專利名稱：灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)、提取方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真菌提取物、提取方法及用途，特別是涉及一種灰樹花提取物、提取方法及用途。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒1型(HSV-1)感染眼部引起的單皰病毒性角膜炎(herpes simplexkeratitis，HSK)可導(dǎo)致角膜溶解、新生血管形成及潰瘍穿孔等嚴(yán)重病理改變，是當(dāng)今世界上危害嚴(yán)重的感染性眼病之一，發(fā)病率占角膜病的首位。由于抗生素、類固醇激素及其他免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，HSK發(fā)病率有明顯上升趨勢，往往因反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，對視力功能損害較大，是常見的嚴(yán)重致盲性眼病。臨床上尚缺乏有效控制和治愈HSK的藥物。
乙型肝炎和丙型肝炎會導(dǎo)致肝硬化和肝癌，是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病；我國病毒性肝炎發(fā)病率居世界首位，每年我國治療病毒性肝炎方面的相關(guān)支出在300億至500億元。但目前對病毒性疾病的治療仍缺乏專屬性強(qiáng)的藥物。國際公認(rèn)的臨床治療乙肝的藥物有干擾素(IFN)及拉米夫定(3TC)，前者的遠(yuǎn)期療效只有20％～30％左右；后者易產(chǎn)生耐藥毒株。ACV是治療HSV病毒的首選藥物，但它易產(chǎn)生耐藥毒株。因此，尋求高效、低毒的抗病毒藥物成為國內(nèi)外新藥研究的熱點。
20世紀(jì)60年代人們發(fā)現(xiàn)食用菌具有抗病毒活性。從皺褶羅鱗傘子實體中分離出一種名為RC-183的蛋白質(zhì)，RC-183能抑制皰疹病毒、流感病毒及HIV病毒等多種病毒的復(fù)制。孫慧等曾從楊樹菇等幾種食用菌中分離到抑制TMF的蛋白，但迄今從食用菌中分離純化出抗病毒蛋白還很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)的提取方法。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)的用途。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)，是用下述方法提取(1)將灰樹花子實體粉末按質(zhì)量比1∶1-15的比例加入70-90℃的水浸泡5-15小時后離心；(2)上清液加入1-3體積倍的體積百分比濃度為60％-90％的乙醇水溶液，在2-6℃，放置8-16小時后離心；(3)沉淀加入1-3質(zhì)量倍的乙酸，在2-6℃，放置1-3小時后離心；(4)沉淀加入1-3質(zhì)量倍的質(zhì)量百分比濃度為4％-10％的氫氧化鈉水溶液，2-6℃，放置1-3小時后離心；
(5)上清液加硫酸銨至飽和度為40％，在2-6℃，放置8-16小時后離心；(6)沉淀加入1-3質(zhì)量倍的重蒸餾水，透析8-16小時；(7)沉淀經(jīng)陰離子交換柱分離，用0.1mol/L-0.3mol/L的氯化鈉水溶液洗脫得到灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)。
優(yōu)選的是一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)，所述提取方法是(1)將灰樹花子實體粉末按質(zhì)量比1∶3的比例加入80℃的水浸泡10小時后離心；(2)上清液加入2體積倍的體積百分比濃度為75％的乙醇水溶液，在4℃，放置12小時后離心；(3)沉淀加入2質(zhì)量倍的乙酸，在4℃，放置2小時后離心；(4)沉淀加入2質(zhì)量倍的質(zhì)量百分比濃度為6％的氫氧化鈉水溶液，4℃，放置2小時后離心；(5)上清液加硫酸銨至飽和度為40％，在4℃，放置12小時后離心；(6)沉淀加入2質(zhì)量倍的重蒸餾水，透析12小時；(7)沉淀經(jīng)陰離子交換柱分離，用0.2mol/L的氯化鈉水溶液洗脫得到灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)。
一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)的提取方法，包括如下步驟(1)將灰樹花子實體粉末按質(zhì)量比1∶1-15的比例加入70-90℃的水浸泡5-15小時后離心；(2)上清液加入1-3體積倍的體積百分比濃度為60％-90％的乙醇水溶液，在2-6℃，放置8-16小時后離心；(3)沉淀加入1-3質(zhì)量倍的乙酸，在2-6℃，放置1-3小時后離心；(4)沉淀加入1-3質(zhì)量倍的質(zhì)量百分比濃度為4％-10％的氫氧化鈉水溶液，2-6℃，放置1-3小時后離心；(5)上清液加硫酸銨至飽和度為40％，在2-6℃，放置8-16小時后離心；(6)沉淀加入1-3質(zhì)量倍的重蒸餾水，透析8-16小時；(7)沉淀經(jīng)陰離子交換柱分離，用0.1mol/L-0.3mol/L的氯化鈉水溶液洗脫得到灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)。
一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)的提取方法，優(yōu)選的提取步驟是(1)將灰樹花子實體粉末按質(zhì)量比1∶3的比例加入80℃的水浸泡10小時后離心；(2)上清液加入2體積倍的體積百分比濃度為75％的乙醇水溶液，在4℃，放置12小時后離心；(3)沉淀加入2質(zhì)量倍的乙酸，在4℃，放置2小時后離心；(4)沉淀加入2質(zhì)量倍的質(zhì)量百分比濃度為6％的氫氧化鈉水溶液，4℃，放置2小時后離心；(5)上清液加硫酸銨至飽和度為40％，在4℃，放置12小時后離心；(6)沉淀加入2質(zhì)量倍的重蒸餾水，透析12小時；(7)沉淀經(jīng)陰離子交換柱分離，用0.2mol/L的氯化鈉水溶液洗脫得到灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)。
一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)，在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明的一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)的提取步驟簡單，提取成本較低，原料易得，實驗證明對病毒性感染有一定的療效。


