專利名稱：一種獲得具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能蛋白片段的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物領(lǐng)域中一種獲得具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能蛋白片段的方法。
背景技術(shù)：
普遍認(rèn)為蛋白質(zhì)的多肽骨架是由具有一定結(jié)構(gòu)、功能的小片段組成的。序列和結(jié)構(gòu)分析表明，這些小片段的集合能夠折疊成相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域(domain)(Doolittle，R.F.，The multiplicity of domains in proteins.Annu.Rev.Biochem.1995，64287-314；Thornton，J.M.，Orengo，C.A.，Todd，A.E.&Pearl，F(xiàn).M.，Protein folds，functions and evolution.J.Mol.Biol.1999，293333-342；Apic，G.，Gough，J.&Teichmann，S.A.，Domain combinations in archaeal，eubacterialand eukaryotic proteomes.J.Mol.Biol.2001，310311-325.)。在某特定位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)(酶)進(jìn)行操作，如將其分為兩部分、環(huán)狀排列蛋白序列(circularpermutation)或者插入外源蛋白片段等，蛋白質(zhì)(酶)依然能夠保持活性，上述結(jié)果也表明蛋白質(zhì)是小多肽的集合(Regan，L.，Protein redesign.Curr.Opin.Struct.Biol.1999，9494-499.)。這些研究引起了人們尋找這些特殊位點(diǎn)，即尋找具有一定結(jié)構(gòu)、功能蛋白片段的關(guān)注，因?yàn)檫@對(duì)研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系以及蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理等具有重要意義。在此基礎(chǔ)上，甚至可以構(gòu)建出自然界不存在的新的功能酶。對(duì)HIV等病毒的表面抗原蛋白的研究表明，一些抗原決定位點(diǎn)包裹于蛋白內(nèi)部，從而逃脫了免疫細(xì)胞的攻擊。因此找到這些決定位點(diǎn)并且暴露出來，將會(huì)極大地促進(jìn)病毒疫苗的研究。由此可見獲得能夠獨(dú)立表達(dá)的蛋白片段是非常必要和有意義的。
目前，蛋白質(zhì)切割的方法主要有蛋白質(zhì)水解法、化學(xué)裂解法、以及利用蛋白質(zhì)及基因工程的方法合成相應(yīng)蛋白片斷等方法，如對(duì)大腸桿菌(Escherichia.coli)的色氨酸合成酶的α亞基(tryptophan synthase αsubunitTSα)進(jìn)行蛋白酶處理，獲得兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(1-188a.a和189-268a.a)(Higgins，W.，F(xiàn)airwell，T.&Miles，E.W.，An active proteolytic derivative of the subunit of tryptophan synthase.Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments.Biochemistry，1979，184827-4835.)。Hiraga K.等人利用色氨酸合成酶α亞基的N端和C端的功能互補(bǔ)以及通過色氨酸合成酶的酶活選擇方法，獲得該蛋白的結(jié)構(gòu)功能單元(Hiraga，K.，Yamagishi，A.，and Oshima，T.，Mapping of unit boundariesof a proteinexhaustive search for permissive sites for duplication bycomplementation analysis of random fragment libraries of tryptophan synthaseαsubunit.J.Mol.Biol.2004，3351093-1104)?；诘鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)信息分析，設(shè)計(jì)相應(yīng)的蛋白片斷來研究其折疊性能的方法(Zitzewitz，J.A.，Gualfetti，P.J.，Perkons，I.A.，Wasta，S.A.&Matthews，C.R.，Identifying the structuralboundaries of independent folding domains in the alpha subunit of tryptophansynthase，a beta/alpha barrel protein.Protein Sci.，1999.8(6)1200-1209)，以及結(jié)合PDB蛋白數(shù)據(jù)庫發(fā)展起來的結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)方法(Fischer KF，Marqusee S.，A rapid test for identification of autonomous folding units in proteins.J.Mol.Biol.2000，302(3)701-712)等也有報(bào)道。
