專利名稱：檢測磺胺嘧啶殘留的免疫膠體金試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸藥殘留的免疫化學速測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種借助膠體金標記顯色的免疫層析反應(yīng)，用以快速檢測磺胺嘧啶殘留的免疫膠體金試紙條及其制備方法。
背景技術(shù)：
長期以來磺胺嘧啶(SD)一直被作為一種優(yōu)良的抗菌藥物應(yīng)用于臨床和作為獸用藥物。近年研究發(fā)現(xiàn)，磺胺嘧啶具有諸多副作用，如由其及其乙酰衍生物在尿液中的結(jié)晶可引起腎損傷，也可引起肝損傷、末端神經(jīng)炎及一種類似結(jié)節(jié)性周圍動脈炎的病癥，以及藥物過敏性皮炎、白細胞減少、溶血性貧血和藥物熱等。另外，長期應(yīng)用時許多細菌也可對其產(chǎn)生抗藥性。因此，目前磺胺嘧啶已被抗菌作用更強、副作用更小的抗菌素類藥物所替代，但其作為獸藥應(yīng)用仍十分普遍。由于磺胺嘧啶在畜禽生產(chǎn)中的不合理使用，致使磺胺嘧啶在動物源食品中殘留并通過食物鏈對人類健康造成潛在的危害?；前粪奏埩粢岩鹆藝鴥?nèi)外的高度重視。因此我國以及美國、歐盟等國家規(guī)定了動物源性食品中磺胺類藥物殘留量必須低于0.1mg/kg，其中包括磺胺嘧啶。為杜絕磺胺嘧啶超標的畜產(chǎn)品進入市場，必須加強對磺胺嘧啶殘留的監(jiān)測。
目前對磺胺嘧啶常用的檢測方法主要有兩種一種是色譜分析，如高效液相色譜法(HPLC)，一種為免疫學方法，如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。
色譜技術(shù)對磺胺嘧啶檢測是非常有效、準確和敏感的，但也存在如下缺點(1)待檢測樣品預處理程序繁瑣費時(2)需要經(jīng)過專業(yè)培訓的技術(shù)人員操作，操作人員要有豐富的相關(guān)經(jīng)驗，操作人員必須了解影響色譜分析的各種干擾因素，了解所使用的預處理方法的優(yōu)缺點，才能獲得可靠的分析結(jié)果；(3)需要昂貴的儀器設(shè)備輔助，難以在中小城市及中小企業(yè)中普及。(4)儀器保養(yǎng)的要求高，保養(yǎng)的好壞直接影響分析結(jié)果的準確性；(5)檢測費用高。
酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是以競爭性酶聯(lián)反應(yīng)為檢測原理，以磺胺嘧啶抗體包被酶標板，檢測時將被檢樣品和酶標結(jié)合物同時加入酶標板，反應(yīng)后通過顯色測OD值來判定結(jié)果。存在的缺點是(1)需要專門的儀器設(shè)備如酶標儀來配合使用，不利于在基層單位進行推廣使用；(2)檢測操作人員需要經(jīng)過專業(yè)培訓；(3)操作過程相對比較復雜，檢測所需時間比較長，全程需要2h-4h；(4)檢測所需費用較高，不能實現(xiàn)單份檢測。
膠體金免疫層析(gold-immunochromatography assay GICA)是20世紀80年代發(fā)展起來的一項新的免疫分析方式，是應(yīng)用膠體金標記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標記技術(shù)。它具有簡便，快速，特異性強，靈敏度高，費用低的優(yōu)點。依據(jù)膠體金免疫層析技術(shù)，在國內(nèi)外無論人醫(yī)應(yīng)用方面，還是獸醫(yī)應(yīng)用方面，都已經(jīng)研制出了多種膠體金免疫層析快速檢測試紙條。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種特異性強、靈敏度高，操作簡便，檢測快速、準確的專門用于檢測磺胺嘧啶殘留的試紙條及其制備方法。
本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖見圖1所示。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的為了實現(xiàn)本發(fā)明，申請人制備了一種能分泌抗磺胺嘧啶的單克隆抗體雜交瘤細胞系BDRXN，其保藏號為CCTCC-C200522。