圖1為一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)的提取工藝流程圖；圖2為用SDS-PAGE鑒定一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)(GFAP)的分子量；圖3為一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)(GFAP)對2.2.15細(xì)胞的毒性(MTT法)；圖4為一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)(GFAP)對2.2.15細(xì)胞HBeAg分泌的抑制作用；圖5為GFAP對2.2.15細(xì)胞系HBV DNA的抑制作用；圖6為GFAP對HBsAg與抗HBs抗體結(jié)合的抑制作用。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實施例1一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)，用下述方法提取(1)將灰樹花子實體粉末按質(zhì)量比1∶3的比例加入80℃的水浸泡10小時后，2500rpm離心20min；(2)上清液加入2體積倍的體積百分比濃度為75％的乙醇水溶液，在4℃，放置12小時后離心；(3)沉淀加入2質(zhì)量倍的乙酸，在4℃，放置2小時后離心；(4)沉淀加入2質(zhì)量倍的質(zhì)量百分比濃度為6％的氫氧化鈉水溶液，4℃，放置2小時后離心；(5)上清液加硫酸銨至飽和度為40％，放置12小時后，10,000rpm離心10min；(6)沉淀加入2質(zhì)量倍的重蒸餾水，透析12小時；(7)沉淀經(jīng)陰離子交換柱分離，用0.2mol/L的氯化鈉水溶液洗脫得到灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)。
實施例2一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)，用下述方法提取(1)將灰樹花子實體粉末按質(zhì)量比1∶1的比例加入90℃的水浸泡15小時后離心；(2)上清液加入3體積倍的體積百分比濃度為60％的乙醇水溶液，在6℃，放置8小時后離心；(3)沉淀加入1質(zhì)量倍的乙酸，6℃，放置3小時后離心；(4)沉淀加入3質(zhì)量倍的質(zhì)量百分比濃度為4％的氫氧化鈉水溶液，2℃，放置3小時后離心；(5)上清液加硫酸銨至飽和度為40％，放置8小時后離心；(6)沉淀加入1-3質(zhì)量倍的重蒸餾水，透析16小時；(7)沉淀經(jīng)陰離子交換柱分離，用0.1mol/L的氯化鈉水溶液洗脫得到灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)。
實施例3一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)，用下述方法提取
(1)將灰樹花子實體粉末按質(zhì)量比1∶15的比例加入70℃的水浸泡5小時后離心；(2)上清液加入1體積倍的體積百分比濃度為90％的乙醇水溶液，在2℃，放置16小時后離心；(3)沉淀加入3質(zhì)量倍的乙酸，在2℃，放置1小時后離心；(4)沉淀加入1質(zhì)量倍的質(zhì)量百分比濃度為10％的氫氧化鈉水溶液，6℃，放置1小時后離心；(5)上清液加硫酸銨至飽和度為40％，放置16小時后離心；(6)沉淀加入1-3質(zhì)量倍的重蒸餾水，透析8小時；(7)沉淀經(jīng)陰離子交換柱分離，用0.3mol/L的氯化鈉水溶液洗脫得到灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)。
實施例4從灰樹花子實體粉末分離到一種抗單純皰疹病毒的蛋白質(zhì)(Grifolan Frondosaantiviral protein，GFAP)，通過體外實驗研究了GFAP抗HSV-1作用。為了驗證其體內(nèi)抗HSV-1作用，本實驗采用小鼠HSK模型，觀察了GFAP對小鼠病毒性角膜炎的治療效果。現(xiàn)將結(jié)果報道如下實驗1GFAP的分離、純化及其生物學(xué)活性1.1實驗材料1.1.1細(xì)胞和病毒株Vero細(xì)胞為本研究室保存細(xì)胞株；HSV-1KOS株為天津醫(yī)科大學(xué)保存毒株。
1.1.2主要試劑與藥品灰樹花購自浙江方格藥業(yè)有限公司；ACV為武漢普生公司生產(chǎn)注射用干粉。DEAE-Sepharose為Pharmacia公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為寶生物產(chǎn)品；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品。
1.1.3主要儀器穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、垂直電泳槽為北京六一儀器廠產(chǎn)品；切膠儀Spotpicker為Amersham Science產(chǎn)品；基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF/MS，Reflex III)為德國BRUKER公司產(chǎn)品。
1.2實驗方法1.2.1灰樹花各組分的提取分離方法見實施例1中步驟(1)-(6)，具體提取步驟見圖1。
1.2.2各組分抗病毒實驗待Vero細(xì)胞長成單層后傾去培養(yǎng)基，每孔加入100TCID50的HSV-1病毒懸液。感染病毒2h后棄去病毒液，使用維持液洗2遍。分別加入不同濃度的各個組分，樣品每個濃度3復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，記錄各孔的CPE。待病毒對照孔細(xì)胞完全病變時，做MTT染色和光吸收值(OD492)測定，并計算抑制率。
2.2.3組分3中蛋白質(zhì)的離子交換柱分離將圖1中所示組分3中蛋白質(zhì)濃縮后裝入透析袋，4℃下在0.1M Tris-HCl(pH 7.2)緩沖液中充分透析，透析后的樣品上樣于經(jīng)0.1M Tris-HCl(pH 7.2)緩沖液充分平衡的DEAE-sepharose(37×1.3cm)層析柱上，然后分別用20ml含0～1M NaCl作線性梯度洗脫，經(jīng)280nm紫外檢測，收集各蛋白質(zhì)吸收峰，然后測定各組分抗HSV-1活性。
