專利名稱：靜脈給藥銀杏內(nèi)酯b及提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是對(duì)藥物原料——銀杏內(nèi)酯B及提取方法的改進(jìn)，尤其涉及一種純度高，銀杏內(nèi)酯B含量≥97％，銀杏酸含量≤2pmm，白果內(nèi)酯未檢出(蒸發(fā)光散射檢測(cè))，可直接用于靜脈給藥的銀杏內(nèi)酯B及提取方法。

背景技術(shù)：
銀杏內(nèi)酯的藥用功能及價(jià)值，已被醫(yī)學(xué)界所認(rèn)可，隨著對(duì)銀杏內(nèi)酯的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)各內(nèi)酯藥效各不相同，其中銀杏內(nèi)酯B較其他內(nèi)酯成份，藥理活性最強(qiáng)，故倍受關(guān)注。
銀杏內(nèi)酯B的來源可分為人工栽培提取、化學(xué)合成和植物細(xì)胞培養(yǎng)。化學(xué)合成存在空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜、手性多變，合成非常煩鎖，工藝復(fù)雜、成本高等不足，目前仍局限于學(xué)術(shù)價(jià)值，尚無生產(chǎn)意義；植物細(xì)胞培養(yǎng)，由于技術(shù)難度大，生產(chǎn)成本高等原因，目前也無實(shí)際生產(chǎn)意義。目前藥用銀杏內(nèi)酯B，主要來自人工栽培銀杏葉提取。但由于銀杏內(nèi)酯B在銀杏葉中含量較低約為0.2％，在銀杏提取物(Ginkgo biloba Extract，GBE)中也只有1％～2％。并銀杏內(nèi)酯A、B、C、J等及銀杏酸、白果內(nèi)酯共同存在，且各單體結(jié)構(gòu)又極為相似，極性差異很小，單體分離純化較為困難。現(xiàn)有技術(shù)較多采用傳統(tǒng)色普或樹脂柱層析分離，不僅對(duì)設(shè)備要求較高，造成投資成本高，且銀杏內(nèi)酯B有效提取率不夠高，而且由于提取方法原因，含有一定量的有毒性的銀杏酸和白果內(nèi)酯，并分離純度不夠高，難以直接應(yīng)用于靜脈給藥。所以通常提取銀杏內(nèi)酯B難以直接用于對(duì)純度要求較高的靜脈給藥，只能作為口服用藥原料。而口服給藥其藥效功能發(fā)揮遠(yuǎn)不如靜脈給藥高，不能充分發(fā)揮銀杏內(nèi)酯B的藥效。因此，尋找有效的銀杏內(nèi)酯B提取及純化方法，使之可直接用于靜脈給藥，成為銀杏開發(fā)的重要任務(wù)。
中國專利01119824.9介紹了銀杏葉提取物系統(tǒng)分離方法，通過加入1-2％抗氧劑水煮提，過聚酰吸附柱，過大孔吸附樹脂，用乙酸乙酯萃取三次，得總內(nèi)酯；上硅膠柱分離，用氯仿-甲醇梯度洗脫，得白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯AB；白果內(nèi)酯重結(jié)晶得無色白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯AB經(jīng)反復(fù)重結(jié)晶得銀杏內(nèi)酯B。此法報(bào)導(dǎo)可分別得到的銀杏總黃酮含量＞50％，銀杏內(nèi)酯B含量＞98％，白果內(nèi)酯含量＞98.5％。但此法，不僅提取分離方法復(fù)雜，銀杏內(nèi)酯B收率也不高，只有0.015％，并且含有較高約5ppm左右銀杏酸。
中國專利00117758.3公開的從銀杏葉或銀杏葉浸膏提取銀杏內(nèi)酯A、B的方法，首先采用乙醇、或甲醇、或丙酮、或丁酮、或乙酸乙酯有機(jī)溶劑及氯化物鹽析劑浸取，對(duì)得到銀杏內(nèi)酯A和B的濃縮物，采用制備液相色譜對(duì)含有銀杏內(nèi)酯A和B的濃縮物進(jìn)行分離，得到銀杏內(nèi)酯A和銀杏內(nèi)酯B。用甲醇與水進(jìn)行重結(jié)晶，可得到單酯純度96左右。此法采用液相色譜分離，生產(chǎn)條件復(fù)雜，生產(chǎn)技術(shù)要求較高，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高，并且未對(duì)銀杏酸及白果內(nèi)酯作出定量指標(biāo)，沒有報(bào)導(dǎo)可直接用于靜脈給藥；其次，此法銀杏內(nèi)酯B收率較低，只有0.001％左右。
中國專利200310104958.7介紹的模擬移動(dòng)床色譜分離提純銀杏內(nèi)酯B方法，首先采用水煮法獲得總黃酮24％、總內(nèi)酯6％的銀杏浸膏；再按每克浸膏粉加入0.8-1.2L乙酸乙酯，在30-35℃下進(jìn)行液萃取，過濾，濾液減壓蒸干得銀杏內(nèi)酯粗提物；再經(jīng)模擬移動(dòng)床純化得混合物；最后，先用乙醇重結(jié)晶，冰箱冷凍放置，得銀杏總內(nèi)酯；再用甲醇重結(jié)晶，逐漸降溫至零下10-18℃，結(jié)晶兩次，得銀杏內(nèi)酯B。報(bào)導(dǎo)可得到純度為90-95％銀杏內(nèi)酯B，但未報(bào)導(dǎo)白果內(nèi)酯、銀杏酸含量，不僅純度仍然較低，而且制備復(fù)雜，未報(bào)導(dǎo)可以用于靜脈給藥。
中國專利200410061284.1公開的從銀杏葉中提取銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯的方法，包括A、在65-75℃用50-60％乙醇分別提取2-3次，合并提取液，減壓濃縮，回收乙醇，加濃縮液1-2倍的水，沉淀、離心，取上清液上吸附柱，先用水沖洗，用75-80％乙醇溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮；B、將濃縮液加入1-2倍水和濃縮液30-40％的乙酸乙酯萃取2-3次，水相液濃縮、65-75℃真空干燥，為銀杏黃酮甙產(chǎn)品，萃取分離出的有機(jī)相濃縮、干燥、粉碎到90-100目，為銀杏內(nèi)酯；C、加85-95％乙醇，上酸性氧化鋁柱，收集流出液，濃縮至固形物25-30％時(shí)，停止加熱，結(jié)晶析出，過濾，再用95％乙醇溶解結(jié)晶，重結(jié)晶，分離出結(jié)晶銀杏內(nèi)酯A，溶液再結(jié)晶，為銀杏內(nèi)酯B，用結(jié)晶的20-40％的95％乙醇沖洗，抽濾，再用95％乙醇溶解，重結(jié)晶，銀杏內(nèi)酯B經(jīng)三次重結(jié)晶；D、將母液加入1-2倍水，在75-80℃蒸去乙醇，冷卻，析出結(jié)晶，結(jié)晶為銀杏內(nèi)酯C，分離出結(jié)晶，母液減壓蒸干，粉碎90-100目為黃色粉末白果內(nèi)酯，用結(jié)晶的20-40％無水乙醇沖洗白果內(nèi)酯，抽濾，用95％乙醇溶解，重結(jié)晶為白色的白果內(nèi)酯，再用95％乙醇溶液溶解，再重結(jié)晶，白果內(nèi)酯經(jīng)三次重結(jié)晶。此法雖然報(bào)導(dǎo)可以得到純度95％以上銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯，但仍未未公開銀杏酸白果內(nèi)酯含量，也沒有報(bào)導(dǎo)可直接用于靜脈給藥，并且提取方法復(fù)雜，分離采用逐一分離方法，工藝步驟多而復(fù)雜。
中國專利200510023164.7公開采用高速逆流色普法(HSCCC)制備高純度銀杏內(nèi)酯的制備方法，雖然能獲得純度高達(dá)99％的各種高純度酯單體，但采用三個(gè)體系，二次分離過程的逐一分離方法，工藝十分復(fù)雜，并需借助色普儀，難以在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。
中國專利200510041266.1公開的銀杏內(nèi)酯提取和純化工藝，按藥材重量加數(shù)倍量的乙醇或甲醇提取，提取液回收醇后用脫脂溶劑除雜，萃取，再除雜，得粗制品；再用乙醇重結(jié)晶，過濾，干燥得銀杏內(nèi)酯精制品，但得到不是銀杏內(nèi)酯B，而是總量92％，銀杏內(nèi)酯B40％以上、銀杏酚酸小于百萬分之二的混合內(nèi)酯。
上述眾多方法，均存在一定不足，不是未單獨(dú)分離銀杏內(nèi)酯B，就是不能得到純度高、銀杏酸含量低可直接用于靜脈給藥的銀杏內(nèi)酯B；能獲得純度較高的銀杏內(nèi)酯B，往往提取、分離工藝復(fù)雜，需采用多次分離方法，難以用于實(shí)際生產(chǎn)；以及銀杏內(nèi)酯B提取率不高；尤其是大部分工藝都未報(bào)導(dǎo)有毒銀杏酸含量，因此都未見可直接用于靜脈給藥報(bào)導(dǎo)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述已有技術(shù)的不足，提供一種純度高，銀杏內(nèi)酯B含量≥97％，銀杏酸≤2ppm，未檢出有白果內(nèi)酯的靜脈給藥銀杏內(nèi)酯B。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種獲得上述靜脈給藥銀杏內(nèi)酯B的提取方法。
