專利名稱：：作為豬生殖和呼吸道征候群疫苗的prrs病毒的融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是關(guān)于具備誘發(fā)豬只產(chǎn)生PRRSV中和力價(jià)反應(yīng)的融合蛋白次單位疫苗。
背景技術(shù)：
：豬生殖與呼吸道征候群(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是一種由豬生殖與呼吸道征候群病毒(PRRSV)感染，其為一種會(huì)導(dǎo)致母豬繁殖障礙，并對(duì)各年齡層豬只呼吸道感染為主的豬只傳染病。PRRSV被視為極頑強(qiáng)的病毒，其基于在寄主體內(nèi)不易誘發(fā)具有中和力價(jià)的抗體。且PRRSV為RNA病毒，可在寄主細(xì)胞內(nèi)經(jīng)由簡(jiǎn)化的基因復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行繁殖，也因此基因突變機(jī)率非常高。此外，PRRSV感染可分為兩階段(A)感染上呼吸道及下呼吸道上皮細(xì)胞系統(tǒng)；及(B)感染呼吸道外圍組織的單核球及巨嗜細(xì)胞。因此，寄主需同時(shí)具備中和力價(jià)的體液或黏膜免疫反應(yīng)機(jī)制及細(xì)胞免疫機(jī)制，利于清除被感染的細(xì)胞以進(jìn)行防御。然而，自然界中PRRSV可以真正的在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生中和力價(jià)即不容易，因此一般的抗體對(duì)防御PRRSV效果不大，甚至?xí)碳げ《镜耐蛔?。因此，在抗體-依賴性的增強(qiáng)作用機(jī)制中，非中和力價(jià)抗體的使用可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的感染。中國(guó)臺(tái)灣第I-2289933號(hào)(美國(guó)專利公開號(hào)US20040247617)中，提供一種對(duì)標(biāo)靶細(xì)胞具專一性的融合蛋白，該融合蛋白利用一綠膿桿菌外毒素部位及一功能區(qū)架構(gòu)PRRSVORF7核蛋白片段，并于羧基端添加KDEL訊碼。該融合蛋白可以大量在大腸桿菌中生產(chǎn)，免疫豬只后，可有效降低及清除豬只攻毒后的病毒血癥的發(fā)生。該專利的全文引用記載并入本申請(qǐng)中。在PRRSV的ORF5與ORF6雜二聚合反應(yīng)(heterodimerization)中，ORF5的Cys-34抗原決定部位區(qū)域，及ORF6的Cys-8抗原決定部位區(qū)域，對(duì)病毒感染及其外套膜裝配(envelopeassembly)具關(guān)鍵性作用(SnijderEricJ.,JessicaC.etal.，JournalofVirology,January2003,Vol.77，No.1:97-104)。此外，PRRSVORF5的保留序列(consensuss叫uence)—YKNTHLDLIYNA，為介于胺基酸38至44之間的抗原決定部位，其位于PRRSVORF5的N-端體外區(qū)，業(yè)經(jīng)鑒別為一中和抗原決定部位(OstrowskiM.,J.A.Galeota，etal.,JournalofVirology,May2002,Vol.76，No.9:4241-4250)。公知技術(shù)亦曾將ORF5或ORF6整個(gè)蛋白架構(gòu)在PE及KDEL中間，免疫到豬只后發(fā)現(xiàn)，攻毒的豬只在肺部反而發(fā)生更嚴(yán)重的發(fā)炎現(xiàn)象，顯見ORF5或ORF6比本身更具有免疫毒性。因此，欲有效防治豬只感染PRRS，仍有必要發(fā)展具有高中和力價(jià)且低免疫毒性的疫苗。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一是提供一種融合蛋白，及其組合方式。本發(fā)明的另一目的是關(guān)于利用該等融合蛋白制備具中和力價(jià)融合蛋白組成的次單位PRRS疫苗。本發(fā)明的再一目的是提供醫(yī)藥組合物，其包括本發(fā)明的融合蛋白及在藥學(xué)上可接受的載劑。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的PE-PQGAB-K3融合蛋白，其包括一含有豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的ORF6部分序列，與PRRSVORF5部分序列的N端蛋白區(qū)；一綠膿桿菌外毒素A移位功能部位；以及一含KDEL-KDEL-KDEL(K3)序列的羧基終端部份。所述的融合蛋白，其中該P(yáng)RRSV為美洲株。所述的融合蛋白，其中該P(yáng)RRSV為歐洲株。所述的融合蛋白，其中該P(yáng)RRSV的該0RF6部分序列為SEQIDN0.13。所述的融合蛋白，其中該P(yáng)RRSVORF5部分序列為SEQIDNO.12。所述的融合蛋白，其中該豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區(qū)的核酸序列為SEQIDNO.l。所述的融合蛋白，其中該P(yáng)RRSV的該部分ORF6為SEQIDNO.15。所述的融合蛋白，其中該P(yáng)RRSV的該部分ORF5為SEQIDNO.14。