專利名稱：肝細胞癌相關基因和蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物科學領域，更具體地是癌癥研究領域。特別地，本發(fā)明涉及新的蛋白，ZNFN3A1，其參與肝細胞癌細胞的增生機制。本發(fā)明蛋白能夠被用來，例如，作為開發(fā)抗肝癌藥物的靶分子。
背景技術：
肝細胞癌(HCC)是世界上最常見的癌癥之一，而且它的發(fā)病率在日本以及美國正逐漸升高(Akriviadis EA等，Br J Surg.1998 Oct；85(10)1319-31)。雖然最近的醫(yī)學進展已經在診斷方面取得很大進步，很多HCC患者仍然是在晚期才被診斷出，而且他們的疾病依然很難完全治愈。此外，由于肝硬變或慢性肝炎患者具有HCC的高風險，它們可能形成多發(fā)肝腫瘤，或者甚至在完全除去原始腫瘤后形成新腫瘤。因此，開發(fā)高效化療藥物和預防策略是迫切關心的問題。
最近的分子生物學進展表明多步驟過程在肝癌起源和發(fā)展為結腸腫瘤的過程中構成了肝癌發(fā)生的基礎。這些過程包括各種基因產物的定性和定量改變。在一HCC亞群中，在包括TP53和AXIN1在內的腫瘤抑制基因、以及諸如c-myc、細胞周期蛋白D1和s-連環(huán)蛋白等癌基因中觀察到基因改變(Tanaka S等，Cancer Res.1993 Jun 15；53(12)2884-7；Satoh S等，NatGenet.2000 Mar；24(3)245-50)。在肝腫瘤細胞中的染色體區(qū)4q、6q、8p、8q、9p、9q、13q、16p、16q和17p已經報道了頻繁的雜合性的丟失(LOH)(Feitelson MA等，Oncogene 2002 Apr 11；21(16)2593-604)。除了這些基因改變之外，許多基因例如TGFα的表達在改變在肝癌發(fā)生中發(fā)揮著作用(LeeGH等，Cancer Res 1992 Oct 1；52(19)5162-70)。
發(fā)明概述本發(fā)明人以前分析了肝細胞癌中基因的基因組范圍內表達并鑒定了許多傾向于參與肝癌發(fā)生的基因。我們還公開了與患者體內的肝炎病毒類型、腫瘤的組織學等級以及它們的血管浸潤狀態(tài)相關聯的基因(Okabe H等，Cancer Res.2001 Mar 1；61(5)2129-37)。雖然已經鑒定了一些腫瘤抑制基因，例如p53和p16INK4A的失活，但迄今為止還沒有哪個已知的癌基因被證明在肝細胞癌中通常是激活的。
本申請?zhí)峁┝朔蛛x的在肝細胞癌中過表達的基因ZNFN3A1，并鑒定出一種具有鋅指結構域和SET結構域的癌蛋白。該新基因ZNFN3A1的表達在HCC中常常是上調的，并傾向于通過轉錄激活性RNA聚合酶II復合體賦予癌細胞致癌活性，這種致癌活性，反過來，增強靶基因，包括EGFR的轉錄。因此，ZNFN3A1充當HCC的新的分子靶。
本發(fā)明的一個目的是提供參與肝細胞癌細胞增殖機制的新蛋白和編碼該蛋白的基因，以及制備并利用它們診斷和治療肝細胞癌(HCC)的方法。
發(fā)明人著手發(fā)現治療HCC的藥物發(fā)現的新靶標。因此，他們利用全基因組cDNA微陣列分析了HCC的表達概況。本文報道的是新的人類基因ZNFN3A1的鑒定，它的表達在大多數HCC中與相應的非癌肝組織相比顯著升高。ZNFN3A1 cDNA由1622個核苷酸組成，它含有一個1284個核苷酸的開放讀框，編碼公認的帶有鋅指基元的428個氨基酸的蛋白。有意思的是，ZNFN3A1蛋白的亞細胞定位在細胞周期的進展過程中或者由于培養(yǎng)細胞的密度而發(fā)生改變；當細胞在S期中期到晚期或者培養(yǎng)在稀疏(sparse)條件下時，它在核中積聚，而當它們處于其它階段和生長于密集條件下時，它定位于胞漿及核中。此外，ZNFN3A1直接與RNA螺旋酶KIAA0054結合，并與RNA聚合酶II形成復合體，通過該復合體與5’側翼區(qū)“(C)CCCTCC(T)”元件的直接結合，它激活下游基因包括表皮生長因子受體(EGFR)的轉錄。一致地，ZNFN3A1在NIH3T3細胞中的外源表達使細胞生長增加，而用反義S-寡核苷酸阻抑它的表達導致肝細胞癌細胞顯著的生長抑制。這些發(fā)現表明ZNFN3A1通過與RNA螺旋酶和RNA聚合酶II形成復合體，轉錄激活包括EGFR在內的靶基因，從而賦予癌細胞致癌活性，而且抑制該復合體的活性應該是有前景的治療HCC的策略。
因此，本發(fā)明涉及參與細胞增殖的新的ZNFN3A1蛋白和編碼它們的基因，以及它們的制備和應用。更具體地，本發(fā)明提供了以下這些本申請?zhí)峁┝舜龠M細胞增殖和靶基因轉錄激活的新的人類蛋白ZNFN3A1或其功能等價體。在優(yōu)選的實施方案中，ZNFN3A1蛋白包括由SEQ.ID.NO.1的開放讀框編碼的公認的具有鋅指基元的428個氨基酸的蛋白。鋅指結構域(MYND)位于密碼子49-87而SET(Su 3-9，zeste增強子，Trihorrax)結構域位于密碼子117-246。ZNFN3A1蛋白優(yōu)選包括SEQ.ID.NO.2所示的氨基酸序列。本申請還提供分離的由至少一部分ZNFN3A1多核苷酸序列、或者有至少15％，更優(yōu)選至少25％與SEQ.ID.NO.1所示的序列互補的多核苷酸序列編碼的蛋白。
本發(fā)明進一步提供新的人類基因ZNFN3A1，它的表達在大多數IHCC中與相應的非癌肝組織相比顯著升高。分離的ZNFN3A1基因包括如SEQ.ID.NO.1中所描述的多核苷酸序列。特別地，ZNFN3A1 cDNA包括含有1284個核苷酸的開放讀框的1622個核苷酸。本發(fā)明進一步涵蓋與SEQ.ID.NO.1所示的多核苷酸序列雜交并至少有15％，更優(yōu)選至少25％與之互補的多核苷酸，只要它們編碼ZNFN3A1蛋白或其功能等價體。這種多核苷酸的例子是SEQ.ID.NO.1的簡并序列。
如本文所用，“分離的ZNFN3A1基因”是指其結構與天然存在的多核苷酸或者天然存在的跨越3個以上獨立基因的基因組多核苷酸片段不同的多核苷酸。因此該術語包括，例如(a)具有其天然存在的生物體基因組中天然存在的基因組DNA分子的部分序列的DNA；(b)摻入到載體或者原核生物或真核生物基因組DNA中，從而使所產生的分子與任何天然存在的載體或基因組DNA不同的多核苷酸；(c)獨立的分子例如cDNA、基因組片段、由聚合酶鏈式反應(PCR)制備的片段或者限制性片段；和(d)雜合基因，即編碼融合多肽的基因的部分重組核苷酸序列。該定義具體排除的是存在于不同(i)DNA分子，(ii)轉染的細胞或(iii)細胞克隆的混合物中的DNA分子的多核苷酸；例如，象存在于DNA文庫例如cDNA或基因組DNA文庫的中的這些多核苷酸。
因此，在一方面，本發(fā)明提供了編碼本文所述的多肽的分離的多核苷酸或其片段。優(yōu)選地，分離的多肽包括與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有至少60％同一性的核苷酸序列。更優(yōu)選地，分離的核酸分子與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。在分離的多核苷酸長度比參照序列，如SEQ ID NO1更長或相等的情況下，比較是與參照序列的全長進行的。當分離的多核苷酸比參照序列短，例如比SEQ ID NO1短的時候，比較是與相同長度的參照序列片段進行的(排除任何同源計算所需的環(huán))。
還提供了包括ZNFN3A1蛋白和至少一個它的共激活因子的轉錄激活復合體。在一個實施方案中，共激活因子可以是RNA螺旋酶和/或RNA聚合酶。RNA螺旋酶可以是RNA螺旋酶KIAA0054。RNA聚合酶可以是RNA聚合酶II。在一種形式中，復合體包括ZNFN3A1蛋白、RNA螺旋酶和RNA聚合酶II。轉錄激活復合體通過與EGFR基因5’側翼區(qū)“(C)CCCTCC(T)”元件的直接結合，可以激活包括表皮生長因子受體(EGFR)在內的基因的轉錄。
本申請還提供了治療癌癥的治療劑。治療劑可以被描述為如(SEQ.ID.NO.3)中所示的多核苷酸序列。治療劑還可以被描述為如SEQ.ID.NO.1中所顯示和描述的ZNFN3A1多核苷酸序列的反義S-寡核苷酸的至少一部分。合適的反義S-寡核苷酸是5’-GCGGGAGGATGGAGCC-3’(SEQ.ID.NO.3)。治療劑可以適當地用來治療肝細胞癌細胞。治療劑的作用療程期望可抑制肝細胞癌細胞的生長。治療劑可以施用于哺乳動物包括人和馴化的哺乳動物。
本申請還提供了識別ZNFN3A1蛋白的抗體。部分地，還提供了ZNFN3A1基因的反義DNA、核酶及RNAi(RNA干擾物)。
進一步地，提供了篩選抗癌劑候選化合物的方法。該方法包括使ZNFN3A1多肽與候選化合物進行接觸，并選擇與ZNFN3A1多肽結合的化合物。
ZNFN3A1多肽還可以在共激活因子存在下，在形成ZNFN3A1多肽和其共激活因子的復合體的合適條件下，與候選化合物進行接觸。然后可以選擇抑制該復合體形成的化合物。共激活因子包括RNA螺旋酶和/或RNA聚合酶II。
本發(fā)明進一步提供了篩選抗癌劑候選化合物的方法，其中該方法包括使ZNFN3A1多肽、它的共激活因子以及含有多肽靶序列的DNA與候選化合物，在形成ZNFN3A1多肽和該DNA的復合體的合適條件下接觸，并選擇抑制該復合體形成的化合物。靶序列期望是側接EGFR 5’區(qū)的CBS序列。
還提供了篩選抗癌劑候選化合物的方法，其中該方法包括使ZNFN3A1多肽、它的共激活因子以及具有為所述多肽和共激活因子復合體識別的轉錄調控區(qū)的報告基因，與候選化合物，在表達報告基因的合適條件下進行接觸，并選擇抑制報告基因表達的化合物。
本發(fā)明進一步提供了診斷癌癥的方法，包括測定標本生物樣品中ZNFN3A1基因的表達水平，將ZNFN3A1基因的表達水平與正常樣品相比較，并將樣品中ZNFN3A1基因的高表達水平判定為具有癌癥。癌癥適當地是肝細胞癌。
本發(fā)明還提供了通過用編碼ZNFN3A1蛋白的多核苷酸序列轉染或轉化宿主細胞，并表達該多核苷酸序列來制備蛋白的方法。
應當理解前述的發(fā)明概述以及下列的詳細說明是優(yōu)選的實施方案，并非限制本發(fā)明或本發(fā)明其它備選的實施方案。


圖1A-1C描繪了A6681和ZNFN3A1在HCC中的表達。圖1A描繪了通過cDNA微陣列所檢測到的A6681在20個原發(fā)性HCC中的相對表達比例。它的表達在通過截留濾膜的12個臨床HCC中有11個(91.7％)顯著上調(Cy3和Cy5信號都大于25,000)。圖1B的照片呈現了通過RT-PCR產物的溴乙錠染色所顯示的描繪HCC候選基因表達(T，腫瘤組織；N，正常組織)。GAPDH的表達起內部對照的作用。圖1C的照片描繪A6681在各種成人組織中的多-組織RNA印跡試驗。
圖2A描繪了預測的ZNFN3A1蛋白結構和蛋白基元。ZNFN3A1蛋白基元是通過簡單模塊構造研究工具(Simple Modular Architecture ResearchTool，SMART)預測的。圖2B描繪了ZNFN3A1和AK010447的公認氨基酸序列之間的同源性。zf-MYND[鋅指蛋白(包含MYND結構域)]結構域(A)和SET[(Su(var)3-9，zeste增強子，Trithorax)]結構域(B)分別表現出94％和95％的同一性。
圖3A-3R的照片顯示經免疫細胞化學，尤其熒光免疫組化染色所觀察到的ZNFN3A1亞細胞定位。圖3A-3C的熒光顯微照片顯示，被表達EGFP-標記生ZNFN3A1的質粒(pEGFP-ZNFN3A1)DNA轉染的SNU475細胞。FITC(g、j、m、p)、DAPI(h、k、n、q)、merge(i、l、o、r)。圖3D-3F的熒光顯微照片顯示，表達FLAG-標記性ZNFN3A1的質粒(pFLAG-ZNFN3A1)DNA轉染的SNU475細胞?？?FLAG(d)、DAPI(e)、merge(f)。圖3G-3R的熒光顯微照片顯示ZNFN3A1在SNU475細胞(g-l)和SNU423細胞(m-r)中的內源表達?？?ZNFN3A1(g、j、m、p)、DAPI(h、k、n、q)、merge(i、l、o、r)。細胞以低濃度(1.25×104細胞/孔)(g-I、m-o)和高濃度(1.0×105細胞/孔)(i-l、p-r)接種。
圖4A和4B描繪的是細胞周期進程對ZNFN3A1亞細胞定位的影響。圖4A描繪的是通過阿非迪霉素(aphidicolin)同步化的Huh7細胞的FACS分析。通過與7.5μg/ml阿非迪霉素溫育36h將細胞生長阻抑在G1期，并通過去除阿非迪霉素而自G1解除。FACS于0、4、8和12h后進行。圖4B的圖片顯示內源ZNFN3A1蛋白在經阿非迪霉素處理而同步化的Huh7中的熒光免疫細胞化學染色。
圖5A-5D描繪了ZNFN3A1在NIH3T3中的生長促進效果。圖5A是描繪ZNFN3A1在NIH3T3細胞中的集落形成試驗結果的圖片，比較了ZNFN3A1模擬物、NIH3T3-反義ZNFN3A1和NIH3T3-有義ZNFN3A1的表達。圖5B描繪了通過電子光密度測定計數的集落數。集落通過電子光密度測定計數。集落數表示為三份板的均值±SD。(*)表示由Fisher’s保護性最小顯著性檢驗(Fisher’s protected least significant test)所測定的顯著性差異(p＜0.05)。圖5C的圖片顯示穩(wěn)定表達ZNFN3A1的NIH3T3細胞的生長誘導。ZNFN3A1 mRNA在穩(wěn)定-轉染體(NIH3T3-ZNFN3A1)細胞中的表達通過RT-PCR測定。圖5D描繪了通過錐蟲藍染色法所檢測到的細胞數目的時間曲線。
圖6A-6E顯示設計用于阻抑ZNFN3A1的反義S-寡核苷酸的生長阻抑效果。圖6A顯示設計用于阻抑ZNFN3A1的有義(Se)或反義(As)寡核苷酸構建物。圖6B的圖片顯示ZNFN3A1在SNU475細胞中的表達，所述細胞用有義(Se)或者反義(As)寡核苷酸處理24h，經RT-PCR和利用抗-ZNFN3A1抗體進行的蛋白質印跡來檢測。圖6C的圖片顯示，利用ZNFN3A1 mRNA的有義或反義寡核苷酸在Huh7、Alexander、SNU423和SNU475細胞中進行的集落形成試驗。反義寡核苷酸(As)阻抑生長。圖6D顯示MIT試驗的結果，它評估了在有義或反義寡核苷酸處理Huh7、Alexander、SNU423和SNU475細胞72小時后的細胞存活能力。圖6E顯示FACS分析結果，它評估Huh7細胞經有義(Se)或反義(As)寡核苷酸處理72小時后的細胞周期。
