專利名稱：3,4,5,4’－四甲氧基二苯乙烷－3’－o－磷酸二鈉在抗腫瘤及其轉(zhuǎn)移藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’O-磷酸二鈉鹽的用途。
背景技術(shù)：
癌癥是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。在全球，癌癥每年大約奪去600萬人的生命，并有1000萬人處于死亡的邊緣。世界衛(wèi)生組織預(yù)測21世紀(jì)癌癥將成為人類的“第一殺手”。根據(jù)全國性死因回顧調(diào)查表明，20年來中國的癌癥發(fā)病和死亡率逐年上升，每5個(gè)因病死亡的人中，就有1個(gè)是死于癌癥，每200個(gè)家庭中，有1個(gè)家庭因有癌癥病人而遭受磨難。
在過去的幾十年中出現(xiàn)了多種癌癥治療方法，主要包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、激素治療、基因治療和免疫治療。其中，手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療已成為主要手段。化學(xué)治療指運(yùn)用化學(xué)藥物來治療癌癥。化學(xué)藥物治療是腫瘤診療中發(fā)展最快的一個(gè)領(lǐng)域，大量的針對(duì)不同靶點(diǎn)的新藥開始應(yīng)用于臨床，對(duì)藥物作用機(jī)制及藥代動(dòng)力學(xué)研究的進(jìn)展，也使臨床給藥途徑與方式更加適合于殺傷腫瘤細(xì)胞、保護(hù)正常組織。
目前化學(xué)治療的藥物主要有影響核酸生物合成的藥物(抗代謝物)，如氟尿嘧啶、6-羥基嘌呤、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、羥基脲；直接破壞DNA并阻止其復(fù)制的藥物如烷化劑類；抗腫瘤抗生素類如順鉑及卡鉑；干擾轉(zhuǎn)錄過程阻止RNA合成的藥物，如放線菌素D、阿霉素、其他抑制轉(zhuǎn)錄過程的抗生素；影響蛋白質(zhì)合成的藥物，如長春堿類、鬼臼毒素類、三尖杉酯堿、L-門冬酰胺酶；激素類，如腎上腺皮質(zhì)激素、雌激素、雄激素、他莫西芬、氨魯米特。目前常用抗癌化療與放療的方法可造成對(duì)人體不利的嚴(yán)重毒副反應(yīng)。
許多天然藥物的干擾微管蛋白聚合或解聚特性，被認(rèn)為是具有抗腫瘤的活性，包括長春新堿，紫杉烷和大環(huán)內(nèi)酯類抗腫瘤藥。微管在細(xì)胞分裂中具有重要作用，開發(fā)微管蛋白結(jié)合因子是基于他們具有干擾細(xì)胞增殖的能力。微管蛋白的解聚因子，如秋水仙素和長春新堿，具有抗有絲分裂的作用，導(dǎo)致腫瘤血管閉合。但是這個(gè)使腫瘤血管閉合的作用只能在藥量接近MTD(最高耐受劑量)時(shí)產(chǎn)生。最新被發(fā)現(xiàn)的血管生成抑制因子Endostatin，對(duì)新生血管生成有抑制作用，而對(duì)已形成的血管并沒有明顯作用，對(duì)腫瘤血管也沒有明顯的靶向作用。
近幾年發(fā)現(xiàn)的一類新型的微管蛋白解聚因子能解決這個(gè)問題，它能在低于MTD的劑量下就能使血管閉合(Expert Opin Investig Drugs.2004 Sep；13(9)1171-82)。 Vincent等人在2005年提到了一類具有類似屬性的新型微管蛋白解聚因子，作為血管靶點(diǎn)因子(VTAs)能破壞微管蛋白骨架，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)顯示血管靶點(diǎn)因子能選擇性誘導(dǎo)腫瘤血管的衰退，部分通過VE-cadherin信號(hào)通道。這類微管蛋白解聚因子選擇性的破壞腫瘤血管，并阻止新生腫瘤血管形成，而且對(duì)正常血管系統(tǒng)沒有影響。同時(shí)它能抑制微管蛋白的聚合、選擇性的導(dǎo)致腫瘤血管功能紊亂和結(jié)構(gòu)的破壞、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡，使得腫瘤細(xì)胞失去營養(yǎng)和氧氣的支持，而發(fā)揮其殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。
Gillian M.Tozer等人于2005年曾在具影響力的雜志Nature Rev Cancer中報(bào)道，指出該類化合物不但影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，也影響內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，快速改變血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，打斷血管中內(nèi)皮細(xì)胞的連接，從而迅速導(dǎo)致腫瘤血管功能紊亂和結(jié)構(gòu)的破壞。由于一般正常血管都是通過平滑肌細(xì)胞支撐的，這一類化合物只作用于沒有平滑肌細(xì)胞支持的血管，對(duì)平滑肌支持的血管沒有影響，從而迅速并有選擇性的導(dǎo)致腫瘤血管功能紊亂和結(jié)構(gòu)的破壞，進(jìn)而能選擇性的作用于腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞的毒性大大降低(NatRev Cancer.2005 Jun；5(6)423-35、J.Clin.Invest.，November 1，2005；115(11)2992-3006)。這類藥物目前被認(rèn)為是抗腫瘤最有前景的藥物之一。
目前國外同時(shí)在開展研究的該類藥物只有CombretastatinA-4進(jìn)入臨床研究，由于通過雙鍵連接，在Combretastatin中芪類單元的最有效破壞腫瘤血管是順式構(gòu)型，而反式構(gòu)型的芪類化合物對(duì)腫瘤沒有抑制作用。由于存在順反異構(gòu)，極易發(fā)生異構(gòu)化等反應(yīng)，反式結(jié)構(gòu)不但沒有藥效，同時(shí)也會(huì)帶來一定的毒副作用(CombretastatinA-4 LD50為500mg/kg)，使得CombretastatinA-4在保存和實(shí)際應(yīng)用中帶來了很大的困難。