1.2.4蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮蘭法測定蛋白質(zhì)的含量以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)對照，繪制考馬斯亮蘭法測定蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測定GFAP的蛋白質(zhì)含量。具體步驟如下吸取1.0ml GFAP溶液加入到具塞試管中，以1.0ml蒸餾水作空白對照，各加考馬斯亮蘭溶液5.0ml，搖勻，4-6min后在分光光度計上于280nm處測定各樣品的吸光度OD280。計算求得GFAP的蛋白質(zhì)含量。
1.2.5SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳1.2.5.1按下表分別配制分離膠和濃縮膠

10％過硫酸銨和1％TEMED最后加入。
1.2.5.2灌制迅速將分離膠加至兩玻璃板的間隙，留出灌注濃縮膠所需空間(梳子的齒長再加0.5cm)。再在分離膠上面小心注入一層水(約3mm高)，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。待分離膠聚合完全后，傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。小心避免混入氣泡，再加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫。待濃縮膠聚合完全后，小心移出梳子。
1.2.5.3電泳把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸電極緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部兩層玻璃板之間的氣泡。
1.2.5.4處理樣品將待分析的樣品與等體積的樣品處理液混合，100℃水浴3-5分鐘，冰浴冷卻。
1.2.5.5加樣按預(yù)定順序加入已處理的樣品，加樣量通常為10～25μl(1.5mm厚的膠)。
1.2.5.6電泳將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8V/cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15V/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約1cm，然后關(guān)閉電源。
1.2.5.7剝膠從電泳裝置上取出玻璃板，撬開玻璃板。緊靠最左邊一孔(第一槽)凝膠下部切去一角以標(biāo)注凝膠的方位。
1.2.5.8染色用考馬斯亮藍(lán)R250對SDS-PAGE電泳分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色。染色1～2小時或過夜。
1.2.5.9脫色與保存用脫色液脫色，需3～10小時，其間多次更換脫色液至背景清楚。用脫色液清洗，少量多換，直至條帶清晰。脫色后，可將凝膠浸于甘油中，或裝在塑料袋內(nèi)放置于4℃保存。為永久性保存，可對凝膠進(jìn)行拍照。
1.2.5GFAP的肽質(zhì)量指紋譜(PMF)的分析及數(shù)據(jù)庫檢索由國家生物醫(yī)學(xué)分析中心使用MALDI-TOF/MS分析其分子量和PMF。具體方法如下將GFAP蛋白質(zhì)斑點從電泳凝膠上切下，用含100mM碳酸氫氨50％乙腈1∶1的溶液在37℃振搖30min，重復(fù)此步驟直到完全脫色，膠片真空干燥后用胰蛋白酶酶切提取肽段，然后與過量的基質(zhì)混合，加在樣品靶盤上，溶劑揮發(fā)后蛋白質(zhì)與基質(zhì)形成共結(jié)晶，再用脈沖激光照射靶點，導(dǎo)致蛋白質(zhì)電離，經(jīng)過質(zhì)量分析器檢測，獲得PMF。將GFAP的質(zhì)量指紋譜同NCBI等數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較，尋找具有相似肽指紋譜的蛋白質(zhì)。
1.2.6GFAP的N端氨基酸序列分析SDS-PAGE電泳后去除濃縮膠，將凝膠和硝酸纖維素膜分別在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡20min，采用Bio-Rad公司的Mini Trans Blot Cell裝置，以200mA穩(wěn)流1h將蛋白質(zhì)從凝膠電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將濾膜置于100％甲醇中潤濕幾秒后在染色液中浸泡1min，甲醇脫色至蛋白質(zhì)條帶清楚并在超純水中漂洗后自然晾干，然后進(jìn)行N端氨基酸序列測定。N端氨基酸序列測定由國家生物醫(yī)學(xué)分析中心色譜室完成。
1.3結(jié)果1.3.1灰樹花各組分抗病毒活性通過40％硫酸銨分級沉淀、陰離子交換柱層析，從灰樹花子實體中分離到了一種具有抗HSV-1作用的蛋白質(zhì)(GFAP)?；覙浠崴崛∥?F1)和灰樹花D組分(F2)抗HSV-1的IC100分別是512μg/ml和128μg/ml?；覙浠?0％硫酸銨沉淀(F3)具有抗病毒活性。將灰樹花40％硫酸銨分級沉淀溶于水，用DEAE-Sepharose交換柱層析分離，得到四個組分(F6-F9)。經(jīng)抗病毒活性檢測，組分7(F7)具有抗HSV-1活性(表2-1)。
表1灰樹花中抗HSV-1物質(zhì)的分離及活性

*完全抑制HSV-1病毒感染細(xì)胞的樣品最小濃度。
1.3.2GFAP的離子交換柱分離將F3濃縮后透析，然后上樣于DEAE-sepharose層析柱，用不同濃度的NaCl作線性梯度洗脫，收集各蛋白質(zhì)吸收峰，獲得到四個組分(F6-F9)，并測定各組分抗HSV-1活性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)3中有四個主峰，其中峰2(F7)含抗HSV-1活性的蛋白質(zhì)。將F7用透析袋在蒸餾水中透析12h，其間換水2～3次，再用聚乙二醇濃縮，得到GFAP。
1.3.3GFAP的純度、分子質(zhì)量、蛋白質(zhì)含量和含糖量等測定由SDS-PAGE電泳圖(圖2)中可以看出，考馬斯亮藍(lán)染色后，GFAP樣品顯示一條均一的蛋白質(zhì)條帶，說明GFAP已達(dá)到電泳純。GFAP是一個單亞基蛋白，其分子質(zhì)量約為29.5kDa。使用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)直接分析它的分子量，測定分子量為29529Da。兩種方法鑒定GFAP的分子量基本上是一致的。