本發(fā)明靜脈給藥銀杏內(nèi)酯B，其特征是銀杏內(nèi)酯B含量≥97％，銀杏酸≤2ppm，白果內(nèi)酯未檢出。
本發(fā)明靜脈給藥銀杏內(nèi)酯B提取分離，包括對(duì)銀杏葉浸提分離獲得銀杏內(nèi)酯，后經(jīng)甲醇重結(jié)晶提純，其特征在于所說浸提為用葉干重8～25倍量、濃度為5％-30％乙醇回流提取若干次，過濾分離；將濾液濃縮至原體積的0.02～0.2倍量，加入吸附劑在攪拌狀態(tài)下充分吸附，過濾，濾餅用3～10倍量乙醇回流提取若干次，合并提取液，濃縮至原體積的0.01～0.2倍量，靜置析晶，過濾得銀杏內(nèi)酯；銀杏內(nèi)酯用10～50倍量的甲醇進(jìn)行重結(jié)晶若干次，析晶溫度-10℃～-25℃，過濾結(jié)晶、干燥，得銀杏內(nèi)酯B。
本發(fā)明浸提，一種較好為乙醇水溶液為葉干重的10-20倍；所述乙醇濃度，更好為10％-25％。
本發(fā)明中 選擇采用濃度為5％-30％乙醇水溶液浸提，為實(shí)驗(yàn)所得，是本發(fā)明創(chuàng)新，此浸提液既能盡可能多的得到銀杏內(nèi)酯B(銀杏內(nèi)酯B≥45％)，同時(shí)提取液中其他銀杏內(nèi)酯相對(duì)低，提高銀杏內(nèi)酯B的得率，又極少帶入銀杏酸和白果內(nèi)酯(銀杏酸≤5ppm，白果內(nèi)酯未能檢出)，更有利于后續(xù)除去。經(jīng)分別對(duì)用10％乙醇提取及50％乙醇提取一次重結(jié)晶得到的銀杏內(nèi)酯進(jìn)行色譜檢測(cè)，圖譜1-4顯示表明采用本發(fā)明低濃度10％乙醇提取的銀杏內(nèi)酯，主要為A和B，銀杏內(nèi)酯C含量極少，且銀杏內(nèi)酯B含量(≥50％)高于銀杏內(nèi)酯A(43.3％)，不含白果內(nèi)酯；而采用50％乙醇提取銀杏內(nèi)酯，不僅銀杏內(nèi)酯B含量有所降低，為30.1％，銀杏內(nèi)酯A較高(54.2％)，并且銀杏內(nèi)酯C含量有所升高，還含有白果內(nèi)酯。表明低濃度乙醇對(duì)銀杏內(nèi)酯B具有更好的選擇性，采用低濃度乙醇提取銀杏內(nèi)酯B優(yōu)于高濃度醇提取。圖譜5-8顯示表明采用本發(fā)明低濃度10％乙醇提取的銀杏內(nèi)酯，銀杏酸含量較低(4.3ppm)；而采用50％乙醇提取的銀杏內(nèi)酯，銀杏酸相對(duì)較高(15.4ppm)，約高出4倍左右，即低濃度醇提銀杏酸含量大大低于高濃度醇提。圖譜表明，本發(fā)明獲得銀杏內(nèi)酯B提取方法采用低濃度乙醇提取，具有優(yōu)良的選擇性，明顯優(yōu)于高濃度醇，而且更優(yōu)于水提(內(nèi)酯水溶解度更低)。
濾液濃縮，與通常中藥如銀杏葉浸提相似，作用主要是對(duì)浸提液中水及乙醇減量。
吸附劑，主要作用是促使提取物一銀杏內(nèi)酯富集，以提高內(nèi)酯B含量及收得率；攪拌吸附，更有利于濾液中內(nèi)酯與吸附劑的充分接觸，提高吸附富集率；吸附劑可以采用符合中藥提取的常用吸附劑，如活性碳、硅藻土、氧化鋁等。
甲醇溶解低溫(-10℃～-25℃)冷凍重結(jié)晶，為本發(fā)明方法又一創(chuàng)新，試驗(yàn)表明采用甲醇溶解低溫冷凍重結(jié)晶，可以提高銀杏內(nèi)酯B的純度，減少其他雜質(zhì)含量，經(jīng)此過程可以獲得銀杏內(nèi)酯B含量≥97％、銀杏酸≤2ppm、未檢出白果內(nèi)酯的高純銀杏內(nèi)酯B。圖譜9-13顯示表明甲醇-15℃冷凍結(jié)晶，所得銀杏內(nèi)酯B含量高達(dá)98.5％，銀杏酸未檢出；而甲醇0℃冷凍結(jié)晶，所得銀杏內(nèi)酯B含量僅94.6％。
回流提取及重結(jié)晶次數(shù)，從理論上講次數(shù)多，提取率及純度均會(huì)提高，試驗(yàn)表明，兼顧利率、純度及經(jīng)濟(jì)性，本發(fā)明工藝中重復(fù)2-4次就能獲得較理想結(jié)果，再增加次數(shù)提高效果并不明顯，因此本發(fā)明兼顧經(jīng)濟(jì)性和提取率及純度，認(rèn)為2-4次較為經(jīng)濟(jì)實(shí)用。
本發(fā)明方法中所用乙醇、甲醇，如未指明濃度，均指市售工業(yè)級(jí)，例如濃度為95％及以上。
本發(fā)明從銀杏葉中提取銀杏內(nèi)酯B方法，所得銀杏內(nèi)酯B純度高，含量≥97％，白果內(nèi)酯和銀杏酸含量極低，銀杏酸≤2ppm，白果內(nèi)酯未檢出(蒸發(fā)光散射檢測(cè))，因而可以直接作為靜脈注射或靜脈滴注原料藥，是本發(fā)明銀杏內(nèi)酯B與其他方法所得銀杏內(nèi)酯B的一大區(qū)別。采用濃度為5％-30％乙醇水溶液浸提，不僅提取工藝簡單，適用于工業(yè)生產(chǎn)，而且銀杏內(nèi)酯B含量高，銀杏內(nèi)酯B≥45％，還能降低提取銀杏酯中其他不需要雜質(zhì)的含量，例如銀杏酸≤5ppm，白果內(nèi)酯未能檢出，其他銀杏內(nèi)酯較少，有利于獲得純度較高的銀杏內(nèi)酯B；甲醇-10℃～-25℃低溫重結(jié)晶純化，選擇、分離純化效果好，方法簡單，實(shí)用性強(qiáng)，不僅可以獲得較高純度的銀杏內(nèi)酯B，而且此過程又能同時(shí)分離去除銀杏酸及其他不需要的雜質(zhì)，單一選擇性強(qiáng)，大大提高了所得銀杏內(nèi)酯B的純度、安全性及有效性。本發(fā)明方法簡單、可靠，經(jīng)濟(jì)性好，銀杏內(nèi)酯B利率高，可達(dá)0.04％左右，成本低，特別適合于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，且無污染，對(duì)設(shè)備要求低，提取、分離成本低。
本發(fā)明所得銀杏內(nèi)酯B 長期毒性試驗(yàn)(見附錄)，按公斤體重計(jì)算分別相當(dāng)于人臨床最大劑量50倍(犬)和75倍(大鼠)時(shí)仍未出現(xiàn)中毒癥狀，仍然是安全的。
急性毒性試驗(yàn)(見附錄)，鼠靜脈注射相當(dāng)于臨床用藥劑量的1075倍，未出現(xiàn)任何明顯的中毒癥狀，無自主活動(dòng)和其他精神、神經(jīng)系統(tǒng)異常，也無動(dòng)物死亡。尸體解剖巨檢未發(fā)現(xiàn)組織器官異常，給藥組與對(duì)照組比較，體重增加無明顯差異。
致突變?cè)囼?yàn)(見附錄)，三項(xiàng)致突變?cè)囼?yàn)結(jié)果表明在本試驗(yàn)條件和劑量(濃度)范圍，注射用銀杏內(nèi)酯無潛在致突變力。
表明本發(fā)明銀杏內(nèi)酯B直接用于靜脈給藥，是安全的；并且藥效學(xué)試驗(yàn)表明對(duì)治療心腦血管疾病具有獨(dú)特療效。
以下結(jié)合幾個(gè)具體實(shí)施例的描述，結(jié)合藥效學(xué)及毒性試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步說明本發(fā)明，下述實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。



圖1為銀杏內(nèi)酯A、B混合對(duì)照溶液(進(jìn)樣5μl)標(biāo)準(zhǔn)圖譜。
圖2為銀杏內(nèi)酯A、B混合對(duì)照溶液(進(jìn)樣10μl)標(biāo)準(zhǔn)圖譜。
圖3為10％乙醇提取銀杏內(nèi)酯色譜圖。
圖4為50％乙醇提取銀杏內(nèi)酯色譜圖。
圖5為總銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。
圖6為總銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖(C130定位)。
圖7為10％乙醇提取總銀杏酸圖譜。
圖8為50％乙醇提取總銀杏酸圖譜。
圖9為銀杏內(nèi)酯B對(duì)照溶液(進(jìn)樣5μl)標(biāo)準(zhǔn)圖譜。
圖10為銀杏內(nèi)酯B對(duì)照溶液(進(jìn)樣10μl)標(biāo)準(zhǔn)圖譜。
圖11為冷凍重結(jié)晶(-15℃)銀杏內(nèi)酯B圖譜。
圖12為重結(jié)晶(0℃)銀杏內(nèi)酯B圖譜。
