jm_y2啟動(dòng)子(Widner 等，(2000)， J Industrial Microbiol Biotechnol 25:204-212)以及溫度敏感性 的調(diào)控CI的啟動(dòng)子系統(tǒng)(Scofield等人，(2003)， Appl. Environ. Microbiol. 69:3385-3392)。特別相關(guān)的是D啟動(dòng)子，其為嗜堿芽孢桿菌鞭毛蛋白(/^g) 基因的天然啟動(dòng)子[Sakamoto等人，(1992) J. Gen. Microbiol. 138:2159-2166]。宿主細(xì)菌細(xì)胞的種或?qū)倏膳c獲得被宿主細(xì)胞表達(dá)的或者將被表達(dá)的 FBFP的鞭毛蛋白衍生序列的種或?qū)傧嗤?，或者也可不同。?yōu)選宿主細(xì)胞 和鞭毛蛋白衍生序列具有相同的屬，更優(yōu)選具有相同的種。此外，本發(fā)明提供微生物的基本純的培養(yǎng)物(例如微生物細(xì)胞，如細(xì) 菌細(xì)胞)。本文使用的微生物的"基本純的培養(yǎng)物"是這樣一種微生物的 培養(yǎng)物，其中相對(duì)于培養(yǎng)物中活的微生物(例如細(xì)菌細(xì)胞)總數(shù)，有小于約 40% (即，小于約35%、 30%、 25%、 20%、 15%、 10%、 5%、 2%、 1%、 0.5%、 0.25%、 0.1%、 0.01%、 0.001%、 0.0001%或者甚至更少)的微生物 是活的微生物細(xì)胞，而不是微生物。上下文中的術(shù)語"約"是指相關(guān)的 百分?jǐn)?shù)可為以特定百分?jǐn)?shù)的15%的幅度位于特定百分?jǐn)?shù)之上或者之下。 因此，例如約20%可以是17%-23%。這樣的微生物的培養(yǎng)物包括所述微 生物以及生長(zhǎng)、儲(chǔ)存或者運(yùn)輸?shù)慕橘|(zhì)。所述介質(zhì)可以是液態(tài)介質(zhì)、半固 態(tài)介質(zhì)(例如凝膠狀介質(zhì))或者冷凍狀介質(zhì)。所述培養(yǎng)物包括細(xì)胞，該細(xì)胞 在所述液體中或者在所述半固態(tài)介質(zhì)中/上生長(zhǎng)，或者在儲(chǔ)存介質(zhì)或運(yùn)輸
介質(zhì)(包括冷凍狀儲(chǔ)存或者運(yùn)輸?shù)慕橘|(zhì))中被儲(chǔ)存或者運(yùn)輸。所述培養(yǎng)物在 培養(yǎng)容器或者儲(chǔ)存容器或者基板中(例如培養(yǎng)皿、燒瓶或管，或者儲(chǔ)存瓶 或管)。本發(fā)明的微生物細(xì)胞可以作為例如冷凍細(xì)胞懸浮液(如在含有如甘 油或者蔗糖等冷凍保護(hù)劑的緩沖液中作為凍干細(xì)胞)進(jìn)行儲(chǔ)存。或者，其 可以作為例如由諸如流化床干燥或者噴霧干燥或者任意的其他適宜的干 燥方法得到的干燥細(xì)胞制劑進(jìn)行儲(chǔ)存。類似地，酶制劑可以冷凍、凍干 或者固定并在適宜條件下儲(chǔ)存以保持其活性。本發(fā)明還提供制備本發(fā)明的FBFP的方法。在所述方法中，培養(yǎng)表 達(dá)表達(dá)載體的細(xì)胞(本文記載的任意細(xì)胞)，該表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)化該細(xì)胞， 在該表達(dá)載體中，核苷酸序列可操作性地與一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)控元件連接。然后(例如從培養(yǎng)物中回收)得到所述FBFP。從培養(yǎng)物中得 到或者回收FBFP可能涉及從細(xì)胞或者從培養(yǎng)介質(zhì)中分離FBFP。本發(fā)明 的FBFP通過鞭毛蛋白通道從表達(dá)它們的重組細(xì)胞被活性分泌，并保持 以鏈長(zhǎng)達(dá)20 000個(gè)單體附著于該細(xì)胞表面，其可以通過例如機(jī)械剪切從 該細(xì)胞表面得到活性分離而進(jìn)入培養(yǎng)介質(zhì)?；蛉睋p的細(xì)胞在本發(fā)明大多數(shù)的細(xì)胞的特定基本純的培養(yǎng)物中以及在特定的分離 細(xì)胞中，內(nèi)源鞭毛蛋白基因是缺損的，使得其既不編碼鞭毛蛋白也不編 碼非功能鞭毛蛋白。本文使用的"培養(yǎng)物中的大多數(shù)細(xì)胞"至少為培養(yǎng) 物中細(xì)胞的60%(例如至少為70%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%、 99%、 99.5%、 99.8%或者甚至100%)。本文使用的"非功能鞭毛蛋白"為不能 被轉(zhuǎn)運(yùn)到制備它的細(xì)胞表面的鞭毛蛋白和/或不能在制備它的細(xì)胞表面 進(jìn)行表達(dá)的鞭毛蛋白。非功能鞭毛蛋白多肽的例子是缺少14-226位氨基 酸的嗜堿芽孢桿菌鞭毛蛋白(參見實(shí)施例4)。在使用編碼本發(fā)明的FBFP 的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，這些細(xì)胞用作在FBFP表面上制備和表達(dá)的宿 主細(xì)胞。使內(nèi)源基因缺損的方法為本領(lǐng)域已知的方法，通常涉及同源重 組。特別有用的方法為實(shí)施例4中描述的強(qiáng)制整合方法或者由其改變的 方法。
除了使功能鞭毛蛋白基因缺少之外，上述培養(yǎng)物中的大多數(shù)細(xì)胞(參 見上文)和分離的細(xì)胞可具有使用上述方法缺損的一個(gè)或多個(gè)編碼細(xì)胞 壁蛋白酶的基因。細(xì)胞壁蛋白酶基因的缺損導(dǎo)致不能制備相關(guān)的細(xì)胞壁蛋白酶或者非功能性細(xì)胞壁蛋白酶。本文使用的"非功能性細(xì)胞壁蛋白 酶"為具有比相關(guān)的野生型細(xì)胞壁蛋白酶的蛋白水解活性小20%(例如小10%、 5%、 2%、 1 %、 0.5%、 0.2%、 0.1%、 0.01%或者沒有蛋白水解活 性)的細(xì)胞壁蛋白酶。通過使一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞壁蛋白酶基因缺損，可以提 高由表達(dá)載體編碼的FBFP在相關(guān)的缺損細(xì)胞表面的表達(dá)水平，其中所 述表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)化該細(xì)胞。其中這樣的基因?yàn)榛?參見實(shí)施例 7)。其他的蛋白酶基因包括a;^、 vpr、印rX。所述細(xì)胞可以是本文提及的任意的屬、種、株的細(xì)菌細(xì)胞。缺少功能鞭毛蛋白基因和缺少細(xì) 胞壁蛋白酶基因的編碼序列的細(xì)菌細(xì)胞的例子為嗜堿芽孢桿菌的 BhFC04菌株(參見實(shí)施例7)。使用FBFP的方法 ,如上所述，F(xiàn)BFP可用于生物整治、生物采礦、酶介導(dǎo)的底物轉(zhuǎn)變以 及用作在各種哺乳動(dòng)物的任一種中作為用于激活免疫應(yīng)答的免疫原，但 不限于這些方面。因此，本發(fā)明的特征在于進(jìn)行生物整治、生物采礦、 酶介導(dǎo)的底物轉(zhuǎn)變、在制備免疫原制劑中的用途、作為在哺乳動(dòng)物受試 者體內(nèi)治療或者預(yù)防以及激活免疫應(yīng)答的方法中使用的物質(zhì)或組合物。生物整治和生物采礦如上所述，生物整治和生物采礦均涉及使液體例如水或者工業(yè)有毒 的廢料流或者來自于例如金和鉑礦的采礦液體與固體底物接觸，所述固 體底物適于與液體中的適宜金屬離子或者原子結(jié)合。對(duì)于生物整治的情 況，棄去其上結(jié)合有金屬原子或離子的固體底物或者通過洗脫并除去金 屬原子或離子將其進(jìn)行處理而實(shí)現(xiàn)再利用。對(duì)于生物采礦的情況，從固 體底物分離金屬原子或離子，并進(jìn)行進(jìn)一步的適宜處理。在本發(fā)明的生物整治和生物采礦過程中，可以將流體與在其表面表 達(dá)含有金屬結(jié)合異源多肽的FBFP的細(xì)菌(本文所列出的任意細(xì)菌)相接 觸。所述細(xì)菌可以是活的或者死的(例如熱殺死的)，可以將其裝入例如適
宜的過濾裝置。或者，可以將所述FBFP從適宜的重組細(xì)菌中分離出來， 并結(jié)合(例如共價(jià)結(jié)合)到固體底物(例如金屬、塑料、纖維素、瓊脂糖或 者合成的聚合物例如尼龍)。所述固體底物可以是例如薄片、微球、顆粒、 纖維或者線狀的形式。作為其他的替代形式，可以將所述異源多肽從所述的FBFP切割出去、分離并結(jié)合到上文所列的一種固體底物。使所述 流體流過或者流經(jīng)例如結(jié)合有FBFP (或異源多肽)的細(xì)菌或者底物的柱 或者床，調(diào)整流速使金屬原子或者離子與FBFP的結(jié)合最佳。根據(jù)金屬 原子或者離子與FBFP最佳結(jié)合的需要，所述液體可與FBFP (或異源多 肽)接觸一次或者多次。在生物整治中，所述流體隨后用于任何所希望的用途，例如作為飲 用水或者相關(guān)的工業(yè)工藝。FBFP源通常被棄去或者可以通過除去所述金 屬原子或離子進(jìn)行再生利用。對(duì)生物采礦的情況，從FBFP源回收金屬原子或者離子。其可以通 過將表達(dá)FBFP或者分離的FBFP的細(xì)菌處于水解條件下，例如酸性或者 堿性條件下，或者高濃度的帶正電的離子如EDTA中，使得金屬從所述 肽上解離，并可再次分離。酶介導(dǎo)的底物轉(zhuǎn)變?cè)诒景l(fā)明的這些方法中，相關(guān)的底物可以是酯類或者組成羧酸類和 醇類。組成分子可以是脂肪族、芳香族的或其組合，并可以含有其他官 能團(tuán)。所述的組成分子可以更大或者更小，并可用于食品(例如脂肪酸類、 薄荷醇)或藥物化合物或中間體(例如萘普生、布洛芬)中。脂肪酶類和酯 酶類可用于食品和飲料加工、生物整治或者精細(xì)化學(xué)品和藥品的合成。 對(duì)于后者，所述酶可用于化學(xué)區(qū)域選擇性或者立體選擇性。尤其是所述 脂肪酶類和酯酶類經(jīng)常用于立體選擇性合成或者酯類水解，因此可以從 外消旋的混合物拆分所需的手性化合物。在這種情況下，在產(chǎn)生足夠量的產(chǎn)物后，可停止反應(yīng)，并從反應(yīng)混 合物中提取產(chǎn)物或者分離產(chǎn)物。在這種情況下，反應(yīng)后，根據(jù)所需對(duì)組合物或者混合物進(jìn)行處理， 包括例如使酶失活和/或從FBFP源分離混合物或者組合物。
所述反應(yīng)可以在大體積發(fā)酵槽中進(jìn)行?？梢耘c上述用于生物整治和生物采礦相同的形式使用FBFP (或者從FBFP酶切割的異源多肽)。因此， 在其表面表達(dá)適宜的FBFP、分離的FBFP、或者從FBFP酶切割的異源 多肽的活的或者死的細(xì)菌可以直接加入含有酶底物的反應(yīng)混合物中?；?者，分離的FBFP或者從FBFP酶切割的異源多肽可以結(jié)合到上述固體底 物之一(例如瓊脂糖微球)。任選地和優(yōu)選地，將所述反應(yīng)混合物攪動(dòng)或者 攪拌。為了使細(xì)菌或者固體底物保持懸浮狀態(tài)，通過將例如在其表面或 者固體底物結(jié)合劑上表達(dá)FBFP的重組細(xì)菌用作FBFP源實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。在 預(yù)定用于產(chǎn)物生成和/或底物損耗的時(shí)間，將產(chǎn)物和/或損耗底物的組合物 或者混合物從FBFP源分離并根據(jù)需要進(jìn)行處理?；蛘?，可監(jiān)控所述反 應(yīng)， 一旦觀察到產(chǎn)物和/或底物損耗達(dá)到所需要的水平，就將所述產(chǎn)物和 /或損耗底物的組合物或者混合物從FBFP源分離出來并根據(jù)需要處理。 在從FBFP源分離所述產(chǎn)物和/或組合物或者混合物之前，可以任選停止 (例如通過加熱)酶反應(yīng)。激活免疫應(yīng)答的方法本發(fā)明的特征在于激活哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，這些方法中，將 免疫系統(tǒng)的細(xì)胞暴露于一種或多種本發(fā)明的FBFP中，在所述FBFP中， 異源多肽為免疫原多肽(參見上文)，或者將免疫系統(tǒng)的細(xì)胞暴露于從 FBFP切割的免疫原異源多肽中。在FBFP的情況下，將免疫系統(tǒng)的細(xì)胞 與分離的FBFP或者在其表面表達(dá)FBFP的重組細(xì)菌相接觸。這些細(xì)菌可 以是活的、死的或者是減毒的細(xì)菌?？梢员贿@些試劑激活的免疫應(yīng)答可 以是例如抗體生成(B淋巴細(xì)胞)應(yīng)答。為了產(chǎn)生MHC (主要組織相容性復(fù) 合體)I類或者II類限制性T細(xì)胞應(yīng)答，F(xiàn)BFP (或者分離的FBFP或者在 細(xì)菌表面上的FBFP)用于將肽表位引入抗原呈遞細(xì)胞(APC)。通過識(shí)別肽 表位通常僅產(chǎn)生這些應(yīng)答，該肽表位是通過對(duì)在適宜的APC內(nèi)合成的多 肽進(jìn)行處理產(chǎn)生的。