但這些現(xiàn)有的研究方法需要對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或者功能具有比較清楚的了解(蛋白結(jié)構(gòu)被解析或者確定的酶活檢測(cè)方法)，且利用蛋白酶水解法或化學(xué)裂解法只能對(duì)特殊位點(diǎn)進(jìn)行操作，因而能夠獲得的數(shù)據(jù)非常有限。由于人們對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能間的關(guān)系了解有限，另外由于現(xiàn)有方法的篩選庫比較小、且操作復(fù)雜、耗時(shí)費(fèi)力，因此現(xiàn)有方法都存在一定的局限性，很難廣泛應(yīng)用并且達(dá)到快速篩選具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段的目的。
在宿主細(xì)胞(尤其是大腸桿菌)內(nèi)，蛋白質(zhì)大量表達(dá)經(jīng)常會(huì)引起蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊甚至聚集沉淀。盡管在蛋白質(zhì)體外復(fù)性方面已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究工作，但目前還沒有行之有效的方法。Geoffrey等人(Geoffrey S.W.，Blake M.S.，Joel B.，ThomasC.T.，Rapid protein-folding assay using green fluorescent protein，NatureBiotechnology，1999，17691-695)構(gòu)建了含有蛋白質(zhì)正確折疊報(bào)告蛋白的載體，即在GFP基因的N-端通過linker與測(cè)試蛋白相連。通過測(cè)試20種外源蛋白表明，大腸桿菌的熒光表達(dá)與GFP基因上游的外源蛋白區(qū)域能夠獨(dú)立、大量的表達(dá)相互依賴。該方法具有檢測(cè)方便，不需要對(duì)目的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析即能有效的判斷外源蛋白的功能表達(dá)特性的特點(diǎn)，但是由于該方法是基于篩選(Screening)來獲得目的片斷的，存在工作量大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)；同時(shí)GFP是比較大的蛋白(28kD)，對(duì)于融合蛋白的大小存在一定的限制。Maxwell等人以提高蛋白的可溶性構(gòu)建了一個(gè)含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloramphenicol acetyl transferase，CAT)的載體(Maxwell，K.，et al.，A simplein vivo assay for increased protein solubility.Protein Science，1999.8(9)1908-1911.)，而F.H.Arnold等用CAT來進(jìn)行預(yù)篩選以方便的獲得的含有雜交蛋白的變種(Sieber，V.，C.Martinez，and F.Arnold，Libraries of hybrid proteins fromdistantly related sequences.Nature Biotechnology，2001，19(5)456-460.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種獲得具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能蛋白片段的方法。
本發(fā)明所提供的獲得具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能蛋白片段的方法，包括以下步驟1)切割編碼蛋白的多核苷酸序列，然后再進(jìn)行重組，得到不同長(zhǎng)度的多核苷酸隨機(jī)片段；2)將步驟1)獲得的多核苷酸隨機(jī)片段連接入含有編碼具有選擇功能的報(bào)告蛋白基因(選擇標(biāo)記基因)的載體中，再將所述重組載體導(dǎo)入宿主，培養(yǎng)宿主，得到具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段。
在上述方法中，步驟1)中編碼蛋白的多核苷酸序列為DNA或RNA，優(yōu)選為雙鏈DNA；切割編碼蛋白的多核苷酸序列的方法為酶法、物理法(如利用超聲波等)或化學(xué)法，其中酶法采用的酶可為DNase、RNase或內(nèi)切酶等，優(yōu)選為DNase I；所述蛋白的選擇是任意的，如色氨酸合成酶α亞基(tryptophan synthaseαsubunit，TSα)、gp120、二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)或胰凝乳蛋白酶抑制劑(chemotrypsin inhibitor)等；可用自身引導(dǎo)(self-priming)的聚合酶反應(yīng)(polymerase reaction)對(duì)經(jīng)隨機(jī)切割的編碼蛋白的多核苷酸序列進(jìn)行重組。
在所述步驟2)中的表達(dá)載體中，多核苷酸隨機(jī)片段與編碼具有選擇功能的報(bào)告蛋白基因可由連接肽編碼序列相連，且多核苷酸隨機(jī)片段位于報(bào)告蛋白基因的上游；所述連接肽可具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列；所述編碼具有選擇功能的報(bào)告蛋白基因可為氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、卡那霉素基因或lacZα基因等；用于構(gòu)建含有編碼具有選擇功能的報(bào)告蛋白基因及連接肽編碼序列的重組載體的出發(fā)載體可為任意一種可在大腸桿菌中表達(dá)外源基因的原核表達(dá)載體，如pUC18、pUC19或pET系列載體，所述pET系列載體包括pET30(a)、pET-22b等，優(yōu)選為pET30(a)。其中，以pET30(a)為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因及連接肽編碼序列的重組載體為pET30(a)-linker-CAT，該載體可作為篩選能夠獨(dú)立折疊的蛋白片段的通用載體使用。
