專利名稱：：一種新的植酸酶的克隆和表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種具有高穩(wěn)定性和高活性的植酸酶、其生產(chǎn)菌株的篩選、植酸酶基因的克隆分離、植酸酶基因在宿主細(xì)胞(如畢赤酵母)中的表達(dá)純化及其酶學(xué)性質(zhì)的研究。
背景技術(shù)：
：在動物日糧中，植酸磷占總磷量的50-70％，甚至更高。但是，單胃動物缺乏分解植酸的酶，因此磷的利用率非常低。在通過消化道時植酸磷不能被動物吸收。大量的植酸排泄到環(huán)境中，導(dǎo)致土壤和水中磷的富積，造成環(huán)境污染。另外，植酸還可以與大量必要離子結(jié)合，抑制了這些元素的吸收。同時植酸還可以與其他營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合，降低了飼料的利用率。顯然磷是生長所必需的，因此為了動物的正常生長添加無機磷(磷酸二氫鈣、去氟磷酸鹽)或動物性產(chǎn)品(肉骨粉、魚粉)是非常必要的，但是價格比較昂貴。植酸酶是能夠?qū)⒐任镏辛椎膬Υ嫘问降闹菜?肌醇六磷酸)(EGraf，KLEmpsonandJWEaton.Phyticacid.Anaturalantioxidant.J.Biol.Chem.，Vol.262，Issue24，11647-11650，Aug，1987)水解為無機磷和肌醇的一類酶的總稱。植酸酶廣泛地存在于動物、植物和微生物之中。根據(jù)不同來源植酸酶的性質(zhì)特征的差異，微生物來源的植酸酶倍受關(guān)注。作為飼料添加劑，微生物植酸酶大量提高了單胃動物日糧中植酸磷的生物學(xué)活性(Cromwell，etal.Efficacyofphytaseinimprovingthebioavailabilityofphosphorusinsoybeanmealandcorn-soybeanmealdietsforpigs.JAnimSci.1993Jul；71(7)1831-40)。結(jié)果降低了動物飼料中無機磷的添加量，同時減少了環(huán)境中磷的排放(Kornegay，etal.Replacementofinorganicphosphorusbymicrobialphytaseforyoungpigsfedonamaize-soyabean-mealdiet.BrJNutr.1996Oct；76(4)563-78)。一方面，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，越來越多的微生物植酸酶被分離純化。例如，“來源于Klebsiellaterrigena的植酸酶純化與性質(zhì)測定”(Greineretal.PurificationandcharacterizationofaphytasefromKlebsiellaterrigena.ArchBiochemBiophys.1997May15；341(2)201-6)，“來源于芽孢桿菌種DS11的熱穩(wěn)定性植酸酶的純化與性質(zhì)測定”(Kimetal.PurificationandpropertiesofathermostablephytasefromBacillussp.DS11.EnzymeMicrobTechnol，1998Jan，22(1)，2-7)，“Citrobacterbraakii來源的植酸酶分離及性質(zhì)測定”(Kimetal.IsolationandcharacterizationofaphytasewithimprovedpropertiesfromCitrobacterbraakii.BiotechnolLett.2003Aug；25(15)1231-4)，“來源于Obesumbacteriumproteus的新型植酸酶的基因克隆表達(dá)及性質(zhì)測定”(Zininetal.Genecloning，expressionandcharacterizationofnovelphytasefromObesumbacteriumproteus.FEMSMicrobiolLett.2004Jul15；236(2)283-90)；另一方面，還通過直接定點突變或基因改組，對已有的植酸酶進(jìn)行性質(zhì)改良。例如，“植酸酶phyAm基因結(jié)構(gòu)延伸突變改善酶的熱穩(wěn)定性”(陳惠等，生物工程學(xué)報，2005年11月，21卷6期，983-987)，“大腸桿菌植酸酶的定點突變”(USpatent6,841,370，LeiXG，Site-directedmutagenesisofEscherichiacoliphytase.2005)。所以微生物來源的植酸酶的價格大幅度的降低。由于這些優(yōu)點，部分植酸酶在飼料行業(yè)被廣泛的接受應(yīng)用。但是，在這些已廣泛使用的植酸酶中，仍然存在著一些缺陷。因為這些植酸酶作為飼添加劑，并不能發(fā)揮它的理想作用。例如，大部分植酸酶在飼料制粒加工的過程中就已經(jīng)高溫變性失活了，所以在腸道中不能發(fā)揮降解植酸的作用。不同的植酸酶在飼料中不能真正發(fā)揮作用的原因，主要是由于，這些酶的穩(wěn)定性比較差(pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、抗蛋白酶降解的穩(wěn)定性以及在儲存運輸過程中的穩(wěn)定性)和在胃腸道環(huán)境中活性比較低的緣故。由于目前使用的植酸酶存在的這些缺陷，因此，人們希望能夠找到這樣一種新的植酸酶其具有非常好的穩(wěn)定性，在動物胃腸道中有非常高的活性，并且該植酸酶還能夠通過發(fā)酵技術(shù)大量生產(chǎn)，這樣可以使其成本大幅度的降低，從而能夠進(jìn)一步推廣該植酸酶的使用。另外，現(xiàn)有技術(shù)中分離植酸酶的手段有限，主要是通過構(gòu)建基因組文庫，或直接從純化蛋白入手。但是，這兩種方式都比較耗費時間和勞力，效率非常的低，并且也非常昂貴。而且，鑒于不同物種中植酸酶基因的同源性很低，難以通過簡單的PCR直接篩選到新的植酸酶基因。因此，本領(lǐng)域也急需發(fā)展新的簡便有效的植酸酶分離方法發(fā)明概述首先，本發(fā)明提供了一株產(chǎn)高活性高穩(wěn)定性植酸酶的菌株無丙二酸檸檬酸桿菌(Citrobacteramalonaticus)B-52，其保藏號為CGMCC1696。本發(fā)明也提供了一種新的植酸酶基因，其包含SEQIDNO1所示的核苷酸序列或其衍生序列。本發(fā)明還提供了具有如下性質(zhì)的植酸酶，其理論分子量46.5kDa，最適pH在4-5之間，最適溫度在50-60℃之間，理論pI值為6.2，比活在3000U/mg以上，且在pH1-10之間都具有良好的pH穩(wěn)定性。所述植酸酶可分離自檸檬酸桿菌屬微生物，優(yōu)選為無丙二酸檸檬酸桿菌。本發(fā)明也涉及一種分離的多肽，其選自a)包含SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽；b)由SEQIDNO2所示的多肽序列經(jīng)過1-10氨基酸的取代、缺失和/或插入衍生且具有植酸酶活性的多肽；c)由SEQIDNO1所示的核酸分子或其簡并序列所編碼的多肽；d)由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNO1所示核酸分子的互補鏈雜交的核酸編碼且具有植酸酶活性的多肽；e)由SEQIDNO1所示核酸分子的等位基因或天然變體所編碼且具有植酸酶活性的多肽；或f)與SEQIDNO2所示的多肽序列具有至少70％同源性且具有植酸酶活性的多肽。特別地，本發(fā)明還提供了一種簡單有效的從基因組DNA中克隆分離植酸酶的基因的方法。所述方法包括a)基于植酸酶保守序列RHGXRXP和HD設(shè)計一對簡并引物；b)利用所述引物通過PCR擴增部分植酸酶序列；和c)進(jìn)一步通過TAIL-PCR獲取植酸酶的全序列。另外，本發(fā)明還提供了在宿主細(xì)胞(例如，包括但不限于畢赤酵母)中產(chǎn)生和表達(dá)重組植酸酶蛋白的方法。從而，本發(fā)明提供了所述基因操作中涉及的重組載體、宿主細(xì)胞。