圖13為冷凍重結(jié)晶(-15℃)總銀杏酸圖譜。
圖14為銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理對(duì)TTC染色后各組腦組織梗死染色腦片。
圖15為銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理對(duì)腦皮層和海馬CA1區(qū)組織病理染色圖。
具體實(shí)施方法 實(shí)施例1取干銀杏葉10kg，加入150kg的30％乙醇溶液回流提取二次，每次2小時(shí)，提取液砂芯過濾；合并濾液，濾液回收乙醇，濃縮至約25kg，濃縮液加入適量活性碳吸附24小時(shí)，并不斷攪拌；過濾，濾餅用10kg95％乙醇分次回流提取3次，合并乙醇提取液，回收乙醇濃縮至約1Kg，靜置析晶，濾過得粗品10.5g；再用100g95％甲醇重結(jié)晶3次，重結(jié)晶溫度-12℃，過濾，干燥，得銀杏內(nèi)酯B3.6克。樣品檢測(cè)銀杏酸小于2PPM，白果內(nèi)酯未檢出，銀杏內(nèi)酯B純度97.8％。
實(shí)施例2取干銀杏葉10kg，加入150kg的10％乙醇溶液回流提取二次，每次2小時(shí)，提取液砂芯過濾；合并提濾液，濾液回收乙醇濃縮至約24kg，濃縮液加入適量活性碳吸附32小時(shí)，并不斷攪拌；過濾，濾餅用20Kg95％乙醇分次回流提取3次，合并乙醇提取液，回收乙醇濃縮至約1.5kg，靜置析晶，濾過得粗品13.4g；再用粗品300g95％甲醇重結(jié)晶3次，重結(jié)晶溫度-15℃，過濾，干燥，得銀杏內(nèi)酯B4.2克。樣品檢測(cè)銀杏酸小于2PPM，白果內(nèi)酯未檢出，銀杏內(nèi)酯B純度98.5％。
實(shí)施例3取干銀杏葉10kg，加入150kg的5％乙醇溶液回流提取二次，每次2小時(shí)，提取液砂芯過濾；合并提取液，濾液回收乙醇濃縮至約30kg倍量，濃縮液加入適量活性炭吸附48小時(shí)，并不斷攪拌；過濾，濾餅用30kg95％乙醇分次回流提取3次，合并乙醇提取液，回收乙醇濃縮至約2.0kg倍量，靜置析晶，濾過得粗品11.3g；再用450g95％甲醇重結(jié)晶3次，重結(jié)晶溫度-25℃，過濾，干燥，銀杏內(nèi)酯B3.8克。樣品檢測(cè)銀杏酸小于2PPM，白果內(nèi)酯未檢出，銀杏內(nèi)酯B純度98.4％。
色譜檢測(cè)說明 銀杏內(nèi)酯色譜測(cè)定，色譜儀日本島津公司LC-10ATVP泵，美國奧泰公司ELSD800檢測(cè)器，色譜柱Hypersil ODS 5μm大連依利特，流動(dòng)相水∶四氫呋南∶正丙醇(690∶300∶10)，流速1.0ml/min，積分方法面積外標(biāo)法。
銀杏總酸色譜測(cè)定，色譜儀美國Lab Alliance公司，色譜柱LichrospherC18 7C柱4.6*250mm 5μm漢邦科技公司，流動(dòng)相1％冰醋酸∶甲醇(10∶90)，波長310mm，柱溫40℃，流速1.0ml/min，積分方法面積外標(biāo)法。
附錄相關(guān)試驗(yàn)及結(jié)果 本發(fā)明靜脈給藥銀杏內(nèi)酯B藥效學(xué)試驗(yàn) 一、受試藥 1、名稱本發(fā)明提取銀杏內(nèi)酯B(銀杏內(nèi)酯B純度97.4％，銀杏酸小于2PPM，白果內(nèi)酯未檢出) 2、受試藥制備方法用氯化鈉注射液配制各種濃度的銀杏內(nèi)酯B液，放置冷藏室避光保存。
二、試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體重250～350g，10～12周齡。用標(biāo)準(zhǔn)顆粒全價(jià)飼料飼養(yǎng)，自由飲用清潔水。試驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)3天，室溫18～22℃，相對(duì)濕度60～80％。
三、試劑 1、紅四氮唑(2，3，5-Tripheny-2H-Tetrazolium chloride，TTC)，上海化學(xué)試劑公司，批號(hào)F990930，用1％磷酸鹽PBS溶液配制成2％工作液。
2、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒；超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒；蛋白定量試劑盒(TP)測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所。
3、尼莫地平(nimodipine，NIM)，批號(hào)20050218，江蘇濟(jì)川制藥有限公司。
4、水合氯醛(choral hydrate)，分析純，批號(hào)20040420，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，用雙蒸水配制成10％的溶液。
5、多聚甲醛(paraformaldehyde)，分析純，批號(hào)031119，上海凌峰化學(xué)試劑公司。
四、實(shí)驗(yàn)操作 1、動(dòng)物分組 根據(jù)隨機(jī)、雙盲、對(duì)照和平行的原則，將大鼠分成如下組 1、偽手術(shù)組； 2、缺血再灌注模型組(溶劑對(duì)照)； 3、尼莫地平為陽性藥對(duì)照藥，5mg.kg-1； 4、銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理組銀杏內(nèi)酯B10mg.kg-1，20mg.kg-1，40mg.kg-1。
2、實(shí)驗(yàn)程序 大鼠在水合氯醛(300mg/kg，ip)麻醉下，切開頸部皮膚，分離頸外淺靜脈，偽手術(shù)組和溶劑對(duì)照組靜脈給予生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組在缺血復(fù)灌前1小時(shí)股靜脈給予銀杏內(nèi)酯B10～40mg/kg，給藥體積1ml.kg-1。
3、大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型 栓塞線制備將直徑2.6mm的尼龍線一端仔細(xì)打磨光滑，分別在距頂端18mm、20mm、22mm處做標(biāo)志。
采用改良Koizumi法制作大腦中動(dòng)脈阻斷(MACO)模型，手術(shù)過程中監(jiān)測(cè)肛溫，使之保持在37±0.5℃。大鼠用水合氯醛麻醉(300mg/kg，ip)，頸部正中切口，暴露氣管和右頸總動(dòng)脈，在頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈分支點(diǎn)，從近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈，從分支處分離結(jié)扎頸外動(dòng)脈，距分支處2mm在頸總動(dòng)脈上剪一小切口，由切口處向頸內(nèi)動(dòng)脈放置栓塞線約20mm或遇到阻力后停止?？p合頸部皮膚切口。將未進(jìn)入血管的栓塞線留置在頸部切口外。缺血2h后將栓塞線向外拔出約10mm，使血流再通22h。偽手術(shù)組大鼠除頸內(nèi)動(dòng)脈不插栓線外，其它同缺血再灌注模型組。模型組剔除死亡或無神經(jīng)功能缺失行為的大鼠。
4、神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分 大鼠缺血復(fù)灌后，除死亡鼠外，絕大多數(shù)鼠已處于清醒狀態(tài)。按Longa的5分法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下0分無神經(jīng)缺損癥狀；1分左前肢不能完全伸直；2分向左旋轉(zhuǎn)；3分向左側(cè)傾倒；4分不能行走或昏迷。
5、梗死區(qū)范圍測(cè)定 再灌注末神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分后，將大鼠斷頭處死，迅速取腦，將腦置于-20℃環(huán)境下(冰箱)保存10min后。將全腦從前向后連續(xù)切厚度約2mm的冠狀腦片，每腦切5片。將腦片立即放入2％TTC溶液。由于TTC可使正常腦組織呈紅色，受損傷腦組織呈白色。腦片在37℃密閉不透光環(huán)境下保持15min，后將腦片置于10％甲醛液避光保存，7天取出腦片拍照。根據(jù)顯色將梗死區(qū)腦區(qū)和正常腦組織分離，分別稱重，計(jì)算每鼠腦梗死百分比(梗死區(qū)腦組織占全腦重量的百分比)比較給藥組(銀杏內(nèi)酯B和尼莫地平)與模型對(duì)照組值間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