一種適用于檢測磺胺嘧啶殘留的試紙條，它包括樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸水墊(4)和PVC背襯(7)，其具體結(jié)構(gòu)是在PVC背襯(7)按順序依次粘附有樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸水墊(4)；所述的結(jié)合墊(2)上包被有所述的抗磺胺嘧啶單克隆抗體-膠體金標記物；所述的硝酸纖維素膜(3)上分別包被有磺胺嘧啶-載體蛋白(牛血清白蛋白)偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線(5)和兔抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線(6)。
一種適用于檢測磺胺嘧啶殘留的免疫膠體金試紙條的制備方法，其步驟包括1)將磺胺嘧啶與載體蛋白偶聯(lián)，形成磺胺嘧啶-載體蛋白偶聯(lián)物；2)用磺胺嘧啶-載體蛋白(人血清白蛋白)偶聯(lián)物免疫小鼠，得到分泌抗磺胺嘧啶的單克隆抗體的細胞系BDRXN，其保藏號為CCTCC-C200522；3)提取小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗體；4)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；5)將步驟2)制備的抗磺胺嘧啶單克隆抗體加入步驟4)制備的膠體金中，得到抗磺胺嘧啶單克隆抗體-膠體金標記物；6)將抗磺胺嘧啶單克隆抗體-膠體金標記物包被在結(jié)合墊(2)上；7)將磺胺嘧啶-載體蛋白(牛血清白蛋白)偶聯(lián)物包被在硝酸纖維素膜(3)上構(gòu)成檢測線(5)；并將兔抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜(3)上構(gòu)成質(zhì)控線(6)；8)在所述的PVC背襯(7)上按順序依次粘附所述的樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸水墊(4)，得到所述的檢測磺胺嘧啶殘留的免疫膠體金試紙條。
本發(fā)明選用磺胺嘧啶-載體蛋白偶聯(lián)物作為檢測線，抗磺胺嘧啶特異性單克隆抗體為膠體金標記的抗體，利用競爭法來檢測待測樣品中是否含有磺胺嘧啶。通過待檢樣品中的磺胺嘧啶與包被于硝酸纖維膜上的磺胺嘧啶-載體蛋白偶聯(lián)物共同競爭抗磺胺嘧啶單克隆抗體-膠體金標記物，在檢測線處出現(xiàn)顏色深淺不同的紅色條帶或不出現(xiàn)條帶，質(zhì)控線處出現(xiàn)紅色條帶。若待測樣品試紙條檢測線顏色明顯淺于陰性標準品試紙條檢測線顏色，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶則判斷為陽性樣品，即待測樣品中磺胺嘧啶的濃度在20ppb-80ppb范圍內(nèi)；若待測樣品試紙條檢測線無顏色出現(xiàn)，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶也判斷為陽性樣品，即待測樣品中磺胺嘧啶的濃度高于80ppb；若待測樣品試紙條檢測線顏色等于或深于陰性標準品試紙條檢測線顏色，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶則判斷為陰性樣品，即磺胺嘧啶的濃度小于20ppb；如果質(zhì)控線上沒有紅色條帶出現(xiàn)，則該試紙條無效。
本檢測試紙條(結(jié)構(gòu)圖如圖2所示)由樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸水墊(4)按圖示的順序依次粘附在PVC背襯(7)上組裝而成的。結(jié)合墊上包被有本發(fā)明制備的抗磺胺嘧啶單克隆抗體-膠體金標記物，硝酸纖維素膜上包被有檢測線(5)和質(zhì)控線(6)，其中檢測線為本發(fā)明制備的磺胺嘧啶-載體蛋白(牛血清白蛋白)偶聯(lián)物，質(zhì)控線為本發(fā)明制備的兔抗鼠IgG。所述樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、PVC背襯均購自Millipore公司。所述的鼠源單抗亞型鑒定試劑盒購自ROCKLAND公司。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點1、本發(fā)明的檢測磺胺嘧啶的免疫膠體金試紙條，具有特異性強，靈敏度高，檢測時間短(20分鐘)等優(yōu)點。
2、本發(fā)明的檢測試紙條不需要任何特殊儀器、設(shè)備，檢測成本低。
3、本發(fā)明的檢測試紙條操作簡便，不需由專業(yè)人員操作。
4、本發(fā)明的檢測試紙條儲存方便，對溫度要求不高，在4～8℃下有效保存期可達一年；在室溫下可保存六個月。


圖1本發(fā)明的總體技術(shù)路線2本發(fā)明檢測試紙條的組裝示意中1為樣品墊，2為結(jié)合墊，3為硝酸纖維素膜，4為吸收墊，5為檢測線，6為質(zhì)控線，7為PVC背襯圖3本發(fā)明檢測試紙條結(jié)果判定示意中A為陰性標準品結(jié)果，B為陰性樣品結(jié)果，C、D為陽性樣品結(jié)果，E、F為試紙條失效。
