專利名稱：誘導(dǎo)凋亡的蛋白質(zhì)復(fù)合物以及其治療應(yīng)用的制作方法
誘導(dǎo)凋亡的蛋白質(zhì)復(fù)合物以及其治療應(yīng)用
本發(fā)明涉及免疫學(xué)和分子醫(yī)學(xué)的領(lǐng)域。尤其是，本發(fā)明涉及蛋 白質(zhì)復(fù)合物，其可以作為治療劑用來在靶細胞群體、例如胂瘤細胞 或病毒感染細胞中誘導(dǎo)凋亡性細胞死亡。尤其是，本發(fā)明涉及多價 蛋白質(zhì)復(fù)合物，該復(fù)合物能夠通過識別和結(jié)合于由靶細胞的主要組
織相容性復(fù)合物(MHC)分子呈遞的源于腫瘤或源于病毒的肽來誘 導(dǎo)凋亡(細^9包凋亡)。
MHC分子的主要免疫功能是結(jié)合和"呈遞"抗原肽(antigenic peptide)以在用于iK別和結(jié)合'淋巴細月包的4元原特異性T細力包受體 (TCR)的細胞的表面上形成MHC-肽(MHC-p)復(fù)合物。根據(jù)它們的功 能，可以區(qū)分兩類MHC-肽復(fù)合物(Germain, R., Cell 76 (1994) 287-299): (i) I類MHC-肽復(fù)合物可以由幾乎所有有核細"包來表達 以吸引CD8+細胞毒性T細胞，以及(ii) II類MHC-肽復(fù)合物僅在 所謂的抗原呈遞細胞(APC)，如B淋巴細胞、巨噬細胞或樹突細胞 (DC)上進行組成型地表達。I類MHC分子由重鏈可變區(qū)、不變|3 微球蛋白以及抗原肽組成。II類MHC分子的特點在于不同的oc和P 多肽亞單位，這些亞單位結(jié)合以形成a(3異二聚體(雜二聚體， heterodimer ),其是成熟的II類MHC分子的特點。I類和II類MHC 分子的不同結(jié)構(gòu)特性是造成在激活T淋巴細胞的不同群體中它們各 自作用的原因。細胞毒性Tc淋巴細胞(CTL)結(jié)合由I類MHC分子 呈遞的抗原肽。輔助1V淋巴細力包結(jié)合由II類MHC分子呈遞的抗 原肽。I類和II類MHC分子不同；也結(jié)合CD8和CD4細月包粘著分子。 I類MHC分子特異性地結(jié)合在細胞毒性Tc淋巴細胞上表達的CD8
分子，而II類MHC分子特異性地結(jié)合在輔助TV淋巴細胞上表達 的CD4分子。
I類和II類MHC分子的抗原肽-結(jié)合口袋(嚢，pocket)的大 小是不同的I類分子結(jié)合較小的抗原肽(長度為8-10個氨基酸殘 基)，而II類分子結(jié)合較大的抗原肽(長度為13-18個氨基酸殘基)。
在人類中，MHC分子稱為人白細胞抗原(HLA)。 HLA相關(guān)肽 較短，包括9-25個氨基酸(Kropshofer, H. & Vogt， A. B., Immunol Today 18 (1997) 77-82)。人類合成了三種不同類型的I類分子，其 稱為HLA-A、 HLA-B、以及HLA-C。人II類分子稱為HLA-D，例 如，HLA-DR。在本領(lǐng)域中已表明，針對I類和II類MHC分子的 抗體可以在表達所述MHC分子的細胞中誘導(dǎo)凋亡。Wallen-Ohman 等人才艮道了 ，通過小鼠單克隆抗體(mAb)的I類MHC的連4妄作用可 在人前B細月包系中、在前髓細月包系(早幼粒細月包系，promyelocytic cell lines)中以及在CD40刺激的成熟B細胞中誘導(dǎo)凋亡(Int Immunol. 1997;9(4):599-606 )。小鼠和人抗HLA I類抗體均顯示出對 人-淋巴纟田月包具有"i秀導(dǎo)凋亡步文應(yīng) (Genestier et al., Blood. 1997,15;90(2):726-35; Daniel et al.， Transplantation. 2003 Apr 27;75(8): 1380-6)。 Newell等人報道了 ， II類MHC分子與抗II類抗 體的連接作用可以在靜止B淋巴細胞中介導(dǎo)凋亡性細胞死亡(Proc Natl Acad Sci USA. 1993 Nov 15;90(22):10459-63 )。 已4苗述了 HLA-DR特異性單克隆抗體可以誘導(dǎo)HLA-DR陽性細胞的凋亡 (Vidovic et al. Cancer Lett. 1998, 19;128(2):127-35;還參見US 6,416,958 )。
因此，已知，通過多種抗MHC抗體與I類或II類MHC分子 的結(jié)合可以具有誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)。然而，目前可獲得的抗MHC抗 體的治療應(yīng)用已受到缺少耙細月包特異性的妨礙。因為已知的抗體主 要定向于MHC分子本身(例如，HLA-DR)的表位，正是所述MHC
表位的細胞表面表達確定是否可以觸發(fā)細胞以經(jīng)歷凋亡。由于I類
和II類MHC分子在正常和患病細胞上均表達，所以很明顯，目前 可獲得的抗體不能區(qū)分正常細月包和異常(例如，患病)細月包。因此， 由健康細胞的不希望的凋亡所引起的副作用顯著降低了它們的治 療價值。此外，借助于I類或II類MHC來"i秀導(dǎo)凋亡的方法嚴才各依 賴于抗MHC抗體的外部交聯(lián)。
本發(fā)明的目的是克服上述限制并提供一種治療劑，其便于在具 有改善的特異性的情況下誘導(dǎo)凋亡。尤其是，本發(fā)明的目的是選擇 性地誘導(dǎo)感興趣的細胞群體的凋亡，例如表達紳瘤抗原的腫瘤細胞 或表達病毒抗原的病毒感染細胞，同時將健康細力包生存力的喪失降 低到最低程度或完全避免健康細胞生存力的喪失。
這些目的通過下述驚人的發(fā)現(xiàn)而得到滿足，即包含多抗原特異 性的、MHC限制T細胞受體(TCR)和/或MHC限制抗體的多價蛋白 質(zhì)復(fù)合物可以有效i也4又在那些表達抗原的革巴細月包的群體中"i秀導(dǎo)凋 亡。發(fā)現(xiàn)了殺死(killing )嚴格取決于MHC鄰近(菌髓，范圍，context) 相關(guān)抗原的存在。這種發(fā)現(xiàn)揭開(提供)了下述可能性選擇性地 殺死對于感興趣的某些MHC-肽復(fù)合物呈陽性的細胞群體，例如表 達I類HLA分子的腫瘤細"包，其中I類HLA分子與源自腫瘤相關(guān) 抗原的肽復(fù)合。
不希望受到理論的約束，認為，本發(fā)明的多價、單特異性蛋白 質(zhì)復(fù)合物通過在耙細月包的細月包表面上群集多個相同的MHC-p復(fù)合 物來誘導(dǎo)凋亡。本文顯示的數(shù)據(jù)表明，群集三個MHC-p復(fù)合物不 足以凋亡i秀導(dǎo)(apoptosis induction ),而六《介復(fù)合物在"i秀導(dǎo)凋亡中非 常有效。因此，凋亡誘導(dǎo)需要通過一個多價、單特異性蛋白質(zhì)復(fù)合 物來結(jié)合至少四個，優(yōu)選至少五個，更優(yōu)選至少六個MHC-p復(fù)合 物。在一種具體實施方式
中，復(fù)合物由4個、5個、6個、7個、8 個、9個、10個、11個或12個多肽組成，每個多肽能夠識別和結(jié)合于特異性主要組織相容性復(fù)合物(MHC)-肽復(fù)合物。與利用抗 MHC抗體用于凋亡i秀導(dǎo)的已知方法相反，本文4皮露的多1"介蛋白質(zhì) 復(fù)合物本身可以誘導(dǎo)凋亡并且不需要任何外部交聯(lián)。
因此，本發(fā)明涉及一種多價單特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包括至 少六個能夠識別和結(jié)合于特異性主要組織相容性復(fù)合物(MHC)-肽 復(fù)合物的多肽。所述至少六個多肽識別相同的MHC-肽(MHC-p)復(fù) 合物，即，多l(xiāng)介蛋白質(zhì)復(fù)合物相對于MHC-p復(fù)合物是單特異性的。 特異性i也識別和結(jié)合于MHC-p復(fù)合物的多肽可以是TCR或其功能 性片段(本文中 一并稱作TCR)和/或模擬TCR特異性的抗體，例如 基因工程抗體，如單鏈可變片段(sc-Fv)。此外，本發(fā)明的多價復(fù)合 物可以包含TCR以及MHC限制抗體，只要兩種類型的多肽均識別 相同的肽抗原。
多價TCR復(fù)合物以及其治療用途在本領(lǐng)域是已知的。以Avidex Ltd.的名義的WO2004/050705披露了 一種多價TCR復(fù)合物，其包 括由非肽聚合物一漣或肽連4妄序列(linker s叫uence )連4妄的至少兩個 TCR。 TCR復(fù)合物可以用來向把細胞遞送治療劑，如細月包毒藥物， 其可以附著于TCR復(fù)合物。披露了二價、三價以及四價TCR復(fù)合 物，但二價TCR復(fù)合物是優(yōu)選的。重要地，沒有描述多于四個TCR 的復(fù)合物。此夕卜，WO2004/050705僅將注意力集中在使用多價TCR 復(fù)合物以將治療劑，例如，用于細力包殺死的毒性部分，遞送到耙細 胞。它并沒有教導(dǎo)或4是示多價TCR復(fù)合物本身的誘導(dǎo)凋亡能力。 本發(fā)明的多肽復(fù)合物的抗原特異性、MHC限制的結(jié)合能力足以誘 導(dǎo)表達相關(guān)抗原的靶細胞的凋亡。因此，該復(fù)合物可以是"4果露的 (bare)"，即沒有任何另外的或附著的細胞毒劑或毒性部分，如例 如在WO2004/050705中所需要的。對于本發(fā)明的多價蛋白質(zhì)復(fù)合 物的治療用途來說，優(yōu)選的是，復(fù)合物的尺寸足夠小以便于進入血 流。優(yōu)選地，它可以滲入包括耙細月包群體的組織，例如腫瘤組織， 尤其是較差形成血管的實體腫瘤。因此，多價復(fù)合物的分子量優(yōu)選 小于約400kDa，更優(yōu)選小于約300kDa，如200、 250、 270或290 kDa。
