專利名稱：表皮生長因子與綠色熒光蛋白的融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；具體地說，本發(fā)明涉及一種能高效與表皮生長因子受體結(jié)合的融合蛋白；本發(fā)明還涉及該蛋白的用途。

背景技術(shù)：
表皮生長因子(EGF)及表皮生長因子受體(EGFR)在人體許多細(xì)胞的生長、分化、增殖過程中起著重要的作用。表皮生長因子受體在很多腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，是腫瘤較理想的靶點(diǎn)。關(guān)于表皮生長因子受體的內(nèi)吞及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)理研究一直都是分子生物學(xué)和分子醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，它也是腫瘤基因治療、生物治療的靶點(diǎn)。
表皮生長因子受體的內(nèi)吞機(jī)理研究以往大多采用同位素標(biāo)記的EGF，該種方法較為敏感，但是由于涉及到放射性物質(zhì)，而且不能直觀觀察，不能在活體細(xì)胞上觀察，所以難以廣泛使用。
隨著熒光標(biāo)記物的發(fā)展，后來人們也采用了熒光標(biāo)記的表皮生長因子(EGF)，這些熒光標(biāo)記物大多是小分子化合物，如FITC，Rhodamine等。熒光化合物標(biāo)記的EGF可以與EGFR結(jié)合并內(nèi)吞，但是這些化合物的敏感度較低，熒光化合物容易見光淬滅，所以操作一定要避光，給操作帶來了很多不便；此外熒光小分子化合物與EGF進(jìn)行交聯(lián)反映，也可能影響EGF的生物學(xué)活性，因此有必要尋找新的方法來解決這些問題。
綠色熒光蛋白(GFP，Green Fluorescent Protein)或增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP，Enhanced Green Fluorescent Protein)作為一種標(biāo)記蛋白已被應(yīng)用于分子生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究。幾年前有研究人員將GFP與Heregulin融合表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)融合蛋白可以與Heregulin受體結(jié)合。
雖然將綠色熒光蛋白(GFP)或者其它熒光蛋白與一個目標(biāo)蛋白進(jìn)行融合是一種已被應(yīng)用的技術(shù)，但人們也了解這樣的事實(shí)這種融合技術(shù)會影響被融合蛋白的固有折疊形式。GFP不僅僅能影響被融合對象的折疊形式，而且當(dāng)GFP與一個自身折疊形式并不恰當(dāng)?shù)牡鞍走M(jìn)行融合時，GFP的自身折疊形式也會遭受破壞，從而導(dǎo)致非正常性的弱熒光出現(xiàn)。
因此，GFP或EGFP并非適合于與各種蛋白相融合表達(dá)，并且，其與大多蛋白融合表達(dá)時往往會導(dǎo)致相應(yīng)的蛋白活性發(fā)生變化，或空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，難以發(fā)揮這些蛋白質(zhì)原先的各種特性，如結(jié)合特性等。迄今為止尚沒有人實(shí)現(xiàn)對EGFP與EGF的融合蛋白進(jìn)行表達(dá)純化。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種融合蛋白，所述的融合蛋白可很好地用于觀察EGFR的內(nèi)吞機(jī)理，檢測細(xì)胞EGFR的表達(dá)狀況，以及研究EGFR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理等。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種產(chǎn)生所述融合蛋白的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的融合蛋白，所述的融合蛋白包括第一部分和第二部分，其中， 第一部分綠色熒光蛋白(或其活性片段)；和 第二部分表皮生長因子(或其活性片段)； 并且，所述的融合蛋白可與表皮生長因子受體結(jié)合。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白與表皮生長因子受體結(jié)合后可被細(xì)胞內(nèi)吞。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白還可使表皮生長因子受體產(chǎn)生信號傳導(dǎo)。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選例中，所述的綠色熒光蛋白為增效的綠色熒光蛋白。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的綠色熒光蛋白或其活性片段位于融合蛋白的氨基端；所述的表皮生長因子或其活性片段位于融合蛋白的羧基端。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，在第一部分和第二部分之間，包括4-20個氨基酸的連接子。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的連接子的氨基酸序列為(GGGS)n，其中，n＝1～5。
更優(yōu)選的，n＝1-4，更優(yōu)選的，n＝2。