此外，本發(fā)明的FBFP還可以通過細(xì)胞毒T淋巴細(xì) 胞(CTL)敏化用于溶菌作用(lysis)的靶細(xì)胞，該敏化對(duì)于FBFP含有的肽 表位(作為異源多肽)具有特異性。本發(fā)明的方法可以在體外、體內(nèi)或者間接體內(nèi)(ex Ww)的條件下進(jìn) 行。FBFP或者切割的免疫原異源多肽的體外應(yīng)用例如可用于免疫機(jī)制的 基礎(chǔ)科學(xué)研究，或者產(chǎn)生用于T細(xì)胞功能研究或者如被動(dòng)免疫治療研究 的激活T細(xì)胞。在本發(fā)明的體外方法中，使用FBFP(分離的或者在細(xì)菌表面表達(dá)的， 優(yōu)選死的細(xì)菌)和優(yōu)選但不是必需從與T細(xì)胞相同的個(gè)體得到的APC培 養(yǎng)從哺乳動(dòng)物受試者得到的T細(xì)胞(CD4+和/或CD8+)。在從不同個(gè)體得 到APC的情況下，通常T細(xì)胞的給體和APC的給體優(yōu)選表達(dá)至少一種 主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子(例如MHC的I類分子)。APC基本上 可為任意的MHC分子表達(dá)細(xì)胞。如果想誘導(dǎo)MHC I類限制性免疫應(yīng)答， APC將表達(dá)MHCI類分子(和任選的MHC II類分子)，如果想要誘導(dǎo)MHC II類限制性免疫應(yīng)答，APC將表達(dá)MHC II類分子(和任選的MHC I類分 子)。APC最佳地還表達(dá)一種或多種共刺激分子，例如B7族分子。因此， APC可以是例如樹突狀細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞、或者 是從任意的這些細(xì)胞產(chǎn)生(克隆或者非克隆)的細(xì)胞系。它們還可以是使用 編碼適宜MHC分子的多核苷酸轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)并表達(dá)多核苷酸編碼的任意 類型的細(xì)胞(例如纖維原細(xì)胞)。還可以使用一種或多種細(xì)胞因子或者生長(zhǎng) 因子補(bǔ)充這些培養(yǎng)物，例如但不限于IL-1、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-6、 IL-7、 IL-12、 IL-13、 IL-15、 IFN-、腫瘤壞死因子-a (TNF-a)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞 集落刺激因子(GM-CSF)或者粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)等?？梢允褂?FBFP或者切割的免疫原異源多肽根據(jù)需要經(jīng)常地"再刺激"這些培養(yǎng)物。 還可以在不同時(shí)間監(jiān)控所述培養(yǎng)物以確定免疫反應(yīng)性(例如CTL活性)是 否己達(dá)到所希望的水平。FBFP (和從FBFP切割的免疫原異源多肽)通常作為用于產(chǎn)生免疫應(yīng) 答的預(yù)防疫苗或者免疫應(yīng)答刺激治療劑、作為治療或者預(yù)防方法中使用 的物質(zhì)或者組合物以及用于制備在治療或者預(yù)防方法中使用的免疫原制 劑。因此，可以將它們用作例如治療由于本文所列的任意病原體的傳染 性疾病的免疫原制劑、疫苗或者治療劑。還可以將免疫原肽作為與鞭毛 蛋白的融合蛋白而給予。這將增強(qiáng)靶生物體的免疫原應(yīng)答，因?yàn)楸廾?白與佐劑(一種處方或者溶液的成分，其便于發(fā)揮或者改變主要成分的作 用)具有相同的效果。佐劑具有刺激內(nèi)在的免疫性并反過來激活適應(yīng)性免 疫應(yīng)答的能力。已經(jīng)建立起通過激活A(yù)PC誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)(參見上文)。
一個(gè)例子是成功產(chǎn)生和表達(dá)鞭毛蛋白增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)融合蛋白。鞭毛蛋白-EGFP融合蛋白能刺激APC應(yīng)答和特異性的抗EGFP T-細(xì) 胞應(yīng)答。單獨(dú)的EGFP既不能刺激APC應(yīng)答，也不能刺激特異性的T-細(xì)胞應(yīng)答(Cuadros等人，2004， Inf. Immun. Vol 72， 2810-2816， McSorley 等人，2002， J. Immunol. Vol 169, 3914-3919)。其他插入到誘導(dǎo)免疫應(yīng)答 的鞭毛蛋白中的肽包括霍亂毒素亞單元B、乙型肝炎表位、化膿性鏈球 菌M蛋白表位、HIV表位(gp41、 gpl20)、流感A紅血球凝集素表位和 來自瘧疾原蟲、Rota病毒、白喉棒狀桿菌以及腦膜炎球菌外膜蛋白等的 各種細(xì)胞表面抗原(Stocker和Newton， 1994， Intern. Rev. Immunol. Vol 2， 167-178)。此外，F(xiàn)BFP (和從FBFP切割的免疫原異源多肽)可用于癌癥(例如上 述提到的任意癌癥)的治療方法；對(duì)于那些具有相對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)患癌癥的受試 者(例如對(duì)于吸煙者為肺癌，或者對(duì)于有很多色素痣的受試者為黑色素 瘤)，可以將適宜的融合劑用作疫苗。本文使用的"預(yù)防"是指疾病癥狀的完全阻止、疾病癥狀發(fā)作的延 遲或者減輕后遺癥的嚴(yán)重程度。本文使用的"治療"是指疾病癥狀的完 全消除或者減輕疾病癥狀的嚴(yán)重程度。應(yīng)當(dāng)理解，由FBFP (和從FBFP切割的免疫原異源多肽)產(chǎn)生的免疫 應(yīng)答優(yōu)選為預(yù)防和/或治療性的免疫應(yīng)答，但并不要求一定是是這樣的。 例如，F(xiàn)BFP (和從FBFP切割的免疫原異源多肽)可用作免疫應(yīng)答的基礎(chǔ) 科學(xué)研究，這種免疫應(yīng)答既不是預(yù)防性的也不是治療性的，其產(chǎn)生例如 用于測(cè)定或者純化多種任意的抗原(例如微生物抗原或者例如本文提及 的TAA)等中的抗體。本發(fā)明的方法可應(yīng)用于寬范圍的物種(species)，例如人、非人的靈長(zhǎng) 類(例如猴子)、馬、牛、豬、綿羊、山羊、狗、貓、兔子、豚鼠、倉鼠、 大鼠和小鼠。體內(nèi)方法在一種體內(nèi)方法中，將FBFP自身、在其表面表達(dá)FBFP的細(xì)菌(例 如共生細(xì)菌)或者從FBFP切割的免疫原異源多肽給予受試者。通常將本
發(fā)明的融合劑懸浮在藥學(xué)可接受的載體(例如生理鹽水)中，并口服給予， 或者經(jīng)皮給予，或者靜脈、皮下、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)、鼻 內(nèi)、胃內(nèi)、氣管內(nèi)或者肺內(nèi)注射(或灌注)給予。可以直接將其輸送到適宜 的淋巴組織(例如脾、淋巴結(jié)或者粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT))。所需劑量 取決于給藥途徑、制劑性質(zhì)、患者疾病的性質(zhì)、受試者身高、體重、體 表面積、年齡和性別、給予的其他藥物以及主治醫(yī)生的判斷。合適的劑量是0.001-10.0 mg/kg的分離的FBFP或者從FBFP切割的免疫原異源多 肽。根據(jù)得到的FBFP(和從FBFP切割的免疫原異源多肽)的不同以及各 種給藥途徑的效果不同，所需劑量范圍可以在寬范圍內(nèi)變化。例如，預(yù) 期口服給藥比靜脈注射給藥所需要的劑量更高?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人 員公知的用于優(yōu)化劑量水平的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法調(diào)整這些劑量水平的變化。 給藥可以是單倍或者多倍(例如，2-或3-、 4-、 6-、 8-、 10-、 20-、 50-、 100-、 150-或者更多倍)。將多肽包封在適宜的遞藥載體(例如聚合物微粒 或者可植入裝置)中可以提高遞藥、特別是口服遞藥的效果?；蛘?，可以將含有編碼相關(guān)FBFP的核酸序列的多核苷酸輸送到動(dòng) 物的適宜細(xì)胞內(nèi)。編碼序列的表達(dá)將優(yōu)選指向受試者的淋巴組織，例如 將多核苷酸輸送到淋巴組織。這可以通過使用例如生物可降解的聚合物 微?；蛘呶⒛z囊遞藥載體，通過調(diào)整其尺寸以優(yōu)化嗜菌細(xì)胞(例如巨噬細(xì) 胞)的嗜菌作用來實(shí)現(xiàn)。例如可以使用直徑大約為l-l(Him的PLGA(聚乳 酸—乙醇酸共聚物)微粒。將多核苷酸包封在這些微粒中，這些顆粒被巨噬細(xì)胞吸收，并逐漸在細(xì)胞內(nèi)得到生物降解，從而釋放多核苷酸。 一旦被 釋放，DNA將在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。第二種類型的微粒不是由細(xì)胞直接吸 收，而是主要作為核酸的緩釋儲(chǔ)藥庫，只有在通過生物降解將核酸從微 粒釋放出時(shí)才由細(xì)胞吸收。這些聚合物顆粒因此應(yīng)當(dāng)足夠大(例如大于 5pm，優(yōu)選大于20pm)，以排除嗜菌作用。另一種達(dá)到吸收核酸的方法是使用由標(biāo)準(zhǔn)方法制備的脂質(zhì)體。這些 載體可以單獨(dú)并入這些遞藥載體或者與組織特異性抗體一起并入。或者，可以制備由通過靜電力或者共價(jià)力連接到聚L-賴氨酸的質(zhì)粒或者其他載 體組成的分子綴合物。聚L-賴氨酸結(jié)合到配體，該配體可以結(jié)合到靶細(xì) 胞的受體上[Cristiano等人(1995)， , Mo/. MeA 73， 479]?；蛘撸ㄟ^使 用淋巴組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(TRE)，例如B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞或 者樹突狀細(xì)胞特異性TRE，可以實(shí)現(xiàn)淋巴組織的特異性靶向。淋巴組織 特異性TRE是已知的[Thompson等人(1992)， Mo/. Ce〃. 5"/. 12， 1043-1053; Todd等人(1993)， 177， 1663-1674; Penix等人(1993)， MW. 178， 1483-1496]。將"裸DNA"(即，沒有遞藥載體)傳送到肌內(nèi)、皮內(nèi)或者皮下的位點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)體內(nèi)表達(dá)的又一方式。在相關(guān)多核苷酸(例如表達(dá)載體)中，具有引發(fā)劑蛋氨酸和任選靶序列 的編碼相關(guān)FBFP的核酸序列可操作性地與啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子-啟動(dòng)子的 結(jié)合體連接。可以將多核苷酸在藥學(xué)可接受的載體中給予。藥學(xué)可接受的載體為 生物相容性載體，其適于給予人類或者其他哺乳動(dòng)物受試者，例如生理 鹽水。治療有效量為能夠在接受治療的動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生醫(yī)學(xué)上期望的結(jié)果 (例如T細(xì)胞應(yīng)答)的多核苷酸的量。作為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的公知常識(shí)，針對(duì)任 何一位患者的劑量取決于很多因素，包括患者的身高、體表面積、年齡、 給予的特定化合物、性別、給藥時(shí)間和途徑、基本健康狀況以及同時(shí)給 予的其他藥物。劑量可以變化，但優(yōu)選的多核苷酸的給予劑量大約為 106-1012個(gè)多核苷酸分子拷貝。如果需要，該劑量可以重復(fù)給予。給藥途 徑可以為如上所述的任意途徑。間接體內(nèi)方法在一種間接體內(nèi)方法中，將淋巴細(xì)胞(包括T細(xì)胞(CD4+和/或CD8+T 細(xì)胞))從受試者體內(nèi)分離出來，暴露在體外FBFP中(參見上文)。淋巴細(xì) 胞可以暴露一次或者多次(例如2、 3、 4、 6、 8或者10次)。在暴露一次 或者多次后，可以測(cè)試淋巴細(xì)胞中免疫活性的水平(例如CTL活性)。一 旦獲得期望的活性并且該活性達(dá)到期望的水平，通過本文所列的任意途 徑將所述細(xì)胞再次引入受試者體內(nèi)。這種間接體內(nèi)方法的治療或預(yù)防效 果取決于間接體內(nèi)激活淋巴細(xì)胞直接或間接發(fā)揮的中和效果或者細(xì)胞毒 效果的能力，該效果例如是針對(duì)傳染性微生物、被微生物感染的宿主細(xì) 胞或者腫瘤細(xì)胞。另一種間接體內(nèi)方法可涉及使用含有編碼FBFP的核苷酸序列的多