由苯酚-硫酸法測得GFAP的含糖量約為1.5％，用考馬斯亮蘭法測定GFAP的蛋白質(zhì)含量為95.3％。證實GFAP是一種天然糖蛋白。
1.3.4GFAP的PMF的制備及數(shù)據(jù)庫檢索用PMF鑒定蛋白質(zhì)主要基于以下參數(shù)匹配的肽段數(shù)、質(zhì)量精度、肽譜的質(zhì)量、分子量、峰的強(qiáng)度、分子量和等電點實驗值和理論值的差異。用MALDI-TOFs技術(shù)制備GFAP的PMF，共檢出13條肽譜峰。通過查詢NCBI等數(shù)據(jù)庫，分析比較數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果，篩選出最適匹配記錄(表2)。相關(guān)檢索結(jié)果中以真菌來源的一種Serine proteianse(Accessiongi28804524)為匹配最好。這種Serine proteianse的分子量為40 410Da，而GFAP的分子量為29 529kDa，兩者的分子量有很大的差異。絲氨酸蛋白酶(Serine proteianse)是一個蛋白酶家族，它們的作用是斷裂大分子蛋白質(zhì)中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質(zhì)。在細(xì)胞內(nèi)蛋白酶參與機(jī)體內(nèi)許多反應(yīng)，如凝血過程、激素作用反應(yīng)、補(bǔ)體的級聯(lián)作用反應(yīng)。但此酶具有抗病毒活性尚未見報道。
表2GFAP蛋白的數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果

1.3.5GFAP的N端氨基酸序列分析N端氨基酸序列分析表明，GFAP的N端序列為RTQDNAPNGLN。測得GFAP的N末端部分氨基酸序列后，將GFAP的N末端11個氨基酸的序列片段為靶序列，在NCBI服務(wù)器上采用BLAST程序進(jìn)行序列對蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較檢索，尋找其和已知蛋白的同源性。在Blast檢索結(jié)果中選擇了相似性較高的3個蛋白進(jìn)行對比分析，見表(3)。Hypothetical protein TTHERM_00324530全序列長1565氨基酸，發(fā)現(xiàn)它和GFAP具有87％的相似性。將它與GFAP所測得的N-氨基酸序列蛋白匹配發(fā)現(xiàn)，其N端第632個氨基酸是和GFAP的第1個氨基酸開始匹配的，這個蛋白的功能是未知的。Serine proteinase全序列長379氨基酸，發(fā)現(xiàn)它和GFAP具有82％(9/11)的相似性，其N端的第92個氨基酸是和GFAP的第1個氨基酸開始匹配的。Hypothetical protein TTHERM_00637630全序列長1076氨基酸，發(fā)現(xiàn)它和GFAP具有87％(7/8)的相似性。將它與GFAP蛋白匹配發(fā)現(xiàn)，其N端第206個氨基酸是和GFAP第4個氨基酸開始匹配的，這個蛋白的功能都是未知的。
表3GFAP的氨基酸序列同源性分析Table3 Analysis of amino acid sequence homology of GFAP

1.4討論灰樹花屬多孔菌科的一種食用菌，其主要的生物活性物質(zhì)為多糖，其次為蛋白質(zhì)。據(jù)中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所檢測，灰樹花干品含蛋白質(zhì)31.5％，碳水化合物49.69％，多糖28.5％。蛋白質(zhì)是灰樹花的主要成分之一，但目前對其中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的研究還比較少。陳寧從灰樹花中分離純化出一種抑制TMV侵染的新蛋白質(zhì)GFPP。GFPP含有兩個亞基，其分子量分別為34kDa、40kDa。GFPP是一種酸性的熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)，它可以耐受80℃高溫。GFPP的40kDa蛋白的N端氨基酸測序表明，其為一個新的氨基酸序列[71]，這是首次從灰樹花中分離到抗病毒蛋白。這個蛋白具有抗植物病毒的活性，而它是否具有抗醫(yī)學(xué)病毒作用還未見報道。我們利用皰疹病毒感染細(xì)胞模型從灰樹花中分離到這種抗病毒蛋白質(zhì)GFAP，分子量為29.5kDa，是單亞基蛋白質(zhì)。其N末端的11個氨基酸序列與Serine proteianse、hypothetical protein等具有較高的相似性。
近年來隨著生物質(zhì)譜技術(shù)，如MALDI-TOF等質(zhì)譜軟電離技術(shù)的發(fā)展，PMF結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索的方法鑒定蛋白質(zhì)是目前較為常用的鑒定方法。由于蛋白質(zhì)的氨基酸序列各不相同，被酶切位點專一的蛋白酶水解后所得的肽混合物具有特征性，稱為指紋譜。蛋白的基團(tuán)越大，質(zhì)譜檢測的準(zhǔn)確率越低。因此，在質(zhì)譜檢測之前，須將蛋白消化成小分子的多肽，以提高質(zhì)譜檢測的準(zhǔn)確率。一般而言，6-20個氨基酸的多肽最適合質(zhì)譜儀的檢測?，F(xiàn)今最常用的酶為胰蛋白酶，它于蛋白的賴氨酸和精氨酸處將其切斷。因此，同一種蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后，會產(chǎn)生相同的多肽。應(yīng)用MALDI-TOF測定肽混合物不需分離即可直接分析，譜峰簡單，每個譜峰代表一種肽段，分析速度快，靈敏度高。本研究利用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)，建立了PMF鑒定GFAP的方法。并用MALDI-TOF測定了GFAP的分子量，實現(xiàn)了對GFAP的初步鑒定。