進(jìn)一步地，本發(fā)明還涉及所述植酸酶在制備飼料添加劑中的用途，以及相應(yīng)的飼料添加劑，所述飼料添加劑以所述植酸酶多肽、表達(dá)植酸酶多肽的宿主細(xì)胞、或者本發(fā)明篩選到的無丙二酸檸檬酸桿菌B-52作為有效成分。圖1純化的蛋白及其脫糖基化處理。泳道1為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為純化的植酸酶，泳道3為脫糖基化處理的植酸酶。圖2重組酶的最適pH和pH穩(wěn)定性?？v坐標(biāo)表示相對活力(％)，以活性最高的和未處理的作為100％。圖3A最適溫度，B溫度穩(wěn)定性?？v坐標(biāo)表示相對活力(％)，以活性最高的和未處理的作為100％。圖4蛋白酶的穩(wěn)定性關(guān)于生物材料的保藏說明本發(fā)明所用的無丙二酸檸檬酸桿菌(Citrobacteramalonaticus)B-52已于2006年4月25日保藏在位于中國北京市中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC1696。序列簡述序列1新植酸酶的核酸序列序列2新植酸酶的氨基酸序列序列3正向簡并引物FI的序列序列4反向簡并引物RI的序列發(fā)明詳述以下詳細(xì)描述本發(fā)明的各個方面，其中列舉的數(shù)值或范圍(比如分子量、pH值、同源性)應(yīng)理解為是大約的數(shù)值或范圍，即可在所述數(shù)值或數(shù)值范圍的上下左右浮動，而不僅僅局限于具體的點值。首先，該發(fā)明提供了一株產(chǎn)高活性高穩(wěn)定性植酸酶的菌株。通過硫酸亞鐵鉬藍(lán)法檢測植酸酶活性，對本實驗室貯存的6株檸檬酸桿菌(即3株弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)、2株未定種名的檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)、1株無丙二酸擰檬酸桿菌(Citrobacteramalonaticus))中進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)已知的這株無丙二酸擰檬酸桿菌能夠在細(xì)胞內(nèi)檢測到高植酸酶活性，其為格蘭氏陰性、棒狀、兼性厭養(yǎng)，最適的產(chǎn)植酸酶條件為30℃，最適的生長溫度也為30℃。由于該菌株在本室的編號為B-52，所以被命名為C.amalonaticusB-52。已于2006年4月25日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC1696。本發(fā)明也涉及具有CGMCC1696的生物學(xué)特征和產(chǎn)植酸酶活性的檸檬酸桿菌純培養(yǎng)物。優(yōu)選為無丙二酸擰檬酸桿菌的純培養(yǎng)物。另一方面，本發(fā)明涉及具有如下性質(zhì)的植酸酶，其理論分子量46.5kDa；最適pH在4-5之間，優(yōu)選pH4.5；最適溫度在50-60℃之間，優(yōu)選55℃；理論pI值為6.2；在37℃，pH4.5時對植酸(鹽)的比活在3000U/mg以上，優(yōu)選3300U/mg以上，如3400，3500，3600，3700，3800，3900或4000U/mg；此酶在pH1-10之間具有良好的穩(wěn)定性，且對胃蛋白酶、胰蛋白酶具有非常強的抗性。所述植酸酶可分離自檸檬酸桿菌屬微生物，優(yōu)選為無丙二酸檸檬酸桿菌。本發(fā)明的植酸酶蛋白包含SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽。優(yōu)選地，本發(fā)明的植酸酶是由SEQIDNO1所示的核酸分子或其簡并序列所編碼的多肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明也提供了SEQIDNO2所示多肽的衍生物，其可由SEQIDNO2所示的多肽序列經(jīng)過一個或多個(例如，一個或幾個，包括具體的點值，可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或者是處于中間的任一范圍，如2-3個、7-8個等等)氨基酸的取代、缺失和/或插入獲得，并仍然具有植酸酶活性。例如，一個常見的策略是保守氨基酸取代，即將氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基在本領(lǐng)域已有明確定義。這些包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，在植酸酶蛋白中用來自同一側(cè)鏈類的另一氨基酸殘基替換一個或幾個位點，將不會在實質(zhì)上影響其植酸酶活性。再如，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在基因的克隆操作中，常常需要設(shè)計合適的酶切位點，這勢必在所表達(dá)的蛋白末端引入了一個或多個不相干的殘基，而這并不影響目的蛋白的活性。又如，在重組蛋白的表達(dá)策略中，為構(gòu)建融合蛋白、令重組蛋白分泌到胞外、增強其表達(dá)、便于純化或純化后與融合部分分離等目的，常常需要將一些氨基酸添加至重組蛋白的N-末端、C-末端或其它合適區(qū)域內(nèi)，例如，包括但不限于，接頭肽、信號肽、前導(dǎo)肽、末端延伸、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白、蛋白A、6His標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、或蛋白水解酶(如Xa因子、凝血酶、腸激酶)識別位點等等。又在一個實施方案中，本發(fā)明的植酸酶蛋白具有這樣的氨基酸序列，該氨基酸序列由與本發(fā)明SEQIDNO1所示的核苷酸序列雜交，例如在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核苷酸序列編碼。如本文所用，術(shù)語“在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交”是用來描述雜交和洗滌條件，在此條件下，相互間至少60％同源的核苷酸序列一般仍可相互雜交。優(yōu)選地，嚴(yán)謹(jǐn)條件為這樣的條件，在此條件下相互間具有至少約65％，更優(yōu)選地至少約70％，且甚至更優(yōu)選地至少約75％或更高同源性的序列一般仍可相互雜交。此嚴(yán)謹(jǐn)條件為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知，可在CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的一個優(yōu)選、非限制性實例為在6×SSC中于約45℃雜交，然后在0.2×SSC，0.1％SDS中于50-65℃洗滌一次或多次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，高度嚴(yán)謹(jǐn)條件可通過提高雜交溫度，例如至50℃、55℃、60℃或65℃來實現(xiàn)。另外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會理解由于自然變異所致的遺傳多態(tài)性可在群體中的個體間存在。此類自然變異所產(chǎn)生的等位基因或天然變體一般可在植酸酶基因核苷酸序列中導(dǎo)致1-5％的差異。任何這種自然變異產(chǎn)生的等位基因或天然變體所編碼的相應(yīng)植酸酶蛋白活性不改變的此類氨基酸多態(tài)性也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。也就是說，本發(fā)明也涉及由SEQIDNO1所示核酸分子的等位基因或天然變體所編碼的具有植酸酶活性的多肽。