專利名稱：：人骨形態(tài)發(fā)生蛋白9重組蛋白質(zhì)核苷酸序列及生產(chǎn)方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種人骨形態(tài)發(fā)生蛋白9重組蛋白質(zhì)核苷酸序列及生產(chǎn)方法和用途。
背景技術(shù)：
：骨骼是一種高度特異化組織，骨組織的成分包括膠原蛋白，蛋白多糖，非膠原蛋白，酯類。貫穿一生的骨組織的更新與修復(fù)由特定的細(xì)胞來完成。骨骼的生長通過成骨細(xì)胞完成，而骨骼的重塑通過破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞共同完成。在病理情況下，應(yīng)用促進骨骼生長的因子可治療骨折。這些因子可促進開放性骨折的愈合及改善人工關(guān)節(jié)的固定，修復(fù)先天性、創(chuàng)傷性顱骨缺損，應(yīng)用于整容手術(shù)。此外，還可用于牙周或其他牙齒修復(fù)的治療。目前對于骨折、顱骨和牙周缺損的治療方法是進行骨移植或置入人工化合物。自體移植的成功率很高，但其缺點是會造成手術(shù)創(chuàng)傷和可應(yīng)用的的移植骨數(shù)量有限。也可應(yīng)用異體骨。但其具有潛在傳播疾病的風(fēng)險。也可應(yīng)用陶瓷或金屬制品，但它們只是骨附著物，新骨只在其附近或正常骨周圍生長。因此，我們需要一種生理上可接受的生物制劑，它可在預(yù)知位點促進骨骼的形成。它可吸引、刺激成骨細(xì)胞或促進成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞的分化?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)了多種促進骨形成的生長因子，但獲得純化的骨生長因子的過程和技術(shù)仍不明朗，處于開始階段。因此，將高度純化的哺乳細(xì)胞的骨生長因子應(yīng)用在骨科疾病的研究、診斷和治療過程中，還需要生物化學(xué)和生理學(xué)方面的深入研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種人骨形態(tài)發(fā)生蛋白9重組蛋白質(zhì)核苷酸序列及生產(chǎn)方法和用途。一種分離的DNA分子，它編碼人骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(BMP-9)核苷酸序列。一種蛋白質(zhì)哺乳細(xì)胞及大腸桿菌表達(dá)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白9重組蛋白質(zhì)。一種載體將編碼BMP-9核苷酸序列基因段重組于質(zhì)粒載體，當(dāng)該質(zhì)粒載體在哺乳細(xì)胞和大腸桿菌擴增時，重組BMP-9得以表達(dá)。一種宿主細(xì)胞使重組BMP-9在其表達(dá)的哺乳細(xì)胞及大腸桿菌宿主細(xì)胞。一種人骨形態(tài)發(fā)生蛋白9重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，其特征在于方法的步驟如下人骨形態(tài)發(fā)生蛋白9重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法的步驟如下在哺乳細(xì)胞1)利用RNA逆轉(zhuǎn)錄-多聚核苷酸鏈反應(yīng)，合成人BMP-9的cDNA，RNA提取自人成骨細(xì)胞株U2-OS細(xì)胞，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；2)將cDNA克隆至pcDNA3載體，這一BMP-9/pcDNA3表達(dá)質(zhì)粒適合BMP-9蛋白在哺乳細(xì)胞的表達(dá)；3)利用DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法，將人BMP-9cDNA轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞；4)通過新霉素篩選和細(xì)胞克隆，獲得穩(wěn)定表達(dá)人BMP-9的單克隆細(xì)胞株，用Northern印漬的方法，測出人BMP-9在CHO細(xì)胞的表達(dá)；5)收集培養(yǎng)CHO/BMP-9細(xì)胞的條件培養(yǎng)液，將此培養(yǎng)液加入到成骨細(xì)胞中測定BMP-9活性。