核苷酸轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)導(dǎo)從受試者體內(nèi)獲得的細(xì)胞。然后將轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)導(dǎo)的 細(xì)胞返回到受試者。盡管這類細(xì)胞優(yōu)選為淋巴細(xì)胞，其還可以是許多類 型的細(xì)胞，包括但不限于纖維原細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、 樹突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角化細(xì)胞或者肌細(xì)胞，其中只要這 些細(xì)胞在受試者體內(nèi)存活，其將作為融合蛋白的來源。在患有癌癥的受 試者體內(nèi)，所述細(xì)胞可以是癌細(xì)胞，例如，其自身的癌細(xì)胞或者來自于 其他個(gè)體的同類型的癌細(xì)胞，優(yōu)選通常與受試者具有一種或多種(例如1、2、 3、 4、 5或者6種)相同MHC分子的個(gè)體。使用淋巴細(xì)胞將特別有利 于這些細(xì)胞返回淋巴組織(例如淋巴結(jié)或者脾)，因而可以在發(fā)揮其作用 (例如激活免疫應(yīng)答)的位點(diǎn)產(chǎn)生高濃度的FBFP。使用這種方法，如同上 述的使用編碼融合劑的多核苷酸的方法，達(dá)到使用FBFP激活體內(nèi)免疫 作用的效果。記載的用于體內(nèi)方法的相同基因結(jié)構(gòu)和信號(hào)序列可用于間 接體內(nèi)方法。所述間接體內(nèi)方法包括以下步驟從受試者獲取細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、 使用表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)這些細(xì)胞、以及將這些細(xì)胞維持在適宜表達(dá)FBFP的 條件下。這些方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域己知的方法。所述轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟通過任 意用于間接體內(nèi)基因治療的標(biāo)準(zhǔn)方法完成，包括磷酸鈣轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)、 電穿孔法、病毒感染法以及生物導(dǎo)彈基因轉(zhuǎn)移法。或者，可以使用脂質(zhì) 體或者聚合物微粒。然后，選擇已經(jīng)被成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，例如用于表達(dá) FBFP或者表達(dá)耐藥基因。如果需要，這些細(xì)胞可以使用試劑(例如，x-或者Y-射線或者絲裂霉素C)進(jìn)行抑制細(xì)胞增殖的處理；通常處理的細(xì)胞 為癌細(xì)胞(尤其是來自受試者或者來自與受試者具有相同MHC的個(gè)體的 癌細(xì)胞)。然后，將這些細(xì)胞注射或者植入給患者。本發(fā)明的這些方法可用于本文所列的任意疾病和物種。用于測(cè)試 FBFP或者從FBFP切割的免疫原異源多肽是否對(duì)特定的疾病有治療或預(yù) 防效果的方法是本領(lǐng)域已知的。當(dāng)測(cè)試治療效果時(shí)，顯示疾病癥狀的受 試人群(例如癌癥患者)通過上述任意的方法使用測(cè)試FBFP或者從FBFP 切割的免疫原異源多肽進(jìn)行治療。同樣也顯示疾病癥狀的對(duì)照人群通過 相同的方法使用安慰劑進(jìn)行治療。受試者疾病癥狀的消失或減輕表明 FBFP或者從FBFP切割的免疫原異源多肽是一種有效的治療劑。
在疾病的癥狀發(fā)作之前，可以通過相同的方法對(duì)受試者使用FBFP 或者從FBFP切割的免疫原異源多肽，測(cè)試其作為預(yù)防劑即疫苗的效果。在此情況下測(cè)試其對(duì)疾病癥狀發(fā)作的阻止作用。相似的方法可用于測(cè)試FBFP和從FBFP切割的免疫原異源多肽在預(yù)防各種傳染性疾病例如上文 所列的涉及任意微生物的疾病中的效果。以下實(shí)施例用于解釋而非限定本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1嗜堿芽孢桿菌Alk36鞭毛蛋白的分離和測(cè)序以保藏號(hào)NCIMB41348保藏在NCIMB Culture Collection (NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn， Aberdeen, AB21 9YA)的嗜堿芽孢桿菌Alk36細(xì)菌的等分試樣在Luria肉湯(胰化蛋白胨10 g/l、酵母提取物5g/1、 NaC110g/1)、 pH8.5、 42°C下生長(zhǎng)不同時(shí)間直至 72小時(shí)。通過在SS34管中以7,000 rpm(轉(zhuǎn)/分鐘)離心10分鐘使細(xì)胞(30 ml)球化，制備所有試樣的細(xì)胞表面蛋白部分。取6ml上清液(胞外部分) 與10% (w/v)三氯乙酸(TCA; 6 ml)混合，并攪袢1小時(shí)。通過在Corex 玻璃管中以7,000 rpm離心20分鐘使蛋白球化，將其重懸于100^1試樣 緩沖液(lx)中，煮沸2分鐘，然后加樣到10y。SDS-PAGE(十二垸基硫酸 鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)凝膠上。將細(xì)胞小球重懸于蒸餾水(3 ml)和0.2N NaOH (3 ml)中，在室溫下攪 拌30分鐘。以7,000 rpm離心10分鐘使細(xì)胞球化，取上清液(6 ml)與10% (w/v)三氯乙酸(TCA; 6ml)混合，并攪拌1小時(shí)。通過在Corex玻璃管中 以7，000rpm離心20分鐘使沉淀的細(xì)胞表面蛋白球化，將其重懸于100|il 的試樣緩沖液(lx)中，煮沸2分鐘，然后加樣到10。/。SDS-PAGE(十二垸 基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)凝膠(每孔50嗎蛋白)上，使用標(biāo)準(zhǔn)方法分 離。高度表達(dá)的蛋白分離為對(duì)應(yīng)于 34kDa的條帶。該蛋白至少穩(wěn)定存在 72小時(shí)(圖1)。隨后將分離的蛋白部分印跡到Immobilon-P膜(Millipore Corporation, Billerica, MA)，用考馬斯藍(lán)
染色2分鐘，在脫色液(50% (v/v)甲醇；10% (v/v)乙酸)中脫色5
分鐘。將圖1的條帶4的 34kDa蛋白條帶切出，根據(jù)廠商的說明書，使 用Perkin Elmer Applied Biosystems (Foster City， CA， U.S.A) Precise 491測(cè)序儀通過N-端測(cè)序確定該印跡蛋白的氨基酸序列。得到前22位氨基 酸的序列(圖2)。實(shí)施例2嗜堿芽孢桿菌Alk36鞭毛蛋白的生物信息學(xué)分析使用從嗜堿芽孢桿菌Alk36鞭毛蛋白N-端得到的22個(gè)氨基酸的肽 序列，篩選同源蛋白的Swiss-Protein數(shù)據(jù)庫。該肽序列顯示出與從嗜堿 芽孢桿菌W. C-125得到的/mg產(chǎn)物鞭毛蛋白的N-端顯示出顯著的同源性 [Sakamoto等人，(1992)， J. Gen. Microbiol. 138: 2159-2166]，現(xiàn)重命名 為嗜堿芽孢桿菌C-125 [Takami等人(1999)' Biosci. Biotechnol. Biochem. 5:943-945](圖3)。嗜堿芽孢桿菌Alk36鞭毛蛋白N-端的前12位氨基酸 顯示出與嗜堿芽孢桿菌C-125鞭毛蛋白N-端92%的同一性[Sakamoto等 人，同上]。進(jìn)一步比較來自大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌(Sa/wwwe〃fl 0^/n'mw/wm)和芽孢枯草桿菌168的鞭毛蛋白的氨基酸序列[LaVallie等人 (1989)， J. Bacteriol. 171:3085-3094]表明該族的鞭毛蛋白的N-和C-端區(qū) 域顯示出顯著的序列保守性，結(jié)論是 34kDa嗜堿芽孢桿菌Alk36蛋白為 一種鞭毛蛋白，因而是/wg基因的產(chǎn)物。實(shí)施例3嗜堿芽孢桿菌Alk36基因的PCR擴(kuò)增和克隆/mg基因開放閱讀框(ORF)的克隆基于嗜堿芽孢桿菌C-125的/^g基因的N-和C-端區(qū)域的保守序列， 使用正向引物(F-flag; 5' CTC CTG CAG AAT CAC AAT TTA CCA GCA 3' Tm二58.1。C)和反向引物(R-flag; 5' GGT TCG AAC ATC GCT TGA GAC GCT TC 3' Tm=61°C)，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從染色體DNA擴(kuò)增Aag 基因的ORF (Sakamoto等人，1992)。該P(yáng)CR反應(yīng)在用MgCl2 (2.0mM) 稀釋至最終體積為100pl的lxPCR緩沖液中包括最終濃度為模板染色體 DNA (100^/^1)、 F-flag(0.5—10|il)、 R-flag (0.5[il/10|il)、 dNTP(脫氧核 苷三磷酸，0.8(al/l(Hil)以及l(fā)pl Pwo DNA聚合酶(5u/pl， Roche)。根據(jù)適 當(dāng)優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)方法，孵育該P(yáng)CR反應(yīng)。使用低熔點(diǎn)的瓊脂糖，通過標(biāo)準(zhǔn) 瓊脂糖(1.0。/。)電泳分離該P(yáng)CR產(chǎn)物，得到的片段分離為對(duì)應(yīng)于800bp(堿
基對(duì))的條帶。在長(zhǎng)波長(zhǎng)UV下，將該800bp的條帶切離，使用BIO 101 (Irvine， CA， U.S.A) Geneclean system從該凝膠中提取DNA，并根據(jù) 廠商關(guān)于產(chǎn)生pMOSBlue(Flg)的說明，將其克隆到pMOSBlue的五coRV 位點(diǎn)中(平端克隆試齊y盒，購自Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway， NJ， U.S.A.)。根據(jù)廠商的說明，使用Bio-Rad (Hercules, CA， U.S.A) Gene Pulser (1.8 kV， 25|iF， 200ohm)將pMOSBlue(Flg)電穿孔到大腸桿菌JM83細(xì)胞 內(nèi)，并在含有氨芐青霉素(50jig/ml)和四環(huán)素(15嗎/ml)的Luria瓊脂平板 上進(jìn)行平板培養(yǎng)。對(duì)于藍(lán)/白選擇，將35pl的X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚基 -a-D-吡喃半乳糖苷)(50mg/ml)和20|il的IPTG (異丙基-(3-D-硫代吡喃半 乳糖苷M100mM)在平板上展開。將該平板在37。C孵育過夜。四環(huán)素確 保含有LacZ M15的可選擇顯型得到維持，因而消除了已經(jīng)喪失顯型的非 重組白菌落的背景。將轉(zhuǎn)化株菌落挑選到含有氨芐青霉素(5(Vg/ml)和四 環(huán)素(15嗎/ml)的Luria肉湯中，在37°C搖動(dòng)孵育過夜。使用Qiagen (Hilden， Germany)質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒DNA，并通過University of Cape Town (Microbiology Department; Cape Town, South Africa) DNA觀lj 序服務(wù)，使用標(biāo)準(zhǔn)T7和U-19 mer引物在兩個(gè)方向上測(cè)序。通過比較表 明嗜堿芽孢桿菌Alk36 ORF在核苷酸序列上顯示出與嗜堿芽孢桿菌 C-125 /zagORF具有100%的同一性(圖4)。使用反向PCR克隆/mg基因片段的側(cè)翼區(qū)為完成嗜堿芽孢桿菌Alk36 /^g的克隆，包括其上游和下游的調(diào)控 區(qū)域，使用反向PCR (iPCR)擴(kuò)增ORF側(cè)翼區(qū)。iPCR使用的方法由Ochman 等人[(1990) Amplification of flanking sequences by inverse PCR. In PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (ed. lnnis M. A等人)，p. 219-227. Academic Press, Inc.]的方法修改而來。用各種限制性酶消化嗜堿 芽孢桿菌Alk36染色體DNA，以識(shí)別那些只"限制"核心區(qū)域一次的限 制性酶，并在已知的易于擴(kuò)增的800bp片段的側(cè)翼產(chǎn)生大約lkb的片段。 在l。/。