又在另一優(yōu)選的實施方案中，植酸酶蛋白為這樣的活性多肽，其包含優(yōu)選地至少69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，或79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，更優(yōu)選地至少89％，90％，91％，92％，93％，94％，甚至更優(yōu)選地至少95％，96％，97％，98％，99％或更高地同源于本發(fā)明SEQIDNO2所示的全長氨基酸序列的氨基酸序列，且其具有植酸酶活性。除上述具體點值之外，上述值中間的范圍和同一性值(例如，69-99％同源性或80-95％同一性)也包括在本發(fā)明中。例如，也包括使用任一上述值作為上限和/或下限組合而成的同一性值范圍。在兩個序列間比較序列并確定百分同源性為本領(lǐng)域公知的技術(shù)，可利用任何數(shù)學(xué)算法完成，既有作為軟件可商購獲得的，也有整合在公共數(shù)據(jù)庫中的，例如多序列比對程序CLUSTALW和模塊分析程序BLOCKS，或NCBI的GenBank中所采用的BLAST服務(wù)器http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將明了針對所分析的具體序列如何優(yōu)化各程序中相應(yīng)的參數(shù)設(shè)置(如分值、字長、缺口罰分、權(quán)重等等)，可以獲得預(yù)期的同源性或同一性比對結(jié)果。利用GenBank中BLAST的缺省參數(shù)設(shè)置，本發(fā)明植酸酶蛋白與其它已知家族成員的序列比對結(jié)果如下表1本發(fā)明植酸酶蛋白與已知植酸酶蛋白的同源性比較結(jié)果另一方面，本發(fā)明涉及分離的核酸分子，即包含SEQIDNO1所示核苷酸序列的植酸酶基因。本發(fā)明還包括這樣的核酸分子，其由于遺傳密碼的簡并性而不同于本發(fā)明的核苷酸序列之一，但其與本發(fā)明SEQIDNO1所示核苷酸序列編碼相同的植酸酶蛋白。在一個實施方案中，本發(fā)明也涉及由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNO1所示核酸分子的互補鏈雜交的核酸。優(yōu)選是由于天然變異所致的等位基因或天然變體。另外，本發(fā)明的分離核酸分子也可以具有這樣的核苷酸序列，其編碼的蛋白質(zhì)具有如序列表中SEQIDNO2所示的氨基酸序列。在另一實施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼全長的谷氨酸棒狀桿菌蛋白質(zhì)，而該蛋白質(zhì)實質(zhì)上同源于本發(fā)明的氨基酸序列。例如，所述同源多肽可以是由SEQIDNO2所示的多肽序列經(jīng)過一個或多個氨基酸的取代、缺失和/或插入而衍生的多肽，或者是與SEQIDNO2所示的多肽序列具有至少69-99％或更高數(shù)值范圍中任一點值或中間范圍的同源性的多肽。這樣的核酸分子可以是例如與SEQIDNO1具有至少71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，更優(yōu)選至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％或90％，91％，92％，93％，94％，甚至更優(yōu)選地至少95％，96％，97％，98％，99％或更高地同源于本發(fā)明的核苷酸序列，其中包括使用任一上述點值作為上限和/或下限組合而成的同源性或同一性值范圍。利用GenBank中BLAST的缺省參數(shù)設(shè)置，本發(fā)明植酸酶基因與其它已知家族成員的序列比對結(jié)果如下表2本發(fā)明植酸酶基因與已知植酸酶基因的同源性比較結(jié)果又在一個方面，本發(fā)明涉及與所述植酸酶基因克隆和表達(dá)相關(guān)的重組載體和宿主細(xì)胞。術(shù)語“載體”是指這樣的核酸分子，其可轉(zhuǎn)運與其連接的另一核酸，例如質(zhì)粒、病毒、噬菌體、粘粒等。本發(fā)明的重組表達(dá)載體以適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)核酸的形式包含本發(fā)明的核酸，這就是說重組表達(dá)載體包括一個或多個與目的核酸有效連接的調(diào)節(jié)序列。其中，“有效連接”是指目的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許該核苷酸序列表達(dá)(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，或當(dāng)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞后在宿主細(xì)胞中表達(dá))的方式連接。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”包括啟動子、阻遏物結(jié)合位點、激活物結(jié)合位點、增強子和其它表達(dá)調(diào)控元件(例如，終止子、多聚腺苷酸化信號、或具有mRNA二級結(jié)構(gòu)的其它元件)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將了解到表達(dá)載體的設(shè)計可取決于如對欲轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素。可以將本發(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生由此處所述核酸所編碼的植酸酶蛋白質(zhì)，包括融合蛋白。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可設(shè)計用于在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)植酸酶蛋白。例如，植酸酶基因可在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌、酵母(如畢赤酵母、黑曲霉)、昆蟲細(xì)胞(如Sf9細(xì)胞、家蠶細(xì)胞，例如使用桿狀病毒表達(dá)載體)或植物細(xì)胞(如擬南芥、煙草、玉米等，如使用農(nóng)桿菌載體)中表達(dá)。從而，本發(fā)明的另一方面涉及已導(dǎo)入本發(fā)明的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可為任何原核或真核細(xì)胞，其包括但不限于上述的那些宿主細(xì)胞。優(yōu)選畢赤酵母細(xì)胞。巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)是一種甲醇酵母，能夠以甲醇作為唯一碳源進(jìn)行代謝。這個系統(tǒng)因為具有非常高的異源蛋白表達(dá)能力而聞名。作為一個真核表達(dá)系統(tǒng)，它具有非常多的優(yōu)點，特別是后加工處理方面。如今已有許多的植酸酶基因在其中成功地表達(dá)，同樣本發(fā)明提供的新的植酸酶基因也得到成功表達(dá)。在搖瓶水平，誘導(dǎo)48h后在培養(yǎng)基上清植酸酶活性達(dá)到352U/mL，因此在發(fā)酵罐水平大量生產(chǎn)該植酸酶將會比較容易。同時本發(fā)明也提供了一個生產(chǎn)該植酸酶的畢赤酵母工程菌株。載體DNA可通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞中。如此處所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”、“接合”和“轉(zhuǎn)導(dǎo)”意指本領(lǐng)域內(nèi)公知的各種將外源核酸(例如，線性DNA或RNA(例如，線性化載體或無載體的單獨的基因構(gòu)建物)或載體形式的核酸(例如，質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、噬粒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子或其它DNA)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、天然感受態(tài)、化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移或電穿孔。