專利名稱：利用sHSPs制備目的蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種目的蛋白的分離和純化方法、目的蛋白的制備方法、以及通過全細(xì)胞酶或部分純化酶來進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的方法，其中添加了有效量的sHSPs(小熱休克蛋白)以防止蛋白酶降解目的蛋白。

背景技術(shù)：
由于重組DNA技術(shù)的顯著發(fā)展，使得通過E.coli、酵母、真菌、植物、動物以及昆蟲細(xì)胞大量生產(chǎn)可供于醫(yī)用和工業(yè)用上的蛋白成為可能，而從自然界中僅能少量地獲取這些蛋白。例如，已經(jīng)成功的利用重組E.coli生產(chǎn)諸如干擾素、白介素2、集落刺激因子、生長激素、胰島素樣生長因子以及人血清白蛋白等蛋白質(zhì)(Lee.SY，Trends Biotechnol.，1498，1996)。特別地，很好地建立了E.coli的高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，其中可以以較高的產(chǎn)率大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白，從而降低目的蛋白生產(chǎn)的成本。然而，即便可以通過有效的載體表達(dá)系統(tǒng)來大量生產(chǎn)有用蛋白，如果沒有建立較好的蛋白分離和純化系統(tǒng)，蛋白的最終產(chǎn)率會迅速降低。在蛋白合成較為困難、費(fèi)時(shí)費(fèi)力或者蛋白本身產(chǎn)量較小的情況下，該分離和純化步驟就顯得尤為重要。
蛋白的分離和純化通常包括如下步驟(1)細(xì)胞抽提用玻璃勻漿器、混合器、polytron和超聲儀等儀器來破壞細(xì)胞或組織，隨后通過離心方法分離；(2)溶解當(dāng)要分離和純化不溶性蛋白時(shí)，首先，需要將蛋白溶解。采用不同性質(zhì)的表面活性劑(SDS、曲拉通X-100、諾乃洗滌劑P-40、CHAPS等)作為溶解生物細(xì)胞膜蛋白的試劑；(3)蛋白的分離、濃縮和透析在純化蛋白樣品之前采用基于蛋白溶解性的硫酸銨沉淀法，基于蛋白分子量不同的分子量截留法，基于多孔纖維素膜的透析法等方法；以及(4)蛋白的最終純化因?yàn)榧兓鞍椎姆椒ㄈ缦卤?那樣是多種多樣的，那么就需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的和材料類型對各種方法進(jìn)行組合從而實(shí)現(xiàn)純化。一般來說，在初始步驟中，需要具有大量處理能力的方法，即便其分離能力在某種程度而言是較低的，而隨著最后步驟的臨近則需采用具有高分離能力的方法。
表1純化蛋白的典型方法 為了防止蛋白酶造成的酶解，需要采用并混入蛋白酶抑制劑。例如，采用0.4～4.0mM Petabloc SC(AEBSF；(4-(2-氨基乙烷)-苯磺酸氟化物氫氯化物)，0.1～1.0mM PMSF(苯甲基磺酰氟化物)以及5～50mM亮肽酶素用來對抗中性絲氨酸蛋白酶，0.5～5mM EDTA用來對抗中性金屬蛋白酶，0.1～30mM E-64用于對抗半胱氨酸蛋白酶，以及1mM抑肽素用于對抗天冬氨酸，也常使用混合有各種抑制劑的混合物(cocktail)。
然而，即便采用了蛋白酶抑制劑蛋白酶降解作用也無法被完全抑制。尤其在分離純化植物抽提物、或諸如胰腺、胃、肝臟或脾等動物組織中的目的蛋白時(shí)，由于其中的各種蛋白酶比較豐富或者目的蛋白本身容易受到蛋白酶的攻擊，蛋白的損失很嚴(yán)重。
同時(shí)，sHSPs是分子量為12-43kDa的低分子量熱休克蛋白(HSPs)，其受到諸如熱休克或特定蛋白過度產(chǎn)生等環(huán)境壓力的誘導(dǎo)。一種或多種sHSPs存在于來自從真核細(xì)胞到原核細(xì)胞的所有生物體中，如下表2中列出了已知的sHSPs。
ATP非依賴sHPSs的防止蛋白不可逆凝集的功能是通過結(jié)合熱環(huán)境下的變性蛋白而實(shí)現(xiàn)的，并協(xié)同于ATP依賴性熱休克蛋白使得變性蛋白由此重新正確的折疊，從而使變性蛋白恢復(fù)到原始狀態(tài)。例如，Kitagawa等人已經(jīng)公布了源自E.coli的IbpA和IbpB從而防止了由于熱或氧化劑而導(dǎo)致的檸檬酸合成酶的失活(Kitagawa等人，Eur.J.Biochem.，2692907，2002)，以及Lee等人則已公布的源自豌豆的HSP18.1可以防止變性蛋白的凝集，例如熱環(huán)境下的蘋果酸脫氫酶(MDH)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Lee等人，EMBOJ.，16∶659，1997).Horwitz等人已經(jīng)公布了源自人類的α-晶狀體球蛋白可以防止蛋白凝集以利于對透析過程中的變性目的蛋白重新進(jìn)行正確折疊(Horwitz等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89∶10449，1992)。公布了源自Badyrbizobium血吸蟲(Badyrbizobium japonicum)的sHSPs可以防止熱導(dǎo)致的檸檬酸合成酶凝集(Studer和Narberhaus，J.Biol.chem.，27537212，2000)。公布了，由于Pfu-sHSP從生物體中純化而來，其在熱條件下是穩(wěn)定的，從而可以保護(hù)處于熱環(huán)境中的細(xì)胞蛋白(WO 01/79250 A1)，其可以對Taq-聚合酶以及在PCR期間處于高溫環(huán)境中的其它酶起到穩(wěn)定作用。Ehrnsperger等人也公布了鼠源sHSP25可以對處于診斷分析時(shí)不穩(wěn)定的蛋白或肽產(chǎn)生穩(wěn)定作用。(Ehrnsperger等人，Anal.Biochem.，259218.1998) 該sHSPs具有在進(jìn)化過程中的保守區(qū)，其也起基本相似的功能。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)遞交了關(guān)于用來防止蛋白降解的含sHSPs組合物以及采用sHSPs進(jìn)行二維凝膠電泳的方法的專利申請(PCT/KR03/02539)。然而，尚未公布可以有效防止在目的蛋白的培養(yǎng)、分離純化以及使用了全細(xì)胞酶或部分純化細(xì)胞酶的反應(yīng)過程中由于蛋白酶所導(dǎo)致的目的蛋白的降解。
表2sHSPs家族 因此，發(fā)明人進(jìn)行了大量研究并開發(fā)了用來防止在制備目的蛋白的培養(yǎng)過程、分離純化過程以及使用目的蛋白作為生物催化劑進(jìn)行酶促反應(yīng)過程中由于蛋白酶所導(dǎo)致的目的蛋白的降解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如果采用sHSPs可以防止蛋白酶所導(dǎo)致的目的蛋白的損失，從而完成了本發(fā)明。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于提供用于分離純化目的蛋白的方法，其特征在于為了分離純化從而發(fā)生由蛋白酶導(dǎo)致目的蛋白的降解過程中加入有效量sHSPs。
本發(fā)明的另一目的在于是提供用于制備目的蛋白的方法，其特征在于會發(fā)生由蛋白酶導(dǎo)致目的蛋白的降解的培養(yǎng)過程中加入有效量的sHSPs。
本發(fā)明的另一目的在于提供用于制備目的蛋白的方法，其特征在于對包含sHSP基因的重組微生物進(jìn)行培養(yǎng)。
本發(fā)明的又一目的在于提供用于采用全細(xì)胞酶或部分純化酶來進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于添加了有效量的sHSPs。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種用于從表達(dá)有目的蛋白的細(xì)胞或者其培養(yǎng)物中分離純化目的蛋白的方法，其特征在于在分離純化過程中添加了有效量的sHSPs以防止發(fā)生由蛋白酶導(dǎo)致目的蛋白的降解。