圖7A-7C描繪了ZNFN3A1和RNA螺旋酶KIAA0054之間的相互作用。在圖7A中，繪制了KIAA0054的保守結構域以及與ZNFN3A1結合的區(qū)域。圖7B呈現了描繪酵母雙雜交實驗結果的圖片，其中含有ZNFN3A1的pAS2-1與含有兩種不同長度KIAA0054的文庫載體共-轉染到酵母菌株AH109中。結果顯示了在酵母菌株AH109中ZNFN3A1和KIAA0054之間結合的確認信息。圖7C呈現了描繪在哺乳動物細胞中ZNFN3A1和KIAA0054之間結合的確認信息的圖片。來自HeLa細胞的裂解物與抗-FLAG或抗-HA抗體免疫沉淀。免疫沉淀物用抗-HA或抗-FLAG抗體通過免疫印跡分析。對裂解物直接進行免疫印跡分析，作為對照。
圖8的圖片證明ZNFN3A1與KIAA0054的相互作用是通過SET結構域和KIAA0054的C-末端區(qū)域介導。分析了ZNFN3A1缺失構建物在雙雜交系統(tǒng)中與KIAA0054的C-末端區(qū)域相互作用的能力。
圖9的圖片證明RNA螺旋酶KIAA0054與ZNFN3A1和RNA聚合酶II在體內結合。細胞提取物是從由轉染了8μg pFLAG-CMV-ZNFN3A1(完整)和pCMV-HA-KIAA0054(全長)表達載體的HeLa細胞制備的。提取物與抗-RNA聚合酶II抗體、抗-HA抗體或抗-FLAG抗體免疫沉淀。免疫沉淀物用抗-RNA聚合酶II抗體、抗-HA抗體或抗-FLAG抗體通過免疫印跡分析。對裂解物直接進行免疫印跡分析，作為對照。
圖10A和10B證明了受ZNFN3A1調節(jié)的侯選下游基因。圖10A描繪了利用含有全長ZNFN3A1的GST融合蛋白通過結合和擴增反應分離到的寡核苷酸序列。圖中顯示了含有隨機核苷酸區(qū)域的核心序列。圖10B呈現了描數個基因的延長轉錄本在外源表達ZNFN3A1的COS7穩(wěn)定轉化體中的反轉錄分析圖片。
圖11(A)圖示了各種在EGFR 5’側翼區(qū)含有公認的ZNFN3A1-結合元件的報告質粒。相對于公認的轉錄-起始位點的核苷酸位置由正或負數指示。(B)利用所示的報告質粒對SNU475細胞中EGFR啟動子的分析。條，標準偏差(SD)。*，由Fisher’s保護性最小-顯著性檢驗測定的顯著性差異(p＜0.05)。
圖12示意ZNFN3A1、RNA螺旋酶和RNA聚合酶II之間形成的復合體，它能調節(jié)基因轉錄。
發(fā)明詳述除非另外明確指出，如本文所用的詞語“一個”、“一種”及“這種”是指“至少一個”。
本申請鑒定了新的人類基因ZNFN3A1，它的表達在HCC中與相應的非癌肝組織中相比顯著升高。ZNFN3A1 cDNA由如SEQ.ID.NO.1所示的含有1284個核苷酸的開放讀框的1622個核苷酸組成。開放讀框編碼具有鋅指基元的公認的428個氨基酸的蛋白。該蛋白被命名委員會命名為ZNFN3A1(鋅指蛋白，3A亞家族(含MYND)，1)。此外，ZNFN3A1直接與RNA螺旋酶KIAA0054結合，并與RNA聚合酶II形成復合體，通過該復合體與EGFR基因5’側翼區(qū)“(C)CCCTCC(T)”元件的直接結合，可以激活下游基因包括表皮生長因子受體(EGFR)的轉錄。一致地，ZNFN3A1在NIH3T3細胞中的外源表達使細胞生長增加，而用反義S-寡核苷酸阻抑它的表達導致肝癌細胞顯著的生長抑制。這些發(fā)現表明ZNFN3A1通過與RNA螺旋酶和RNA聚合酶II的復合體轉錄激活包括EGFR在內的靶基因，從而賦予癌細胞致癌活性，而且抑制該復合體的活性應該是有前景的治療HCC的策略。
本發(fā)明涵蓋新的人類基因ZNFN3A1，包括SEQ.ID.NO.1中所述的多核苷酸序列，及其簡并體和突變體，只要它們編碼ZNFN3A1蛋白，包括如SEQ.ID.NO.2中所示的氨基酸序列或它的功能等價體。與ZNFN3A1功能等價的蛋白的例子包括，例如，與人類ZNFN3A1蛋白相應的其它生物體的同源蛋白，以及人類ZNFN3A1蛋白的突變體。
在本發(fā)明中，術語“功能等價體”是指受試蛋白象ZNFN3A1蛋白一樣具有促進細胞增殖的活性，并通過與RNA螺旋酶或RNA聚合酶或兩者形成轉錄激活復合體來賦予癌細胞致癌活性，這種致癌活性，反過來，增強靶基因，例如EGFR的轉錄。受試蛋白是否具有細胞增殖活性可以通過將編碼該受試蛋白的DNA引入到表達該蛋白的細胞(如NIH3T3中)，并檢測細胞增殖的促進或者集落形成活性的提高來判斷。受試蛋白與RNA聚合酶或RNA螺旋酶或兩者形成復合體的能力，可以通過免疫共沉淀進行分析，例如下文實施例中所描述的那些。EGRR轉錄的增強可以利用諸如下文實施例中所描述的那些報告質粒進一步進行測定。
制備在功能上與給定蛋白等價的蛋白的方法是本領域熟練技術人員公知的，并且包括向蛋白引入突變的已知方法。例如，本領域熟練技術人員通過定點突變法在人類ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列中引入合適的突變，能夠制備在功能上與人類ZNFN3A1蛋白等價的蛋白(Hashimoto-Gotoh，T.等(1995)，Gene 152，271-275；Zoller，MJ和Smith，M.(1983)，Methods Enzymol.100)，468-500；Kramer，W.等(1984)，Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer W和Fritz HJ.(1987)Methods.Enzymol.154，350-367；Kunkel，TA(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1988)，Methods Enzymol.85，2763-2766)。氨基酸突變也能天然發(fā)生。本發(fā)明蛋白包括那些在人ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列中突變一或多個氨基酸所得的蛋白，只要所得的突變蛋白在功能上與人類ZNFN3A1蛋白等價。這樣的突變體中待突變的氨基酸數目一般為10個氨基酸或更少，優(yōu)選6個氨基酸或更少，并且更優(yōu)選3個氨基酸或更少。
突變或修飾蛋白，具有通過缺失、添加和/或取代某一氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基而修飾的氨基酸序列的蛋白，已知能保留原始的生物活性(Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666，Zoller，M.J.& Smith，M.，Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500，Wang，A.等，Science 224，1431-1433，Dalbadie-McFarland，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。
待突變的氨基酸殘基優(yōu)選突變?yōu)椴煌被帷⒌Ａ粼被醾孺湹男再|(公知的保守氨基酸取代操作)。氨基酸側鏈性質的例子有疏水氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，親水氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，以及具有如下共同的官能團或特征的側鏈脂肪族側鏈(G、A、V、L、I、P)；含羥基的側鏈(S、T、Y)；含硫原子的側鏈(C、M)；含羧酸和酰胺的側鏈(D、N、E、Q)；含堿基的側鏈(R、K、H)和含芳基的側鏈(H、F、Y、W)。注釋，括號中的字母表示氨基酸的單字母代碼。
在人類ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.2)中添加一個或多個氨基酸殘基所得的蛋白的例子是，含人類ZNFN3A1蛋白的融合蛋白。融合蛋白是人類ZNFN3A1蛋白與其它肽或蛋白的融合物，并且包括在本發(fā)明之中。融合蛋白能夠通過本領域熟練技術人員公知的技術，例如通過連接編碼本發(fā)明的人類ZNFN3A1蛋白的DNA與編碼其它肽或蛋白的DNA，使讀框適配，將該融合DNA插入到表達載體中并使其在宿主中表達來制備。對于與本發(fā)明蛋白融合的肽或蛋白沒有限制。
能夠作為與本發(fā)明蛋白融合的肽的已知肽包括，例如，FLAG(Hopp，T.P.等，Biotechnology(1988)6，1204-1210)、含6個His(組氨酸)殘基的6xHis、10xHis、流感病毒凝激素(HA)、人類c-myc片段、VSP-GP片段、p18HIV片段、T7-標簽、HSV-標簽、E-標簽、SV40T抗原片段、lck標簽、α-微管蛋白片段、B-標簽、C蛋白片段等?？梢耘c本發(fā)明蛋白融合的蛋白的例子包括GST(谷胱甘肽-S-轉移酶)、流感病毒凝激素(HA)、免疫球蛋白恒定區(qū)、β-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖-結合蛋白)等等。
融合蛋白可通過將編碼上文所討論的融合肽或蛋白的商業(yè)可用的DNA與編碼本發(fā)明蛋白的DNA融合，并表達所制備的融合蛋白來制備。
本領域已知的分離功能等價體蛋白的另一種替代方法是，例如，利用雜交技術的方法(Sambrook，J.等，Molecular Cloning第2版9.47-9.58，冷泉港實驗室出版，1989)。本領域熟練技術人員能夠容易地分離到與編碼人類ZNFN3A1蛋白的DNA序列(SEQ.ID.NO.1)的全部或部分具有高度同源的DNA，并從分離到的DNA中分離人類ZNFN3A1蛋白的功能等價體。本發(fā)明蛋白包括那些由與編碼人類ZNFN3A1蛋白的全部或部分DNA序列雜交的DNA編碼的、并與人類ZNFN3A1蛋白在功能上等價的蛋白。這些蛋白包括與來源于人類或小鼠的蛋白相應的哺乳動物同系物(例如，由猴子、大鼠、兔子和牛基因編碼的蛋白)。在從動物中分離與編碼人類ZNFN3A1蛋白的DNA高度同源的cDNA時，特別優(yōu)選利用來自卵巢或睪丸的組織。
用來分離編碼與人類ZNFN3A1蛋白在功能上等價的蛋白的DNA的雜交條件可以由本領域熟練技術人員常規(guī)地選擇。例如，雜交可以通過利用“Rapid-hyb buffer”(Amersham LIFE SCIENCE)在68℃進行30分鐘或更長時間的預雜交，添加標記探針，并在68℃保溫1小時或更長時間進行?？梢栽?，例如，低嚴謹條件下進行如下的洗滌步驟。低嚴謹條件為，例如，42℃、2X SSC、0.1％SDS，或者優(yōu)選50℃、2X SSC、0.1％SDS。更優(yōu)選利用高嚴謹條件。高嚴謹條件為，例如，在2X SSC、0.01％SDS中于室溫下20分鐘洗滌3次，然后在1X SSC、0.1％SDS中于37℃20分鐘洗滌3次，并在1XSS℃、0.1％SDS中于50C 20分鐘洗滌2次。不過，多種因素例如溫度和鹽濃度能夠影響雜交的嚴謹性，因而本領域熟練技術人員可以適當第選擇這些因素以獲得必要的嚴謹性。
作為雜交的替代，可以用基因擴增法，例如，利用以編碼人類ZNFN3A1蛋白的DNA(SEQ.ID.NO.1)序列信息為基礎合成的引物，經聚合酶鏈式反應(PCR)法，分離編碼與人類ZNFN3A1蛋白在功能上等價的蛋白的DNA。
由通過上述雜交技術或基因擴增技術所分離到的DNA編碼的與人類ZNFN3A1蛋白在功能上等價的蛋白，通常與人類ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列具有高度同源?！案叨韧础蓖ǔＪ侵?0％或更高的同源性，優(yōu)選60％或更高的同源性，更優(yōu)選80％或更高的同源性，甚至更優(yōu)選95％或更高的同源性。蛋白的同源性可以通過如下“Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80，726-730”中的算法測定。
本發(fā)明蛋白可能在氨基酸序列、分子量、等電點、糖鏈的存在或無、或者形式方面具有變化，取決于用來制備它的細胞或宿主或者所用的純化方法。然而，只要它具有與本發(fā)明的人類ZNFN3A1蛋白(SEQ.ID.NO.2)等價的功能，它就落在本發(fā)明的范圍之內。
通過本領域熟練技術人員公知的方法，本發(fā)明蛋白可以作為重組蛋白或天然蛋白制備。重組蛋白可通過將編碼本發(fā)明蛋白的DNA(例如包含核苷酸序列SEQ.ID.NO.1的DNA)插入到合適的表達載體中，將載體引入到合適的宿主細胞中，獲取提取物，并通過使提取物經層析，例如，離子交換層析、反相層析、凝膠過濾或利用固定了針對本發(fā)明蛋白的抗體的柱子的親和層析，或通過不止一個前述柱子的結合來制備和純化蛋白。
并且當本發(fā)明蛋白作為與谷胱甘肽-S-轉移酶蛋白的融合蛋白、或者作為增加了多個組氨酸的重組蛋白在宿主細胞(例如，動物細胞和大腸桿菌(E.coli))內表達時，表達的重組蛋白可利用谷胱甘肽柱或鎳柱純化。
在純化融合蛋白后，還有可能根據需要用凝血酶或因子-Xa通過切割除去目的蛋白之外的區(qū)域。
天然蛋白可通過本領域技術人員已知的方法，例如，通過使親和柱(該柱結合有下文所述的與ZNFN3A1蛋白結合的抗體)，與表達本發(fā)明蛋白的組織或細胞的提取物接觸來分離?？贵w可以是多克隆抗體或者單克隆抗體。
本發(fā)明還涵蓋本發(fā)明蛋白的部分肽。所述部分肽具有本發(fā)明蛋白特有的氨基酸序列，并由至少7個氨基酸，優(yōu)選8個氨基酸或更多，更優(yōu)選9個氨基酸或更多組成。部分肽能用于，例如，制備針對本發(fā)明蛋白的抗體，篩選與本發(fā)明蛋白結合的化合物，以及篩選本發(fā)明蛋白的促進因子或抑制利。
本發(fā)明的部分肽可以通過基因工程方法、通過已知的肽合成方法、或者通過用合適的肽酶消化本發(fā)明蛋白來制備。關于肽合成，舉例來說，可以利用固相合成或液相合成。
分離的ZNFN3A1蛋白包括公認的428-氨基酸的蛋白，具有鋅指基元，由ZNFN3A1多核苷酸序列的開放讀框編碼。鋅指結構域(MYND)位于第49-87位密碼子，而SET(Su 3-9，zeste增強子，Trihorrax)結構域位于第117-246位密碼子。正如下文所詳細討論的，ZNFN3A1結合區(qū)位居SET結構域之中。所以，ZNFN3A1的部分肽優(yōu)選包括SET結構域。