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法可在Sambrook等人(分子克隆實驗室手冊第二版，冷泉港實驗室出版社，NY，1989)和其它實驗室手冊中找到。本發(fā)明的宿主細(xì)胞(如培養(yǎng)的原核或真核宿主細(xì)胞)可用于產(chǎn)生(即表達(dá))植酸酶蛋白。因此，本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生植酸酶蛋白的方法。在一個實施方案中，該方法包括在適于植酸酶表達(dá)的條件下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(其中已導(dǎo)入了編碼植酸酶蛋白的重組表達(dá)載體，或其基因組中已導(dǎo)入了編碼野生型或改變的植酸酶蛋白的基因)，直至產(chǎn)生植酸酶蛋白。在另一實施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞分離植酸酶蛋白。所以，本發(fā)明提供了在畢赤酵母中表達(dá)的重組植酸酶。為了測定該重組植酸酶的性質(zhì)，表達(dá)的植酸酶經(jīng)過了一系列的方法純化，最終達(dá)到電泳純。純的未經(jīng)脫糖基處理的重組植酸酶分子量在52-59kDa，對植酸(鹽)底物具有高達(dá)3548±34U/mg活性。該重組酶的最適pH在4-5之間，最適溫度在50-60℃。此酶在pH1-10之間都具有良好穩(wěn)定性，在pH3.5-10都非常穩(wěn)定，處理一小時后還保留有85％以上的活性。在pH1.0-3.0時穩(wěn)定性略差點，處理一小時后還保留有40％以上的活性。此重組酶對胃蛋白酶、胰蛋白酶也具有非常強的抗性。同時離子影響方面Na+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、EDTA對酶活有促進(jìn)作用；而Zn2+、Cr3+、Cu2+、Fe2+有抑制作用；SDS完全抑制該重組酶的活性。以上性質(zhì)決定了該植酸酶將會有一個較好的應(yīng)用前景。進(jìn)一步地，本發(fā)明還涉及所述植酸酶在制備飼料添加劑中的用途，以及相應(yīng)的飼料添加劑，所述飼料添加劑的有效成分可以是所述植酸酶多肽、表達(dá)植酸酶多肽的宿主細(xì)胞、或者本發(fā)明篩選到的無丙二酸檸檬酸桿菌B-52。所述飼料添加劑可制備為干粉或液體制劑，并且可額外地包括一種或多種酶制品，包括但不限于角蛋白酶、脂解酶(如脂肪水解酶)、淀粉酶、磷酸酶、麥芽糖酶、轉(zhuǎn)化酶、木聚糖酶、羧甲基纖維素酶等等。除了植酸酶和/或產(chǎn)植酸酶微生物，本發(fā)明的飼料添加劑還可額外包括其它非致病性的有益微生物，例如包括但不限于益生菌乳酸菌、雙歧桿菌等，有助于消化和飼料吸收的酵母菌，有助于增重的米曲霉菌，能夠產(chǎn)生有益蛋白酶的枯草芽孢桿菌等等。特別地，本發(fā)明提供了一個從靶生物體基因組DNA中簡便有效的獲取植酸酶基因的方法。傳統(tǒng)的獲取植酸酶的基因主要由兩種方式一種方法是通過構(gòu)建基因組文庫，另一種是直接從純化蛋白入手。但是，這兩種方式都比較耗費時間和勞力，效率非常的低，并且也非常昂貴。而且，鑒于不同物種中植酸酶基因的同源性很低，難以通過簡單的PCR直接篩選到新的植酸酶基因。為了解決這個問題，我們試著去發(fā)展了一個新的簡便有效的方法，該方法包括a)基于植酸酶保守序列RHGXRXP和HD設(shè)計一對簡并引物；b)利用所述引物通過PCR擴增部分植酸酶序列；和c)進(jìn)一步通過TAIL-PCR獲取植酸酶的全序列。具體而言，我們利用BLOCKS程序[http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html]通過分析大量組氨酸酸性磷酸家族的植酸酶的蛋白質(zhì)序列，找到了兩個比較保守的序列RHGXRXP和HD，并設(shè)計了一對簡并性引物FI(ForwardPrimer)，5’-GTKSTKAWwKTSAGYCGCCA-3’(20mer)(SEQIDNO3)和RI(ReversePrimer)，5’-TWKGCMAKRTTRGTATCRTG-3’(20mer)(SEQIDNO4)，用于擴增部分植酸酶基因(其中堿基縮寫的含義如下表3所示)。這個部分序列在已知的組氨酸酸性磷酸酶序列中大小約為900bp，可以根據(jù)大小對所擴增的序列進(jìn)行篩選。并對所獲得的900bp的序列進(jìn)行測序和BLAST分析。從分析結(jié)果我們可以很簡單的知道，所獲序列是否是植酸酶的序列。如果通過分析所獲的900bp的序列有可能是植酸酶基因，接下來通過TAIL-PCR(Liuetal.，ThermalasymmetricinterlacedPCRautomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics.1995Feb.10；25(3)674-81)獲取這900bp上下游的序列，從而得到完整的植酸酶基因。通過這種方法我們目前已經(jīng)成功地獲得了兩個植酸酶基因(分別來自本申請描述的Citrobacteramalonaticus和申請人另一發(fā)明中描述的Yersiniaintermedia和)，這兩個物種之間的植酸酶基因的相似性只有40.8％，因此說明該方法是可行的。通過比較該新方法比傳統(tǒng)的方法，簡單、有效、便宜、方便。表3具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，而并不旨在以任何方式限制本發(fā)明。實施例1產(chǎn)植酸酶的檸檬酸桿菌的初步篩選以本實驗室保藏的共6株檸檬酸桿菌(包括3株弗氏檸檬酸桿菌、2株未定種名的檸酸桿菌、1株無丙二酸擰檬酸桿菌)為出發(fā)菌株，產(chǎn)酶培養(yǎng)基使用LB培養(yǎng)基，其成分為0.5％的酵母粉、1％的蛋白胨、1％的氯化鈉、pH為7。培養(yǎng)條件接種適量檸檬酸桿菌到5mL的LB培養(yǎng)基中，30℃，200r/min試管培養(yǎng)14-16h。培養(yǎng)液通過離心分離，分別對上清液和菌體破碎液進(jìn)行植酸酶酶活性的測定。植酸酶的測定方法采用了硫酸亞鐵鉬藍(lán)法，具體操作步驟參照下文實施例3-3所述進(jìn)行。植酸酶活性單位(u)定義為在37℃下，每分鐘分解植酸鈉釋放出1μM無機磷酸所需要的酶蛋白的量為1U。從而確定6株檸檬酸桿菌中的無丙二酸檸檬酸桿菌(Citrobacteramalonaticus)有高的植酸酶活性，該菌株在本實驗室的編號為B-52，并按照專利法的相關(guān)規(guī)定送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，保藏號為CGMCC1696。實施例2CitrobacteramalonaticusB-52植酸酶基因的克隆通常，同一家族的基因在蛋白和核酸序列上通過比對，可以找到部分比較保守的序列。所以在獲取同一家族的其他希望所獲得的基因序列時，相似性克隆是一種非常有效簡單的方法。根據(jù)植酸酶的分類，可以得到大部分細(xì)菌來源的植酸酶都屬于組氨酸酸性磷酸酶家族。通過多序列比對程序CLUSTALW和模塊分析程序BLOCKS(http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html)，在對大量組氨酸酸性磷酸酶進(jìn)行分析時，我們找到了組氨酸酸性磷酸酶蛋白序列中兩個保守區(qū)域RHGXRXP和HD區(qū)域。基于這兩個保守區(qū)域，我們設(shè)計了如<2-1>所述的簡并引物用于從無丙二酸檸檬酸桿菌基因組DNA中擴增部分植酸酶序列。<2-1>部分植酸酶基因序列的獲得我們根據(jù)上述兩個保守區(qū)域RHGXRXP和HD、部分旁側(cè)序列以及密碼子偏好性，設(shè)計合成了如下的簡并性引物FI，5’-GTKSTKAWWKTSAGYCGCCA-3’(20mer)(SEQIDNO3)和RI，5’-TWKGCMAKRTTRGTATCRTG-3’(20mer)(SEQIDNO4)，并以無丙二酸檸檬酸桿菌基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴增。