本發(fā)明中3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽(AP)為合成的化合物，其結(jié)構(gòu)式如式(I) 它是由本公司自己創(chuàng)新、研制的一種全新化學(xué)物質(zhì)、全新結(jié)構(gòu)的腫瘤血管抑制劑，不同于CombretastatinA-4，兩個(gè)苯環(huán)是通過單鍵連接，使得3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽和CombretastatinA-4結(jié)構(gòu)的不同、構(gòu)象、結(jié)合力、逆反等作用都不同，極大的提高了藥物的穩(wěn)定性(光能使CombretastatinA-4異構(gòu)為反式構(gòu)型。因此需要避光保存)，也提高了對(duì)微管蛋白的作用功能，同時(shí)具有了更低的毒副作用(3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽的LD50為1243.0377mg/kg，CombretastatinA-4的LD50為500mg/kg，而環(huán)磷酰胺為小鼠和大鼠口服LD50分別為350和94mg/kg，順鉑大鼠腹腔給藥為13-14mg/kg)和更低的有效濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽的最低有效劑量為20mg/kg，相比CombretastatinA-4的50mg/kg，要降低一倍以上。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽具有良好的水溶性，它通過定向打靶，針對(duì)性地作用于是腫瘤血管，對(duì)非腫瘤血管沒有作用，這比直接抑制腫瘤細(xì)胞生長的傳統(tǒng)化療藥物有更大的優(yōu)勢；克服了傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物的毒副作用大，會(huì)導(dǎo)致耐藥的局限。對(duì)其在抗腫瘤和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用的研究表明，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽不但對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，在對(duì)肝癌、肺癌等腫瘤的試驗(yàn)表明，它比目前常規(guī)的化療藥物環(huán)磷酰胺的抗癌作用更強(qiáng)，而且具有顯著的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的效果。聯(lián)合用藥的試驗(yàn)表明，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽對(duì)于化療藥物具有顯著的增效作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供式(I)化合物，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
其中Na也可以為H、Na、K或NH4等金屬、銨鹽或有機(jī)胺。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供式(I)化合物，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽在制備抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供式(I)化合物，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽在制備聯(lián)合抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明所指的腫瘤可為實(shí)體腫瘤例如肉瘤和癌(例如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝臟腫瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維耳姆斯氏瘤、頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)，也可為血液瘤例如白血病(例如急性白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病、急性髓母細(xì)胞白血病、急性前髓細(xì)胞白血病、急性髓單核細(xì)胞白血病、急性單核細(xì)胞細(xì)胞白血病、急性紅白血病、慢性白血病、慢性髓細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病)、真性紅細(xì)胞增多、淋巴瘤(何杰金氏病、非何杰金氏病)、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、重鏈病。優(yōu)選地，為肉瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、白血病、人食管癌、胃腺癌。
研究表明，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽通過抑制微管蛋白的聚合、選擇性的導(dǎo)致腫瘤血管功能紊亂和結(jié)構(gòu)的破壞、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡，使得腫瘤細(xì)胞失去營養(yǎng)和氧氣的支持，而發(fā)揮其殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽還可以聯(lián)合其他治療方法，如化學(xué)治療、外科手術(shù)、放射治療、免疫療法、抗血管生成療法或者基因療法，顯著增加對(duì)腫瘤的治療效果。優(yōu)選地，所述另外的治療為使用抗腫瘤藥物的化學(xué)療法。更優(yōu)選地，所述另外的治療為使用細(xì)胞毒素和抗增殖、抑制血管生成的藥物的治療，優(yōu)選的藥物包括順鉑、氟尿嘧啶、阿霉素、瘤可寧、美法侖、紅豆杉醇、依立替康(irinotecan，CPT-11)、阿瓦斯汀(Avastin)、ZD6126(N-acetylcochinol-O-phosphate)和脈管鈣黏蛋白(vascular endothelial-cadherin)的抗體anti-VE-cadherin(BV 13)或against VE-cadherin(E4G10)等。
在抗腫瘤藥物中使用3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽作為有效成分時(shí)，最低有效劑量為20mg/kg，相比CombretastatinA-4的50mg/kg，要降低一倍以上。3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽的LD50為1243.0377mg/kg，相比CombretastatinA-4的LD50為500mg/kg，要提高2倍以上，極大地增加了其安全窗口，對(duì)治療各種腫瘤帶來極大的便利和選擇的余地。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，AP具有廣譜的抗腫瘤作用，尤其在抗肺癌，黑色素瘤以及S180腫瘤模型中有更加明顯的抑制腫瘤的效果。對(duì)肺癌有很好的抑制作用，特別是100mg/kg.d劑量組，抑瘤率達(dá)到72％以上，明顯比目前常規(guī)的環(huán)磷酰胺的抗癌作用強(qiáng)(實(shí)施例3)。對(duì)小鼠黑色素瘤B16有很好的抑制作用，在25mg/kg劑量組的抑瘤率達(dá)到52％以上(實(shí)施例5)。對(duì)S180腫瘤的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(實(shí)施例9)表明，該藥物的最低有效劑量達(dá)到20mg/kg左右，比同類型的combretastatinA-4最低有效劑量要降低一倍以上。在與50mg/kg劑量組中，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽的抑瘤效果要好于combretastatinA-4。