將含有報(bào)告蛋白基因及雙鏈DNA片段的融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌的方法可為生物工程領(lǐng)域中常用的轉(zhuǎn)化方法，如熱激法、電轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法等。所述宿主菌可為適于蛋白表達(dá)的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選為大腸桿菌，如E.coliBL21(DE3)、E.coliXL-1blue或E.coliDH5α等，尤其優(yōu)選為E.coli BL21(DE3)。
本發(fā)明提供了一種基于基因隨機(jī)切割技術(shù)獲得具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段的方法。該方法不具有基因/蛋白的特異性，適用范圍廣，由于CAT蛋白比GFP更小，并且可以利用氯霉素抗性進(jìn)行選擇性篩選(selection)，因此該篩選方法更加方便快速，是尋找具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段簡(jiǎn)單、有效的通用方法。還可用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和折疊機(jī)理的研究和新的功能酶的構(gòu)建。此外，用該方法獲得的具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段可作為抗原用于制備病毒(如禽流感H5N1等)抗體和病毒疫苗。本發(fā)明將在具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段的篩選中發(fā)揮巨大作用。
以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為pET30(a)-linker-CAT的部分物理圖譜圖2為篩選到的TSα片段與全長(zhǎng)序列的位置比較結(jié)果圖3A為TScat-1多肽基因的表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖3B為TScat-2多肽基因的表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖3C為TScat-5多肽基因的表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖4A為TScat-1的鎳柱親和純化的洗脫曲線圖4B為TScat-2的鎳柱親和純化的洗脫曲線圖4C為TScat-5的鎳柱親和純化的洗脫曲線圖5A為TScat-1純化產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖5B為TScat-2純化產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖5C為TScat-5純化產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖6為經(jīng)純化的TScat-1、TScat-2和TScat-5多肽的園二色光譜圖具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所有引物合成及測(cè)序工作均由大連寶生物(TakaRa)或上海生工生物工程公司完成，測(cè)序工作由大連寶生物(TakaRa)或北京三博遠(yuǎn)志公司完成，所有百分比濃度均為質(zhì)量百分比濃度。
實(shí)施例1、具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段的獲得現(xiàn)以色氨酸合成酶α亞基(tryptophan synthase αsubunit，TSα)為例，用本發(fā)明的方法得到具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段，具體過程包括以下步驟一、構(gòu)建含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因及l(fā)inker編碼序列的重組載體1、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的擴(kuò)增以含有CAT基因的質(zhì)粒pACYC184(New England Biolabs)為模板，在兩對(duì)引物P1和P2的引導(dǎo)下，用重疊延伸PCR法(overlap PCR)擴(kuò)增CAT基因，并在CAT基因的上游引入連接肽(linker)編碼序列(編碼序列表中序列1的氨基酸殘基序列)，兩端引入限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III識(shí)別位點(diǎn)，同時(shí)將CAT基因中的限制性內(nèi)切酶EcoR