更優(yōu)選的，所述的連接子具有SEQ ID NO10所述的氨基酸序列(即GGGSGGGS)。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，在融合蛋白的氨基端設(shè)置有His6標(biāo)簽。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種核酸分子， (i)所述的核酸分子編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白；或 (ii)所述的核酸分子與(i)所述的核酸分子相互補(bǔ)。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種載體，所述的載體中含有前面所述的核酸分子。
在本發(fā)明的第四方面，提供一種基因工程化的細(xì)胞，所述的細(xì)胞含有前面所述的載體；或所述的細(xì)胞基因組中整合有前面所述的核酸分子。
在本發(fā)明的第五方面，提供所述的融合蛋白的用途，用于 制備觀察表皮生長因子的內(nèi)吞及分子機(jī)理的物質(zhì)；或 制備檢測表皮生長因子受體的表達(dá)水平的物質(zhì)。
在本發(fā)明的第六方面，提供一種產(chǎn)生所述的融合蛋白的方法，所述的方法包括培養(yǎng)前面所述的細(xì)胞，使所述細(xì)胞產(chǎn)生所述的融合蛋白。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，還包括回收所述的融合蛋白；更優(yōu)選的，包括分離和純化所述的融合蛋白。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。



圖1顯示了pET28a-EGFP-EGF載體示意圖。
圖2顯示了采用SDS-PAGE凝膠電泳確定目標(biāo)蛋白在洗脫液中的分布情況。其中，泳道1為標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記(marker)的電泳情況；泳道2為用NTA-0緩沖液洗脫的蛋白的電泳情況；泳道3為用NTA-40緩沖液洗脫的蛋白的電泳情況；泳道4-5為用NTA-80緩沖液洗脫的蛋白的電泳情況；泳道6-7為用NTA-100緩沖液洗脫的蛋白的電泳情況；泳道8-9為用NTA-200緩沖液洗脫的蛋白的電泳情況；泳道10為用NTA-250緩沖液洗脫的蛋白的電泳情況； 圖3顯示了純化后的EGFP-EGF蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖。其中，泳道1為蛋白分子量標(biāo)記，泳道2為0.5μg EGFP-EGF蛋白。
圖4顯示了EGFP-EGF蛋白與細(xì)胞表面EGFR結(jié)合及內(nèi)吞圖。其中， AEGFP-EGF蛋白的結(jié)合及內(nèi)吞； BEGFP蛋白的結(jié)合及內(nèi)吞； C用EGF蛋白競爭EGFP-EGF蛋白的結(jié)合及內(nèi)吞。
圖5顯示了EGFP-EGF蛋白的內(nèi)吞及其與網(wǎng)格蛋白(Clathrin)在細(xì)胞內(nèi)共定位。
圖6顯示了EGFP-EGF蛋白的氨基酸序列。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明人經(jīng)過長期的研究和試驗(yàn)，首次獲得了表皮生長因子(EGF)與增效的綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)的融合蛋白。更特別的，本發(fā)明人在EGFP與EGF之間加上一段適當(dāng)長度的連接子，從而大大提高融合蛋白與表皮生長因子受體的結(jié)合。本發(fā)明所形成融合蛋白可很好地用于研究EGFR的內(nèi)吞機(jī)理，檢測細(xì)胞EGFR的表達(dá)狀況，研究EGFR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理等?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。
含有(a)綠色熒光蛋白(更優(yōu)選的為增效的綠色熒光蛋白)或其活性片段作為第一部分和(b)表皮生長因子或其活性片段作為第二部分的融合蛋白 本發(fā)明提供一種融合蛋白，該蛋白包括綠色熒光蛋白或其中的生物活性片段，和表皮生長因子或其中的生物活性片段，該分子能用于觀察表皮生長因子受體的內(nèi)吞及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)理。更優(yōu)選的，所述的融合蛋白是一種獨(dú)立的蛋白，與其它蛋白、多肽或分子無聯(lián)系，是重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)的純化產(chǎn)物或作為一種純化的提取物。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的融合蛋白的分子量大約在38690道爾頓左右。
表皮生長因子 任何適合的表皮生長因子均可用于制備本發(fā)明的融合蛋白。本文使用的術(shù)語“表皮生長因子”是指一種多肽，能結(jié)合表皮生長因子受體并誘導(dǎo)內(nèi)吞和/或信號傳導(dǎo)。表皮生長因子(EGF)是一種細(xì)胞因子，其能與靶細(xì)胞膜上的表皮生長因子受體(EGFR)結(jié)合產(chǎn)生生物效應(yīng)。而EGFR是一種酪氨酸激酶(TK)型受體，當(dāng)它與EGF結(jié)合后能促進(jìn)受體內(nèi)的TK激活，導(dǎo)致受體酪氨酸殘基自身磷酸化，提供持續(xù)分裂信號到細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞增殖、分化。EGFR在人類組織中大量存在，在惡性腫瘤中呈高表達(dá)。