的瓊脂糖凝膠上分離消化的染色體DNA，并印跡到Reed等人[(1985) Nucleic Acids Res. 13:7207-7221]記載的Immobulon-P膜(Millipore)上，然 后根據(jù)廠商(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)的說明'使用DIG標(biāo)記的800bp片段進(jìn)行探測(cè)。使用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(Boehringer Mannheim)檢測(cè)DIG標(biāo)記的條帶。從印跡結(jié)果看(圖5)，可得出最有價(jià)值 的消化產(chǎn)物是///rn^III (針對(duì)下游區(qū)域)和^ccl (針對(duì)上游區(qū)域)的消化產(chǎn)物。反向PCR (iPCR)方案在l。/。低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上分離嗜堿芽孢桿菌Alk36染色體消化產(chǎn)物 (Hz>^III和^ccl)。電泳分離后，使用剃刀將含有合適尺寸的片段的凝膠 區(qū)域切離。將凝膠薄片在68。C加熱20分鐘以熔化瓊脂糖。將DNA片段 在下述條件下進(jìn)行再連接，所述條件有利于在含有10nl熔融瓊脂糖、5pl 10x連接緩沖液、34pl蒸餾水以及1 Weiss單位的T4DNA連接酶的總反 應(yīng)體積為5(Hd的反應(yīng)體系中形成單體性循環(huán)(monomeric circle)。在15°C， 將所述反應(yīng)孵育過夜，并在68°C加熱15分鐘終止所述反應(yīng)。在lOOpl 使用下列引物的PCR反應(yīng)體系中，使用l(Hil的連接混合物。 IF: 5' GCT GAG TCT CGT ATC CGT GAC (Tm-56.2°C) (SEQ ID NO:30) IR: 5' CCT GCA GCA TCG TCT CCT GCA (Tm-58,1。C) (SEQ ID NO:31)按照上述記載進(jìn)行PCR反應(yīng)，該反應(yīng)在94°C孵育2分鐘，然后進(jìn) 行一個(gè)3步循環(huán)94°C孵育1分鐘、50°C孵育1分鐘以及72°C孵育2 分鐘，共重復(fù)35個(gè)循環(huán)。還包括在72。C孵育5分鐘的最后延伸步驟。完成iPCR后，反應(yīng)產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上分離，使用溴化乙錠染 色進(jìn)行顯色。從凝膠圖(圖6)可以看出，使用^ccI和i^u/III的消化產(chǎn)物 使約1.15kb和0.925kb的PCR產(chǎn)物分別得到擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物的大小與 Southern印跡所得結(jié)果具有很好的相關(guān)性。使用High Pure PCR純化試劑盒(Boehringer Mannheim)純化PCR的反應(yīng)產(chǎn)物。使用與上述PCR反應(yīng)使用的引物相同的兩個(gè)引物對(duì)得到的 DNA進(jìn)行測(cè)序。DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí)兩個(gè)PCR片段都具有正確的上游和 下游區(qū)域。將這兩個(gè)片段都克隆到pMOSBlue載體，再次使用T7和 U19-mer引物測(cè)序。結(jié)果證實(shí)了 iPCR測(cè)序樣品的起始序列。上述兩個(gè)克 隆產(chǎn)生了 977bp的新序列數(shù)據(jù)，上游為800bp的核心區(qū)域以及下游為 796bp的核心區(qū)域(圖7)。這些序列足以包括上游和下游調(diào)控區(qū)域。將這 些調(diào)控區(qū)域序列與嗜堿芽孢桿菌C-125的序列進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者顯示 出顯著的同一性(大于99.9%)，僅有4個(gè)不同的堿基對(duì)。完整的hagg基因及其調(diào)控區(qū)域示于圖8。實(shí)施例4內(nèi)源嗜堿芽孢桿菌Alk36染色體鞭毛蛋白基因的滅活由 German culture collection DSMZ (Deutsche Sam mlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH， Mascheroder weg lb， 38124 Braunschweig, Germany)得到質(zhì)粒pE194 (DSMZ 4554)。質(zhì)粒pE194從金 黃葡萄球菌細(xì)菌分離得到，轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌細(xì)菌中，顯示可以在達(dá) 到34°C的溫度下穩(wěn)定存在。然而，當(dāng)溫度高于37。C時(shí)，隨著通過分離 質(zhì)粒的損失，復(fù)制數(shù)目降低[Weisblum等人(1979) J. Bacteriol. 137:635-643]。在42°C以上時(shí)，質(zhì)粒不能復(fù)制，細(xì)胞可以在氯霉素上存 活的唯一途徑是通過將該質(zhì)粒整合到染色體內(nèi)。只有使用來自pE194的 復(fù)制起點(diǎn)、來自pC194的氯霉素基因、大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)以及從 Stratagene (La JoIIa， CA， U.S.A)獲得的Bluescript pSK載體得到的(p-內(nèi)酰胺酶)基因可以得到穿梭載體(pSEC194)。由于pE194在37°C以上不 穩(wěn)定，在43。C以上不能復(fù)制，該特征用于促使嗜堿芽孢桿菌Alk36中的 整合事件。根據(jù)Chang和Cohen [(1979) Mol. Gen. Genet. 168:111-115]，使用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，將所有的嗜堿芽孢桿菌Alk36菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化。穿梭載體pSEC194的構(gòu)建通過使用氯霉素耐藥基因代替pE194上的紅霉素耐藥基因，并連接 pSKon'到pE194on'，構(gòu)建芽胞桿菌/大腸桿菌穿梭載體(pSEC194)。使用 %《1消化質(zhì)粒pE194。將含有on'的1.35kb的條帶連接到用C/al消化的 pSK(2.959kb)，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B以產(chǎn)生pSE194(圖9A)。使 用Sg/II/尸v"I1消化質(zhì)粒pJM103以得到源自pC194的氯霉素基因(1.2kb) [Iordanescu等人(198C)) Plasmid 4:256-260]。將含有所述基因的片段連接 到由SamHIASmaI消化的pSE194，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B中以產(chǎn)生 pSEC194 (圖9B)。在含有氨芐青霉素的平板上，從大腸桿菌中篩選轉(zhuǎn)化 株很重要，因?yàn)橛寐让顾睾Y選導(dǎo)致結(jié)構(gòu)中的缺失。然而，當(dāng)將pSEC194 轉(zhuǎn)化到嗜堿芽孢桿菌中時(shí)，氯霉素將被用作標(biāo)記物，得到的克隆體能在
30°C-34°C保持穩(wěn)定。這種載體被用作大腸桿菌/嗜堿芽孢桿菌Alk36和 芽孢枯草桿菌之間的穿梭載體，用于將相關(guān)基因整合到嗜堿芽孢桿菌 Alk36的染色體中。整合載體pSEC194Flg-的構(gòu)建僅使用N-和C-端ORF區(qū)域以及上游和下游調(diào)控區(qū)域中的一些構(gòu)建 有缺陷的(缺損的內(nèi)源基因)/wg基因，將其連接至pSEC194，并轉(zhuǎn)化到 嗜堿芽孢桿菌Alk36中。在構(gòu)建pSECFlg-中，缺失了/ 化基因的大部分 內(nèi)部區(qū)域(圖IOA)。使用如下引物獲得兩個(gè)構(gòu)建Flg-片段所需的PCR產(chǎn) 物UPFor: 5' GC GGATCC GTG TGG TGA CAT TTG AC 3' (SamHI) (SEQ ID NO:32) UPRev: 5' GC TCTAGA CGATGC GCATTC ATT GCT GG 3'(勘I) (SEQ ID NO:33) DownFor: 5' GC TCTAGA GAG TCT CGTATC CGT G 3' (AM) (SEQ ID NO:34) DownRev: 5' CG CTG CAG AAG AGG AAC GTA AAC G 3'(SEQ ID NO:35)使用適當(dāng)優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)方法得到PCR產(chǎn)物，這些PCR產(chǎn)物與pBCKS (Stratagene)連接到一起，在3路連接中使用5amHI/尸Wl消化得到Flg-片 段。然后使用五coi I消化pBCFlg-，克隆到用五coi I消化的pSEC194中 以獲得pSECFlg-(圖IOB)。用于整合的方案為記載于Biswas等人[(1993) J. Bacteriol, 175:3628-3635]和Poncet等人[(1997) Appl. and Environ. Microbiol. 63:4413-4420]中的兩種不同方法的結(jié)合。通過在52°C孵育被挑選到具有 氯霉素(10嗎/ml)的25 ml LB (pH 8.5)中的含有pSEC194Flg-的嗜堿芽孢 桿菌Alk36轉(zhuǎn)化株16-24小時(shí)，促進(jìn)第一交換(單交換(sco))事件。連續(xù)稀 釋得到的細(xì)胞懸浮液，平板培養(yǎng)到LALuria瓊脂(pH8.5， lO^l/ml氯霉素) 平板和LA(pH 8.5)平板上，52。C孵育過夜。比較在LA(pH8.5， 10nl/ml 氯霉素)平板和LA(pH8.5)平板上的生長(zhǎng)情況以確定整合效率。使用菌落 PCR確定單交換事件(圖11)。鑒定兩種氯霉素耐藥克隆體49和50，然 后將克隆體49用于產(chǎn)生第二交換(雙交換(dco))事件。隨后在不存在氯霉 素時(shí)，在25 ml的LB Luria肉湯(pH S.5)中于30。C將克隆體49孵育2-2.5 小時(shí)(細(xì)胞生長(zhǎng)曲線對(duì)數(shù)期)來實(shí)現(xiàn)上述第二交換事件。將培養(yǎng)物稀釋，平 板培養(yǎng)到LA(pH8.5)平板上，在30。C孵育過夜。將菌落一式兩份挑選到 LA (pH 8.5， 10pl/ml氯霉素)平板和LA (pH 8.5)平板上。發(fā)生基因替代(dco) 的菌落為氯霉素敏感型和不動(dòng)型。將氯霉素敏感菌落挑選到游動(dòng)性評(píng)估 平板上(Luria平板，pH8.5， 0.4%瓊脂+0.8%明膠)以篩選不動(dòng)型突變體。 通過菌落PCR篩選用于雙交換事件的不動(dòng)型雙交換突變體(圖10)。將這 種變異的不動(dòng)型培養(yǎng)物重新命名為BhFCOl菌株。為確保氯霉素基因的 缺失，雙交換十分重要，其還是質(zhì)粒序列缺失的指示，由此產(chǎn)生了具有 缺陷的/^g基因的嗜堿芽孢桿菌Alk36突變體BhFCOl菌株(A/mg)，顯示 不動(dòng)型顯型體(游動(dòng)性平板；圖15A)。顯示雙交換事件使用的不同引物對(duì)如果染色體上存在完整的/^g基因，預(yù)計(jì)SigDF/InvR引物組合獲得 342bp的PCR產(chǎn)物。預(yù)測(cè)SigDF/FHCR引物對(duì)會(huì)擴(kuò)增染色體上存在的有缺陷的(400bp)和 完整的/wg(1.150kb)基因。盡管使用SigDF/InvR引物對(duì)顯示存在完整的 拷貝(圖ll，引物對(duì)B，條帶l)，但顯示只有缺陷的條帶存在于兩個(gè)單交 換事件中(圖ll,引物對(duì)B，條帶1和2)。似乎是引物優(yōu)先擴(kuò)增有缺陷的 拷貝。Aquino deMuro等人[(2000) Res. Microbiol. 151:547-555]報(bào)道了類 似的結(jié)果；在該研究中，觀察到一個(gè)拷貝的強(qiáng)烈條帶和另一個(gè)拷貝的微 弱條帶。如果染色體上存在質(zhì)粒DNA，預(yù)測(cè)SigDF/M13R引物對(duì)僅擴(kuò)增/^g 基因，其已經(jīng)從單交換事件得到。雙交換事件后，所有的質(zhì)粒DNA為環(huán) 出序列，應(yīng)當(dāng)沒有得到PCR產(chǎn)物。這是所觀察到的結(jié)果(圖11，引物對(duì)C， 條帶3和4)。 PCR產(chǎn)物(sco)的大小預(yù)計(jì)為2.507kb (有缺陷的/mg)或者 3.178 (完整的/mg)，其取決于是否存在N-端或者C-端交換體。觀察到適 宜大小的條帶。預(yù)計(jì)UpFor/DownRev引物對(duì)會(huì)擴(kuò)增有缺陷的或者完整的/^g基因， 這取決于交換體的位置。根據(jù)預(yù)測(cè)，N-端交換體(有缺陷的/^g)得到1.735 kb的PCR產(chǎn)物(圖11，引物對(duì)D，條帶1-3)， C-端交換體(完整的/zag) 得到2.406 kb的PCR產(chǎn)物(圖11，引物對(duì)D，條帶4)。雙交換事件后， 僅擴(kuò)增了較小的條帶。