在與DDP聯(lián)合治療肝癌實(shí)驗(yàn)中(實(shí)施例8)，AP 100mg/kg的抑瘤率為41.9％、AP 100mg/kg+DDP 2.5mg/kg的抑瘤率為79.7％；陽性對(duì)照組抑瘤率為73.3％。表明3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽與DDP治療肝癌的聯(lián)合用藥具有很好協(xié)同治療作用，聯(lián)合用藥不但比AP單獨(dú)給藥效果明顯，同時(shí)也比陽性對(duì)照組有更好的抑制腫瘤效果。
在與DDP聯(lián)合用藥對(duì)S180腫瘤模型實(shí)驗(yàn)中(實(shí)施例10、11)，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽不但顯示了與DDP的聯(lián)合用藥對(duì)抑制S180腫瘤有很好的協(xié)同作用，同時(shí)在改善動(dòng)物生活質(zhì)量以及延長生命有明顯的效果。其中AP 300mg/kg+DDP2.5劑量組平均延長生命達(dá)到10天左右，存活率增大一倍以上，實(shí)驗(yàn)延續(xù)了一個(gè)月左右，該劑量的腫瘤小鼠基本的存活，由此可見，AP可能達(dá)到治愈腫瘤的效果。
以3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽為藥效成分，添加藥學(xué)上可接受的藥用輔料并通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法可以制備用于本發(fā)明的藥物制劑。本藥物制劑的劑型可以是口服給藥的劑型諸如片劑、膠囊(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊和微囊)、粉劑、顆粒劑和糖漿劑；非口服給藥的劑型諸如注射劑、凍干制劑、栓劑、丸劑、凝膠劑和貼劑。除這些常規(guī)劑型外，還可以將口服的速釋固體制劑(例如片劑、顆粒劑等)和用于口服或非口服給藥的緩釋制劑(片劑、顆粒、精細(xì)顆粒、丸劑、膠囊、糖漿、乳劑、懸浮液、溶液)用于本發(fā)明，通過常規(guī)方法也可以制備這些制劑。本發(fā)明中的制劑可以是包衣或未包衣的形式，視需要而定。本發(fā)明優(yōu)選的是將3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽用于注射給藥和口服的劑型。
本發(fā)明中的藥用輔料包括用于固體制劑的賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、發(fā)泡劑、包衣劑等，或用于半固體制劑、液體制劑的溶劑、增溶劑、懸浮劑、等滲劑、緩沖劑、潤膚劑、乳化劑等，此外，也可以根據(jù)需要使用其它藥用添加劑諸如防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑和矯味劑等。
下列實(shí)施例只用于說明發(fā)明，而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍無任何的限制。
具體實(shí)施例方式
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽的制備實(shí)施例13，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽的制備3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽(AP)由浙江賽爾生物醫(yī)學(xué)研究有限公司提供，其他試劑材料如無特別說明均為市售產(chǎn)品。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽(AP)的制備方法具體描述如下1、3，4，5-三甲氧基芐醇的制備250ml的三頸瓶中，加入3，4，5-三甲氧基苯甲醛15g(76.45mmol)，200ml的無水乙醇，加熱40℃溶解，再加入硼氫化鈉1.48g(38.23mmol)，加熱回流45min后，TLC檢測，反應(yīng)完全后，冷卻至室溫，加入去離子水10ml(555.8mmol)，淬滅后，抽濾，濾渣用20ml無水乙醇洗滌，合并濾液后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，加入100ml二氯甲烷溶解，用2N氫氧化鈉溶液50ml×2洗滌，再用去離子水50ml×2洗滌，加入適量的無水硫酸鎂干燥過夜。過濾，用20ml二氯甲烷洗滌濾渣，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得3，4，5-三甲氧基芐醇，無色油狀物14.05g，收率92.72％。
得到的產(chǎn)物不需要進(jìn)一步純化，即可進(jìn)行下一步反應(yīng)。若想得到純品可以減壓蒸餾，收集BP216-218℃/12mmHg的餾分。
2、3，4，5-三甲氧基芐溴的制備3，4，5-三甲氧基芐醇14.05g(70.89mmol)，用100ml二氯甲烷溶解，加入到250ml的三頸瓶中，三溴化磷6.73ml(70.89mmol)溶于25ml二氯甲烷中，室溫反應(yīng)50min后，冰浴冷卻，緩慢滴加18ml去離子水18ml(1.0mol)，淬滅反應(yīng)。然后再用100ml×2去離子水洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾，用20ml二氯甲烷洗滌濾渣，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，真空干燥，得3，4，5-三甲氧基芐溴，淡黃色固體16.05g，收率84.44％。
得到的產(chǎn)物不需要進(jìn)一步純化，即可進(jìn)行下一步反應(yīng)。若想得到純品可以用乙酸乙酯∶正己烷＝1∶3重結(jié)晶，得到白色片狀晶體。
3、3，4，5-三甲氧基芐溴-三苯基溴化磷的制備3，4，5-三甲氧基芐溴16.05g(61.47mmol)溶于150ml甲苯中，加入到250ml的三頸瓶中，加入三苯基磷16.12g(61.47mmol)，立即溶解，加熱回流1hr，有白色固體析出，冷卻到室溫，抽濾，濾餅用30ml甲苯洗滌，真空干燥后，得3，4，5-三甲氧基芐溴三苯基溴化磷，白色粉末固體27.81g，收率為86.44％得到的產(chǎn)物不需要進(jìn)一步純化，即可進(jìn)行下一步反應(yīng)。若想得到純品可以用丙酮洗滌固體，得白色粉末固體。
4、芐基保護(hù)異香蘭素的制備
250ml三頸瓶中，加入異香蘭素15g(98.59mmol)，200ml無水乙醇，加熱到40℃溶解，加入碳酸鉀9g(65.07mmol)，攪拌下加入氯化芐15ml(130.13mmol)，加熱回流1hr，TLC檢測反應(yīng)完全后，冷卻到50℃，趁熱過濾，濾液放入冰箱中冷卻過夜，晶體析出，抽濾，濾餅用30ml無水乙醇洗滌，真空干燥后，得芐基保護(hù)異香蘭素，白色針狀晶體19.72g，收率為82.56％。
得到的產(chǎn)物不需要進(jìn)一步純化，即可進(jìn)行下一步反應(yīng)。若想得到純品可以用無水乙醇重結(jié)晶，得到白色柱狀晶體。
