專利名稱：從心肌中提取純化高鐵肌紅蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種蛋白的提取純化工藝，具體是從心肌中提取純化高鐵肌紅蛋白的方法。
背景技術：
肌紅蛋白是脊椎動物骨骼肌和心肌組織胞漿中一種重要的血紅素蛋白，肌紅蛋白具有可逆地與氧結合的性質，它的主要功能是在肌細胞內運輸和儲存氧。高鐵肌紅蛋白(MetMb)是它的氧化形式，它在動物體內在一定的酶系的作用下可以與脫氧肌紅蛋白和氧合肌紅蛋白相互轉化，這對完成正常的呼吸過程具有重要的生理作用，這個過程如果發(fā)生障礙將影響呼吸過程的正常進行。純化的高鐵肌紅蛋白可以應用于動物肉色穩(wěn)定性的研究等，也可以作為人的克山病檢測的底物。因此，純化的高鐵肌紅蛋白可以作為生物試劑應用于臨床檢測和研究。
高鐵肌紅蛋白的分離純化國內目前還沒有相關報導，在國外文獻中曾報導了從牛肉中提純氧合肌紅蛋白的方法，但這些方法需要特殊的設備，如TSK-2000W凝膠高壓層析柱、高效液相色譜(HPLC)等，且所需時間較長，一般為3天左右(Gotoh，T.andShikama，K.(1976).Biochom.J.，80，397、Krzywicki，K.(1982).Meat Sci.，7，29、Gatellier，Ph.，Anton，M.and Renerre，M.(1993).Meat Sci.，33，401、Renerre M，AntonM，Gatellier，Ph.(1992).Meat Science，32，331)。不適于工業(yè)化生產。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種提取純化高鐵肌紅蛋白的方法，該方法選用DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephacryl S-200HR兩種層析介質，采用色譜法從豬心中分離和純化高鐵肌紅蛋白，可在較短的時間內得到電泳純的高鐵肌紅蛋白，且得率高，有效地解決了問題。
本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是一種從心肌中提取純化高鐵肌紅蛋白的方法，包括以下步驟1)將新鮮動物心肌剁碎，加入冰冷的肌紅蛋白萃取緩沖液，經勻漿、離心、過濾后得粗提液；所說的肌紅蛋白萃取緩沖液是10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0；
2)粗提液經70％-100％硫酸銨鹽析，得到的沉淀用平衡緩沖液A重懸，再加入過量的K3Fe(CN)6，離心后取上清液對平衡緩沖液A透析，透析膜的截留分子量為14000，得透析液；所說的平衡緩沖液A是10mM Tris-HCl，1mM EDTA，10mM NaCl，pH8.5；3)將透析液上樣到DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱，用平衡緩沖液A洗脫，收集洗脫峰對應的紅褐色洗液；4)將收集的洗脫液泠凍干燥濃縮后，上樣到Sephacryl S-200HR凝膠過濾層析柱，用平衡緩沖液B洗脫，收集洗脫峰相對應的紅褐色洗脫液，即得到純化的高鐵肌紅蛋白；所說的平衡緩沖液B是100mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH7.5。
為了便于保存，可將得到的產品冷凍干燥后分裝，于-80℃保存。
與通常的蛋白質提取純化相似，其中第2～4步最好在4℃下進行。
本發(fā)明方法中所說的動物心肌，優(yōu)選豬心肌，因為其來源廣、成本低；其他動物如牛、羊等的心肌同樣可做為原材料。對于本領域的技術人員，可以理解，除心肌外，其他富含高鐵肌紅蛋白的動物肌肉如骨骼肌，同樣可參照本發(fā)明的步驟，制備高鐵肌紅蛋白。
目前我國很多醫(yī)院和科研機構在做肌紅蛋白方面的研究，高鐵肌紅蛋白標準品都需要從Sigma公司購進，價格昂貴。Sigma公司高鐵肌紅蛋白的售價為150美元/克左右，且純度只能達到≥95％，而通過本發(fā)明方法從心肌中提純得到的高鐵肌紅蛋白純度大于Sigma公司的，純度達到電泳純，得率達到14.1％。而且豬心等原材料可直接從屠宰場采購，成本低廉。因此本發(fā)明方法具有產品純度高，工藝簡單、成本低等優(yōu)點，既可填補我國該生物試劑制備的空白，又具有較高的經濟價值。