所述的融合蛋白，其中該豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區(qū)的核酸序列為SEQIDNO.10。本發(fā)明可作為疫苗的醫(yī)藥組合物，其包含一豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區(qū)；一綠膿桿菌外毒素A移位功能部位；一含KDEL-KDEL-KDEL(KDEL3)序列的羧基終端部份；以及一藥學(xué)上可接受的載體。所述的醫(yī)藥組合物，其中該P(yáng)RRSV為美洲株。所述的醫(yī)藥組合物，其中該P(yáng)RRSV為歐洲株。所述的醫(yī)藥組合物，其中該P(yáng)RRSV的該部分ORF6為SEQIDN0.13。所述的醫(yī)藥組合物，其中該P(yáng)RRSV的該部分ORF5為SEQIDNCU2。所述的醫(yī)藥組合物，其中該豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區(qū)的核酸序列為SEQIDNO.1。所述的醫(yī)藥組合物，其中該P(yáng)RRSV的該部分ORF6為SEQIDN0.15。所述的醫(yī)藥組合物，其中該P(yáng)RRSV的該部分ORF5為SEQIDN0.14。所述的醫(yī)藥組合物，其中該豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區(qū)的核酸序列為SEQIDNO.10。所述的醫(yī)藥組合物，其中該載體包含一福氏佐劑、乳化劑二縮甘露醇單油酸鹽(mannidemono-oleateemulsifier，ISA720,ISA206)佐齊U。所述的醫(yī)藥組合物，其中該載體包含一ISA206佐劑。再進(jìn)一步地說(shuō)，本發(fā)明PE-PQGAB-K3融合蛋白包括一含有豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的ORF6部分序歹U，與PRRSVORF5部分序列的N端蛋白區(qū)；一綠膿桿菌外毒素A移位功能部位；以及一含KDEL-KDEL-KDEL(K3)序列的羧基終端部份。本發(fā)明還包括一種可作為疫苗的醫(yī)藥組合物，其包含一豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區(qū)；一綠膿桿菌外毒素A移位功能部位；一含KDEL-KDEL-KDEL(KDEL3)序列的羧基終端部份；以及一藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明中所指的PRRSV病毒株種類不限，可以是美洲型病毒株、歐洲型病毒株、或澳洲型病毒株，于本發(fā)明較佳實(shí)施例中，PRRSV病毒株為美洲型病毒株、或歐洲型病毒株。本發(fā)明中，融合蛋白的N端蛋白區(qū)可包含的片段不限制，較佳為任一具備抗原特性的PRRSV片段，如PRRSVORF5、ORF6、或ORF7。以美洲型病毒株為例，較佳PRRSV的ORF6部分序列可為SEQIDN0.13。而PRRSVORF5部分序列則可為SEQIDN0.12。以歐洲型病毒株而言，較佳PRRSV的部分ORF6可為SEQIDN0.15,而PRRSV的部分ORF5較佳則可為SEQIDNCU4。本發(fā)明中，融合蛋白含部分PRRSVORF6及部分PRRSVORF5的核酸序列是經(jīng)改質(zhì)，其序列不限制，較佳為可于大腸桿菌系統(tǒng)中高度表現(xiàn)，且表現(xiàn)出的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與野生型相同的核酸序列。以美洲型病毒株為例，更佳的改質(zhì)后核酸序列為SEQIDNO.l。而以歐洲型病毒株為例，更佳的改質(zhì)后核酸序列為SEQIDNO.IO。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可包括根據(jù)已知技術(shù)使用適合的佐劑；分散劑或保濕劑(如Tween80)以及懸浮劑調(diào)配無(wú)菌注射劑，例如，無(wú)菌注射水溶液或含油性懸浮液。無(wú)菌注射制劑亦可用于無(wú)毒性注射的稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌注射液或懸浮液，例如，于l，3-丁二醇中的溶液。在可使用的可接受的載體與溶劑中，有甘露醇、水、Ringer溶液、與等張氯化鈉溶液。此外，常用上使用滅菌、固定油類作為溶劑或懸浮介質(zhì)(例如合成的單酸或二酸甘油酯類)。脂肪酸(例如油酸與其甘油酯衍生物)，以及天然醫(yī)藥上可接受的油類(例如橄欖油或蓖麻油，尤其是其多氧乙基化的型態(tài))，可使用于可注射制劑。此等油溶液或懸浮液亦可含有長(zhǎng)鏈醇稀釋劑或分散劑、或羧甲基纖維素或類似的分散劑。其它一般使用的界面活性劑例如Tweens或Spans或其它類似的乳化劑或生體可用率增強(qiáng)劑(一般用于制造醫(yī)藥上可接受的固體、液體、或其它劑量形式)亦可用于調(diào)配的目的。口服投藥用的組合物可為任何口服上可接受的劑量形式，包含但不限于膠囊、錠、乳劑、及水性懸浮液、分散劑、與溶液。在口服用途的錠劑例中，一般使用的載體包含乳醣及玉米淀粉。一般亦常添加潤(rùn)滑劑，例如，硬脂酸鎂。對(duì)于以膠囊形式口服投藥而言，可使用的稀釋劑包含乳糖及玉米淀粉。當(dāng)口服投藥水性分散劑或乳劑時(shí)，可使活性成份與乳化劑或懸浮劑組合懸浮或分散于油相中。若需要，可添加特定的甜味劑、風(fēng)味劑、或著色劑。