在另一方面，本發(fā)明提供一種用于以細(xì)胞培養(yǎng)的方式來制備目的蛋白的方法，其特征在于在培養(yǎng)過程中添加了有效量的sHSPs以防止發(fā)生由蛋白酶導(dǎo)致目的蛋白的降解。
在又一方面，本發(fā)明提供一種用于以細(xì)胞培養(yǎng)的方式來制備目的蛋白的方法，其特征在于采用帶有sHSP基因的重組細(xì)胞來防止在培養(yǎng)期間發(fā)生由蛋白酶導(dǎo)致目的蛋白的降解。
在本發(fā)明中，具有sHSP基因的重組細(xì)胞是一種染色體中插入sHSP基因的細(xì)胞，或者是一種用含sHSP基因的重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，也可以是使sHSP基因和目的蛋白基因以融和蛋白的形式共表達(dá)的重組細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明提供一種用于利用色譜從表達(dá)有目的蛋白的細(xì)胞或者其培養(yǎng)物中分離純化目的蛋白的方法，其特征在于采用了樹脂或珠子上固定有有效量sHSPs的色譜法來防止發(fā)生由蛋白酶導(dǎo)致目的蛋白的降解。
在另一方面，本發(fā)明提供一種用于從反應(yīng)基質(zhì)中制備目的物質(zhì)的方法，該反應(yīng)利用全細(xì)胞酶或部分純化酶，其特征在于在反應(yīng)過程中添加了有效量的sHSPs來防止由蛋白酶導(dǎo)致的降解。
在又一方面，本發(fā)明提供了一種方法，其特征在于在處理目的物質(zhì)的過程中使用了sHSPs以防止發(fā)生由蛋白酶導(dǎo)致目的蛋白的降解。
在本發(fā)明中，sHSPs優(yōu)選為一種或多種選自由如下物質(zhì)所構(gòu)成的組中，其包括源自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的IbpA、源自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的sHSPs、源自Bradyrbizobium血吸蟲(BradyrbizobiumJaponicum)的HSPB、HSPH、HSPC以及HSPF、源自豬布魯桿菌(Brucella suis)的IbpA、源自蚜蟲巴克納氏菌(Bruchnera aphidicola)的sHSPs、源自蚜蟲巴克納氏菌(Bruchnera aphidicola(Acyrthosiphon pisum))的IbpA，源自柑橘衰退病(Citrus tristeza)病毒的sHSPs，源自E.coli的IbpA和IbpB、源自幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)的IbpB、人源HSP27和α、β-晶狀體球蛋白、源自甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的HSP16.5。源自Methanopyrus kandleri的IbpA、鼠源HSP25、源自麻風(fēng)桿菌(Mycobacterium leprae)的sHSPs、源自結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的HSP16.3、源自Poirellulasp.的IbpB、源自豌豆(Pisum sativum(pea))的HSP18.1、源自Plasmdiumfalciparum的sHSPs、源自假單胞菌屬(genus Pseudomonas)的IbpA、源自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的HSP26、源自Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhi的IbpA和IbpB、源自Salmonella typhimurium的IbpA和IbpB、源自Salmonella oneidensis的IbpA、源自弗累克斯訥氏桿菌(Shigella flexneri)的IbpA和IbpB、源自苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的IbpA、源自Streotocuccus pyogenes的IbpA、源自天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)的sHSPs、源自硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)的sHSPs、源自武爾坎聚球菌(Synechococcus vulcanus)的HSP16、源自騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)的IbpA、源自嗜酸熱原體(Thermoplasma acidophilum)的IbpA、源自鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)的IbpA和IbpB，以及更優(yōu)選一種或多種選自由源自E.coli的IbpA、IbpB、IbpAB、和源自假單胞菌屬(genus Pseudomonas)的IbpA以及源自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的HSP26所構(gòu)成的組中的物質(zhì)。
在本發(fā)明中，為了防止發(fā)生由蛋白酶導(dǎo)致的降解而添加的sHSPs量的范圍優(yōu)選0.1-50份重量份，更優(yōu)選0.5-20份重量份，該重量份相對于100份的總蛋白重量。如果sHSPs的添加量少于0.1份重量份就完全不足以防止蛋白的降解，如果添加量超過20份重量份那么過量的sHSPs也會妨礙目的蛋白的分離純化或者考慮到sHSPs的成本其會導(dǎo)致相反的作用。



圖1為質(zhì)粒pTac99IbpAH的基因圖譜。
圖2為質(zhì)粒pTac99IbpBH的基因圖譜。
圖3為質(zhì)粒pTac99PPIbpAH的基因圖譜。
圖4為質(zhì)粒pTac99HSP26H的基因圖譜。
圖5為顯示了重組E.coli XL1-Blue所表達(dá)的IbpA、IbpB、PPIbpA或HSP26蛋白純化結(jié)果的電泳圖，其中重組E.coli XL1-Blue分別轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pTac99IbpAH、pTac99IbpBH、pTac99PPIbpAH以及pTac99HSP26H。在(A)中，條帶M顯示了分子量標(biāo)準(zhǔn)、條帶1和2顯示了純化的IbpA、條帶3和4顯示純化的IbpB、條帶5和6顯示純化的PPIbpA。在(B)中，條帶M顯示了分子量標(biāo)準(zhǔn)、條帶1-3顯示純化HSP26。