此外，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明蛋白的DNA。本發(fā)明的DNA能夠如上所述用于體內或體外制備本發(fā)明蛋白，或者能夠應用于因編碼本發(fā)明蛋白的基因的遺傳性異常引起的疾病的基因治療?？梢岳萌魏涡问降谋景l(fā)明的DNA，只要它編碼本發(fā)明蛋白。具體地，可以利用由mRNA合成的cDNA、基因組DNA以及化學合成的DNA。本發(fā)明的DNA包括包含了給定的核苷酸序列以及它的簡并序列的DNA，只要所得的DNA編碼本發(fā)明蛋白。
本發(fā)明的DNA可以通過本領域熟練技術人員已知的方法制備。例如，本發(fā)明的DNA可以通過從表達本發(fā)明蛋白的細胞制備cDNA文庫，并利用本發(fā)明的DNA(例如，SEQ.ID.NO.1)的部分序列作為探針進行雜交來制備。cDNA文庫可以，例如，通過Sambrook J.等，《分子克隆》，冷泉港實驗室出版(1989)中所描述的方法制備；作為選擇地，可利用商業(yè)上可獲得的cDNA文庫。cDNA文庫還可以通過從表達本發(fā)明蛋白的細胞提取RNA，根據本發(fā)明的DNA(例如，SEQ.ID.NO.1)的序列合成oligo DNA，利用該寡聚物作為引物進行PCR，并擴增出編碼本發(fā)明蛋白的cDNA，來制備。
另外，通過對獲得的cDNA測序，可以常規(guī)地確定該cDNA編碼的翻譯區(qū)，并且能夠容易地獲得本發(fā)明蛋白的氨基酸序列。而且，通過利用所獲得的cDNA作為探針篩選基因組DNA文庫，能夠分離基因組DNA。
更具體地，可以首先從表達本發(fā)明蛋白的細胞、組織或器官(例如，卵巢、睪丸、胎盤等)中分離mRNA。可以利用已知的方法分離mRNA；例如，總RNA可以通過胍超速離心(Chirgwin J.M.等Biochemistry 185294-5299(1979))或AGPC法(Chomczynski P.和Sacchi N.Anal.Biochem.162156-159(1987))制備。另外，mRNA可以利用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)等從總RNA中純化，或者，作為選擇地，mRNA可以通過QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia)直接純化。
所獲得的mRNA利用反轉錄酶用于合成cDNA。cDNA可以利用商業(yè)上可獲得的試劑盒，例如AMV反轉錄酶第1鏈cDNA合成試劑盒(SeikagakuKogyo)合成。作為選擇地，cDNA可以按照5’-RACE法合成并擴增(FrohmanM.A.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.858998-9002(1988)；Belyavsky A.等Nucleic Acids Res.172919-2932(1989))，如本文所述，該方法利用引物等，5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech)以及聚合酶鏈式反應(PCR)。
從PCR產物中制備所需的DNA片段，并將該片段與載體DNA連接。重組載體被用于轉化大腸桿菌等，并從挑選的克隆中制備所需的重組載體。所需的DNA的核苷酸序列可以通過常規(guī)方法，例如雙脫氧核苷酸鏈終止法檢驗。
通過考慮用于表達的宿主中的密碼子利用頻率，可以設計更有效地表達本發(fā)明的DNA的核苷酸序列(Grantham R.等Nucleic Acids Res.943-74(1981))。本發(fā)明的DNA可以通過商業(yè)上可獲得的試劑盒或者常規(guī)方法進行改變。例如，DNA可以通過用限制酶消化、摻入合成寡核苷酸或合適的DNA片段、添加接頭、或者插入起始密碼子(ATG)和/或終止密碼子(TAA、TGA或TAG)予以改變。
具體地，本發(fā)明的DNA涵蓋包含了編碼位于SEQ.ID.NO.2第49-87位密碼子的鋅指結構域和位于SEQ.ID.NO.2第117-246位密碼子的DET結構域的核苷酸序列的DNA。
此外，本發(fā)明提供了在嚴謹條件下與具有核苷酸序列SEQ.ID.NO.1的DNA雜交、并編碼如上所述的在功能上與本發(fā)明蛋白等價的蛋白的DNA。本領域熟練技術人員可以適當地選擇嚴謹條件。例如，可以使用低嚴謹條件。更優(yōu)選地，可以使用高嚴謹條件。這些條件與上文所述相同。上文的雜交DNA優(yōu)選為cDNA或染色體DNA。
本發(fā)明還提供了插入了本發(fā)明的DNA的載體。本發(fā)明的載體可用于在宿主細胞中維持本發(fā)明的DNA，或者用于表達本發(fā)明蛋白。
當大腸桿菌為宿主細胞并且載體在大腸桿菌(如，JM109、DH5α、HB101或XL1Blue)中大量擴增和生產時，載體應當具有在大腸桿菌中擴增的復制起點″ori″以及用來選擇轉化的大腸桿菌的標記基因(如，由藥物例如氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素等藥物進行選擇的抗藥性基因)。例如，可以利用M13-系列載體、pUC-系列載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，pGEM-T、pDIRECT和pT7也可以與上述載體一樣用于亞克隆和提取cDNA。當利用載體制備本發(fā)明蛋白時，表達載體尤為有用。例如，待在大腸桿菌中表達的表達載體應當具有可在大腸桿菌中擴增的上述特征。當利用大腸桿菌例如JM109、DH5α、HB101或XL1 Blue作為宿主細胞時，載體應當具有能夠在大腸桿菌中有效地表達所需基因的啟動子，例如，lacZ啟動子(Ward等，Nature(1989)341，544-546；FASEB J(1992)6，2422-2427)、araB啟動子(Better等，Science(1988)240，1041-1043)或T7啟動子等。就這方面而言，舉例來說，pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpresssystem”(Qiagen)、pEGFP和pET(在這種情況下，宿主優(yōu)選為表達T7 RNA聚合酶的BL21)可用來代替上述載體。
另外，載體還可以含有多肽分泌的信號序列。指導待分泌的蛋白進入大腸桿菌周質的例示性信號序列是pelB信號序列(Lei，S.P.等，J.Bacteriol.(1987)69，4379)。將載體引入靶宿主細胞的手段包括，例如，氯化鈣法以及電穿孔法。
除了大腸桿菌，舉例來說，可利用來自哺乳動物的表達載體(例如，pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990，18(17)，p5322)、pEF、pCDM8)、來自昆蟲細胞的表達載體(例如，“Bac-to-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)”(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、來自植物的表達載體(例如pMH1、pMH2)、來自動物病毒的表達載體(例如，pHSV、pMV、pAdexLcw)、來自反轉錄病毒的表達載體(例如，pZIpneo)、來自酵母的表達載體(例如，“畢赤酵母表達試劑盒”(Invitrogen)、pNVll、SP-Q01)、以及來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的表達載體(例如，pPL608、pKTH50)生產本發(fā)明蛋白。
為了在動物細胞，例如CHO、COS或NIH3T3細胞中表達載體，載體應當具有在這種細胞中表達所必須的啟動子，例如，SV40啟動子(Mulligan等，Nature(1979)277，108)、MMLV-LTR啟動子、EF1α啟動子(MiZushima等，Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)、CMV啟動子等，并且優(yōu)選具有用于選擇轉化體的標記基因(例如，進行藥物選擇的藥物抗性基因(如新霉素、G418))。具有這些特征的已知載體的例子包括，例如，pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。
另外，可以使用方法穩(wěn)定地表達基因，并同時擴增細胞中基因的拷貝數。例如，可以將包含互補DHFR基因的載體(例如pCHO I)引入到缺失了核酸合成路徑的CHO細胞中、并隨后通過氨甲喋呤(MTX)擴增。此外，在基因瞬時表達的情況下，可以使用將包含SV40復制起點的載體(pcD等)轉化到在染色體上包含SV40T抗原表達基因的COS細胞中的方法。
如上所述獲得的本發(fā)明蛋白可以自宿主細胞的內部或外部(例如培養(yǎng)基中)分離，并純化為基本純的均質蛋白。如本文所用的關于給定多肽的術語“基本純”是指多肽基本上沒有其它生物大分子。基本純的多肽干重純度至少75％(如，至少80、85、95或99％)。純度可以通過任何合適的標準方法，例如通過柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析測量。蛋白分離和純化的方法不局限于任何特定的方法；事實上，可以利用任何標準方法。
例如，可以適當地選擇并組合柱層析、過濾、超濾、鹽沉淀、溶劑沉淀、溶劑提取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點電泳、透析和重結晶以分離和純化蛋白。
層析的例子包括，例如，親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak等，冷泉港實驗室出版(1996))。這些層析可以通過液相層析進行，例如HPLC和FPLC。因此，本發(fā)明提供了通過上述方法制備的高度純化的蛋白。
本發(fā)明蛋白可以任選地通過在純化前或后用合適的蛋白酶處理而被修飾或部分缺失。有用的蛋白修飾酶包括，但不限于，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、賴氨酰內肽酶(lysylendopeptidase)、蛋白激酶、葡萄糖苷酶等。
本發(fā)明提供了與本發(fā)明蛋白結合的抗體。本發(fā)明的抗體能夠以任何形式應用，例如單克隆抗體或多克隆抗體形式，并且包括通過用本發(fā)明蛋白免疫動物例如兔子所獲得的抗血清、所有類型的多克隆和單克隆抗體、人類抗體以及通過基因重組制備的人源化抗體。
用作抗原以獲得抗體的本發(fā)明蛋白可以來自于任何動物物種，但優(yōu)選來自哺乳動物例如人類、小鼠或大鼠，更優(yōu)選來自人類。來自人的蛋白可以從本文公開的核苷酸或氨基酸序列獲得。
根據本發(fā)明，用作免疫抗原的蛋白可以是完整蛋白或該蛋白的部分肽。部分肽可以包含，例如，本發(fā)明蛋白的氨基(N)-末端或羧基(C)-末端片段。這里，抗體被定義為與本發(fā)明蛋白的全長或者片段反應的蛋白。
編碼本發(fā)明蛋白或它的片段的基因可以被插入到已知的表達載體中，然后它被用來轉化如本文所述的宿主細胞。所需蛋白或它的片段可以通過任何標準方法自宿主細胞的外部或內部回收，并且可以隨后用作為抗原。作為選擇地，表達蛋白的完整細胞或它們的裂解物，或者化學合成的蛋白可用作為抗原。
任何哺乳動物可以用該抗原免疫，但優(yōu)選考慮與用于細胞融合的親本細胞的相容性。一般地，利用嚙齒類(Rodentia)、兔類(Lagomorpha)或靈長類(Primates)動物。
嚙齒類動物包括，例如小鼠、大鼠和倉鼠。兔類動物包括，例如，兔子。靈長類動物包括，例如，狹鼻猿(Catarrhini)(東半球猴子)猴子例如獼猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(rhesus monkey)、狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzees)。
用抗原免疫動物的方法是本領域公知的。腹腔內注射或皮下注射抗原是免疫動物的標準方法。更具體地，抗原可以稀釋并懸浮于適量的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、生理鹽水中等。如果需要，抗原懸浮液可以與適量的標準佐劑(例如弗氏完全佐劑)混合，制成乳劑，然后給藥哺乳動物。優(yōu)選地，隨后每4到21天給藥與適量弗氏不完全佐劑混合的抗原數次。適當的載體也可用于免疫。如上所述免疫之后，通過標準方法檢查血清中所需抗體量的增加。
針對本發(fā)明蛋白的多克隆抗體可以通過，從血清中所需抗體增加的免疫動物收集血液，并通過任何常規(guī)方法從血液中分離血清來制備。多克隆抗體包括含有該多克隆抗體的血清，以及可以從血清中分離的含有多克隆抗體的組份。免疫球蛋白G或M可以從只識別本發(fā)明蛋白的組份中，利用例如，偶聯本發(fā)明蛋白的親和柱制備，并利用蛋白A或蛋白G柱進一步純化該組份。
為制備單克隆抗體，從用抗原免疫的、并如上所述檢查到血清中所需抗體水平提高的哺乳動物中收集免疫細胞，并使之進行細胞融合。用于細胞融合的免疫細胞優(yōu)選獲自脾臟。其它優(yōu)選的與上述免疫細胞融合的親本細胞包括，例如，哺乳動物骨髓瘤細胞，并且更優(yōu)選具備用來由藥物選擇融合細胞的后天性質的骨髓瘤細胞。
上述免疫細胞和骨髓瘤細胞可以根據已知的方法融合，例如，Milstein等的方法(Galfre，G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)。
通過細胞融合所得的雜交瘤可以通過在標準選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)它們進行選擇，例如HAT培養(yǎng)基(含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脫氧核苷的培養(yǎng)基)。細胞培養(yǎng)通常在HAT培養(yǎng)基中持續(xù)數天到數周，培養(yǎng)時間應足以讓除了所需的雜交瘤之外的所有其它細胞(未融合細胞)死亡。然后，通過標準的有限稀釋篩選和克隆出產生所需抗體的雜交瘤細胞。
除了上述用抗原免疫非人動物制備雜交瘤的方法之外，人類雜交瘤細胞例如那些被EB病毒感染的細胞可以用蛋白、蛋白表達細胞、或它們的裂解物在體外免疫。然后，免疫的淋巴細胞與來自人的能夠無限分裂的骨髓瘤細胞，例如U266融合，以得到能產生與所述蛋白結合的所需人類抗體的雜交瘤(未審的
公開日本專利申請No.(JP-A)Sho 63-17688)。