鼻腔噴劑或吸入劑組合物可依據(jù)醫(yī)藥配方的技術(shù)中公知技術(shù)制備，及可制成生理食鹽水，使用苯甲醇或其它適合的防腐劑、增加生體可用率的吸收促進(jìn)劑、氟碳化合物、及或其它技術(shù)中已知的溶解劑或分散劑。含吲哚化合物的組合物亦可以直腸投藥的栓劑形式投藥。醫(yī)藥組合物中的載體必須為"可接受"，意為與配方中的活性成份相容(及較佳地是能使配方安定)及對(duì)接受治療的病患無(wú)害。其它載體的實(shí)例包含膠態(tài)二氧化硅、硬脂酸鎂、纖維素、十二垸基硫酸鈉、及D&C黃色10號(hào)。而含本發(fā)明融合蛋白的醫(yī)藥組合物中，較佳地還包括一免疫佐劑；所適用的免疫佐劑不限，可以是任何一種常用于疫苗的佐劑，包括鋁膠以及油質(zhì)佐劑如福氏佐劑(Freund'sFCAorFIA)或乳化劑二縮甘露醇單油酸鹽(mannidemono-oleateemulsifier,ISA720或ISA206,SEPPIC,France),較佳為ISA206佐劑。本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明陳述于下列說(shuō)明中。在本發(fā)明說(shuō)明及申請(qǐng)專利范圍中將顯而易見本發(fā)明的其它特征、目的及優(yōu)勢(shì)。圖l表示根據(jù)實(shí)例1的PE-PQGAB-K3融合蛋白的簡(jiǎn)圖。圖2表示根據(jù)實(shí)例1的PE(AIII)-PQGAB質(zhì)體構(gòu)筑流程圖。圖3表示根據(jù)實(shí)例1所合成的核酸片段電泳圖，共4段DNA片段(a段70bp、b段129bp、c段186bp、d段204bp)。圖4表示PE(AIII)-PQGAB質(zhì)體圖譜。圖5為利用8M尿素法萃取及溶出包涵體(inclusionbodies)內(nèi)的PE-PQGAB-K3抗原蛋白質(zhì)片段定量的結(jié)果圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明特征在于，發(fā)現(xiàn)將ORF5及ORF6大多數(shù)的抗原去除，僅留下ORF5及ORF6的N端數(shù)十幾個(gè)胺基酸，以此架構(gòu)一個(gè)雜合勝肽鏈PQGAB，接著使的嵌入PE及KDEL3序列中間，該融合蛋白PE-PQGAB-KDEL3經(jīng)小鼠及豬只的免疫試驗(yàn)，確認(rèn)具有血清中和力價(jià)能力。為解釋本發(fā)明目的，提供下列實(shí)例，惟，其并非用以限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l:美洲株P(guān)RRSV的PQGAB融合勝肽美洲株P(guān)RRSV的ORF5及ORF6結(jié)構(gòu)蛋白序列是得自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)數(shù)據(jù)中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫(kù)。而根據(jù)上述病毒感染機(jī)轉(zhuǎn)已知，PRRSV病毒具有中和力價(jià)的區(qū)域分別為ORF6及ORF5的N端。即為ORF6結(jié)構(gòu)蛋白第2至26號(hào)胺基酸勝肽區(qū)(SEQIDNO.13)，及ORF5結(jié)構(gòu)蛋白第30至63號(hào)胺基酸勝肽區(qū)(SEQIDN0.12)。將融合此二段勝肽區(qū)的胺基酸序列列出，如下GSSLDDFCYDSTAPQKVLLAFSITYASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFDWA艮卩，PRRSV-ORF6-226-ORF5-31~63融合勝肽，其由(ORF6)-G2SSLDDFCYDSTAPQKVLLAFSITY26(SEQIDNO.13)及(ORF5)-A31SNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFDWA63(SEQIDN0.12)兩勝肽片段所組成，其中，GSSLDDFC片段稱的P、YDSTAPQKVLLAFSITY片段稱的Q、ASNDSSSHLQLIYNLTLC片段稱的A，且ELNGTDWLANKFDWA片段稱的B。PQ片段屬于一部份的ORF6片段，而AB片段屬于一部份的ORF5片段。本例利用PQGAB勝肽融合區(qū)，構(gòu)筑一個(gè)具有誘發(fā)中和力價(jià)免疫保護(hù)力的關(guān)鍵蛋白質(zhì)(即抗原決定部位)，以達(dá)成誘發(fā)活體免疫效果。PE-PQGAB-K3融合蛋白簡(jiǎn)圖及PE(AIII)-PQGAB質(zhì)體構(gòu)筑的流程圖分別如圖1及2所示。實(shí)施例2以下說(shuō)明PQGAB核酸序列的編制。由于一胺基酸可對(duì)應(yīng)多組不同的核酸序列，因此可先由學(xué)術(shù)數(shù)據(jù)(如http:〃www.kazusa.or.jp/codon)，找到比較適合在大腸桿菌(￡."")寄主系統(tǒng)中表現(xiàn)的核酸對(duì)應(yīng)序列，且避開大腸桿菌不容易辨識(shí)、表現(xiàn)的核酸對(duì)應(yīng)序列。同理，如果這序列要在酵母菌系統(tǒng)中表現(xiàn)，則亦要選擇適于酵母菌系統(tǒng)GSacc/wraA^c^或P/c/zz'aspp.)表達(dá)的序列。