專利名稱：一種適于分離低分子多肽的非連續(xù)膠電泳方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽電泳方法，尤其涉及一種適于分離低分子多肽的非連續(xù)膠電泳方法，屬生化分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
低分子活性多肽在醫(yī)學(xué)研究中具有非常重要的意義，生物體的很多調(diào)節(jié)因子都是低分子多肽例如胰島素、緩激肽、胸腺肽和促腎上腺皮質(zhì)激素等?？咕氖巧矬w內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種有抗菌活性小分子多肽，已測(cè)序的抗菌肽達(dá)數(shù)百種，一般都由13～50個(gè)氨基酸組成，分子量小于5KDa。凝膠電泳技術(shù)是分析、分離和直接測(cè)定蛋白亞基和多肽單體分子量的有效方法。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳技術(shù)首先在1967年由Shapiro等建立[Shapiro A L， E et al.Molecular weightestimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.Biochem Biophys Res Commun，1967，28815-820]，Laemmli改進(jìn)的非連續(xù)膠系統(tǒng)以其高分辨率應(yīng)用最為廣泛[Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4.Nature，1970，227680-685]。但是對(duì)分子量低于10Kda的多肽分辨率很低。
目前國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的多種檢測(cè)低分子量多肽的電泳方法，全是基于對(duì)SDS-PAGE系統(tǒng)的改進(jìn)。例如增加甲叉雙丙烯酰胺的濃度，即交聯(lián)度C，并在分離膠中加入高濃度(8mol/L)的尿素[Swank R T and Munkres K D.Molecular weight analysis ofoligopeptides by electrophoresis in polyacrylamide gel with sodium dodecylsulfate.Anal Biochem，1971，39462-477]；增加緩沖液的離子強(qiáng)度并配置梯度膠[Fling S P，Gregerson D S.Peptide and protein molecular weight determinationby electrophoresis using a high-molarity Tris buffer system without urea.AnalBiochem，1986，15583-88]；在緩沖體系中添加吡啶[Kyte J，Rodriguez H.Adiscontinuous electrophoretic system for separating peptides on polyacrylamidegels.Anal Biochem，1983，133515-522]，或者添加氨基酸[Yim S K，Ahn T，KimJ S.Polyacrylamide Gel Electrophoresis without a Stacking GelApplication forSeparation of Peptides.Analytical Biochemistry，2002，305277-279]；利用改進(jìn)的Glycine-SDS-PAGE系統(tǒng)[Sarfo K，Greg B，Turner R.A novel procedure forseparating small peptides on polyacrylamide gels.Letters in Peptide Science，2003，10127-133]等。其中應(yīng)用較廣泛的是Schagger建立的Tricine-SDS-PAGE體系[Schgger H，Jagow G V.Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100kDa.Anal.Biochem，1987，166368-379]，它可以分離分子量為1-100KDa的蛋白質(zhì)和多肽，但其分離系統(tǒng)比較復(fù)雜，需要配置灌注分離膠、間隙膠和濃縮膠三層凝膠，還需要不同的陰極、陽(yáng)極電極緩沖液，電泳時(shí)間要10-20小時(shí)，且Tricine價(jià)格比較昂貴；大量電泳的結(jié)果表明Tricine-SDS-PAGE體系對(duì)分離小于3KDa的小肽效果不甚理想，多表現(xiàn)為帶型彌散。