5、(Z)和(E)-3，4，5-三甲氧基-3’-芐氧基-4’-甲氧基二苯乙烯的制備250ml三頸瓶中，加入3，4，5-三甲氧基芐溴三苯基溴化磷20.00g(38.21mmol)，150ml四氫呋喃，攪拌懸浮液，芐基保護(hù)異香蘭素10.00g(41.27mmol)溶于70ml四氫呋喃，放入100ml的滴液漏斗中。反應(yīng)瓶中加入固體叔丁醇鉀7.46g(66.49mmol)，反應(yīng)體系變?yōu)檠t色，室溫?cái)嚢?min，緩慢滴加芐基保護(hù)異香蘭素的溶液，再室溫?cái)嚢?0min，TLC檢測反應(yīng)完全后，倒入500ml的分液漏斗中，加入140ml去離子水后，溶液分層，加入乙醚300ml×2萃取，合并乙醚層，用無水硫酸鎂干燥，過濾，濾餅用50ml乙醚洗滌，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得油狀物25g，加入20ml無水乙醇固化，抽濾得淡黃色固體12.50g，收率為80.48％。
6、(Z)和(E)-3，4，5-三甲氧基-3’-芐氧基-4’-甲氧基二苯乙烯的重結(jié)晶50ml的圓底燒瓶中，加入順反異構(gòu)體12.50g(30.75mmol)，加入20ml無水乙醇，加熱部分固體溶解后，室溫?cái)嚢瑁闉V，濾餅用10ml的無水乙醚洗滌后，紅外燈干燥，得純順反異構(gòu)體9.27g，淡黃色粉末固體，收率為74.16％。
7、3，4，5-三甲氧基-3’-羥基-4’-甲氧基二苯乙烷的制備250ml的三頸瓶中，加入純(Z)和(E)-3，4，5-三甲氧基-3’-芐氧基-4’-甲氧基二苯乙烯5.14g(12.56mmol)，溶于100ml乙酸乙酯和60ml無水乙醇中，淡黃色溶液，加入5％鈀炭0.50g后，攪拌下通氫氣，室溫?cái)嚢?hr，過濾，得無色濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得油狀物4.05g，3，4，5-三甲氧基-3’-羥基-4’-甲氧基二苯乙烷粗品，收率為100％。
8、3，4，5-三甲氧基-3’-羥基-4’-甲氧基二苯乙烷的精制
500ml的圓底燒瓶中，加入3，4，5-三甲氧基-3’-羥基-4’-甲氧基二苯乙烷粗品4.05g(12.72mmol)，用20ml無水乙醇溶解，若有不溶物，過濾除去，室溫靜止，有晶體析出，放置過夜，溶劑揮發(fā)完全，大量白色晶體析出。過濾，濾餅用乙醇洗滌，白色晶體3.56g，收率為100％。
9、磷?；磻?yīng)在100ml圓底燒瓶中，加入三氯氧磷4.4ml(47.4mmol)和二氯甲烷25ml，滴加入3，4，5-三甲氧基-3’-羥基-4’-甲氧基二苯乙烷5g(15.7mmol)于10ml二氯甲烷的溶液。滴完后，攪拌5分鐘。滴加入三乙胺3.3ml(23.8mmol)于5ml二氯甲烷的溶液。室溫?cái)嚢?hr，TLC檢測，反應(yīng)完全后，加入100ml冷水淬滅。充分振蕩分出有機(jī)相；再用水50ml×2洗滌，二氯甲烷萃取水層后合并有機(jī)層，用適量無水硫酸鈉干燥過夜；抽濾，濾液減壓蒸去溶劑，得粘稠液體，即為粗酰氯。
10、成鹽反應(yīng)用冰浴冷卻粗酰氯，攪拌下加入2mol/L的NaOH溶液，直到混合液pH值在8～10之間，50℃～80℃攪拌8小時(shí)。過濾除去不溶物，減壓蒸去大部分溶劑，冷卻析晶得白色固體，為3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽粗品。粗品用乙醇加熱溶解，趁熱過濾除去不溶固體，濾液冷卻析晶得到3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽純品約6.0克，為白色結(jié)晶產(chǎn)物，產(chǎn)率86％。M.p.266-269℃(分解)；在水中的溶解度200mg/ml。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽的安全性評(píng)價(jià)實(shí)施例23，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽的LD50測定一、實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重18～22g，雌雄各半。
試劑0.9％NaCl，AP3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽(AP)浙江賽爾生物醫(yī)學(xué)研究有限公司提供，依上述方法制備，苦味酸器材1ml一次性注射器二、實(shí)驗(yàn)方法和步驟1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用KM小鼠，每組10只，雌雄各半，共設(shè)7組。用苦味酸標(biāo)記。
2.每組分別按體重以1300mg/kg、1250mg/kg、1200mg/kg、1150mg/kg、1100mg/kg、1050mg/kg、1000mg/kg尾靜脈注射給藥。
3.給藥后0.25h、0.5h、1h、2h、4h、24h分別觀察一次，記錄死亡率。以后每天觀察1次，記錄死亡率(表1)，持續(xù)14天，第15天處死未死亡的小鼠，進(jìn)行病理解剖。
表1 劑量—死亡率數(shù)據(jù)表(n＝4)

注n為實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果AP LD50＝1243.0377mg/kg置信區(qū)間為1049.9757≤LD50≤1471.5984對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中死亡的小鼠進(jìn)行解剖后沒有明顯病變；14天處死存活小鼠并進(jìn)行病理解剖，沒有出現(xiàn)病理變化。
說明3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽毒性很低，具有很好的臨床用藥安全性。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽的抗肺癌藥效學(xué)試驗(yàn)實(shí)施例33，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽抑制Lewis肺癌實(shí)驗(yàn)1、試驗(yàn)樣品樣品3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽(AP)用生理鹽水溶解。
對(duì)照品注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，上海華聯(lián)制藥有限公司，批號(hào)020806。配制時(shí)用生理鹽水溶解。
2、動(dòng)物和瘤株C57小鼠24只，雌性，體重17-21g，由浙江賽爾生物醫(yī)學(xué)研究有限公司動(dòng)物房提供。
Lewis肺癌荷瘤裸鼠1只，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院提供。
3、試驗(yàn)方法Lewis肺癌荷瘤裸鼠，在無菌條件下剝離腋下腫瘤，勻漿，記數(shù)細(xì)胞，用生理鹽水稀釋為1-2×107個(gè)/ml，按0.2ml/只給小鼠腋下皮下接種。接種后第2天將小鼠根據(jù)腫瘤大小隨機(jī)均分為4組，每組6只。