根據(jù)PQGAB融合蛋白區(qū)的胺基酸序列，找出適合于大腸桿菌寄主系統(tǒng)中表現(xiàn)的對(duì)應(yīng)核酸序列，并且在核酸序列的5'及3'-末端分別接上限制酵素序列，以利于往后的基因片段剪接步驟。為了增加酵素的切割效率以及利于PCR引子的設(shè)計(jì)，該基因兩端可加上一些重復(fù)堿基的核酸，如CCC、AAA、GGG或TTT。本例中改質(zhì)后的PQGAB融合蛋白區(qū)核酸序列可見SEQIDNO.l。SEQIDNO.l中總共207個(gè)核酸，當(dāng)利用酵素進(jìn)行與質(zhì)體的剪接時(shí)，上述連續(xù)三碼的核酸會(huì)有部分被切除，而至少會(huì)有186至180個(gè)核酸進(jìn)入質(zhì)體內(nèi)。標(biāo)的核酸序列確定后，在開始進(jìn)行合成前，需利用計(jì)算機(jī)軟件(如DNAstrider)分析標(biāo)的核酸序列上帶有限制酵素切點(diǎn)的圖譜，并根據(jù)圖譜結(jié)果，于標(biāo)的核酸序列兩端安裝限制酵素的序列，以供往后進(jìn)行剪接用。而由于產(chǎn)生出來(lái)的標(biāo)的物須進(jìn)行限制酵素的剪接，因此最好在標(biāo)的核酸序列內(nèi)避免出現(xiàn)與剪接時(shí)相同的限制酵素切位。為此，須再利用常用的軟件，分析DNA序列中是否有這些切位(restrictionmap)。如果標(biāo)的核酸序列內(nèi)有與剪接時(shí)相同的限制酵素切位序列，就必須再改換核酸序列，找尋相同胺基酸對(duì)應(yīng)的不同核酸序列，使標(biāo)的核酸序列片段內(nèi)的限制酵素切位消失。接著利用前述中國(guó)臺(tái)灣第1-2289933號(hào)(美國(guó)專利號(hào)US20040247617)專利所公開的方法，根據(jù)野生型胺基酸進(jìn)行對(duì)應(yīng)的核酸序列的改質(zhì)，使得上述野生型胺基酸可由大腸桿菌系統(tǒng)大量表現(xiàn)出來(lái)。改質(zhì)的重點(diǎn)主要在將野生病毒株的核酸片段，以在不影響其原本表現(xiàn)出的胺基酸，而又能有效的在大腸桿菌宿主系統(tǒng)中表現(xiàn)的狀況下，進(jìn)行核酸序列的改質(zhì)。此改質(zhì)后的核酸序列，可分別利用多對(duì)引子，以聚合酶連鎖反應(yīng)進(jìn)行合成，所有引子對(duì)的對(duì)應(yīng)編號(hào)請(qǐng)見表l。表l:美洲株P(guān)RRSV標(biāo)的抗原PQGAB引子對(duì)的對(duì)應(yīng)編號(hào)標(biāo)的抗原正向引子序列編號(hào)(S叫.IDNo.)反向引子序列編號(hào)(Seq.IDNo.)PQGABFl2Rl6PQGABF23R27PQGABF34R38PQGABF45正向引子及反向引子的序列分別如下所示正向引子Fl(SEQIDNo.2)為SEQIDNo.l的第81至124號(hào)胺基酸序列，即，5'-GCTTTCTCCATCACCTACGCTTCCAACGACTCCTCCTCCCACCT-3';正向引子F2(SEQIDNo.3)為SEQIDNo.l的第48至96號(hào)胺基酸序列，即，5'-CGACTCCACCGCTCCCCAGAAAGTTCTGCTGGCTTTCTCCATCACCTA-3';正向引子F3(SEQIDNo.4)為SEQIDNo.l的第22至65號(hào)胺基酸序列，即，5'-GGTTCCTCCCTGGACGACTTCTGCTACGACTCCACCGCTCCCCA-3';正向引子F4(SEQIDNo.5)為SEQIDNo.l的第l至41號(hào)胺基酸序列，即，5'-CCCAAACCCCATATGGAATTCGGTTCCTCCCTGGACGACT-3';反向引子Rl(SEQIDNo.6)為SEQIDNo.l的第148至106號(hào)胺基酸序列，即，GGAGTC-3';反向引子R2(SEQIDNo.7)為SEQIDNo.l的第176至133號(hào)胺基酸序列，即，5'-GCCAGCCAGTCGGTACCGTTCAGTTCGCACAGGGTCAGGTTGTA-3';反向引子R3(SEQIDNo.8)為SEQIDNo.l的第204至164號(hào)胺基酸序列，即，5'-TTTTTTCTCGAGAGCCCAGTCGAATTTGTTAGCCAGCCAGTCGG-3';其中R1、R2及R3為表1基因序碼的逆向互補(bǔ)基因序列。首先利用無(wú)DNA模板的聚合方式，利用正向引子F1以及反向引子R1進(jìn)行核酸片段的聚合，其中各引子的3'端部分各有10-18個(gè)堿基是設(shè)計(jì)為彼此互補(bǔ)的結(jié)合，以經(jīng)由聚合酵素的讀寫及補(bǔ)足成為一條雙股的DNA模板聚合產(chǎn)物。完成第一次PCR后，取0.01~4pl的聚合產(chǎn)物作為第二次PCR的模板DNA，同時(shí)加入第二組引子對(duì)正向引子F2及反向引子R2各0.014pl，連同所需的dNTPs、反應(yīng)試劑以及Pfli聚合酶等，開始進(jìn)行第二次PCR;接著依照相同方式，分次加入不同引子對(duì)F3及R3進(jìn)行PCR后，再進(jìn)行引子對(duì)F4及R3的PCR步驟，即可合成出PQGAB改質(zhì)后的207bp核酸序列。所分別合成出的核酸片段經(jīng)電泳試驗(yàn)后，可確認(rèn)其產(chǎn)物的片段大小與預(yù)期相符。