在大腸桿菌1)將人BMP-9成熟肽的cDNA克隆至pGEM-GST-KG載體，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)至DH5α大腸桿菌中；2)含有人BMP-9的大腸桿菌培養(yǎng)液蛋白經(jīng)過凝膠電泳和離子交換層析方法純化，然后經(jīng)過透析及復(fù)性處理冷凍干燥后，制成純化的，有活性的人BMP-9重組蛋白質(zhì)。人骨形態(tài)發(fā)生蛋白9重組蛋白質(zhì)用于制備刺激成骨細(xì)胞分化和新骨形成、促進骨折愈合，治療骨折、骨缺損疾病的藥物。本發(fā)明的優(yōu)點是1.利用哺乳細(xì)胞和大腸桿菌首次成功表達(dá)人BMP-9重組蛋白質(zhì)；2.人重組BMP-9蛋白質(zhì)經(jīng)復(fù)性處理后，具有完整性的生物活性；3.BMP-9重組蛋白質(zhì)具有刺激成骨細(xì)胞分化和骨形成的功能；4.BMP-9重組蛋白質(zhì)具有促進骨缺損和骨折修復(fù)的用途。圖1是BMP-9cDNA核苷酸序列及BMP-9蛋白質(zhì)氨基酸序列；圖2是BMP-9刺激成骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性示意圖；圖3是BMP-9刺激堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)和骨特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Runx2mRNA的表達(dá)示意圖；圖4是BMP-9刺激成骨細(xì)胞骨小結(jié)的形成示意圖；圖5是BMP-9刺激小鼠顱骨表面新骨形成示意圖；圖6是BMP-9誘導(dǎo)小鼠異位骨形成示意圖，左、中(a、b)圖為X一光攝相，右(c)圖為組織切片示意圖；圖7a是BMP-9誘導(dǎo)大鼠顱骨骨缺損的下X-光攝相示意圖；圖7b是BMP-9誘導(dǎo)大鼠顱骨缺損的組織切片示意圖；圖8是BMP-9促成骨痂形成和骨折修復(fù)示意圖。具體實施例方式人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9(BMP-9)的cDNA序列和蛋白質(zhì)氨基酸序列見圖1。人BMP-9的cDNA含有1,942個核苷酸。5′端非編碼序列有163個核苷酸，3′端非編碼序列有489個核苷酸。人BMP-9含有429個氨基酸殘基。通過SDS-PAGE法測得的人BMP-9蛋白質(zhì)的分子量約28,000-32,000道爾頓(28-32kDa)，在SDS-PAGE還原狀態(tài)中，該蛋白質(zhì)的分子量約為14,000-22,000道爾頓(14-22kDa)。在本項發(fā)明中，我們首先利用RNA逆轉(zhuǎn)錄-多聚核苷酸鏈反應(yīng)(RT-PCR)的技術(shù)，合成了人BMP-9的cDNA，RNA提取自人成骨細(xì)胞株U2-OS細(xì)胞，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后將cDNA克隆至pcDNA3載體，這一BMP-9/pcDNA3表達(dá)質(zhì)粒(Expressionplasmid)適合BMP-9蛋白在哺乳細(xì)胞的表達(dá)。利用DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(Stabletransfection)的方法，我們將人BMP-9cDNA轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。通過新霉素篩選和細(xì)胞克隆，獲得了穩(wěn)定表達(dá)人BMP-9的單克隆細(xì)胞株。用Northern印漬(Northernblot)的方法，測出人BMP-9在CHO細(xì)胞的表達(dá)。然后我們收集了培養(yǎng)CHO/BMP-9細(xì)胞的條件培養(yǎng)液。將此培養(yǎng)液加入到原代大鼠成骨細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)液可刺激大鼠成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶(ALP)活性，骨鈣素(Osteocalcin，OC)和骨特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Runx2基因的表達(dá)和促進體外骨小結(jié)(Bonenodule)的形成。