總之，盡管人們對(duì)SDS電泳系統(tǒng)的改進(jìn)做了大量的努力，但是，SDS電泳系統(tǒng)還是對(duì)低分子多肽的分辨率普遍較低，無(wú)法根本實(shí)現(xiàn)分離低分子多肽的目的。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種適于分離低分子多肽的非連續(xù)膠電泳方法，該方法能夠快速有效地分離分子量在1-70Kda范圍內(nèi)的蛋白和多肽并測(cè)定其分子量，尤其適于分離分子量在1-10Kda的低分子多肽，具有較高地靈敏度和分辨率，且操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，成本低。可廣泛應(yīng)用于低分子肽的分離純化和分子量測(cè)定。
本發(fā)明所述適于分離低分子多肽的非連續(xù)膠電泳方法，采用以AOT即二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉為變性劑的非連續(xù)膠電泳系統(tǒng)，AOT分子量比SDS高，且有兩條疏水鏈，與蛋白結(jié)合后，能明顯降低低分子蛋白的遷移速率，減少低分子蛋白的擴(kuò)散，這不僅有利于低分子蛋白在聚丙烯酰胺凝膠中的分離，而且能減少后續(xù)固定、染色和脫色過程中低分子蛋白質(zhì)的擴(kuò)散和流失。其特征是濃縮膠緩沖液1mol/LTris-HCl，pH6.8；分離膠緩沖液1.5mol/LTris-HCl，pH8.8；濃縮膠濃度為T＝3％，分離膠濃度為T＝10～16.5％，交聯(lián)度C＝3％，并加入0.1％AOT和6mol/L尿素；所述膠的制備與一般SDS-PAGE電泳膠的制備方法相同；電極緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng)，其配方為0.025mol/LTris，0.192mol/L甘氨酸，pH8.3，并添加0.1％AOT；樣品緩沖液(pH6.8)，其配方為1.6ml濃縮膠緩沖液+4ml 10％AOT+0.6g二硫蘇糖醇+2.5ml87％甘油+0.1mg溴酚藍(lán)，用雙蒸水稀釋到20ml；其中含有的2％AOT能使多肽樣品充分變性；變性條件依樣品的分子量和性質(zhì)，選用60℃孵育10min或75℃孵育10min或95℃孵育5min或者100℃煮沸3min；使用70mm*80mm*1mm的小膠板進(jìn)行電泳；電泳條件將電極緩沖液注入電泳槽中，先60V恒壓，待樣品進(jìn)入分離膠界面時(shí)，升電壓至120V～140V，電泳時(shí)間1.5-2h；若使用160mm*160mm*1mm的大膠板進(jìn)行電泳；電泳條件將電極緩沖液注入電泳槽中，先80V恒壓，待樣品進(jìn)入分離膠界面時(shí)，電壓升至160-200V電泳約10-12h。
電泳完畢后將膠置于固定液(20％三氯乙酸)中固定1h，然后放置于染色液(0.29g考馬斯亮藍(lán)R-250+250ml脫色液)中染色過夜，轉(zhuǎn)至脫色液(250ml95％乙醇+80ml冰醋酸+蒸餾水定容至1000ml)中脫色，并多次更換脫色液，直至膠背景清晰。
上述的適于分離低分子多肽的非連續(xù)膠電泳方法中所述分離膠濃度為T＝12～14％時(shí)，更適于分離分子量為10KDa～70KDa范圍內(nèi)的蛋白和多肽。
上述的適于分離低分子多肽的非連續(xù)膠電泳方法中所述分離膠濃度為T＝15～16.5％時(shí)，更適于分離分子量小于10KDa范圍內(nèi)的蛋白和多肽。
上述的適于分離低分子多肽的非連續(xù)膠電泳方法中變性條件優(yōu)選為75℃孵育10min或95℃孵育5min。
上述的適于分離低分子多肽的非連續(xù)膠電泳方法中所述電泳條件優(yōu)選為使用70mm*80mm*1mm的小膠板進(jìn)行電泳，電泳條件將電極緩沖液注入電泳槽中，先60V恒壓，待樣品進(jìn)入分離膠界面時(shí)，升電壓至120V，電泳時(shí)間2h。
使用160mm*160mm*1mm的大膠板進(jìn)行電泳，電泳條件將電極緩沖液注入電泳槽中，先80V恒壓，待樣品進(jìn)入分離膠界面時(shí)，電壓升至180-200V電泳10h。
下面通過SDS-尿素電泳與AOT-尿素電泳的比較來(lái)對(duì)本發(fā)明效果作進(jìn)一步闡述在上述優(yōu)選的制膠和電泳實(shí)驗(yàn)條件下，分別用AOT和SDS為變性劑，分離樣品低分子肽標(biāo)準(zhǔn)分子量2512-16949Da(Pharmacia LKB)和胰島素(5780Da)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在本發(fā)明所述AOT電泳體系中，低分子蛋白和多肽樣品的遷移率明顯比SDS電泳系統(tǒng)中要低，分辨率要高。AOT-PAGE電泳中，牛胰島素解鏈為兩條帶，2Kda和3Kda的肽段很好的分開，帶型清晰可辨，低分子量標(biāo)準(zhǔn)6條帶均出現(xiàn)。而在同樣條件下，SDS-PAGE電泳中，低分子量標(biāo)準(zhǔn)僅分出4條大分子帶，6Kda以下得帶均沒有出現(xiàn)。牛胰島素?zé)o法分離，只堆積在膠的前沿。AOT-PAGE電泳比SDS-PAGE電泳的靈敏度高得多。對(duì)于低分子量于10Kda的多肽，在AOT-PAGE中0.5-1μg多肽就能出現(xiàn)清晰的條帶，而同樣膠濃的條件下SDS-PAGE要2-3μg上樣量才能出現(xiàn)同樣清晰的條帶。