凝膠電泳能夠用來估計蛋白質(zhì)的分子量，盡管在最佳條件下時誤差為1-10％，但凝膠電泳依然是一種對蛋白分子量進(jìn)行估計的高通量的方法?，F(xiàn)在，通過質(zhì)譜技術(shù)如MALDI-TOF可以獲得更加精確的分子質(zhì)量。MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)是目前蛋白質(zhì)鑒定中精確測定測定分子量的手段，特別適合對混合蛋白多肽類物質(zhì)的相對分子質(zhì)量的測定[77]。然而，質(zhì)譜儀是昂貴的，并非每一個實驗室都可以擁有，而且樣品需要的純化，因為這些方法通常不能耐受在生物學(xué)實驗室廣泛使用的含鹽的緩沖液。質(zhì)譜測定對樣品的含鹽量有著嚴(yán)格的要求，若含鹽量過高將無法檢測到樣品峰。樣品在測定前有必要進(jìn)行透析完全去除鹽分。本研究使用凝膠電泳和MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)分析GFAP的分子量，其分子量約為29.5kD。兩種方法鑒定GFAP的分子量基本上是一致的。
1.5小結(jié)通過硫酸銨分級沉淀、陰離子交換柱層析，我們從灰樹花中分離到了一種抗病毒的蛋白質(zhì)。經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示為單一條帶，其分子質(zhì)量為29.5kDa。對GFAP進(jìn)行了N端氨基酸序列測定，測定的11個氨基酸序列為VRTQDNAPNGLN。經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，其N末端的11個氨基酸序列與Serine proteianse、hypothetical protein等具有較高的相似性。
實施例5GFAP體外抗乙型肝炎病毒作用1.1實驗材料1.1.1細(xì)胞株細(xì)胞株2.2.15是將HBV DNA克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞(HepG2)獲得的，由美國Mount Sinai醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建，解放軍第302醫(yī)院藥理研究室引進(jìn)后自行傳代培養(yǎng)。該細(xì)胞系能轉(zhuǎn)錄、翻譯HBV基因，并產(chǎn)生HBsAg、HBeAg和Dane顆粒。
1.1.2主要試劑和耗材灰樹花購自浙江方格藥業(yè)有限公司；干擾素α-2b(IFN)為天津華立達(dá)生物工程公司生產(chǎn)的注射用水劑(批號SA050101)。噻唑鹽(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)為Sigma產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基、胰酶、谷氨酰胺、胎牛血清系美國Gibco公司產(chǎn)品。由京科化學(xué)試劑公司進(jìn)口分裝。青霉素、鏈霉素系華北制藥廠產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。DMEM生長液含胎牛血清10％、谷氨酰胺2％、G418380.0μg/ml及青霉素、鏈霉素各100IU/ml，用NaHCO3溶液調(diào)pH值至7.2。DMEM維持液含2％胎牛血清。細(xì)胞消化液含0.25％胰酶，用Hanks’液配制。MTT染色液濃度為5mg/ml，用PBS溶液配制。培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板為美國Corning公司產(chǎn)品；微孔濾膜為Millipore公司產(chǎn)品。
HBeAg、HBsAg固相放射免疫檢測試劑盒，購自中國原子能研究所。HBV DNA熒光定量PCR檢測試劑盒，購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。
1.1.3主要實驗儀器二氧化碳孵箱(日本，SANYO公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(奧地利，TECAN公司)；ABI Prism7000型熒光定量PCR儀(美國，ABI公司)；倒置顯微鏡BX-41型(日本，Olympus公司)；電子分析天平AE-240(梅特勒-托利多公司)；CG1200γ放射免疫計數(shù)儀(中國科技大學(xué)中佳光電儀器公司)；1.2實驗方法1.2.1GFAP的提取工藝及配制見實施例1GFAP溶液的配制實驗時稱取一定量的GFAP，用滅菌的PBS或DMEM維持液溶解，配成濃度為8.0mg/ml的溶液，使用0.22μm濾膜過濾除菌后備用。
1.2.22.2.15細(xì)胞的培養(yǎng)在長滿2.2.15細(xì)胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)加適量的0.25％胰酶，37℃消化3分鐘，棄去胰酶，加適量生長液吹打成均勻的細(xì)胞懸液，1∶3傳代，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，配制成5×105個/ml細(xì)胞懸液后接種培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，96孔板每孔0.1ml，24孔板每孔1ml。37℃、5％CO2培養(yǎng)，細(xì)胞長至單層后可用于實驗。
1.2.3GFAP對2.2.15細(xì)胞的毒性實驗1.2.3.1細(xì)胞病變法(CPE法)將GFAP用培養(yǎng)液以2倍稀釋至4.00、2.00、1.00、0.50、0.25mg/ml，加入到96孔板細(xì)胞孔中，每個濃度6個復(fù)孔，第4天更換含有相同GFAP濃度的培養(yǎng)液，設(shè)不加GFAP的細(xì)胞對照。將IFN用培養(yǎng)液配成濃度為102400.0IU/ml的溶液，以2倍稀釋至不同濃度，加入到96孔細(xì)胞孔中，實驗方法同上。每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，細(xì)胞完全病變?yōu)?；75％為3；50％為2；25％為1；無病變?yōu)?。計算每個濃度GFAP和IFN對2.2.15細(xì)胞的破壞率。
1.2.3.2MTT法藥物與細(xì)胞作用第8天棄去上清，余下細(xì)胞加入含有5mg/mL MTT的培養(yǎng)液，37℃、5％CO2孵育4小時，可見黃黑色甲瓚顆粒。棄MTT液，加入100％DMSO，每孔0.1ml，用酶聯(lián)免疫檢測儀于492nm處測定吸光度值。按Reed-Meuench法計算各藥物的半數(shù)有毒濃度。