這些結(jié)果證實BMP-9具有刺激成骨細(xì)胞分化作用。我們?nèi)缓髮⑷薆MP-9成熟肽的cDNA克隆至pGEM-GST-KG載體，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)(transform)至DH5α大腸桿菌中。含有人BMP-9的大腸桿菌培養(yǎng)液蛋白經(jīng)過凝膠電泳(Gelfiltration)和離子交換層析(IonExchange)方法純化后，經(jīng)過透析及復(fù)性處理冷凍干燥后，制成純化的，有活性的人BMP-9重組蛋白質(zhì)。經(jīng)離體與在體實驗測定后，證明此重組蛋白質(zhì)具有成骨功能活性。BMP-9重組蛋白質(zhì)的主要功能1)骨折修復(fù)。人BMP-9可用于促進各類臨床骨折的愈合。對于難愈合性骨折(Non-unionfracture)，目前臨床上尚無有有效的治療方法，應(yīng)用BMP-9，可有效地促進難愈合性骨折的愈合。重組BMP-9可注射于骨折部位或與I型膠原或聚丙烯等載體制成復(fù)合的生物材料敷于骨折部位，促進骨折的愈合。2)骨缺損的修復(fù)。由骨腫瘤手術(shù)后或創(chuàng)傷后造成的大塊骨缺損(Segmentalbonedefect)，在臨床上，目前只有用骨移植的方法進行治療，且療效往往不成功。用人BMP-9與其載體制成的復(fù)合物填充于骨缺損部位，可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖與分化，保進新骨的形成。顱骨或頜面骨的缺損也可用人BMP-9治療。3)用于脊柱融合。脊柱融合(Spinalfusion)是骨科常見手術(shù)，將BMP-9用于手術(shù)部位，可促進脊柱融合，加快手術(shù)后的愈合過程，大大縮短病人的住院時間和愈合時間。4)牙周骨修復(fù)和根管療法。中年以上的病人，尤其婦女，伴隨全身骨組織的丟失，牙周骨也有不同程度的缺損，嚴(yán)重時，可致牙齒脫落。人BMP-9可與載體制成復(fù)合物，種植于牙周骨組織內(nèi)，促進新骨形成。此一治療可用于種植牙(Toothimplant)手術(shù)前。5)用于伴有骨丟失的代謝性骨病。許多代謝性骨病伴有嚴(yán)重的骨丟失，其中最常見和最嚴(yán)重的是骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis)。骨質(zhì)疏松癥多發(fā)于絕經(jīng)后婦女，其機體骨吸收大于骨形成而造成骨重塑(Boneremodeling)的負(fù)平衡。目前臨床上常用的治療骨質(zhì)疏松病的藥物為雙磷酸鹽類藥物(Bisphosphonates)，該藥物可有效地抑制骨吸收，防止骨組織的進一步丟失。目前臨床上尚無有效藥物促進骨形成，使骨質(zhì)疏松癥病人的丟失的骨重新建立。動物實驗發(fā)現(xiàn)BMP-9可逆轉(zhuǎn)卵巢去除后造成的骨丟失，具有良好的治療骨質(zhì)疏松癥的前景。BMP-9還可用于其它原因造成的全身性骨丟失，如腫瘤轉(zhuǎn)移造成的骨丟失。6)用于治療軟骨疾病。人BMP-9還有促進軟骨細(xì)胞(Chondrocyte)的成熟和分化的功能。BMP-9可促進軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肥大軟骨細(xì)胞(Hypertrophicchondrocyte)，促進軟骨細(xì)胞特異性基因，如X型膠原(TypeXcollagen)，MMP-9，骨橋蛋白(Osteopontin)等的表達(dá)。人BMP-9可用于治療各類軟骨發(fā)育不良綜合癥(Chondrodysplasia)。7)用于糖尿病的治療。近年來的動物實驗，還發(fā)現(xiàn)BMP-9可升高血液中胰島素(Insulin)的水平和降低血糖水平，糾正動物實驗性糖尿病。因此，人BMP-9重組蛋白質(zhì)還具有治療糖尿病的臨床用途。實施例1、人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9的核苷酸和氨基酸序列?？寺『捅磉_(dá)的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9(BMP-9)cDNA的核苷酸序列和蛋白質(zhì)的氨基酸序列(圖1)。