所得的雜交瘤隨后被移植到小鼠的腹腔內，并提取腹水。所得的單克隆抗體可以通過，例如，硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或偶聯了本發(fā)明蛋白的親和柱純化。本發(fā)明的抗體不僅可用來純化和檢測本發(fā)明蛋白，而且可用作本發(fā)明蛋白的激動劑和拮抗劑的侯選者。另外，該抗體可用于與本發(fā)明蛋白相關的疾病的抗體治療。當向人體給藥所得的抗體(抗體治療)時，優(yōu)選人類抗體或人源化抗體以降低免疫原性。
例如，可以用選自蛋白、蛋白表達細胞或其裂解物的抗原免疫具有人類抗體基因庫的轉基因動物。然后從動物中收集抗體生成細胞，并與骨髓瘤細胞融合以獲得雜交瘤，從中可以制備針對該蛋白的人類抗體(參見WO92-03918、WO93-2227、WO94-02602、WO94-25585、WO96-33735和WO96-34096)。
作為選擇地，產生抗體的免疫細胞，例如免疫的淋巴細胞，可用癌基因永生化，并用于制備單克隆抗體。
這樣獲得的單克隆抗體也可以利用基因工程技術重組制備(例如參見Borrebaeck C.A.K.和Larrick J.W.Therapeutic Monoclonal Antibodies，英國MacMillan出版社有限公司出版(1990))。舉例來說，可以從免疫細胞，例如產生抗體的雜交瘤或免疫淋巴細胞克隆出編碼該抗體的DNA，將該DNA插入到合適的載體中，并引入宿主細胞以制備重組抗體。本發(fā)明還提供了如上所述制備的重組抗體。
此外，本發(fā)明的抗體可以是抗體片段或修飾抗體，只要它與本發(fā)明的一或多種蛋白結合。例如，抗體片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或單鏈Fv(scFv)，其中來自H和L鏈的Fv片段通過合適的接頭連接(Huston J.S.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.855879-5883(1988))。更具體地，抗體片段可以通過用酶，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體產生。作為選擇地，可以構建編碼抗體片段的基因，將該基因插入到表達載體中，并在合適的宿主細胞中表達(例如參見Co M.S.等J.Immunol.1522968-2976(1994)；Better M.和Horwitz A.H.Methods Enzymol.178476-496(1989)；Pluckthun A.和Skerra A.MethodsEnzymol.178497-515(1989)；Lamoyi E.Methods Enzymol.121652-663(1986)；Rousseaux J.等Methods Enzymol.121663-669(1986)；Bird R.E.和Walker B.W.Trends Biotechnol.9132-137(1991))。
抗體可通過與多種分子，例如聚乙二醇(PEG)偶聯而被修飾。本發(fā)明提供了這種修飾抗體。修飾抗體可以通過化學修飾抗體獲得。這些修飾方法在本領域中是常規(guī)的。
作為選擇地，本發(fā)明的抗體可以是來自非人抗體的可變區(qū)和來自人類抗體的恒定區(qū)的嵌合抗體、或者作為包含來自非人抗體的互補決定區(qū)(CDR)、來自人類抗體的框架區(qū)(FR)以及恒定區(qū)的人源化抗體獲得。這樣的抗體可以利用已知的技術制備。
如上所述獲得的抗體可以被純化為均質的。例如，抗體的分離和純化可以根據一般蛋白所用的分離和純化方法進行。例如，抗體可以通過柱層析法的適當選擇和組合進行分離，例如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦等(AntibodiesA Laboratory Manual.Ed Harlow和David Lane，冷泉港實驗室1988)，但不局限于此。
蛋白A柱或蛋白G柱可用作為親和柱?？捎玫睦拘缘鞍譇柱包括，例如，Hyper D、POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除了親和以外的例示性層析包括，例如，離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak等，冷泉港實驗室出版，1996)。層析操作可以通過液相層析進行，例如HPLC和FPLC。
舉例來說，可以利用吸光度測量、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、酶免疫測定(EIA)、放射免疫測定(RIA)和/或免疫熒光測量本發(fā)明的抗體的抗原結合活性。在ELISA中，將本發(fā)明的抗體固定在板上，向板上施加本發(fā)明蛋白，然后施加含有所需抗體的樣品，例如抗體生成細胞的培養(yǎng)上清或者純化的抗體。然后，施加識別一抗并且用酶，例如堿性磷酸酶標記的二抗，并溫育板。接著，洗滌之后，向板中添加酶底物，例如p-硝基苯基磷酸，然后測量吸光度，以評估樣品的抗原結合活性。蛋白片段，例如C-末端或N-末端片段，可作為蛋白應用?？梢岳肂IAcore(Pharmacia)評估根據本發(fā)明的抗體的活性。
上述方法通過將本發(fā)明的抗體暴露于預計含有本發(fā)明蛋白的樣品中，并檢測或測量抗體和蛋白形成的免疫復合體，使得能夠檢測或測量本發(fā)明蛋白。
由于檢測或測量根據本發(fā)明蛋白的方法能夠容易地檢測或測量蛋白，該方法可用在利用該蛋白的許多實驗中。
本發(fā)明還提供了與編碼人類ZNFN3A1蛋白的DNA(SEQ.ID.NO.1)或其互補鏈雜交的多核苷酸，它包含至少15個核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選是與編碼本發(fā)明蛋白的DNA特異性雜交的多核苷酸。如本文所用的術語“特異性雜交”是指在常用的雜交條件下，優(yōu)選在嚴謹雜交條件下，與編碼其它蛋白的DNA的交叉雜交不顯著發(fā)生。這樣的多核苷酸包括與編碼本發(fā)明蛋白的DNA或其互補鏈特異性地雜交的探針、引物、核苷酸和核苷酸衍生物(例如，反義寡核苷酸和核酶)。而且，這樣的多核苷酸可用于制備DNA芯片。
本發(fā)明包括與核苷酸序列SEQ.ID.NO.1之內的任何位點雜交的反義寡核苷酸。該反義寡核苷酸優(yōu)選是針對核苷酸序列SEQ.ID.NO.1的至少15個連續(xù)的核苷酸。甚至更優(yōu)選在上述至少15個連續(xù)的核苷酸中含有起始密碼子的上述反義寡核苷酸。
反義寡核苷酸的衍生物或修飾產物可作為反義寡核苷酸應用。這種修飾產物的例子包括低級烷基膦酸酯修飾例如甲基膦酸酯型或乙基膦酸酯型修飾、硫代磷酸酯(phosphothioate)修飾和氨基磷酸酯(phosphoramidate)修飾。
如本文所用的術語“反義寡核苷酸”不僅是指其中與構成DNA或mRNA特定區(qū)域的那些核苷酸相應的核苷酸是完全互補的那些寡核苷酸，而且指那些具有一個或多個核苷酸誤配的核苷酸，只要DNA或mRNA以及反義寡核苷酸能夠與核苷酸序列SEQ.ID.NO.1特異性雜交。
本發(fā)明包括這樣的多核苷酸，如在“至少15個連續(xù)核苷酸的序列區(qū)域”具有至少70％或更高、優(yōu)選80％或更高、更優(yōu)選90％或更高、甚至更優(yōu)選95％或更高同源性的那些多核苷酸。本文所陳述的算法能夠用于確定同源性。如在稍后的實施例中所陳述的那樣，這樣的多核苷酸可作為探針用于分離或檢測編碼本發(fā)明蛋白的DNA，或者可作為引物用于擴增。
本發(fā)明的反義寡核苷酸衍生物作用于產生本發(fā)明蛋白的細胞，通過與編碼本發(fā)明蛋白的DNA或mRNA結合、抑制它的轉錄或翻譯、促進mRNA的降解、以及抑制該蛋白的表達，導致對該蛋白功能的抑制。
本發(fā)明的反義寡核苷酸衍生物可以通過與適當的對該衍生物無活性的堿性材料混合，制成外用制劑，例如搽劑(liniment)或敷劑(poultice)。
并且，根據需要，衍生物可以通過添加賦形劑、等滲劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、保存劑、鎮(zhèn)痛劑等配制成片劑、粉劑、粒劑、膠囊、脂質體膠囊、注射劑、溶液、鼻滴劑和冷凍干燥制劑。這些可以通過如下通用方法制備。
反義寡核苷酸衍生物給予患者的方式是，直接施用于生病部位或者通過注射到血管中，從而它可到達疾病部位。還可以使用反義-固定(mounting)介質提高耐久性和膜通透性。例子有脂質體、多聚-L-賴氨酸、脂類、膽固醇、脂質轉染物(Lipofectin)或這些物質的衍生物。
本發(fā)明的反義寡核苷酸衍生物的劑量可以根據患者的情況適當調整并按照所需的量使用。例如，可以給藥0.1到100mg/kg，優(yōu)選0.1到50mg/kg的劑量范圍。
本發(fā)明的反義寡核苷酸抑制本發(fā)明蛋白的表達，因而可用來阻抑本發(fā)明蛋白的生物活性。并且，包含本發(fā)明反義寡核苷酸的表達抑制劑，就它們能夠抑制本發(fā)明蛋白的生物活性而言是有用的。
而且，本發(fā)明提供了利用本發(fā)明蛋白篩選與本發(fā)明蛋白結合的化合物的方法。這個篩選方法包括步驟(a)使本發(fā)明蛋白或其部分肽與受試樣品進行接觸；(b)檢測本發(fā)明蛋白或其部分肽與受試樣品結合的活性，和(c)選擇與本發(fā)明蛋白或其部分肽結合的化合物。
用于篩選的本發(fā)明蛋白可以是重組蛋白和得自天然的蛋白，或者它的部分肽?？梢允褂萌魏问茉嚇悠?，例如，細胞提取物、細胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵微生物的產物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗制蛋白、肽、非肽化合物、合成微分子化合物以及天然化合物。與受試樣品接觸的本發(fā)明蛋白可以是，例如，純化的蛋白，可溶蛋白，與載體結合的形式或者與其它蛋白融合的融合蛋白。
很多本領域熟練技術人員公知的方法都可以用作篩選蛋白的方法，例如，利用本發(fā)明蛋白篩選與本發(fā)明蛋白結合的蛋白。這種篩選可以通過，例如免疫沉淀法，具體地，以如下方式進行。編碼本發(fā)明蛋白的基因通過將該基因插入到用于外來基因的表達載體(如pSV2neo、pcDNA I和pCD8)上，而在動物細胞中表達。表達所用的啟動子可以是通常所用的任何啟動子，并且包括，例如，SV40早期啟動子(Rigby in Williamson(ed.)，GeneticEngineering，第3卷，學院出版社，倫敦，p.83-141(1982))、EF-1α啟動子(Kim等，Gene91，p217-223(1990))、CAG啟動子(Niwa等Gene108，p.193-200(1991))、RSV LTR啟動子(Cullen Methods in Enzymology152，p.684-704(1987))、SRα啟動子(Takebe等，Mol.Cell.Biol.8，p.466(1988)、CMV即早期啟動子(Seed和Aruffo Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，p.3365-3369(1987))、SV40晚期啟動子(Gheysen和Fiers J.Mol.Appl.Genet.1，p.385-394(1982))、腺病毒晚期啟動子(Kaufman等，Mol.Cell.Biol.9，p.946(1989))、HSV TK啟動子等。將基因引入到動物細胞中以便表達外來基因時，所述引入可根據任何已知的方法進行，例如，電穿孔法(Chu G.等Nucl.Acids Res.15，1311-1326(1987))、磷酸鈣法(Chen，C和Okayama，H.Mol.Cell.Biol.7，2745-2752(1987))、DEAE葡聚糖法(Lopata，M.A.等Nucl.Acids Res.12，5707-5717(1984))，Sussman，D.J.和Milman，G. Mol.Cell.Biol.4，1642-1643(1985))、脂質轉染物法(Derijard，B.Cell7，1025-1037(1994)；Lamb，B.T.等Nature Genetics5，22-30(1993)Rabindran，S.K.等Sclence259，230-234(1993))等。通過將已經揭示其特異性的單克隆抗體的表位引入本發(fā)明蛋白的N-或C-末端，可以將本發(fā)明蛋白表達為包含單克隆抗體識別位點(表位)的融合蛋白。可以利用商業(yè)上可獲得的表位-抗體系統(tǒng)(ExperimentalMedicine13，85-90(1995))。利用，例如，β-半乳糖苷酶、麥芽糖結合蛋白、谷胱甘肽S-轉移酶、綠色熒光蛋白(GFP)等的多克隆位點而表達與這些蛋白的融合蛋白的載體是商業(yè)上可獲得的。
還報道了一種融合蛋白，它是通過僅引入由幾個到幾十個氨基酸組成的小表位而制備的，所述融合不改變本發(fā)明蛋白的性質。表位，例如多聚組氨酸(His-標簽)、流感標度凝集素HA、人類c-myc、FLAG、水皰性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-標簽)、人單皰疹病毒糖蛋白(HSV-標簽)、E-標簽(單克隆噬菌體上的表位)等，以及識別它們的單克隆抗體，可作為表位-抗體系統(tǒng)用于篩選與本發(fā)明蛋白結合的蛋白(ExperimentalMedicine13，85-90(1995))。
在免疫沉淀中，通過用合適的去污劑制備細胞裂解物，向該裂解物中添加這些抗體，可以形成免疫復合體。該免疫復合體由本發(fā)明蛋白、包含與該蛋白結合的活性的蛋白、以及抗體組成。除了利用針對上述表位的抗體之外，免疫沉淀還可以利用針對本發(fā)明蛋白的抗體進行。針對本發(fā)明蛋白的抗體可以如下制備，例如將編碼本發(fā)明蛋白的基因引入到合適的大腸桿菌表達載體中，在大腸桿菌中表達該基因，純化表達的蛋白，并用該蛋白來免疫兔、小鼠、大鼠、山羊、家禽等。抗體還可以通過用本發(fā)明蛋白的合成性部分肽免疫上述動物來制備。
當抗體為小鼠IgG抗體時，免疫復合體可以通過蛋白A Sepharose或蛋白GSepharose沉淀。如果將本發(fā)明蛋白制成與表位(如GST)的融合蛋白，就可以以相同的方式，利用與這些表位特異性結合的物質(如谷胱甘肽-Sepharose 4B)以及抗本發(fā)明蛋白的抗體，形成免疫復合體。