從PCR圖譜得到的結(jié)果顯示得到雙交換事件，產(chǎn)生鞭毛蛋白-突變體 BhFCOl 。下一步是證實(shí)通過與pSEC194上基因的完整拷貝的突變互 補(bǔ)，突變位于/zag基因內(nèi)。
實(shí)施例5互補(bǔ)研究表明在BhFCOl菌株中鞭毛蛋白表達(dá)的恢復(fù) 這些實(shí)驗(yàn)中使用的引物為
FliCR: 5' CAA CAA AGT AAC GGT TGA GCG 3' (SEQ ID NO:36)
InvR: 5' CCT GCA GCA TCG TCT CCT GCA 3' (SEQ ID NO:37)
SigDF: 5' CTC GGTACC CTC GCG TTA CGC TCT TTC TGT 3'(爭(zhēng)I) (SEQ ID NO:38)
UPFor:5' GC GGATCC GTG TGG TGA CAT TTG AC 3' (S腦HI) (SEQ ID NO:32)
DownRev:5' CG CTG CAGAAG AGG AAC GTA AAC G 3'(尸s,I) (SEQ ID NO:35)
M13R: 5' GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3' (SEQ ID NO:39)
含有D啟動(dòng)子和編碼序列的完整Aag基因克隆到pSEC194中，并轉(zhuǎn) 化到BhFCOl菌株中。通過質(zhì)粒原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將pSEC194FliC(含有完整 的鞭毛蛋白啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)基因)引入BhFCOl，以評(píng)價(jià)使用多個(gè)拷貝互補(bǔ) 基因組Aflg缺失的能力。將轉(zhuǎn)化株挑選到游動(dòng)性評(píng)估平板上，含有 pSEC194FliC的BhFCOl菌株顯示清楚的運(yùn)動(dòng)(圖15)。得到如實(shí)施例1 的BhFCOl菌株的細(xì)胞表面蛋白提取物，然后使用SDS-PAGE進(jìn)行分離。 分離的對(duì)應(yīng)于 34kDa條帶的蛋白表明BhFCOl菌株轉(zhuǎn)化株中鞭毛蛋白表 達(dá)的恢復(fù)(圖14A，條帶6)。
實(shí)施例6嗜堿芽孢桿菌Alk36鞭毛蛋白可變區(qū)的蛋白質(zhì)模型制作以及融 合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建
3D-PSSM (三維位置特異性得分矩陣)是一種使用1D和3D序列圖譜 結(jié)合二級(jí)結(jié)構(gòu)和溶劑化能信息的、用于進(jìn)行蛋白質(zhì)折疊識(shí)別的快速且基 于網(wǎng)絡(luò)的方法。該方法的概述記載于Journal of Molecular Biology, 299:501-522 (Kelley等人，2000)，將該文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容并入本文作 為參考。使用3D-PSSM軟件制作嗜堿芽孢桿菌Alk36鞭毛蛋白的推斷的 可變區(qū)模型。在該蛋白模型的可變區(qū)中選擇5個(gè)允許肽插入的位點(diǎn)。所 有這些位點(diǎn)都位于或參與嗜堿芽孢桿菌FliC蛋白可變區(qū)的外露的延伸-鏈和巻曲的操作(圖12)。使用載體pSEC194^ "I/歷"cII作為骨架，構(gòu)建了 5個(gè)結(jié)構(gòu)。
NC1結(jié)構(gòu)缺失鞭毛蛋白可變區(qū)，并插入9個(gè)氨基酸的肽，而NC2、 NC3、 NC5和NC6結(jié)構(gòu)插入各種大小的肽。
pSEC'194NCl的構(gòu)建
使用pSEC194FliC作為模板，根據(jù)適當(dāng)優(yōu)化的的標(biāo)準(zhǔn)方法，通過PCR 擴(kuò)增獲得用于構(gòu)建截短的/^g基因(pSEC194NCl)的N端和C端區(qū)域。使 用/^薦coi I消化pSECFliC以得到N-端片段(566bp)。使用FliCR和 CterF引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以得到C-端片段(232bp)。 FliCR: 5' CAA CAA AGT AAC GGT TGA GCG 3' (SEQ ID NO:36) CterF: 5' CGC GAATTC CTA GGA GCT ATG CAA AAC C 3' (SEQ ID NO:40)
使用五coi ADral消化C-端PCR片段，并與N-端片段(A:/7"I/五coi I) 3 路連接到^/ MlADral消化的pSEC194。得到的截短的鞭毛蛋白(FliC)蛋白 缺失114-202位之間的89個(gè)氨基酸。該缺失跨越了 FliC蛋白可變區(qū)的大部分。
pSEC194NC2的構(gòu)建
在開放閱讀框的606位核苷酸(nt)之后，通過插入15bp (對(duì)應(yīng)于5個(gè) 氨基酸)多克隆位點(diǎn)(MCS)插入片段，得到pSEC194NC2(NC2)(圖13A)。 根據(jù)適當(dāng)優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)方法，使用引物SigDKpn和FliN-terRev (參見下文) 對(duì)N-端區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用引物CterF2和DownRev (參見下文)對(duì) C-端區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。嗜堿芽孢桿菌Alk36基因組DNA用作所有PCR 反應(yīng)的模板。
FliN-terRev: 5' CTC CTC GAG CGA CCT TCT GAA ACA GC 3'(為I) (SEQ ID NO:41) AAC3'(五coAI， ^Tio1， Smal， 5awHI) (SEQ ID NO:43)
DownRev: 5' CGC TGCAGAAGA GGA ACG TAA ACG 3'(SEQ ID NO:35)
使用X/^I/X戶I消化N-端片段，使用消化C-端片段。使用 《p"I/歷"c11消化pSEC194，并進(jìn)行3路連接得到pSEC194NC2。
pSEC194NC3的構(gòu)建
pSEC194NC3與pSEC194NC2的不同之處在于插入片段的位置(在nt 459位之后而不是nt 606位之后)以及插入片段的大小(27bp，對(duì)應(yīng)于9個(gè) 氨基酸)(圖13B)。根據(jù)適當(dāng)優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)方法，使用引物SigDKpn和VNR2 (參見下文)對(duì)N-端區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用引物VCF和DownRev (參見 下文)對(duì)C-端區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。嗜堿芽孢桿菌Alk36基因組DNA用作 兩個(gè)反應(yīng)的模板。
Sig。Kpn: 5' CTC GGTACC CTC GCG TTA CGC TCT TTC TGT (爭(zhēng)I) (SEQ ID NO :42) VNR2: 5' CGG CAG CTG TTC ACC AGA ATT AGC ACC AAC 3'(尸v"II) (SEQ ID NO:44) VCF: 5' CAC GTC GAC TCG AGC CCG GGA TCC TTA ATT GAA CTT GAT TTA AC A AAAG3'CSa/L ^oI， Smal， 5awHI) (SEQ ID NO:45)
DownRev: 5' CGC TGC AGA AGA GGA ACG TAA ACG 3'(尸竭(SEQ ID NO:35)
使用Sa/I和尸M消化C-端PCR片段，并連接到pSK載體，該pSK 載體使用相同的兩種限制性酶進(jìn)行消化，得到pSKCter。 N-端片段僅使 用消化(另一端保持為平端)，然后連接到W/"dl和消化的 pSKCter，得到pSKNC3。使用X/^I和消化上述結(jié)構(gòu)，以釋放NC3 片段，然后將NC3片段連接到《; "I和i^'wcll消化的pSEC194以獲得 pSEC194NC3。
pSEC194NC5的構(gòu)建
在開放閱讀框387位核苷酸(nt)之后，通過插入21個(gè)核苷酸(對(duì)應(yīng)于 7個(gè)氨基酸)，得到pSEC194NC5 (圖13C)。根據(jù)適當(dāng)優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)方法， 使用引物NC5R和SigDKpn (參見下文)對(duì)N-端區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用 引物NC5F和DownRev (參見下文)對(duì)C-端區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。嗜堿芽 孢桿菌基因組DNA用作所有PCR反應(yīng)的模板。
CSWI， Wol， S顧I， 5謹(jǐn)HI) (SEQ ID NO:46)
DownRev: 5' CGC TGC AGA AGA GGA ACG TAA ACG 3' (P竭(SEQ ID NO:35) NC5R: 5' CAC CTC GAG TGA GTTGTA TCT TTG ATT C 3'(勘I) (SEQ ID NO :47) 使用《p"I和^T o1消化N-端PCR片段。使用pwo DNA聚合酶(Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)產(chǎn)生C-端片段，得到平端的PCR產(chǎn)物。 然后使用限制C-端PCR片段，并在3路連接中使用該片段得到 pSEC194NC5。pSEC194NC6的構(gòu)建在開放閱讀框540位核苷酸(nt)之后，通過插入27bp (對(duì)應(yīng)于9個(gè)氨 基酸)產(chǎn)生pSEC194NC6 (圖13D)。使用引物SigDKpn和VNR6對(duì)N-端 (767bp)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用引物VCF6和DownRev對(duì)C-端(349bp) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用5WI/尸WI限制C-端產(chǎn)物，連接到Sfl/1//^1限制的 pSK，得到pSKCter2。使用A:/ "I/i"a/1限制質(zhì)粒pSKCter2以及N-端PCR 產(chǎn)物，連接以產(chǎn)生質(zhì)粒pSKNC6。使用PWO taq，通過引物SigDKpn和 FIiCR對(duì)來自pSKNC6的NC6片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得平端PCR產(chǎn) 物，然后使用《p"I限制該產(chǎn)物，連接到pSEC194(XpwI/7^"cn)中，獲得 pSEC194NC6。FliCR: 5' CAA CAA AGT AAC GGT TGA GCG 3' (SEQ ID NO: 3 6)SigDKpn: 5' CTC GGTACC CTC GCG TTA CGC TCT TTC TGT 3' (&"I) (SEQ ID NO:42) VNR6: 5' GAC GTC GAC AGT GTG GTC AGT AAT ATC CTC 3' (Sa/I) (SEQ ID NO:48)ATT GAC 3'(歸)(SEQ ID NO:49)DownRev: 5' CGC TGC AGAAGAGGAACG TAAACG 3'(SEQ ID NO:35)在所有情況下，設(shè)計(jì)插入片段以攜帶用于加入編碼異源肽和蛋白的 序列的多克隆位點(diǎn)(MCS)。產(chǎn)生所有的NC結(jié)構(gòu)以識(shí)別在FliC蛋白內(nèi)的 功能插入位點(diǎn)，確定表達(dá)水平，以及觀察轉(zhuǎn)化后顯型(嗜堿芽孢桿菌 BhFCOl中游動(dòng)性的恢復(fù))特性。細(xì)胞表面蛋白(CS)提取物從分別使用 NC1、 NC2、 NC3、 NC5和NC6轉(zhuǎn)化的嗜堿芽孢桿菌Alk36培養(yǎng)物中得 到，該蛋白提取物使用如前所述的SDS-PAGE進(jìn)行分離。發(fā)現(xiàn)含有NC3 和NC6的BhFCOl過表達(dá)一種蛋白，該蛋白分離為與FliC蛋白對(duì)應(yīng)的條 帶(圖14A，條帶1-5以及圖14B，條帶2-3)。從電泳凝膠結(jié)果清楚顯示 BhFC04 (NC6)菌株產(chǎn)生的修飾的FliC蛋白水平與WT (野生型)細(xì)菌的 FliC蛋白水平具有很強(qiáng)的可比性。NC6是使嗜堿芽孢桿菌不動(dòng)型突變體