具體實施例方式
實施例1(制備實施例)檢測磺胺嘧啶的免疫膠體金試紙條的制備方法1、磺胺嘧啶-載體蛋白偶聯(lián)物的制備合成磺胺嘧啶-載體蛋白偶聯(lián)物(1)準確稱取40mg磺胺嘧啶溶于2ml 1MNaOH和1.1ml 1％NaNO2的混合溶液中，配制成磺胺嘧啶溶液。
(2)冰水浴且磁力攪拌下，將磺胺嘧啶溶液逐滴加到2.4ml 1mol/l HCl中，進行重氮化(Itaru Y，KohjiI.Enzyme immunoassay for clenbuterol，an β2-adrnergicstimulant[J].Journal of immunoassay，1982，3(2)155-171)反應(yīng)，加完后繼續(xù)反應(yīng)5min。
(3)磁力攪拌下，將重氮化產(chǎn)物分別逐滴加到人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)溶液中，用1mol/l NaOH調(diào)pH值到9.5，4℃緩慢攪拌過夜，得到三種連接產(chǎn)物，即磺胺嘧啶-HSA、磺胺嘧啶-BSA、磺胺嘧啶-OVA。
(4)將步驟(3)得到的連接產(chǎn)物磺胺嘧啶-HSA、磺胺嘧啶-BSA、磺胺嘧啶-OVA分別裝入透析袋，用0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液(配方NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，用蒸餾水定容至1000ml)透析三天，去除游離的磺胺嘧啶小分子后，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、抗磺胺嘧啶單克隆抗體的制備利用申請人所制備的磺胺嘧啶-人血清白蛋白(HSA)偶聯(lián)物免疫Balb/C小鼠(購自湖北省醫(yī)科院實驗動物中心)，免疫程序是取含磺胺嘧啶-人血清白蛋白(HSA)偶聯(lián)物100μg的溶液與等體積的弗氏完全佐劑(購自sigma公司)乳化，注射小鼠腹腔，以后每間隔十天加強一次，換用弗氏不完全佐劑乳化(購自sigma公司)。最后于融合前三天，(最好與上次免疫相隔4周以上)，腹腔強化免疫，抗原量加倍(200μg)，不加佐劑。融合時，取經(jīng)最后強化免疫的Balb/C小鼠一只，眼眶放血處死(收集血清，即為陽性血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。無菌取出小鼠脾臟，分離出脾細胞，與新鮮制備的SP2/0骨髓瘤細胞(SP2/0骨髓瘤細胞購自衛(wèi)生部武漢生物制品所)按1～2×107個SP2/0與108個免疫細胞(1∶10～1∶15)的比例于50ml離心管中混勻，1500rpm，離心10min。倒凈上清(可用滅菌的濾紙吸干)，輕輕敲擊管底，使細胞沉淀略加松動。將裝有細胞混合物的離心管放于37℃水浴中。然后在1min內(nèi)慢慢滴入預溫至37℃的50％聚乙二醇(PEG)0.8ml(購自sigma公司產(chǎn)品)，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌，繼續(xù)攪拌1min。然后慢慢加入37℃預溫的1640(購自sigma公司商品)基礎(chǔ)液(配方1640 10.4g，NaHCO32g，用蒸餾水用蒸餾水定容至1000ml，調(diào)pH至7.2)10ml。具體方法為第一分鐘逐滴滴入1ml。第二分鐘加1ml，第3～4分鐘加3ml，第5分鐘加其余的5ml，每次加時需緩慢加入，并不斷輕輕地攪拌。最后加入30ml 1640液，也需慢慢加入。800rpm離心5min，去上清，于37℃放置5～8min。用HAT(購自Sigma公司商品，其成分為100％含量)培養(yǎng)基懸浮，同時也用HAT培養(yǎng)基懸浮制備好的飼養(yǎng)脾細胞并與融合后的細胞混合，根據(jù)需要補加適量的HAT培養(yǎng)基(培養(yǎng)基的成分80ml 1640基礎(chǔ)液，20ml滅菌小牛血清，1ml 100％的HAT，1ml雙抗)，分種于96孔培養(yǎng)板中，約250μl/孔。一次融合可接種4～8塊96孔板。根據(jù)需要也可少種，一般按SP2/0的細胞數(shù)計算，每孔接種量約含104左右個SP2/0細胞。于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后第二天開始觀察有無污染，于第4天補加1滴HAT培養(yǎng)基，第8～10天吸去100μl培養(yǎng)基換HT(購自sigma公司)培養(yǎng)基100μl。