表皮生長因子或其中的生物活性片段包括一部分保守氨基酸替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域的公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實(shí)施并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使人們認(rèn)識到，一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活性。見Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。表1是這種替換的一些示例。
表1 可能還有其他的類似的可替換性，這種可替換性往往可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定或者根據(jù)已知的保守序列進(jìn)行確定。
任何一種表皮生長因子的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，表皮生長因子的生物活性片段的含義是指作為一種細(xì)胞因子，其仍然能保持全長的表皮生長因子的全部或部分功能。通常情況下，表皮生長因子與表皮生長因子受體在細(xì)胞表面結(jié)合，刺激一個或多個信號傳導(dǎo)通路或途徑并引起細(xì)胞反應(yīng)，例如增殖。正常情況下，所述的生物活性片段至少保持50％的全長表皮生長因子的刺激活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的刺激活性。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，所述的表皮生長因子或生物活性片段在融合蛋白中具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中第271-327位的氨基酸序列。
經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的表皮生長因子的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。
綠色熒光蛋白 如本文所用，所述的“綠色熒光蛋白”還包括“增效的綠色熒光蛋白”。
任何適合的綠色熒光蛋白均可用于制備本發(fā)明的融合蛋白。本文使用的術(shù)語“綠色熒光蛋白”是指一種標(biāo)記蛋白，其內(nèi)源熒光基團(tuán)在受到紫外光或藍(lán)光激發(fā)時可高效發(fā)射清晰可見的綠光，且見光不易淬滅。綠色熒光蛋白的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)為了解和研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和光譜學(xué)功能關(guān)系提供了一個極好的機(jī)會。在本發(fā)明中，所述的“綠色熒光蛋白”包括各種在野生型綠色熒光蛋白基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)的蛋白，比如進(jìn)行基因優(yōu)化(如去除隱蔽性內(nèi)含子，在隱蔽內(nèi)含子的結(jié)合位點(diǎn)引入植物內(nèi)含子，合成密碼子用于優(yōu)化新基因，對GFP進(jìn)行環(huán)狀序列改變等)；或通過氨基酸替換提高GFP脫輔基蛋白在高溫(如37℃)條件下的正確折疊，以及改變GFP光譜特性等。“增效的綠色熒光蛋白”為對綠色熒光蛋白進(jìn)行改進(jìn)后的蛋白，例如，可克隆自質(zhì)粒pEGFP-N1(購自Clontech)。
綠色熒光蛋白或其中的生物活性片段包括一部分保守氨基酸替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性?？刹捎玫囊徊糠职被崽鎿Q的示例見表1。可能還有其他的類似的可替換性，這種可替換性往往可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定或者根據(jù)已知的保守序列進(jìn)行確定。
任何一種綠色熒光蛋白的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，綠色熒光蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種標(biāo)志分子，其仍然能保持全長的綠色熒光蛋白的全部或部分功能。正常情況下，所述的生物活性片段至少保持50％的全長綠色熒光蛋白的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
具體地說，綠色熒光蛋白或生物活性片段在融合蛋白中具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中第11-262位的氨基酸序列。
經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的綠色熒光蛋白的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。
連接 作為本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的方式，所述的表皮生長因子或其活性片段和綠色熒光蛋白或其活性片段通過多肽連接子連接，從而形成融合蛋白。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，在表皮生長因子和綠色熒光蛋白的氨基酸序列之間連接上一段適當(dāng)長度的氨基酸接頭，可大大提高融合蛋白與表皮生長因子受體的結(jié)合和內(nèi)吞。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，所述的連接子包括4-20個氨基酸。在本發(fā)明的更優(yōu)選的方式中，所述的連接子的氨基酸序列為(GGGS)n(其中，n＝1～5)；更優(yōu)選的，所述的n＝1-4；最優(yōu)選的，所述的n＝2，即所述連接子為GGGSGGGS(SEQ ID NO10)。