對于整個PCR成分而言，除了簡并引物和模板DNA自基因合成公司定制之外，其他的成分均購于TIANGENBIOTECHCO.，LTD。通過對PCR條件的優(yōu)化，我們確定了最佳的退火溫度50℃。整個PCR的反應(yīng)條件為1個循環(huán)，95℃，2分鐘；30個循環(huán)，95℃，30秒/退火溫度，30秒/72℃，1分鐘；最后在72℃延伸5分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)一系列的片段，即這些簡并引物擴增出了許多片段。接下來對這些條帶進(jìn)行分析，通過TaKaRa的瓊脂糖凝膠回收試劑盒，回收與估計目的條帶大小(900bp左右)相符的片段，并用單引物對該回收的片段進(jìn)行檢測，確信該片段是由雙引物所擴增出來的片段，再將其連結(jié)pGEMTeasy(Promega)載體，接著轉(zhuǎn)化大腸菌感受態(tài)細(xì)胞JM109。篩選轉(zhuǎn)化子，并對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒提取檢測，并將含有目的片段的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA序列的測定。結(jié)果確定了901bp的DNA序列為目標(biāo)片段。<2-2>完整的植酸酶序列的克隆為了獲得完整的植酸酶基因序列，以上所獲得的901bp目的片段上游和下游的序列，分別通過熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)克隆得到。因為TAIL-PCR是一種非常強大的用于揭示已知序列兩端的未知序列的工具，并且這也是非常簡單、快速、便宜、有效的方法，用于獲得已知序列兩端的未知序列。根據(jù)以上所獲得的901bp目的片段的DNA序列，設(shè)計了用于TAIL-PCR的巢式特異性引物，它們分別為上游特異性引物(usp，upspecialprimer)usp1(5’-GCAAATCCAGCCAGAAATGCCTCACCGG-3’)；usp2(5’-GCAATAACTGCCACCTGTTCTGGTGACGG-3’)；usp3(5’-ATCCCATTGCGGCCAATGG-3’)；下游特異性引物(dsp，downspecialprimer)dsp1(5’-GGTTGCGTGGGGGCGAATTCATGGGGAG-3’)；dsp2(5’-GAACTCCCGAAGTTGCCCGCAGCAGAGC-3’)；dsp3(5’-CCGTCTCATTATTGTTTATTGCTGG-3’)。另外一端的非特異性引物(AD，arbitrarydegenerateprimers)包括AD3(5’-WGTGNAGWANCANAGA-3’)；AD5(5’-AGWGNAGWANCAWAGG-3’)，這些非特異性引物是TAIL-PCR成敗的關(guān)鍵。上游特異性引物和下游非特異性引物一起用于PCR擴增，這兩條引物分別設(shè)計不同的退火溫度。TAIL-PCR的反應(yīng)條件基本與Liuetal.1995(Liuetal.，ThermalasymmetricinterlacedPCRautomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics.1995Feb.10；25(3)674-81)相同，故在此不再贅述。在整個循環(huán)過程中交錯的使用高的、低的退火溫度，產(chǎn)物的一端是特異性引物，而另一端是AD引物。通過瓊脂糖凝膠電泳分析TAIL-PCR的產(chǎn)物，結(jié)果表明已知的901bp的上游我們獲得一段850bp的片段。通過對TAIL-PCR條件的優(yōu)化，同樣在已知片段的下游我們也獲得了一段約950bp的片段。所獲得的這兩條片段，分別通過TaKaRa的瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，并將所回收的片段連接到pGEMTeasy(Promega)載體。接著轉(zhuǎn)化大腸菌感受態(tài)細(xì)胞JM109。篩選轉(zhuǎn)化子，并對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒提取檢測，并將含有目的片段的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA序列分析。以上所獲得的兩條片段序列和已知的片段序列都被輸入DNASTAR軟件，并通過序列拼接程序，將以上三條序列拼接成一條完整的序列。再使用ORFfind程序找到完整的植酸酶開放閱讀框。該閱讀框由1311bp組成，含有一段信號肽序列和成熟蛋白序列。<2-3>所獲得完整序列的分析所獲得的完整片段全長2527bp，含有一個1311bp的開放閱讀框(SEQIDNO1)。該開放閱讀框編碼一段22aa的信號肽序列和411aa的成熟蛋白序列。通過SignalP程序[http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/]，預(yù)測了信號肽，其最可能的切除位點在N端Ala22-Glu23之間。N端信號肽序列的確定，對于蛋白質(zhì)在異源表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，并得到有活性的蛋白非常重要。利用PeptideMass程序[http://cn.expasy.org/tools/peptide-masshtml]，還預(yù)測了除信號肽之外的成熟蛋白的分子量。成熟蛋白的預(yù)測分子量為46.3kDa，歸屬于組氨酸酸性磷酸酶家族。在NCBI的GenBank中利用BLAST服務(wù)器[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST]，對該基因序列進(jìn)行了相似性研究。結(jié)果表明該蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO2)與GenBank中所有的蛋白質(zhì)序列相比，同源性最高的是來源于弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)的植酸酶，同源性為70.1％。同時核酸序列也于GenBank中的核酸序列進(jìn)行了比對，相似性最高的也是來源于弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)的植酸酶基因，同源性為68.9％。因此可以確定這個來源于無丙二酸檸檬酸桿菌的開放閱讀框編碼了一個新的植酸酶，所獲得的植酸酶基因為新的基因。和其他的植酸酶一樣，該植酸酶被命名為AppA(AcidPhosPhataseA)。實施例3植酸酶AppA在畢赤酵母中的表達(dá)<3-1>表達(dá)載體的構(gòu)建為了獲得成熟蛋白的編碼區(qū)，設(shè)計合成了引物(BmF和BmR)。帶有EcoRI和NotI限制性酶切位點的引物BmF和BmR的序列在表4中列出。成熟蛋白的編碼區(qū)用引物BmF和BmR自無丙二酸檸檬酸桿菌的基因組DNA中擴增。擴增結(jié)果通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，表明目的大小的DNA片段被擴增，并將該條帶回收純化。通過EcoRI和NotI酶切位點連接進(jìn)入表達(dá)載體pPIC9(Invitrogen，SanDiego，Calif.)，構(gòu)建成酵母表達(dá)載體pPIC9-AppA。連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109。陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA測序，測序表明序列正確的轉(zhuǎn)化子用于制備重組質(zhì)粒。表達(dá)質(zhì)粒載體DNA進(jìn)一步用于轉(zhuǎn)化畢赤酵母。