6、腦組織SOD和MDA測(cè)定 同前法制備大鼠腦局灶缺血復(fù)灌損傷模型，同前分組和給藥，復(fù)灌結(jié)束后將大鼠斷頭處死，迅速取腦，制作10％腦組織勻漿。按試劑盒說明書用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定MDA含量，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD含量，雙縮脲法測(cè)定勻漿中的蛋白濃度。
7、腦病理組織學(xué)檢查 同前法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型。同前分組，每組SD大鼠3只，再灌注末迅速打開大鼠胸腔暴露心臟，將灌流針插入大鼠心尖部，向上到達(dá)大鼠升主動(dòng)脈。用剪刀在右心房處剪一小口。灌注開始后先灌冷生理鹽水約200ml左右，相繼灌4％的多聚甲醛150～200ml。灌注結(jié)束后將腦置于4％的多聚甲醛溶液4℃下保存。取各組大鼠視交叉至漏斗柄冠狀切面的腦組織，常規(guī)石蠟包埋，做連續(xù)切片，切片厚度為5μm。取切片3和7片，常規(guī)HE染色，觀察藥物對(duì)缺血復(fù)灌引起皮層和海馬(主要是CA1區(qū))病理損傷的影響。
8、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用

表示，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理對(duì)MACO大鼠行為的影響 結(jié)果表明銀杏內(nèi)酯B10mg/kg，20mg/kg和40mg/kg，iv預(yù)處理劑量依賴地改善大鼠MACO后神經(jīng)行為學(xué)功能，但僅銀杏內(nèi)酯B40mg/kg組值與溶劑對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)，10和20mg/kg組雖有改善趨勢(shì)，但與溶劑對(duì)照組值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。尼莫地平5mg/kg，iv預(yù)處理也有減少M(fèi)ACO引起的腦功能損傷(p＜0.05)。
表1銀杏內(nèi)酯B對(duì)大鼠腦局灶性缺血再灌注損傷神經(jīng)功能缺失評(píng)分影響。

注*為與溶劑對(duì)照組比較P＜0.05，
2、銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理對(duì)大鼠腦梗死體積的影響 銀杏內(nèi)酯B10～40mg/kg劑量依賴地減小大鼠局灶性腦缺血2h再灌注22h后的腦梗死體積，其中20mg/kg和40mg/kg組值與模型對(duì)照組值比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，銀杏內(nèi)酯B10mg似有減小腦梗死體積的作用，但與溶劑對(duì)照組比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖14和表2)。
圖14 TTC染色腦片說明梗死區(qū)為白色，非梗死區(qū)為紅色a偽手術(shù)組；b溶劑對(duì)照組；c銀杏內(nèi)酯B10mg/kg組；d銀杏內(nèi)酯B20mg/kg組；e銀杏內(nèi)酯B40mg/kg組；f尼莫地平組。
表2銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理對(duì)大鼠腦中動(dòng)脈缺血復(fù)灌損傷引起腦梗死區(qū)重量(g)影響 Expressed as

；**p＜0.01 compared with vehicle control 3、銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理對(duì)腦MDA含量和SOD活力的影響 銀杏內(nèi)酯B20mg/kg組和40mg/kg組可以增加大鼠局灶性腦缺血2h再灌注22h后的腦組織的SOD活性(P＜0.05)，減少M(fèi)DA含量(P＜0.05)，且有劑量依賴關(guān)系(表3)。
表3銀杏內(nèi)酯B對(duì)大鼠腦局灶性缺血再灌注損傷后腦組織MDA和SOD的影響
注*為與溶劑對(duì)照組比較P＜0.05；#為與偽手術(shù)組比較P＜0.05，
4、銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理大腦皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理學(xué)改變的影響 組織病理學(xué)結(jié)果表明偽手術(shù)組大鼠皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊，層次清楚，無細(xì)胞壞死，無炎性細(xì)胞浸潤；模型對(duì)照組該腦區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，排列紊亂，大量壞死細(xì)胞，神經(jīng)元胞體腫脹，核深染、固縮、碎裂或溶解消失，炎性細(xì)胞(主要為中性粒細(xì)胞)浸潤明顯，細(xì)胞間質(zhì)稀疏；銀杏內(nèi)酯B10mg/kg組與溶劑對(duì)照組相似，有較多的壞死細(xì)胞，呈片狀或灶狀分布，細(xì)胞排列層次消失，組織水腫明顯；銀杏內(nèi)酯B20mg/kg和銀杏內(nèi)酯B40mg/kg以及尼莫地平組組病變輕微，可見點(diǎn)狀壞死，輕度水腫，神經(jīng)元數(shù)量多于溶劑對(duì)照組但少于偽手術(shù)組(見圖15)。由圖15各組腦組織CA1區(qū)和皮層HE染色顯示，銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理可以減輕腦組織缺血再灌注后病理損傷。
圖15說明大鼠皮層和海馬CA1區(qū)病理學(xué)觀察，HE染色，200倍視野a1偽手術(shù)組皮層；a2偽手術(shù)組海馬；b1溶劑對(duì)照組皮層；b2溶劑對(duì)照組海馬；c1銀杏內(nèi)酯B10mg組海馬；c2銀杏內(nèi)酯B10mg組皮層；d1銀杏內(nèi)酯B20mg組海馬；d2銀杏內(nèi)酯B20mg組皮層；e1銀杏內(nèi)酯B40mg組海馬；e2銀杏內(nèi)酯B40mg組皮層；f1尼莫地平組海馬；f2尼莫地平組皮層。
六、結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)證實(shí)靜脈給藥用銀杏內(nèi)酯B10-40mg/kg靜注劑量，依賴降低大鼠腦膜中動(dòng)脈缺血復(fù)灌引起的梗死體積，增加缺血區(qū)的SOD，降低MDA水平，減少缺血復(fù)灌引起的皮層和海馬CA1區(qū)損傷。表明靜脈給藥用銀杏內(nèi)酯B有抗大鼠局灶性腦缺血損傷作用，表明本品對(duì)治療心腦血管疾病具有獨(dú)特療效。
本發(fā)明靜脈給藥銀杏內(nèi)酯B長期毒性試驗(yàn) 一、研究目的 通過比格犬和大鼠靜脈注射銀杏內(nèi)酯B13周慢性毒性試驗(yàn)，觀察過量藥物可能引起的不良反應(yīng)，包括不良反應(yīng)的性質(zhì)、程度等；推測(cè)銀杏內(nèi)酯B重復(fù)靜脈給藥的臨床毒性靶器官或靶組織。
二、受試藥 1.本發(fā)明制取的銀杏內(nèi)酯B； 2.溶劑氯化鈉注射液 規(guī)格4.5g/500mL 批號(hào)0512196，生產(chǎn)單位揚(yáng)州中寶制藥有限公司； 3.受試藥制備方法 用氯化鈉注射液配制注射用銀杏內(nèi)酯B液，溶液放置在冷藏室避光保存。
三、試驗(yàn)動(dòng)物 犬6月齡Beagle犬12只，雌性體重5-6.5kg，雄性7-8.5kg，兩組(高劑量組和溶劑對(duì)照組)，每組雌雄各3只，共12只。由南京安立默科技有限公司提供。
大鼠6周齡SD大鼠4組，每組雌雄各10只，每籠同性別5只。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)雌鼠體重70-90g，雄鼠80-110g，由南京江寧青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(蘇)2002-0018。