待融合細胞集落長至培養(yǎng)孔1/4，培養(yǎng)基略變黃時，進行抗體檢測。采用磺胺嘧啶-卵清蛋白(OVA)作為篩選抗原，利用ELISA方法篩選出分泌抗磺胺嘧啶的陽性孔。對篩選出來的陽性孔立刻用有限稀釋法(參照薛慶善《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》科學出版社2001年版)進行克隆、篩選。經(jīng)過3～4次克隆，最終篩選出分泌抗磺胺嘧啶的單克隆雜交瘤細胞系，該細胞系編號為BDRXN，于2005年12月30日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號CCTCC-C200522。對該細胞系進行了染色體計數(shù)，結(jié)果顯示，SP2/0的染色體的平均數(shù)為70，脾細胞染色體為40條，而雜交瘤細胞的染色體數(shù)目在80～94之間。均高于兩親本細胞的染色體數(shù)目，說明融合細胞的確是SP2/0細胞與脾細胞的雜交產(chǎn)物，雜交瘤細胞的染色體數(shù)目明顯多于骨髓瘤細胞SP2/0的染色體。將該細胞系注射Balb/C小鼠腹腔，生產(chǎn)單克隆抗體。采用購自ROCKLAND公司的鼠源單抗亞型鑒定試劑盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)對本發(fā)明所得到的單克隆抗體進行亞型鑒定，結(jié)果為小鼠IgG2b亞類。
3、抗磺胺嘧啶單克隆抗體的純化參照朱立平等，《免疫學常用實驗方法》，人民軍醫(yī)出版社2000版教導的方法取所得的小鼠腹水5ml與適量的二氧化硅混合，加入等體積的巴比妥緩沖液(配方氯化鈉85.00g，巴比妥5.75g，巴比妥鈉3.75g，疊氮鈉2.00g，用蒸餾水用蒸餾水定容至2000ml)，室溫振蕩1h后，室溫靜置30min，取上清于潔凈離心管中，4℃，3000rpm離心10min；取上清液8ml，加入16ml 0.06mol醋酸鈉緩沖液，用HCL調(diào)pH值至4.5，充分攪拌下緩緩加入辛酸132μl后，室溫攪拌30min，然后轉(zhuǎn)入4℃冰箱充分沉淀2h，4℃，15000rpm離心30min，得上清液22ml，加入2.2ml pH7.2、0.1M的磷酸緩沖液(PB)，用NaOH調(diào)pH值至7.6，攪拌下緩緩加入硫酸銨至終濃度為0.277g/ml，4℃冰箱充分沉淀2h后，4℃，12000rpm離心30min，棄上清，沉淀用5ml0.01MpH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，裝入透析袋，對5000ml0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液充分透析后，再對2000ml蒸餾水透析，最后對3000ml三蒸去離子水透析，將充分透析好的蛋白溶液用聚乙二醇-20000(PEG-20000)濃縮至3ml，然后4℃，12000rpm離心30min，棄沉淀，收集上清液，測得蛋白濃度為1.6mg/ml。經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠變性電泳(SDS-PAGE)鑒定為純化的單克隆抗體，純度大于95％。該單克隆抗體可用于制備免疫膠體金。
4、兔抗鼠IgG抗體的制備利用申請人所在的微生物與免疫實驗室提取的Balb/C小鼠IgG免疫健康家兔，制備高特異性、高效價的兔抗鼠IgG高免血清，對高免血清采用飽和硫酸銨沉淀法進行粗提，經(jīng)G-200過柱后得到高純度的兔抗鼠IgG抗體。利用該抗體作為質(zhì)控線。
5、抗磺胺嘧啶單克隆抗體-膠體金標記物的制備(1)膠體金的制備用雙蒸去離子水將1％氯金酸稀釋成0.01％，置磁力加熱攪拌器上攪拌煮沸，按每100ml 0.01％氯金酸加入2ml 1％檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈橙紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補足失水。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期一周。