免疫沉淀可以如下，或者根據，例如，文獻(Harlow，E.和Lane，D.Antibodies pp.511-552，冷泉港實驗室出版，紐約(1988))中的方法進行。
SDS-PAGE通常用于分析免疫沉淀的蛋白，結合的蛋白可以利用合適濃度的凝膠通過蛋白的分子量進行分析。由于與本發(fā)明蛋白結合的蛋白難以由普通的染色方法，例如考馬斯亮蘭染色或銀染檢測，蛋白的檢測靈敏度可以通過在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，標記細胞中的蛋白并檢測所述蛋白而得以提高。在得知蛋白的分子量之后，可以從SDS-聚丙烯酰胺凝膠中直接純化靶蛋白，并測序。
可以利用West-Western印跡分析作為利用本發(fā)明蛋白分離與該蛋白結合的蛋白的方法(Skolnik，E.Y.等，Cell(1991)65，83-90)。具體地，與本發(fā)明蛋白結合的蛋白可以如下獲得利用噬菌體載體(如ZAP)從預期表達與本發(fā)明蛋白結合的蛋白的細胞、組織或器官(例如，諸如卵巢、睪丸和胎盤等組織或培養(yǎng)的細胞)中制備cDNA文庫，在LB-瓊脂上表達該蛋白，將表達的蛋白固定在濾膜上，使純化和標記的本發(fā)明蛋白與上述濾膜反應，并根據該標記檢測處表達與本發(fā)明蛋白結合的蛋白的噬菌斑。本發(fā)明蛋白可以利用生物素和抗生物素蛋白的結合、或者利用與本發(fā)明蛋白特異性結合的抗體或與本發(fā)明蛋白融合的肽或多肽(例如GST)進行標記。利用放射性同位素或熒光等的方法也可以使用。
作為選擇地，在本發(fā)明的篩選方法的另一個實施方案中，可以采用利用了細胞的雙雜交(two-hybrid)系統(tǒng)(“MATCHMAKER雙雜交系統(tǒng)”、“哺乳動物MATCHMAKER雙雜交測定試劑盒”、“MATCHMAKER單雜交系統(tǒng)”(Clontech)；“HybriZAP雙雜交載體系統(tǒng)”(Stratagene)；參考文獻“Dalton S，和Treisman R(1992)Cell 68，597-612”、“Fields S.和Sternglanz R.TrendsGenet.(1994)10286-292”)。
在雙雜交系統(tǒng)中，本發(fā)明蛋白被融合到SRF-結合區(qū)或GAL4-結合區(qū)并在酵母細胞中表達。從預期表達與本發(fā)明蛋白結合的蛋白的細胞制備cDNA文庫，該文庫在表達時與VP16或GAL4轉錄激活區(qū)融合。然后將cDNA文庫引入到上述酵母細胞中，并從所測的陽性克隆(當與本發(fā)明蛋白結合的蛋白在酵母細胞中表達時，兩者的結合可激活報告基因，使得能檢測陽性克隆)分離來自該文庫的cDNA。由該cDNA編碼的蛋白可以通過將如上述分離到的cDNA引入到大腸桿菌中并表達該蛋白來制備。
除了HIS3基因，還可以利用Ade2基因、laeZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等作為報告基因。
與本發(fā)明蛋白結合的化合物可以利用親和層析篩選。例如，可將本發(fā)明蛋白固定在親和柱的載體上，向柱中加入含有預計表達與本發(fā)明蛋白結合的蛋白的受試樣品。本文中受試樣品可以是，例如，細胞提取物、細胞裂解物等。將受試樣品上樣后，洗滌柱子，制備與本發(fā)明蛋白結合的蛋白。
對所得的蛋白的氨基酸序列進行分析，根據該序列合成oligo DNA，并利用該oligo DNA作為探針篩選cDNA文庫以獲得編碼該蛋白的DNA。
利用表面胞質團(plasmon)共振現象的生物傳感器可在本發(fā)明中用作檢測或定量結合化合物的工具。當利用這種生物傳感器時，僅利用少量蛋白且無需標記，就可以實時觀察本發(fā)明蛋白與受試化合物之間的相互作用，其為表面胞質團共振信號形式(例如BIAcore，Pharmacia)。所以，利用生物傳感器例如BIAcore評估本發(fā)明蛋白與測試化合物之間的結合是可能的。
通過將已被固定的本發(fā)明蛋白暴露于合成化學化合物、或天然物質庫、或隨機噬菌體肽展示文庫而篩選結合分子的方法，或者利用基于組合化學技術的高通量篩選來分離與本發(fā)明蛋白結合的蛋白和化學化合物(包括激動劑和拮抗劑)的方法(Wrighton Nc，Farrel FX，Chang R，Kashyap AK，BarboneFP，Mulcahy LS，Johnson DL，Barret RW，Jolliffe LK，Dower WJ；Small peptidesas potent mimetics of the protein hormone erythropoietin，Science(美國)Jul 261996，273 p458-64，Verdine GL.，The combinatorial chemistry of nature.Nature(英國)Nov 7 1996，384，p11-13，Hogan JC Jr.，Directed combinatorial chemistry.Nature(ENGLAND)Nov 7 1996，384 p17-9)，都是本領域公知的。
通過篩選而分離的化合物是促進或抑制本發(fā)明蛋白的活性、治療或預防引起細胞增性疾病(如癌癥)的疾病的侯選藥物。由本發(fā)明的篩選方法獲得的化合物還包括這樣的化合物，其中通過本篩選方法獲得的、具有與本發(fā)明蛋白結合的活性的部分結構通過添加、缺失和/或取代而被改變。
而且，本發(fā)明提供了篩選促進或抑制本發(fā)明蛋白的活性的化合物的方法。由于本發(fā)明的ZNFN3A1蛋白具有促進細胞增殖的活性，促進或抑制本發(fā)明ZNFN3A1蛋白的這種活性的化合物可以利用這種活性作為指標來篩選。
該篩選方法包括以下步驟(a)在受試樣品存在下培養(yǎng)表達ZNFN3A1蛋白的細胞，(b)檢測細胞的增生，和(c)選擇與不存在受試樣品時檢測到的增生相比促進或抑制增生的化合物。抑制ZNFN3A1的表達和/或活性的化合物具有抗癌劑的用途。
任何ZNFN3A1蛋白都可以用來篩選，只要它們包含抑制細胞增殖的活性。例如，可以利用人類ZNFN3A1蛋白，以及與這些蛋白功能上等價的蛋白。ZNFN3A1蛋白可以由細胞內源表達或外源表達。
任何受試樣品，例如，細胞提取物、細胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵微生物產物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗制的蛋白、肽、非肽化合物、合成微分子化合物、天然化合物都可以利用。由上述與本發(fā)明蛋白結合的化合物的篩選獲得的化合物也可以用作為受試化合物。
通過這種篩選分離的化合物是本發(fā)明蛋白的激動劑或拮抗劑。術語“激動劑”是指通過結合本發(fā)明蛋白而激活該蛋白的功能的分子。同樣地，術語“拮抗劑”是指通過結合本發(fā)明蛋白而抑制該蛋白的功能的分子。而且，這種通過篩選分離的化合物是抑制本發(fā)明蛋白在體內與分子(包括DNA和蛋白)相互作用的侯選化合物。
細胞增殖可以，例如，通過測定細胞增殖的速度、測量細胞周期等，以及通過測量集落形成活性予以檢測，象實施例中所描述的那樣。
通過該篩選分離到的化合物是抑制本發(fā)明蛋白的活性的侯選藥物，它可用于治療與本發(fā)明蛋白相關的疾病，例如，癌癥，更特定地，肝細胞癌。
而且，通過添加、缺失和/或取代而改變了抑制ZNFN3A1蛋白活性的那一部分結構的化合物，包括在由本發(fā)明的篩選方法獲得的化合物中。
當由本發(fā)明的方法分離的化合物作為藥物給藥人類或其它哺乳動物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、小雞、貓、綿羊、豬、牛、猴子、狒狒(baboon)、黑猩猩(chimpanzee)時，分離的化合物可以直接給藥，或者可以利用已知的藥物制備方法配制成劑型。例如，根據需要，藥物可以作為糖衣片劑、膠囊、藥酒和微膠囊口服，或者用水或其它任何藥學上可接受的液體配制成用于注射的無菌溶液或懸液形式，非口服給予。例如，化合物可以與藥學上可接受的載體或介質，具體地，無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、調味劑、賦形劑、媒介物、保存劑、粘附劑等，以藥物實施通常所接受的單位劑量的形式進行混合。這些藥劑中活性成分的含量在指定范圍內可獲得適當的劑量。
能夠混合到片劑和膠囊中的添加劑的例子有，粘附劑例如明膠、玉米淀粉、黃芪膠和阿拉伯膠；賦形劑例如微晶纖維素；膨脹劑例如玉米淀粉、明膠和海藻酸；潤滑劑例如硬脂酸鎂；甜味劑例如蔗糖、乳糖或糖精；調味劑例如薄荷油、Gaultheria adenothrix油和櫻桃。當單位劑量形式為膠囊時，上述成分中還可以包括液體載體，例如油。用于注射的無菌組合物可以利用媒介物例如用于注射的蒸餾水，按照常規(guī)的藥物實施進行配制。
生理鹽水、葡萄糖以及其它等滲液體包括助劑，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉，可以用作為注射水溶液。這些可以與合適的增溶劑聯合使用，例如醇類，特別是乙醇，多元醇例如丙二醇和聚乙二醇，非離子表面活性劑，例如Polysorbate 80(TM)和HCO-50。
芝麻油或大豆油可用作油質液體，可以與苯甲酸芐酯或苯甲醇聯合用作增溶劑，還可與緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液和乙酸鈉緩沖液；鎮(zhèn)痛劑，例如鹽酸普魯卡因；穩(wěn)定劑，例如苯甲醇、酚；以及抗氧化劑一起配制。制備的注射劑可以填充到合適的安瓿中。
可以利用本領域熟練技術人員所公知的方法向患者給藥本發(fā)明的藥物化合物，例如作為動脈注射、靜脈注射、經皮注射，并且還可以作為鼻內、經支氣管、肌內或口服給藥。給藥的劑量和方法根據患者的體重和年齡以及給藥方法而變化；不過，本領域熟練技術人員能夠常規(guī)選擇它們。如果所述化合物由DNA編碼，可將該DNA插入到基因治療載體中，并給藥載體進行治療。給藥的劑量和方法根據患者的體重、年齡和癥狀變化，但是本領域熟練技術人員能夠適當地選擇它們。
舉例來說，當向標準成年人(體重60kg)口服給藥時，雖然就癥狀而言存在某些差異，但與本發(fā)明蛋白結合并調節(jié)其活性的化合物的劑量為約0.1mg-100mg每天，優(yōu)選約0.1mg-50mg每天，更優(yōu)選約1.0mg-20mg每天。
當以注射形式向標準成年人(體重60kg)腸胃外給藥時，雖然就患者、靶器官、癥狀和給藥方法而言存在某些差異，但可以很方面地靜脈內注射約0.01mg-30mg每天，優(yōu)選約0.1mg-20mg每天，更優(yōu)選約0.1mg-10mg每天的劑量。在其它動物的情況下，可以按60kg體重的標準換算給藥量。
而且，本發(fā)明提供了利用ZNFN3A1基因作為診斷標志診斷癌癥的方法。該診斷方法包括步驟(a)測定標本的生物樣品中ZNFN3A1基因的表達水平；(b)將ZNFN3A1基因的該表達水平與正常樣品中的進行比較，和(c)將樣品中ZNFN3A1基因的高表達水平定義為具有癌癥。
ZNFN3A1基因在具體標本中的表達水平可以通過定量相應于ZNFN3A1基因的mRNA或者由ZNFN3A1基因編碼的蛋白進行評估。mRNA定量方法是本領域熟練技術人員公知的。例如，與ZNFN3A1基因相應的mRNA可以通過RNA印跡或者RT-PCR進行評估。由于ZNFN3A1基因的全部核苷酸序列已顯示在SEQ ID NO1中，本領域任何技術人員都能設計探針和引物的核苷酸序列以定量ZNFN3A1基因。
ZNFN3A1基因的表達水平可以根據該ZNFN3A1基因編碼的蛋白的活性或量進行分析。測定ZNFN3A1蛋白量的方法顯示于下。例如，免疫測定法可用來測定生物材料中的上述蛋白。任何生物材料都可以用于該蛋白或其活性的測定。例如，分析血樣以評估由血清標志所顯示的蛋白。另一方面，可以根據待分析的每種蛋白的活性選擇合適的方法用于測定ZNFN3A1基因所編碼的蛋白的活性。
評估標本(受試樣品)中ZNFN3A1基因的表達水平并與正常樣品中的進行比較。當這種比較證明ZNFN3A1基因的表達水平高于正常樣品中的水平時，則判定受試者染有癌癥。來自正常樣品和受試者的標本中ZNFN3A1基因的表達水平可以同時進行測定。作為選擇地，可以根據對事先從對照組收集的標本中ZNFN3A1基因的表達水平的分析所獲得的結果，通過統(tǒng)計學方法確定表達水平的正常范圍。將通過檢查受試者樣品所獲得的結果與該正常范圍進行比較；當結果未落在正常范圍內時，受試者被判定染有癌癥。在本發(fā)明中，待診斷的癌癥優(yōu)選為肝細胞癌。
本發(fā)明還提供了診斷肝細胞癌的診斷試劑。本發(fā)明的診斷試劑包含與本發(fā)明的DNA或蛋白結合的化合物。優(yōu)選地，與本發(fā)明的多核苷酸雜交的寡核苷酸，或者可與本發(fā)明蛋白結合的抗體可以作為這些化合物來用。
提供下列實施例是用來舉例說明本發(fā)明，并幫助普通技術人員制備和利用本發(fā)明的。這些實施例并不旨在以任何方式另外限制本發(fā)明的范圍。
本文所引用的任何專利、專利申請和出版物都并入作為參考。
實施例實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明通過下列實施例詳細地舉例說明，但不受限于這些實施例。
材料和方法許多哺乳動物宿主細胞包括人肝細胞癌細胞系Huh7和Alexander、人子宮頸細胞系HeLa和小鼠成纖維細胞系NIH3T3，它們均得自于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，它們都用來分離和鑒定ZNFN3A1。還利用了人肝細胞癌細胞系SNU423和SNU475，它們來自韓國細胞系庫。所有的細胞系在合適的培養(yǎng)基中單層培養(yǎng)用于Huh7 Alexander和NIH3T3的Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基；用于HeLa的Eagle’s極限必需培養(yǎng)基；用于SNU423和SNU475的、補充有10％胎牛血清和1％抗生素/抗真菌溶液(Sigma)的RPMl640，在含有5％CO2的空氣中于37℃生長。
ZNFN3A1的克隆化通常利用KOD-plus(TOYOBO)通過PCR進行。為進行大腸桿菌表達，ZNFN3A1編碼區(qū)被克隆到pET21a的EcoR I-Kpn I位點。