作為一種優(yōu)選的方式，所述的增效的綠色熒光蛋白或其活性片段位于融合蛋白的氨基端(N端)；所述的表皮生長因子或其活性片段位于融合蛋白的羧基端(C端)?？蛇x擇地，也可互換兩種蛋白所處的位置，也即所述的增效的綠色熒光蛋白或其括性片段位于融合蛋白的羧基端；所述的表皮生長因子或其活性片段位于融合蛋白的氨基端。
此外，作為另一種方式，將所述的表皮生長因子和綠色熒光蛋白或它們的活性片段直接連接，比如把綠色熒光蛋白與表皮生長因子的編碼基因直接連接，融合表達(dá)，二者之間不加氨基酸連接子。但是，本發(fā)明人的結(jié)果顯示，不加連接子所獲得的蛋白與表皮生長因子受體的結(jié)合不如表皮生長因子與綠色熒光蛋白之間帶有本發(fā)明優(yōu)選的連接子的情況。
純化標(biāo)簽 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的融合蛋白的氨基端(或羧基端)還可含有一個多肽片段，作為蛋白標(biāo)簽。任何合適的標(biāo)簽都可以用于本發(fā)明。例如，所述的標(biāo)簽可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，6-His，AU1，EE，T7，4A6，∈，B，gE以及Ty1(見表2)。這些標(biāo)簽可用于對融合蛋白進(jìn)行純化。
表2可使用的標(biāo)簽系統(tǒng) 對上述可用的標(biāo)簽的描述可參見如下文獻(xiàn)Prickett等，BioTechniques，7(6)580-584(1989)；Xie等，Endocrinology，139(11)4563-4567(1998)；Nagelkerke等，Electrophoresis，182694-2698(1997)；Tolbert和Lameh，J.Neurochem.，70113-119(1998)；Chen和Katz，BioTechniques，25(1)22-24(1998)；Tseng和Verma，Gene，169287-288(1996)；Rudiger等，BioTechniques，23(1)96-97(1997)；Olah等，Biochem.，22194-102(1994)；Wang等，Gene，169(1)53-58(1996)；Grose，U.S.Patent No.5,710,248；Bastin等，Mol.Biochem.Parasitology，77235-239(1996)Invitrogen，Sigma，Santa Cruz Biotech。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在融合蛋白的氨基端設(shè)置有His6標(biāo)簽，以便于融合蛋白的純化。
核酸分子 另一方面，本發(fā)明提供了編碼所述的融合蛋白的分離的核酸，也可以是其互補(bǔ)鏈。
并且，本發(fā)明還提供了包含編碼所述融合蛋白的核酸分子的載體。所述的載體還可包含與所述核酸分子的序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列，以便于所述融合蛋白的表達(dá)。
任何編碼表皮生長因子或其活性片段的合適的DNA結(jié)構(gòu)都適用于本發(fā)明。任何編碼綠色熒光蛋白或其活性片段的合適的DNA結(jié)構(gòu)也適用于本發(fā)明。下文實(shí)例中提及的序列都適用于本發(fā)明的方法。
表達(dá)載體 任何合適的載體都可以使用，比如一些用于細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞的克隆和表達(dá)的載體，如Pouwels等，克隆載體實(shí)驗(yàn)室手冊(Elsevier最新版)中所描述的。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的載體為原核載體，如pET28a載體。
表達(dá)載體包括連接有合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列的融合蛋白DNA序列，如哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因。調(diào)節(jié)序列包括轉(zhuǎn)錄啟動子、操縱子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)或控制轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止的合適序列。在融合蛋白序列需要調(diào)節(jié)序列功能的時候，則連接合適的調(diào)節(jié)序列。這樣，啟動子序列被連接在編碼融合蛋白DNA序列前端。在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制的能力通常由復(fù)制起始點(diǎn)控制。用于轉(zhuǎn)化株識別的篩選基因也可加入表達(dá)載體。
另外，非天然的表皮生長因子或綠色熒光蛋白的信號肽的編碼序列可以引入表達(dá)載體。例如信號肽(分泌引導(dǎo)物)序列可以和與融合蛋白編碼序列融合，從而使翻譯的融合蛋白可分泌到細(xì)胞外。信號肽可增強(qiáng)宿主細(xì)胞向胞外分泌嵌合多肽。信號肽在多肽從細(xì)胞內(nèi)分泌出來的過程中可被切去。
宿主細(xì)胞 此外，含有編碼所述融合蛋白的核酸序列的重組細(xì)胞也包括在本發(fā)明中。在本發(fā)明的一種方式中，該細(xì)胞可為原核細(xì)胞。更優(yōu)選的，所述細(xì)胞可為大腸桿菌細(xì)胞(E.coli)，如大腸桿菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。