(2)抗磺胺嘧啶單克隆抗體-膠體金標記物的制備磁力攪拌下，用0.1M碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至8.2，按1～2μg抗體/ml膠體金加入抗磺胺嘧啶單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻30min，加入10％BSA至終濃度為1％，靜置30min。12000rpm、4℃離心30min，棄上清，沉淀用0.02M pH9.0的硼酸鹽緩沖液(配方硼酸0.1237g，PEG-20000 1g，用三餾水定容至1000ml，調(diào)pH至9.0)洗滌兩次，用二十分之一初始膠體金體積的0.02M pH9.0的硼酸鹽緩沖液(配方硼酸0.1237g，PEG-20000 1g，用三餾水定容至1000ml，調(diào)pH至9.0)將沉淀重懸，置4℃?zhèn)溆茫行?0天。
6、結(jié)合墊的包被將結(jié)合墊浸泡于0.01M pH7.4磷酸緩沖液(配方及制備20g BSA，25g蔗糖，3gPVP K-30，0.2gNaN3NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO40.2g，用蒸餾水定容至1000ml)中30min后，于37℃烘干。然后用Biodot點膜儀將制備好的抗磺胺嘧啶單克隆抗體-膠體金標記物均勻包被在結(jié)合墊上，每厘米結(jié)合墊包被9μl抗磺胺嘧啶單克隆抗體-膠體金標記物，真空干燥，真空封裝，置4℃?zhèn)溆谩?br> 7、樣品墊的處理將樣品墊浸泡于0.01M pH7.4磷酸緩沖液(配方及制備20g BSA，25g蔗糖，3gPVP K-30，0.2gNaN3NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO40.2g，用蒸餾水定容至1000ml)中30min后，于37℃烘干，真空封裝，置4℃?zhèn)溆谩?br> 8、硝酸纖維素膜的包被用0.01M pH7.4 PBS緩沖液(含3％的甲醇)將磺胺嘧啶-牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物稀釋到65μg/ml，用Biodot點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜作為檢測線，包被量為0.6μl/cm，檢測線靠近結(jié)合墊端，距結(jié)合墊墊端約8mm；用0.01M pH7.4PBS緩沖液(含3％的甲醇)將兔抗鼠IgG抗體稀釋到200μg/ml，用Biodot點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜作為質(zhì)控線，包被量為0.6μl/cm，質(zhì)控線靠近吸水墊，距吸收墊約8mm，兩線距離5～8mm。37℃烘干，封裝備用。
9、試紙條的組裝將樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸水墊(4)按圖2所示的順序依次粘附在PVC背襯(7)上，切成3mm寬的小條，真空封裝。4～8℃保存，有效期一年；常溫保存，有效期6個月。
實施例2(應(yīng)用實施例)檢測磺胺嘧啶的免疫膠體金試紙條的使用方法1、樣品的預處理(1)組織樣品的預處理將待檢組織樣品勻漿，取3g待檢組織樣品加入6ml乙酸乙酯上下振蕩10min，室溫2000g離心10min，取2ml上層液體蒸干或在氮氣流下吹干，用1ml0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液(配方NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO40.2g，用蒸餾水定容至1000ml)溶解殘留物。
(2)蜂蜜樣品的預處理取2g蜂蜜樣品加入4ml雙蒸水溶解，加4ml乙酸乙酯上下振蕩10min，室溫3000g離心10min，取1ml上層液體蒸干或在氮氣流下吹干，用0.5ml0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解殘留物。
(3)牛奶樣品的預處理牛奶樣品經(jīng)3500rpm離心10min脫脂后，吸取中層牛奶3ml加入6ml乙酸乙酯上下振蕩10min，室溫2000g離心10min，取2ml上層液體蒸干或在氮氣流下吹干，用1ml0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解殘留物。
(4)雞蛋樣品的預處理吸取3ml蛋黃加入6ml乙酸乙酯上下振蕩10min，室溫2000g離心10min，取2ml上層液體蒸干或在氮氣流下吹干，用1ml0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解殘留物。
2、檢測陰性標準品(0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液，配方NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，用蒸餾水定容至1000ml)及待檢樣品各取120μl加入微孔板中，將膠體金試紙條插入待檢樣品中，20分鐘后觀察結(jié)果。