為進行哺乳動物細胞表達，ZNFN3A1編碼區(qū)被克隆到pcDNA3.1(+)和(-)(Invitrogen)的EcoR I-Kpn I位點、pFLAG的EcoR I-Kpn I位點以及pEGFP 的EcoR I-Kpn I位點(Clontech)。KIAA0054編碼區(qū)被克隆到pCMV-HA(Clontech)的EcoR I-Xho I位點。
RNA在如下實驗中利用Qiagen RNeasy試劑盒(Qiagen)或Trizol試劑(Life Technologies)根據制造商的方案通過提取總RNA進行制備。
本文通過RT-PCR擴增RNA。利用poly dT12，18引物(AmershamBiosciences)和Superscript II反轉錄酶(Life Technologies)將10μg總RNA反轉錄為單鏈cDNA。稀釋每一單鏈cDNA用于隨后的PCR擴增。標準RT-PCR在20μl體積的PCR緩沖液(TAKARA)中進行，并在Gene Amp PCR系統(tǒng)9700(Perkin-Elmer)中于94C變性4分鐘、接著以94C 30s、56℃ 30)s、72℃30s進行20個(對于GAPDH)或30個(對于ZNFN3A1)循環(huán)予以擴增。引物序列如下，GAPDH正向5’-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG(SEQ.ID.NO.4)及反向5’-GGTCCACCACTGACACGTTG(SEQ.ID.NO.5)，ZNFN3A1正向5’-TTCCCGATATCAACATCTACCAG(SEQ.ID.NO.6)及反向5’-AGTGTGTGACCTCAATAAGGCAT(SEQ.ID.NO.7)。
為檢測ZNFN3A1，制備了兔抗-ZNFN3A多克隆抗體。利用睪丸cDNA作為模板通過PCR擴增了ZNFN3A1全長編碼序列并克隆到pET21a(Novagen)中。用已克隆的載體轉染BL21-CodonPlus感受態(tài)細胞(Stratagene)。重組ZNFN3A1蛋白由1.0mM IPTG于30℃誘導6小時。利用Pro BondTMResin(Invitrogen)純化His-ZNFN3A1融合蛋白。兔子用純化的His-ZNFN3A1免疫10次。用所得多克隆抗體進行的免疫印跡顯示了50kD的單一條帶，它是帶有FLAG-標記的ZNFN3A1，這與利用抗-FLAG單克隆抗體(Sigma)所檢測到的模式(數據未顯示)相同。
ZNFN3A1在細胞周期進程中的效果由流式細胞術測定。細胞以1×105細胞/100mm皿的密度鋪板。細胞在指定的時間用胰蛋白酶處理，收集于PBS中，并固定在70％冷乙醇中。RNase處理后，細胞在PBS中用碘化丙錠(50μg/ml)染色。在Becton Dickinson FACScan上進行流式細胞計數，并通過CellQuest和ModFit軟件(Verity Software House)進行分析。從至少20,000個未經選通的細胞確定處于細胞周期G0/G1、S和G2/M期的核、以及任何亞-G1細胞群的百分比。
還在各種實驗中進行了免疫印跡和免疫組化分析。在免疫印跡中，細胞用PBS洗滌兩次，并用裂解緩沖液(150mM NaCI、1％ Triton X-100、50mM Tris-HCI pH 7.4、1mM DTT和1X完全蛋白酶抑制劑混合物(Roche))收集。在細胞勻漿并于10,000xg離心30分鐘后，通過Bradford測定(Bio-Rad)對上清進行蛋白濃度標準化。蛋白通過10％ SDS-PAGE分離，并用小鼠抗-FLAG、兔抗-RNA聚合酶II、兔抗-HA抗體以及兔抗-ZNFN3A1抗體進行免疫印跡。HRP-偶聯的山羊抗-小鼠lgG和抗-兔lgG作為ECL檢測系統(tǒng)(Amersham Biosciences)的二抗。
在免疫組化分析中，利用抗-ZNFN3A1抗體進行免疫組化染色。根據制造商建議的方法將石蠟-包埋的組織切片置于SAB-PO過氧化物酶免疫染色系統(tǒng)(Nichirei，東京，日本)中。將檸檬酸緩沖液(pH6)中的載玻片在微波爐中700W預處理10分鐘，使抗原從脫石蠟且再水合的組織中回收。
實施例1鑒定在HCC中頻繁上調的新基因利用具有23040個基因的基因組范圍的cDNA微陣列，我們鑒定了表達序列標簽(EST)，它在乙型肝炎-陽性和/或丙型肝炎-陽性HCC中普遍上調。其中，我們聚焦于與一種EST對應的基因A6681(Hs.8109)，因為與相應的非癌肝組織相比，它的表達在12個臨床HCC中有11個(91.7％)顯著上調(圖1A)?；駻6681的表達提高在另外的10個HCC病例中通過RT-PCR也得到了確認(圖1B)。通過半定量RT-PCR確認的相對表達與通過cDNA微陣列確認的非常相關。
實施例2A新的人類基因ZNFN3A1的分離和鑒定利用Clonetech的多組織RNA印跡，使32P標記的部分A46681 cDNA與約1.7-kb轉錄本雜交，該轉錄本購自Clontech，可在睪丸及骨骼肌中表達(圖1C)。A6681探針利用一組引物5’-TTCCCGATATCAACATCTACCAG-3’(SEQ.ID.NO.6)和5′-AGTGTGTGACCTCAATAAGGCAT-3′(SEQ.ID.NO.7)通過RT-PCR制備。預雜交、雜交和洗滌根據供應商的建議進行。印跡用增感屏于-80℃放射自顯影24小時。約1.7kb的多核苷酸轉錄本被命名為ZNFN3A1基因。
利用Clontech的Marathon cDNA擴增試劑盒根據制造商的指示通過cDNA末端5’快速擴增(5’RACE)，從而測定轉錄本5’區(qū)序列。為擴增ZNFN3A1 cDNA的5’部分，采用基因特異性反向引物(5’-CTGCCAAGAAGTCGGAGTCTGGAG)[SEQ.ID.NO.8]。cDNA模板通過RT-PCR自人睪丸mRNA合成。PCR產物利用Invitrogen的TA克隆化試劑盒進行克隆，其序列用來自Applied Biosystems的ABI PRISM 377 DNA測序儀進行測定。結果，組裝得到SEQ.ID.NO1所示的具有1622個核苷酸的序列，它含有編碼428個氨基酸的1284個核苷酸的開放讀框。
由于在EST數據庫中未鑒定出含有ZNFN3A1基因5’部分的EST克隆，在基因組數據庫中查找了與ZNFN3A1 cDNA相應的基因組序列。在基因組序列對比中發(fā)現了歸屬于染色體帶1q44的粘粒序列，它也包括ZNFN3A1基因。利用GENSCAN和Gene Recognition(GENSCAN來自MIT(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)而GRAIL 2來自IMS(http://www.genome.ad.jp))以及ABI提供的Assembly Internet Link程序(AutoAssembler 2.1)，預測了候選外顯子序列，并進行了外顯子連接。
實施例2B分離并鑒定新的人類蛋白，ZNFN3A1利用含有編碼428個氨基酸的開放讀框的1622個核苷酸的序列，利用簡單模塊構造研究工具(SMART)從中EMBL(http://smart.embl-heidelberg.de)鑒定到了蛋白ZNFN3A1。SMART提示，ZNFN3A1蛋白含有zf-MYND[鋅指蛋白(含MYND結構域)]結構域(密碼子49-87)以及SET[(Su(var)3-9，zeste增強子，Trithorax)]結構域(密碼子117-246)(圖2A)。ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列與小鼠(Mus museulus)ES細胞cDNA的氨基酸序列(GenBank登錄號AK010447)享有94％的同一性(圖2B)，編碼該蛋白的基因被命名委員會命名為“ZNFN3A1”/(鋅指蛋白，亞家族3A(含MYND結構域)，1)。
實施例3ZNFN3A1亞細胞定位與ZNFN3A1相應的完整編碼區(qū)被克隆到pEGFP-N1載體和pFLAG-CMV-5a載體中，這些構建物被轉染到SNU475細胞中并表達。EGFP標記型ZNFN3A1和FLAG標記型ZNFN3A1通過蛋白質印跡確認(數據未顯示)。通過熒光免疫細胞化學分析，在胞漿和核中都檢測到均質的ZNFN3A1-EGFP融合蛋白和FLAG-標記的ZNFN3A1蛋白(圖3A-F)。利用ZNFN3A1特異性抗體觀察了內源ZNFN3A1蛋白的亞細胞定位。
有趣的是，ZNFN3A1蛋白的亞細胞定位在細胞周期進程中或者因培養(yǎng)細胞的密度而改變。通過進行內源ZNFN3A1蛋白的免疫細胞化學分析，有些量的蛋白在低細胞濃度培養(yǎng)的情況下定位于核內(圖3G-I和圖3M-O)。不過，在高細胞濃度培養(yǎng)的情況下，大多數ZNFN3A1蛋白定位于胞漿中(圖3J-L和圖3P-R)。這些結果揭示ZNFN3A1的亞細胞定位取決于細胞濃度。當細胞處于S期中期到晚期或者培養(yǎng)于稀疏條件下時，ZNFN3A1在核中積聚，而當它們處于其它時期或生長在密集條件下時，ZNFN3A1定位于胞漿和核中。
進行免疫細胞化學分析，用含4％多聚甲醛的PBS將培養(yǎng)的細胞在帶有小格的載玻片上固定15分鐘，然后用含0.1％Triton X-100的PBS室溫下處理2.5分鐘使之滲透。細胞用2％BSA在PBS中于4C覆蓋24小時以封閉非特異性雜交，隨后與1∶2000稀釋的小鼠抗-FLAG抗體和1∶3000稀釋的兔抗-ZNFN3A1抗體(一抗)溫育?？贵w用熒光底物偶聯的抗-小鼠IgG和抗-兔lgG二抗(ICN/Cappel和Jackson Immuno Research)染色。核用4′，6′-聯脒-2′-苯基吲哚二氫氯化物(4’，6’-diamidine-2’-phenylindole dihydrochioride)(DAPI)復染。熒光圖像用ECLIPSE E800顯微鏡獲取。
ZNFN3A1的定位可能取決于細胞周期，因而利用流式細胞儀在不同細胞濃度的SNU475細胞中分析細胞周期。細胞以1×1O5細胞/100mm皿的密度鋪板。細胞在指定的時間用胰蛋白酶處理，收集于PBS中，并固定在70％冷乙醇中。RNase處理后，細胞在PBS中用碘化丙錠(50μg/ml)染色。在Becton Dickinson FACScan上進行流式細胞計數，并通過CellQuest和ModFit軟件(Verity Software House)進行分析。從至少20,000個未經選通的細胞確定處于細胞周期G0/G1、S和G2/M期的核、以及任何亞-G1細胞群的百分比。
將低細胞濃度和高細胞濃度相比，處于G0/G1期的細胞群在高細胞濃度的情況下升高，然而S和G2/M期的細胞群大大下降。為詳細確定細胞周期對ZNFN3A1定位的影響，利用阿非迪霉素(aphidicolin)使Huh7細胞同步化，并觀察ZNFN3A1的亞細胞定位(圖4a，b)。大多數Huh7細胞在阿非迪霉素處理36小時之后停留在G0/G1期，并且ZNFN3A1定位于胞漿中。當從培養(yǎng)基中除去阿非迪霉素后，細胞周期得以前進，并且ZNFN3A1蛋白從胞漿轉移到核中。這些數據證明ZNFN3A1蛋白的亞細胞定位受細胞周期狀態(tài)的調控，而且ZNFN3A1蛋白在增殖條件下轉移到核中。
實施例4ZNFN3A1對正常組織細胞系NIH3T3細胞的生長的促進為分析ZNFN3A1基因轉移對肝細胞癌細胞系生長的影響，用包含有義ZNFN3A1和反義-ZNFN3A1的表達質粒pcDNA3.1轉染正常組織細胞系NIH3T3細胞。
利用FuGENE 6轉染試劑根據供應商的建議用含有全長ZNFN3A1編碼序列的pcDNA3.1載體(Invitrogen)轉染NIH3T3細胞。細胞在含有10％FBS和0.9mg/ml遺傳霉素(geneticin)的DMEM中維持，并挑選單個集落。通過RT-PCR確定組成型ZNFN3A1表達。
NIH3T3細胞通常不表現出ZNFN3A1 mRNA的內源表達。在集落形成寸，有義ZNFN3A1表達載體促進的NIH3T3細胞的集落形成，而模擬物和反義-ZNFN3A1載體與之則相比顯示未生長，如圖5A、5B所示。
集落形成測定通過將細胞以1×105細胞/100mm皿的密度鋪板來進行。24小時后，利用FuGENE 6轉染試劑(Roche)用質粒載體轉染細胞，并用適當濃度的遺傳霉素培養(yǎng)2周。細胞用100％甲醇固定，并用Giemsa溶液染色。這些集落形成測定通過三個獨立的實驗確認。
為進一步研究ZNFN3A1的生長促進效果，進一步對ZNFN3A1穩(wěn)定轉染的NlH3T3細胞進行檢查。被有義ZNFN3A1穩(wěn)定轉染的細胞表達組成型ZNFN3A1 mRNA(圖5C，5D)。表達由RT-PCR測定。如圖5C、5D中所示，持續(xù)表達ZNFN3A1的集落與被反義ZNFN3A1和對照載體轉染的細胞相比，表現出高的生長能力，表明ZNFN3A1對于肝細胞癌細胞的生長促進具有重要作用。
實施例5反義寡核苷酸所致的ZNFN3A1表達的降低阻抑了肝細胞癌細胞的生長為調查阻抑ZNFN3A1是否可誘導HCC細胞的生長遲緩和/或細胞死亡，合成了許多反義寡核苷酸以抑制ZNFN3A1的表達?？缙鹗济艽a子的ZNFN3A1的有義或反義S-寡核苷酸利用LIPOFECTIN試劑(GIBCO-BRL)轉染。硫代磷酸酯修飾的ODN序列如下反義S-寡核苷酸5’-GCGGGAGGATGGAGCC(SEQ.ID.NO.3)。
細胞與有義和反義S-寡核苷酸培養(yǎng)24小時，并通過RT-PCR和利用抗-ZNFN3A1抗體的蛋白質印跡對它們的ZNFN3A1和ZNFN3A1表達進行分析。
用跨起始密碼子的反義S-寡核苷酸轉染的細胞顯著降低組成型地表達大量ZNFN3A1的SNU475和Huh7細胞中ZNFN3A1的內源表達(圖6A、B)。如先前所描述的集落形成測定所確定的，反義S-寡核苷酸的轉染還顯著抑制Huh7和SNU475細胞的細胞數目。
MTT試驗通過將細胞以1×105細胞/100mm皿的密度鋪板來進行。第二天，細胞用ZNFN3A1的有義或反義S-寡核苷酸轉染，一式三份。培養(yǎng)72小時之后，培養(yǎng)基用含5mg 3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-聯苯四唑溴化物(MTT)(SIGMA)的1Oml新鮮培養(yǎng)基替換。于37℃進一步溫育4小時之后，細胞通過添加1ml 0.01N HCI/10％SDS裂解。顏色反應用ELISA板閱讀器在570nm測試波長處定量(參比，630nm)。細胞存活力表示為與對照相比較的吸光度。