I的識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行無義突變(GAATTC->GAATTT)，引物序列如下P1(用于擴(kuò)增CAT基因的約前220bp序列)F1(正向引物)5’-CCAAGGATCCATGGAGAAAAAAATCACTGGATATAC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI識(shí)別位點(diǎn))R1(反向引物)5’-TTCATTGCCATACGAAATTC-3’；P2(用于擴(kuò)增CAT基因的約后500bp序列)F2(正向引物)5’-CCGGAATTTCGTATGGCAATG-3’R2(反向引物)5’-AGACCAAGCTTTTACGCCCCGCCCTGCCACTC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Hind III識(shí)別位點(diǎn))先分別在引物對(duì)P1和P2的引導(dǎo)下，用常規(guī)的PCR方法擴(kuò)增出CAT基因的兩個(gè)片段，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為220bp和500bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符。各取少量的擴(kuò)增出的CAT基因的兩個(gè)片段，再在正向引物F1和反向引物R2的引導(dǎo)下，用重疊延伸PCR法獲得全長(zhǎng)的CAT基因。
2、含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因及l(fā)inker編碼序列的重組載體的獲得用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III分別對(duì)重組質(zhì)粒pET30(a)-linker-GFP(Shuang Li，Zhen Cai，Yong Chen & Zhanglin Lin，Dissectionof SARS coronavirus spike protein into discrete folded fragments，TsinghuaScience and Technology，received)和步驟1擴(kuò)增的CAT基因進(jìn)行雙酶切后，將兩種酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性重組子，提質(zhì)粒，得到含有CAT基因及l(fā)inker編碼序列的重組質(zhì)粒，命名為pET30(a)-linker-CAT，其部分物理圖譜如圖1所示(其余部分與pET30(a)相同)，該載體可作為篩選能夠獨(dú)立折疊的蛋白片段的通用載體使用。
二、TSα基因的擴(kuò)增以TSα基因的cDNA(GenBank號(hào)946204)為模板，在正向引物P35’-CTATGGAACGCTACGAATCTCT-3’和反向引物P45’-AACTGCGCGTCGCCGCTTTCATC-3’的引導(dǎo)下，用常規(guī)的PCR方法擴(kuò)增TSα基因，該P(yáng)CR反應(yīng)的退火溫度(AnnealingTemperature)為45℃，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收約800bp的目的片段，用Qiagen公司的DNA片段純化試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化。
三、TSα基因的隨機(jī)切割1)取步驟二中純化的TSα基因0.1-5μg，加入反應(yīng)管中，再向反應(yīng)管中添加以下試劑1M Tris-Cl(pH7.5)2.5μl，50mM MnCl210μl，用雙蒸水補(bǔ)充反應(yīng)體系至50μl。然后15℃保溫10min，再加入1.5μl DNaseI(5U/μl，使用前用50mMTris-ClpH7.5按1∶100比例進(jìn)行稀釋)到反應(yīng)管中，15℃反應(yīng)4min；2)加入EDTA至終濃度為50mM用以終止反應(yīng)；3)加熱至90℃，保溫10min使DNase I失活；4)用頗爾公司(Pall Ltd.)Nanosep系列純化柱回收并純化長(zhǎng)度為50-100bp的雙鏈DNA片段。
四、TSα基因的重組采用自身引導(dǎo)(self-priming)的聚合酶反應(yīng)(polymerase reaction)，即不加入引物的聚合酶反應(yīng)對(duì)步驟三獲得的TSα基因隨機(jī)切割片段進(jìn)行重組，具體步驟如下取TSα基因隨機(jī)切割片段0.1-5μg，先加熱到94-95℃，再冷卻到45-55℃，然后在60-72℃下用1-50U/μg Taq聚合酶進(jìn)行聚合酶反應(yīng)0.5-2分鐘，用頗爾公司Nanosep系列純化柱回收并純化長(zhǎng)度為50-1000bp的雙鏈DNA片段。
五、含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因及50-1000bp雙鏈DNA片段的融合表達(dá)載體的構(gòu)建1)用限制性內(nèi)切酶EcoR I對(duì)質(zhì)粒pET30(a)-linker-CAT進(jìn)行酶切；2)按常規(guī)方法對(duì)步驟四經(jīng)重組的長(zhǎng)度為50-1000bp的TSα基因隨機(jī)切割片段和經(jīng)單酶切后的線性質(zhì)粒進(jìn)行平末端化處理，具體方法為加入T4DNA聚合酶(2U酶/μgDNA)，12℃保溫10-40min，然后加熱至75℃20min使酶失活；3)將經(jīng)平末端化處理的長(zhǎng)度為50-1000bp的TSα基因隨機(jī)切割片段和經(jīng)單酶切后的線性質(zhì)粒用T4DNA連接酶連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性重組子，提質(zhì)粒，得到含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因及經(jīng)重組的50-1000bp TSα基因隨機(jī)切割片段的融合表達(dá)載體。