給藥劑量3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽(AP)，尾靜脈注射給藥，分別為50mg/kg.d、100mg/kg.d兩個(gè)劑量。
對(duì)照品環(huán)磷酰胺采用腹腔注射途徑給藥，劑量為30mg/kg.d。
另設(shè)空白對(duì)照組。
動(dòng)物接種第2日開始按體重給藥，連續(xù)10天，根據(jù)體重給藥，接種后第12天處死，取瘤塊稱重，計(jì)算抑瘤率。
結(jié)果判定根據(jù)以下公式 4、結(jié)果實(shí)驗(yàn)期間各組均未見死亡。
表2、AP抑制LLC小鼠(C57)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝3)

注n為實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)5、結(jié)論本實(shí)驗(yàn)中顯示，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽對(duì)小鼠Lewis肺癌有良好的抑制作用，特別是100mg/kg.d劑量組效果特別突出，明顯比常用的環(huán)磷酰胺的抗癌作用強(qiáng)。
實(shí)施例43，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽抑制NCI-H460腫瘤(人大細(xì)胞肺癌)1、試驗(yàn)樣品樣品3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽(AP)用生理鹽水溶解對(duì)照品注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，上海華聯(lián)制藥有限公司，批號(hào)020806。配制時(shí)用生理鹽水溶解。
2、動(dòng)物和瘤株裸鼠BALB/c-nu 15只，雌性，體重18-20g，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院提供。
NCI-H460荷瘤裸鼠1只，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院提供。
3、試驗(yàn)方法NCI-H460荷瘤裸鼠，在無菌條件下剝離腋下腫瘤，勻漿，記數(shù)細(xì)胞，用生理鹽水稀釋為1-2×107個(gè)/ml，按0.2ml/只給小鼠腋下皮下接種。9天后腫瘤生長到0.1cm3時(shí)，將裸鼠根據(jù)腫瘤大小隨機(jī)均分為3組，每組5只。
給藥劑量AP，0.2g/kg.d對(duì)照品環(huán)磷酰胺采用腹腔注射途徑給藥，劑量為30mg/kg.d。
另設(shè)空白對(duì)照組。
動(dòng)物接種第9日開始按體重給藥，靜脈，在給藥第二天開始，每隔一天用游標(biāo)卡尺測量、計(jì)算小鼠瘤重，接種后第17天處死，取瘤塊稱重，計(jì)算抑瘤率。
結(jié)果判定根據(jù)以下公式

4、結(jié)果實(shí)驗(yàn)期間各組均未見死亡。
表3、AP抑制NCI-H460荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝5)

注n為實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)**第8天為解剖數(shù)據(jù)，其它為游標(biāo)卡尺測量數(shù)據(jù)。
5、結(jié)論3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽對(duì)NCI-H460腫瘤(人大細(xì)胞肺癌)的抑制作用明顯高于陽性對(duì)照組(CTX)，即3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽對(duì)NCI-H460腫瘤(人大細(xì)胞肺癌)有特別突出的抑制作用。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽抑制小鼠黑色素瘤B16藥效試驗(yàn)實(shí)施例53，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽和combretastatinA-4抑制小鼠黑色素瘤B16試驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)材料樣品3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽(AP)，由浙江賽爾生物醫(yī)學(xué)研究有限公司提供。
陽性對(duì)照品注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，上海華聯(lián)制藥有限公司。
瘤源小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理室傳代維持。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠50只，雌性，17-22克。由上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(滬)2003-0003。
2、實(shí)驗(yàn)方法無菌條件下取對(duì)數(shù)生長期的B16小鼠黑色素瘤培養(yǎng)細(xì)胞，制備成約2.8×105/ml細(xì)胞懸液，于C57BL/6小鼠尾靜脈接種0.2ml/每鼠，次日按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案給藥，連續(xù)給藥15天后處死，取瘤塊稱重，計(jì)算抑瘤率。
結(jié)果判定根據(jù)以下公式

表4、ZC-1抑制B16小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝3)

注n為實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)3、結(jié)果分析3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽對(duì)小鼠黑色素瘤B16有很好的抑制作用，在25mg/kg低劑量組中，顯示了很好抑瘤效果。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥效及其與combretastatinA-4在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥效的對(duì)比試驗(yàn)實(shí)施例63，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽和combretastatinA-4抑制小鼠黑色素瘤B16肺轉(zhuǎn)移試驗(yàn)1、受試物1.1名稱樣品3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽(AP)，combretastatinA-4(A4)。
1.2來源AP、A4均由浙江賽爾生物醫(yī)學(xué)研究有限公司提供。