還在其它HCC細胞系包括Alexander細胞和SNU423細胞中觀察到因反義-ZNFN3A1轉染所引起的與對照S-寡核苷酸相比的細胞生長阻抑，如圖6C、6D所示，所述兩種細胞也都組成型地表達大量的ZNFN3A1。集落形成測定結果通過三個獨立實驗得到確認。此外，流式細胞計數顯示抑制ZNFN3A1表達可顯著降S期細胞群的細胞數目并提高亞-G1期的數目(圖6E)。這些結果揭示，阻抑ZNFN3A1表達可誘導HCC的生長抑制和促進其凋亡。
實施例6ZNFN3A1與RNA螺旋酶KIAA0054的相互作用為調查ZNFN3A1的致癌機制，利用酵母雙雜交篩選系統(tǒng)尋找與ZNFN3A1相互作用的蛋白。酵母雙雜交試驗利用Clontech的MATCHMAKER GAL4雙雜交系統(tǒng)2和系統(tǒng)3根據制造商的方案進行。全長ZNFN3A1編碼序列被克隆到pAS2-1的EcoR I位點中作為誘餌載體。為篩選文庫，將人睪丸文庫克隆到pACT2(Clontech)中。將同時共轉化的AH109酵母細胞(帶有pAS2-1誘餌載體和多個pACT2捕獲載體)涂板在添加有25mg/L X-α-Gal(Clontech)和25mM 3-氨基-1，2，4，-三唑(Sigma)的SD基本培養(yǎng)基(-Ade/-His/-Leu/-Trp)上。從陽性集落中分離文庫質粒，并對序列和讀框進行確認。
在鑒定的克隆中，RNA螺旋酶KIAA0054的C-末端區(qū)與ZNFN3A1通過利用pAS2.1-ZNFN3A1和pACT2-KIAA0054進行的同時轉化而相互作用(圖7A、7B)。RNA螺旋酶構成一個利用核苷三磷酸作為能源解開雙鏈RNA的蛋白家族。很清楚RNA螺旋酶是事實上發(fā)現于所有的生物過程中的廣泛分布的一組蛋白。
為進一步確認ZNFN3A1和KIAA0054的相互作用，制備了FLAG-標記的ZNFN3A1蛋白。每10-cm皿HeLa細胞用8μg pFLAG-CMV-ZNFN3A1和pCMV-HA-KIAA0054 DNA轉染，并且再過48小時后收集。細胞用含150mM NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(PBS)(pH 7.4)洗滌1次，并在NET-N緩沖液(150mM NaCl、0.5％NP-40、20mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA、和1X完全蛋白酶抑制劑混合物)中裂解。在典型的免疫沉淀反應中，300μgHela全細胞裂解物提取物與1μg所需抗體和20μl蛋白A或蛋白G Sepharose珠子(Zymed)于4℃溫育1-2小時。珠子用1ml NET-N緩沖液洗滌4次。結合于珠子的蛋白通過在SDS樣品緩沖液中煮沸而洗脫，通過SDS-PAGE分離，并轉移到硝酸纖維素膜上。膜如上所述用于免疫印跡。裂解物用抗-FLAG抗體和抗-HA抗體作為對照通過免疫印跡進行直接分析。ZNFN3A1蛋白顯示了它與表達在HeLa哺乳動物細胞中的HA-標記的KIAA0054蛋白的結合(圖7C)。
為鑒定ZNFN3A1中負責與KIAA0054相互作用的區(qū)域，利用ZNFN3A1缺失片段進行雙雜交試驗。缺乏氨基酸1-250或者100-428的突變體與KIAA0054C-末端區(qū)的相互作用為陰性，而含有氨基酸100-250的片段為陽性(圖8)。這說明ZNFN3A1-結合區(qū)位于SET結構域中。
實施例7ZNFN3A1、RNA螺旋酶和RNA聚合酶II之間的相互作用RNA螺旋酶通過結合轉錄因子和RNA聚合酶II對轉錄起著關鍵作用。這些結果顯示存在著鋅指蛋白ZNFN3A1通過不僅與RNA螺旋酶KIAA0054而且與RNA聚合酶II結合調控轉錄的可能性。ZNFN3A1、RNA螺旋酶KIAA0054和RNA聚合酶II之間的結合由共免疫沉淀測試(圖9)。每10-cm皿HeLa細胞用8μg pFLAG-CMV-ZNFN3A1和pCMV-HA-KIAA0054 DNA轉染，并且再過48小時后收集。細胞用含150mM NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(PBS)(pH 7.4)洗滌1次，并在NET-N緩沖液(150mM NaCl、0.5％NP-40、20mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA、和1X完全蛋白酶抑制劑混合物)中裂解。在典型的免疫沉淀反應中，300μg全細胞裂解物提取物與1μg抗體和20μl蛋白A或蛋白G Sepharose珠子(Zymed)于4C溫育1-2小時。珠子用1ml NET-N緩沖液洗4次。結合于珠子的蛋白通過在SDS樣品緩沖液中煮沸而洗脫，通過SDS-PAGE分離，并轉移到硝酸纖維素膜上。膜如上所述用于免疫印跡。
利用抗-FLAG抗體、抗-HA抗體和抗-RNA聚合酶II抗體檢測到與內源RNA聚合酶II的結合。當抗-FLAG抗體用于免疫沉淀并且抗RNA聚合酶II抗體用于免疫印跡的時候，RNA聚合酶II特異性帶在共同表達FLAG-ZNFN3A1蛋白和HA-KIAA0054蛋白的情況下被強烈檢測到，并且在僅表達FLAG-ZNFN3A1蛋白的情況下少量檢測到。在另一方面，當抗-HA抗體用于免疫沉淀并且抗RNA聚合酶II抗體用于免疫印跡的時候，RNA聚合酶特異性帶不僅在共同表達FLAG-ZNFN3A1蛋白和HA-KIAA0054蛋白的情況下，而且還在僅表達HA-KIAA0054蛋白的情況下被強烈檢測到。而且，通過改變用于免疫沉淀和免疫印跡的抗體反向進行了共免疫沉淀。結果與利用對等抗體的情況相似。這些結果證明RNA螺旋酶KIAA0054通過分別與ZNFN3A1蛋白和RNA聚合酶II接觸，可以介導ZNFN3A1蛋白和RNA聚合酶II之間的復合體的形成。因此，ZNFN3A1、RNA螺旋酶KIAA0054和RNA聚合酶II的轉錄調控可能在肝細胞癌致癌作用中對促進細胞生長方面具有重要作用。圖12是ZNFN3A1、RNA螺旋酶和RNA聚合酶II之間形成的復合體調控基因轉錄的圖解。
實施例8ZNFN3A1蛋白的序列特異性結合利用含有20個隨機核苷酸的核心的寡核苷酸構建物測定了ZNFN3A1的共有DNA結合位點。利用隨機寡核苷酸通過DNA選擇手段尋找公認的能夠在體外與ZNFN3A1蛋白結合的保守性序列。制備了GST-ZNFN3A1融合蛋白，并將其固定在Sepharose 4B是噶報告，選出能與該蛋白結合的雙鏈隨機寡核苷酸DNA。在經過1O次選擇和隨后的擴增之后，擴增的DNA被克隆到PCR載體(Clontech)中，并對92個克隆進行了測序。在這92個克隆中，32個(34.8％)含有共有序列5’-CCCTCC-3’，這是比計算概率高102倍的發(fā)生率(圖10A)。為制備表達ZNFN3A1鋅指結構域的重組蛋白，利用一對引物5’-CGGAATTCATGGAGCCGCTGAAGGTGGAAAAG-3’[SEQ.ID.NO.9]和5’-CCGCTCGAGGGATGCTCTGATGTTGGCGTCG-3’[SEQ.ID.NO.10]，通過RT-PCR擴增了與全長ZBFN3A1密碼子對應的cDNA片段，將其亞克隆到pGEX-6P質粒中合適的克隆位點上。如前所述制備重組融合蛋白并由Sepharose 46柱純化。具有序列“5’-GGGAGAATTCCGACACGCGT(N20)CTCGAGCGTCTACATGGATCCTCA-3’”[SEQ.ID.NO.11]的寡核苷酸，用于按照上文所述進行選擇和擴增。
利用真核啟動子數據庫(http://www.epd.isb-slb.ch/index.html)，尋找ZNFN3A1下游候選基因，并挑選到5個候選基因。首選，通過半定量RT-PCR在外源表達ZNFN3A1的COS7穩(wěn)定轉染體中測定每個基因的表達水平(圖10B)。這些結果揭示EGFR、myc和Bcl2的表達被ZNFN3A1上調。
在EGFR的5’側翼區(qū)-213-bp和-207-bp之間(CBS1)、-106-bp和-100-bp之間(CBS2)、-65-bp和-59-bp之間(CBS3)、以及-46-bp和-40-bp之間(CBS4)，鑒定到四個公認的ZNFN3A1結合位點，它們的共有靶序列為5’-(C)CCCTCC(T)或(A)GGAGGG(G)-3’。通過將CBS1、CBS2、cBS3和CBS4每個序列克隆到pGL3-基礎載體(Promega)的合適的酶位點中，制備了含有這些序列的野生型報告質粒(P1)以及該質粒的四個缺失構建體(P2、P3、P4和P5)。質粒P1、P2、P3、P4和P5通過擴增來制備，其中用到P1-F(5′-GGGGTACCCAGTGCTGGGAACGCCCCTCTCG-3′)[SEQ.ID.NO.12]、P2-F(5’-GGGGTACCCACTCCCGCCGGAGACTAGGTCC-3’)[SEQ.ID.NO.13]、3-F(5’-GGGGTACCCTCGCATTCTCCTCCTCCTCTGC-3’)[SEQ.ID.NO.14]、4-F(5’-GGGGTACCTGGTCCCTCCTCCTCCCGCCCTG-3’)[SEQ.ID.NO.15]或P5-F(5’-GGGGTACCTCCCGCCCTGCCTCCCGCGCCTC-3’)[SEQ.ID.NO.16]以及相同的反向引物(P1-R；5’-GAAGATCTAG GTGGCCTGTCGTCCGGTCTG G-3’)[SEQ.ID.NO.17]。利用QuickChange定點誘變試劑盒根據供應商(Stratagene)的建議用CATTCC取代CCCTCC，從而對兩個公認的ZNFN3A1結合位點進行定點誘變。
每個報告質粒(2μg)利用FuGENE6試劑(Boehringer)根據制造商的說明與0.2μg pRL-TK質粒(Promega)共轉染。利用雙重-螢光素酶報告子測定系統(tǒng)(Promega)按照制造商的方案進行螢光素酶測定。
實施例9ZNFN3A1對FGFR啟動子活性的上調既然在HCC中報道了增強的EGFR表達，我們聚焦于該報告分子并測試它的啟動子是否受ZNFN3A1-結合序列的調控。我們在它的5’側翼區(qū)鑒定到四個可能的ZNFN3A1-結合基元(CBS1、2、3和4)，并制備了含有這四個基元的報告質粒(P1)以及多個缺失形式(P2、P3、P4和P5)。當這些報告質粒被轉染到SNU475細胞中時，P1的活性顯著高于P2、P3、P4或P5?？紤]到P4的活性與P5的非常相似的事實，我們認為-261和-50之間含有CBS1、CBS2和CBS3的區(qū)域，可能與EGFR的轉錄激活相關。為揭露這些結構域的作用，我們構建了含有突變體CBS1(P1m1)和突變體CBS2(P1m2)或者突變的CBS3(P1m3)的報告質粒，其中每個候選結合基元由5’-CCCTCC-3’變?yōu)?’-CATTCC-3’(圖11A)。報告子測定揭示含突變基元的片段(P1m1、P1m2和P1m3)激活EGFR轉錄的程度比P1弱(圖11B)。這些結果意味著這三個公認的ZNFN3A1-結合基元參與EGFR的轉錄激活。
工業(yè)實用性新的人類基因ZNFN3A1在肝細胞癌中的表達與非癌肝組織相比顯著提高。因此，該基因可作為HCC的診斷標志，而其所編碼的蛋白因此可用于診斷測定。
本發(fā)明人還已經證明新蛋白ZNFN3A1的表達促進細胞生長，反之細胞生長受與ZNFN3A1相應的反義寡核苷酸的抑制。這些發(fā)現表明ZNFN3A1刺激致癌活性。因此，這種新的癌蛋白是開發(fā)抗癌醫(yī)藥品的有用靶。舉例來說，封閉ZNFN3A1表達或者阻止它的活性的制劑可能會找到作為抗癌制劑的治療用途，特別是治療HCC的抗癌制劑。這類制劑的例子包括識別ZNFN3A1的反義寡核苷酸和抗體。
此外，本發(fā)明人已經證明ZNFN3A1直接與RNA螺旋酶聯合并與RNA聚合酶II形成復合體。該復合體隨即通過與5’側翼區(qū)元件“(C)CCCTCC(T)”的直接結合，激活下游靶基因，包括EGFR的轉錄。因此，抑制該復合體活性的制劑可能也會找到治療和預防HCC的用途。
盡管已經詳細并參照其中的具體實施方案對本發(fā)明進行了描述，對本領域熟練技術人員顯而易見的是，能夠對其進行各種變化和修飾而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。
序列表<110>東京大學總長代表日本國(JAPAN As REPRESENTED BY THE PRESIDENT OF THEUNIVERSITY OF TOKYO ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)腫瘤療法科學股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENcE，INC.)<120>肝細胞癌相關基因和蛋白<130>ONC-A0206P<150>US 60/324.261<151>2001-09-25<150>US 60/391,666<151>2002-06-26<150>CA<151>2002-08-23<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1622<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(96)..(1382)<223>
<400>1gtgcgcgcag ggcgcaggcg cgcgggtccc ggcagcccgt gagacgcccg ctgctggacg60cgggtagccg tctgaggtgc cggagctgcg ggagg atg gag ccg ctg aag gtg 113Met Glu Pro Leu Lys Val1 5gaa aag ttc gca acc gcc aac agg gga aac ggg ctg cgc gcc gtg acc 161Glu Lys Phe Ala Thr Ala Asn Arg Gly Ash Gly Leu Arg Ala Val Thr