六、E.coli BL21(DE3)的轉(zhuǎn)化及表達(dá)將融合表達(dá)載體用熱激法轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂于卡那霉素(Kanamycine)LB抗性平板(每升培養(yǎng)基含胰蛋白胨10.0g，酵母浸膏粉5.0g，NaCl 10.0g，瓊脂15.0g，pH7.0，50μg/mL卡那霉素)上，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，將其接種于含0.5mM IPTG和40μg/mL氯霉素的LB平板上，在30℃下誘導(dǎo)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因及50-1000bp雙鏈DNA片段融合基因表達(dá)。
七、大規(guī)模(large-scale)篩選能夠獨(dú)立表達(dá)的TSα蛋白片段1、菌落PCR檢測(cè)以步驟六獲得的表達(dá)有乙酰轉(zhuǎn)移酶基因及50-1000bp雙鏈DNA片段融合基因的重組菌為模板，在引物P55’-TAAGAAGGAGATATACATAATG-3’和引物P65’-CTAGGAGAACCAGCAGCACTCGAGCCA-3’的引導(dǎo)下，按常規(guī)的菌落PCR方法檢測(cè)插入的TSα基因片段，挑選具有不同大小的插入片段的菌株，測(cè)序、分析插入片段的氨基酸結(jié)構(gòu)、功能特征。通過表達(dá)、篩選到的TSα多肽片段與全長(zhǎng)序列的比較結(jié)果如圖2所示(多肽片段相應(yīng)名稱標(biāo)示于多肽片段上方，相對(duì)于原始全長(zhǎng)基因的起始終點(diǎn)位置標(biāo)在相應(yīng)片段的下方；其中F73，G170和R189表示文獻(xiàn)報(bào)道可能的切割位點(diǎn))，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(Higgins，W.，F(xiàn)airwell，T.&Miles，E.W.An active proteolytic derivativeof the a subunit of tryptophan synthase.Identification of the site of cleavageand characterization of the fragments.Biochemistry，1979，184827-4835)，TSα蛋白能夠在R189處斷開，也有文獻(xiàn)報(bào)道(Hiraga，K.，Yamagishi，A.，and Oshima，T.，Mapping of unit boundaries of a proteinexhaustive search for permissivesites for duplication by complementation analysis of random fragment librariesof tryptophans α subunit J.Mol.Biol.2004，3351093-1104)在F73和G170兩個(gè)位置斷開。另外來自對(duì)TSα蛋白的N端一系列遞增的大于100個(gè)氨基酸的片段研究表明，這些片段都存在典型的二級(jí)結(jié)構(gòu)，隨著其氨基酸的個(gè)數(shù)的增加，其結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，其中蛋白片段1-188a.a是一個(gè)穩(wěn)定且能獨(dú)立表達(dá)的蛋白片段(Zitzewitz，J.A.，Gualfetti，P.J.，Perkons，I.A.，Wasta，S.A.&Matthews，C.R.，Identifyingthe structural boundaries of independent folding domains in the alpha subunitof tryptophan synthase，a beta/alpha barrel protein.Protein Sci.，1999.8(6)1200-1209)。
2、氯霉素抗性分析對(duì)步驟1獲得的重組菌(其中含有的TSα片段名稱見表1)進(jìn)行氯霉素抗性分析，具體方法為將培養(yǎng)12-24小時(shí)的含有目的TSα片段的菌液按1∶50的比例接種到新鮮的含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600達(dá)到1時(shí)，再按1∶50的比例稀釋到含有0.5mM IPTG和不同氯霉素濃度(40、80、120μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，不同時(shí)間測(cè)定菌液的OD600值，與不含氯霉素的對(duì)照組比較，結(jié)果如表1所示，表明重組菌中的CAT基因獲得表達(dá)，具有較高的氯霉素抗性，而不同的重組菌對(duì)氯霉素具有的抗性有一定差異。
表1篩選獲得的TSα片段與CAT的融合蛋白的氯霉素抗性分析結(jié)果a


√表示含有氯霉素的樣品的OD值至少大于對(duì)照組的20％。-表示沒有測(cè)定該點(diǎn)數(shù)據(jù)。