生產(chǎn)融合蛋白的方法 生產(chǎn)融合蛋白的方法也已包括在本發(fā)明中。所述方法包括培養(yǎng)含有融合蛋白編碼核酸的重組細(xì)胞。所述的融合蛋白包括表皮生長因子或其有活性的片段以及綠色熒光蛋白或其活性片段。所述方法可包括讓細(xì)胞表達(dá)編碼的融合蛋白，以及使表達(dá)的融合蛋白的復(fù)性。在一個實(shí)例中，所述方法還可包括復(fù)性的融合蛋白的分離和/或純化。所述方法的產(chǎn)物也被保護(hù)。
可將上述制備獲得的融合蛋白純化為基本均一的性質(zhì)，例如在SDS-PAGE電泳上呈單一條帶。例如，當(dāng)重組蛋白為分泌表達(dá)時，可以采用商品化的超濾膜，例如Millipore、Amicon、Pellicon等公司產(chǎn)品，首先將表達(dá)上清濃縮。濃縮液可采用凝膠層析的方法進(jìn)一步加以純化，或采用離子交換層析的方法純化。例如陰離子交換層析(DEAE等)或陽離子交換層析。凝膠基質(zhì)可為瓊脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白純化的基質(zhì)。SP基團(tuán)是較為理想的離子交換基團(tuán)。最后，還可用反相高效液相色譜(RP-HPLC)等方法對上述純化產(chǎn)物進(jìn)一步精制純化。上述所有純化步驟可利用不同的組合，最終使蛋白純度達(dá)到基本均一。
可利用含有表皮生長因子或綠色熒光蛋白的抗體、受體或配體的親和層析柱對表達(dá)的融合性多肽進(jìn)行純化。根據(jù)所使用的親和柱的特性，可利用常規(guī)的方法，如高鹽緩沖液、改變pH等方法洗脫結(jié)合在親和柱上的融合性多肽。
重組蛋白以及編碼該重組蛋白的核酸可利用適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽?，例如，化學(xué)合成、重組表達(dá)，或其合并應(yīng)用。參見John Wiley & Sons，Inc 2000年出版的《Current Protocolsin Molecular Biology》，以及Cold Spring HarborLaboratory Press1989年出版的《Molecular ConingA Laboratory Manual》。在一個實(shí)例中，編碼融合蛋白的核酸序列是利用PCR技術(shù)制備的，方法參見Prodromou等(Protein Eng.5(8)827-29；1992)論著。
融合蛋白的用途 本發(fā)明的表皮生長因子與綠色熒光蛋白的融合蛋白可用于觀察表皮生長因子受體的內(nèi)吞、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理、以及表達(dá)情況。采用本發(fā)明的融合蛋白，不僅能夠在觀察表皮生長因子受體的內(nèi)吞及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理時提高敏感性和靈敏度，并且還便于進(jìn)行直觀觀察和活體觀察。由于表皮生長因子及表皮生長因子受體在人體許多細(xì)胞的生長、分化、增殖過程中起著重要的作用，并且表皮生長因子受體在很多腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，是腫瘤較理想的靶點(diǎn)，因此觀察表皮生長因子受體的內(nèi)吞及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理是非常有意義的，有利于找到腫瘤基因治療、生物治療的靶點(diǎn)。
當(dāng)獲得了所述的融合蛋白后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過一些手段來觀察表皮生長因子受體的內(nèi)吞、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或表達(dá)等一系列性狀。比如，首先將本發(fā)明所述的融合蛋白與受試細(xì)胞(如其細(xì)胞膜上包含表皮生長因子受體)相接觸；接著借助熒光顯微鏡拍照，或通過免疫熒光檢測的手段觀察綠色熒光蛋白的位置、以及定量結(jié)果，從而獲知表皮生長因子受體的內(nèi)吞或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)情況、或獲知表皮生長因子受體的表達(dá)情況。
本發(fā)明所提供的融合蛋白在濃度為1.5ng/ml(指的是所含EGF的量)時，就可以在共聚焦熒光顯微鏡下觀察到EGF的內(nèi)吞，并且可以觀察到它與網(wǎng)格蛋白(Clathrin)共定位，可見所述的融合蛋白是高度靈敏的，并且易于觀察。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于 (1)首次提供且制備出表皮生長因子與綠色熒光蛋白的融合蛋白，綠色熒光蛋白與表皮生長因子的融合不影響表皮生長因子與其受體的結(jié)合；為觀察表皮生長因子受體的內(nèi)吞、檢測細(xì)胞表皮生長因子受體的表達(dá)狀況以及研究表皮生長因子受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理創(chuàng)造了極其良好的條件。
(2)在操作時無需避光，不存在放射等污染因素，操作簡單便捷。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例1 pET28a-EGFP-EGF載體的構(gòu)建 以帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pEGFP-N1(購自Clontech)為模板，用引物GFPNde和GFPECOR擴(kuò)增EGFP序列，然后用Ndel及EcoRl酶切，然后插入Ndel/EcoRl雙酶切的pET28a載體(購自Novagen)骨架，其中， GFPNde(SEQ ID NO2) 5’-GGGAATTCCATATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’； GFPECOR(SEQ ID NO3) 5’-CCGGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATG-3’。