表4擴增成熟蛋白全長的引物。<3-2>轉(zhuǎn)化酵母及表達(dá)用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)畢赤酵母菌株GS115(Invitrogen)，根據(jù)畢赤酵母表達(dá)操作手冊，制備感受態(tài)細(xì)胞GS115。約8微克的表達(dá)質(zhì)粒載體用限制性內(nèi)切酶BglII進(jìn)行線性化，線性化的表達(dá)載體中加入80μL感受態(tài)細(xì)胞GS115，混合均勻，用Bio-RadGenePulser電擊儀電擊。電擊結(jié)束后立即加入1mL浴冷的1M的山梨醇，取300μL涂布于RDB培養(yǎng)基上。通過RDB平板篩選在基因組中插入了HIS4的轉(zhuǎn)化子。RDB平板上沒有組氨酸，GS115中HIS4也被破壞了，所以只有在GS115插入了HIS4的轉(zhuǎn)化子才能在RDB平板上生長。在RDB平板上培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)化子被接種到BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時。接著培養(yǎng)的菌體轉(zhuǎn)移到BMMY進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)植酸酶。<3-3>轉(zhuǎn)化子植酸酶活性的檢測通過硫酸亞鐵鉬藍(lán)法，總共72個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了植酸酶活性的檢測。其測定過程如下在950μL的底物溶液(4μM的植酸鈉，溶解在0.25M的乙酸鈉緩沖液中，pH為4.5)加入50μL稀釋的酶，并混合均勻，在37℃反應(yīng)30分鐘。接著在以上反應(yīng)體系中加入1mL10％的TCA(三氯乙酸)使酶蛋白變性，終止以上反應(yīng)。對于空白對照而言，在酶液中先加入1mL10％的TCA，使酶蛋白失活，接著在加入950μL的底物溶液，37℃放置30分鐘。等反應(yīng)終止后，再加入2mL的顯色液(0.576摩爾的硫酸，1％的鉬酸銨，7.32％的七個結(jié)晶水硫酸亞鐵。配置新鮮的使用)放置10分鐘。在700nm下檢測吸光值，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出酶活單位。一個酶活單位指37℃時，1分鐘釋放1μM無機磷所需的酶蛋白的量。經(jīng)過兩天的甲醇誘導(dǎo)后，72個轉(zhuǎn)化子中有40轉(zhuǎn)化子被檢測到植酸酶活性，在培養(yǎng)基上清的酶活單位范圍約在40-200U/mL之間。明顯以上所獲得的開放閱讀框為一個新的有功能的植酸酶基因，編碼一個新的具有植酸酶活性的蛋白。這個由以上開放閱讀框編碼的在酵母中表達(dá)的蛋白，被命名為r-AppA。實施例4重組植酸酶r-AppA的制備和純化為了純化酵母表達(dá)的重組植酸酶r-AppA，上清液酶活為200U/mL的轉(zhuǎn)化子在較優(yōu)的的培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件下通過搖瓶培養(yǎng)。經(jīng)過兩天的誘導(dǎo)之后，利用實施例4所描述的方法檢測植酸酶活性，上清液的酶活達(dá)到352unit/mL。經(jīng)過12000g離心10分鐘，含有植酸酶蛋白的上清液被收集，酵母菌體被去除。用0.22μm的濾膜對上清液進(jìn)行抽真空處理，去掉上清液中其他的雜質(zhì)。對處理過的上清進(jìn)行硫酸銨沉淀，硫酸銨粉末被加入到上清液中，到達(dá)80％的飽和度，攪拌過夜。離心收集沉淀，沉淀用0.1M，pH5.0的乙酸鈉緩沖液溶解。對溶解的沉淀溶液，再次離心，除去其中一些不溶的物質(zhì)。將所獲得的溶液裝入透析帶中，透析帶懸浮在0.1M，pH5.0的乙酸鈉緩沖液中，過夜處理，除去大量的鹽離子。接下來，使用截流分子量為10kDa的超濾管濃縮透析后的溶液，最終體積濃縮致約為500μL。最后，將得到的500μL濃縮液通過SephacrylS-200(PharmaciaBiotech)進(jìn)行分離。用0.1M，pH5.0的乙酸鈉緩沖液做為洗脫溶液，收集目的峰尖的洗脫液3mL。將收集液電泳檢測，表明目的蛋白已被純化。實施例5重組植酸酶r-AppA酶學(xué)性質(zhì)分析<5-1>重組植酸酶r-AppA分子量的確定以及脫糖基處理純化的重組植酸酶r-AppA分子量，通過SDS-PAGE電泳進(jìn)行測定。電泳結(jié)果圖1泳道1為標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道2為純化的重組植酸酶r-AppA；泳道3為脫糖基處理的r-AppA。根據(jù)電泳檢測的結(jié)果，純化的r-AppA的分子量被確定為52-59kDa，比理論分子量46.5kDa大(圖1)。通過NetNglyc(預(yù)測N糖基化位點的程序)程序，我們對r-AppA的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白有4個潛在的N-糖基化位點(Asn-Xaa-Ser/Thr)。分子量比理論值偏大很有可能就是由于糖基化的原故，所以對該重組蛋白用脫糖基化酶endoH進(jìn)行脫糖基處理。從以上電泳結(jié)果表明，該重組蛋白確實存在糖基化作用，用endoH處理后分子量變小了點，但從電泳圖上看，還差不多有49kDa，比理論分子量還稍偏大，可能是因為脫糖基化不徹底，也有可能是因為還存在其他的修飾等。其結(jié)果還有待進(jìn)一步的研究。<5-2>重組植酸酶r-AppA的最適pH和pH穩(wěn)定性在不同的溫度和pH條件下，對經(jīng)SephacrylS-200純化的重組植酸酶r-AppA進(jìn)行了植酸酶活性研究。PH值對植酸酶的影響被確定了利用以下緩沖液甘氨酸-鹽酸pH1.5-3.5；乙酸鈉-乙酸pH3.5-6.0；Tris-鹽酸pH6.0-8.5；和甘氨酸-氫氧化鈉pH8.5-10。所有這些對純化的植酸酶溶液進(jìn)行稀釋的緩沖液中都含有0.05％BSA和0.05％Triton。取50μL稀釋好的酶液，分別在pH2.0-10.0測定酶活。如圖2所示植酸酶的活性隨pH值的變化而變化，計算相對酶活確定最適pH。測定條件下，重組酶的最適pH為4.0-5.0，pH4.5時酶活達(dá)到最大值。pH2.0-8.0之間都可檢測到活性。重組植酸酶的pH穩(wěn)定性如圖2所示。將純化的重組植酸酶稀釋到一定濃度，取10μL在pH1-10的緩沖液中，37℃放置1h。然后再在37℃、pH4.5的條件下測定酶活，通過計算相對酶活來比較重組酶對pH的穩(wěn)定性。該酶在pH3.5-10都非常穩(wěn)定，處理一小時后還保留有85％以上的活性。在pH1.0-3.0時穩(wěn)定性略差點，處理一小時后還保留有40％以上的活性。<5-3>重組植酸酶r-AppA的最適溫度和熱穩(wěn)定性將純化的重組酶r-AppA稀釋到所示濃度，取50μL分別在10、20、30、40、45、50、55、60、70、80℃溫度下測定酶活，計算相對酶活，以確定該酶的最適溫度。其結(jié)果如圖3A所示，該酶的最適溫度在50-60℃之間，優(yōu)選55℃。在20-70℃之間保持較好的活性。將純化的重組酶r-AppA純酶稀釋到所示濃度，取2mL分別在70℃、80℃保溫。接著分別在5、10、15、20、30、60、120min取出100μL酶液稀釋到所示濃度。在37℃，pH4.5的條件下測定酶活，以未處理的原酶液作為100％的對照，其測定結(jié)果如圖3B所示。<5-3>金屬離子及抑制劑對重組植酸酶r-AppA活性的影響金屬離子及抑制劑對重組植酸酶r-AppA活性的影響在最適pH條件下進(jìn)行了測定。取50μL稀釋好的酶液，在37℃，pH4.5的條件下，反應(yīng)體系中加入終濃度為1mM金屬離子或抑制劑，進(jìn)行活性測定。計算相對酶活力，以未處理的做為對照100％。