四、給藥途徑靜脈注射(bolus)犬前臂靜脈，大鼠胃靜脈 五、給藥體積與給藥速度犬2.0mL/kg/min，大鼠1.0mL/kg/min 六、給藥期限13周 七、給藥劑量選擇 犬銀杏內(nèi)酯B100mg/kg；大鼠125mg/kg，50mg/kg，20mg/kg，用等體積生理鹽水做溶劑對(duì)照，每日一次，每周6天。
八、觀察指標(biāo) 1.一般狀況觀察 在給藥期間每日一次觀察犬和大鼠外觀體征、行為活動(dòng)、腺體分泌、呼吸、糞便形狀、攝食量、給藥局部反應(yīng)。體重每周一次。
2.血液學(xué)指標(biāo) 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞容積、平均紅細(xì)胞容積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類、血小板計(jì)數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、凝血酶原時(shí)間等。
3.血液生化學(xué)指標(biāo) 天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、尿素氮、肌酐、白蛋白、總蛋白、總膽紅素、血糖、總膽固醇、甘油三酯、鈉離子濃度、鉀離子濃度、氯離子濃度、肌酸磷酸激酶。
4.尿檢查(僅犬) 尿液外觀、比重、pH、尿糖、尿蛋白、尿膽紅素、尿膽原、酮體、潛血、白細(xì)胞。
5.系統(tǒng)尸解和組織病理學(xué)檢查 5.1系統(tǒng)尸體解剖 試驗(yàn)期間及時(shí)觀察癥狀，及時(shí)發(fā)現(xiàn)瀕死動(dòng)物，進(jìn)行病理學(xué)檢查。試驗(yàn)結(jié)束活殺所有存活犬，收集血標(biāo)本后，認(rèn)真仔細(xì)檢查器官，發(fā)現(xiàn)病理改變及時(shí)記錄，按指導(dǎo)原則要求測(cè)定臟器重量，并將應(yīng)檢查的標(biāo)本送病理教研室做病理學(xué)檢查。
5.2臟器系數(shù) 對(duì)心、腦、肝、腎、脾、腎上腺、胸腺、肺、睪丸、附睪、卵巢和子宮等臟器進(jìn)行稱重，并計(jì)算臟器系數(shù)。
5.3組織病理學(xué)檢查 檢查的臟器和組織包括心、肝、脾、肺、腎、腦、食管、胃、小腸、大腸、垂體、脊髓、骨髓、淋巴結(jié)、膀胱、睪丸、附睪、子宮、卵巢、胸腺、腎上腺、視神經(jīng)(犬)、甲狀腺、甲狀旁腺、唾液腺、膽囊(犬)、胰腺、氣管、主動(dòng)脈、前列腺、乳腺、坐骨神經(jīng)、眼(犬)及給藥局部組織等。
6.觀察指標(biāo)的時(shí)間和次數(shù) 臨床癥狀每日一次，及時(shí)發(fā)現(xiàn)記錄，體重每周一次，進(jìn)食量(大鼠)每周一次。
試驗(yàn)開始前和結(jié)束后進(jìn)行犬的血液學(xué)檢查，血液生化和尿常規(guī)檢查，大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束日活殺前采血進(jìn)行血液學(xué)、血液生化檢查。
試驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行尸體解剖和病理學(xué)檢查。
眼科檢查犬藥前和活殺前，檢查瞳孔大小，對(duì)光反射，眼瞼和結(jié)膜有無充血，潰瘍。
心電圖犬給藥前和給藥結(jié)束后各進(jìn)行一次。
九、結(jié)果 (一)犬 1)臨床癥狀 犬銀杏內(nèi)酯B組犬給藥后，與對(duì)照組比，一般情況良好，無行為異常，未見呼吸頻率和幅度改變，體重增加與對(duì)照組無明顯差異，糞便黃成形。給藥局部無紅腫、潰爛和硬結(jié)等局部血管刺激癥狀。
2)死亡 對(duì)照組與給藥組犬和大鼠在試驗(yàn)13周內(nèi)均未出現(xiàn)死亡 3)體重 犬未見與給藥有關(guān)改變，0～13周體重變化詳見表4 4)食物消耗 犬由動(dòng)物中心統(tǒng)一飼養(yǎng)，每日早晚各一次供食和水，而給藥在早上給食前進(jìn)行，每日檢查未發(fā)現(xiàn)有剩余食物。
5)眼科檢查 觀察期間未見瞳孔、結(jié)膜和鞏膜與給藥有關(guān)的變化。
6)ECG；未見與給藥有關(guān)的變化(心率和心電圖指標(biāo))，給藥前和給藥后犬心電圖，給藥組與對(duì)照組比較，P波，PR間期，QRS波，T波，ST段均未發(fā)現(xiàn)異常，均未出現(xiàn)心律失常。
表4犬靜脈注射銀杏內(nèi)酯B100mg/kg/d，13周體重變化
7)血液學(xué) 溶劑對(duì)照組和銀杏內(nèi)酯B組犬主要血液學(xué)指標(biāo)變化，見表5-1.表5-2 與對(duì)照組比較，各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)未出現(xiàn)與給藥有關(guān)的異常，血液學(xué)指標(biāo)中對(duì)照組雌雄各有2犬的白細(xì)胞計(jì)數(shù)低于4×109/L，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異，其余血液學(xué)指標(biāo)給藥組與溶劑對(duì)照組比較均無明顯差異。
表5-1犬靜脈注射銀杏內(nèi)酯B100mg/kg.13周對(duì)血液學(xué)指標(biāo)影響(藥前基礎(chǔ)值)
表5-2犬銀杏內(nèi)酯B100mg/kg.iv，13周后主要血液學(xué)指標(biāo)
8)臨床化學(xué) 給藥前對(duì)照組與給藥組各項(xiàng)血液生化指標(biāo)，無明顯差異。靜脈注射銀杏內(nèi)酯B雌雄犬藥后血清總蛋白、白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酰氨基轉(zhuǎn)肽酶似有增加，但與溶劑對(duì)照組值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他變化輕微和零星，不認(rèn)為有意義。見表6-1，6-2。
9)尿檢查 未見與給藥有關(guān)的變化 10)器官重量 銀杏內(nèi)酯B組雌犬心、肝、腎、脾臟器重量和臟器系數(shù)稍高于對(duì)照組值(P＜0.05)。雄犬臟器重量與臟器系數(shù)與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表7 表6-1犬銀杏內(nèi)酯B100mg/kg，靜脈注射13周對(duì)血液生化指標(biāo)的影響---藥前血液生化基礎(chǔ)值
表6--2犬銀杏內(nèi)酯B100m/kg靜脈注射13周后對(duì)血液生化指標(biāo)的影響
*與對(duì)照比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異 11)巨檢 未見與給藥有關(guān)的變化，但某些器官的臟器重量和系數(shù)銀杏內(nèi)酯B組與對(duì)照組比較差異有顯著性意義。
12)鏡檢 未見與給藥有關(guān)異常，詳見病理報(bào)告。
13)體溫 詳見表8 14)注射部位 肉眼和顯微鏡下檢查未見明顯血管刺激癥狀。
表7-1雌性犬靜脈注射銀杏內(nèi)酯B100mg/kg 13周對(duì)臟器重量及臟器系數(shù)的影響
*P＜0.05與溶劑對(duì)照組比較 表7--2雄性犬靜脈注射銀杏內(nèi)酯B100mg/kg對(duì)臟器重量及臟器系數(shù)的影響
(二)大鼠13周長期靜脈注射銀杏內(nèi)酯毒理學(xué)研究結(jié)果 1.一般情況大鼠靜注銀杏內(nèi)酯B后，三個(gè)劑量組(20，50和125mg/kg)與對(duì)照組比較，未見精神和行為異常，進(jìn)食量與體重變化與對(duì)照鼠比較，無明顯差異。
2.死亡 本試驗(yàn)觀察期間所有大鼠包括溶劑對(duì)照組和低、中和高劑量組雌雄大鼠均存活到觀察期結(jié)束。
3.體重 雌雄大鼠連續(xù)靜注銀杏內(nèi)酯B前、后每周體重變化和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示銀杏內(nèi)酯B靜注不影響大鼠體重增加。見表9 表8犬靜脈注射銀杏內(nèi)酯B對(duì)犬體溫的影響
表9-1雄性大鼠銀杏內(nèi)酯B三個(gè)月靜脈注射體重變化
4.血液學(xué)檢查 結(jié)果表明雌雄大鼠銀杏內(nèi)酯B125mg/kg，iv連續(xù)13周對(duì)各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)，無明顯影響，給藥組與溶劑對(duì)照組間各對(duì)應(yīng)值比較，差異無顯著性意義，即未發(fā)現(xiàn)與給藥有關(guān)的改變。見表10 表9-2雌性大鼠銀杏內(nèi)酯B三個(gè)月靜脈注射體重變化