3、結(jié)果判定如圖3所示，若待測樣品試紙條檢測線顏色明顯淺于陰性標準品試紙條檢測線顏色，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶則判斷為陽性樣品，即待測樣品中磺胺嘧啶的濃度在20ppb-80ppb范圍內(nèi)；若待測樣品試紙條檢測線無顏色出現(xiàn)，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶也判斷為陽性樣品，即待測樣品中磺胺嘧啶的濃度高于80ppb；若待測樣品試紙條檢測線顏色等于或深于陰性標準品試紙條檢測線顏色，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶則判斷為陰性樣品，即磺胺嘧啶的濃度小于20ppb；如果質(zhì)控線上沒有紅色條帶出現(xiàn)，則該試紙條無效。
實施例3(應(yīng)用實施例)檢測磺胺嘧啶的免疫膠體金試紙條的應(yīng)用1、特異性試驗將磺胺嘧啶、磺胺嘧啶鈉、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、克倫特羅、氯霉素配制成濃度為500ppb的樣品。按實施例2所述方法進行試驗。試驗結(jié)果(見表1)表明，磺胺嘧啶、磺胺嘧啶鈉樣品檢測線無顏色出現(xiàn)，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，而磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、克倫特羅、氯霉素樣品試紙條檢測線顏色與標準品試紙條檢測線顏色一致，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，這表明磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、克倫特羅、氯霉素與本發(fā)明試紙條無交叉反應(yīng)，顯示本發(fā)明試紙條具有好的特異性。
表1 本發(fā)明試紙條特異性試驗結(jié)果

注“+”表示陽性，“-”表示陰性。
2、敏感性試驗按實施例2所述的方法，用本發(fā)明檢測試紙條分別檢測濃度為0、5、10、20、40、80ppb的磺胺嘧啶標準品，重復8次，用Biodot TSR3000讀條系統(tǒng)測其檢測線吸光值(G/Peak-ROD值)，結(jié)果見表2。根據(jù)統(tǒng)計學分析，5ppb磺胺嘧啶標準品的檢測線G/Peak-ROD值與0ppb磺胺嘧啶標準品檢測線G/Peak-ROD值差異極顯著。因此當磺胺嘧啶標準品濃度在5ppb-20ppb范圍內(nèi)時可借助Biodot TSR3000讀條系統(tǒng)來判定結(jié)果；當磺胺嘧啶標準品濃度在20ppb-80ppb范圍內(nèi)時檢測線受到明顯抑制(抑制率為30.51％)，肉眼很容易判定結(jié)果。當磺胺嘧啶標準品濃度高于80ppb時檢測線無顏色出現(xiàn)。因此本發(fā)明檢測試紙條靈敏度為5ppb，肉眼判定檢測限為20ppb，符合中華人民共和國國家“磺胺嘧啶殘留限量標準”。
表2 本發(fā)明試紙條敏感性(靈敏度)試驗結(jié)果

注x表示平均值，S表示標準差，CV表示變異系數(shù)，抑制率＝標準品的平均吸光值/0標準品的平均吸光值3、樣品中的磺胺嘧啶模擬檢測試驗(1)雞肉樣品中磺胺嘧啶的模擬檢測試驗分別向雞肉樣品中添加磺胺嘧啶標準品，使雞肉樣品中磺胺嘧啶濃度分別為0ppb，20ppb，制成0ppb和20ppb磺胺嘧啶雞肉樣品。按實施例2所述方法，用本發(fā)明檢測試紙條分別對0ppb和20ppb磺胺嘧啶雞肉樣品進行檢測，重復8次，結(jié)果顯示，0ppb磺胺嘧啶雞肉樣品檢測線顏色與陰性標準品檢測線顏色一致，判為陰性樣品，而20ppb磺胺嘧啶雞肉樣品檢測可以線顏色明顯淺于陰性標準品檢測線顏色，判為陽性樣品。說明用本發(fā)明檢測試紙條可以用來檢測雞肉樣品。
(2)雞肝臟樣品中磺胺嘧啶的模擬檢測試驗分別向雞肝臟樣品中添加磺胺嘧啶標準品，使雞肝臟樣品中磺胺嘧啶濃度分別為0ppb，20ppb，制成0ppb和20ppb磺胺嘧啶雞肝臟樣品。按實施例2所述方法，用本發(fā)明檢測試紙條分別對0ppb和20ppb磺胺嘧啶雞肝臟樣品進行檢測，重復8次，結(jié)果顯示，0ppb磺胺嘧啶雞肝臟樣品檢測線顏色與陰性標準品檢測線顏色一致，判為陰性樣品，而20ppb磺胺嘧啶雞肝臟樣品檢測線顏色明顯淺于陰性標準品檢測線顏色，判為陽性樣品。說明用本發(fā)明檢測試紙條可以用來檢測雞肝臟樣品。