實施例2、用哺乳細(xì)胞表達(dá)人BMP-9。為在哺乳細(xì)胞表達(dá)人BMP-9蛋白，將編碼的全長人BMP-9cDNA克隆至哺乳細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3中。轉(zhuǎn)染方法為用lipofectamineplus試劑的方法。轉(zhuǎn)染細(xì)胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。由于pcDNA3質(zhì)粒含有抗新霉素(Neomycin)的基因，在pcDNA3/BMP-9表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞后，新霉素被加入到培養(yǎng)液中，表達(dá)BMP-9的細(xì)胞株具有抗新霉素的特性，其他細(xì)胞則被新霉素殺死。然后克隆此穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞?？寺〖?xì)胞的方法為有限稀釋(Limitingdilution)的方法。耐新霉素的細(xì)胞被稀釋成1個細(xì)胞/200微升培養(yǎng)液并加入到96孔培養(yǎng)皿中(每孔200微升)。2-3周后，此單克隆細(xì)胞株長成細(xì)胞群。然后經(jīng)蛋白酶(Trypsin)消化后，轉(zhuǎn)至24孔板培養(yǎng)皿，后經(jīng)6孔板培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶(Flask)培養(yǎng)后，將該細(xì)胞株液氮保存?；钚詼y定收集不含血清的或含低濃度血清(1％)的表達(dá)人BMP-9的細(xì)胞株的條件培養(yǎng)液，經(jīng)對倍稀釋后，與成骨細(xì)胞培養(yǎng)24小時，檢測此條件培養(yǎng)液對成骨細(xì)胞(Osteoblast)堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase)的刺激活性。此細(xì)胞株為小鼠C2C12細(xì)胞，實驗證明CHO細(xì)胞表達(dá)的人BMP-9具有刺激成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性，其活性在3-12倍之間，并呈計量依賴(Dose-dependent)的方式。該條件培養(yǎng)液對成骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)的刺激作用由瞬時PCR(Real-timePCR)的方法測定。該條件培養(yǎng)液與成骨細(xì)胞培養(yǎng)后，成骨細(xì)胞的I型膠原(TypeIcollagen)，骨橋蛋白(Osteopontin)RNA的表達(dá)均顯著增加。將此條件培養(yǎng)液與成骨細(xì)胞培養(yǎng)10天后，用福爾馬林固定，經(jīng)vonKossa染色后，表明此條件培養(yǎng)液對成骨細(xì)胞骨小結(jié)(Bonenodule)的形成有刺激作用。這些實驗結(jié)果表明，用CHO細(xì)胞表達(dá)的人BMP-9的重組蛋白質(zhì)具有刺激成骨細(xì)胞分化的活性。實施例3、用大腸桿菌表達(dá)人BMP-9。用PCR的方法擴增人BMP-9成熟片斷的cDNA。人BMP-9基因庫存儲號為AF188285，上游引物核苷酸序列為caccatgagcgccggggctggcag和下游引物核苷酸序列為ctacctgcacccacactctg。PCR試劑包括1微升上游引物(10nM)，1微升下游引物(10nM)，1微升cDNA模板和17微升PlatenumPCRSupermix。PCR條件為95℃/5分鐘；95℃/30秒，56℃/30秒，72℃/40秒，35個循環(huán)(cycles)，72℃/2分鐘。PCR產(chǎn)物(300-bp)經(jīng)2％的瓊脂膠分離后，由QiagenDNA純化試劑盒純化，然后由20微升TE緩沖液再溶解。克隆BMP-9PCR產(chǎn)物至表達(dá)載體為引入與表達(dá)載體一致的適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(Restrictionsite)我們先將BMP-9的PCR產(chǎn)物克隆至pGEMT-Easy載體(Promega)。