圖6顯示了由裂解液中的sHSPs對蛋白酶的抑制作用，其中添加了人血清白蛋白。(A)代表作為對照的不含sHSPs的細(xì)胞裂解液，條帶M顯示分子量標(biāo)準(zhǔn)、條帶1顯示僅含0.5ug/uL人體血清白蛋白的細(xì)胞解液，條帶2顯示往0.5ug/uL人體血清白蛋白中添加了0.05ug/uL胰蛋白酶的溶液，條帶3顯示往0.5ug/uL人體血清白蛋白中添加了0.025ug/uL胰蛋白酶的溶液，條帶4顯示往0.5ug/uL人體血清白蛋白中添加了0.017ug/uL胰蛋白酶的溶液，條帶5顯示往0.5ug/uL人體血清白蛋白中添加了0.01ug/uL胰蛋白酶的溶液。(B)、(C)以及(D)顯示分別添加了IbpA、IbpB及HSP26的細(xì)胞裂解液，條帶M顯示分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶1顯示往0.5μg/μL的人血清白蛋白中僅添加0.005μg/μLsHSPs的細(xì)胞裂解液，條帶2顯示往0.5μg/μL的人血清白蛋白中添加0.05μg/μL胰蛋白酶和0.005μg/μL sHSPs的細(xì)胞裂解液，條帶3顯示往0.5μg/μL的人血清白蛋白中添加0.025μg/μL胰蛋白酶和0.005μg/μL sHSPs的細(xì)胞裂解液，條帶4顯示往0.5μg/μL的人血清白蛋白中添加0.017μg/μL胰蛋白酶和0.005μg/μL sHSPs的細(xì)胞裂解液，條帶5顯示往0.5μg/μL的人血清白蛋白中添加0.01μg/μL胰蛋白酶和0.005μg/μL sHSPs的細(xì)胞裂解液。(E)顯示其中添加了各種蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，條帶M顯示分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶1顯示僅添加0.5ug/uL人血清白蛋白的細(xì)胞裂解液，條帶2顯示往0.5ug/uL的人血清白蛋白中添加0.05ug/uL胰蛋白酶的溶液，條帶3顯示往0.5μg/μL的人血清白蛋白中添加0.025μg/μL胰蛋白酶溶液，條帶4顯示往0.5μg/μL的人血清白蛋白中添加0.05μg/μL胰蛋白酶和1mM PMSF的溶液，條帶5顯示往0.5μg/μL的人血清白蛋白中添加0.025μg/μL胰蛋白酶和1mMPMSF的溶液，條帶6顯示往0.5μg/μL的人血清白蛋白中添加0.05μg/μL胰蛋白酶和4mM Pefabloc SC的溶液，條帶7顯示往0.5μg/μL的人血清白蛋白中添加0.025μg/μL胰蛋白酶和4mM PMSF的溶液，條帶8顯示往0.5μlg/μL的人血清白蛋白中添加0.05μg/μL胰蛋白酶和雞尾酒抑制劑(7ml/片)的溶液，條帶9顯示往0.5μg/μL的人血清白蛋白中添加0.025μg/μL胰島素和雞尾酒抑制劑(7ml/片)的溶液，條帶10顯示往0.5μg/μL的人血清白蛋白中添加0.05μg/μL胰蛋白酶和1mM EDTA的溶液，條帶11顯示往0.5μg/μL的人血清白蛋白中添加0.025μg/μL胰蛋白酶和1mM EDTA的溶液。箭頭代表人血清白蛋白。
圖7顯示通過添加了人血清白蛋白的細(xì)胞裂解液中sHSPs產(chǎn)生的蛋白酶抑制作用的電泳圖。(A)代表作為對照的不含sHSPs的細(xì)胞裂解液，條帶M顯示分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶1顯示僅添加0.5μg/μL人血清白蛋白的細(xì)胞裂解液，條帶2顯示往0.5μg/μL的人血清白蛋白中添加1.5×10-3μg/μL蛋白酶K的溶液，條帶3顯示往0.5μg/μL的人血清白蛋白中添加0.5×10-3μg/μL蛋白酶K的溶液，條帶4顯示往0.5μg/μL的人血清白蛋白中添加1.5×10-4μg/μL蛋白酶K的溶液，條帶5顯示往0.5μg/μL的人血清白蛋白中添加0.5×10-4μg/μL蛋白酶K的溶液。(B)、(C)和(D)代表其中分別添加了IbpA、IbpB和HSP26的細(xì)胞裂解液，條帶M顯示分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶1顯示僅往0.5μg/μL人血清白蛋白中添加0.005μg/μL sHSPs的細(xì)胞裂解液，條帶2顯示往0.5μg/μL人血清白蛋白中添加1.5×10-3μg/μL蛋白酶K和0.005μg/μL sHSPs的溶液，條帶3顯示往0.5μg/μL人血清白蛋白中添加0.5×10-3μg/μL蛋白酶K和0.005μg/μL sHSPs的溶液，條帶4顯示往0.5μg/μL人血清白蛋白中添加1.5×10-4μg/μL蛋白酶K和0.005μg/μL sHSPs的溶液，條帶5顯示往0.5μg/μL人血清白蛋白中添加0.5×10-4μg/μL蛋白酶K和0.005μg/μL sHSPs的溶液。箭頭代表人血清白蛋白。(E)代表其中添加了各種蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，條帶M顯示分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶1顯示僅添加0.5μg/μL人血清白蛋白的細(xì)胞裂解液，條帶2顯示往0.5μg/μL人血清白蛋白中添加0.5×10-3μg/μL蛋白酶K和4mM Pefabloc SC的溶液，條帶3顯示往0.5μg/μL人血清白蛋白中添加1.5×10-4μg/μL蛋白酶K和4mM Pefabloc SC的溶液，條帶4顯示往0.5ug/uL人血清白蛋白中添加0.5×10-3ug/uL蛋白酶K和雞尾酒抑制劑(7ml/片)的溶液，條帶5顯示往0.5μg/μL人血清白蛋白中添加1.5×10-4μg/μL蛋白酶K和雞尾酒抑制劑(7ml/片)的溶液，條帶6顯示往0.5μg/μL人血清白蛋白中添加0.5×10-3μg/μL蛋白酶K和1mM EDTA的溶液，條帶7顯示往0.5μg/μL人血清白蛋白中添加1.5×10-4μg/μL蛋白酶K和1mM EDTA的溶液。箭頭代表人血清白蛋白。
圖8為sHSPs在分離純化過程中防止目的蛋白降解的示意圖。

具體實(shí)施例方式 下面通過舉例方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)地描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易明白這些例子僅用作闡述目的而不會對本發(fā)明的保護(hù)范圍作出限定。
特別地，此處所舉例子被用來闡述源自E.coli的IbpA和IbpB、源自假單胞菌屬(genus Pseudomonas)的IbpA、以及源自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作為sHSPs的HSP26，然而可以理解的是表2所述的sHSPs可以不受限制的用于本發(fā)明中。
實(shí)施例1包含ibpA、ibpB或HSP26基因的重組質(zhì)粒的制備 E.coli W3110(ATCC 39936)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)KT2440(ATCC 47054)以及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的染色體DNA按照Sambrook等的方法(分子克隆，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)，NY，1989)進(jìn)行分離和純化。
E.coli W3110，惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)KT2440以及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)分別在500ml LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。通過離心法收集處于早期指數(shù)生長期的菌株，然后于在50ml含10mg/mL溶菌酶的TE溶液中懸浮(10mM Tris，1mM EDTA；pH7.6)。菌株懸液在室溫中緩慢振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。
為了破壞菌株并去除蛋白，往培養(yǎng)基中添加了16ml 10％的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液和570uL 20mg/mL的蛋白酶K(美國Sigma公司)，隨后在37℃中反應(yīng)1小時(shí)。
接下來，溶解在0.7M NaCl溶液中的14ml 5M NaCl溶液和10.66ml的10％CTAB(溴化十六烷基三甲基季銨鹽，美國Sigma公司)加入到反應(yīng)溶液中，隨后在65℃下反應(yīng)10分鐘。在此之后，加入與反應(yīng)溶液相同體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)并在室溫下小心混合2小時(shí)。該混合液在6000rpm下離心10分鐘，并將懸浮液轉(zhuǎn)入到破碎機(jī)中，緩慢加入2倍懸浮液體積的冰乙醇以沉淀染色體DNA。該沉淀的DNA纏繞在玻璃棒上并被取出，用空氣干燥該玻璃棒以去除乙醇，并將染色體DNA溶解在1mL TE溶液中。