1.3配制精確稱取AP樣品直接以生理鹽水配制和稀釋至所需濃度，置于4℃冰箱中備用。A4樣品需加入少量吐溫80濕潤，助溶再逐漸加入0.5％CMC-Na溶液至完全混勻，稀釋至所需濃度，該樣品需避光且不穩(wěn)定，故需每日現(xiàn)配現(xiàn)用。
2、實(shí)驗(yàn)材料2.1溶劑生理鹽水及0.5％CMC-Na溶液，吐溫80。
2.2陽性對(duì)照品注射用環(huán)磷酰胺，上海華聯(lián)制藥有限公司。
2.3瘤源小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理室傳代維持。
3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3.1來源C57BL/6小鼠由上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(滬)2003-0003。
3.2體重C57BL/6小鼠20克左右。
3.3性別雌性。
3.4動(dòng)物數(shù)實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組為9-10只小鼠，陰性對(duì)照為兩組。
4、實(shí)驗(yàn)方法無菌條件下取對(duì)數(shù)生長期的B16小鼠黑色素瘤培養(yǎng)細(xì)胞，制備成約2.8×105/ml細(xì)胞懸液，于C57BL/6小鼠尾靜脈接種0.2ml/每鼠，次日按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案給藥，四周左右處死各組動(dòng)物，剖取各組小鼠的肺臟，計(jì)測每鼠肺臟所轉(zhuǎn)移的集落數(shù)，以各組腫瘤平均集落數(shù)，按下列公式計(jì)算抗肺轉(zhuǎn)移率
抗肺轉(zhuǎn)移率％＝[(對(duì)照組平均集落數(shù)-給藥組平均集落數(shù))/對(duì)照組平均集落數(shù)]×100％5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果AP樣品100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg，iv×10qd對(duì)尾靜脈接種小鼠B16黑色素瘤抗肺轉(zhuǎn)移率分別為41.69％、35.36％、29.27％。參照品A4 50mg/kg，ip×10qd的療效為32.79％。詳見表5。
6、結(jié)果分析AP樣品在所設(shè)計(jì)的劑量范圍內(nèi)對(duì)尾靜脈接種小鼠B16黑色素瘤模型具有一定的抗肺轉(zhuǎn)移率。在同劑量時(shí)與參照品A4抗轉(zhuǎn)移結(jié)果相似。實(shí)驗(yàn)過程中還觀察到在給藥前后體重變化與陰性對(duì)照組接近，反映出該樣品在上述治療劑量時(shí)比較安全。
表5 小鼠黑色素瘤B16實(shí)驗(yàn)肺轉(zhuǎn)移療效結(jié)果(n＝3)

注1)、***P值＜0.01，**P值＜0.05與陰性對(duì)照組相比2)、試驗(yàn)組在接種后三周左右各解剖1只，觀察肺轉(zhuǎn)移情況，以正確確定最終的解剖日期，故終點(diǎn)時(shí)各組尚存9只小鼠。并非樣品毒性所至的死亡。
3)、注n為實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)3、結(jié)果分析3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽對(duì)小鼠黑色素瘤B16實(shí)驗(yàn)肺轉(zhuǎn)移有很好的抑制作用。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽的抗肝癌藥效學(xué)試驗(yàn)實(shí)施例73，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽對(duì)小鼠肝癌H22作用1、試驗(yàn)樣品樣品3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽(AP)用生理鹽水溶解。
對(duì)照品注射用順鉑(DDP)，齊魯制藥有限公司，批號(hào)0503008。配制時(shí)用生理鹽水溶解。
2、動(dòng)物和瘤株小鼠40只，雌性，體重18-20g，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院提供。
H22荷瘤小鼠1只，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院提供。
3、試驗(yàn)方法H22荷瘤小鼠，在無菌條件下剝離腋下腫瘤，勻漿，記數(shù)細(xì)胞，用生理鹽水稀釋為1-2×107個(gè)/ml，按0.2ml/只給小鼠腋下皮下接種。9天后腫瘤生長到0.1cm3時(shí)，將小鼠根據(jù)腫瘤大小隨機(jī)均分為4組，每組5只。設(shè)2個(gè)藥物計(jì)量組50mg/kg、100mg/kg。對(duì)照品DDP采用腹腔注射途徑給藥，劑量為2.5mg/kg。
另設(shè)空白對(duì)照組。
動(dòng)物接種第9日開始按體重靜脈給藥，接種后第24天處死，取瘤塊稱重，計(jì)算抑瘤率。
結(jié)果判定根據(jù)以下公式

4、結(jié)果實(shí)驗(yàn)期間各組均未見死亡。
表6 AP對(duì)H22荷瘤小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝2)


注n為實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)5、結(jié)論3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽對(duì)小鼠肝癌H22有很好的抑制作用，特別是100mg/kg劑量組效果更好。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽聯(lián)合用藥試驗(yàn)實(shí)施例83，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽與DDP治療肝癌的聯(lián)合用藥試驗(yàn)1、試驗(yàn)樣品樣品3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽(AP)用生理鹽水溶解。
對(duì)照品注射用順鉑(DDP)，齊魯制藥有限公司，批號(hào)0503008。配制時(shí)用生理鹽水溶解。
2、動(dòng)物和瘤株小鼠40只，雌性，體重18-20g，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院提供。
H22荷瘤小鼠1只，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院提供。
3、試驗(yàn)方法H22荷瘤小鼠，在無菌條件下剝離腋下腫瘤，勻漿，記數(shù)細(xì)胞，用生理鹽水稀釋為1-2×107個(gè)/ml，按0.2ml/只給小鼠腋下皮下接種。9天后腫瘤生長到0.1cm3時(shí)，將裸鼠根據(jù)腫瘤大小隨機(jī)均分為4組，每組10只。
設(shè)4個(gè)劑量組分別為AP 100mg/kg、AP 100mg/kg+DDP 2.5mg/kg、DDP2.5mg/kg，靜脈給藥。