在本發(fā)明的復(fù)合物中的多肽，無"i侖是抗原特異性MHC限制 TCR、 TCR樣抗體或其組合，都可以以任何適當?shù)姆绞奖舜诉B接或 耳關(guān)結(jié)(link or connect )。在一種具體實施方式
中，各個多肽直4妻或 間接地彼此共價連接。例如，它們可以通過化學(xué)交聯(lián)或經(jīng)由非肽聚 合物鏈加以連接(參見WO2004/050705 )。經(jīng)由功能性耦聯(lián)位點(例 如，SH基團)用于化學(xué)偶合多肽的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。
在另一種具體實施方式
中，多肽4皮此非共{介連4妾。在一個方面， 多個多肽^f昔助于能夠結(jié)合兩個或更多個多肽的連4妻肽(linker peptide)進4亍連4妄。連孑妻肽可以包括兩個或更多個，如三個、四個、 五個或六個，用于多肽的特異性結(jié)合位點。該多肽可以包括用于連 接肽上的結(jié)合位點的結(jié)合配體。在一種具體實施方式
中，在多價復(fù) 合物中的每個多肽包括結(jié)合配體，該結(jié)合配體便于多肽與連接肽的 非共價結(jié)合。每個多肽的結(jié)合配體可以相同或它們可以不同。當結(jié) 合于連接肽時，具有不同結(jié)合配體的多肽便于影響多肽的空間排 列。
在一種優(yōu)選的具體實施方式
中，連4妾肽包括多聚化基序，借助 于該基序，連4妻肽可以與另 一個包含所述基序的連4妄肽進4亍多聚 化。連4妾肽的多聚化(每個連接肽能夠結(jié)合至少一個MHC-p特異 性多肽)非常適合于將多個多肽裝配成一個復(fù)合物。多聚化基序包 括二聚化基序、三聚化基序、四聚化基序、五聚化基序以及六聚化 基序。典型的多《介蛋白質(zhì)復(fù)合物由以下成分組成六個多肽，其結(jié) 合于一個具有六個多肽結(jié)合位點的連接肽(六價復(fù)合物)；兩個連接 肽，每個包括二聚化基序和三個多肽結(jié)合位點(六價)；兩個連接肽， 每個具有二聚化基序和四個多肽結(jié)合位點(八價)；三個連接肽，每
個具有三聚化基序和兩個或三個多肽結(jié)合位點(六價或九價)；兩個 連接肽，每個具有四聚化基序和兩個多肽結(jié)合位點(八價)；等等。
上述尺寸限制可以形成一些關(guān)于以下內(nèi)容的實際限制a)組裝 到一個多價復(fù)合物中的多肽數(shù)目，即，復(fù)合物的價；以及b)它們被 組裝的方式，因為人們通常希望最大程度地降低并不有助于實際的 MHC-p結(jié)合于靶細胞上的成分的尺寸和重量。因此，價高達九的蛋 白質(zhì)復(fù)合物是優(yōu)選的。此外，與單個連接肽或非肽接頭(所有多肽 附著于其上)相比，使用具有多聚化基序的連接肽便于將多肽組裝 成相對致密的復(fù)合物。還可以將連4妾肽融合至多肽。
可以用來將多肽連4妾于連4妻肽上的結(jié)合位點的結(jié)合配體在本 領(lǐng)域中是已知的。任何結(jié)合配體，無論具有肽或非肽來源，只要存 在一個可用的結(jié)合4立點(其可以是連4妄肽的一部分)，者卩可以4吏用。 優(yōu)選地，多肽包含單結(jié)合配體以防止一個多肽結(jié)合于一個以上的連 4妄肽，其可能導(dǎo)致形成不希望的"鏈"，該鏈由交^^的連4妻肽和多 肽而不是所希望的蛋白質(zhì)復(fù)合物組成。結(jié)合配體可以共價或非共價 地附著于多肽。共《介附著是優(yōu)選的。這可以例如通過結(jié)合配體與多 肽的化學(xué)偶合或通過基因融合來實現(xiàn)。優(yōu)選地，結(jié)合配體是一種肽， 其編石馬核g交序列可以基因融合到編石馬MHC-p特異性多肽的核S交序 列中。更優(yōu)選地，結(jié)合配體和結(jié)合位點均具有肽特性，以致它們可 以分別被基因融合到多肽和連4妾肽中。結(jié)合配體與多肽的融合通常 在來自多肽的C末端進行，但也可以在N末端進行。如下文將描述 的，連4妾肽中的一個或多個結(jié)合位點的位置可以變化。
可以用來將一個或多個MHC-p特異性多肽結(jié)合于連接肽的適 宜的結(jié)合配體/結(jié)合位點對包括生物素/(鏈)抗生物素蛋白對和二聚 化結(jié)構(gòu)域，如亮氨酸拉鏈。生物素-鏈霉抗生物素蛋白(鏈抗生物素 蛋白，streptavidin )系統(tǒng)是已知最強的非共i介生物相互作用，其具 有約為4x 10"14) M的解離常數(shù)K(d)。該相互作用的強度和特異性
4吏它成為在分子、免疫、以及細胞測定中最廣泛使用的親和對之一。 二聚化結(jié)構(gòu)域，如亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。在一種具體實施方式
中，利
用了 一種S-S 4立鏈(De Kruif J， Logtenberg T. J Biol Chem. 1996 Mar 29;271(13):7630-4 )。在一種優(yōu)選的具體實施方式
中，小多肽神經(jīng)毒 素a-4艮環(huán)蛇毒素(BTX)用作結(jié)合配體。由于BTX可以高親和力結(jié)合 于13-aa oc-銀環(huán)蛇毒素(BTX)-結(jié)合位點(BBS) ( Harel et al.， (2001) Neuron 32， 265-275 )，所以BTX-標記的多肽可以非共價地結(jié)合于包 含BTX的連接肽。
在連4妄肽中4吏用的多聚化基序可以在原核生物和真核生物中 天然存在的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。生物素/鏈霉抗生物素蛋白系統(tǒng)先前已用 來制備用于體外結(jié)合研究的TCR四聚體。然而，鏈霉抗生物素蛋 白是 一 種源于樣t生物的多肽并且同樣并不理想地適用于治療性復(fù) 合物中。多聚化基序的其它實例包括噬菌體T4纖維蛋白(fibritin) 的三聚化信號(Efimov et al., (1994) J. Mol. Bio1.242， 470~486、人肺 表面活4匕D蛋白(人肺表面活性物質(zhì)D蛋白，人肺表面活性D蛋 白，human Lung Surfactant D protein )的頸區(qū)肽(Neck Region Peptide ) (NRP)(三聚化基序；參見Hoppe et al" (1994) FEBS Lett. 344:191-195 )、以及修飾的亮氨酸拉鏈三聚化結(jié)構(gòu)域(Harbury et al.,(1993) Science 262， 1401-1407 )。
對于治療用途，優(yōu)選的是，基序不是來源于致病生物。更優(yōu)選 地，哺乳動物多聚化基序用來組裝本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物。人多聚 化基序是最優(yōu)選的。存在許多包含多聚化結(jié)構(gòu)域的人蛋白，其中多 聚化結(jié)構(gòu)域可以用于生產(chǎn)本發(fā)明的多價復(fù)合物。例如，可以使用p53 的四聚化結(jié)構(gòu)域，其已用來生產(chǎn)scFv抗體片4殳的四聚體。血紅蛋白 也具有可用于本發(fā)明的四聚化基序。在一種優(yōu)選的具體實施方式
中，使用了人肺表面活化D蛋白的三聚化基序NRP。
因此，本發(fā)明還4是供了一種用于本發(fā)明的復(fù)合物的連4妻肽。該 連接肽包括至少一個用于多肽的結(jié)合位點，其中多肽包括用于所述 結(jié)合位點的結(jié)合配體。優(yōu)選地，連4妾肽包括兩個或更多這樣的結(jié)合 位點。由于上述原因，還優(yōu)選的是，連接肽包括多聚化基序。結(jié)合
位點和多聚化基序可以存在于連4妄肽中，作為分開的節(jié)革殳(segment) 或作為連接的節(jié)段，即，它們可以被小段氨基酸殘基(如l-50個、 優(yōu)選1-20個、更優(yōu)選1-10個氨基酸殘基)隔開。節(jié)段排列在其中 的順序可以變化。多聚化基序和結(jié)合位點之間的間隔應(yīng)足以便于 a)連4妄肽和另一個連4妄肽之間的多聚化；以及b)多肽與結(jié)合位點 的結(jié)合。優(yōu)選的是，多聚化基序在每一側(cè)旁側(cè)有一個或更多個結(jié)合 位點。在一種具體實施方式
中，連4lr肽包^"(從N末端至C末端) 以下節(jié)段結(jié)合位點(例如，BBS)-多聚化基序(例如，NRP)-結(jié)合位 點(例如，BBS)。連4妄肽可以進一步包括多^殳氨基酸，其有助于連 *接肽的表達和/或分泌，尤其是如果連4妾肽由重組宿主細力包所產(chǎn)生。 例如，它可以包含N末端分泌信號序列以促進肽在介質(zhì)中的分泌。 適宜的分泌信號是白細胞介素-2(IL-2)分泌信號序列。其它有用的序 列包括那些便于適宜的蛋白質(zhì)純化的序列，尤其是本領(lǐng)域中已知的 親和才示i己4勿(才示簽，tag)長口 c畫myc畫才示i己4勿、6 x His-木亍i己4勿、HA-標記物等。 一個連接肽可以包括一個或多個這樣的標記物，可選地 在其一側(cè)或兩側(cè)旁側(cè)有短柔性連4妾序列(例如，交替的Gly和Ser 殘基)。在一種具體實施方式