往DNA溶液中添加終濃度為50μg/ml的RNase(美國Sigma公司)，隨后在37℃下反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完畢，加入與反應(yīng)溶液等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，并在室溫下小心攪拌2小時(shí)。
該混合液在6000rpm條件下離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入破碎機(jī)中，往所沉淀的染色體DNA中緩緩加入2倍上清液體積的冰乙醇。沉淀的DNA纏繞在玻璃棒上并被取出。玻璃棒經(jīng)空氣干燥后去除乙醇，最后將純化的E.coli W3110、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)KT2440以及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)染色體DNA分別溶解在1ml TE溶液中。
為使IbpA、IbpB、ppIbpA或HSP26蛋白的表達(dá)和純化變得容易，按照如下方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pTac99IbpAH、pTac99IbpBH、pTac99ppIbpAH以及pTac99HSP26H。
采用E.coli W3110染色體DNA作為模板，以序列1和2作為引物以及序列3和4作為引物進(jìn)行PCR從而獲取源自E.coli的ibpA-6his和ibpB-6his基因。
此外，以惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)KT2440染色體DNA作為模板，序列5和6作為引物進(jìn)行PCR從而獲取源自惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的ppibpA-6his基因。在惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)KT2440基因組中，ibpB基因是未知基因。
以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)染色體DNA作為模板，以序列7和8作為引物進(jìn)行PCR從而獲取源自惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的HSP26-6his基因。
所有PCR反應(yīng)都在在下條件下進(jìn)行在95℃預(yù)變性5分鐘；在95℃變性50秒，在55℃退火1分鐘，在72℃延伸1分30秒鐘，循環(huán)30次；最后在72℃延伸5分鐘。
將所獲得的ibpA-6his、ibpB-6his、PPibpA-6his和HSP26-his基因各自插入到用EcoRI和HindIII酶切的重組pTac99A質(zhì)粒中，從而分別構(gòu)建質(zhì)粒pTac99IbpAH、pTac99IbpBH、pTac99PPIbpAH和pTac99HSP26H(圖1、圖2、圖3和圖4)。
重組質(zhì)粒pTac99A是一種將pTrc99A的trc啟動子(Pharmacia Biotech.，Uppsala，瑞典)轉(zhuǎn)化為pKK223-3的tac啟動子(Pharmacia Biotech.，Uppsala，瑞典)，并通過限制性酶PvuII和EcoRI對pTrc99A的trc啟動子進(jìn)行酶切，然后把pKK223-3的tac啟動子的酶切片段插入用相同的限制性酶進(jìn)行酶切的pTrc99A中。
序列15′-ggaattcatgcgtaactttgatttatccccg-3′ 序列25′-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggttgatttcgatacggcgcgg-3′ 序列35′-ggaattcatgcgtaacttcgatttatccccactg-3′ 序列45′-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggctatttaacgcgggacgttcgct-3′ 序列55′-ggaattcatgaccatgactactgctttc-3′ 序列65′-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggttcagcgctggttttt-3′ 序列75′-ggaattcatgtcatttaacagtccatttt-3′ 序列85′-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggttaccccacgattcttgaga-3′ 實(shí)施例2IbpA、IbpB以及HSP26蛋白的純化 轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒pTac99IbpAH、pTac99IbpBH、pTac99PPIbpAH以及pTac99HSP26H的E.coli XL 1-Blue(美國Stratagene)分別在含50mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(酵母抽提物5g/L，色氨酸10/L，NaCl 10g/L)中進(jìn)行培養(yǎng)，上述重組質(zhì)粒分別包含了實(shí)施例1中的IbpA、IbpB或HSP26蛋白的編碼基因。
在600nm下分光光度檢測光密度(O.D.)達(dá)0.7的時(shí)候加入1mM IPTG(異丙基-β-硫代半乳糖苷)以誘導(dǎo)表達(dá)IbpA、IbpB、PPIbpA以及HSP26蛋白。誘導(dǎo)4小時(shí)后，取每種培養(yǎng)基1mL并在6000rpm、4℃條件下離心5分鐘，隨后將所獲得的沉淀用0.5mL的TE溶液進(jìn)行洗滌(10mM Tris-HCl，1mMEDTA；pH8.0)并在6000rpm、4℃條件下離心5分鐘從而獲得沉淀。該沉淀物懸浮在0.2mL平衡液中(8M尿素，100mM NaH2PO4，10mM Tris；pH8.0)，超聲破碎并分級。
上述懸浮液在4℃、10,000rpm條件下離心10分鐘，收集上清液并通過平衡液預(yù)平衡Ni-NTA離心柱(美國Qiagen)。隨后該溶液2,000rpm離心2分鐘。600μL洗脫液(8M尿素，100mM NaH2PO4，10mM Tris；pH6.3)兩次通過柱。往柱子中引入200μL洗提液(8M尿素，100mM NaH2PO4，10mM Tris；pH4.5)以純化IbpA、IbpB和HSP26蛋白。
取200μL分別包含經(jīng)純化的IbpA、IbpB和HSP26蛋白的溶液并與50μLSDS-PAGE樣品液(25％甘油，2％SDS，14.4mM 2-巰基乙醇，0.1％溴酚藍(lán)，60mMTris-HCl)混合。該混合液在沸水煮10分鐘并在12％分離膠中進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。接著，將凝膠浸泡在染色液中(甲醇40％，醋酸10％，0.25g/L的考馬斯亮藍(lán)R)超過2小時(shí)以對其進(jìn)行染色，并在脫色液(40％甲醇，7％醋酸)中脫色2次，每次脫色2小時(shí)。
圖5為電泳圖，其顯示分別轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pTac99IbpAH、pTac99IbpBH、pTac99PPIbpAH以及pTac99HSP26H的重組E.coli XL-1 Blue所表達(dá)的IbpA、IbpB、PPIbpA和HSP26蛋白的純化結(jié)果。如圖5所示，經(jīng)純化的IbpA、IbpB、PPIbpA和HSP26的純度幾乎達(dá)100％。