恢復(fù)游動(dòng)性的唯一結(jié)構(gòu)(圖15)。通過使用FliC特異性抗體的Western印跡分析證實(shí)細(xì)胞表面(CS)部 分中的 34kDa蛋白條帶為鞭毛蛋白或者修飾的鞭毛蛋白(圖14C)。實(shí)施例7使用pSEC194整合載體在嗜堿芽孢桿菌菌株BhFCOl的染色體 上定向滅活編碼細(xì)胞壁蛋白酶的基因基因編碼能降低在相關(guān)重組細(xì)菌表面上融合蛋白的表達(dá)水平 的細(xì)胞壁蛋白酶。設(shè)計(jì)了一種在BhFCOl細(xì)菌中使vv/7"基因缺失的方法。通過使基因內(nèi)部區(qū)域的1056bp缺失，構(gòu)建質(zhì)粒pSECw戶"-(圖 16A)。該區(qū)域包括整個(gè)wj^4編碼序列。圖16B顯示wpM蛋白的氨基酸 序列。使用下列引物獲得構(gòu)建wpM-片段所需的N-和C-端PCR產(chǎn)物。 N-For 5' GC GAG CTC TGC AGC GTA CTA CAA CCA 3' ,cl) (SEQ ID NO:50) N陽Rev: 5' GC GGATCC AGC TGATAA CGC TAC GTA 3' CB鵬HI) (SEQ ID NO:51) G-For: 5, GC GGATCC TAG CGG ACC TGTAGATGC TA3,(丑amHI) (SEQ ID NO:5" C-Rev: 5' GG TCTAGA TGC CTT GTC CTT CGC TGT A 3' (ASaI) (SEQ ID NO:53)將所述的PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，并一起連接到使用&cI/X^I限制的 pSEC194，獲得pSEC194w/ ^4-(圖16B)。將質(zhì)粒pSEC194w; M-如前文 所述那樣轉(zhuǎn)化到BhFCOl菌株。如實(shí)施例4所述，使用含有sco的轉(zhuǎn)化株 促使雙交換事件。得到的菌株命名為BhFC04(/^g， AW/ ")。提取嗜堿 芽孢桿菌菌株BhFCOl和BhFC04的胞外和細(xì)胞表面蛋白，在SDS-PAGE 和明膠-SDS-PAGE凝膠上得到蛋白和蛋白酶圖譜(圖17)。從兩種菌株中，從報(bào)告子基因得到的結(jié)果顯示在BhFC04的不同片 段中蛋白產(chǎn)量和穩(wěn)定性獲得改善(結(jié)果未示出)。然后將質(zhì)粒pSEC194NC3 和pSEC194NC6轉(zhuǎn)化到BhFC04菌株，以改善表面上修飾的FliC蛋白的 產(chǎn)量和穩(wěn)定性。申請(qǐng)人按照布達(dá)佩斯條約于2006年11月23日將BhFC04 ( /mg，△wpM)嗜堿芽孢桿菌菌株以保藏號(hào)NCIMB_保藏到NCIMB CultureCollection (NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn，Aberdeen, AB21 9YA)。給予BhFC04菌株NCIMB保藏號(hào)_。自本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)日之前，提交NCIMB Culture Collection保藏的菌株從科學(xué)
與工業(yè)研究理事會(huì)(the Council for Industrial and Scientific Research, CSIR) 保存的保藏中取出。在NCIMB保藏處，該菌株保藏物在30年內(nèi)或者最 新請(qǐng)求后5年內(nèi)，或者本專利的有效期內(nèi)將會(huì)無限制地供給，以其中的 較長(zhǎng)時(shí)間計(jì)算，如果在上述期限內(nèi)該保藏物不能存活，其將被代替。實(shí)施例8融合蛋白的表面展示生物整治和生物采礦聚組氨酸標(biāo)記物肽的表面展示pSEC194NHisC6的構(gòu)建使用NC6插入位點(diǎn)構(gòu)建pSEC194NHisC6，作為展示BhFC04菌株表 面上的金屬結(jié)合肽(聚組氨酸標(biāo)記物)的例子。已經(jīng)顯示聚組氨酸標(biāo)記物 (含有6個(gè)組氨酸殘基)結(jié)合鎘、鎳和銅[Sousa等人(1996) Nature Biotech. 14:1017-1020]。因此該標(biāo)記物適宜展示鞭毛蛋白展示系統(tǒng)用于生物整治 或者在采礦工業(yè)中貴金屬生物采礦的用途。通過使用 J^ol和5amHI限制3g pSEC194NC6 ， 構(gòu)建 pSEC194NHisC6。根據(jù)IDT (Integrated DNA Technologies, Coralville， IA， U.S.A.)記載的方法，通過使兩個(gè)互補(bǔ)寡核苷酸(HisF3和HisR3;參見下 文)退火，產(chǎn)生聚組氨酸標(biāo)記物。HisF3 5' TCG AGA CAT CAT CAT CAT CAT CAC AG (SEQ ID NO:54) HisR3 5' GAT CCT GTG ATG ATG ATG ATG ATG TC (SEQ ID NO:55)簡(jiǎn)言之，將上述兩個(gè)寡核苷酸分別稀釋到STE緩沖液中(10mM Tris pH 8， 50mMNaCl， lmM EDTA)，使最終濃度為50fiM。相同體積的每 種寡核苷酸溶液混合在一起，稀釋到最終濃度為5pM。在沸水浴中將寡 核苷酸混合物加熱到100°C，然后通過切斷水浴使其緩慢冷卻至室溫。 使用Geneclean III試劑盒(BIO IOI)純化退火的寡核苷酸。退火的寡核 苷酸在5'端和3'端分別含有ZAoI和BamHI位點(diǎn)。5' TCG AGA CAT CAT CAT CAT CAT CAC AG 5a附ffl (SEQ ID NO:56) 為I CT GTA GTA GTA GTA GTA GTG TCC TAG 3' (SEQ ID NO :5 7)使用Fast-Link DNA連接試劑盒(Epicentre， Madison， WI)，將退 火的聚組氨酸標(biāo)記物與受限制的pSEC194NC6連接，得到pSEC194NHisC6。在連接反應(yīng)中使用20ng pSEC194NC6和30ng退火的 組氨酸寡核苷酸。在70。C加熱15分鐘熱滅活停止上述反應(yīng)。通過電穿 孔法(25pF， 200 0hms， 1.6KV)將2^1連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B 細(xì)胞中。使用弓I物HisF3和FliCR (5' CAA CAA AGT AAC GGT TGA GCG 3')通過菌落PCR分析(25(il)篩選克隆體。將克隆體挑選到50^1滅菌水中 并煮沸5分鐘。煮沸的菌落在12,000 rpm離心30秒使細(xì)胞碎片球化。在 每個(gè)PCR反應(yīng)中使用5pl煮沸的裂解液。反應(yīng)混合物如下2.5^1 10x緩 沖液，2.5jil 8mM dNTP's， 0.75pl 50 mM MgCl2， 1.25|il 5M每種引物， 0.2|ul Taq聚合酶(l單位)和滅菌PCR水到25pl的總體積。PCR參數(shù)為 94°C， 4分鐘， 一個(gè)循環(huán)；94°C， 1分鐘，35個(gè)循環(huán)，56°C， 1分鐘；72°C, 1.5分鐘；以及最后的延伸步驟，72°C， 4分鐘， 一個(gè)循環(huán)。使單陽性克 隆體生長(zhǎng)，從得到的培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA。圖18顯示聚組氨酸的氨 基酸序列(及編碼該序列的核苷酸序列)以及形成插入的異源多肽的由部 分MCS編碼的氨基酸。整個(gè)插入肽長(zhǎng)度為13個(gè)氨基酸。如上所述，使用pSEC194NHisC6將BhFC04菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，確定該 結(jié)構(gòu)的金屬結(jié)合能力。使用菌落PCR確認(rèn)轉(zhuǎn)化株攜帶pSEC194NHisC6。 攜帶有pSEC194NHisC6結(jié)構(gòu)的BhFC04克隆體在25 ml pH8.5的LB肉 湯中生長(zhǎng)，以確定該肽的成功展示及其結(jié)合MagneffisNi-顆粒的能力。NHisC6蛋白的制備和功能通過分離胞外(Ex)、細(xì)胞表面(CS)、細(xì)胞壁(CW)和胞內(nèi)(IC)蛋白部分 以及在10% SDS-PAGE凝膠上分離蛋白試樣，確定展示的肽在細(xì)菌細(xì)胞 中的位置。分離的部分如下。在25 ml pH 8.5 Luria肉湯(LB)中，于30°C使細(xì)胞生長(zhǎng)到固定相(16 小時(shí))。使細(xì)胞球化，并重懸于2.5mlpH7.5的滅菌磷酸鹽緩沖液中，細(xì) 胞球用作CS部分(參見下一段)。通過加入等體積的5。/。三氯乙酸(TCA) 對(duì)上清液進(jìn)行沉淀，在室溫下孵育30分鐘。通過在17,000xg離心30分 鐘，使沉淀的蛋白球化，并在37。C干燥30分鐘。蛋白球重懸于300^1 pH 7.5的磷酸鹽緩沖液中，以制備EX蛋白部分。在重懸的細(xì)胞球中加入等體積的0.2MNaOH，在冰上使用攪拌棒劇
烈攪拌30分鐘。在8,000xg離心10分鐘，使細(xì)胞球化除去細(xì)胞材料， 得到上清液。將等體積的5。/。TCA(三氯乙酸)加到上清液中，得到的混合 物在室溫?fù)u動(dòng)孵育30分鐘。通過在17,000xg離心30分鐘，使細(xì)胞表面 (CS)蛋白球化。使用滅菌水洗滌蛋白球，并在37°C干燥30分鐘。然后 將CS蛋白重懸于30(^1 pH 7.5的磷酸鹽緩沖液中。使用NaOH "去蛋 白"之后得到的細(xì)胞球重懸于5ml磷酸鹽緩沖液中，并使用Sonopuls超 聲均質(zhì)器(Bandelin， Berlin, Germany)以全強(qiáng)度超聲處理30分鐘。裂解 的細(xì)胞在10,000xg離心IO分鐘，以沉淀CW部分。取出上清液(IC)置于 2 ml的Eppendorf管中。將CW球在37°C干燥30分鐘，重懸于500W pH 7.5的磷酸鹽緩沖液中。使用Bradford法(Bradford, 1976， Anal Biochem 72:248-259)測(cè)定蛋白濃度。在10% SDS-PAGE凝膠上分離CS部分并使 用考馬斯藍(lán)染色法染色(圖19)。使用MagneHisM蛋白純化系統(tǒng)(Promega， Madison， WI， U.S.A.)確定展示的聚組氨酸標(biāo)記物的金屬結(jié)合能力。該試劑盒利用組氨酸標(biāo)記物 結(jié)合鎳顆粒的能力，隨后可以使用磁體分離鎳顆粒。然后使用咪唑?qū)⒌?白從上述鎳顆粒上切離。通過將pSEC194NHisC6和pSEC194NC6轉(zhuǎn)化 細(xì)菌的過夜培養(yǎng)物6 ml球化(-ve control),并將培養(yǎng)物球重懸于5 ml磷酸 鹽緩沖液中，得到細(xì)胞粗提物。每個(gè)試樣按上述對(duì)IC提取物所物進(jìn)行超 聲處理。使用等體積的5% TCA使蛋白沉淀，重懸于600W的裂解緩沖 液(MagneHis試劑盒)中。根據(jù)廠商的說明在非變性條件下進(jìn)行后續(xù)的所 有步驟。洗脫蛋白使最終體積為ioow。通過在10% SDS-PAGE凝膠上分離試樣并使用考馬斯藍(lán)染色顯現(xiàn)組 氨酸標(biāo)記物與Magneffis微球(鎳)的成功結(jié)合(圖20)。包括未結(jié)合蛋白(條 帶6和7)、未洗脫的微球結(jié)合蛋白(條帶4和5)以及微球結(jié)合并洗脫的蛋 白(條帶2和3)三個(gè)部分。聚組氨酸標(biāo)記物到鞭毛蛋白的融合獲得該肽功 能形態(tài)的成功展示。正如序列對(duì)比研究預(yù)測(cè)的那樣，在非變性條件下制 備的事實(shí)還表明該肽在鞭毛蛋白的暴露域上得到展示。抗原的表面表達(dá)HIV(人類免疫缺陷病毒)肽pSEC194NHivC6的構(gòu)建以展示嗜堿芽孢桿菌菌株BhFC04表面上的外 源表位。重組生物體例如那些可用作產(chǎn)生多種類型的免疫應(yīng)答并對(duì)抗多 種來源的抗原的免疫原。選擇HIV分離的HIV-1的V3環(huán)部分作為一個(gè)例 子。發(fā)現(xiàn)gpl20 (V3環(huán))的抗原基序?yàn)楸Ｊ氐?Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe)， 并誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。還顯示該表位激活T-輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒T淋巴細(xì) 胞應(yīng)答[Goudsmit等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 4478-4482; Javaherian等人(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6788-6772]。通過使用^7k I和5amHI限制pSEC194NC6構(gòu)建pSEC194NHivC6。 通過如上所述的使兩個(gè)互補(bǔ)寡核苷酸(序列如下)退火產(chǎn)生HIV gpl20抗 原表位。 、HivF3B 5' CAC CTC GAG ACG TTC ATT ATC ATA TGG ACC AGG ACG TGC ATT TCG TAC GCG TTG GAT CCA CAG 3' (SEQ ID NO :5 8)HivR3B 5' CTG TGG ATC CAA CGC GTA CGA AAT GCA CGT CCT GGT CCA TAT GAT AAT GAA CGT CTC GAG GTG 3' (SEQ ED NO:59)根據(jù)如上所述，使用和5amHI限制并純化退火的寡核苷酸。G-3'(SEQIDN0:61)使用Fast-Link DNA連接試劑盒(Epicentre)，將HIV肽與受限制的 pSEC194NC6連接，得到pSEC194NHivC6。在連接反應(yīng)中使用20ng pSEC194NC6和30ng退火的HIV寡核苷酸。在70°C加熱15分鐘熱滅 活連接反應(yīng)。通過電穿孔法(25)aF， 200 Ohms， 1.6Kv)將2pl連接混合物轉(zhuǎn)化到大 腸桿菌DH10B細(xì)胞中。使用引物NC5F和FHN-terRev通過菌落PCR分 析(25pl)篩選克隆體。根據(jù)上述進(jìn)行PCR，其中退火時(shí)間從1.5分鐘降低 為1分鐘。在1.5。/。TAE瓊脂糖凝膠上分析所有試樣。使單陽性克隆體生
