專利名稱：一種從人工種植南方紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種從人工種植南方紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法。
背景技術：
紫杉醇是Wani等人于1971年首次從短葉紅豆杉中分離得到的一種天然抗癌藥物，它具有促進微管雙聚體裝配成微管，使微管穩(wěn)定，從而阻礙細胞分裂，抑制腫瘤生長的作用。由于紫杉醇的作用機理獨特、療效顯著，因此已用于轉(zhuǎn)移性卵巢癌、乳腺癌等小細胞和非小細胞肺癌等的治療。對于紫杉醇的研究成為藥品行業(yè)研究的重點。
紫杉醇資源珍貴，價格居高難下，制備的收率成為制約紫杉醇成本的關鍵因素。在天然原料中紫杉醇的含量低，紫杉烷系列化合物共存，并含有大量植物臘、色素和樹膠等雜質(zhì)，因而，紫杉醇的分離難度極高。目前常用的工藝過程是將液—液萃取，色譜分離和重結晶等手段有機結合，并反復多次采用色譜手段。萃取和重結晶是紫杉醇回收率難以提高的制約因素，色譜過程中溶劑消耗大也使其加工成本居高難下。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡單方便、回收率高、成本低廉的從人工種植南方紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法，這種方法利用發(fā)酵方式來提取紫杉醇，有利于破壞植物細胞壁，有利于紫杉醇的浸出，使提取時間縮短，提取工藝簡化；濃縮液直接經(jīng)樹脂層析減少了溶劑損耗，縮短了工藝流程。
按照本發(fā)明提供的技術方案，從人工種植南方紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法包含下述步驟a、提取與濃縮粉碎后的紅豆杉全株按物料∶90％甲醇(重量比)＝1∶3～3.5的比例于溫度50～56℃下，利用超聲波提取50～55分鐘，得到濾液，再將濾液減壓濃縮，使?jié)饪s液的密度達到0.92～0.96kg/L，得濃縮液；b、一次層析上述濃縮液利用大孔吸附樹脂進行層析，按照樹脂∶濃縮液(重量比)＝1∶25～30的比例，采用甲醇水溶液為流動相，流動相洗脫時，層析柱內(nèi)流出液的流速為0.5～1.5柱床體積/小時，收集紫杉醇段；c、一次結晶將一次層析后收集的紫杉醇段濃縮蒸干，按8～9mL/g的比例溶解在甲醇中，水浴加熱到50～55℃，同時在攪拌的情況下加入水，控制甲醇和水的比例為1∶3～3.5，靜止冷卻48～54小時，過濾結晶，低溫烘干后得黃白色粉末，紫杉醇的含量達到50～60％；d、二次層析將一次結晶獲得的黃白色粉末上硅膠柱層析，按黃白色粉末量∶硅膠∶二氯甲烷＝1∶2～2.2∶2～2.5(重量比)的比例拌勻成混合物，40～50℃烘干，過篩，按拌好干燥的混合物與硅膠1∶4～5(重量比)的比例裝入層析柱，采用正己烷與乙酸乙酯體系為流動相進行洗脫，收集紫杉醇段；e、二次結晶將經(jīng)過二次層析后收集的紫杉醇段進行二次結晶，二次結晶的條件與一次結晶的條件相同，經(jīng)過二次結晶后，晶體中紫杉醇的純度達到99.5％。
在提取前，先進行物料準備選用人工種植的南方紅豆杉全株為原料，南方紅豆杉全株挖出后沖洗干凈，晾干，用粉碎機粉碎。在提取時，重復提取過程三次，再合并三次提取時獲得的所有濾液，然后進行濃縮，同時回收甲醇，剩下的濾渣回收溶劑。所述大孔吸附樹脂為DA201或D101或AB-8。在一次層析中，甲醇水溶液濃度范圍為70～100％，洗脫方式為梯度洗脫，共分為四個梯度70～74％、80～84％、90～94％及98～100％，其中收集90～94％段為紫杉醇段。在二次層析中，硅膠為200～300目；在用正己烷與乙酸乙酯體系為流動相進行洗脫時，先用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝7∶3洗脫；再用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7洗脫，并收集正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7的洗脫段為紫杉醇段，最后用純乙酸乙酯洗脫。