中，本發(fā)明提供了一種連接肽，其包 括以下節(jié)^殳(從N末端至C末端)分泌信號序列-結(jié)合位點一妾頭-親 和標記物-接頭-多聚化基序-接頭-親和標記物-接頭-結(jié)合位點。這種 類型的 一種示例性連4妄肽是在實施例中描述的六標記物肽。
本文還提供了 一種編碼本發(fā)明的連接肽的核酸。如在實施例中 所描述的，標準重組DNA沖支術(shù)可以用來構(gòu)建該核酸。
根據(jù)本發(fā)明，任何能夠識別和結(jié)合于特異性MHC-肽復(fù)合物(I 類或II類)的多肽適用于多價誘導(dǎo)凋亡的蛋白質(zhì)復(fù)合物中。在一種具體實施方式
中，該復(fù)合物包4舌至少一個多肽，^尤選至少兩個多肽， 更優(yōu)選至少四個多肽，如六個或甚至更多多肽，其包括對應(yīng)于天然
TCR的胞外恒定(C)區(qū)和可變(V)區(qū)序列的氨基酸序列。在本發(fā)明的 復(fù)合物中，TCR分子可以是單鏈T細胞受體(scTCR)多肽或雙鏈(二 聚體)TCR(tcTCR)多肽對。可以通過對應(yīng)于TCR胞外恒定區(qū)和可變 區(qū)序列的TCR氨基酸序列來構(gòu)成scTCR多肽、或tcTCR多肽對， 其中對應(yīng)于一個TCR鏈的可變區(qū)序列的scTCR可變區(qū)序列通過連 接序列與對應(yīng)于另一個TCR鏈的恒定區(qū)序列的恒定區(qū)序列連接連 接；tcTCR多肽對或scTCR多肽的可變區(qū)序列基本上如在天然TCR 中那樣相互定向；并且在scTCR多肽的情況下，在天然(未致壽文， native) T細胞受體中沒有任何等效物的二石危4建連接多肽的殘基。
在一種具體實施方式
中，至少一個多肽是單鏈T細胞受體 (scTCR)多肽，例如一種scTCR,其包括抗原特異性TCR的可變(V) 區(qū)，并且可選地進一步包括抗原特異性TCR的胞外恒定(C)區(qū)。在 另一種具體實施方式
中，至少一個多肽是包括抗原特異性TCR的 胞外可變(V)區(qū)和恒定(C)區(qū)的雙鏈TCR(tcTCR)。所述scTCR或 tcTCR例如包括抗原特異性TCR的a和(3鏈對或者y和5鏈對。
對于存在于本發(fā)明的復(fù)合物中的aJ3-類似物scTCR或tcTCR， a 和P節(jié)^殳的可變區(qū)序列基本上如在天然a(3 TCR中那樣相互定向的 要求是通過證實分子結(jié)合于相關(guān)TCR配體(pMHC復(fù)合物)來進行試 驗的，如果它結(jié)合，那么要求得到滿足。多肽(無論是TCR或是 基于抗體的多肽)和pMHC復(fù)合物之間的相互作用可以利用 BlAcore3000TM或BIAcore 20007^義器來測量。WO99/6120 4是供了為 分析TCR結(jié)合于MHC-肽復(fù)合物所需要的方法的詳細描述。在yS-類似物TCR存在于本發(fā)明的復(fù)合物中的情況下，用于這些分子的 同源配體(cognate ligands )是未4口的，因jt匕可以采用壽乾助方法 (secondary means )來i正實這些分子的才勾象，》口通過^t體來i只另'J 。
對于5鏈可變區(qū)特異性的單克隆抗體MCA991T(可獲自Serotec)是適 合于此^f壬務(wù)的抗體的 一個實例。
scTCR是包括單氨基酸鏈的人工建構(gòu)物(構(gòu)建物，construct), 其如同天然異二聚體TCR那樣結(jié)合于MHC-肽復(fù)合物。在一種具體 實施方式中，多肽編碼雙結(jié)構(gòu)域(2D)scTCR,其包括通過接頭連接 的TCR的胞外可變(V)區(qū)VocVp鏈。在另一種具體實施方式
中，該 多肽包括三結(jié)構(gòu)域(3D)scTCR，該三結(jié)構(gòu)域(3D)scTCR包括TCR的 胞外可變(V)區(qū)和恒定(C)區(qū)，例如包括抗原特異性TCR的VaV(3C(3 或VocV(3Cot鏈的scTCR。連接VctV卩的接頭可以選自本領(lǐng)域中已知 的標準接頭，如15-20個氨基酸的低聚肽，其便于兩個V結(jié)構(gòu)域之 間的柔性和適當?shù)木喓?還參見WO2004/033685的教導(dǎo))。存在于 本發(fā)明的復(fù)合物中的scTCR多肽可以是那些多肽，其具有例如由 對應(yīng)于TCRa或5鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列構(gòu)成的第 一節(jié)段，其中 TCRoc或5鏈可變區(qū)序列融合到對應(yīng)于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的氨 基酸序列的N末端；由對應(yīng)于TCRP或y鏈可變區(qū)的氨基酸序列構(gòu)成 的第二節(jié)段，其中TCRP或y鏈可變區(qū)融合到對應(yīng)于TCR卩鏈恒定區(qū) 胞外序列的氨基酸序列的N末端；連4妾序列，其將第一節(jié),史的C 末端連接到第二節(jié)段的N末端，或反之亦然；以及第一鏈與第二鏈 之間的二硫鍵，所述二硫鍵是這樣的一種鍵，其在天然a(3或yST細 胞受體中沒有等效物，連接序列的長度和二石充4定的位置是這樣的以 致第一和第二節(jié)段的可變區(qū)序列基本上如同在天然aP或Sy TCR中 那樣相互定向。這樣的多肽例如描述在WO2004/033685中。
在本發(fā)明的復(fù)合物中的雙鏈TCR(tcTCR)可以是由以下所構(gòu)成 的雙鏈TCR(tcTCR):第一多肽，其中對應(yīng)于TCR a或5鏈可變區(qū)序 列的序列被融合到對應(yīng)于TCR a鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末 端；以及第二多肽，其中對應(yīng)于TCR p或Y鏈可變區(qū)序列的序列被 融合到對應(yīng)于TCR p鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端。通過在天 然a(3或y5 TCR中有或沒有等歲文物的二石克一建，第一和第二多月太可以 相連以形成本發(fā)明的MHC-p特異性多肽。在一種具體實施方式
中， 多肽是一種包括胞外V和C區(qū)的雙鏈TCR，如包括TCR的VotCoc + V(3C(3《連的tcTCR。
在上述scTCR和tcTCR中存在的恒定區(qū)胞外序列優(yōu)選對應(yīng)于 那些人TCR的恒定區(qū)胞外序列，如同可變序列那樣。然而，上述 序列之間的對應(yīng)并不需要在氨基酸水平上達到1:1。相對于人TCR 序列的N-和/或C-截斷(截短)、和/或氨基酸缺失和/或取代是可以 4妾受的，只要總結(jié)果是，如在天然aP、或y5TCR中那樣，a和(3可 變區(qū)序列、或y和5可變區(qū)序列分別地相互定向，以致可以保持MHC-結(jié)合能力。尤其是，由于恒定區(qū)胞外序列并不直接涉及接觸scTCR 或tcTCR與其結(jié)合的配體(MHC-p復(fù)合物)，所以它們可以比天然 TCR的胞外恒定結(jié)構(gòu)域序列更短，或相對于天然TCR的胞外恒定 結(jié)構(gòu)域序列可以包含取代或缺失。
可^^l灸;也或除TCR多狀以外，在本發(fā)明的復(fù)合物中的MHC-p 特異性多肽是MHC-限制、抗原特異性TCR樣抗體(Ab)或其功能性 片段。由抗體的最少結(jié)合亞單位組成的蛋白質(zhì)片段，稱作單鏈抗體 (scFv),對于它們的配體具有極好的結(jié)合特異性和親和性。與抗體 相反，缺少非結(jié)合區(qū)的scFv可以連同竟爭性抗原一起加以選才奪，因 此具有更高特異性/敏感性的潛力。例如，該多肽是一種單鏈 Ig(scFv-Ig),其包括可變(V)區(qū)以及可選地包括在MHC鄰近
區(qū)，例如病毒4元原特異性抗體或腫瘤4元原特異性4元體。TCR才羊Ab 多肽還可以是雙鏈抗體片4殳，例如，包含抗體的胞外V和C區(qū)的雙 鏈抗體片段。
通過本領(lǐng)域中已知的包4舌經(jīng)典免疫程序和基因工程的標準程 序，可以提供抗原特異性抗體或其功能性片段。特別感興趣的是應(yīng) 用噬菌體展示(phage display)技術(shù)。可獲得關(guān)于噬菌體展示的許
多綜述，參見例如Smith和Petrenko [1997] Chem. Rev. 97:391-410。 簡而言之，噬菌體展示技術(shù)是一種選擇技術(shù)，其中肽或人單鏈Fv 抗體的變體文庫表達在噬菌體病毒顆粒的外側(cè)，而編碼每種變體的 遺傳物質(zhì)存在于內(nèi)側(cè)上。這在每個變體蛋白質(zhì)序列與編碼它的DNA 之間產(chǎn)生物理連鎖，其允許基于結(jié)合親和力并通過稱作淘選 (panning)的體外選擇方法來快速分配到給定的靶分子。在本發(fā)明 中，耙分子是例如感興趣的重組MHC-肽復(fù)合物，如通過HLA-Al 分子呈遞的黑色素瘤-相關(guān)抗原(MAGE)-A1 。在其最簡單的形式中， 通過用涂布有輩巴(即，感興趣的MHC-p)的平板(或珠)溫育噬菌體展 示肽的文庫、洗去未結(jié)合的虔菌體、以及洗脫特異性地結(jié)合的噬菌 體而進行淘選。然后擴增經(jīng)洗脫的噬菌體并經(jīng)過另外的結(jié)合/擴增循 環(huán)來富集有利于結(jié)合序列的池(pool)。在3-4個周期(循環(huán))以后， 通常通過DNA序列測定和ELISA來表4正各個克隆。然后包含在所 希望的噬菌體內(nèi)的DNA (編碼特定的肽序列)可以用作編碼基于 抗體的多肽的核酸，該多肽用于本發(fā)明的i秀導(dǎo)凋亡的多^f介復(fù)合物 中。