測序鑒定獲得含有EGFP的載體，命名為pET28a-EGFP。為了便于在EGFP編碼序列的3’端插入其他蛋白的編碼序列，本發(fā)明人在pET28a-EGFP的酶切位點(diǎn)EcoRI和XhoI之間插入以下序列MCSU，以引入BamHI和HindIII酶切位點(diǎn) 5’-AATTCAGCCAGCCGAAGCTTCGCGGATCCTAAC-3’(SEQ ID NO4)；及 5’-TCGAGTTAGGATCCGCGAAGCTTCGGCTGGCTG-3’(SEQ ID NO5)。
經(jīng)測序鑒定，本發(fā)明人把該載體命名為pET28a-GFPmcs。
隨后，本發(fā)明人以M13KO7-EGF載體(詳見Liang Y，Shi B，Zhang J，et al.(-)gene leads to better gene expression than(+)gene in phage gene delivery systems.Biotechnology Progress.2006 May-Jun；22(3)626-30.)為模板，用引物EGF-2及EGF-11擴(kuò)增EGF，然后用BamHI/HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠回收插入BamHI/HindIII雙酶切的pET28a-GFPmcs的載體骨架，即獲得pET28a-GFPmcsEGF載體。
EGF-2(SEQ ID NO6) 5’-CGCGGATCCGCGCAGTTCCCACCACTTC-3’； EGF-11(SEQ ID NO7) 5’-CCCAAGCTTAATAGTGACTCTGAATGTCCC-3’ 為了減少EGF和EGFP蛋白之間的構(gòu)象互相影響，本發(fā)明人在EGF和EGFP之間，也就是EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)之間插入了連接子序列Link1和Link2，從而獲得載體pET28a-EGFP-EGF，其中， Link1(SEQ ID NO8) 5’-AGCTTAGAGCCGCCGCCAGAGCCGCCGCCG-3’； Link2(SEQ ID NO9) 5’-AATTCGGCGGCGGCTCTGGCGGCGGCTCTA-3’。
獲得的pET28a-EGFP-EGF載體見圖1。
實(shí)施例2 EGFP-EGF蛋白的表達(dá)及純化 將經(jīng)過鑒定的pET28a-EGFP-EGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌HMS174(DE3)(購自ATCC)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落接種于含卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
次日，1∶20稀釋于300ml含卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6，加入IPTG使終濃度為1mM，30℃誘導(dǎo)3h。離心收集菌體，用30ml PBS重新懸浮起菌體，超聲至細(xì)胞完全裂解，4℃，13000rpm，10分鐘離心，收集上清。
取Ni-NTA resin溶液(購自Qiagen)加入蛋白上清中，4℃，旋轉(zhuǎn)孵育7～8小時。將孵育液轉(zhuǎn)移至洗脫柱中，用5倍NTA Resin體積的NTA-0 Buffer洗滌樹脂，收集洗脫液，依次用5倍Ni-NTA resin體積的NTA-40 Buffer，NTA-80Buffer，NTA-100 Buffer，NTA-200 Buffer，NTA-250 Buffer洗滌樹脂，收集洗脫液，每管收集一個NTA Resin體積。在12％SDS-PAGE凝膠中電泳，確定目標(biāo)蛋白在洗脫液中的分布情況，結(jié)果見圖2。
然后使用Amicon Ultra-4離心過濾裝置對含有蛋白的洗脫液進(jìn)行脫鹽、濃縮。收集濃縮蛋白，采用BCA及SDS-PAGE電泳確定EGFP-EGF蛋白的濃度，結(jié)果見圖3。
最后將蛋白保存于HBS(20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4)緩沖液及50％甘油中，-20℃長期保存。
經(jīng)測序，所述的融合蛋白的氨基酸序列如下(SEQ ID NO1) MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MMVSKGEELF TGVVPILVEL DGDVNGHKFS VSGEGEGDAT60 YGKLTLKFIC TTGKLPVPWP TLVTTLTYGV QCFSRYPDHM KQHDFFKSAM PEGYVQERTI120 FFKDDGNYKT RAEVKFEGDT LVNRIELKGI DFKEDGNILG HKLEYNYNSH NVYIMADKQK180 NGIKVNFKIR HNIEDGSVQL ADHYQQNTPI GDGPVLLPDN HYLSTQSALS KDPNEKRDHM240 VLLEFVTAAG ITLGMDELYK EFGGGSGGGS KLNSDSECPL SHDGYCLHDG VCMYIEALDK300 YACNCVVGYI GERCQYRDLK WWELRGS327 實(shí)施例3 EGFP-EGF蛋白與細(xì)胞結(jié)合及內(nèi)吞 為了分析EGFP-EGF蛋白的內(nèi)吞，接種3×104Hela細(xì)胞(購自ATCC)于24孔板；第二天，于實(shí)驗(yàn)前3小時將細(xì)胞培養(yǎng)液換為無血清的DMEM培養(yǎng)液。血清饑餓3小時后，將純化的EGFP-EGF蛋白加入細(xì)胞中，使EGFP-EGF的終濃度為200ng/ml，37℃孵育1小時，在室溫下用PBS洗滌3次，每次10分鐘。同時以EGFP蛋白(200ng/ml)作為陰性對照。