長(zhǎng)，從得到的培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA。圖21顯示HIVV3環(huán)肽的氨基酸 序列(及編碼該序列的核苷酸序列)以及形成插入的異源多肽的由部分 MCS編碼的氨基酸。經(jīng)證實(shí)序列是正確的，隨后轉(zhuǎn)化到嗜堿芽孢桿菌 BhFC04(A/^g， A甲^)。(SEQ ID NO:46)FliN-terRev: 5' CTC CTC GAG CGA CCT TCT GAA ACA GC 3'(為I)(SEQ ID NO:41)如上所述對(duì)BhFC04菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化。使用引物FIiN-terRev和NC5F 通過菌落PCR證實(shí)陽性轉(zhuǎn)化株。如上所述，選擇單陽性克隆體以分離蛋 白部分。將10g CS、20g EX、40g CW和40g IC部分加樣到10% SDS-PAGE凝膠上，使用考馬斯藍(lán)染色法進(jìn)行染色。在SDS-PAGE凝膠上，只有CS部分得到與鞭毛-Hiv肽融合體的正 確尺寸類似的條帶(圖22)。包含所述肽，使得FliC蛋白中21個(gè)氨基酸的 肽的插入，在凝膠上可以明顯看出尺寸增大的約2.3KDa的鞭毛嵌合體。使用FliC特異性抗體的Western印跡分析顯示在SDS-PAGE凝膠上 得到的條帶為FliC或功能FliC融合蛋白(圖23)。生物轉(zhuǎn)化pSEC194NMLipC的構(gòu)建構(gòu)建pSEC194NMLipC3以顯示FliC展示系統(tǒng)用于生物轉(zhuǎn)化的應(yīng)用。 上述例子集中在可用于生物整治或者疫苗開發(fā)中的抗原決定簇的小肽。 Ezaki等人[(1998) J. Ferm. Bioeng. 86:500-503]和Tanskanen [(2000) Appl. Environ. Micro. 66:4152-4156]均顯示使用大腸桿菌鞭毛蛋白，長(zhǎng)的多肽 (長(zhǎng)度為471和302個(gè)氨基酸)還能被成功展示。已經(jīng)很好地表征了脂肪酶， 并在許多組合物和方法中發(fā)揮作用，包括但不艱于去垢劑、脂肪和油的 甘油醇解、直接酯化反應(yīng)、手性拆分和?；铣蒣Litthauer等人(2002) Enz. Micro. Tech. 30:209-215]。使用融合于豬葡萄球菌脂肪酶的纖維結(jié)合蛋白 B顯示固定在肉葡萄球菌細(xì)胞表面的脂肪酶的用途[Stmuss等人(1996) Mol. Microbiol, 21:491-500〗。通過使用5amHI和ATzoI限制pSEC194NC3構(gòu)建pSEC194NLipC。
使用PCR擴(kuò)增來自喜熱噬油芽孢桿菌染色體DNAOLZ/^)的成熟脂肪酶， 使得信號(hào)序列不存在(圖24)。使用的引物是LipFSD和LipR(參見下文)。 純化并使用5awHI和ATzoI限制PCR產(chǎn)物。LipFSD: 5' GTC CTC GAG GCT TCG CGA GCC AAC GAT G 3'(為I) (SEQ ED NO :62) LipR: 5' GTC GGATCC AGG CCC GAA GCT CGC CA -3' (5awHI) (SEQ ID NO :63)使用Fast-Link DNA連接試劑盒(Epicentre)，將脂肪酶多肽與受限 制的pSEC194NC3連接，得到pSEC194NLipC3。在連接反應(yīng)中使用20ng 載體DNA和60ng脂肪酶。在70°C加熱15分鐘熱滅活連接反應(yīng)。根據(jù) 如上所述，將2pl連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B細(xì)胞中。選擇單陽 性克隆體用于進(jìn)一步的分析。使用pSECNLipC轉(zhuǎn)化嗜堿芽孢桿菌BhFC04以及脂肪酶活性的確定根據(jù)如上所述，進(jìn)行嗜堿芽孢桿菌BhFC04菌株的轉(zhuǎn)化。通過菌落 PCR使用引物M13F (5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3')和LipR篩選克 隆體。從過夜培養(yǎng)物接種50 ml含有氯霉素(10pg/ml)的LB，生長(zhǎng)為OD540 1.2-1.6。根據(jù)如上所述，分離蛋白部分，除了使用5mlLiCl(5M)，而不是 NaOH，從細(xì)胞表面將CS蛋白去除。與NaOH滅活脂肪酶一樣，這可以 獲得最大的脂肪酶活性。使用TCA沉淀EX和CS部分，盡管該方法降 低脂肪酶活性；仍保持足夠的活性以在酶譜(活性凝膠)顯示(圖25)。然而， 該方法自然不能用于準(zhǔn)確定量EX和CS部分內(nèi)的活性。然而，活性凝膠 對(duì)于測(cè)定融合蛋白的實(shí)際尺寸和穩(wěn)定性很有用，可以按照Takahashi等人 [(1998) J. Ferm Bioeng. 86:164-168]的記載進(jìn)行。通過加入非變性加樣染 料并在37。C孵育30分鐘制備試樣。在30mA恒定電流下進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，直至染料前沿到達(dá)凝膠的末端。該凝膠在25mM Tris pH 7.5 和2.5% Triton X-100中孵育過夜，以除去SDS，然后將其轉(zhuǎn)移到平衡緩 沖液(25mM Tris pH 7.5)中停留30分鐘，隨后使用0.1%乙酸-)3-萘酯和 0.2。/。快紅TR鹽(Fast Red TR Salt)在平衡緩沖液中染色以獲得脂肪酶活 性。一旦能清楚看到條帶，使用TE緩沖液(10mM Tris，pH 8， 1 mM EDTA) 洗滌兩次，停止上述反應(yīng)。在CS、 CW和胞內(nèi)部分中觀察到脂肪酶活性，但在胞外部分中并未
觀察到。這些結(jié)果表明FliC-脂肪酶融合體與CW和CS部分保持牢固結(jié)合，并暴露在細(xì)胞表面。cs部分中活性降低可能是由于使脂肪酶滅活的TCA的原因。這些結(jié)果還表明融合蛋白十分穩(wěn)定。下一步是對(duì)在液體培養(yǎng)物中產(chǎn)生的脂肪酶活性進(jìn)行定量(圖26)。使 用pSEC194NC6 (對(duì)照)或者pSEC194NLipC結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的BhFC04的過夜 培養(yǎng)物在含lOpg/ml氯霉素的pH 8.5 Luria肉湯中在30°C進(jìn)行生長(zhǎng)。從 ON培養(yǎng)物接種裝有含10pg/ml氯霉素的pH 8.5 Luria肉湯(60 ml)的兩個(gè) 燒瓶，得到起始的ODs4o為0.1。這些燒瓶在30。C孵育，并在8、 24和 48小時(shí)采樣。整個(gè)細(xì)胞和胞外試樣用于脂肪酶測(cè)試。使用分光光度法以 棕櫚酸對(duì)硝基苯酯作為底物，基本上根據(jù)Vorderwtilbecke等人[(1992) Enzym Microb. Technol. 14:631-639]的方法測(cè)定脂肪分解活性。通過將 90mg棕櫚酸對(duì)硝基苯酯溶解于30 ml 2-丙醇制備測(cè)試溶液1。將脫氧膽 酸鈉(2g)和阿拉伯膠(0.5g)溶解于450ml pH 8 Tris-HCl緩沖液中制備測(cè)試 溶液2。將1 ml的測(cè)試溶液1加到9 ml的測(cè)試溶液2制備乳液。在標(biāo)準(zhǔn) 條件下，通過將60(^1乳液和25^酶制劑孵育進(jìn)行上述測(cè)試。在65。C進(jìn)行反應(yīng)，在410nm測(cè)定吸光度。脂肪酶活性以U/ml Oimol 脂肪酸/min/ml酶)進(jìn)行計(jì)算。對(duì)硝基苯酚在410 nm (pH 8)的消光系數(shù)為 15 (1 x nmor1 x cm" = ml x cm-"。以牛血清白蛋白稀釋液作為標(biāo)準(zhǔn)，通 過Bradford(1976)方法測(cè)定酶試樣的蛋白濃度。最終的活性以U/mg總蛋 白表示，見圖26。該數(shù)據(jù)顯示有可能將酶插入FliC夾層(sandwich)結(jié)構(gòu)， 并保持活性。在嗜堿芽孢桿菌細(xì)胞壁內(nèi)部，F(xiàn)liC/脂肪酶融合蛋白形成非 常穩(wěn)定的復(fù)合物，在細(xì)胞表面仍可獲得脂肪酶活性。顯示酶活性相對(duì)很 強(qiáng)并持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間，而在上清液中幾乎檢測(cè)不到酶活性，這是對(duì)生物轉(zhuǎn) 化有利的兩個(gè)特征。實(shí)施例9免疫原肽作為與鞭毛蛋白的融合體佐劑具有刺激內(nèi)在的免疫性并反過來激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答的能力。 已經(jīng)建立起通過激活A(yù)PC誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)(參見上文)。 一個(gè)例子是成功 產(chǎn)生和表達(dá)鞭毛蛋白增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)融合蛋白。鞭毛蛋白 -EGFP融合蛋白能刺激APC和特異性的抗EGFP T-細(xì)胞應(yīng)答。單獨(dú)的 EGFP既不能刺激APC，也不能刺激特異性的T-細(xì)胞應(yīng)答(Cuadros等人，2004， Inf. Immun. Vol 72， 2810-2816， McSorley等人，2002， J. Immunol. Vol 169,3914-3919)。其他插入到誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的鞭毛蛋白中的肽包括霍 亂毒素亞單元B、乙型肝炎表位、化膿性鏈球菌M蛋白表位、HIV表位 (gp41、 gpl20)、流感A紅血球凝集素表位和來自瘧疾原蟲、Rota病毒、 白喉棒狀桿菌以及腦膜炎球菌外膜蛋白等的各種細(xì)胞表面抗原(Stocker 和Newton， 1994， Intern. Rev. Immunol. Vol 2， 167-178)。 Newton等人， (1995) Res. Microbiol. 146:203-216。已經(jīng)描述了本發(fā)明的多種實(shí)施方案。然而，應(yīng)當(dāng)理解可以在本發(fā)明 的精神和范圍內(nèi)做出各種修改。因此，其他實(shí)施方案仍然落入所附權(quán)利 要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其含有全部或部分細(xì)菌鞭毛蛋白，其中所述部分鞭毛蛋白包含所述鞭毛蛋白的N-端和C-端保守區(qū)；以及異源多肽序列，位于所述鞭毛蛋白的可變區(qū)內(nèi)或者代替所述鞭毛蛋白的可變區(qū)，其中如果由革蘭氏陽性菌細(xì)胞制備所述融合蛋白，那么所述融合蛋白具有能在所述革蘭氏陽性菌細(xì)胞的表面上過表達(dá)的能力。
2. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述異源多肽為具有結(jié)合金 屬離子能力的多肽。