下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。
圖1是DEAE-Sepharose Fast Flow層析圖譜圖2是Sephacryl S-200HR分子篩層析圖譜圖3是SDS-PAGE電泳圖其中M.蛋白marker；1.粗提液；2.透析后樣品；3.經離子交換后樣品；4.凝膠層析后樣品圖4A是粗提液樣品電泳后凝膠掃描4B是經硫酸銨鹽析樣品電泳后凝膠掃描4C是經離子交換層析樣品電泳后凝膠掃描4D是凝膠層析后樣品電泳后凝膠掃描5是MetMb的分光光度計掃描圖具體實施方式
在本發(fā)明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。
下面結合具體的實施例，并參照附圖數據進一步詳細地描述本發(fā)明。應理解，這些實施例及附圖只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。
實施例1高鐵肌紅蛋白的制備材料新鮮豬心，陰離子交換層析材料(DEAE-Sepharose Fast Flow，Pharmacia)，凝膠過濾層析材料(Sephacryl S-200HR，Amersham-Pharmacia)，馬心肌高鐵肌紅蛋白標準品(Sigma，purity＞90％)，考馬斯亮藍試劑盒，其它試劑均為分析純。肌紅蛋白萃取緩沖液10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0；平衡緩沖液A10mM Tris-HCl，1mMEDTA，10mM NaCl，pH8.5；平衡緩沖液B100mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH7.5。主要儀器及試劑DS-1高速組織搗碎機，FJ-200高速分散勻質機，JB-2型恒溫磁力攪拌器，PHS-3C型精密pH計，BioLogic LP層析系統(tǒng)，Gel Doc2000成像系統(tǒng)，JeDa801凝膠分析軟件，Spectrumlab54紫外可見分光光度計，LGJ1.5冷凍干燥機，LGR10-4.2冷凍高速離心機，Eppendorf 5415R臺式冷凍高速高心機，DYY-12型電泳儀和電泳槽。方法(1)粗提取去掉脂肪和結締組織的新鮮豬心約220克，切成小塊，用冰冷的生理鹽水沖洗，除去殘留的血液。再剁碎，按1∶2的比例(V/M)加入肌紅蛋白萃取緩沖液440ml，用DS-1高速組織搗碎機搗碎。再用FJ-200高速分散勻質機以20000rpm勻漿100s，4℃靜置萃取1h后，以5000rpm，4℃下離心10min，上清液用中速定性濾紙進行粗濾，得粗提液350ml。
(2)鹽析及透析濾液用2M冷銨水調節(jié)pH值至8.0，4℃下，10000rpm離心20min。將盛上清液的燒杯置JB-2型恒溫磁力攪拌器上，緩慢加入固體(NH4)2SO4至70％飽和度，用2M冷銨水調節(jié)pH值至8.0，靜置30min后，4℃下以10000rpm離心20min，棄沉淀。上清液再緩慢加入固體(NH4)2SO4至100％飽和度，用2M冷銨水調節(jié)pH值至8.0。靜置30min，10000rpm離心25min，棄上清，沉淀用冷的平衡緩沖液A重懸。加入過量的K3Fe(CN)6，10000rpm離心10min，取上清對平衡緩沖液A透析(14000MWcut-off)過夜，其間換液3次，得透析液102ml。
(3)離子交換層析得到的透析液以0.4ml/min的流速上樣到用平衡緩沖液A平衡過夜的DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱，以同一緩沖液洗去未結合的蛋白，再用含100mM NaCl的同一緩沖液進行洗脫，洗脫速度為1.25ml/min。280nm下自動檢測并記錄，自動收集洗脫峰對應的洗脫液。層析圖譜如圖1所示，洗脫峰對應的流出液為紅褐色。