本發(fā)明主要通過對肺瘤或病毒抗原特異性的多價蛋白質(zhì)復(fù)合 物的產(chǎn)生來加以-說明。這些復(fù)合物在治療癌癥和病毒感染方面具有 治療價值。然而，技術(shù)人員將明了，本發(fā)明并不限于任何類型的抗 原，并且提供了這樣的復(fù)合物，其可以選擇性地殺死表達任何抗原、 已知的或有待發(fā)現(xiàn)的把細胞。
優(yōu)選地，多肽能夠識別和結(jié)合于病毒表位、癌癥特異性表位或 與自身免疫疾病有關(guān)的表位。表位例如選自由HTLV-1表位、HIV 表位、EBV表位、CMV表位以及黑色素瘤表位組成的組。在一種 優(yōu)選的具體實施方式
中，多價復(fù)合物包含至少六個多肽，其能夠識 別和結(jié)合于I類或II類MHC-腫瘤抗原復(fù)合物，尤其是黑色素瘤相 關(guān)抗原。已描述了由II類MHC分子呈遞的人腫瘤抗原，其中幾乎 所有這些抗原都與惡性黑色素瘤有關(guān)。發(fā)現(xiàn)的第 一 黑色素瘤抗原肽
是MAGE-1 ( Trave麗i et al. J Exp Med. 1992 Nov 1 ;176(5): 1453-7 )。 此外，發(fā)現(xiàn)3個黑色素瘤表位是源自蛋白質(zhì)的MAGE家族并且由 HLA-DRll和HLA-DR13呈遞(Manici S et al., J Exp Med 1999; 189, 871-876)。另一組黑色素瘤抗原(已知還包含I類MHC腫瘤抗原) 包括Melan畫A/MART-l( Zarour H M et al., PNAS 2000; 97, 400-405 )、 gpl00以及膜聯(lián)蛋白(annexin) II ( Li K et al. Cancer Immunol Immunother 1998; 47, 32-38 )。關(guān)于可用于本發(fā)明的T細胞表位的綜 述, 還可以參見www.cancerimmunity.org/ peptidedatabase/ Tcellepitopes.htm 。
本發(fā)明的另 一 方面涉及用于提供根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物 的方法。如上文所描述的，它通常涉及提供編碼期望的構(gòu)成復(fù)合物 的多肽的核酸，并且，如果要非共價地附著多肽，則可選地還涉及 編碼連4妄肽的建構(gòu)物。所述核酸建構(gòu)物可以優(yōu)選借助于質(zhì)粒或表達 載體被51入到能夠表達所述建構(gòu)物的宿主細胞中。在一種具體實施 方式中，本發(fā)明的用來提供誘導(dǎo)凋亡的多價蛋白質(zhì)復(fù)合物的方法包 ;括以下步莩《^是供具有一個或多個編石馬所述至少六個多肽的核酸的 宿主細胞，其中多肽能夠識別和結(jié)合于特異性主要組織相容性復(fù)合 物(MHC)-肽復(fù)合物；以及可選地提供一種核酸，其編碼連接肽并使 所述宿主細"包可以表達所述核酸。伊二選的宿主細力包是哺乳動物宿主 細胞，更優(yōu)選人宿主細胞。適宜的宿主細胞包括人胚胎腎(HEK-293T) 細胞或中國倉鼠卯巢(CHO)細胞，其可以商業(yè)上獲得。利用軒狀病 毒或昆蟲細胞表達載體，還可以使用昆蟲細胞，如S2或S9細月包。 產(chǎn)生的多肽(TCR和/或連4妄肽)可以摘:耳又或分離自宿主細胞，或 者如果它們被分泌，則可以提取或分離自宿主細胞的培養(yǎng)基。其后 可以將它們體外組裝到多價蛋白質(zhì)復(fù)合物中。如果復(fù)合物的所有成 分由相同的宿主細胞產(chǎn)生，則它們可以"自組裝"成蛋白質(zhì)復(fù)合物， 以致可以不需要分離各個成分。因此，在一種具體實施方式
中，本 發(fā)明的方法包括^是供具有一個或多個編碼所述至少六個多肽的核
酸的宿主細胞，其中所述多肽能夠識別和結(jié)合于特異性主要組織相
容性復(fù)合物(MHC)-肽復(fù)合物，以及至少一種連接肽，使所述宿主細 胞可以表達所述核酸；以及將得到的肽組裝到蛋白質(zhì)復(fù)合物中，其 中所述多肽和連接肽在所述宿主細胞的培養(yǎng)基中被分泌和組裝。用 于在(哺乳動物)宿主細胞中重組表達(哺乳動物)蛋白質(zhì)的方法在本 領(lǐng)域中是眾所周知的。可以順序地或同時地將建構(gòu)物51入宿主細胞 中。還可以在宿主細胞中產(chǎn)生TCR(樣)多肽并通過化學(xué)交聯(lián)使純化 的多肽4皮此附著。
如將明了的，本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物可以用于許多治療性和非 治療性(例如，科學(xué))用途。本文提供了一種用于誘導(dǎo)靶細胞的體 外或體內(nèi)凋亡的方法，包括"使所述細胞與才艮據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合 物接觸，其中蛋白質(zhì)復(fù)合物的用量可有效的誘導(dǎo)凋亡?？梢苑奖愕?使靶細胞與宿主細胞的培養(yǎng)基接觸，其中宿主細胞用于重組生產(chǎn)構(gòu) 成蛋白質(zhì)復(fù)合物的成分(多肽、連4妻肽)。在一種具體實施方式
中， 它可以用于體外凋亡研究，例如這樣的研究，其用來闡明在I類和 II類MHC i秀導(dǎo)凋亡中所涉及的分子途徑。本發(fā)明的復(fù)合物還可以 用于檢測(循環(huán))腫瘤細胞或病毒感染細胞、用于耙細胞特異性遞送 細月包毒性化合物或遞送免疫刺激性分子。
優(yōu)選地，蛋白質(zhì)復(fù)合物用于觸發(fā)受治療者、更優(yōu)選人受治療者 中患病細胞的凋亡。對于人類治療用途，當然優(yōu)選的是，蛋白質(zhì)復(fù) 合物并不包含非哺乳動物起源的肽。更優(yōu)選的是僅包含人肽序列的 蛋白質(zhì)復(fù)合物。本文證明了，本發(fā)明的方法便于以抗原特異性、 MHC-限制性方式殺死細胞。因此，可以給予患者治療有效量的能 夠別識和結(jié)合于疾病特異性表位的蛋白質(zhì)復(fù)合物以刺激表達所述 表位的患病纟田月包的凋亡，而不影響不表達所述疾病特異性表位的(正 常)細胞的生存力。在一種特定具體實施方式
中，疾病特異性表位是 癌癥表位，例如黑色素瘤特異性表位。在給予(給藥)蛋白質(zhì)復(fù)合
物以后，殺死患病細胞同時將正常細胞死亡降至最小程度或甚至完 全避免正常細力包死亡爿尋基本上改善患者的治療效果。
因此，還提供了一種根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物作為藥劑。在 另一個方面，本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)復(fù)合物在制備用于治療癌癥、病 毒或微生物感染、自身免疫疾病或在殺死表達疾病特異性抗原或表 位的細胞以后可減輕其癥狀的任何其它疾病的藥劑中的應(yīng)用。例 如，蛋白質(zhì)復(fù)合物可有利地用來制備用于治療黑色素瘤的藥劑。
還提供了 一種藥物組合物，其包括作為活性組分的根據(jù)本發(fā)明 的蛋白質(zhì)復(fù)合物以及藥用載體。該藥物組合物當然可以包含一種或 多種另外的活性組分，其通常用于治療給定疾病?？梢酝ㄟ^各種途 徑將蛋白質(zhì)復(fù)合物給予需要其的受治療者。它可以靜脈內(nèi)(IV)或腸 外^會予。


圖1:通過多價MHC限制性、抗原特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物來誘 導(dǎo)把細胞的凋亡。
MZ2-MEL3.0纟田月包的FAM-VAD-FMC染色，其中細月包用下迷進 行溫育
圖(A)模擬品(mock)上清液，其來源于用空pBullet載體(10ng) 壽爭染的293T。
圖(B)三標記物(Tri-TAG)-scFv HyW上清液，其來源于用 pBullet畫三才示^4勿和pBullet scFv Hyb3/BTX(各5 jxg)4爭染的293T纟田胞。
圖(C)六標記物(Hexa-TAG)-scFv Hyb>3上清液，其來源于用 pBullet六才示i己物和pBullet scFv Hyb3/BTX(各5 ing)4爭染的293T細胞。。
用上清液溫育細月包4小時并通過caspatag測定(Intergen)力卩以分 析。示出的是用FAM-VAD-FMC染色的細胞。
圖2:通過六標記物(Hexa-TAG)scFv Hyb3， HLA-A1/MAGE-A1 特異性誘導(dǎo)凋亡。詳情參見實驗部分的4.2項。
圖3:六標i己物(Hexa誦TAG)-scTCR MPD i秀導(dǎo)HLA-A2/gp100
特異,性凋亡。詳情參見實一險部分的4.3項。
實驗部分
本發(fā)明是通過以下實施例來舉例說明的。
材料和方法
細胞