實(shí)施例3sHSPs對由胰蛋白酶所導(dǎo)致的目的蛋白降解過程所產(chǎn)生的作用 由于目的蛋白在細(xì)胞裂解液中容易受到蛋白酶的攻擊，而造成目的蛋白的嚴(yán)重?fù)p失。在該實(shí)施例中，作為目的蛋白的人血清白蛋白在細(xì)胞裂解液中被稀釋，隨后在含作為蛋白酶的多種濃度胰蛋白酶溶液中室溫培養(yǎng)2小時(shí)。蛋白酶相對于目的蛋白的濃度變?yōu)?、1/10、1/20、1/30和1/50。源自E.coli的IbpA和IbpB和源自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的HSP26被用作sHSPs。
圖6為電泳圖，其顯示了添加有人血清白蛋白的細(xì)胞裂解液中sHSPs對蛋白酶的抑制作用。如圖6所示，目的蛋白、人血清白蛋白在含sHSPs的溶液中幾乎沒有降解，而另一方面，對照溶液中大部分人血清白蛋白則由于受到蛋白酶的攻擊而降解。將圖6(A)和6(D)中的條帶2進(jìn)行對照，人血清白蛋白被胰島素完全降解，而在含有少量sHSP的溶液中則幾乎沒有降解。同樣地，對圖6(B)-6(D)中的條帶2和3進(jìn)行比較可以證實(shí)sHSPs可以比傳統(tǒng)蛋白酶抑制劑更有效地防止目的蛋白的降解。
實(shí)施例4sHSPs對蛋白酶K導(dǎo)致的目的蛋白降解的影響 在該實(shí)施例中，采用另外一種蛋白酶即蛋白酶K來實(shí)施上述相同的實(shí)驗(yàn)。將人血清白蛋白作為目的蛋白稀釋到細(xì)胞裂解液中，并在多種濃度的蛋白酶K中室溫培養(yǎng)2小時(shí)。蛋白相對于目的蛋白的濃度分別為0、1/300、1/1000、1/3000和1/10000。把源自E.coli的IbpA和IbpB以及源自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的HSP26作為sHSPs。
圖7為電泳圖，其顯示了添加有人血清白蛋白的細(xì)胞裂解液中sHSPs的蛋白酶抑制作用。如圖7所示，目的蛋白即人血清白蛋白在含有sHSPs的溶液中幾乎沒有降解，另一方面，在對照溶液中大多數(shù)人血清白蛋白受到蛋白酶的攻擊而被降解了。分別對圖7(A)-7(D)中的條帶3和4進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)大多數(shù)人血清白蛋白被蛋白酶K所降解，而在含有少量sHSP的溶液則幾乎沒有降解。
同樣地對圖7(B)-7(D)中的條帶3以及圖7(E)中的條帶2、4和6進(jìn)行比較，可以證實(shí)sHSPs可以比傳統(tǒng)的蛋白酶抑制劑更有效地防止目的蛋白的降解。
間接實(shí)施例 通過上述實(shí)施例可以理解如果在目的蛋白的分離純化過程中加入sHSPs可以防止由蛋白酶所引起的目的蛋白降解。然而，從實(shí)際來看大多數(shù)微生物在培養(yǎng)的時(shí)候就產(chǎn)生并釋放出蛋白酶，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解即使在制備目的蛋白的培養(yǎng)過程中加入sHSPs也能夠防止目的蛋白的降解，或者將sHSP基因轉(zhuǎn)化目的蛋白制備細(xì)胞中隨后進(jìn)行培養(yǎng)使得sHSPs和目的蛋白同時(shí)進(jìn)行表達(dá)，在這種情況下也能夠防止目的蛋白的降解。
因此，本發(fā)明圖8顯示了在微生物分離純化過程中使目的蛋白降解最小化的示意圖。如圖8所示，其包括其中在目的蛋白分離純化的各個(gè)步驟中加入經(jīng)純化的sHSPs的方法，或者其中sHSPs與目的蛋白在初始步驟中體外共表達(dá)的方法。如果要使sHSPs和目的蛋白在細(xì)胞中共表達(dá)，可以通過插入細(xì)胞染色體的方法或者以質(zhì)粒形式插入的方法或者通過采用直接連接肽以制備帶有目的蛋白的融合蛋白的方法來表達(dá)sHSPs。
本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，由于全細(xì)胞酶或部分純化酶中含有蛋白酶，因而如果在采用全細(xì)胞酶或部分純化酶的反應(yīng)過程中加入sHSPs也可以防止由蛋白酶所導(dǎo)致的目的蛋白的降解。
雖然參照特定的例示性實(shí)施方式對本發(fā)明作了描述，但是其并不對本發(fā)明產(chǎn)生限制作用而僅由所附權(quán)利要求對本發(fā)明進(jìn)行限定。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不脫離本發(fā)明范圍和實(shí)質(zhì)的情況下對本發(fā)明實(shí)施方式作出改變和修飾。
工業(yè)實(shí)用性 如上所述，本發(fā)明所起作用在于提供了防止由蛋白酶所導(dǎo)致的目的蛋白降解的方法，其中在為制備目的蛋白而進(jìn)行的培養(yǎng)、分離和純化過程以及在采用目的蛋白作為生物催化劑的酶促反應(yīng)中采用了sHSPs。通過在生物體的分離純化過程中加入本發(fā)明所述的諸如IbpA、IbpB、IbpAB、HSP26之類的sHSPs，可以防止由蛋白酶所導(dǎo)致的目的蛋白的損失，并且sHSPs可以比傳統(tǒng)昂貴的蛋白酶抑制劑更有效地防止蛋白酶對目的蛋白的降解。因此，本發(fā)明可被期望用于有效改進(jìn)目的蛋白的制備方法以及采用目的蛋白的方法。
權(quán)利要求
1.一種從表達(dá)有目的蛋白的細(xì)胞或者其培養(yǎng)物中分離和純化目的蛋白的方法，其特征在于，在分離和純化過程中添加了有效量的sHSPs以防止發(fā)生由蛋白酶導(dǎo)致目的蛋白的降解。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的目的蛋白分離和純化的方法，其特征在于，sHSPs為一種或多種選自如下一組物質(zhì)中，該組包括源自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的IbpA、源自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的sHSPs、源自Bradyrbizobium血吸蟲(Bradyrbizobium Japonicum)的HSPB、HSPH、HSPC以及HSPF、源自豬布魯桿菌(Brucella suis)的IbpA、源自蚜蟲巴克納氏菌(Bruchnera aphidicola)的sHSPs、源自蚜蟲巴克納氏菌(Bruchneraaphidicola(Acyrthosiphon pisum))的IbpA，源自柑橘衰退病(Citrus tristeza)病毒的sHSPs，源自E.coli的IbpA和IbpB、源自幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)的IbpB、人源HSP27和α、β-晶狀體球蛋白、源自甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)的HSP 16.5，源自Methanopyrus kandleri的IbpA、鼠源HSP25、源自麻風(fēng)桿菌(Mycobacterium leprae)的sHSPs、源自結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的HSP 16.3、源自Poirellula sp.