PQGAB-l段(207bp)，如圖3;PQGAB-產(chǎn)生a、b、c及d共4段DNA片段(a段70bp、b段129bp、c段186bp、d段204bp)。實(shí)施例3、歐洲型病毒株P(guān)RRSV的PQGAB實(shí)施例12為PRRSV美洲型的融合蛋白設(shè)計(jì)，但是PRRSV在全球的感染盛行率除了PRRSV美洲型病毒株外，歐洲型病毒株、澳洲型病毒株的盛行亦相當(dāng)普遍，由于這些病毒株在結(jié)構(gòu)蛋白胺基酸的相似度并不高，只在60~80%，因此對(duì)于其它型的ORF5與ORF6的融合蛋白設(shè)計(jì)，亦可分別根據(jù)如實(shí)施例12的類似方式，進(jìn)行序列的設(shè)計(jì)與合成。歐洲型病毒株P(guān)RRSV的PQGAB融合蛋白區(qū)的胺基酸序列如SEQIDNO.ll所示。其中包含0RF6-M1I28(SEQIDNCU5)片段，以及ORF5-F31A64(SEQIDNO,14)的片段序列。以SEQIDNO.ll為依據(jù)所設(shè)計(jì)的合成用引子，分別為四組，如下表2所示。表2:歐洲株P(guān)RRSV標(biāo)的抗原PQGAB引子對(duì)的對(duì)應(yīng)編號(hào)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>經(jīng)如實(shí)施例2所述的方式，由如表2的引子序列，可體外合成出一改質(zhì)后的歐洲株P(guān)QGAB核酸序列。為了增加酵素的切割效率以及利于PCR引子的設(shè)計(jì)，于歐洲株P(guān)QGAB核酸序列的兩端，同樣可加上一些具重復(fù)堿基的核酸，如CCC、AAA、GGG或TTT。本例中改質(zhì)后的歐洲株P(guān)QGAB核酸序列為SEQIDNO.IO。實(shí)施例4:含標(biāo)的序列的質(zhì)體構(gòu)筑以實(shí)施例2制備出的改質(zhì)核酸片段為例，將上述合成出的207bpDNA片段，分別以限制酵素￡"/7、^!o7切割后，接入已帶有一結(jié)合與移位功能的勝肽序列，以及一羧基終端勝肽的大腸桿菌質(zhì)體中，所得質(zhì)體為pPE-PQGAB-K3質(zhì)體。構(gòu)筑于含T7啟動(dòng)子及具抗生素(ampicilin)抗性片段的pET15質(zhì)體系統(tǒng)，可表現(xiàn)含有PRRSVPQGAB以及去毒性的綠膿桿菌外毒素A(/^M&mo"asexoto;n力AwithoutdomainIII)的融合蛋白，質(zhì)體圖譜系如圖4所示。最后分別將上述質(zhì)體轉(zhuǎn)染于可以表現(xiàn)該融合蛋白質(zhì)的菌株或細(xì)胞中。實(shí)施例5、標(biāo)的蛋白質(zhì)的表現(xiàn)與分析經(jīng)確定含有以上質(zhì)體的菌種，90。/。以上細(xì)菌均含有質(zhì)體及PQGAB基因，個(gè)別以甘油保存法于2ml分裝瓶中保存于-7(TC溫度下。在無(wú)菌室中，將以上保存菌苗取2ml接種于滅菌的500ml三角瓶，其內(nèi)含有200mlLB(+500嗎/mlAmp)，于37'C回轉(zhuǎn)式培養(yǎng)箱以150rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)1012小時(shí)，完成種菌培養(yǎng)。該菌苗的OD600應(yīng)達(dá)到1.0士0.4。在無(wú)菌室中，將50ml菌種液各別接種于滅菌的3000ml三角瓶共八瓶，該三角瓶?jī)?nèi)含有1250mlLB(+500嗎/mlAmp+50ml10%Glucose),于37°。回轉(zhuǎn)式培養(yǎng)箱以150rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)23小時(shí)，檢測(cè)OD600在0.3士0.1時(shí)，注入最終濃度為50ppm的IPTG蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑后，于37'C回轉(zhuǎn)式培養(yǎng)箱以150rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)2小時(shí)，即完成蛋白生產(chǎn)步驟。接著，利用8M尿素法萃取及溶出包涵體(inclusionbodies)內(nèi)的PE-PQGAB-K3抗原蛋白質(zhì)片段，各以十公升細(xì)菌液(一小批量，Iot庫(kù)取，可得到300400mg抗原量。利用西方墨點(diǎn)法(Westem-blottingmethod)、coomasieblue染色法、SDS-PAGE電泳分析法，并以密度計(jì)(densitometer)量測(cè)電泳條帶的密度，以進(jìn)行各抗原溶液的蛋白質(zhì)定量(結(jié)果如圖5)。將上述抗原蛋白質(zhì)取0.2士0.02mg，作為針劑高劑量的主成份。取0.02士0.002mg作為針劑低劑量的主成份，進(jìn)行豬只免疫及攻毒的功效性試驗(yàn)。實(shí)施例6、豬只免疫及攻毒的功效性試驗(yàn)在SPF農(nóng)場(chǎng)中，將豬只隨機(jī)分成三組，每組五只豬，且每組豬只分別飼養(yǎng)在裝設(shè)有空調(diào)及換氣設(shè)備的隔離室內(nèi)。PE-PQGAB-E3接種疫苗組的豬只在14及28日齡時(shí)，藉由肌肉內(nèi)分別注射含有l(wèi)mlPE-PQGAB-E3(含有200嗎蛋白質(zhì)/劑量)，在lmlISA206(SEPPK^法國(guó))佐劑中乳化的2ml疫苗，免疫兩次。