在此研究中使用的靶細胞系是(i)HLA-AlPQS、 MAGE-1PQ\E 色素瘤細胞系MZ2-MEL.3.0, (ii) HLA-A1PC)S、 MAGE-1肌G黑色素 瘤細月包系MZ2-MEL 2.2(由比利時布魯塞爾的T. Boon和P. Coulie 友好提供)，(iii) HLA-Alpos EBV轉(zhuǎn)化的B母細胞APD, (iv) HLA-A2POS、 gplOC)Pos黑色素瘤細胞系BLMgplOO, (v) HLA-A2pos、 gpl00NEG黑色素瘤細月包系BLM，以及(vi) HLA-A2POS EBV專爭4匕的B 母纟田胞BLM。人胚胎腎細胞系293T(由英國牛津的Y. Soneoka友好 才是供)用作生產(chǎn)scTCR和scFv復(fù)合物的細月包系。
凋亡人細胞的免疫熒光分析
胱冬裂酶3
在凋亡細胞中胱冬裂酶3 (半胱天冬蛋白酶3，半胱天冬酶3， caspase 3 )活性是通過來自Intergen(Intergen， Purchase, NY， USA)的 caspaTag，胱冬裂酶活性試劑盒加以確定的。簡而言之，用胱冬裂 酶-3抑制劑FAM-VAD-FMC溫育1 x 106個細胞30分鐘，接著進行 兩次洗滌步驟。在FACSCAN4義器(Becton Dickinson Biosciences, San Jose, USA)上固定和分析細胞。
膜聯(lián)蛋白V/7-AAD染色
通過利用膜聯(lián)蛋白V(BD-Pharmingen)和7-AAD(Sigma)的雙重 染色法來確定凋亡。簡而言之，采集細胞(lxl06),用PBS洗滌 并再懸浮在0.5 ml膜聯(lián)蛋白V結(jié)合緩沖液(2.5 mM CaCl2 )中。在 加入膜聯(lián)蛋白V和7-AAD(0.2嗎/總量)以后，在4°C下溫育細月包30 分鐘，用PBS洗涂，然后在FACSCAN 4義器(Becton Dickinson Biosciences, San Jose, USA )上進行分析。
實施例
l.: scFv Hvb3和scTCR MPD多肽的構(gòu)建。
1.1:從較大噬菌體展示文庫分離和克隆MAGE-l特異性單鏈可 變片段(scFv)。
標準克隆"l支術(shù)用于以下實施例。這些4支術(shù)描述在Maniatis等人 的Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)中。從非免疫噬菌體-Fab文庫選擇定向于腫瘤T細胞表位 HLA誦A1-MAGE-A1的人抗體片段。
為了獲得定向于由基因黑色素瘤-相關(guān)抗原(MAGE)-A1編碼并 由HLA-A1(人I類MHC)分子呈遞的肽抗原的人抗體，較大嗟菌體 Fab抗體譜用于選擇通過體外重4斤疊產(chǎn)生的復(fù)合物 HLA-A 1-MAGE-A 1的重組變體，基本上如在Chames等人的"Direct selection of a human antibody fragment directed against the tumor T-cell epitope HLA-A 1-MAGE-A 1 from a nonimmunized phage-Fab library" ， Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jul 5;97(14):7969-74中所描 述的。
簡而言之
選擇在生物素化復(fù)合物上的噬菌體-抗體。包含3.7xl(T個抗體 片段的較大人Fab文庫用于選擇。在室溫下、在涂布有鏈霉抗生物 素蛋白(10嗎/ml)的免疫試管中的2。/。非脂肪干乳-PBS中首先預(yù)溫 育噬菌體(1013)1小時，以排除鏈霉抗生物素蛋白粘合劑。還在室溫 下、在2。/o乳-PBS中溫育涂布有鏈霉抗生物素蛋白的順磁珠(200 Dynal, Oslo)l小時。隨后用減少量的生物素化復(fù)合物溫育噬菌體1 小時(分別為500、 100、 20、以及4nM， 1~4個周期)。力口入鏈霉 抗生物素蛋白珠，然后將混合物放置在旋轉(zhuǎn)輪上15分鐘。在用0.1% 吐溫-PBS洗滌15次以后，通過用60 pl的50 mM DTT溫育10分 鐘來洗脫結(jié)合的噬菌體，/人而斷裂在復(fù)合物和生物素之間的二石克 鍵。將洗脫的噬菌體在PBS中稀釋至1 ml，然后0.5 ml用來感染生 長至對數(shù)生長期(OD6oo為0.5)的大腸桿菌菌林TG1纟田月包。平皿接種 感染的細胞以進行擴增。在37。C下感染TG1纟田胞30分鐘以后，在 30。C下、在瓊脂平^反上生長細菌過夜。
對HLA-A1/MAGE-A1復(fù)合物表現(xiàn)特異性的分離的Fab片#殳G8 具有低親和力(250 nM)。因此，選擇的TCR樣Ab， Fab-G8，其對 于由HLA-A1分子呈遞的肽黑色素瘤-相關(guān)Ag-Al是高度特異性的， 具有經(jīng)由L鏈改組(鏈混雜，chain shuffling )、 H鏈-耙向誘變、以 及噬菌體展示文庫的體外選擇的結(jié)合而成熟的親合力，基本上如所 4笛述的(Chames P， et al. TCR國Like Human Antibodies Expressed on Human CTLs Mediate Antibody Affinity-Dependent Cytolytic Activity, 777e加謹/ 0//畫畫/0gy, 2002, 169: 1110-1118)。這種程序產(chǎn)生 Fab-G8 Ab書亍生物，F(xiàn)ab-Hyb3，其具有18倍(fold )改善的親和力 (14nM)并且仍具有相同的肽精細特異性。
簡而言之
鏈 U且文庫構(gòu)建。為了構(gòu)建L鏈改組(LS)文庫，將G8Vh基因 克隆到包含人AU和止鏈的文庫的栽體中。后者文庫是在構(gòu)建4交大 非免疫Fab文庫期間產(chǎn)生的。簡短i也i兌，用S/ I和消化包含 Fab-G8的pCESl載體，然后凝膠純化對應(yīng)于G8 Vh的片段并利用 QiaEX方法加以提取(Qiagen， Valencia, CA )。類似;也消4bK和X文庫 并;疑月交純化。在16°C下(利用20 ng插入片^殳和20 jag載體)進4亍大 規(guī)才莫連接作用過夜；乙醇沉淀混合物并通過電穿孔引入到大腸桿菌 TG1纟田月包中。將細胞平皿接種在包含100 pg/ml氨千青霉素和2% 葡萄糖的2xTY瓊脂平板上。在30。C下過夜溫育以后，從平板刮下 細胞并在-80。C下儲存在包含15%甘油的2xTY中。
用于H鏈-CDR3摻加(spiking ) (HS)文庫構(gòu)建的H鏈CDR3
i秀變。為了以Vh基因的一歩PCR擴增來產(chǎn)生HS文庫，我們通過 利用雜交在CDR3力。FR4區(qū)上的引物在H鏈CDR3的13個氨基酸 殘基中引入差異。
使用的引物是
ATACACAGCC-3'，其中下劃線殘基利用90%的野生型核香酸和 10%的A、 T、 C、以及G的等摩爾混合物(購自Eurogentec，Liege, 比利時)。通過PCR并使用pCESl-Fab-G8作為才莫板擴增VH片段。 用和S^EII消化此片段并克隆到包含G8 L鏈的pCESl載體中。 如前所述構(gòu)建文庫。利用引物 pUC 反向 (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3') 以及fd-tet畫s叫24 (5'—TTTGTCGTCTTTCCAGACGTTAGT-3')進4亍才旨纟丈分才斤。由 Eurogentec進4亍DNA序列測定，其中^f吏用pUC反向用于VL而 CHl-fw ( 5'-GAAGTAGTCCTTGACCAGGC-3')用于VH。最后，通 過將輕鏈可變區(qū)(來自最好的HLA-A1/MAGE-A1粘合劑，其獲自 鏈改組文庫)與來源于H鏈文庫的重鏈可變區(qū)結(jié)合而獲得Fab Hyb3。
Hyb3 scFv的構(gòu)建
分兩步來產(chǎn)生FabHyb3的單鏈Fv片段。首先，編碼Fab Hyb3 重和輕鏈片段的基因進行PCR(引物序列為scFv Hyb3序列中的下 劃線部分)以引入限制位點，其使基因可以插入到pBlue-212載體中 (WUlemsen， R. A. et al. Grafting primary human T lymphocytes with cancer-specific chimeric single chain and two chain TCR. Gewe 77^ 7: 1369-1377)。所得到的scFv的序列被證實并引入到用于分析TCR 樣特異性的反轉(zhuǎn)錄病毒表達盒中，基本上如所描述的(Ralph A. et al. T Cell Retargeting with MHC Class I畫Restricted Antibodies: The CD28 Costimulatory Domain Enhances Antigen-Specific Cytotoxicity and Cytokine Production, TTze Jot/m / o/ /wwimo/ogy, 2005, 174: 7853-7858 )。反轉(zhuǎn)錄病毒表達盒，稱為pBullet-盒，包含(1)G250 重鏈可變區(qū)信號序列，以及(2)恒定卡巴鏈接頭(CK)、 CD4跨膜結(jié) 構(gòu)域和胞內(nèi)Y鏈(CD4/力。所有結(jié)構(gòu)域來源于G250特異性嵌合 scFv匿HKCD4/y受體4亥酉交建構(gòu)物(Weijtens， et al. Gene Therapy. 1998， 9:1195-203 )。將scFv Hyb3片段插入斬/和M //消化的pBullet盒 DNA，將scFv Hyb3 5，連接到信號序列以及將3，連接到在pBullet 載體中的CD4/y片,殳。通過下述來i正實scFv的特異性結(jié)合1 )引 入原代(primary)人外周血淋巴細力包，2)分析'淋巴細胞對于相關(guān) 和不相關(guān)的人黑色素瘤細胞的反應(yīng)性，如在Willemsen等人的"T Cell Retargeting with MHC Class I-Restricted Antibodies: The CD28 Costimulatory Domain Enhances Antigen-Specific Cytotoxicity and Cytokine Production" ， T7ze c/owrwa/ o/ /w附wwo/ogy， 2005, 174: 7853-7858)中所描述的。