本發(fā)明所述的AOT-PAGE系統(tǒng)能很好地分離分子量在1-70KDa的蛋白和多肽樣品。尤其使對(duì)分子量在1-10KDa低分子多肽具有較高地靈敏度和分辨率。其分子量對(duì)數(shù)與遷移率呈很好地線性關(guān)系(R2＝0.93)，可以較準(zhǔn)確地測(cè)定低分子多肽的分子量。
本發(fā)明的電泳方法操作過程簡(jiǎn)便，快速，成本低廉。所述的AOT-PAGE系統(tǒng)是進(jìn)行低分子多肽研究的有力工具，可廣泛應(yīng)用于低分子肽的分離純化和分子量測(cè)定。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1分離分子量在1-70kDa的低分子肽標(biāo)準(zhǔn)分子量2512-16949 Da(Pharmacia LKB)濃縮膠濃度為T＝3％，分離膠濃度為T＝15％，C＝3％，并加入0.1％AOT和6mol/L尿素。電極緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng)(0.025mol/LTris，0.192mol/L甘氨酸，pH8.3)并添加0.1％AOT。
變性條件為在pH6.8樣品緩沖液中加2％AOT，100℃煮沸3min使樣品充分變性。
用70mm*80mm*1mm的小膠板進(jìn)行電泳。
電泳條件將電極緩沖液注入電泳槽中，先60V恒壓，待樣品進(jìn)入分離膠界面時(shí)，升電壓至120V電泳2h。
用考瑪斯亮藍(lán)R-250染色系統(tǒng)固定、染色和脫色。
在此條件下，低分子肽標(biāo)準(zhǔn)樣品中的六條帶均能得到良好的分離，且遷移率與分子量的對(duì)數(shù)間呈良好的線性關(guān)系。
實(shí)施例2分離大腸桿菌全細(xì)胞蛋白或細(xì)胞色素C酶解樣等復(fù)雜未知樣品。
細(xì)胞色素C酶解條件每管分別加入8μl細(xì)胞色素C(20mg/ml)，10ul 50mMTris-HCl(pH 8.0)，1μl胰蛋白酶(細(xì)胞色素C∶胰蛋白酶＝50∶1)。37℃水浴，2h。立即放入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。大腸桿菌需煮沸5-10分鐘破壁，離心取上清。
濃縮膠濃度為T＝3％，分離膠濃度為T＝16.5％，C＝3％，并加入0.1％AOT和6mol/L尿素。
電極緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng)(0.025mol/LTris，0.192mol/L甘氨酸，pH8.3)并添加0.1％AOT。
變性條件為在pH6.8樣品緩沖液中加2％AOT，95℃孵育5min，使樣品充分變性。
用160mm*160mm*1mm的大膠板進(jìn)行電泳。
電泳條件為將電極緩沖液注入電泳槽中，先80V恒壓，待樣品進(jìn)入分離膠界面時(shí)，電壓升至180-200V電泳約10h。
用考瑪斯亮藍(lán)R-250染色系統(tǒng)固定、染色和脫色。
在此條件下，大腸桿菌全細(xì)胞蛋白的中分子量和低分子量部分的蛋白可充分分離，最低分子量蛋白帶的分子量為1KDa。細(xì)胞色素C酶解樣也能分離出多個(gè)酶解產(chǎn)物的條帶，最低分子量為1KDa。
實(shí)施例3分離中分子量蛋白，如中分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量14,400-66,000Da(Waston)，以及其他在實(shí)施例1和2電泳條件下易出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象的蛋白。
濃縮膠濃度為T＝3％，分離膠濃度為T＝12％，C＝3％，并加入0.1％AOT。電極緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng)(0.025mol/LTris，0.192mol/L甘氨酸，pH8.3)并添加0.1％AOT。pH6.8樣品緩沖液中加2％AOT，75℃孵育10min使樣品變性。
用70mm*80mm*1mm的小膠板進(jìn)行電泳。
電泳條件為將電極緩沖液注入電泳槽中，先70V恒壓，待樣品進(jìn)入分離膠界面時(shí)，升電壓至140V電泳時(shí)間2h。
用考瑪斯亮藍(lán)R-250染色系統(tǒng)固定、染色和脫色。