表10雌雄SD大鼠靜注銀杏內(nèi)酯B125mg/kg，13周對(duì)血液學(xué)指標(biāo)的影響
5.對(duì)凝血的影響 雌雄大鼠銀杏內(nèi)酯B125mg/kg，iv連續(xù)13周對(duì)凝血指標(biāo)(出凝血時(shí)間和前凝血酶原時(shí)間)，無與給藥有關(guān)的明顯影響， 6.血液生化指標(biāo)的影響 結(jié)果表明雌雄大鼠銀杏內(nèi)酯B125mg/kg，iv連續(xù)13周對(duì)各項(xiàng)血液生化指標(biāo)，無明顯影響，給藥組與溶劑對(duì)照組間各對(duì)應(yīng)值比較，差異無顯著性意義，即未發(fā)現(xiàn)與給藥有關(guān)的改變。見表11。
表11雌雄SD大鼠靜注銀杏內(nèi)酯B125mg/kg，3個(gè)月對(duì)血液生化指標(biāo)的影響
7.器官重量 結(jié)果表明雌雄大鼠銀杏內(nèi)酯B125mg/kg，iv連續(xù)13周給藥對(duì)臟器重量無明顯的與給藥有關(guān)影響，給藥組與溶劑對(duì)照組間各對(duì)應(yīng)值比較，差異無顯著性意義，即未發(fā)現(xiàn)與給藥有關(guān)的改變。見表12 表12大鼠長期銀杏內(nèi)酯B125mg/kg靜脈注射對(duì)臟器重量的影響

8.大鼠長期銀杏內(nèi)酯B125mg/kg靜脈注射對(duì)臟器系數(shù)的影響 結(jié)果表明雌雄大鼠銀杏內(nèi)酯B125mg/kg，iv連續(xù)3個(gè)月對(duì)臟器系數(shù)無明顯影響，給藥組與溶劑對(duì)照組間各對(duì)應(yīng)值比較，差異無顯著性意義，即未發(fā)現(xiàn)與給藥有關(guān)的改變。見表13 9.病理學(xué)檢查 銀杏內(nèi)酯B125mg/kg靜注13周后雌雄大鼠病理學(xué)檢查結(jié)果表明未發(fā)現(xiàn)與給藥有關(guān)的病理學(xué)改變。
10.注射部位肉眼檢查犬注射部位，未發(fā)現(xiàn)給藥血管出現(xiàn)靜脈炎樣的改變。
表13大鼠長期銀杏內(nèi)酯B125mg/kg靜脈注射對(duì)臟器系數(shù)的影響
十、結(jié)果評(píng)價(jià) 本試驗(yàn)結(jié)果表明比格犬靜脈注射銀杏內(nèi)酯B100mg/kg，大鼠銀杏內(nèi)酯B20mg/kg，50mg/kg和125mg/kg，連續(xù)13周靜脈注射，給藥期間犬和大鼠均未出現(xiàn)與給藥有關(guān)的生長、行為、精神、體重、食物消耗、血液學(xué)和血凝、血液生化、尿常規(guī)檢查等異常，病理學(xué)肉眼和顯微鏡觀察也未發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟結(jié)構(gòu)組織形態(tài)等方面的改變，不能確定毒性靶器官。臟器系數(shù)等與對(duì)照組比較各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，由于藥物溶解性和給藥體積的限制，本試驗(yàn)按公斤體重計(jì)算該劑量分別相當(dāng)于人臨床最大劑量50倍(犬)和75倍(大鼠)時(shí)仍未出現(xiàn)中毒癥狀，仍然是安全的。
本發(fā)明靜脈給藥銀杏內(nèi)酯B急性毒性試驗(yàn) 一、試驗(yàn)?zāi)康? 按擬臨床給藥途徑(灌胃)進(jìn)行急性毒性反應(yīng)的觀察，以對(duì)銀杏內(nèi)酯B安全性進(jìn)行臨床前評(píng)價(jià)。
二、受試物 (1)名稱本發(fā)明制取的銀杏內(nèi)酯B，室溫保存； (2)溶媒和/或輔料吐溫-80(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，無水乙醇(上海試劑一廠，批號(hào)050701)。
三、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年小鼠SPF級(jí)，體重18～22g；雌雄各半，每籠5只。南京軍區(qū)總院提供，合格證號(hào)SCXK2003-0004 四、試驗(yàn)方法 4.1預(yù)試驗(yàn) 預(yù)試驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)本預(yù)試驗(yàn)采取霍恩氏Horn法，劑量從10g/kg開始，4.64g/kg，2.15g/kg和1.0g/kg，每組雌雄各2只。觀察24小時(shí)內(nèi)動(dòng)物死亡數(shù)。
預(yù)實(shí)驗(yàn)擬用無水乙醇溶解，吐溫-80助溶銀杏內(nèi)酯B后，再用生理鹽水稀釋。小鼠靜脈給藥和小鼠灌胃體積分別為10ml/kg和20mL/kg。由于受試藥溶解限制，本試驗(yàn)用11.75％銀杏內(nèi)酯B溶液。靜脈和灌胃給藥體積均為20mL，但給藥分兩次(上午8:00和下午4:00)，預(yù)試驗(yàn)給藥劑量分別為2.15g/kg/d，1.00g/kg/d和0.64g/kg/d。結(jié)果表明小鼠銀杏內(nèi)酯B給藥后7天內(nèi)受試藥組與賦形劑組均無一小鼠死亡。小鼠進(jìn)食、精神和神經(jīng)活動(dòng)，糞便均未見異常。由于溶解性和給藥體積限制，本試驗(yàn)擬用最大給藥劑量作為急性毒性試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。
4.2正式試驗(yàn) 4.2.1動(dòng)物來源和飼養(yǎng)條件同上，18-22g昆明小鼠40只，雌雄各半。
4.2.2劑量2150mg/kg(iv)，4300mg/kg(ig) 4.2.3給藥途徑 本受試物為注射劑，故試驗(yàn)采取靜脈注射(iv)和灌胃(ig)給藥。給藥時(shí)間上午8:00和下午4:00。經(jīng)口給藥時(shí)禁食16小時(shí)但不禁水。
4.2.4給藥容量 尾靜脈注射(bolus)10ml/kg(0.1ml/10g/次，2次/日)； 灌胃20mL/kg(0.2mL/10g/次，2次/日) 4.2.5觀察期限 14天，如果毒性反應(yīng)出現(xiàn)較慢，應(yīng)適當(dāng)延長觀察時(shí)間。
4.2.6觀察指標(biāo) 包括動(dòng)物體重變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物、死亡情況及中毒反應(yīng)(中毒反應(yīng)的癥狀、嚴(yán)重程度、起始時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、是否可逆)等。對(duì)瀕死及死亡動(dòng)物應(yīng)及時(shí)進(jìn)行大體解剖，其他動(dòng)物在觀察期結(jié)束后進(jìn)行大體解剖，當(dāng)發(fā)現(xiàn)器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時(shí)，則對(duì)改變的器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
4.2.7結(jié)果 在觀察期14天內(nèi)，小鼠靜脈注射銀杏內(nèi)酯B2150mg/kg和灌胃4300mg/kg均未出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)，給藥后動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)減少，但2小時(shí)后恢復(fù)正常，所有鼠存活到觀察期結(jié)束。體重增加受試藥組和溶劑對(duì)照組之間無明顯差異。觀察期結(jié)束后尸體解剖肉眼觀察未發(fā)現(xiàn)重要臟器出現(xiàn)異常改變。見表14 表14銀杏內(nèi)酯B靜脈2150mg/kg或灌胃4300mg/kg藥前和藥后體重變化 n＝20
五、結(jié)果分析 本試驗(yàn)結(jié)果表明小鼠銀杏內(nèi)酯B一次靜脈注射2.15g/kg(相當(dāng)于臨床用藥劑量的1075倍)和4.3g/kg灌胃后14天內(nèi)，未出現(xiàn)任何明顯的中毒癥狀，無自主活動(dòng)和其他精神、神經(jīng)系統(tǒng)異常，也無動(dòng)物死亡。觀察期結(jié)束后尸體解剖巨檢未發(fā)現(xiàn)組織器官異常，給藥組與對(duì)照組比較，體重增加無明顯差異。