scFvHyb3的序歹'J
61 CCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTQTOCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCC
121 ATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGG
181 AATAGTGGTAGCA'rAGGCTATGCGQAGTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAQAGAC
241 AACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTG 301窗TACTGTGCGAGGGGTCGTGGATTCCACTACTACTATTACGGTATGGACATOTGGGGC
361 CAAf 郎ACCACgGyCACCGTC!TCAA(MrereQCTCTACTTCCGQTAGCGGCAAATCCTCT
421 GAAGGCAAAQQTACTAGACAG!Z1CTGrocm4CTCAQCCACCCTCQQTGTCAGTGGCCCnA
481 GGACAGACGOCCAGGATTACCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTAGAAGTGTGCACTGG
541 TACCAGCAG AAGCGAQGCCAGQCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATAGCGACCGGCCC
601 TCAGGGATCCCTGAGCQATTCTCTGGK)TCCAACTCTGGGAACATGGCCACCCrGACCATC
挑1 AGCAGGGTCGAAGCCGGGGATOAQGCCQACTATTACTGTCAGGTOTGGGATAGTCGTACT
1.2:具有HLA-A2 P艮制性、gpl00抗原特異性的單鏈T細胞 受體的構(gòu)建。
具有HLA-A2/ gp100特異性的單鏈T細胞受體(scTCR)由溶胞性 T細胞克隆MPD構(gòu)建，基本上如針對具有HLA-A1/MAGE-A1特異 4生的scTCR所4苗述的(R A Willemsen， et al. Grafting primary human T lymphocytes with cancer-specific chimeric single chain and two chain TCR. Gene Therapy. 2000, 7:1369-77 )。
首先，通過TCR家族分型PCR確定了 CTL MPD的TCR a(3 基因用途，長口戶斤4葛述的(Schaft N. Peptide fine specificity of anti-glycoprotein 100 CTL is preserved following transfer of engineered TCR alpha beta genes into primary human T lymphocytes. J Immunol. 2003 170:2186-94)。于是所獲得片段的序列分析便于設(shè)計 引物以特異性地擴增TCR oc可變區(qū)和TCR (3可變和恒定區(qū)(引物 序列為在scTCR-MPD序列中的下劃線部分)。然后一尋這些TCR片 段克隆到載體pBluescript-接頭中，基本上如針對scFv Hyb3所描述 的，以獲得scTCR Vct-接頭-VpCp。所得到的scTCR的連接序列是 在scTCR MPD的序列中的下劃線部分。
為了證實scTCR-MPD與HLA-A2/gpl00的特異性結(jié)合，首先 將scTCR Vot-接頭-VI3aC(3 DNA克隆到pBullet盒中，如針對scFv Hyb3所描述的，然后在引入到原代人外周血淋巴細胞中以后分析 其與HLA-A2/gpl00陽性腫瘤細胞的功能性結(jié)合，如針對scFv Hyb3
所描述的。
scTCR MPD的序歹O
61 AGGOGAAGATOCTGTCATCAACTGCACTTCCTCCAAGGCTTTATATTCTGTACACTGGTA
121 CAGOCAGAAGCATGGTGAAGCACCCGTCTTCCTGATGATATTACTGAAGGGTGGAGAACA
181 GAAGGGTGATGACAAAATATCTGCTTCATTTAATOAAAAAAAGCAGCAAAGCTCCCTGTA
241 GCTTACGGCKirCCCAGCTCAGTTACTCAGGAACCTACTTCTGTGGCACAGAGACGAACAC
S01 CAACCAGTTCTA雷TGGGACAGGGA綴GymMCG置ATTCCA歸TCTOO潔
361 mOTC卿T柳卿AW附CTQAA柳楊柳ACT織暢G柳C7卿g7W
421 CCAGTCACQXGGCACGAGGTGACAGAGATGGGACAAGAAGTGACTCTGAGATGTAAACC
481 AATTTCAGGACACGACTACCTTTTCTGGTACAGACAGACCATGATOCQGiQGACTGGAGTT
541 GCTCATTTACTTTAACAACAACGTTCCaATAGATQATTCAQGGATGCCCGAGGATCGATT
601 CTCMJCTAAGATOGCTAATGCATCATTCTCCACTCraMGATCCAGCCCTCAGAACCCAG
661 GGACTCAJSCTGTGTACTTCTGTGCCAQCAGTTTGGGGCGGTACAATGAGCAGTTCTTCGG
721 GCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGAGGACCTQAAAAACGTOTTCCCACCCGAGGTCGC
781 TGTGTTTGAGCCATCAGAAOCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACAGTOaTATGCCT
841 GGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTQAGCTGGTQGGTGAATGGGAAGGAGGT
恥1 GCACAGTOGGGfTCAGCACAGACCCGCAG!CCGCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATOACTC
961 CAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCQGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAA
1021 CCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTGGGAGAATGACQAGTOGACCCAGGA
1081 T A anonnA A A nCT(Trr,Ar'nCA.ftATCOTCAfiCiGCCGAGQCCTGGGG7!AGAGCAGACGCGGC
1141 C< C
2.: scFv-BTX和scTCR-BTX的構(gòu)建
本部分描述了編石馬基于 TCR 、 i殳置有結(jié)合配體 BTX(scTCR-BTX)的多肽的核酸的構(gòu)建，以及編碼基于抗體、設(shè)置 有結(jié)合配體BTX (scFv-BTX)的多肽的核酸的構(gòu)建。
將編碼scFv Hyb3和scTCR-MPD的基因(參見1.1和1.2)連4妾 到a-4艮環(huán)蛇毒素(BTX)基因(具有以下限制位點的序列)，其由 Baseclearb.v.制備成合成基因(Leiden，荷蘭)并克隆到pGEMU栽體 中。3尋BTX基因克隆到7Vw /和y;70 /消4匕的pBullet Hyb3-CD4/y 和pBullet MPD-CD4々中，去除CD4/y片段并將BTX蛋白質(zhì)5'連接 到 scFv和scTCR 。 這導(dǎo)致載體pBullet-scFv Hyb3/BTX和 pBullet-scTCR MPD/BTX。
a-銀環(huán)蛇毒素的序列
1 GCGGCCQCTATCGTATGCCACACAACAGCTACTTCGCCTATTAGCGCTGTGACTTGTCCA