在此條件下，中分子蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品中的六條帶均能得到良好的分離，遷移率與分子量的對(duì)數(shù)間呈良好的線性關(guān)系。其他蛋白一般也都能得到很好地變性和分離。
權(quán)利要求
1.一種適于分離低分子多肽的非連續(xù)膠電泳方法，采用以AOT即二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉為變性劑的非連續(xù)膠電泳系統(tǒng)，其特征是濃縮膠緩沖液1mol/LTris-HCl，pH6.8；分離膠緩沖液1.5mol/LTris-HCl，pH8.8；濃縮膠濃度為T＝3％，分離膠濃度為T＝10～16.5％，交聯(lián)度C＝3％，并加入0.1％AOT和6mol/L尿素；所述膠的制備與一般SDS-PAGE電泳膠的制備方法相同；電極緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng)，其配方為0.025mol/LTris，0.192mol/L甘氨酸，pH8.3，并添加0.1％AOT；樣品緩沖液為pH6.8，其配方為1.6ml濃縮膠緩沖液+4ml 10％AOT+0.6g二硫蘇糖醇+2.5ml87％甘油+0.1mg溴酚藍(lán)，用雙蒸水稀釋到20ml；其中含有的2％AOT能使多肽樣品充分變性；變性條件依樣品的分子量和性質(zhì)，選用60℃孵育10min或75℃孵育10min或95℃孵育5min或者100℃煮沸3min；使用70mm*80mm*1mm的小膠板進(jìn)行電泳；電泳條件將電極緩沖液注入電泳槽中，先60V恒壓，待樣品進(jìn)入分離膠界面時(shí)，升電壓至120V～140V，電泳時(shí)間1.5-2h；若使用160mm*160mm*1mm的大膠板進(jìn)行電泳；電泳條件將電極緩沖液注入電泳槽中，先80V恒壓，待樣品進(jìn)入分離膠界面時(shí)，電壓升至160-200V，電泳10-12h；電泳完畢后，將膠置于固定液中固定1h，然后放置于染色液中染色過夜，轉(zhuǎn)至脫色液中脫色，并多次更換脫色液，直至膠背景清晰；其中所述固定液由20％三氯乙酸配制；所述染色液配方為0.29g考馬斯亮藍(lán)R-250+250ml脫色液；所述脫色液配制方法為250ml95％乙醇+80ml冰醋酸+蒸餾水定容至1000ml。
2.如權(quán)利要求1所述的適于分離低分子多肽的非連續(xù)膠電泳方法，其特征是所述分離膠濃度為T＝12～14時(shí)，更適于分離分子量為10KDa～70KDa范圍內(nèi)的蛋白和多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的適于分離低分子多肽的非連續(xù)膠電泳方法，其特征是所述分離膠濃度為T＝15～16.5％時(shí)，更適于分離分子量小于10KDa范圍內(nèi)的蛋白和多肽。
4.如權(quán)利要求1所述的適于分離低分子多肽的非連續(xù)膠電泳方法，其特征是所述樣品緩沖液pH為6.8，變性條件為75℃孵育10min或95℃孵育5min。
5.如權(quán)利要求1所述的適于分離低分子多肽的非連續(xù)膠電泳方法，其特征是使用70mm*80mm*1mm的小膠板進(jìn)行電泳，電泳條件將電極緩沖液注入電泳槽中，先60V恒壓，待樣品進(jìn)入分離膠界面時(shí)，升電壓至120V，電泳時(shí)間2h。
6.如權(quán)利要求1所述的適于分離低分子多肽的非連續(xù)膠電泳方法，其特征是使用160mm*160mm*1mm的大膠板進(jìn)行電泳，電泳條件將電極緩沖液注入電泳槽中，先80V恒壓，待樣品進(jìn)入分離膠界面時(shí)，電壓升至180-200V電泳10h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適于分離低分子多肽的非連續(xù)膠電泳方法，采用以AOT即二(2－乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉為變性劑的非連續(xù)膠電泳系統(tǒng)，本系統(tǒng)能夠快速有效地分離分子量在1－70Kda范圍內(nèi)的蛋白和多肽并測(cè)定其分子量，尤其適于分離分子量在1－10Kda的低分子多肽，具有較高地靈敏度和分辨率，且操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，成本低。本系統(tǒng)克服了傳統(tǒng)十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)不適于分離低分子多肽的缺陷，可廣泛應(yīng)用于低分子肽的分離純化和分子量測(cè)定。
文檔編號(hào)C07K1/26GK1958604SQ200610069909
公開日2007年5月9日 申請(qǐng)日期2006年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月30日
發(fā)明者盧雪梅, 姚瑤, 張為燦, 高培基 申請(qǐng)人:山東大學(xué)