另設(shè)空白對(duì)照組。
動(dòng)物接種第9日開始按體重給藥，接種后第24天處死，取瘤塊稱重，計(jì)算抑瘤率。
結(jié)果判定根據(jù)以下公式

4、結(jié)果AP 100mg/kg的抑瘤率為41.9％、AP 100mg/kg+DDP 2.5mg/kg的抑瘤率為79.7％；陽性對(duì)照組抑瘤率為73.3％。
表明3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽與DDP治療肝癌的聯(lián)合用藥具有很好協(xié)同治療作用，聯(lián)合用藥不但比AP單獨(dú)給藥效果明顯，同時(shí)也比陽性對(duì)照組有更好的抑制腫瘤效果。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽在S180腫瘤模型藥效學(xué)試驗(yàn)實(shí)施例93，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽對(duì)S180腫瘤作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠，體重18～22g，雌性，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
腫瘤細(xì)胞株小鼠肉瘤S180，中科院上海細(xì)胞所提供，KM小鼠腹腔體內(nèi)傳代。
樣品3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽(AP)，用0.9％NaCl溶解。
對(duì)照品注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，上海華聯(lián)制藥有限公司，批號(hào)020806。配制時(shí)用生理鹽水溶解。
實(shí)驗(yàn)步驟1、選取生長狀態(tài)良好的S180肉瘤細(xì)胞，配制成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為(1～2)×107/ml，接種于昆明鼠腹腔，在無菌條件下，按常規(guī)方法抽取小鼠腹水。用生理鹽水配置成5×107/ml單細(xì)胞懸液，接種于雌性昆明小鼠后肢皮下，每只小鼠注射0.2ml(含腫瘤細(xì)胞1×107個(gè))，共接種50只小鼠。
2、接種后第3天開始測量腫瘤體積，待大部分小鼠腫瘤生長至0.5cm后剔除腫瘤生長不良的個(gè)別小鼠，進(jìn)行隨機(jī)分組，每組6只，按設(shè)計(jì)劑量每天給藥，給藥9天后動(dòng)物稱體重，并剖取各組動(dòng)物的腫瘤，稱濕重，最后統(tǒng)計(jì)各組動(dòng)物的抑瘤率。
瘤重抑制率％＝(1-治療組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)×100％
表7 抑制S180荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝5)

注n為實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)結(jié)果分析3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽對(duì)S180腫瘤有很好抑制作用，且最低有效計(jì)量為20mg/kg。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽及其聯(lián)合DDP在S180腫瘤模型藥效學(xué)試驗(yàn)實(shí)施例103，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽及其聯(lián)合DDP對(duì)S180腫瘤作用實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠，體重18～22g，雌性，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
2.腫瘤細(xì)胞株小鼠肉瘤S180，中科院上海細(xì)胞所提供，KM小鼠腹腔體內(nèi)傳代。
3.樣品3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽(AP)，用0.9％NaCl溶解；順鉑(DDP)，齊魯制藥有限公司，批號(hào)0503008，配制時(shí)用生理鹽水溶解。
4.對(duì)照品注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，上海華聯(lián)制藥有限公司，批號(hào)020806。配制時(shí)用生理鹽水溶解。
實(shí)驗(yàn)方法和步驟1、選取生長狀態(tài)良好的S180肉瘤細(xì)胞，配制成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為(1～2)×107/ml，接種于昆明鼠腹腔，在無菌條件下，按常規(guī)方法抽取小鼠腹水。用生理鹽水配置成5×107/ml單細(xì)胞懸液，接種于雌性昆明小鼠后肢皮下，每只小鼠注射0.2ml(含腫瘤細(xì)胞1×107個(gè))，共接種40只小鼠。
2、接種后第3天開始測量腫瘤體積，待大部分小鼠腫瘤生長至0.5cm后剔除腫瘤生長不良的個(gè)別小鼠，進(jìn)行隨機(jī)分組，每組6只，按設(shè)計(jì)劑量給藥，給藥9天后動(dòng)物稱體重，并剖取各組動(dòng)物的腫瘤，稱濕重，最后統(tǒng)計(jì)各組動(dòng)物的抑瘤率。
瘤重抑制率％＝(1-治療組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)×100％表8 AP及其與DDP聯(lián)合用藥對(duì)S180腫瘤模型的作用結(jié)果(n＝3)

結(jié)果分析3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽對(duì)S180腫瘤有良好的抑制作用，與DDP的聯(lián)合用藥對(duì)抑制S180腫瘤有很好的協(xié)同作用。
實(shí)施例113，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽及其與DDP治療S180的聯(lián)合用藥生命延長率試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料1、驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠，體重18～22g，雌性，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
2、瘤細(xì)胞株小鼠肉瘤S180，中科院上海細(xì)胞所提供，KM小鼠腹腔體內(nèi)傳代。
3、AP用0.9％NaCl溶解，順鉑(DDP)，齊魯制藥有限公司，批號(hào)0503008。配制時(shí)用生理鹽水溶解。
注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，上海華聯(lián)制藥有限公司，批號(hào)020806。配制時(shí)用生理鹽水溶解。