的IbpB、源自豌豆(Pisum sativum(pea))的HSP 18.1、源自Plasmdium falciparum的sHSPs、源自假單胞菌屬(genus Pseudomonas)的IbpA、源自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的HSP26、源自Salmonella enterica subsp.entericaserovar Typhi的IbpA和IbpB、源自Salmonella typhimurium的IbpA和IbpB、源自Salmonella oneidensis的IbpA、源自弗累克斯訥氏桿菌(Shigella flexneri)的IbpA和IbpB、源自苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的IbpA、源自Streotocuccus pyogenes的IbpA、源自天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)的sHSPs、源自硫化葉菌(Sulflobus solfataricus)的sHSPs、源自武爾坎聚球菌(Synechoeoccus vulcanus)的HSP16、源自騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)的IbpA、源自嗜酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum)的IbpA、源自鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis)的IbpA和IbpB。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離和純化目的蛋白的方法，其特征在于，sHSPs為一種或多種選自下列一組物質(zhì)中，該組包括源自E.coli的IbpA、IbpB、IbpAB、和源自假單胞菌屬(genus Pseudomonas)的IbpA以及源自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的HSP26。
4.一種以細(xì)胞培養(yǎng)的方式制備目的蛋白的方法，其特征在于，在培養(yǎng)過程中添加了有效量的sHSPs以防止發(fā)生由蛋白酶導(dǎo)致目的蛋白的降解。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備目的蛋白的方法，其特征在于，sHSPs為一種或多種選自如下一組物質(zhì)中，該組包括源自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的IbpA、源自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的sHSPs、源自Bradyrbizobium血吸蟲(Bradyrbizobium Japonicum)的HSPB、HSPH、HSPC以及HSPF、源自豬布魯桿菌(Brucella suis)的IbpA、源自蚜蟲巴克納氏菌(Bruchnera aphidicola)的sHSPs、源自蚜蟲巴克納氏菌(Bruchneraaphidicola(Acyrthosiphon pisum))的IbpA，源自柑橘衰退病(Citrus tristeza)病毒的sHSPs，源自E.coli的IbpA和IbpB、源自幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)的IbpB、人源HSP27和α、β-晶狀體球蛋白、源自甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的HSP16.5。源自Methanopyrus kandleri的IbpA、鼠源HSP25、源自麻風(fēng)桿菌(Mycobacterium leprae)的sHSPs、源自結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis的HSP 16.3、源自Poirellula sp.的IbpB、源自豌豆(Pisum sativum(Pea))的HSP18.1、源自Plasmdium falciparum的sHSPs、源自假單胞菌屬(genus Pseudomonas)的IbpA、源自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的HSP26、源自Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhi的IbpA和IbpB、源自Salmonella typhimurium的IbpA和IbpB、源自Salmonellaoneidensis的IbpA、源自弗累克斯訥氏桿菌(Shigella flexneri)的IbpA和IbpB、源自苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的IbpA、源自Streotocuccuspyogenes的IbpA、源自天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)的sHSPs、源自硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)的sHSPs、源自武爾坎聚球菌(Synechococcus vulcanus)的HSP16、 源自騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)的IbpA、源自嗜酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum)的IbpA、源自鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis)的IbpA和IbpB。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備目的蛋白的方法，其特征在于，sHSPs為一種或多種選自如下一組物質(zhì)中，該組包括源自E.coli的IbpA、IbpB、IbpAB、和源自假單胞菌屬(genus Pseudomonas)的IbpA以及源自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的HSP26。
7.一種以細(xì)胞培養(yǎng)的方式制備目的蛋白的方法，其特征在于，采用了含有sHSP基因的重組細(xì)胞來防止在培養(yǎng)過程中發(fā)生由蛋白酶導(dǎo)致目的蛋白的降解。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，含有sHSP基因的重組細(xì)胞是染色體中插入了sHSP基因或者轉(zhuǎn)化有含sHSP基因的重組載體的細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，含有sHSP基因的重組細(xì)胞是通過重組從而可以融合蛋白的形式對sHSP基因和目的蛋白基因進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，sHSPs為一種選自如下一組物質(zhì)中，該組包括源自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的IbpA、源自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的sHSPs、源自Bradyrbizobium血吸蟲(Bradyrbizobium Japonicum)的HSPB、HSPH、HSPC以及HSPF、源自豬布魯桿菌(Brucella suis)的IbpA、源自蚜蟲巴克納氏菌(Bruchnera aphidicola)的sHSPs、源自蚜蟲巴克納氏菌(Bruchnera aphidicola(Acyrthosiphon pisum))的IbpA，源自柑橘衰退病(Citrus tristeza)病毒的sHSPs，源自E.coli的IbpA和IbpB、源自幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)的IbpB、人源HSP27和α、β-晶狀體球蛋白、源自甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的HSP16.5。