用熒光顯微鏡拍照(Axioskop 2；Carl Zeiss，Gottingen Germany)。為了證明EGFP-EGF中是通過EGF介導(dǎo)內(nèi)吞的，在競爭對照組中的EGFP-EGF同時添加了200倍過量(質(zhì)量比)的EGF。
結(jié)果見圖4，其中A為EGFP-EGF蛋白的結(jié)合及內(nèi)吞情況；B為EGFP蛋白的結(jié)合及內(nèi)吞情況；C為用EGF蛋白競爭EGFP-EGF蛋白的結(jié)合及內(nèi)吞情況。顯示了EGFP-EGF中通過EGF介導(dǎo)內(nèi)吞。
實(shí)施例4 免疫熒光檢測EGFP-EGF蛋白的內(nèi)吞途徑 將Hela細(xì)胞培養(yǎng)基換成含EGFP-EGF蛋白(終濃度為1.5ng/ml)的DMEM培養(yǎng)基，在4℃孵育60分鐘，轉(zhuǎn)移到37℃孵育20～30分鐘。細(xì)胞用PBS洗滌3次，每次10分鐘，然后用含4％多聚甲醛，0.1％Triton X-100的PBS固定及通透10分鐘，接著在室溫下用PBS再次洗滌。
然后，用含5％山羊血清的PBS封閉3分鐘，用PBS洗滌3次，每次5分鐘；然后與用PBS1∶500稀釋的網(wǎng)格蛋白小鼠抗體室溫作用3小時。隨后，用PBS洗3次，每次10分鐘。
然后，添加用PBS 1∶50稀釋的TRITC(tetramethylrhodamine isothiocyanate)標(biāo)記的抗小鼠免疫球蛋白抗體(H+L；KPL，Guildford，UK)，孵育30分鐘。
接著，用PBS洗3次，每次10分鐘。
最后可用Zeiss LSM共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞及熒光。
實(shí)施例5 EGFP-EGF蛋白與網(wǎng)格蛋白在細(xì)胞內(nèi)共定位 Hela細(xì)胞種于蓋玻片上，過夜，血清饑餓3小時。添加含終濃度為1.5ng/mlEGFP-EGF的DMEM，4℃孵育60min，轉(zhuǎn)移到37℃，孵育30min，固定，免疫熒光檢測網(wǎng)格蛋白。
Zeiss LSM共聚焦熒光顯微鏡下觀察。
結(jié)果見圖5，其中，A為EGFP-EGF內(nèi)吞(綠色)；B為免疫熒光檢測網(wǎng)格蛋白(紅色)；C為A和B的疊加影像(黃色)。
上述結(jié)果表明，EGFP-EGF融合蛋白能夠發(fā)生內(nèi)吞并可與網(wǎng)格蛋白在細(xì)胞內(nèi)共定位。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表
<110>上海市腫瘤研究所
<120>表皮生長因子與綠色熒光蛋白的融合蛋白
<130>063929
<160>10
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>327
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>融合蛋白
<400>1
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly
20 25 30
Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys
35 40 45
Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu
50 55 60
Thr Leu Lys PheIle Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro
65 70 75 80
Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr
85 90 95
Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu
100 105 110
Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr
115 120 125
Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg
130 135 140
Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly
145 150 155 160
His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn ValTyr Ile Met Ala
165 170175
Asp Lys GIn Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn
180 185 190
Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr
195 200 205
Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser
210 215 220
Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met
225 230 235 240
Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp
245 250 255
Glu Leu Tyr Lys Glu Phe Gly Gly G1y Ser Gly Gly Gly Ser Lys Leu
260 265 270
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
275 280 285
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
290 295 300
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
305 310 315 320
Trp Trp Glu Leu Arg Gly Ser
325
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>2
gggaattcca tatggtgagc aagggcgag 29
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>3
ccggaattcc ttgtacagct cgtccatg 28
<210>4
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>4
aattcagcca gccgaagctt cgcggatcct aac 33
<210>5
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>5
tcgagttagg atccgcgaag cttcggctgg ctg 33
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>6
cgcggatccg cgcagttccc accacttc 28
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>7
cccaagctta atagtgactc tgaatgtccc 30
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>8
agcttagagc cgccgccaga gccgccgccg 30
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>9
aattcggcgg cggctctggc ggcggctcta30
<210>10
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>連接子
<400>10
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 權(quán)利要求
1.一種分離的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括第一部分和第二部分，其中，
第一部分綠色熒光蛋白；和
第二部分表皮生長因子；
并且，所述的融合蛋白可與表皮生長因子受體結(jié)合。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的綠色熒光蛋白為增效的綠色熒光蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的綠色熒光蛋白或其活性片段位于融合蛋白的氨基端；所述的表皮生長因子或其活性片段位于融合蛋白的羧基端。
4.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，在第一部分和第二部分之間，包括4-20個氨基酸的連接子。
5.如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述的連接子的氨基酸序列為(GGGS)n，其中，n＝1～5。
6.一種核酸分子，其特征在于，
(i)所述的核酸分子編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白；或
(ii)所述的核酸分子與(i)所述的核酸分子相互補(bǔ)。
7.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的核酸分子。
8.一種基因工程化的細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞含有權(quán)利要求7所述的載體；
或所述的細(xì)胞基因組中整合有權(quán)利要求6所述的核酸分子。
9.權(quán)利要求1所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于
制備觀察表皮生長因子的內(nèi)吞及分子機(jī)理的物質(zhì)；或
制備檢測表皮生長因子受體的表達(dá)水平的物質(zhì)。
10.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，使所述細(xì)胞產(chǎn)生所述的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了一種融合蛋白，所述的融合蛋白的第一部分為綠色熒光蛋白或其活性片段；第二部分為表皮生長因子或其活性片段；更特別的，上述兩個部分之間還包括一段適當(dāng)長度的氨基酸連接子。本發(fā)明的融合蛋白可以用于表皮生長因子受體的內(nèi)吞及其分子機(jī)理研究，以及表皮生長因子受體表達(dá)水平的檢測等。本發(fā)明的融合蛋白在用于檢測時敏感性好且無需避光操作，不存在放射等污染因素。
文檔編號C07K14/435GK101096383SQ20061002834
公開日2008年1月2日 申請日期2006年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月29日
發(fā)明者李宗海, 顧健人, 華 蔣, 徐宇虹 申請人:上海市腫瘤研究所