本發(fā)明靜脈給藥銀杏內(nèi)酯B致突變?cè)囼?yàn) 一、試驗(yàn)?zāi)康? 評(píng)價(jià)“靜脈給藥銀杏內(nèi)酯B”的可能存在的遺傳毒性和潛在致癌作用的可能性，為臨床研究和安全用藥提供信息。
二、受試藥 本發(fā)明制取的銀杏內(nèi)酯B 三、試驗(yàn)內(nèi)容 3.1體外鼠傷寒沙門氏桿菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn) 3.2體內(nèi)哺乳動(dòng)物骨髓多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn) 3.3中國倉鼠肺細(xì)胞(CHL)染色體畸變?cè)囼?yàn) 四、組胺酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn) 4.1銀杏內(nèi)酯B組胺酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn))，結(jié)果表明在5個(gè)試驗(yàn)劑量組4個(gè)菌株(TA98，TA100，TA102，TA97)，無論是否S9活化系統(tǒng)存在，銀杏內(nèi)酯B的Ames試驗(yàn)均為陰性結(jié)果。
4.2溶劑DMSO 規(guī)格500mL/瓶 批號(hào)20021109(中國醫(yī)藥集團(tuán))氯化鈉注射液 規(guī)格4.5g∶500mL 生產(chǎn)單位揚(yáng)州中寶制藥有限公司 4.3受試藥制備用DMSO將銀杏內(nèi)酯B配制成0.5、1.5、5.0、15和50mg/ml共5個(gè)濃度，避光冷存。
4.4對(duì)照品 4.4.1陽性對(duì)照藥阿的平，對(duì)硝基喹啉，甲基甲烷磺酸酯，2-氨基芴，1，8-二羥基蒽醌。
4.4.2溶劑對(duì)照DMSO(色譜純)。
4.4.3空白對(duì)照不加受試物和溶劑。
4.5菌株 4.5.1試驗(yàn)菌株名稱組胺酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)，四株菌株為TA97、TA98、TA100、TA102。
4.5.2來源及保存美國加利福利亞大學(xué)生物化學(xué)系提供，液氮凍存。
4.5.3菌株鑒定正式試驗(yàn)前，進(jìn)行試驗(yàn)菌株基因型鑒定(組胺酸營養(yǎng)缺陷型鑒定、深度粗糙型鑒定、R因子鑒定及ΔuvrB鑒定)及自發(fā)回復(fù)數(shù)鑒定，試驗(yàn)用菌株生物學(xué)特性符合要求，測(cè)試用菌液濃度為1-2×109/ml。
4.6代謝活化系統(tǒng) 哺乳動(dòng)物肝微粒體酶(S9)活化系統(tǒng)上海市疾病預(yù)防控制中心提供，按Lowry方法測(cè)得蛋白質(zhì)含量為35mg/ml。液氮保存。
4.7劑量及選擇理由 劑量設(shè)置銀杏內(nèi)酯B能溶于DMSO，經(jīng)預(yù)試后，設(shè)劑量級(jí)5個(gè)，分別為0.05、0.15、0.5、1.5、5.0mg/皿。
4.8試驗(yàn)方法 操作步驟將鑒定合格的菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用標(biāo)準(zhǔn)平皿參入法，設(shè)0.05、0.15、0.5、1.5和5.0mg/皿等5個(gè)系列劑量組，每個(gè)劑量組4個(gè)菌株，試驗(yàn)分活化試驗(yàn)(+S9)和非活化試驗(yàn)(-S9)，同時(shí)設(shè)相應(yīng)的陽性和陰性對(duì)照組。各劑量組和對(duì)照組均做3塊平皿，48小時(shí)觀察結(jié)果。并重復(fù)一次。
4.9結(jié)果判定 4.9.1受試物所誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)增加，超過溶劑對(duì)照組的2倍，有劑量反應(yīng)關(guān)系； 4.9.2某測(cè)試點(diǎn)超過對(duì)照2倍，需呈現(xiàn)重復(fù)性，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
符合上述之一者，即可判為Ames試驗(yàn)陽性，否則為陰性。
4.10結(jié)果 銀杏內(nèi)酯B自0.05、0.15、0.5、1.5、5.0mg/皿，不論加入S9或不加入S9對(duì)TA97、TA98、TA100及TA102 4個(gè)菌株的回復(fù)突變菌落數(shù)，均未超過自發(fā)回復(fù)突變數(shù)的2倍；各陽性對(duì)照化合物組，均呈超過2倍的陽性反應(yīng)。重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果一致。提示銀杏內(nèi)酯B對(duì)組胺酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)無誘發(fā)回變作用。見表15。
表15銀杏內(nèi)酯B Ames試驗(yàn)結(jié)果(6皿均值±標(biāo)準(zhǔn)差)
表中結(jié)果為兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均值。
*陽性物不加用S9TA97 500μg/皿阿的平；TA98 200μg/皿對(duì)硝基喹啉；TA100及TA1021μl/皿甲基甲烷磺酸酯；加用S9TA97、TA98、TA100 10μg/皿2-氨基芴，TA102 500μg/皿1，8-二羥基蒽醌。
各實(shí)驗(yàn)組4個(gè)菌株加與不加S9活化系統(tǒng)回變菌落均數(shù)均為超過陰性對(duì)照回變菌落數(shù)的2倍，故可認(rèn)為銀杏內(nèi)酯B的Ames實(shí)驗(yàn)為陰性結(jié)果。
五、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和中國倉鼠肺細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn) 5.1.受試藥配制因銀杏內(nèi)酯B難溶于水，易溶于DMSO。
精確稱量銀杏內(nèi)酯B以DMSO溶解供細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)用。
用0.5％羧甲基纖維素(CM纖維素鈉鹽300-800)化學(xué)純，批號(hào)F20040419，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)制成所需濃度的混懸液供小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)用。
5.2.對(duì)照品 5.2.1.陽性對(duì)照品 5.2.1.1微核試驗(yàn)環(huán)磷酰胺。
5.2.1.2中國倉鼠肺細(xì)胞(CHL)染色體畸變?cè)囼?yàn)絲裂霉素C，環(huán)磷酰胺。
5.2.1.3空白對(duì)照品DMSO。
5.3小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 5.3.1動(dòng)物 性成熟昆明種小鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)提供。生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2003-0003；動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(蘇)2002-0130。
5.3.2劑量及選擇理由 劑量設(shè)置劑量級(jí)3個(gè)分別為1.08、0.54、0.27g/Kg.bw 5.3.3給藥途徑 經(jīng)口灌胃。
5.3.4方法 5.3.4.1操作步驟 經(jīng)預(yù)試后確定采樣時(shí)間為給藥后30小時(shí)。選擇體重18-24克的昆明種小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。試驗(yàn)組分別以1/2、1/4和1/8LD50三個(gè)劑量經(jīng)口灌胃給藥，陰性對(duì)照用等體積的0.5％羧甲基纖維素，陽性對(duì)照用40mg/Kg.bw的環(huán)磷酰胺腹腔注射，全部動(dòng)物給藥兩次，于第二次給藥后6h后處死動(dòng)物。取胸骨常規(guī)制片，Giemsa染色，光學(xué)顯微鏡下每只動(dòng)物觀察1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算微核細(xì)胞的千分率。