其結(jié)果如表5所示，Na+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、EDTA對酶活有促進(jìn)作用；而Zn2+、Cr3+、Cu2+、Fe2+有抑制作用；SDS完全抑制該重組酶的活性。<5-4>蛋白酶對重組植酸酶r-AppA活性的影響為了確定蛋白酶對重組植酸酶r-AppA活性的影響，純化的重組酶(0.2mg/mL)與0.1mg/ml的胃蛋白酶和胰蛋白酶等體積混合，保溫在37℃。接著分別在5、10、20、30、60、90、120min取樣。在37℃，pH4.5的條件下測定酶活性。以未用蛋白酶處理酶液做為100％的對照，計算相對酶活力。其結(jié)果如圖4所示，該重組植酸酶r-AppA對胃蛋白酶和胰蛋白酶都有很強的抗性。因此，該植酸酶能夠穩(wěn)定的在動物胃腸道中存在，不會被腸道蛋白酶降解。表5金屬離子及抑制劑對重組植酸酶活性的影響<5-5>重組植酸酶r-AppA比活的測定為了確定該植酸酶r-AppA的比活，首先通過Lowry方法確定了純化的重組酶r-AppA的酶蛋白的濃度。并且重組酶r-AppA酶活力單位，在37℃，pH4.5的條件下，通過硫酸亞鐵鉬藍(lán)法確定。通過計算，該重組植酸酶r-AppA的比活為3548±34U/mg，這是如今報道的比活最高的植酸酶。<5-6>植酸酶pI值的預(yù)測此外，經(jīng)VectorNTI7.0程序預(yù)測，該酶的理論pI值為6.2左右。實施例6重組植酸酶的飼喂效果<6-1>材料與方法植酸酶重組植酸酶r-APPA，最適PH為4.5試驗動物選擇健康的1日齡商品雛雞500只，用正對照組日糧飼養(yǎng)至6日齡。選取體重一致的健康雛雞400只，隨機分成5個處理，每個處理80只，分4群飼養(yǎng)。日糧配方試驗用玉米豆粕型日糧，參照NRC營養(yǎng)需要，結(jié)合現(xiàn)場生產(chǎn)實際設(shè)計日糧配方。處理組在負(fù)對照組日糧基礎(chǔ)上每公斤添加250U、500U和750U的植酸酶。試驗設(shè)計試驗采用完全隨機設(shè)計。試驗雞設(shè)5個處理，每個處理80只，分為4個重復(fù)，每個重復(fù)20只。負(fù)對照組日糧中不添加磷酸氫鈣，為基礎(chǔ)日糧，正對照組日糧中添加磷酸氫鈣；試驗組在負(fù)對照組日糧基礎(chǔ)上每公斤添加250U、500U和750U的植酸酶。<6-2>結(jié)果飼養(yǎng)試驗結(jié)果見表5。結(jié)果指出，玉米豆粕型日糧中添加250、500和750U/kg植酸酶能提高肉仔雞增重和攝食量。添加植酸酶較負(fù)對照提高增重，差異極顯著(p＜0.01)，而與正對照差異不顯著。表5.日糧添加植酸酶對肉雞生長的影響(單位g)肉仔雞脛骨中鈣磷含量分析表明(表6)，添加植酸酶能提高肉仔雞骨骼鈣磷含量，與負(fù)對照組的差異顯著(p＜0.01)，與正對照組骨骼鈣磷含量差異不顯著。表6.肉雞脛骨中鈣磷含量添加植酸酶顯著降低肉仔雞糞便中的氮磷含量如下(表7)表7.試驗肉雞糞便中鈣磷含量工業(yè)化應(yīng)用根據(jù)以上所述，我們所發(fā)明的新的植酸酶具有以下幾個優(yōu)點高比活，合適的作用pH，良好的熱穩(wěn)定性，強的蛋白酶抗性，容易發(fā)酵生產(chǎn)。所有這些優(yōu)點都意味著新發(fā)明的植酸酶作為飼料添加劑，將會更有應(yīng)用價值比以前所報道的植酸酶。第一，高比活意味著生產(chǎn)同樣量的酶蛋白，可以降解更多的植酸。即降解同樣量的植酸所需的酶蛋白量更少，成本也將更低。第二，合適的作用pH意味著該植酸酶可以更好的在動物腸道內(nèi)發(fā)揮作用。第三，良好的熱穩(wěn)定性意味著該酶在制粒加工的過程中不容易失活。第四，強的蛋白酶抗性意味著該植酸酶在動物腸道內(nèi)可以穩(wěn)定的存在，而不被蛋白酶降解。最后，容易發(fā)酵生產(chǎn)說明，可以通過簡單的工業(yè)發(fā)酵大量生產(chǎn)該植酸酶，并用于飼料行業(yè)。我們所發(fā)明的來源于CitrobacteramalonaticusB-52新的植酸酶可以克服通常所使用的植酸酶的缺陷。因此，我們所發(fā)明的植酸酶將會帶來比較大的商業(yè)價值。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所<120>一種新的植酸酶的克隆和表達(dá)<130>PF060010CNI<140>2006100765403<141>2006-04-30<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1311<212>DNA<213>無丙二酸檸檬酸桿菌(Citrobacteramalonaticus)<400>1atgaatacgctactttttcgattaataatgtttatattcatgtttggttctttcccatta60caggcggaagtgccagatgacatgaagctagaacgagttgtgatagtaagtcgccacggt120gtaagagcaccaacaaagttcaccccattgatgcaggaaatcacaccttactattggccg180caatgggatgttcccctgggctggttgacggctcggggtggtgagctcgtcaccgaaatg240ggacgatatcaacaaaaagtattaatcgataacggcgttctggaaagtaatgtatgtccg300tcaccagaacaggtggcagttattgccgataccgatcagcgcactcgtaaaaccggtgag360gcatttctggctggatttgcgccgggatgtaaaaataaggttcattatcaaaaagatcac420gataaaaaagatcctctttttaatccagtaaaaatgggggtgtgcgcttttaatgtacaa480aaaactcaggaagcgattctgacacgtgcggaaggaaacattgaacggtacactcagcgt540tatgactctgcattccgtactctggaacaggttctcaatttctcccggtcagcagcatgc600cgatcagcaagccagtctggttgcacgctaccaggaaccttaccttcagaactcagggtt660tctgcggataccgtttccttatctggcgcgtggagtctttcttccatgctgacggaaata720tttctattgcaagaggcgcagggaatgccagaggttgcgtgggggcgaattcatggggag780aaagaatggacagcgttattaagtctgcataatgctcagtttgaccttttgcaaagaact840cccgaagttgcccgcagcagagcaacaccattactcgatttgatcagcgaagcattagtg900agtaatgggtcaacagaaaatcattacggaattaaattacccgtctcattattgtttatt960gctggtcatgataccaatcttgcaaatctcagtggggtatttgatcttaactggtctcta1020cctgggcagccagataatacacctcctggcggggagctggttttcgaaagatggacgcga1080gtgagtgataacactgactggattcaaatttcgtttgtttttcagactcttcaacaaatg1140cgtaagtttaaacctttttcatcttcgtctctcccaaacaagattgtgcttacgttgccc1200tcttgccaggataaaaatcctgagggtatgtgtccattaaagcattttattgacattgtg1260cagacagcacgtattccacaatgtgcagtgatggctgatgtaaaccgttaa1311<210>2<211>436<212>PRT<213>無丙二酸檸檬酸桿菌(Citrobacteramalonaticus)<400>2MetAsnThrLeuLeuPheArgLeuIleMetPheIlePheMetPheGly151015SerPheProLeuGlnAlaGluValProAspAspMetLysLeuGluArg202530ValValIleValSerArgHisGlyValArgAlaProThrLysPheThr354045ProLeuMetGlnGluIleThrProTyrTyrTrpProGlnTrpAspVal505560ProLeuGlyTrpLeuThrAlaArgGlyGlyGluLeuValThrGluMet65707580GlyArgTyrGlnGlnLysValLeuIleAspAsnGlyValLeuGluSer859095AsnValCysProSerProGluGlnValAlaValIleAlaAspThrAsp100105110GlnArgThrArgLysThrGlyGluAlaPheLeuAlaGlyPheAlaPro115120125GlyCysLysAsnLysValHisTyrGlnLysAspHisAspLysLysAsp130135140ProLeuPheAsnProValLysMetGlyValCysAlaPheAsnValGln145150155160LysThrGlnGluAlaIleLeuThrArgAlaGluGlyAsnIleGluArg165170175TyrThrGlnArgTyrAspSerAlaPheArgThrLeuGluGlnValLeu180185190AsnPheSerArgSerAlaAlaCysArgSerAlaSerGlnSerGlyCys195200205ThrLeuProGlyThrLeuProSerGluLeuArgValSerAlaAspThr210215220ValSerLeuSerGlyAlaTrpSerLeuSerSerMetLeuThrGluIle225230235240PheLeuLeuGlnGluAlaGlnGlyMetProGluValAlaTrpGlyArg245250255IleHisGlyGluLysGluTrpThrAlaLeuLeuSerLeuHisAsnAla260265270GlnPheAspLeuLeuGlnArgThrProGluValAlaArgSerArgAla275280285ThrProLeuLeuAspLeuIleSerGluAlaLeuValSerAsnGlySer290295300ThrGluAsnHisTyrGlyIleLysLeuProValSerLeuLeuPheIle305310315320AlaGlyHisAspThrAsnLeuAlaAsnLeuSerGlyValPheAspLeu325330335AsnTrpSerLeuProGlyGlnProAspAsnThrProProGlyGlyGlu340345350LeuValPheGluArgTrpThrArgValSerAspAsnThrAspTrpIle355360365GlnIleSerPheValPheGlnThrLeuGlnGlnMetArgLysPheLys370375380ProPheSerSerSerSerLeuProAsnLysIleValLeuThrLeuPro385390395400SerCysGlnAspLysAsnProGluGlyMetCysProLeuLysHisPhe405410415IleAspIleValGlnThrAlaArgIleProGlnCysAlaValMetAla420425430AspValAsnArg435<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向簡并引物<400>3gtkstkawwktsagycgcca20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向簡并引物<400>4twkgcmakrttrgtatcrtg20權(quán)利要求1.一種分離的具有如下性質(zhì)的植酸酶蛋白a)理論分子量46.5kDa；b)最適pH在4-5之間；c)最適溫度在50-60℃之間；d)理論pI值為6.2；e)比活在3000U/mg以上；且f)對胃蛋白酶、胰蛋白酶具有高抗性。2.一種分離的蛋白，其選自a)包含SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽；b)由SEQIDNO2所示的多肽序列經(jīng)過一個或多個氨基酸的取代、缺失和/或插入衍生的具有植酸酶活性的多肽；c)由SEQIDNO1所示的核酸分子或其簡并序列所編碼的多肽；d)由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNO1所示核酸分子的互補鏈雜交的核酸所編碼的具有植酸酶活性的多肽；e)由SEQIDNO1所示核酸分子的等位基因或天然變體所編碼的具有植酸酶活性的多肽；或f)與SEQIDNO2所示的多肽序列具有至少70％同源性的具有植酸酶活性的多肽，優(yōu)選75％，80％，85％，90％或95％，特別是99％的同源性。3.如權(quán)利要求1或2所述的多肽，其來自檸檬酸桿菌屬微生物，優(yōu)選無丙二酸檸檬酸桿菌。4.一種分離的核酸分子，其編碼如權(quán)利要求1至3中任一項所述的蛋白。5.一種DNA構(gòu)建體或重組載體，其含有如權(quán)利要求4中所述的核酸分子。6.一種宿主細(xì)胞，其含有如權(quán)利要求4中所述的核酸分子或如權(quán)利要求5中所述的DNA構(gòu)建體或重組載體。7.如權(quán)利要求6中所述的宿主細(xì)胞，其為真核生物細(xì)胞。8.如權(quán)利要求6或7中所述的宿主細(xì)胞，其為畢赤酵母細(xì)胞。9.無丙二酸檸檬酸桿菌CitrobacteramalonaticusB-52，其保藏號為CGMCC1696。10.一種飼料添加劑，其含有選自如下的有效成分a)如權(quán)利要求1至3中任一項所述的蛋白；和/或b)如權(quán)利要求6至8中任一項所述的宿主細(xì)胞；和/或c)如權(quán)利要求9中所述的無丙二酸檸檬酸桿菌。11.如權(quán)利要求11所述的飼料添加劑，其還含有一種或多種選自角蛋白酶、脂解酶、淀粉酶、磷酸酶、麥芽糖酶、轉(zhuǎn)化酶、木聚糖酶、羧甲基纖維素酶的酶制品。12.如權(quán)利要求1至3中任一項所述的多肽，和/或如權(quán)利要求6至8中任一項所述的宿主細(xì)胞，和/或如權(quán)利要求9中所述的無丙二酸檸檬酸桿菌在制備飼料添加劑中的用途。13.一種產(chǎn)生植酸酶的方法，包括在適于植酸酶產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求6至8中任一項所述的宿主細(xì)胞。14.一種從靶生物體中分離植酸酶基因的新方法，包括a)基于植酸酶保守序列RHGXRXP和HD設(shè)計一對簡并引物；b)利用所述引物通過PCR擴增部分植酸酶序列；和c)進(jìn)一步通過TAIL-PCR獲取植酸酶的全序列。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的簡并引物對具有SEQIDNO3和4所示的序列。全文摘要本發(fā)明涉及一種新的植酸酶、編碼這個酶的基因及其生產(chǎn)菌株無丙二酸檸檬酸桿菌(CitrobacteramalonaticusB－52)。該植酸酶具有如下性質(zhì)比活高達(dá)3548±34U/mg，良好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，最適pH4.5，最適溫度55℃，強的蛋白酶抗性，且易于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。本發(fā)明也涉及含有所述基因的重組載體，含有所述載體的宿主細(xì)胞，利用基因工程方法產(chǎn)生植酸酶的方法。而且，本發(fā)明還涉及植酸酶在制備飼料添加劑中的用途以及相應(yīng)的飼料添加劑。此外，本發(fā)明還提供了一種全新的分離植酸酶基因的方法。文檔編號C07H21/04GK101063113SQ200610076540公開日2007年10月31日申請日期2006年4月30日優(yōu)先權(quán)日2006年4月30日發(fā)明者姚斌,羅會穎,黃火清,王亞茹,袁鐵錚,史秀云,柏映國,孟昆,楊培龍申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所