6 i CCTGGGGAGAACOTATGCTATAGAAAGATGTGGTGTGATGTATTCTGTTCCAGCAGAGGA 121 AAGGTAGTGGAATTGGGGTGTGCTGCTACTTGCCCTTCAAAGAAGCCCTATGAGGAAGTT 181 ACCTGTTGCTCAACAGACAAGTGCAACCCACATCCGAAACAQAQACCTGOTTGAC2]2GAG
a 4M^蛇毒素基因的^IL^^^且成
AAA1VCHTTATSPISAVTCPPGENLCYRKMWCDVFCSS RGKVVELGCAATCPSKKPYEEVTCCSTDKCNPHPKQRP
G
3:三才示^己物和六標i己物的構(gòu)建
為了能夠產(chǎn)生包4舌scFv Hyb3或scTCR MPD多肽的三聚體和 六聚體多價蛋白質(zhì)復(fù)合物，通過PCR技術(shù)產(chǎn)生了兩種不同的連接 肽。三標記物連4妾肽包含三聚化基序和一個BTX結(jié)合位點，以致 三聚化的三標記物連4妻肽對于設(shè)置有結(jié)合配體BTX的多肽具有三 個高親和力結(jié)合位點。六標記物連4妾肽包含三聚化基序和兩個用于 BTX-多肽的BTX結(jié)合位點，以致三聚化的六標記物連接肽對于包 含BTX的多肽具有總共六個結(jié)合位點。
3.1:三標記物連接肽的構(gòu)建。
通過PCR來產(chǎn)生合成基因片段，其編碼三聚化基序以及用于 BTX-多肽的結(jié)合位點。產(chǎn)生了編碼人肺表面活化蛋白(surfactant protein) D的頸區(qū)肽(NRP)、 BTX結(jié)合位點序列以及互補序列的寡 核苷酸，并在PCR中用作模板，以產(chǎn)生合成基因，該合成基因編碼 1 )白細胞介素2蛋白的信號序列，2 ) NRP序列，以及3 ) BTX結(jié) 合位點。通過序列分析(對于序列參見下文)i正實了所得到的核酸 建構(gòu)物(三標記物)并利用Nco I和Xho I限制位點將其克隆到反轉(zhuǎn)錄 病毒載體pBullet中。
三才示i己物的序列
1 CCATGGACAGGATGCAACTCCTGTCTTOCATTQCACTAAGTCTTGCACTTGTCACTCCTO
61 ACGTAGCAAGOTTACGACAACAGGTAGAAGCCTTGCAAGGGCAGGTACAAGACTTACAGG
121 CGGC ATTTAGCCAATACAAAAAGGTAGAGTTGTTTCCAAACTGGCGGTACTACGAGAGCA
181. GCCTGGAGCCCTACCCCGACTAACTCGAG
三標記物的#^酸組成
IL-2信號序列 三聚化基序 QVQHLQAAFSQYKKVELFPN WRYYESSLEPYPn
BTX結(jié)合位點
3.2.六標i己物i^接肽的構(gòu)建
構(gòu)建了編碼連接肽的核酸，其中連接肽便于生產(chǎn)包括六個 TCR-(才羊)多肽的蛋白質(zhì)復(fù)合物。這涉及通過PCR ^夸在三標"i己物肽 (參見3.1項)中的第二 BTX結(jié)合位點序列引入IL-2信號序列與三聚 4匕基序之間。這導(dǎo)致以下核酸建構(gòu)物
六才示i己物的序歹'J
1 CCATGGACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAOTCTTGCACTTGTCACTTGGC
61 GGTACTACGAGAGGAGCCTGOAjGCCOTACCCCQACCCTQACGTAGCAAGCTTACGACAAC
121 AGGTAGAAGCCTTGCAAGGGCAGGTACAACACTTACAGGCGGGATTTAGCCAATACAAAA
181 AGGTAGAGTTGTTTCCAAACGGATGGCGGTACTACGAGAGCAGGCTaGAGCCCTACCCCG
241 ACTAACTCGAG
六標i己物的^^^i且成
MDRMQ.LLSCIALSLALVT WRYYESSLEPYPDPDVASLi IL2信號序列 B1X結(jié)合位點
QQV^"QGQVQfl"LQAAFSQyJS:iirVELfPiVGWRYYESSLE 三聚化基序 BTX結(jié)合位點
P Y P D
lt匕外，制備了六標i己物連4妾肽建構(gòu)物，該建構(gòu)物不^f又包含兩個
BTX結(jié)合位點序列，而且包含His-標記物和c-myc-標記物序列，其 便于蛋白質(zhì)純化，并通過短柔性連接序列(關(guān)于序列參見下文)加 以分離。
具有6 x His和c-myc標i己物的六才示i己物的序歹寸
1 CCATGGACAGGATGCAACTCCTGTCTTQCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACTTGGC
61 GGTACTACGAGAGCAGCCTGGAGCCCTACCCCGACQQATCTGGATCTGGCTCTGQATCTG
121 AACAAAAAGTTA1TTCTOAAGAAGATCTGGGATCTGGCTCTGQATCTGGCTCTCCTGACG
181 TAGCAAGCTTACGACAACAGGTAOAAGCCTTGCAAGGGCAGGTACAACACTTACAGGCGG
241 CATTTAGCCAATACAAAAAGGTAGAGTTGTTTCGAAACGGAGGATCTG<3ATCTGGCTCTG
301 GATCTCATCATCATCACCATCACGGAGQATCTOGATCTGGCTCT(K5ATCTTOGCGGTACT
361 ACQAGAGCAGCCTGGAGCCCTACCGCGACTAACTCGAG具有6 x His和 c-myc才示{己物的六才示^己物的^L^^^且成
MDRMQLLSCIALSLALVTWRYYESSLEPYPDGSGSGSG IL-2信號序列 BTX結(jié)合位點
接頭
S EOKLISEEDLG S G S G S G S PDVASLROOVEALQGOVO c-myc標記物 接頭 NRP三聚化基序
HLQAAFSQYKKVELFPNGG S G S G S GSH H H H H HG G S G S G
接頭 6xHis標記物 接頭
SGSWRYYESSLEPYPD BT^合位點
4.:三^#^和六^#^ scFv陽Hyb3/BTX和scTCR陽MPD/BTX蛋白 質(zhì)復(fù)合物的生產(chǎn)。
在人HEK-293T細胞(293T)中分別產(chǎn)生稱作三標記物 -scFv/scTCR和六才示i己物-scFv/scTCR的三聚體和六聚體 scFv-Hyb3/BTX和scTCR-MPD/BTX蛋白質(zhì)復(fù)合物。為此，利用來 自Amersham bioscience的Cellfect i式劑盒、通過石粦酸4丐4爭染，^!尋編 碼用于三聚體或六聚體復(fù)合物的多肽和連4妻肽的pBullet載體引入到 293T細胞中。在轉(zhuǎn)染一天以后，用新鮮介質(zhì)更換轉(zhuǎn)染細胞的組織培 養(yǎng)基并使細胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)3至5天。由于IL-2信號序列，連接肽被 分泌到培養(yǎng)基中。在第3或第5天，收集包含組裝復(fù)合物的培養(yǎng)基， 通過0.22 juM過濾器，并立即用于i秀導(dǎo)凋亡，或存^f諸在-80。C。
4.1:利用六聚體scFvHyb3蛋白質(zhì)來i秀導(dǎo)凋亡
為了試驗三聚體和六聚體scFv Hyb3誘導(dǎo)HLA-Alpos、 MAGE-A1PQS黑色素瘤細月包凋亡的能力，用獲自經(jīng)編碼三標記物或六 標記物的DNA建構(gòu)物連同編碼scFv Hyb3的建構(gòu)物轉(zhuǎn)染的細胞的3
ml組織培養(yǎng)上清液溫育在6孔4反中的1 x io6個MZ2-MEL 3.0細胞4小時。
4小時以后，1 )用PBS洗滌細胞，2)通過胰蛋白酶消化收集細 胞，接著在介質(zhì)中洗滌，3)用PBS洗滌細胞，并且最后按照制造商 的說明書用胱冬裂酶-3底物FAM-VAD-FMC對細胞進行染色。
圖1說明，僅在用包含六聚體scFv Hyb3蛋白質(zhì)的上清液溫育的 MZ2-MEL3.0細胞中可以檢測到胱冬裂酶-3活性，而當用包含三聚 體scFv Hyb3蛋白質(zhì)或獲自用空pBullet栽體轉(zhuǎn)染的293T細胞的組織
培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)基溫育時則檢測不到。這表明，六聚體而不是三 聚體多價單特異性復(fù)合物可以在表達肺瘤抗原MAGE-A1的人細胞
中i秀導(dǎo)凋亡。
4.2:通過六標i己物-scFvHyb3,HLA-Al/MAGE-Al特異性i秀導(dǎo) 凋亡。
為了試驗凋亡誘導(dǎo)的特異性，例如，HLA-A1/MAGE-A1限制性 特異性，用單層HLA-A1PQS、MAGE-A1PGS黑色素瘤細月包系MZ2-MEL 3.0和/或突變MZ2-MEL2.2黑色素瘤細月包系(其已喪失MAGE-A1 抗原)溫育包含六標記物-Hyb 3的上清液。為此，用以下上清液溫 育1 x 106個黑色素瘤細胞4小時1 )來源于才莫擬品轉(zhuǎn)染的293T細 胞(空pBullet載體)的上清液，2 )來源于用不相關(guān)建構(gòu)物pBullet scTCR MPD連同pBullet載體六標記物轉(zhuǎn)染的293T細月包的上清液，或3 ) 來源于用pBullet scFv Hyb3載體連同pBullet六標記物載體轉(zhuǎn)染的 293T細胞的上清液。通過用膜聯(lián)蛋白V(PS暴露)和7-AAD(生存力染 料)兩者的雙重染色法分析了凋亡的誘導(dǎo)。