八、TSα蛋白片段TScat-1、TScat-2和TScat-5的進(jìn)一步表征分析現(xiàn)用下述方法對(duì)步驟八篩選到的蛋白片段TScat-1(序列表中的序列2)、TScat-2(序列表中的序列3)和TScat-5(序列表中的序列4)做進(jìn)一步表征分析1、不含CAT基因的TSα多肽TScat-1、TScat-2和TScat-5基因的表達(dá)1)PCR擴(kuò)增TScat-1、TScat-2和TScat-5多肽基因以含有TScat-1多肽基因的重組質(zhì)粒為模板，在通用正向引物PF5’-CGAATAACAATTCCCCTCTAGAAAT-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Xba I識(shí)別位點(diǎn))和TScat-1的反向引物TScat-1R5’-ATGCAAGCTTGTCGTCATCGGCATTTGGC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Hind III識(shí)別位點(diǎn))的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增不含CAT基因的TScat-1多肽基因片段；以含有TScat-2多肽基因的重組菌的基因組DNA為模板，在通用正向引物PF和TScat-2的反向引物TScat-2R5’-CCCCAAGCTTGGTCACGCCTGCTCGTGACA-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Hind III識(shí)別位點(diǎn))的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增不含CAT基因的TScat-2多肽基因片段；以含有TScat-5多肽基因的重組菌的基因組DNA為模板，在通用正向引物PF和TScat-5的反向引物TScat-5R5’-CCCCAAGCTTGGTCACGCCTGCTCGTGACA-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Hind III識(shí)別位點(diǎn))的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增不含CAT基因的TScat-5多肽基因片段。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)三種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)PCR擴(kuò)增分別獲得了約350bp、500bp和550bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符。
2)構(gòu)建TScat-1、TScat-2和TScat-5多肽基因的重組表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶Xba I和Hind III對(duì)載體pET30(a)和步驟1)的三種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，回收三種酶切產(chǎn)物并用Qiagen公司的DNA片段純化試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化，然后將經(jīng)酶切的TScat-1、TScat-2和TScat-5多肽基因分別與線性化的pET30(a)質(zhì)粒連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，篩選陽性重組子，提質(zhì)粒，得到含有TScat-1基因的重組表達(dá)載體，命名為pET30(a)/TScat-1，含有TScat-2基因的重組表達(dá)載體，命名為pET30(a)/TScat-2，以及含有TScat-5基因的重組表達(dá)載體，命名為pET30(a)/TScat-5。
3)TScat-1、TScat-2和TScat-5多肽基因的表達(dá)將pET30(a)/TScat-1、pET30(a)/TScat-2和pET30(a)/TScat-5分別用熱激法轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂于含50μg/mL卡那霉素的LB抗性平板上，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，將其接種于含0.5mM IPTG的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃下誘導(dǎo)TScat-1、TScat-2和TScat-5多肽基因的表達(dá)，以轉(zhuǎn)化有pET30(a)空載體的重組菌BL21(DE3)/pET30a為對(duì)照。表達(dá)結(jié)束后，對(duì)三種表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行12％SDS-PAGE檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖3A-圖3C所示(泳道1不可溶蛋白；泳道2可溶蛋白；泳道3BL21(DE3)/pET30a對(duì)照組；泳道4蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(NEB))，表明TScat-2和TScat-5蛋白片段在沒有CAT蛋白作為融合蛋白的情況下，其可溶表達(dá)比例大大提高。
4)TScat-1、TScat-2和TScat-5的鎳柱親和純化經(jīng)過上述克隆操作后，TScat-1、TScat-2和TScat-5三種多肽片段的C端均添加了組氨酸標(biāo)簽(His-tag)，因此可采用鎳柱親和純化法對(duì)其進(jìn)行純化，具體方法為用安瑪西亞(Amersham Biosciences)公司的HitrapTMChelating HP 1mL柱子，采用鎳離子作為親和離子，用含不同咪唑濃度的緩沖液A(0.02M磷酸緩沖溶液，0.5MNaCl，0.03M咪唑，pH7.4)和緩沖液B(0.02M磷酸緩沖溶液，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH7.4)洗脫目的蛋白，其中，TScat-5的洗脫曲線如圖4C所示(標(biāo)號(hào)為收集管號(hào))，洗脫后，對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行12％SDS-PAGE檢驗(yàn)，TScat-5純化產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果如圖5C所示(標(biāo)號(hào)為收集管號(hào)，“un”為未純化樣品，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn))，表明經(jīng)純化獲得了純度較高的TScat-5。