5.3.4.2.結(jié)果判別標(biāo)準(zhǔn) a.受試物所誘發(fā)的微核率的增加，有劑量反應(yīng)關(guān)系； b.某測(cè)試點(diǎn)微核增加呈現(xiàn)重復(fù)性，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
符合上述之一者，即可判為微核試驗(yàn)陽性，否則為陰性。
5.4結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果。見表16 表16銀杏內(nèi)酯B小鼠經(jīng)口給藥骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果
*與陰性對(duì)照組比P＜0.001 由表16可見銀內(nèi)B高、中、低三個(gè)劑量組小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率與陰性對(duì)照組相比較均無顯著性差異(P＞0.05)，陽性對(duì)照組與陰性對(duì)照組比，則有明顯差異(P＜0.001)。
5.5結(jié)論 銀杏內(nèi)酯B在本實(shí)驗(yàn)條件下不能引起小鼠骨髓細(xì)胞微核率升高。提示銀杏內(nèi)酯B不引起小鼠體細(xì)胞發(fā)生突變。
六、CHL細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn) 6.1細(xì)胞 中國倉鼠肺細(xì)胞(CHL細(xì)胞)。
6.3劑量及選擇理由 劑量設(shè)置經(jīng)預(yù)試驗(yàn)在藥物的最大溶解度(10.00mg/ml)下，細(xì)胞存活率大于90％，所以設(shè)3個(gè)劑量級(jí)分別為10.0、5.0、2.5mg/ml。另設(shè)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照組。直接陽性為絲裂霉素C 0.2μg/mL培養(yǎng)液，間接陽性為環(huán)磷酰胺20μg/mL培養(yǎng)液，直接陰性為DMSO 0.1ml/L培養(yǎng)液，間接陰性為50ml肝微粒體酶/L培養(yǎng)液。
6.4方法 6.4.1.操作步驟 細(xì)胞置37℃培養(yǎng)液中培養(yǎng)3d，分別加入不同劑量的銀內(nèi)B作用48h，在最大溶解度(10.00mg/ml)下細(xì)胞存活率大于90％，故以10.00mg/ml為染色體畸變?cè)囼?yàn)的最高劑量。
正式試驗(yàn)時(shí)，在不加肝臟微粒體酶(S9)時(shí)，處理24h后收獲細(xì)胞。在加S99混合物時(shí)，藥物處理6h后，洗去S9混合物和藥物，再培養(yǎng)18h收獲細(xì)胞，在收獲細(xì)胞前2h加入秋水仙素，劑量為0.2μg/ml，按常規(guī)方法制備染色體，然后染色，鏡檢。重復(fù)上述試驗(yàn)，觀察結(jié)果是否一致。
每一劑量觀察100個(gè)中期分裂相細(xì)胞的染色體畸變數(shù)，記錄間隙(g)，斷裂(b)，交換(t)，環(huán)狀(r)，多倍體(p)5種類型畸變(其中g(shù)不計(jì)入總的畸變率)，以百分率表示。
6.5結(jié)果判別標(biāo)準(zhǔn) 畸變率 ＜5％ 陰性(-) 畸變率 ＞5％ 可疑(±) 畸變率 ＞10％ 陽性(+) 畸變率 ＞20％ 強(qiáng)陽性 (++) 某一測(cè)試點(diǎn)呈現(xiàn)可重復(fù)的并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加；符合上述一條即可判為陽性。
6.6結(jié)果 CHL細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果。見表17 表17銀杏內(nèi)酯B對(duì)CHL細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)的影響
**和陰性對(duì)照組比較P＜0.01 從表17可知銀杏內(nèi)酯B高、中、低三個(gè)劑量組，無論加與不加活化系統(tǒng)，CHL細(xì)胞染色體畸變率均＜5％。而陽性對(duì)照組加與不加活化系統(tǒng)，CHL細(xì)胞染色體畸變率則分別高達(dá)28％和29％、30％。顯示銀杏內(nèi)酯B不引起CHL細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)異常。
6.7結(jié)論 銀杏內(nèi)酯B鼠傷寒沙門氏桿菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果表明，無論是否存在S9代謝激活物都無致突變作用。注射用銀銀杏內(nèi)酯B，小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和中國倉鼠肺細(xì)胞(CHL)染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果表明在本試驗(yàn)條件下，注射用銀杏內(nèi)酯B不誘發(fā)小鼠骨髓細(xì)胞微核增加；也不誘發(fā)CHL細(xì)胞染色體出現(xiàn)畸變。三項(xiàng)致突變?cè)囼?yàn)的結(jié)果表明在本試驗(yàn)條件和劑量(濃度)范圍，注射用銀杏內(nèi)酯無潛在致突變力。
權(quán)利要求
1.靜脈給藥銀杏內(nèi)酯B，其特征是銀杏內(nèi)酯B含量≥97％，銀杏酸≤2ppm，白果內(nèi)酯未檢出。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述靜脈給藥銀杏內(nèi)酯B提取方法，包括對(duì)銀杏葉浸提分離獲得銀杏內(nèi)酯，后經(jīng)甲醇重結(jié)晶提純，其特征在于所說浸提為用葉干重8～25倍量、濃度為5％-30％乙醇回流提取若干次，過濾分離；將濾液濃縮至原體積的0.02～0.2倍量，加入吸附劑在攪拌狀態(tài)下充分吸附，過濾，濾餅用3～10倍量乙醇回流提取若干次，合并提取液，濃縮至原體積的0.01～0.2倍量，靜置析晶，過濾得銀杏內(nèi)酯；銀杏內(nèi)酯用10～50倍量的甲醇進(jìn)行重結(jié)晶若干次，析晶溫度-10℃～-25℃，過濾結(jié)晶、干燥，得銀杏內(nèi)酯B。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述靜脈給藥銀杏內(nèi)酯B提取方法，其特征在于所說乙醇水溶液為葉干重的10-20倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述靜脈給藥銀杏內(nèi)酯B提取方法，其特征在于所說所述乙醇濃度為10％-25％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種靜脈給藥銀杏內(nèi)酯B及提取方法，其特征是銀杏內(nèi)酯B含量≥97％，銀杏酸≤2ppm，白果內(nèi)酯未檢出，可以直接作為靜脈注射或靜脈滴注原料藥；提取采用葉干重8～25倍量、濃度為5％-30％乙醇水溶液回流提取若干次，過濾分離；將濾液濃縮至原體積的0.05～0.2倍量，加入吸附劑在攪拌狀態(tài)下充分吸附，過濾，濾餅用3～10倍量乙醇回流提取若干次，合并提取液，濃縮至原體積的0.01～0.2倍量，靜置析晶，過濾得銀杏內(nèi)酯；銀杏內(nèi)酯用10～50倍量的甲醇進(jìn)行重結(jié)晶若干次，析晶溫度-10℃～-25℃，過濾結(jié)晶、干燥，得銀杏內(nèi)酯B。較現(xiàn)有提取分離方法具有，工藝簡單，可靠，經(jīng)濟(jì)性好，特別適用于工業(yè)生產(chǎn)，對(duì)設(shè)備要求低，銀杏內(nèi)酯B得率高，達(dá)0.04％左右，純度高，且無污染，安全性好。
文檔編號(hào)C07D493/22GK101182325SQ20061009749
公開日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2006年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月13日
發(fā)明者張國清, 吳洪君 申請(qǐng)人:江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司