如圖2所示，僅HLA-A1PQS、 MAGE-A1PQS黑色素瘤細胞系 MZ2-MEL 3.0顯示出凋亡的顯著誘導(dǎo)，其是在用包含六標記物scFv
Hyb3蛋白質(zhì)的上清液溫育以后通過膜聯(lián)蛋白V和7-AAD染色而測 得的(圖2A)。相反，其它條件均沒有顯示出任何高于背景水平的凋 亡4正兆。用不相關(guān)六標記物scTCR MPD溫育的MZ2-MEL 3.0細月包 表現(xiàn)為一個實例(圖2B)。蛋白質(zhì)復(fù)合物的凋亡誘導(dǎo)的抗原特異性由 以下事實得到證明MAGE-A1抗原喪失突變細胞系MZ2-MEL2.2(其 來源于MAGE-A1抗原陽性細胞系MZ2-MEL 3.0)的生存力并未受 到六標記物-scFvHyb3蛋白質(zhì)的影響(圖2C、 D)。
4.3:通過六銜己物scTCR MPD， HLA-A2/gp100特異性i秀導(dǎo)凋
亡
gp100抗原在黑素細胞中高度表達。通過六標記物scTCR MPD 蛋白質(zhì)復(fù)合物，HLA-A2/gp100特異性誘導(dǎo)凋亡是通過用組織培養(yǎng) 上清液溫育HLA-A2pos BLM和HLA-A2/gpl00pos BLM-gplOO黑色 素瘤細月包來加以分析，其中組織培養(yǎng)上清液是通過用pBullet六標 記物載體連同pBullet scTCR MPD/BTX栽體轉(zhuǎn)染293T細胞而獲得 的。溫育4小時后，收集細胞并用膜聯(lián)蛋白V和7-AAD染色，以 確定凋亡的i秀導(dǎo)。圖3"i兌明，4又在gplOO-陽性黑色素瘤細月包中i秀導(dǎo) 凋亡(圖3C),而在gplOO-陰性細胞中則沒有(圖3B)。此外，不 相關(guān)六標記物scFv Hyb3蛋白質(zhì)并沒有誘導(dǎo)gp100陽性黑色素瘤細 胞的凋亡(圖3A)。這些lt據(jù)說明，靶細胞的殺死是抗原特異性的。
權(quán)利要求
1. 一種多價單特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物，包括至少六個能夠識別和結(jié)合于特異性主要組織相容性復(fù)合物(MHC)-肽復(fù)合物的多肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，進一步包括至少一個包 含多聚化基序的連4妻肽；以及至少一個結(jié)合位點，用于所述至 少六個多肽之一，其中所述多肽包括用于所述結(jié)合位點的結(jié)合
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中，所述結(jié)合位點是 a-銀環(huán)蛇毒素(BTX)結(jié)合位點并且其中所述配體是BTX。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中，所述多聚化 基序是哺乳動物多聚化基序，優(yōu)選為人多聚化基序。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中，所 述連接肽包括三聚化基序和至少兩個結(jié)合位點，所述至少兩個 結(jié)合4立點用于所述至少六個多肽中的至少兩個。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中，所述三聚化基序 選自由人肺表面活化D蛋白的頸區(qū)肽(NRP)、噬菌體T4纖維 蛋白的三聚化信號以及修飾拉鏈基序組成的組。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中，所述三聚化基序 是人肺表面活化D蛋白的NRP。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中，至少 一個多肽包括氨基酸序列，所述氨基S交序列對應(yīng)于天然TCR 的月包外恒定(C)區(qū)和可變(V)區(qū)序列。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中，至少一個多肽是 單鏈T細胞受體(scTCR)多肽。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中，至少一個多 肽是雙鏈TCR(tcTCR),所述雙鏈TCR包括抗原特異性TCR 的胞外可變(V)區(qū)和恒定(C)區(qū)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中，所述scTCR 或tcTCR包括抗原特異性TCR的ot和p鏈對或者y和5鏈對。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中， 至少一個多肽是抗原特異性MCH-限制性抗體或其功能性片 段，優(yōu)選為單鏈可變抗體片段(scFv)。
13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中，所述 至少六個多肽能夠識別和結(jié)合于病毒表位、癌癥特異性表位或 與自身免疫病有關(guān)的表位。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中，所述表位選自 由HTLV-1表位、HIV表位、EBV表位、CMV表位、黑色素 瘤表位組成的組。
15. —種用于提供根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的蛋白質(zhì)復(fù) 合物的方法，包括以下步驟才是供具有一種或多種核酸的宿主細月包，其中所述核酸編 碼所述至少六個能夠識別和結(jié)合于特異性主要組織相容性復(fù) 合物(MHC)-肽復(fù)合物的多肽，以及可選地一種連接肽；-使所述宿主細爿包表達所述核酸；以及使所述得到的肽組裝到所述蛋白質(zhì)復(fù)合物中。
16. 才艮據(jù)4又利要求15所述的方法，其中，^是供編碼所述多肽的所 述一種或多種核酸，包4舌乂人i蜜菌體展示文庫分離和克隆scFv。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中，所述表達的肽在所 述宿主細胞的培養(yǎng)基中被分泌和組裝。
18. —種用于體外或體內(nèi)誘導(dǎo)靶細胞凋亡的方法，包括使所述細胞 與根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物接觸。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，包括通過權(quán)利要求17的方法產(chǎn) 生所述蛋白質(zhì)復(fù)合物的成分以及^f吏所述耙細月包與包括所述蛋 白質(zhì)復(fù)合物的培養(yǎng)基接觸。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其作為 藥劑。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其作為抗病毒或抗腫 瘤劑。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物在制備用 于治療癌癥、自身免疫病或病毒或纟效生物感染的藥劑中的應(yīng) 用。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的應(yīng)用，其中，所述癌癥是黑色素瘤。
24. —種藥物組合物，包括才艮據(jù)4又利要求1至14中任一項所述的 蛋白質(zhì)復(fù)合物以及藥用載體。
25. —種連接肽，包括多聚化基序，優(yōu)選人多聚化基序，更優(yōu)選人 三聚〗匕基序，以及至少兩個結(jié)合4立點，可選i也進一步包纟舌至少 一個親和標記物，其中所述親和標記物便于純化所述連接肽。
26.編碼根據(jù)權(quán)利要求25所述的連接肽的核酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學(xué)和分子醫(yī)學(xué)的領(lǐng)域。尤其是，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)復(fù)合物，其可以作為治療劑用來在靶細胞群體，例如在腫瘤細胞或病毒感染細胞中誘導(dǎo)凋亡性細胞死亡。本發(fā)明提供了一種多價單特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物，該復(fù)合物包括至少6個能夠識別和結(jié)合于特異性主要組織相容性復(fù)合物(MHC)-肽復(fù)合物的多肽，該復(fù)合物通過識別和結(jié)合于靶細胞的MHC-肽分子來誘導(dǎo)凋亡。還提供了蛋白質(zhì)復(fù)合物例如在制備用于治療癌癥、病毒或微生物感染的藥劑中的治療應(yīng)用。
文檔編號C07K19/00GK101379083SQ200580052546
公開日2009年3月4日 申請日期2005年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月20日
發(fā)明者拉爾夫·亞歷山大·威廉森 申請人:鹿特丹伊拉斯姆斯大學(xué)醫(yī)療中心