(4)凝膠過濾將上述收集的洗脫液經LGJ1.5冷凍干燥機冷凍干燥濃縮后，上樣到用平衡緩沖液B平衡好的Sephacryl S-200HR凝膠過濾層析柱，用同一緩沖液洗脫，洗脫速度為1ml/min，收集紅褐色洗脫液，即得到高鐵肌紅蛋白。層析圖譜如圖2所示，曲線上有3個峰，第一個峰對應的為無色液體，第二個峰對應的為紅褐色液體，第三個峰對應的也為無色液體。
(5)將得到的產品冷凍干燥后，于-80℃保存。
實施例2高鐵肌紅蛋白的定性與定量將實施1中(1)-(4)步驟得到的粗提樣品、透析液樣品、經離子交換層析樣品和經凝膠過濾處理樣品進行SDS-PAGE電泳試驗，結果如圖3所示。電泳后凝膠用Gel Doc2000成像系統(tǒng)拍照后，經JeDa801凝膠分析軟件進行條帶掃描定量分析，結果如圖4。
從圖3及圖4分析可知，粗提樣品中含有的蛋白種類較多，且蛋白之間不能很好分開(圖4A)；經70％-100％硫酸銨分段鹽析并透析后，大致可以看到九個條帶，即主要由九種蛋白質構成，且電泳后凝膠掃描可知，透析后的提取液中MetMb的相對含量為39.29％(圖4B)；再經離子交換層析后，大致由五條帶組成，條帶也較清晰，且MetMb所對應條帶濃度最高，經掃描可知MetMb的相對含量已經達到了88.12％(圖4C)；最后經凝膠過濾后，只留下一個條帶，表明已經純化得到了電泳純的蛋白，含量大于98％(圖4D)，此蛋白的分子量在17000左右。
將凝膠過濾后收集的第二個峰對應的為紅褐色液體和馬心肌高鐵肌紅蛋白標準品進行波長掃描，通過分光光度計掃描圖譜(圖5)，可見它們均在波長為505nm和630nm處分別有特征吸收峰。由此判定該蛋白就是高鐵肌紅蛋白。
權利要求
1.一種從心肌中提取純化高鐵肌紅蛋白的方法，包括以下步驟1)將新鮮動物心肌剁碎，加入冰冷的肌紅蛋白萃取緩沖液，經勻漿、離心、過濾后得粗提液；所說的肌紅蛋白萃取緩沖液是10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0；2)粗提液經70％-100％硫酸銨鹽析，得到的沉淀用平衡緩沖液A重懸，再加入過量的K3Fe(CN)6，離心后取上清液對平衡緩沖液A透析，透析膜的截留分子量為14000，得透析液；所說的平衡緩沖液A是10mM Tris-HCl，1mM EDTA，10mMNaCl，pH8.5；3)將透析液上樣到DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱，用平衡緩沖液A洗脫，收集洗脫峰對應的紅褐色洗液；4)將收集的洗脫液泠凍干燥濃縮后，上樣到Sephacryl S-200HR凝膠過濾層析柱，用平衡緩沖液B洗脫，收集洗脫峰相對應的紅褐色洗脫液，即得到純化的高鐵肌紅蛋白；所說的平衡緩沖液B是100mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH7.5。
2.根據權利要求1所說的從心肌中提取純化高鐵肌紅蛋白的方法其特征在于，其中第2～4步在4℃下進行。
3.根據權利要求1或者2所說的從心肌中提取純化高鐵肌紅蛋白的方法，其特征在于，所說的動物心肌是豬心肌。
4.根據權利要求3所說的從心肌中提取純化高鐵肌紅蛋白的方法，其特征在于，還有步驟5)得到的高鐵肌紅蛋白液經冷凍干燥，于-80℃保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白的提取純化工藝，具體是從心肌中提取純化高鐵肌紅蛋白的方法。具體的方法是將新鮮動物心肌經前處理，萃取得到組織蛋白粗提物；粗提物再經硫酸銨鹽析后，通過截留分子量為14000的透析處理得透析樣品；將透析樣品經DEAE－Sepharose Fast Flow陰離子交換層析，收集紅褐色洗脫液；收集的洗脫液再經Sephacryl S－200HR凝膠過濾層析，收集洗脫峰相對應的紅褐色洗脫液，即得到純化的高鐵肌紅蛋白。本發(fā)明方法具有產品純度高，工藝簡單、成本低等優(yōu)點，既可填補我國該生物試劑制備的空白，又具有較高的經濟價值。
文檔編號C07K14/805GK1800202SQ200610037909
公開日2006年7月12日 申請日期2006年1月20日 優(yōu)先權日2006年1月20日
發(fā)明者金邦荃, 湯祥明, 劉興余 申請人:南京師范大學