1.2.4GFAP對2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg、HBsAg和HBV DNA的影響將2.2.15細(xì)胞3×105個/ml接種24孔板，每孔1ml，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)。根據(jù)藥物毒性實驗結(jié)果，以GFAP的最大無毒濃度為起始濃度，以2倍稀釋至1.00、0.50、0.25、0.13mg/ml，加入24孔板中細(xì)胞中。第4天換用含有相同GFAP濃度的培養(yǎng)液。GFAP的每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)不加藥的病毒對照。GFAP與細(xì)胞作用第8天時收獲細(xì)胞上清液，馬上進(jìn)行檢測或-20℃冷凍保存。
1.2.5HBeAg和HBsAg測定采用固相放射免疫法檢測HBeAg、HBsAg，具體操作按放射免疫檢測試劑盒說明書進(jìn)行，用放射免疫計數(shù)儀測定每孔cpm值，3個平行孔取均值后計算GFAP對HBeAg和HBsAg的抑制率。
1.2.6HBV DNA含量的測定用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司研制的HBV DNA熒光定量PCR試劑盒檢測HBV DNA含量，檢測方法按試劑盒說明書進(jìn)行，使用ABI Prism熒光定量PCR擴(kuò)增儀測定HBV DNA含量。具體檢測方法如下1.2.6.1HBV-DNA提取取待測細(xì)胞上清液及試劑盒中的對照品各100μl，分別加到0.5ml離心管中；然后加入100μl DNA提取液1，振蕩混勻，13000rpm離心10min；棄上清液(離心時注意固定離心管方向、盡可能吸棄上清液且不碰沉淀)；再加入25μl DNA提取液2，振蕩混勻，2000rpm離心10s，100℃沸水浴10min，13000rpm離心10min，棄去沉淀，保留上清液備用。
1.2.6.2加樣分別取樣本上清液、陰性對照、強(qiáng)陽性對照及陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品2μl加入到PCR管中，然后每個PCR管中分別加入一定量的RT-PCR反應(yīng)液和Taq酶。蓋緊管蓋后，充分混合均勻。
1.2.6.3RT-PCR反應(yīng)及結(jié)果分析將加樣后的PCR管放入熒光PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。擴(kuò)增條件92℃1min預(yù)變性，然后按92℃5s、60℃30s，40個循環(huán)。儀器自動以陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品拷貝濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以實際測得的Cr值為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，儀器軟件自動分析出定量結(jié)果。采用計算對數(shù)平均值的方法來計算HBV DNA平均拷貝數(shù)，遇有陰性結(jié)果，不參加平均值的統(tǒng)計。3個平行樣品取均值，然后計算GFAP對HBV DNA抑制率。
1.2.7GFAP抗乙肝病毒的效果計算根據(jù)藥物對HBeAg、HBsAg分泌和HBV DNA的抑制率，計算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)和治療指數(shù)(TI)1.2.7.1抑制抗原百分率＝[(細(xì)胞對照cpm-給藥組cpm)/細(xì)胞對照cpm]×100％；1.2.7.2抑制HBV DNA百分率＝[(細(xì)胞對照DNA拷貝量-給藥組DNA拷貝量)/細(xì)胞對照DNA拷貝量]×100％；1.2.7.3藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)＝Antilog[logB+C×(50-B的抑制百分?jǐn)?shù))/(A的抑制百分?jǐn)?shù)-B的抑制百分?jǐn)?shù))]，A＝＞50％藥物濃度B＝＜50％藥物濃度，C＝log稀釋倍數(shù)；1.2.7.4治療指數(shù)TI＝TC50/IC50。TI可以用于評價藥物臨床應(yīng)用前景。TI＞2為有效低毒，1＜TI＜2為低效有毒，TI＜1為有毒性作用。
1.2.8GFAP對HBsAg與抗HBs抗體結(jié)合的抑制實驗將不同濃度的GFAP與等體積純化的HBsAg混合作為待測樣品，設(shè)陰性(無純化HBsAg)和陽性(無GFAP)對照，用固相放免試劑盒測定樣品中HBsAg含量，計算GFAP對HBsAg與抗HBs抗體結(jié)合的抑制率。GFAP抑制它們結(jié)合的百分率＝[(陽性組cpm-實驗組cpm)/(陽性組cpm-陰性組cpm)]×100％。
1.2.9統(tǒng)計學(xué)處理各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件，以方差分析法計算各實驗組的HBeAg、HBsAg、HBV DNA和對照組間的差別。
1.3.實驗結(jié)果1.3.1GFAP對2.2.15細(xì)胞的毒性每天觀察細(xì)胞病變，在接種2.2.15細(xì)胞第6天，8.0mg/ml GFAP處理的細(xì)胞開始明顯病變。病變細(xì)胞形態(tài)略有腫脹，脫落。加入MTT液和DMSO溶解甲瓚顆粒后，測OD492值，并分別計算GFAP對2.2.15細(xì)胞的TC50和TC0(見圖3)。使用CPE法和MTT法測定GFAP對2.2.15細(xì)胞的TC50分別為5.56mg/ml和5.07mg/ml，平均值為5.37±1.59mg/ml，TC0為2.00±0.90mg/ml。使用MTT法測定IFN對2.2.15細(xì)胞的TC50為83753.5IU/ml。
1.3.2GFAP對2.2.15細(xì)胞HBeAg分泌的抑制作用采用2.2.15細(xì)胞在24孔板培養(yǎng)系統(tǒng)中實驗證明GFAP對HBeAg表達(dá)有明顯的抑制作用(見圖4)。GFAP 2.00、1.00、0.50、0.25和0.13mg/ml 5個劑量組分別加入2.2.15細(xì)胞中培養(yǎng)，第8天對細(xì)胞上清液HBeAg的抑制率(inhibition)分別為55.8％、55.3％、44.1％、23.5％和22.7％。GFAP對HBeAg的抑制作用與劑量呈依賴性。GFAP抑制HBeAg的IC50和TI分別為0.77mg/ml和7.0。12800.0IU/ml IFN對HBeAg的抑制率為26.3％。因為IFN最大無毒濃度對HBeAg的抑制率沒有超過50％，故不能統(tǒng)計IFN對HBeAg的IC50。GFAP對HBeAg的抑制率與IFN相比差異非常顯著(P＜0.01)，這表明GFAP對HBeAg的抑制作用明顯強(qiáng)于IFN。