3. 如權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其中所述金屬離子選自鎳、銅、 鎘、鉑、鈀、鈦、銀和金。
4. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中所述異源多肽為聚組氨酸序列。
5. 如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其中所述聚組氨酸序列含有6個(gè) 組氨酸殘基。
6. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中所述異源多肽為 酶或者酶的功能片段。
7. 如權(quán)利要求6所述的融合蛋白，其中所述酶為脂肪酶。
8. 如權(quán)利要求7所述的融合蛋白，其中所述脂肪酶為喜熱噬油芽孢 桿菌脂肪酶A。
9. 如權(quán)利要求6所述的融合蛋白，其中所述酶為水解酶。
10. 如權(quán)利要求6所述的融合蛋白，其中所述酶選自淀粉酶、蛋白 酶、酯酶和纖維素酶。
11. 如權(quán)利要求l所述的融合蛋白，其中所述異源多肽為免疫原。
12. 如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，還包括所述異源多 肽N-端的1-15個(gè)接頭殘基N-端。
13. 如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，還包括所述異源多 肽C-端的l-15個(gè)接頭殘基C-端。
14. 如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，還包括所述異源多 肽N-端的N-端切割位點(diǎn)和所述異源多肽C-端的C-端切割位點(diǎn)。
15. —種編碼權(quán)利要求1所述的融合蛋白的核酸。
16. —種含有權(quán)利要求15所述的核酸序列的載體。
17. 如權(quán)利要求16所述的載體，其中所述核酸序列可操作性地與轉(zhuǎn) 錄調(diào)控元件(TRE)連接。
18. —種含有權(quán)利要求17所述的載體的分離的細(xì)胞。
19. 如權(quán)利要求18所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為原核細(xì)胞。
20. 如權(quán)利要求19所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞。
21. 如權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為革蘭氏陽性菌細(xì)胞。
22. 如權(quán)利要求21所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是芽孢桿菌屬的細(xì)胞。
23. 如權(quán)利要求22所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是嗜堿芽孢桿菌種的細(xì)胞。
24. 如權(quán)利要求23所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是2005年11月23 日在NCIMB以保藏號(hào)_保藏的BhFC04菌株。
25. —種制備融合蛋白的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求18所述 的細(xì)胞以及從培養(yǎng)物中得到所述融合蛋白。
26. —種DNA結(jié)構(gòu)，其含有用于細(xì)菌鞭毛蛋白多肽的全部或部分編碼序列，其中所述部分編碼 序列包含編碼所述鞭毛蛋白的N-端和C-端保守區(qū)的核苷酸；以及含有至少一個(gè)限制性酶位點(diǎn)的核苷酸序列，其插入到編碼所述鞭毛 蛋白多肽的可變區(qū)的序列中或者代替編碼所述鞭毛蛋白多肽的可變區(qū)的 序列。
27. 如權(quán)利要求26所述的結(jié)構(gòu)，其中所述細(xì)菌鞭毛蛋白為孢芽桿菌 鞭毛蛋白。
28. 如權(quán)利要求26所述的結(jié)構(gòu)，其中所述孢芽桿菌鞭毛蛋白為嗜堿 芽孢桿菌鞭毛蛋白(SEQ ID NO:l)。
29. 如權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)所述的結(jié)構(gòu)，其中將所述核苷酸序列 緊鄰SEQ IDNO:l的162-606位核苷酸之間的任意核苷酸之后插入。
30. 如權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)所述的結(jié)構(gòu)，其中將所述核苷酸序列 緊鄰SEQ IDNO:l的441-570位核苷酸之間的任意核苷酸之后插入。
31. 如權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)所述的結(jié)構(gòu)，其中將所述核苷酸序列 緊鄰SEQ IDNO:l的459-540位核苷酸之間的任意核苷酸之后插入。
32. 如權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)所述的結(jié)構(gòu)，其中將所述核苷酸序列 緊鄰SEQ IDNO:l的459位核苷酸之后插入。
33. 如權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)所述的結(jié)構(gòu)，其中將所述核苷酸序列 緊鄰SEQ ID NO:l的540位核苷酸之后插入。
34. —種革蘭氏陽性菌細(xì)胞的基本純的培養(yǎng)物，其中大多數(shù)的革蘭 氏陽性菌細(xì)胞含有缺損的鞭毛蛋白基因，其中所述缺損阻止功能鞭毛蛋 白的表達(dá)。
35. 如權(quán)利要求34所述的培養(yǎng)物，其中所述缺損為通過使用不編碼 多肽或者非功能鞭毛蛋白多肽的DNA序列替代所述大多數(shù)的細(xì)菌細(xì)胞 中的內(nèi)源基因。
36. 如權(quán)利要求34或35所述的培養(yǎng)物，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為革蘭 氏陽性菌細(xì)胞。
37. 如權(quán)利要求36所述的培養(yǎng)物，其中所述革蘭氏陽性菌細(xì)胞為孢 芽桿菌細(xì)胞。
38. 如權(quán)利要求37所述的培養(yǎng)物，其中所述孢芽桿菌細(xì)胞為嗜堿孢 芽桿菌細(xì)胞。
39. 如權(quán)利要求38所述的培養(yǎng)物，其中所述嗜堿孢芽桿菌細(xì)胞選自2005年11月23日在NCIMB以保藏號(hào)_保藏的BhFC04 (A/zag，Aw/ M)細(xì)胞和BhFCOl (AAag)細(xì)胞。
40. 如權(quán)利要求35-39中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)物，其中所述非功能鞭毛 蛋白多肽缺失SEQ IDNO:2的14-226位氨基酸。
41. 如權(quán)利要求34-40中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)物，其中除了含有缺損的鞭毛蛋白基因外，大多數(shù)的細(xì)菌細(xì)胞缺損至少一個(gè)細(xì)胞壁蛋白酶基因。
42. 如權(quán)利要求41所述的培養(yǎng)物，其中所述至少一個(gè)細(xì)胞壁蛋白酶 基因的缺損為使用不編碼多肽或者非功能細(xì)胞壁蛋白酶多肽的DNA序 列替代所述大多數(shù)的細(xì)菌細(xì)胞中的內(nèi)源基因。
43. 如權(quán)利要求41所述的培養(yǎng)物，其中所述的至少一個(gè)細(xì)胞壁蛋白 酶基因?yàn)関w77」基因。
44. 如權(quán)利要求41或43所述的培養(yǎng)物，其中所述缺損包括缺失細(xì) 胞壁蛋白酶基因的整個(gè)編碼序列。
45. —種分離的、含有缺損的鞭毛蛋白基因的革蘭氏陽性菌細(xì)胞， 其中所述缺損阻止功能鞭毛蛋白的表達(dá)。
46. —種芽孢桿菌屬細(xì)菌的基因工程方法，所述方法包括在所述細(xì) 菌的染色體中缺損/^g基因，其中所述缺損阻止所述基因?qū)δ鼙廾?白的表達(dá)。
47. 如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述細(xì)菌為嗜堿芽孢桿菌菌株 BhFC04 (AAflg，
48. 如權(quán)利要求46所述的方法，還包括缺損編碼一個(gè)或多個(gè)蛋白酶 的一個(gè)或多個(gè)基因，其中所述缺損阻止所述一個(gè)或多個(gè)基因?qū)λ龅囊?個(gè)或多個(gè)功能蛋白酶的表達(dá)。
49. 如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞壁蛋白酶 基因含有W7^4基因。
50. —種除去液體中的一種或多種金屬離子的方法，所述方法包括使含有一種或多種金屬離子的液體與權(quán)利要求1所述的融合蛋白接 觸，其中所述的異源多肽為與所述的一種或多種金屬離子結(jié)合的多肽。
51. 如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述液體與在其表面上表達(dá)所 述融合蛋白的細(xì)菌細(xì)胞接觸。
52. 如權(quán)利要求50或51所述的方法，其中所述融合蛋白為細(xì)胞表 面多肽。
53. —種從含有一種或者多種金屬離子的液體中分離所述的一種或 者多種金屬離子的方法，所述方法包括使含有一種或者多種金屬離子的液體與權(quán)利要求1所述的融合蛋白 接觸，其中所述的異源多肽為與所述的一種或者多種金屬離子結(jié)合的多肽，所述接觸使得所述的一種或者多種金屬離子與所述的融合蛋白結(jié)合； 以及從所述融合蛋白分離所述的一種或者多種金屬離子。
54. —種將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的方法，所述方法包括 使酶底物與權(quán)利要求1所述的融合蛋白接觸，其中所述的異源多肽 為酶或者所述酶的功能片段。
55. 權(quán)利要求1所述的融合蛋白在制備用于在哺乳動(dòng)物受試者內(nèi)產(chǎn) 生免疫應(yīng)答的制劑中的用途，其中所述異源多肽為免疫原。
56. —種在哺乳動(dòng)物受試者內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法中使用的物質(zhì)或 者組合物，所述物質(zhì)或組合物含有權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所 述的異源多肽為免疫原，所述方法包括將有效量的所述物質(zhì)或組合物給 予所述的哺乳動(dòng)物受試者。
57. —種產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1所述的 融合蛋白給予哺乳動(dòng)物受試者，其中所述的異源多肽為免疫原。
58. 如權(quán)利要求57所述的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物受試者是人。
59. —種含有表達(dá)載體的試劑盒，所述表達(dá)載體含有權(quán)利要求26所 述的DNA結(jié)構(gòu)。
60. 如權(quán)利要求59所述的試劑盒，還包含至少一種限制性酶。
61. 如權(quán)利要求59或60所述的試劑盒，還包含宿主細(xì)胞，其中所 述宿主細(xì)胞為能在其中復(fù)制所述表達(dá)載體的細(xì)胞。
62. 如權(quán)利要求59-61中任一項(xiàng)所述的試劑盒，還包含用于將編碼異 源多肽的核酸序列插入所述DN A結(jié)構(gòu)中的說明。
63. —種制備附著到革蘭氏陽性菌的細(xì)胞表面的多肽的方法，所述 方法包括使宿主細(xì)胞生長(zhǎng)，從而制備所述多肽，其中所述宿主細(xì)胞含有 編碼權(quán)利要求1所述的融合蛋白的核酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了基于鞭毛蛋白的融合蛋白(FBFP)、編碼FBFP的核酸、含有核酸的載體以及攜帶該載體的宿主細(xì)胞，F(xiàn)BFP可用于各種用途，包括在生物整治中從液體中除去金屬離子、表達(dá)酶或者免疫原。此外，本發(fā)明提供用于在革蘭氏陽性菌細(xì)胞中獲得異源多肽的過表達(dá)和表面展示的方法，特別是嗜堿芽孢桿菌屬。此外，本發(fā)明的特征在于用于在其表面表達(dá)重組FBFP的基因缺損的細(xì)菌。本發(fā)明還包括用于制備FBFP的基因結(jié)構(gòu)以及使用FBFP的方法。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101128480SQ200580046676
公開日2008年2月20日 申請(qǐng)日期2005年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月2日
發(fā)明者埃爾德·貝格爾, 莫林·伊麗莎白·勞, 邁克爾·克雷格·克蘭普頓 申請(qǐng)人:Csir公司