源自Methanopyrus kandleri的IbpA、鼠源HSP25、源自麻風(fēng)桿菌(Mycobacteriumleprae)的sHSPs、源自結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的HSP16.3、源自Poirellula sp.的IbpB、源自豌豆(Pisum sativum(pea)))的HSP18.1、源自Plasmdium falciparum的sHSPs、源自假單胞菌屬(genusPseudomonas)的IbpA、源自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的HSP26、源自Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhi的IbpA和IbpB、源自Salmonella typhimurium的IbpA和IbpB、源自Salmonella oneidensis的IbpA、源自弗累克斯訥氏桿菌(Shigella flexneri)的IbpA和IbpB、源自苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的IbpA、源自Streotocuccus pyogenes的IbpA、源自天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)的sHSPs、源自硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)的sHSPs、源自武爾坎聚球菌(Synechococcus vulcanus)的HSP16、源自騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)的IbpA、源自嗜酸熱原體(Thermoplasma acidophilum)的IbpA、源自鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)的IbpA和IbpB。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，sHSPs為一種選自如下一組物質(zhì)中，該組包括源自E.coli的IbpA、IbpB、IbpAB、和源自假單胞菌屬(genus Pseudomonas)的IbpA以及源自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的HSP26。
12.一種采用色譜法從目的蛋白表達(dá)細(xì)胞或者其培養(yǎng)物中分離和純化目的蛋白的方法，其特征在于，色譜中采用固定了有效量sHSPs的樹脂或者由其構(gòu)成的珠子以防止發(fā)生由蛋白酶導(dǎo)致目的蛋白的降解。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，sHSPs為一種或多種選自如下一組物質(zhì)中，該組包括源自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的IbpA、源自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的sHSPs、源自Bradyrbizobium血吸蟲(Bradyrbizobium Japonicum)的HSPB、HSPH、HSPC以及HSPF、源自豬布魯桿菌(Brucella suis)的IbpA、源自蚜蟲巴克納氏菌(Bruchnera aphidicola)的sHSPs、源自蚜蟲巴克納氏菌(Bruchnera aphidicola(Acyrthosiphon pisum))的IbpA，源自柑橘衰退病(Citrus tristeza)病毒的sHSPs，源自E.coli的IbpA和IbpB、源自幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)的IbpB、人源HSP27和α、β-晶狀體球蛋白、源自甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的HSP16.5。源自Methanopyrus kandleri的IbpA、鼠源HSP25、源自麻風(fēng)桿菌(Mycobacteriumleprae)的sHSPs、源自結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的HSP16.3、源自Poirellula sp.的IbpB、源自豌豆(Pisum sativum(pea))的HSP18.1、源自Plasmdium falciparum的sHSPs、源自假單胞菌屬(genusPseudomonas)的IbpA、源自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的HSP26、源自Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhi的IbpA和IbpB、源自Salmonella typhimurium的IbpA和IbpB、源自Salmonella oneidensis的IbpA、源自弗累克斯訥氏桿菌(Shigella flexneri)的IbpA和IbpB、源自苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的IbpA、源自Streotocuccus pyogenes的IbpA、源自天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)的sHSPs、源自硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)的sHSPs、源自武爾坎聚球菌(Synechococcus vulcanus)的HSP16、源自騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)的IbpA、源自嗜酸熱原體(Thermoplasma acidophilum)的IbpA、源自鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)的IbpA和IbpB。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，sHSPs為一種或多種選自如下一組物質(zhì)中，該組包括源自E.coli的IbpA、IbpB、IbpAB、和源自假單胞菌屬(genus Pseudomonas)的IbpA以及源自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的HSP26。
15.一種用于從采用了全細(xì)胞酶或部分純化酶的反應(yīng)基質(zhì)中制備目的蛋白的方法，其特征在于，往酶促反應(yīng)過程中添加了有效量的sHSPs以防止由蛋白酶產(chǎn)生的酶解。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，sHSPs為一種或多種選自如下一組物質(zhì)中，該組包括源自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的IbpA、源自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的sHSPs、源自Bradyrbizobium血吸蟲(Bradyrbizobium Japonicum)的HSPB、HSPH、HSPC以及HSPF、源自豬布魯桿菌(Brucella suis)的IbpA、源自蚜蟲巴克納氏菌(Bruchnera aphidicola)的sHSPs、源自蚜蟲巴克納氏菌(Bruchnera aphidicola(Acyrthosiphon pisum))的IbpA，源自柑橘衰退病(Citrus tristeza)病毒的sHSPs，源自E.coli的IbpA和IbpB、源自幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)的IbpB、人源HSP27和α、β-晶狀體球蛋白、源自甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的HSP16.5。