DNA連結(jié)反應(yīng)的條件如下10微升PCR產(chǎn)物，1微升PGERT-Easy載體，1.5微升T4DNA連結(jié)酶緩沖液，1微升T4DNA連結(jié)酶，加水至15微升。DNA連結(jié)反應(yīng)為16℃，過夜。連結(jié)反應(yīng)后，DNA經(jīng)熱休克的方法轉(zhuǎn)導(dǎo)(Transform)至DH5α菌株。接種DH5α菌株的至接種板(Plate)含有IPTG和X-gal。經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)后，選出白色菌落(Colony)，并接種于2ml含氨芐青霉素(Ampicillin)的LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)。用QiagenDNA純化試劑盒純化BMP-9/pGEMT-Easy質(zhì)粒(Plasmid)，純化的質(zhì)粒經(jīng)EcoRI消化(37℃，1h)后，經(jīng)2％的瓊脂膠分離和純化出300-bp的BMP-9DNA片斷。此一DNA片斷的5’和3’端含有EcoRI的酶切位點。pGEM-GST-KG載體為BMP-9的表達(dá)載體，此一載體經(jīng)EcoRI消化后，做脫磷酸處理，處理過的載體經(jīng)純化后與純化的BMP-9cDNA片斷做連結(jié)反應(yīng)(Ligation)，反應(yīng)條件如前敘。連結(jié)反應(yīng)的產(chǎn)物導(dǎo)入(Transform)DH5α菌株，選擇單克隆菌落(Colony)并培養(yǎng)于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液。DNA純化后，BMP-9在pGEM-GST-KG載體中的方向(Orientation)和核苷酸序列由DNA測序鑒定。純化BMP9-GST融合蛋白1)將表達(dá)BMP-9的DH5α菌株在5ml的LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)(37℃)，然后將此5ml的飽和菌液加入至50毫升LB培養(yǎng)液中在室溫下培養(yǎng)至OD600值在0.6-0.7，然后加入IPTG(0.1mM)誘導(dǎo)BMP-9表達(dá)，IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為30℃，3小時。培養(yǎng)結(jié)束時的OD600值應(yīng)為1.2-1.3。然后將培養(yǎng)細(xì)胞離心6,000xg，10分鐘。2)將細(xì)胞在-80℃低溫冰箱中冷凍1小時，然后化解細(xì)胞并加入酶蛋白抑制劑，超聲裂解細(xì)胞4-6次，每次10秒，間隔45秒，加入TritonX-100試劑(終濃度為1％)，震蕩20分鐘，離心細(xì)胞裂解物(10,000xg，15分鐘)后，將上清(Supernatant)轉(zhuǎn)移至一干凈試管中。3)加1毫升75％的GlutathioneSepharose勻漿洗凈上清液。震蕩2小時(4℃)，使蛋白與GlutathioneSepharose結(jié)合，通過離心(500xg，2分鐘)去除未結(jié)合的蛋白，用冷PBS-T溶液洗樹脂(Resin)2次和用冷PBS溶液洗樹脂1次。4)用1毫升的洗脫緩沖液(Elutionbuffer)[(100mMTris，pH8.5-9.0；20mM還原的谷胱甘肽(Glutathione)]與樹脂培養(yǎng)10分鐘，離心樹脂和收集上清液。用SDS-PAGE膠純化的蛋白并用Coomassieblue染色方法檢測BMP-9的蛋白的表達(dá)。用含有20％甘油(Glycerol)的PBS透析(Dialysis)和復(fù)性處理洗脫的蛋白，并將此蛋白粗提物凍存于-80℃低溫冰箱。含有人BMP-9的大腸桿菌培養(yǎng)液蛋白經(jīng)過凝膠電泳(Gelfiltration)和離子交換層析(IonExchange)方法純化后，經(jīng)冷凍干燥后，制成純化的、有活性的人BMP-9重組蛋白質(zhì)。實施例4、重組BMP-9刺激成骨細(xì)胞分化。將原代大鼠顱骨成骨細(xì)胞接種(Plate)于24孔培養(yǎng)皿中，細(xì)胞培養(yǎng)液為αMEM和10％小牛血清。