(3)豬肉樣品中磺胺嘧啶的模擬檢測試驗分別向豬肉樣品中添加磺胺嘧啶標準品，使豬肉樣品中磺胺嘧啶濃度分別為0ppb，20ppb，制成0ppb和20ppb磺胺嘧啶豬肉樣品。按實施例2所述方法，用本發(fā)明檢測試紙條分別對0ppb和20ppb磺胺嘧啶豬肉樣品進行檢測，重復8次，結(jié)果顯示，0ppb磺胺嘧啶豬肉樣品檢測線顏色與陰性標準品檢測線顏色一致，判為陰性樣品，而20ppb磺胺嘧啶豬肉樣品檢測線顏色明顯淺于陰性標準品檢測線顏色，判為陽性樣品。說明用本發(fā)明檢測試紙條可以用來檢測豬肉樣品。
(4)豬肝臟樣品中磺胺嘧啶的模擬檢測試驗分別向豬肝臟樣品中添加磺胺嘧啶標準品，使豬肝臟樣品中磺胺嘧啶濃度分別為0ppb，20ppb，制成0ppb和20ppb磺胺嘧啶豬肝臟樣品。按實施例2所述方法，用本發(fā)明檢測試紙條分別對0ppb和20ppb磺胺嘧啶豬肝臟樣品進行檢測，重復8次，結(jié)果顯示，0ppb磺胺嘧啶豬肝臟樣品檢測線顏色與陰性標準品檢測線顏色致，判為陰性樣品，而20ppb磺胺嘧啶豬肝臟樣品檢測線顏色明顯淺于陰性標準品檢測線顏色，判為陽性樣品。說明用本發(fā)明檢測試紙條可以用來檢測豬肝臟樣品。
(5)雞蛋樣品中磺胺嘧啶的模擬檢測試驗分別向雞蛋樣品中添加磺胺嘧啶標準品，使雞蛋樣品中磺胺嘧啶濃度分別為0ppb，20ppb，制成0ppb和20ppb磺胺嘧啶雞蛋樣品。按實施例2所述方法，用本發(fā)明檢測試紙條分別對0ppb和20ppb磺胺嘧啶雞蛋樣品進行檢測，重復8次，結(jié)果顯示，0ppb磺胺嘧啶雞蛋樣品檢測線顏色與陰性標準品檢測線顏色一致，判為陰性樣品，而20ppb磺胺嘧啶雞蛋樣品檢測線顏色明顯淺于陰性標準品檢測線顏色，判為陽性樣品。說明用本發(fā)明檢測試紙條可以用來檢測雞蛋樣品。
(6)蜂蜜樣品中磺胺嘧啶的模擬檢測試驗分別向蜂蜜樣品中添加磺胺嘧啶標準品，使蜂蜜樣品中磺胺嘧啶濃度分別為0ppb，20ppb，制成0ppb和20ppb磺胺嘧啶蜂蜜樣品。按實施例2所述方法，用本發(fā)明檢測試紙條分別對0ppb和20ppb磺胺嘧啶蜂蜜樣品進行檢測，重復8次，結(jié)果顯示，0ppb磺胺嘧啶蜂蜜樣品檢測線顏色與陰性標準品檢測線顏色一致，判為陰性樣品，而20ppb磺胺嘧啶蜂蜜樣品檢測線顏色明顯淺于陰性標準品檢測線顏色，判為陽性樣品。說明用本發(fā)明檢測試紙條可以用來檢測蜂蜜樣品。
(7)牛奶樣品中磺胺嘧啶的模擬檢測試驗分別向牛奶樣品中添加磺胺嘧啶標準品，使牛奶樣品中磺胺嘧啶濃度分別0ppb，20ppb，制成0ppb和20ppb磺胺嘧啶牛奶樣品。按實施例2所述方法，用本發(fā)明檢測試紙條分別對0ppb和20ppb磺胺嘧啶牛奶樣品進行檢測，重復8次，結(jié)果顯示，0ppb磺胺嘧啶牛奶樣品檢測線顏色與陰性標準品檢測線顏色一致，判為陰性樣品，而20ppb磺胺嘧啶牛奶樣品檢測線顏色明顯淺于陰性標準品檢測線顏色，判為陽性樣品。說明用本發(fā)明檢測試紙條可以用來檢測牛奶樣品。
4、樣品檢測(1)動物試驗選擇健康仔肉雞(0.75kg/只)80只，隨機分成2組，即對照組和試驗組。對照組飼喂不含任何抗菌藥物的飼料，試驗組飼喂含500mg/kg磺胺嘧啶的飼料。試驗期間，自由采食，自由飲水。試驗組連續(xù)喂藥7d后停藥，喂藥之前、喂藥后1d、3d、5d、7d，停藥后0d、1d、2d每天宰殺試驗組雞5只，對照組2只，采肌肉同時用本發(fā)明檢測試紙條法(GICA)和高效液相法(HPLC)測定，結(jié)果見表3。56份樣品中，HPLC法檢測結(jié)果為陽性28份，陰性28份；GICA法檢測結(jié)果為陽性30份，陰性26份；HPLC法和GICA法檢測均為陽性者28份，均為陰性者26份，二者陽性符合率為93.3％(28/30)，陰性符合率為92.9％(26/28)，總符合率為96.4％(54/56)。說明本發(fā)明的檢測試紙條完全可以作為常規(guī)方法用于市場上雞肉產(chǎn)品中磺胺嘧啶殘留的快速檢測。
表3 本發(fā)明試紙條法與HPLC法對雞肌肉樣品檢測效果的比較

(2)農(nóng)貿(mào)市場和超級市場中樣品的檢測2005年10月和11月在武漢市的農(nóng)貿(mào)市場和超級市場采集雞肌肉樣品68份，用本發(fā)明檢測試紙條進行檢測，檢出陽性樣品2份，陽性檢出率為2.94％，用HPLC法復核，含量分別為138ppb、56ppb，大于20ppb，判為陽性，與試紙條檢測結(jié)果一致。
盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實施例進行說明，但是不能認為是對本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)對本發(fā)明進行各種改動或修飾，這些改動或修飾形式同樣落在本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種雜交瘤細胞系BDRXN，其保藏號為CCTCC-C200522。