1.3.3GFAP對2.2.15細(xì)胞HBsAg分泌的抑制作用采用2.2.15細(xì)胞系在24孔板培養(yǎng)系統(tǒng)實驗證明GFAP對HBsAg表達(dá)有一定的抑制作用(表4)。GFAP 2.00、1.00、0.50、0.25和0.13mg/ml 5個劑量組加入到2.2.15細(xì)胞中，第8天對細(xì)胞上清液HBsAg的抑制率分別為28.1％、27.4％、27.2％、22.8％和15.9％。不能統(tǒng)計GFAP和IFN對HBsAg的IC50。經(jīng)方差分析，0.13mg/ml GFAP對HBsAg的抑制作用與12800.0IU/ml IFN統(tǒng)計學(xué)上差異無顯著性，作用效果相當(dāng)。
表4GFAP對2.2.15細(xì)胞HBsAg表達(dá)的抑制作用(n＝3，x±s)Tab.4 Inhibitory effect of GFAP on the expression of HBsAg in 2.2.15

1.3.4GFAP對2.2.15細(xì)胞中HBV DNA的抑制作用使用用熒光定量PCR檢測試劑盒檢測各藥物處理組和細(xì)胞對照孔上清液中HBV DNA含量。GFAP 2.00、1.00、0.50、0.25和0.13mg/ml 5劑量組處理2.2.15細(xì)胞，第8天對HBV DNA的抑制率(inhibition)分別為73.8％、66.4％、45.0％、20.0％和3.3％(圖5)。GFAP對HBV DNA的抑制作用與劑量呈依賴性。GFAP抑制HBV DNA的IC50和TI分別為0.59mg/ml和9.1。IFN 3200、1600和800IU/ml各劑量組對HBV DNA的抑制率分別為93.3％、56.5％和23.0％。IFN抑制HBV DNA的IC50和TI分別為1398.7IU/ml和59.9。
1.3.5GFAP對HBsAg與抗HBs抗體結(jié)合的抑制作用用GFAP與HBsAg混合物作為待測樣品，用放射免疫法測定樣品中HBsAg含量，借此觀察GFAP對HBsAg與抗HBs抗體結(jié)合的抑制作用。2.00mg/ml GFAP對HBsAg與抗HBs抗體結(jié)合的抑制率(inhibition)為48.8％(圖6)。結(jié)果表明GFAP對HBsAg與抗HBs抗體結(jié)合有一定的抑制作用。GFAP對它們結(jié)合的抑制作用，有助于阻斷HBV吸附宿主細(xì)胞。
1.4討論轉(zhuǎn)染細(xì)胞株2.2.15是美國Sells等利用電穿孔基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將HBV DNA導(dǎo)入人肝癌細(xì)胞株HepG2中獲得的，該細(xì)胞株能夠長期、穩(wěn)定地表達(dá)HBV的全部病毒標(biāo)志，包括HBV DNA、HBsAg、HBeAg、HBcAg、DNA多聚酶，并從轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的培養(yǎng)上清中及細(xì)胞裂解物中證實了HBV Dane顆粒的存在(圖1-5)。近十余年來已成功應(yīng)用于抗HBV藥物的篩選，是目前各實驗室廣泛應(yīng)用于篩選和評價體外抗HBV藥物較好的細(xì)胞模型，被中國衛(wèi)生部收載于治療肝炎的中藥新藥研究指南[26]。因此，我們選用2.2.15細(xì)胞株作為乙肝病毒的模型。
HBV持續(xù)感染會導(dǎo)致肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌變等肝臟疾病，是嚴(yán)重危害人類健康的疾病。目前認(rèn)為，乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，除與病毒的直接感染有關(guān)外，還與機(jī)體的免疫應(yīng)答失調(diào)有關(guān)。由于有乙肝病毒自身免疫的參與，現(xiàn)有的治療乙肝的藥物療效均不十分滿意，因此，抗乙型肝炎天然藥物的篩選與研究被重新高度重視，如珍珠草、苦參堿、香菇多糖和豬苓多糖等。
某些真菌(如香菇、靈芝等)具有很高的藥用價值，并已開發(fā)成為藥物?；覙浠ň哂锌鼓[瘤、降低高血壓、治療肝病和改善高血脂等多種藥理作用[11-14]。1984年Nanba從灰樹花的子實體和菌絲體中提取到GFAP。GFAP主要成分是β-葡聚糖，含有少量的蛋白質(zhì)。與其他蘑菇類抗癌藥相比，灰樹花D組分具有口服有效、抗癌效果好等優(yōu)點。1998年美國藥物管理局批準(zhǔn)其用于治療第三、四期乳腺癌和前列腺癌。
Kruining等報道重組IFN2α2500U/ml對HBV DNA的抑制率＜20％，而不抑制HBsAg及HBeAg的表達(dá)，但Hagelstein等[28]報道2.2.15細(xì)胞在20％～90％融合狀態(tài)下，IFN2α可降低HBsAg 60％。我們測定IFNα-2b抑制HBV DNA的IC50為1398.7IU/ml，TC50為83753.2IU/ml。IFN 12800.0IU/ml對HBeAg和HBsAg的抑制率分別為26.3％和9.2％。IFN2α對HBsAg及HBeAg是否有抑制活性，各家的結(jié)果矛盾，這可能與各實驗室實驗條件不同有關(guān)。
本研究從灰樹花中提取分離到了GFAP，其多糖含量約為65％，蛋白含量約為27％。采用2.2.15細(xì)胞抑制實驗評價了GFAP抗病毒活性。通過本研究發(fā)現(xiàn)它對2.2.15細(xì)胞的半數(shù)有毒濃度平均為5.37±1.59mg/ml，最大無毒濃度為2.00mg/ml。它抑制HBeAg和HBV DNA的IC50分別為0.77mg/ml和0.59mg/ml，治療指數(shù)分別為7.0和9.1；2.00mg/mlGFAP對HBsAg的抑制率為28.1％。結(jié)果表明GFAP在2.2.15細(xì)胞中對HBeAg、HBsAg及HBV DNA有抑制作用，說明GFAP在體外有明顯地抗乙肝病毒作用。
以前研究表明GFAP抑制肝臟線粒體膜的氧化損傷，防止和延緩肝纖維化，降低肝炎或肝損傷而引起的血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶濃度，通過保肝降酶作用起到間接抗乙型肝炎病毒。我們研究發(fā)現(xiàn)，GFAP能夠直接抗乙型肝炎病毒[30]。因此，我們認(rèn)為灰樹花這一有效提取成分有可能成為新的抗乙肝藥物，對乙型肝炎的治療具有重大的意義。但是，由于利用細(xì)胞株進(jìn)行藥物體外篩選存在著一定的局限性，結(jié)果受多種因素影響。因此，實驗結(jié)果有待進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實驗來確定評價。