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70％融合時，在培養(yǎng)液中加入BMP-9，培養(yǎng)24小時后，用0.05％的TritonX-100試劑提取細(xì)胞溶解產(chǎn)物(Celllysate)，然后用Sigma堿性磷酸酶試劑盒檢測堿性磷酸酶活性。BMP-9刺激成骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性(圖2)。將BMP-9與原代大鼠顱骨成骨細(xì)胞(Osteoblast)培養(yǎng)4和8天后，從細(xì)胞中提取RNA并用Northern印漬的方法檢測成骨細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA表達(dá)的變化。BMP-9可促進成骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)，骨鈣素(Osteocalcin，OC)和骨特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Runx2mRNA的表達(dá)(圖3)。此外，將原代大鼠顱骨成骨細(xì)胞接種(Plate)于24孔培養(yǎng)皿中，細(xì)胞培養(yǎng)液為αMEM和10％小牛血清。待細(xì)胞融合(Confluence)后(此時定為零天)，細(xì)胞培養(yǎng)液換為αMEM/5％小牛血清/5mMβ-磷酸甘油(β-glycerophosphate)/100μg/ml維生素C(AscorbicAcid)及不同劑量的BMP-9(50和200ng/ml)。細(xì)胞培養(yǎng)于CO2溫箱中，每兩天換一次培養(yǎng)液，每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞變化和骨小結(jié)(Bonenodule)是否形成。細(xì)胞培養(yǎng)中止于10天。經(jīng)福爾馬林固定后，用vonKossa方法染色，然后用連接于顯微鏡的計算機和OsteoMeasure軟件系統(tǒng)計算骨小結(jié)的形成量，BMP-9呈劑量依賴的方法促進骨小結(jié)的形成(圖4)。實施例5、重組BMP-9刺激骨形成。BMP-9(500μgBMP-9/公斤體重)連續(xù)5天皮下注射于一月齡的ICRSwiss小鼠的顱骨表面。注射完成兩周后，將動物處死，將顱骨取出，經(jīng)福爾馬林固定，用12％EDTA脫鈣兩周后，用石蠟(Paraffin)包埋，經(jīng)組織切片，H&E染色后，觀察顱骨表面的新骨形成，并用OsteoMeasure軟件系統(tǒng)測量新骨的骨量。實驗證明，重組BMP-9促進小鼠新骨的形成(圖5)。實施例6、重組BMP-9誘導(dǎo)小鼠異位骨形成。將1mg純化的BMP-9與I型膠原溶液混和后，冰凍干燥，種植于一月齡小鼠股骨附近的肌肉內(nèi)，一個月后，做X光照相，并將動物處死后，將移植部位組織用福爾馬林固定和12％EDTA脫鈣，經(jīng)石蠟包埋后，做組織切片和H&E染色。BMP-9誘導(dǎo)小鼠異位骨形成(圖6)。實施例7、重組BMP-9促進骨缺損的修復(fù)。由骨腫瘤手術(shù)后或創(chuàng)傷后造成的大塊骨缺損(Segmentalbonedefect)，在臨床上，目前只有用骨移植的方法進行治療，且療效往往不成功。用人BMP-9與其載體制成的復(fù)合物填充于骨缺損部位，可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖與分化，保進新骨的形成。將BMP-9與脫鈣骨基質(zhì)混和后，將二月齡大鼠顱骨表皮做手術(shù)切開，用特制的手術(shù)電鉆制成1cm的圓形骨缺損。將BMP-9/脫鈣骨基質(zhì)混合物種植于骨缺損處。對照組大鼠種植不含BMP-9的脫鈣骨基質(zhì)。8周后，將大鼠處死，做X光照相，取出顱骨組織，福爾馬林固定，脫鈣，石蠟包埋，組織切片處理后做H&E染色。BMP-9可誘導(dǎo)顱骨骨缺損的修復(fù)，在骨缺損處可觀察到新骨和骨髓腔的形成(圖7)。實施例8、重組BMP-9促進骨折修復(fù)。對于難愈合性骨折(Non-unionfracture)，目前臨床上尚無有有效的治療方法，應(yīng)用BMP-9，可有效地促進難愈合性骨折的愈合。將二月齡的小鼠用Thomas-Einhorn裝置制成股骨骨折后，將BMP-9(0.5mg)連續(xù)7天注射于骨折部位，觀察動物骨折2-3周后骨痂形成和骨折愈合的情況，對照組為注射等量生理鹽水。