對(duì)于可溶蛋白表達(dá)量不高的TScat-1和可溶蛋白表達(dá)量較高但純度不夠的TScat-2用復(fù)性包涵體的辦法進(jìn)行純化，同樣使用安瑪西亞(Amersham Biosciences)公司的HitrapTMChelating HP 1mL柱子進(jìn)行蛋白的復(fù)性，(復(fù)性緩沖液A0.02M磷酸緩沖溶液，0.5M NaCl，0.03M咪唑，1mM DTT pH7.4；變性緩沖液B10.02M磷酸緩沖溶液，0.5M NaCl，0.03M咪唑，8M尿素，1mM DTT，pH7.4；洗脫緩沖液B20.02M磷酸緩沖溶液，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH7.4)，TScat-1、TScat-2的洗脫曲線分別如圖4A和圖4B所示，洗脫后，對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行12％SDS-PAGE檢驗(yàn)，TScat-1、TScat-2純化產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果分別如圖5A和圖5B所示(標(biāo)號(hào)為收集管號(hào)，“in”為提取物不可溶部分，“soluble”為提取物可溶部分，“8M Sample”為經(jīng)8M尿素變性的包涵體樣品，“Flow Through”為未與純化柱結(jié)合的收集物，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn))，表明經(jīng)純化獲得了純度較高的TScat-1和TScat-2。
5)經(jīng)純化的TScat-1、TScat-2和TScat-5多肽的園二色光譜(CD spectrum)檢測(cè)先將經(jīng)純化后的TScat-1、TScat-2和TScat-5的多肽置于20mM磷酸緩沖溶液(pH7.4)中，然后按常規(guī)方法測(cè)定園二色光譜，光譜圖如圖6所示，表明TScat-1、TScat-2和TScat-5具有穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，證明用本發(fā)明的方法可得到具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段。
序列表<160>4<210>1<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Gly Asn Ser Ala Gly Ser Ser Ala Ala Gly1 5 10<210>2<211>98<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Ile Gln Asn Ala Thr Leu Arg Ala Phe Ala Ala Gly Val Thr Pro Ala1 5 10 15Gln Cys Phe Glu Met Leu Ala Leu Ile Arg Gln Lys His Pro Thr Ile20 25 30Pro Ile Gly Leu Leu Met Tyr Ala Asn Leu Val Phe Asn Lys Gly Ile35 40 45Asp Glu Phe Tyr Ala Gln Cys Glu Lys Val Gly Val Asp Ser Val Leu
50 55 60Val Ala Asp Val Pro Val Glu Glu Ser Ala Pro Phe Arg Gln Ala Ala65 70 75 80Leu Arg His Asn Val Ala Pro Ile Phe Ile Cys Pro Pro Asn Ala Asp85 90 95Asp Asp<210>3<211>144<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>3Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asp Ala Leu Glu Leu Gly Ile Pro Phe Ser1 5 10 15Asp Pro Leu Ala Asp Gly Pro Thr Ile Gln Asn Ala Thr Leu Arg Ala20 25 30Phe Ala Ala Gly Val Thr Pro Ala Gln Cys Phe Glu Met Leu Ala Leu35 40 45Ile Arg Gln Lys His Pro Thr Ile Pro Ile Gly Leu Leu Met Tyr Ala50 55 60Asn Leu Val Phe Asn Lys Gly Ile Asp Glu Phe Tyr Ala Gln Cys Glu65 70 75 80Lys Val Gly Val Asp Ser Val Leu Val Ala Asp Val Pro Val Glu Glu85 90 95Ser Ala Pro Phe Arg Gln Ala Ala Leu Arg His Asn Val Ala Pro Ile100 105 110Phe Ile Cys Pro Pro Asn Ala Asp Asp Asp Leu Leu Arg Gln Ile Ala115 120 125Ser Tyr Gly Arg Gly Tyr Thr Tyr Leu Leu Ser Arg Ala Gly Val Thr