1.5小結(jié)GFAP對2.2.15細(xì)胞的TC50為5.37mg/ml，TC0為2.00mg/ml；其抑制HBeAg和HBV DNA的IC50分別為0.77mg/ml和0.59mg/ml，其TI分別為7.0和9.1；GFAP 2.00mg/ml對HBsAg的抑制率為28.1％。IFNα-2b抑制HBV DNA的IC50和TI分別為1398.7IU/ml和59.9；12800.0IU/ml IFNα-2b對HBeAg和HBsAg的抑制率分別為26.3％和19.2％。GFAP對HBeAg的抑制作用與IFN相比差異非常顯著(P＜0.01)；1.00mg/ml GFAP對HBV DNA的抑制率與1600IU/ml IFN的抑制率差異沒有顯著性(P＞0.05)。GFAP對HBeAg的抑制作用比IFN明顯，而對HBV DNA的抑制作用與IFN相當(dāng)。我們上述研究結(jié)果，證實了GFAP在體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中抗乙型肝炎病毒作用，迄今國內(nèi)外文獻(xiàn)尚無報道。
實施例6將本發(fā)明的一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)按常規(guī)方法制成病人可接受的劑型，用于單純皰疹病毒1型、乙型肝炎病毒性疾病的治療。
權(quán)利要求
1.一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)，其特征是用下述方法提取(1)將灰樹花子實體粉末按質(zhì)量比1∶1-15的比例加入70-90℃的水浸泡5-15小時后離心；(2)上清液加入1-3體積倍的體積百分比濃度為60％-90％的乙醇水溶液，在2-6℃，放置8-16小時后離心；(3)沉淀加入1-3質(zhì)量倍的乙酸，在2-6℃，放置1-3小時后離心；(4)沉淀加入1-3質(zhì)量倍的質(zhì)量百分比濃度為4％-10％的氫氧化鈉水溶液，2-6℃，放置1-3小時后離心；(5)上清液加硫酸銨至飽和度為40％，在2-6℃，放置8-16小時后離心；(6)沉淀加入1-3質(zhì)量倍的重蒸餾水，透析8-16小時；(7)沉淀經(jīng)陰離子交換柱分離，用0.1mol/L-0.3mol/L的氯化鈉水溶液洗脫得到灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)，其特征是所述提取方法是(1)將灰樹花子實體粉末按質(zhì)量比1∶3的比例加入80℃的水浸泡10小時后離心；(2)上清液加入2體積倍的體積百分比濃度為75％的乙醇水溶液，在4℃，放置12小時后離心；(3)沉淀加入2質(zhì)量倍的乙酸，在4℃，放置2小時后離心；(4)沉淀加入2質(zhì)量倍的質(zhì)量百分比濃度為6％的氫氧化鈉水溶液，4℃，放置2小時后離心；(5)上清液加硫酸銨至飽和度為40％，在4℃，放置12小時后離心；(6)沉淀加入2質(zhì)量倍的重蒸餾水，透析12小時；(7)沉淀經(jīng)陰離子交換柱分離，用0.2mol/L的氯化鈉水溶液洗脫得到灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)。
3.一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)的提取方法，其特征是包括如下步驟(1)將灰樹花子實體粉末按質(zhì)量比1∶1-15的比例加入70-90℃的水浸泡5-15小時后離心；(2)上清液加入1-3體積倍的體積百分比濃度為60％-90％的乙醇水溶液，在2-6℃，放置8-16小時后離心；(3)沉淀加入1-3質(zhì)量倍的乙酸，在2-6℃，放置1-3小時后離心；(4)沉淀加入1-3質(zhì)量倍的質(zhì)量百分比濃度為4％-10％的氫氧化鈉水溶液，2-6℃，放置1-3小時后離心；(5)上清液加硫酸銨至飽和度為40％，在2-6℃，放置8-16小時后離心；(6)沉淀加入1-3質(zhì)量倍的重蒸餾水，透析8-16小時；(7)沉淀經(jīng)陰離子交換柱分離，用0.1mol/L-0.3mol/L的氯化鈉水溶液洗脫得到灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)的提取方法，其特征是所述步驟是(1)將灰樹花子實體粉末按質(zhì)量比1∶3的比例加入80℃的水浸泡10小時后離心；(2)上清液加入2體積倍的體積百分比濃度為75％的乙醇水溶液，在4℃，放置12小時后離心；(3)沉淀加入2質(zhì)量倍的乙酸，在4℃，放置2小時后離心；(4)沉淀加入2質(zhì)量倍的質(zhì)量百分比濃度為6％的氫氧化鈉水溶液，4℃，放置2小時后離心；(5)上清液加硫酸銨至飽和度為40％，在4℃，放置12小時后離心；(6)沉淀加入2質(zhì)量倍的重蒸餾水，透析12小時；(7)沉淀經(jīng)陰離子交換柱分離，用0.2mol/L的氯化鈉水溶液洗脫得到灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求1或2所述的一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)，其特征是在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)、提取方法及用途，提取方法是(1)將灰樹花子實體粉末加入70－90℃的水浸泡后離心；(2)上清液加入乙醇水溶液，在2－6℃，放置8－16小時后離心；(3)沉淀加入乙酸，在2－6℃，放置1－3小時后離心；(4)沉淀加入氫氧化鈉水溶液，2－6℃，放置1－3小時后離心；(5)上清液加硫酸銨至飽和度為40％，在2－6℃，放置8－16小時后離心；(6)沉淀加入重蒸餾水，透析；(7)沉淀經(jīng)陰離子交換柱分離，用氯化鈉水溶液洗脫得到灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)。本發(fā)明的一種灰樹花抗病毒蛋白質(zhì)的提取步驟簡單，提取成本較低，原料易得，實驗證明對病毒性感染有一定的療效。
文檔編號C07K1/14GK1872875SQ200610014348
公開日2006年12月6日 申請日期2006年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月14日
發(fā)明者李君文, 古長慶, 王新為, 金敏, 諶志強(qiáng) 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所