BMP-9對動物骨折愈合有明顯的促進作用(圖8)。權(quán)利要求1.一種分離的DNA分子，其特征在于它編碼人骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(BMP-9)核苷酸序列。2.一種蛋白質(zhì)，其特征在于哺乳細(xì)胞及大腸桿菌表達(dá)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白9重組蛋白質(zhì)。3.一種載體，其特征在于將編碼BMP-9核苷酸序列基因段重組于質(zhì)粒載體，當(dāng)該質(zhì)粒載體在哺乳細(xì)胞和大腸桿菌擴增時，重組BMP-9得以表達(dá)。4.一種宿主細(xì)胞，其特征在于使重組BMP-9在其表達(dá)的哺乳細(xì)胞及大腸桿菌宿主細(xì)胞。5.一種人骨形態(tài)發(fā)生蛋白9重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，其特征在于方法的步驟如下在哺乳細(xì)胞1)利用RNA逆轉(zhuǎn)錄-多聚核苷酸鏈反應(yīng)，合成人BMP-9的cDNA，RNA提取自人成骨細(xì)胞株U2-OS細(xì)胞，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；2)將cDNA克隆至pcDNA3載體，這一BMP-9/pcDNA3表達(dá)質(zhì)粒適合BMP-9蛋白在哺乳細(xì)胞的表達(dá)；3)利用DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法，將人BMP-9cDNA轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞；4)通過新霉素篩選和細(xì)胞克隆，獲得穩(wěn)定表達(dá)人BMP-9的單克隆細(xì)胞株，用Northern印漬的方法，測出人BMP-9在CHO細(xì)胞的表達(dá)；5)收集培養(yǎng)CHO/BMP-9細(xì)胞的條件培養(yǎng)液，將此培養(yǎng)液加入到成骨細(xì)胞中測定BMP-9活性。在大腸桿菌1)將人BMP-9成熟肽的cDNA克隆至pGEM-GST-KG載體，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)至DH5α大腸桿菌中；2)含有人BMP-9的大腸桿菌培養(yǎng)液蛋白經(jīng)過凝膠電泳和離子交換層析方法純化，然后經(jīng)過透析及復(fù)性處理冷凍干燥后，制成純化的，有活性的人BMP-9重組蛋白質(zhì)。6.一種人骨形態(tài)發(fā)生蛋白9重組蛋白質(zhì)的用途，其特征在于它用于制備刺激成骨細(xì)胞分化和新骨形成、促進骨折愈合，治療骨折、骨缺損疾病的藥物。全文摘要本發(fā)明公開了一種人骨形態(tài)發(fā)生蛋白9重組蛋白質(zhì)核苷酸序列及生產(chǎn)方法和用途。一種分離的DNA分子，它編碼人骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(BMP－9)核苷酸序列。一種蛋白質(zhì)哺乳細(xì)胞及大腸桿菌表達(dá)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白9重組蛋白質(zhì)。一種載體將編碼BMP－9核苷酸序列基因段重組于質(zhì)粒載體，當(dāng)該質(zhì)粒載體在哺乳細(xì)胞和大腸桿菌擴增時，重組BMP－9得以表達(dá)。一種宿主細(xì)胞使重組BMP－9在其表達(dá)的哺乳細(xì)胞及大腸桿菌宿主細(xì)胞。人骨形態(tài)發(fā)生蛋白9重組蛋白質(zhì)用于制備刺激成骨細(xì)胞分化和新骨形成、促進骨折愈合，治療骨折、骨缺損疾病的藥物。本發(fā)明的優(yōu)點是1.利用哺乳細(xì)胞和大腸桿菌首次成功表達(dá)人BMP－9重組蛋白質(zhì)；2.BMP－9重組蛋白質(zhì)具有刺激骨形成，促進骨缺損和骨折修復(fù)的功能。文檔編號C07K14/435GK1844391SQ200610050518公開日2006年10月11日申請日期2006年4月26日優(yōu)先權(quán)日2006年4月26日發(fā)明者陳棣,耿健晨,李恒林,鮑憶申請人:嘉興波億生物科技開發(fā)有限公司