本發(fā)明從人工種植南方紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法的優(yōu)點為1、采用紅豆杉全株發(fā)酵的方式，能破壞植物細胞壁，有利于紫杉醇的浸出，使提取時間縮短，減少了由于提取時間過長造成的紫杉醇的損失。2、濃縮液直接經(jīng)大孔吸附樹脂層析，減少了溶劑損耗，縮短了工藝流程。大孔吸附樹脂具有較好的吸附色素的能力，并能除去提取液中的水溶性雜質(zhì)。3、避免了萃取法、沉淀法、堿洗法雜質(zhì)去除不徹底，需反復多次、操作煩瑣、溶劑損耗大等弊端；4、極大地提高了后續(xù)色譜分離能力、降低了其負荷和費用，工藝大為簡化、總收率高。
本發(fā)明為制備紫杉醇提供了一種簡單方便、回收率高、成本低廉的方法，發(fā)酵有利于破壞植物細胞壁，有利于紫杉醇的浸出，使提取時間縮短，提取工藝簡化；濃縮液直接經(jīng)樹脂層析減少了溶劑損耗，縮短了工藝流程。使用本方法制備的紫杉醇含量≥99.5％，紫杉醇總收率≥85％。
具體實施例方式
1、物料準備選用人工種植的南方紅豆杉全株為原料，南方紅豆杉全株挖出后沖洗干凈，晾干，用粉碎機粉碎。
2、提取與濃縮粉碎后的紅豆杉全株按物料∶90％甲醇(重量比)＝1∶3～3.5的比例于溫度50～56℃下，利用超聲波提取50～55分鐘；在提取時，重復提取過程三次，再合并三次提取時獲得的所有濾液，再將濾液減壓濃縮，使?jié)饪s液的密度達到0.92～0.96kg/L，同時回收甲醇，剩下的濾渣回收溶劑，得濃縮液；3、一次層析上述濃縮液利用大孔吸附樹脂進行層析，按照樹脂∶濃縮液(重量比)＝1∶25～30的比例，采用甲醇水溶液為流動相，流動相洗脫時，層析柱內(nèi)流出液的流速為0.5～1.5柱床體積/小時，收集紫杉醇段；所述大孔吸附樹脂為DA201或D101或AB-8；在一次層析中，甲醇水溶液濃度范圍為70～100％，洗脫方式為梯度洗脫，共分為四個梯度(指甲醇水溶液的濃度)70～74％、80～84％、90～94％及98～100％，其中收集90～94％段為紫杉醇段。
4、一次結晶將一次層析后收集的紫杉醇段濃縮蒸干，按8～9mL/g的比例溶解在甲醇中，水浴加熱到50～55℃，同時在攪拌的情況下加入水，控制甲醇和水的比例為1∶3～3.5，靜止冷卻48～54小時，過濾結晶，低溫烘干后得白色發(fā)黃的針狀粉末，紫杉醇的含量達到50～60％；5、二次層析將第一次獲得的粉末上硅膠柱層析，按粉末量∶硅膠∶二氯甲烷＝1∶2～2.2∶2～2.5(重量比)的比例拌勻成混合物，40～50℃烘干，過篩，按拌好干燥的混合物與硅膠1∶4～5(重量比)的比例裝入層析柱，采用正己烷∶乙酸乙酯體系為流動相，先用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝7∶3洗脫，再用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7洗脫，最后用純乙酸乙酯洗脫，收集正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7的洗脫段為紫杉醇段；在二次層析中所用的硅膠為200～300目；6、二次結晶第二次結晶的條件與第一次相同，經(jīng)過二次結晶，晶體中紫杉醇的純度達到99.5％。
下面描述具體的實施例。
實施例11、人工種植的南方紅豆杉全株鮮枝葉3kg，經(jīng)檢測紫杉醇含量為0.5/萬，全株鮮枝葉粉碎過篩，發(fā)酵(24～48h)，90％甲醇水溶液超聲波提取(50℃，9L×3次，每次50分鐘)，提取液混合后濃縮，得濃縮液(10L)。
2、DA201型大孔吸附樹脂380g，經(jīng)甲醇浸泡前處理48小時后使用，將濃縮液(10L)經(jīng)過大孔吸附樹脂吸附，收集母液。
3、待母液收集完后，用70％甲醇水溶液洗脫，收集10L，80％甲醇水溶液洗脫，收集10L，90％甲醇水溶液洗脫，收集10L，此為紫杉醇收集液，最后直接用100％甲醇洗脫完畢。將紫杉醇收集液減壓濃縮蒸干，得紫杉醇浸膏(2g)，含量為7.2％，回收率96％。
4、紫杉醇浸膏(2g)溶解在16mL甲醇中，水浴加熱到50℃，同時在攪拌的情況下加入48mL水，靜止冷卻50h以上，過濾結晶，低溫烘干后得黃白色粉末(280mg)，紫杉醇的含量為50.5％，回收率為98％。