130 135 140<210>4<211>166<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>4Met Glu Arg Tyr Glu Ser Leu Phe Ala Gln Leu Lys Glu Arg Lys Glu1 5 10 15Gly Ala Phe Val Pro Phe Val Thr Leu Gly Asp Pro Gly Ile Glu Gln20 25 30Ser Leu Lys Ile Ile Asp Thr Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asp Ala Leu35 40 45Glu Leu Gly Ile Pro Phe Ser Asp Pro Leu Ala Asp Gly Pro Thr Ile50 55 60Gln Asn Ala Thr Leu Arg Ala Phe Ala Ala Gly Val Thr Pro Ala Gln65 70 75 80Cys Phe Glu Met Leu Ala Leu Ile Arg Gln Lys His Pro Thr Ile Pro85 90 95Ile Gly Leu Leu Met Tyr Ala Asn Leu Val Phe Asn Lys Gly Ile Asp100 105 110Glu Phe Tyr Ala Gln Cys Glu Lys Val Gly Val Asp Ser Val Leu Val115 120 125Ala Asp Val Pro Val Glu Glu Ser Ala Pro Phe Arg Gln Ala Ala Leu130 135 140Arg His Asn Val Ala Pro Ile Phe Ile Cys Pro Pro Asn Ala Asp Asp145 150 155 160Asp Leu Leu Arg Gln Ile16權(quán)利要求
1.一種獲得具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段的方法，包括以下步驟1)切割編碼蛋白的多核苷酸序列，然后再進(jìn)行重組，得到不同長(zhǎng)度的多核苷酸隨機(jī)片段；2)將步驟1)獲得的多核苷酸隨機(jī)片段連接入含有編碼具有選擇功能的報(bào)告蛋白基因的載體中，再將所述重組載體導(dǎo)入宿主，培養(yǎng)宿主，得到具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中編碼蛋白的多核苷酸序列為DNA或RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述步驟1)中切割編碼蛋白的多核苷酸序列的方法為酶法、物理法或化學(xué)法。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述酶法采用的酶為DNase、RNase或內(nèi)切酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述酶法采用的酶為DNase I。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中的具有選擇功能的報(bào)告蛋白基因?yàn)槁让顾匾阴＾D(zhuǎn)移酶基因、卡那霉素基因或lacZα基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中用于構(gòu)建含有具有選擇功能的報(bào)告蛋白基因的載體為pUC18、pUC19或pET。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述具有選擇功能的報(bào)告蛋白基因?yàn)槁让顾匾阴＾D(zhuǎn)移酶基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述重組載體為pET30(a)-linker-CAT。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中的宿主為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述宿主為E.coliBL21(DE3)、E.coli XL-1blue、或E.coliDH5α。
12.用權(quán)利要求1-11所述方法得到的具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段。
13.權(quán)利要求12所述的蛋白片段在制備病毒抗原和病毒疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能蛋白片段的獲得方法。該蛋白片段的獲得方法，包括以下步驟1)隨機(jī)切割編碼蛋白的多核苷酸序列，然后再進(jìn)行重組，得到不同長(zhǎng)度的多核苷酸隨機(jī)片段；2)將步驟1)獲得的多核苷酸隨機(jī)片段連接入含有選擇標(biāo)記基因的表達(dá)載體中，再將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主，培養(yǎng)宿主，得到具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段。本發(fā)明不具有基因/蛋白的特異性，篩選方法簡(jiǎn)單易行，將在具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)/功能的蛋白片段的篩選中發(fā)揮巨大作用。
文檔編號(hào)C07K16/08GK1821401SQ200610058148
公開日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2006年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月8日
發(fā)明者林章凜, 陳勇, 李爽 申請(qǐng)人:清華大學(xué)