GP5&M免疫組則以PE-ORF5-K3及PE-ORF6-K3(各含有200嗎蛋白質(zhì)/劑量)所免疫。對(duì)照組則于無(wú)免疫接種下養(yǎng)育。在最后的疫苗接種之后二周，對(duì)豬只在肌肉內(nèi)投予100mg氯胺酮(ketamine)溶液以達(dá)鎮(zhèn)靜作用，接著在鼻內(nèi)滴下lml的2。/。利多卡因(Lidocaine)抑制咳嗽-反射作用之后，以鼻內(nèi)攻毒豬只。使用新鮮的lml的MD-1品系的PRRSV培養(yǎng)物，以大約1x107TCID5()/ml的劑量攻毒每組中的五只豬。接種后第14天時(shí)，對(duì)所有犧牲的豬只進(jìn)行完整解剖。收集肝臟樣品(自頭蓋葉的兩部份及各來(lái)自肝尾狀葉的中間及附屬部份)，并利用10%中性緩沖福爾馬林予以固定，以進(jìn)行后續(xù)組織病理學(xué)檢驗(yàn)。該檢驗(yàn)方式是采用盲模式(blindfashion)并根據(jù)間質(zhì)性肺炎嚴(yán)重程度加以評(píng)比(OpriessnigT,P.G.Halbur,etal.,JournalofVirology,76(2002):11837-11844及Halbur，P.G.,P.S.Paul,etal.，1996.J.VetDiagn.Investig.8:11-20)，以0至6作區(qū)分，數(shù)字愈大表示病變程度愈嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果第二次免疫的后兩周，豬只血液白血球試樣以RT-PCR檢測(cè)PRRSV，結(jié)果顯示在PRRSV攻毒之前，所有豬只均未引起病毒血癥。在攻毒之后3、7及14天后，再次利用RT-PCR檢測(cè)豬只的血液白血球試樣，結(jié)果如表3所示。表3:PRRSV攻毒后，豬只PRRSV病毒血癥比例<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>"^表示死亡的豬只之前均由RT-PCR檢測(cè)出PRRSV病毒血癥對(duì)所有豬只(包括已經(jīng)犧牲的豬只及兩周研究結(jié)束時(shí)還存活的豬只)進(jìn)行解剖，巨觀檢查顯示，攻毒后豬只肺臟顯示，對(duì)照組及ORF5&ORF6疫苗組觀察到較廣泛的病變以及嚴(yán)重之間質(zhì)性肺膜炎，而本發(fā)明PE-PQGAB-K3疫苗組則未發(fā)現(xiàn)此等廣泛的病變及之間質(zhì)性肺膜炎。表4:以PRRSV攻毒后14天對(duì)于PRRSV-所誘發(fā)的巨觀肺臟病變的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>平均指數(shù)5.75±0.503.80±0.845.80±0,45*:間質(zhì)性肺炎病變指數(shù)。如表4所示，本發(fā)明PE-PQGAB-K3疫苗組所表現(xiàn)的巨觀肺臟病變嚴(yán)重程度顯著地較對(duì)照組及ORF5&ORF6疫苗組為小。表5、PE-PQGAB-K3疫苗組所表現(xiàn)的巨觀肺臟病變指數(shù)，以生物統(tǒng)計(jì)具極顯著差異水平，較對(duì)照組及ORF5&ORF6疫苗組低(p0.01)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>NOVA變?cè)磗s自由度MSFP曙值臨界值組間13.3333326.66666718.181820.0002333.885294組內(nèi)4,4120.366667總禾口17.7333314比較對(duì)照組及ORF5&ORF6疫苗組低(p0.01)根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果清楚顯示，本發(fā)明PE-PQGAB-K3不但確實(shí)可有效保護(hù)豬只免于PRRSV感染，且根據(jù)本發(fā)明的疫苗，其相對(duì)于其它疫苗(例如PE-ORF5-K3，PE-ORF6-K3)所表現(xiàn)之間質(zhì)性肺炎更為輕微。表6、血清力價(jià)總表GroupcoatingantigenIFAtitersNTtitersPE(AIII)IgG-ELISAPQGABtiters(S肌)APE-ABCF-K3PE-PQGF-K312808-168-16BNegativeCTL11<8<8CPE-PQG1AB畫K3173032-6416-64攻毒后豬只抗體力價(jià)變化如圖6所示。序列表<110>生寶生物科技股份有限公司<120>作為豬生殖與呼吸道征候群疫苗的PRRS病毒的融合蛋白<130>S0160/0613<160>23<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>207<212>DNA<213>豬生殖與呼吸道征候群病毒<400>1cccaaaccccatatggaattcggttcctccctggacgacttctgctacgactccaccgct60cccc3gaaagttctgctggctttctccatcacctacgcttcc犯cgactcctcctcccac120ctgcaactgatctacaacctgaccctgtgcgaactgaacggtaccgactggctggctaac180aaattcgactgggctctcgagaaaaaa207<210〉2<211>44<212>DNA<213>人工合成<220><223>正向引子PQGAB-US.