源自Methanopyrus kandleri的IbpA、鼠源HSP25、源自麻風(fēng)桿菌(Mycobacteriumleprae)的sHSPs、源自結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的HSP16.3、源自Poirellula sp.的IbpB、源自豌豆(Pisum sativum(pea))的HSP18.1、源自Plasmdium falciparum的sHSPs、源自假單胞菌屬(genusPseudomonas)的IbpA、源自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的HSP26、源自Salmonella enterica subspenterica serovar Typhi的IbpA和IbpB、源自Salmonella typhimurium的IbpA和IbpB、源自Salmonella oneidensis的IbpA、源自弗累克斯訥氏桿菌(Shigella flexneri)的IbpA和IbpB、源自苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的IbpA、源自Streotocuccus pyogenes的IbpA、源自天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)的sHSPs、源自硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)的sHSPs、源自武爾坎聚球菌(Synechococcus vulcanus)的HSP16、源自騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)的IbpA、源自嗜酸熱原體(Thermoplasma acidophilum)的IbpA、源自鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)的IbpA和IbpB。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，sHSPs為一種或多種選自如下一組物質(zhì)中，該組包括源自E.coli的IbpA、IbpB、IbpAB、和源自假單胞菌屬(genus Pseudomonas)的IbpA以及源自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的HSP26。
18.一種防止蛋白酶降解目的蛋白的方法，其特征在于，在其過程中采用了sHSPs。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，sHSPs為一種或多種選自如下一組物質(zhì)中，該組包括源自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的IbpA、源自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的sHSPs、源自Bradyrbizobium血吸蟲(Bradyrbizobium Japonicum)的HSPB、HSPH、HSPC以及HSPF、源自豬布魯桿菌(Brucella suis)的IbpA、源自蚜蟲巴克納氏菌(Bruchnera aphidicola)的sHSPs、源自蚜蟲巴克納氏菌(Bruchnera aphidicola(Acyrthosiphon pisum))的IbpA，源自柑橘衰退病(Citrus tristeza)病毒的sHSPs，源自E.coli的IbpA和IbpB、源自幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)的IbpB、人源HSP27和α、β-晶狀體球蛋白、源自甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的HSP16.5。源自Methanopyrus kandleri的IbpA、鼠源HSP25、源自麻風(fēng)桿菌(Mycobacteriumleprae)的sHSPs、源自結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的HSP16.3、源自Poirellula sp.的IbpB、源自豌豆(Pisum sativum(Pea))的HSP18.1、源自Plasmdium falciparum的sHSPs、源自假單胞菌屬(genusPseudomonas)的IbpA、源自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的HSP26、源自Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhi的IbpA和IbpB、源自Salmonella typhimurium的IbpA和IbpB、源自Salmonella oneidensis的IbpA、源自弗累克斯訥氏桿菌(Shigella flexneri)的IbpA和IbpB、源自苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的IbpA、源自Streotocuccus pyogenes的IbpA、源自天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)的sHSPs、源自硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)的sHSPs、源自武爾坎聚球菌(Synechococcus vulcanus)的HSP16、源自騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)的IbpA、源自嗜酸熱原體(Thermoplasma acidophilum)的IbpA、源自鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)的IbpA和IbpB。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，sHSPs為一種或多種選自如下一組物質(zhì)中，該組包括源自E.coli的IbpA、IbpB、IbpAB、和源自假單胞菌屬(genus Pseudomonas)的IbpA以及源自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的HSP26。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離和純化目的蛋白的方法，制備目的蛋白的方法、以及通過全細(xì)胞酶或部分純化酶來進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的方法。根據(jù)本發(fā)明，如果把sHSPs施加到為了制備目的蛋白而進(jìn)行的培養(yǎng)、分離和純化過程中，通過防止蛋白酶解而導(dǎo)致蛋白損失從而獲得高產(chǎn)率。同樣地，如果把sHSPs加入到采用了全細(xì)胞酶或部分純化酶的反應(yīng)過程中，可以通過防止由蛋白酶造成的酶損失來提高采用酶所進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)率。
文檔編號C07K1/14GK101180308SQ200580049905
公開日2008年5月14日 申請日期2005年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月23日
發(fā)明者李相燁, 韓美正 申請人:韓國科學(xué)技術(shù)院