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360 365 370aaa gtt ggc aaa ctg cag cta cat caa ggc atg ttt ccc caa gca atg 1265Lys Val Gly Lys Leu Gln Leu His Gln Gly Met Phe Pro Gln Ala Met375 380 385 390aag aat ctg aga ctg gct ttt gat att atg aga gtg aca cat ggc aga 1313Lys Asn Leu Arg Leu Ala Phe Asp Ile Met Arg Val Thr His Gly Arg395 400 405gaa cac agc ctg att gaa gat ttg att cta ctt tta gaa gaa tgc gac 1361Glu His Ser Leu Ile Glu Asp Leu Ile Leu Leu Leu Glu Glu Cys Asp410 415 420gcc aac atc aga gca tcc taa gggaacgcag tcagagggaa atacggcgtg1412Ala Asn Ile Arg Ala Ser425tgtctttgtt gaatgcctta ttgaggtcac acactctatg ctttgttagc tgtgtgaacc 1472tctcttattg gaaattctgt tccgtgtttg tgtaggtaaa taaaggcaga catggtttgc 1532aaaccacaag aatcattagt tgtagagaag cacgattata ataaattcaa aacatttggt 1592tgaggatgcc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1622<210>2<211>428<212>PRT<213>人(HOmo sapiens)<400>2Met Glu Pro Leu Lys Val Glu Lys Phe Ala Thr Ala Asn Arg Gly Asn1 5 10 15Gly Leu Arg Ala Val Thr Pro Leu Arg Pro Gly Glu Leu Leu Phe Arg20 25 30Ser Asp Pro Leu Ala Tyr Thr Val Cys Lys Gly Ser Arg Gly Val Val35 40 45Cys Asp Arg Cys Leu Leu Gly Lys Glu Lys Leu Met Arg Cys Ser Gln50 55 60
Cys Arg Val Ala Lys Tyr Cys Ser Ala Lys Cys Gln Lys Lys Ala Trp65 70 75 80Pro Asp His Lys Arg Glu Cys Lys Cys Leu Lys Ser Cys Lys Pro Arg85 90 95Tyr Pro Pro Asp Ser Val Arg Leu Leu Gly Arg Val Val Phe Lys Leu100 105 110Met Asp Gly Ala Pro Ser Glu Ser Glu Lys Leu Tyr Ser Phe Tyr Asp115 120 125Leu Glu Ser Asn Ile Asn Lys Leu Thr Glu Asp Lys Lys Glu Gly Leu130 135 140Arg Gln Leu Val Met Thr Phe Gln His Phe Met Arg Glu Glu Ile Gln145 150 155 160Asp Ala Ser Gln Leu Pro Pro Ala Phe Asp Leu Phe Glu Ala Phe Ala165 170 175Lys Val Ile Cys Asn Ser Phe Thr Ile Cys Asn Ala Glu Met Gln Glu180 185 190Val Gly Val Gly Leu Tyr Pro Ser Ile Ser Leu Leu Asn His Ser Cys195 200 205Asp Pro Asn Cys Ser Ile Val Phe Asn Gly Pro His Leu Leu Leu Arg210 215 220Ala Val Arg Asp Ile Glu Val Gly Glu Glu Leu Thr Ile Cys Tyr Leu225 230 235 240Asp Met Leu Met Thr Ser Glu Glu Arg Arg Lys Gln Leu Arg Asp Gln245 250 255Tyr Cys Phe Glu Cys Asp Cys Phe Arg Cys Gln Thr Gln Asp Lys Asp260 265 270Ala Asp Met Leu Thr Gly Asp Glu Gln Val Trp Lys Glu Val Gln Glu275 280 285Ser Leu Lys Lys Ile Glu Glu Leu Lys Ala His Trp Lys Trp Glu Gln
290 295 300Val Leu Ala Met Cys Gln Ala Ile Ile Ser Ser Asn Ser Glu Arg Leu305 310 315 320Pro Asp Ile Asn Ile Tyr Gln Leu Lys Val Leu Asp Cys Ala Met Asp325 330 335Ala Cys Ile Asn Leu Gly Leu Leu Glu Glu Ala Leu Phe Tyr Gly Thr340 345 350Arg Thr Met Glu Pro Tyr Arg Ile Phe Phe Pro Gly Ser His Pro Val355 360 365Arg Gly Val Gln Val Met Lys Val Gly Lys Leu Gln Leu His Gln Gly370 375 380Met Phe Pro Gln Ala Met Lys Ash Leu Arg Leu Ala Phe Asp Ile Met385 390 395 400Arg Val Thr His Gly Arg Glu His Ser Leu Ile Glu Asp Leu Ile Leu405 410 415Leu Leu Glu Glu Cys Asp Ala Asn Ile Arg Ala Ser420 425<210>3<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個人工合成的引物序列<400>3gcgggaggat ggagcc16<210>4<211>22<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>一個人工合成的引物序列<400>4acaacagcct caagatcatc ag 22<210>5<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個人工合成的引物序列<400>5ggtccaccac tgacacgttg 20<210>6<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個人工合成的引物序列<400>6ttcccgatat caacatctac cag 23<210>7<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個人工合成的引物序列<400>7agtgtgtgac ctcaataagg cat 23<210>8
<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個人工合成的引物序列<400>8ctgccaagaa gtcggagtct ggag 24<210>9<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個人工合成的引物序列<400>9cggaattcat ggagccgctg aaggt ggaaa ag 32<210>10<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個人工合成的引物序列<400>10ccgctcgagg gatgctctga tgttggcgtc g 31<210>11<211>64<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(40)<223>″n″＝A，G，C或T<400>11gggagaattc cgacacgcgt nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ctcgagcgtc tacatggatc 60ctca 64<210>12<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個人工合成的引物序列<400>12ggggtaccca gtgctgggaa cgcccctctc g 31<210>13<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個人工合成的引物序列<400>13ggggt acccaac tcccgccgg agactaggtc c 31<210>14<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個人工合成的引物序列
<400>14ggggtaccct cgcattctcc tcctcctctg c 31<210>15<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個人工合成的引物序列<400>15ggggtacctg gtccctcctc ctcccgccct g 31<210>16<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個人工合成的引物序列<400>16ggggtacctc ccgccctgcc tcccgcgcct c 31<210>17<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個人工合成的引物序列<400>17gaagatctag gtggcctgtc gtccggtctg g 3權利要求
1.分離的DNA，為下面(a)到(d)中任何之一(a)編碼由氨基酸序列SEQ.ID.NO.2組成的蛋白的DNA；(b)包含核苷酸序列SEQ.ID.NO.1的編碼區(qū)的DNA；(c)編碼由氨基酸序列SEQ.ID.NO.2組成的蛋白的DNA，其中一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，從而所編碼的蛋白是由氨基酸序列SEQ.ID.NO.2組成的蛋白的功能等價體；和(d)在嚴謹條件下與由核苷酸序列SEQ.ID.NO.1組成的DNA雜交的DNA，從而所編碼的蛋白是由任何一種SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列組成的蛋白的功能等價體。
2.分離的DNA，編碼由氨基酸序列SEQ.ID.NO.2組成的蛋白的部分肽。
3.載體，其中插入了權利要求1或2的DNA。
4.轉化的細胞，包含權利要求1或2的DNA，或者權利要求3的載體。
5.分離的蛋白，由根據權利要求1的DNA編碼，具有促進細胞增殖和靶基因的轉錄激活的活性。
6.分離的多肽，由根據權利要求2的DNA編碼。
7.制備權利要求5的蛋白的方法，包括培養(yǎng)權利要求4的轉化細胞，并從細胞或其培養(yǎng)上清收集所表達的蛋白的步驟。
8.轉錄激活復合體，包括權利要求5的蛋白及其至少一種共激活因子。
9.權利要求8的復合體，其中的共激活因子選自RNA螺旋酶或RNA聚合酶。
10.抗體，它識別并特異性結合權利要求5的蛋白或權利要求8的復合體。
11.多核苷酸，與由核苷酸序列SEQ.ID.NO.1組成的DNA或其互補鏈雜交，并包括至少15個核苷酸。
12.用于治療癌癥的治療制劑，包括權利要求10的抗體或者權利要求11的多核苷酸。
13.篩選與權利要求5所述蛋白結合的化合物的方法，包括步驟(a)使包含至少一種測試化合物的受試樣品與權利要求5的蛋白或其部分肽進行接觸；(b)檢測受試樣品與蛋白或其部分肽的結合活性；和(c)選擇與蛋白或其部分肽結合的測試化合物。
14.與權利要求5的蛋白結合的化合物，它能夠通過權利要求13的方法分離。
15.篩選抑制權利要求5所述蛋白的活性的化合物的方法，包括步驟(a)在存在包含至少一種測試化合物的受試樣品的時候培養(yǎng)表達權利要求5的蛋白或其部分肽的細胞；(b)檢測細胞增殖；和(c)選擇與不存在受試樣品時所檢測到的增殖相比抑制增殖的測試化合物。
16.抑制權利要求5的蛋白的活性的化合物，它能夠通過權利要求15的方法分離。
17.篩選抗癌活性的化合物的方法，包括步驟(a)使包含至少一種測試化合物的受試樣品與權利要求5的蛋白、它的共激活因子以及包含所述蛋白的靶序列的DNA，在允許所述蛋白和DNA形成復合體的合適條件下接觸；和(b)選擇抑制復合體形成的測試化合物。
18.權利要求17的方法，其中所述靶序列包括側接EGFR 5’區(qū)的CBS序列。
19.篩選抗癌活性的化合物的方法，包括步驟(a)使包含至少一種測試化合物的受試樣品與權利要求7的復合體和具有為所述復合體識別的轉錄調控區(qū)的報告基因接觸；和(b)選擇抑制報告基因表達的測試化合物。
20.抗癌組合物，包括通過權利要求18或19的方法分離的化合物作為活性成分。
21.抗癌組合物，包括與權利要求1的DNA結合的反義寡核苷酸、核酶或干擾性RNA作為活性成分。
22.診斷癌癥的方法，其中所述方法包括步驟(a)測定標本的生物樣品中ZNFN3A1基因的表達水平；(b)將ZNFN3A1基因的表達水平與正常樣品中的水平相比較，和(c)將樣品中ZNFN3A1基因的高表達水平判定為具有癌癥。
23.權利要求13的方法，其中癌癥是肝細胞癌。
24.診斷肝細胞癌的診斷劑，包括與權利要求1的DNA或者權利要求5的蛋白結合的化合物。
全文摘要
本申請?zhí)峁┝诵碌娜祟惢騔NFN3A1，它的表達在大多數HCC中與相應的非癌肝組織相比顯著升高。該基因編碼的蛋白具有鋅指結構域以及SET結構域，并發(fā)現與RNA螺旋酶和RNA聚合酶形成調節(jié)復合體。
文檔編號C07K16/18GK1891825SQ20061008038
公開日2007年1月10日 申請日期2002年9月25日 優(yōu)先權日2001年9月25日
發(fā)明者中村佑輔, 古川洋一 申請人:國立大學法人東京大學, 腫瘤療法科學股份有限公司