5、將黃白色粉末(280mg)上硅膠柱層析，正己烷∶乙酸乙酯為流動相，先用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝7∶3洗脫，再用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7洗脫，此為紫杉醇段，最后用純乙酸乙酯洗脫。將紫杉醇段減壓濃縮蒸干后，用上述同樣的方法再結晶一次，得135mg結晶，紫杉醇含量可達到99.5％，回收率為95％。
6、從3kg(含量為0.5/萬)人工種植的南方紅豆杉全株鮮枝葉，經(jīng)過超聲波提取，大孔吸附樹脂層析，一次結晶，硅膠柱層析，二次結晶五步，得到純度為99.5％的結晶135mg，總回收率為89.6％。
實施例21、人工種植的南方紅豆杉全株鮮枝葉3kg，經(jīng)檢測紫杉醇含量為0.55/萬，全株鮮枝葉粉碎過篩，發(fā)酵(24～48h)，90％甲醇水溶液超聲波提取(50℃，9L×3次，每次50分鐘)，提取液混合后濃縮，得濃縮液(12L)。
2、D101型大孔吸附樹脂400g，經(jīng)甲醇浸泡前處理48h后使用，將濃縮液(12L)經(jīng)過大孔吸附樹脂吸附，收集母液。
3、待母液收集完后，用72％甲醇水溶液洗脫，收集10L，82％甲醇水溶液洗脫，收集10L，92％甲醇水溶液洗脫，收集10L，此為紫杉醇收集液，最后直接用100％甲醇洗脫完畢。將紫杉醇收集液減壓濃縮蒸干，得紫杉醇浸膏(2.1g)，含量為7.5％，回收率95.5％。
4、紫杉醇浸膏(2.1g)溶解在16.5mL甲醇中，水浴加熱到52℃，同時在攪拌的情況下加入50mL水，靜止冷卻48h以上，過濾結晶，低溫烘干后得黃白色粉末(288mg)，紫杉醇的含量為52.8％，回收率為96.5％。
5、將黃白色粉末(288mg)上硅膠柱層析，正己烷∶乙酸乙酯為流動相，先用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝7∶3洗脫，再用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7洗脫，此為紫杉醇段，最后用純乙酸乙酯洗脫。將紫杉醇段減壓濃縮蒸干后，用上述同樣的方法再結晶一次，得142mg結晶，紫杉醇含量可達到99.5％，回收率為93％。
6、從3kg(含量為0.55/萬)人工種植的南方紅豆杉全株鮮枝葉，經(jīng)過超聲波提取，大孔吸附樹脂層析，一次結晶，硅膠柱層析，二次結晶五步，得到純度為99.5％的結晶142mg，總回收率為85.6％。
實施例31、人工種植的南方紅豆杉全株鮮枝葉3kg，經(jīng)檢測紫杉醇含量為0.6/萬，全株鮮枝葉粉碎過篩，發(fā)酵(24～48h)，90％甲醇水溶液超聲波提取(50℃，9L×3次，每次50分鐘)，提取液混合后濃縮，得濃縮液(12L)。
2、AB-8型大孔吸附樹脂400g，經(jīng)甲醇浸泡前處理48h后使用，將濃縮液(12L)經(jīng)過大孔吸附樹脂吸附，收集母液。
3、待母液收集完后，用74％甲醇水溶液洗脫，收集10L，84％甲醇水溶液洗脫，收集10L，94％甲醇水溶液洗脫，收集10L，此為紫杉醇收集液，最后直接用100％甲醇洗脫完畢。將紫杉醇收集液減壓濃縮蒸干，得紫杉醇浸膏(2.2g)，含量為7.8％，回收率95％。
4、紫杉醇浸膏(2.2g)溶解在18mL甲醇中，水浴加熱到50℃，同時在攪拌的情況下加入54mL水，靜止冷卻48h以上，過濾結晶，低溫烘干后得黃白色粉末(320mg)，紫杉醇的含量為51.5％，回收率為96％。
5、將黃白色粉末(320mg)上硅膠柱層析，正己烷∶乙酸乙酯為流動相，先用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝7∶3洗脫，再用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7洗脫，此為紫杉醇段，最后用純乙酸乙酯洗脫。將紫杉醇段減壓濃縮蒸干后，用上述同樣的方法再結晶一次，得155mg結晶，紫杉醇含量可達到99.5％，回收率為93.6％。
6、從3kg(含量為0.6/萬)人工種植的南方紅豆杉全株鮮枝葉，經(jīng)過超聲波提取，大孔吸附樹脂層析，一次結晶，硅膠柱層析，二次結晶五步，得到純度為99.5％的結晶142mg，總回收率為85.7％。
權利要求