實(shí)驗(yàn)方法和步驟1、選取生長狀態(tài)良好的S180肉瘤細(xì)胞，配制成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為(1～2)×107/ml，接種于昆明鼠腹腔，在無菌條件下，按常規(guī)方法抽取小鼠腹水。用生理鹽水配置成5×107/ml單細(xì)胞懸液，接種于雌性昆明小鼠后肢皮下，每只小鼠注射0.2ml(含腫瘤細(xì)胞1×107個(gè))，共接種50只小鼠。
2、接種后第3天開始測量腫瘤體積，待大部分小鼠腫瘤生長至0.5cm后剔除腫瘤生長不良的個(gè)別小鼠，進(jìn)行隨機(jī)分組，每組6只，按設(shè)計(jì)方案給藥，記錄小鼠生存天數(shù)。31天后記錄數(shù)據(jù)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(見表9)。
平均生存天數(shù)為每組中小鼠的生存天數(shù)的平均值；生命延長天數(shù)為實(shí)驗(yàn)組的平均生存天數(shù)減去空白組的平均生存天數(shù)所得；生命延長率＝(T/C-1)×100％，T值為實(shí)驗(yàn)組小鼠的平均生存天數(shù)，C值為對(duì)照組小鼠的平均生存天數(shù)。
表9 生命延長率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝3)


結(jié)果分析1、從各組數(shù)據(jù)來看，無論是AP單獨(dú)給藥，還是與DDP聯(lián)合給藥，都具有很好的抗腫瘤作用。
2、聯(lián)合用藥的數(shù)據(jù)上，從第2組(300mg/kg隔2天給藥)，第4組(AP300mg/kg+DDP2.5隔2天給藥)，第5組(DDP2.5隔2天給藥)的數(shù)據(jù)可以看出，聯(lián)合用藥藥效結(jié)果優(yōu)于單獨(dú)化療或單獨(dú)給予AP的實(shí)驗(yàn)組。
3、從31天后的存活數(shù)量看，第4組(AP 300mg/kg+DDP2.5隔2天給藥)死亡一只，尚有5只存活，陽性對(duì)照組DDP死亡5只，存活1只，陰性對(duì)照組全部死亡，由此可以看出，AP能明顯地改善動(dòng)物生活質(zhì)量、延長腫瘤動(dòng)物的生命。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽通過定向打靶，針對(duì)性地作用于腫瘤血管，對(duì)所有的實(shí)體瘤均有抑制腫瘤的效果，對(duì)于同類藥物CombretastatinA-4也有各種適應(yīng)證的研究報(bào)道，因此可利用以上實(shí)驗(yàn)作出各種改變，適用的所有實(shí)體瘤均在本發(fā)明要求的權(quán)利范圍之內(nèi)。
以上對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
1.式(I)化合物，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽在制備抗腫瘤及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中Na為H、K或NH4、銨鹽、有機(jī)胺及其他金屬鹽或有機(jī)鹽替代。
3.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的腫瘤為所有實(shí)體瘤。
4.權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述所有的實(shí)體腫瘤為所有肉瘤和癌。
5.權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中所述肉瘤和癌為纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝臟腫瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維耳姆斯氏瘤、頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤。
6.權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤為肉瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、食管癌或胃腺癌。
7.權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中所述的腫瘤為肺癌、肝癌、肉瘤或黑色素瘤。
8.權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述的肺癌為Lewis肺癌、人大細(xì)胞肺癌。
9.式(I)化合物，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽在制備腫瘤聯(lián)合治療藥物中的應(yīng)用
10.權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤聯(lián)合治療藥物為3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽在與化療藥物聯(lián)合的藥物。
11.權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其中所述化療藥物為順鉑、氟尿嘧啶、阿霉素、瘤可寧、美法侖、依立替康(irinotecan，CPT-11)、紅豆杉醇、ZD6126(N-acetylcochinol-O-phosphate)和阿瓦斯汀(Avastin)。
12.權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤聯(lián)合治療藥物為3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二鈉鹽與順鉑聯(lián)合的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及3，4，5，4’－四甲氧基二苯乙烷－3’O－磷酸二鈉鹽在制備抗腫瘤及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。3，4，5，4’－四甲氧基二苯乙烷－3’－O－磷酸二鈉鹽通過抑制微管蛋白的聚合、選擇性的導(dǎo)致腫瘤血管功能紊亂和結(jié)構(gòu)的破壞、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡，使得腫瘤細(xì)胞失去營養(yǎng)和氧氣的支持，而發(fā)揮其殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。
文檔編號(hào)C07F9/12GK101062043SQ20061008006
公開日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2006年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月30日
發(fā)明者李亦平, 李寧, 周丹萍, 陳立鉆 申請(qǐng)人:浙江賽爾生物醫(yī)學(xué)研究有限公司