2.一種能夠?qū)ｉT識別磺胺嘧啶的單克隆抗體，它是由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞系BDRXN所分泌的。
3.含權(quán)利要求1或2的試紙條。
4.權(quán)利要求3所述的試紙條，其特征在于，所述的試紙條是檢測磺胺嘧啶殘留的試紙條。
5.一種適用于檢測磺胺嘧啶殘留的試紙條，它包括樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸水墊(4)和PVC背襯(7)，其特征在于，在PVC背襯(7)按順序依次粘附有樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸水墊(4)；所述的結(jié)合墊(2)上包被有所述的抗磺胺嘧啶單克隆抗體-膠體金標記物；所述的硝酸纖維素膜(3)上分別包被有磺胺嘧啶-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線(5)和兔抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線(6)。
6.權(quán)利要求5所述的試紙條，其特征在于，所述的載體蛋白是牛血清白蛋白。
7.權(quán)利要求5或6所述的一種適用于檢測磺胺嘧啶殘留的免疫膠體金試紙條的制備方法，其步驟包括1)將磺胺嘧啶與載體蛋白偶聯(lián)，形成磺胺嘧啶-載體蛋白偶聯(lián)物；2)用磺胺嘧啶-載體蛋白偶聯(lián)物免疫小鼠，得到分泌抗磺胺嘧啶的單克隆抗體的細胞系BDRXN，其保藏號為CCTCC-C200522；3)提取小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗體；4)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；5)將步驟2)制備的抗磺胺嘧啶單克隆抗體加入步驟4)制備的膠體金中，得到抗磺胺嘧啶單克隆抗體-膠體金標記物；6)將抗磺胺嘧啶單克隆抗體-膠體金標記物包被在結(jié)合墊(2)上；7)將磺胺嘧啶-載體蛋白偶聯(lián)物包被在硝酸纖維素膜(3)上構(gòu)成檢測線(5)；并將兔抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜(3)上構(gòu)成質(zhì)控線(6)；8)在所述的PVC背襯(7)上按順序依次粘附所述的樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸水墊(4)，得到所述的檢測磺胺嘧啶殘留的免疫膠體金試紙條。
8.權(quán)利要求7所述的制備方法，其中，步驟2)所述的載體蛋白為人血清白蛋白。
9.權(quán)利要求7所述的制備方法，其中，步驟7)所述的載體蛋白為牛血清白蛋白。
10.權(quán)利要求3-6任一項所述的試紙條在檢測磺胺嘧啶殘留中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于快速檢測磺胺嘧啶殘留的免疫膠體金試紙條及其制備方法，屬于獸藥殘留的免疫化學速測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試紙條，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，其特征在于，在PVC背襯上按順序依次粘附有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊；所述的結(jié)合墊上包被有所述的抗磺胺嘧啶單克隆抗體－膠體金標記物，該單克隆抗體由雜交瘤細胞系BDRXN(保藏號為CCTCC－C200522)所分泌得到的。所述的硝酸纖維素膜上分別包被有磺胺嘧啶－載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線和兔抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線。本發(fā)明的試紙條有靈敏度高、特異性強、操作簡便、檢測快速、準確等顯著優(yōu)點。
文檔編號C07K16/18GK1807601SQ200610018120
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月9日
發(fā)明者畢丁仁, 王喜亮, 熊寧, 石德時, 李自力, 劉百紅, 李曉云, 張道宏 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學