1.一種從人工種植南方紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法，該方法包括以下步驟a、提取與濃縮粉碎后的紅豆杉全株按物料∶90％甲醇(重量比)＝1∶3～3.5的比例于溫度50～56℃下，利用超聲波提取50～55分鐘，得到濾液，再將濾液減壓濃縮，使?jié)饪s液的密度達到0.92～0.96kg/L，得濃縮液；b、一次層析上述濃縮液利用大孔吸附樹脂進行層析，按照樹脂∶濃縮液(重量比)＝1∶25～30的比例，采用甲醇水溶液為流動相，流動相洗脫時，層析柱內(nèi)流出液的流速為0.5～1.5柱床體積/小時，收集紫杉醇段；c、一次結晶將一次層析后收集的紫杉醇段濃縮蒸干，按8～9mL/g的比例溶解在甲醇中，水浴加熱到50～55℃，同時在攪拌的情況下加入水，控制甲醇和水的比例為1∶3～3.5，靜止冷卻48～54小時，過濾結晶，低溫烘干后得黃白色粉末，紫杉醇的含量達到50～60％；d、二次層析將一次結晶獲得的黃白色粉末上硅膠柱層析，按黃白色粉末量∶硅膠∶二氯甲烷＝1∶2～2.2∶2～2.5(重量比)的比例拌勻成混合物，40～50℃烘干，過篩，按拌好干燥的混合物∶硅膠按1∶4～5(重量比)的比例裝入層析柱，采用正己烷與乙酸乙酯體系為流動相進行洗脫，收集紫杉醇段；e、二次結晶將經(jīng)過二次層析后收集的紫杉醇段進行二次結晶，二次結晶的條件與一次結晶的條件相同，經(jīng)過二次結晶后，晶體中紫杉醇的純度達到99.5％。
2.如權利要求1所述的從人工種植紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法，其特征在于在提取前，先進行物料準備選用人工種植的南方紅豆杉全株為原料，南方紅豆杉全株挖出后沖洗干凈，晾干，用粉碎機粉碎。
3.如權利要求1所述的從人工種植紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法，其特征在于，在提取時，重復提取過程三次，再合并三次提取時獲得的所有濾液，然后進行濃縮，同時回收甲醇，剩下的濾渣回收溶劑。
4.如權利要求1所述的從人工種植紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法，其特征在于，大孔吸附樹脂為DA201或D101或AB-8。
5.如權利要求1所述的從人工種植紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法，其特征在于，在一次層析中，甲醇水溶液濃度范圍為70～100％，洗脫方式為梯度洗脫，共分為四個梯度70～74％、80～84％、90～94％及98～100％，其中，收集90～94％段為紫杉醇段。
6.如權利要求1所述的從人工種植紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法，其特征在于，在二次層析中，硅膠為200～300目；在用正己烷與乙酸乙酯體系為流動相進行洗脫時，先用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝7∶3洗脫；再用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7洗脫，最后用純乙酸乙酯洗脫，其中，收集正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7的洗脫段為紫杉醇段。
全文摘要
一種從人工種植南方紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法，過程為紅豆杉全株粉碎發(fā)酵，超聲波提取，大孔吸附樹脂層析脫色和純化，一次結晶，硅膠柱層析純化，二次結晶。其特征在于紅豆杉全株粉碎后，發(fā)酵，超聲波提??；用提取后的濃縮液直接經(jīng)大孔吸附樹脂層析達到脫色和初步純化的目的。本發(fā)明為制備紫杉醇提供了一種簡單方便、回收率高、成本低廉的方法，發(fā)酵有利于破壞植物細胞壁，有利于紫杉醇的浸出，使提取時間縮短，提取工藝簡化；濃縮液直接經(jīng)樹脂層析減少了溶劑損耗，縮短了工藝流程。使用本方法制備的紫杉醇含量≥99.5％，紫杉醇總收率≥85％。
文檔編號C07D305/14GK1958580SQ20061009762
公開日2007年5月9日 申請日期2006年11月13日 優(yōu)先權日2006年11月13日
發(fā)明者李弟貴, 任莉 申請人:江蘇紅豆杉生態(tài)科技有限公司