<400>2Gctttctccatcacctacgcttccaacgactcctcctcccacct44<210>3<211>48<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-US的正向引子.<400>3cgactccaccgctccccagaaagttctgctggctttctccatcaccta48<210>4<211>44<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-US的正向引子.<400>4ggttcctccctggacgacttctgctacgactccaccgctcccca44<210>5<211>44<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-US的正向引子<權(quán)>5ggttcctccctggacgacttctgctacgactccaccgctcccca44<210>6<211>43<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-US的反向引子.<400>6acagggtcaggttgtagatcagttgcaggtgggaggaggagtc43<210>7<211>44<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-US的反向引子.<400>7gccagccagtcggtaccgttcagttcgcacagggtcaggttgta44<210>8<211>44<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-US的反向引子.<400>8ttttttctcgagagcccagtcgaatttgttagccagccagtcgg44<210>9<211〉207<212>PRT<213>豬生殖與呼吸道征候群病毒<400>9CysCysCysAlaAlaAlaCysCysCysCysAlaThrAlaThrGlyGly151015202530GlyGlyAlaCysGlyAlaCysThrThrCysThrGlyCysThrAlaCys354045GlyAlaCysThrCysCysAlaCysCysGlyCysThrCysCysCysCys505560AlaGlyAlaAlaAlaGlyThrThrCysThrGlyCysThrGlyGlyCys65707580ThrThrThrCysThrCysCysAlaThrCysAlaCysCysThrAlaCys859095GlyCysThrThrCysCysAlaAlaCysGlyAlaCysThrCysCysThr100105110CysCysThrCysCysCysAlaCysCysThrGlyCysAlaAlaCysThr115120125GlyAlaThrCysThrAlaCysAlaAlaCysCysThrGlyAlaCysCys130135140145150155160GlyThrAlaCysCysGlyAlaCysThrGlyGlyCysThrGlyGlyCys165170175ThrAlaAlaCysAlaAlaAlaThrThrCysGlyAlaCysThrGlyGly180185190GlyCysThrCysThrCysGlyAlaGlyAlaAlaAlaAlaAlaAla195200205<210>10<211>219<212>PRT400>10CysCysCysGlyAlaAlaThrThrCysCysAlaThrAlaThrGlyGly151015ThrCysGlyAlaCysAlaThrGlyGlyGlyThrThrCysThrCysThr202530CysGlyAlaCysGlyAlaCysThrThrThrThrGlyThrAlaAlaCys354045GlyAlaCysThrCysThrAlaCysCysGlyCysThrGlyCysThrCys505560AlaGlyAlaAlaAlaCysThrGlyGlyThrThrCysThrGlyGlyCys65707580ThrThrThrThrThrCysThrAlaThrCysAlaCysCysThrAlaCys85909525AlaCysCysCysCysAlaAlaThrCysThrThrThrGlyThrThrGly100105110CysThrGlyGlyThrGlyGlyThrThrCysThrThrCysThrThrCys115120125ThrAlaCysCysThrAlaCysCysAlaGlyThrAlaCysAlaThrCys130135140ThrAlaCysAlaAlaCysCysThrCysAlaCysCysAlaThrCysThr145150155160GlyThrGlyAlaAlaCysThrCysAlaAlaCysGlyGlyThrAlaCys165170175CysGlyAlaCysThrGlyGlyCysThrGlyThrCysThrAlaAlaCys180185190CysAlaCysThrThrThrGlyAlaCysThrGlyGlyGlyCysThrCys195200205ThrCysGlyAlaGlyAlaAlaAlaAlaAlaAla210215<210>11<211>219<212>DNA<213〉豬生殖與呼吸道征候群病毒<400>11cccgaattccatatggtcgacatgggttctctcgacgacttttgtaacgactctaccgct60gctcagaaactggttctggctttttctatcacctacaccccaatctttgttgctggtggt120tcttcttctacctaccagtacatctacaacctcaccatctgtgaactcaacggtaccgac180tggctgtctaaccactttgactgggctctcgagaaaaaa219<210>12<211>33<212>PRT<213>豬生殖與呼吸道征候群病毒<400>12AlaSerAsnAspSerSerSerHisLeuGinLeulieTyrAsnLeuThr151015LeuCysGluLeuAsnGlyThrAspTipLeuAlaAsnLysPheAspTip202530Ala<210>13<211>25<212>PRT<213>豬生殖與呼吸道征候群病毒<400>13GlySerSerLeuAspAspPheCysTyrAspSerThrAlaProGinLys151015ValLeuLeuAlaPheSerlieThrTyr2025<210>14<211>28<212>PRT<213>豬生殖與呼吸道征候群病毒<400>14MetGlySerLeuAspAspPheCysAsnAspSerThrAlaAlaGinLys151015LeuValLeuAlaPheSerlieThrTyrThrProlie2025<210>15<211>34<212>PRT<213>豬生殖與呼吸道征候群病毒<400>15PheValAlaGlyGlySerSerSerThrTyrGinTyrlieTyrAsnLeu151015ThrlieCysGluLeuAsnGlyThrAspTipLeuSerAsnHisPheAsp202530TipAla<210>16<211>42<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-EP的正向引子.<400>16ctggctttttctatcacctacaccccaatctttgttgctggt42<210>17<211>41<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-EP的正向引子<400>17gactctaccgctgctcagaaactggttctggc微ctat41<210>18<211>39<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-EP的正向引子.<楊>18ggttctctcgacgac加gtaacgactctaccgctgct39<210>19<211>38<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-EP的正向引子.<楊>19cccgaattccatatggtcgacatgggttctctcgacga38<210>20<211>42<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-EP的反向引子.<400>20gatgtactggtaggtagaagaagaaccaccagcaacaaagat42<210>21<211>42<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-EP的反向引子.<400>21gttgagttcacagatggtgaggttgtagatgtactggtaggt42<210>22<211>39<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-EP的反向引子.<400>22gtggttagacagccagtcggtaccgttgagttcacagat3932<210>23<211>38<212>DNA<213>人工合成<220><223>PQGAB-EP的反向引子.<400>23ttttttctcgagagcccagtcaaagtggttagacagcc38權(quán)利要求1、一種PE-PQGAB-K3融合蛋白，其包括一含有豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的ORF6部分序列，與PRRSVORF5部分序列的N端蛋白區(qū)；一綠膿桿菌外毒素A移位功能部位；以及一含KDEL-KDEL-KDEL(K3)序列的羧基終端部份。2、如權(quán)利要求l所述的融合蛋白，其中該P(yáng)RRSV為美洲株。3、如權(quán)利要求l所述的融合蛋白，其中該P(yáng)RRSV為歐洲株。4、如權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其中該P(yáng)RRSV的該ORF6部分序列為SEQIDN0.13。5、如權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其中該P(yáng)RRSVORF5部分序列為SEQIDNO,12。6、如權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其中該豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區(qū)的核酸序列為SEQIDNO.l。7、如權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其中該P(yáng)RRSV的該部分ORP6為SEQIDNO,15。8、如權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其中該P(yáng)RRSV的該部分ORF5為SEQIDNO.14。9、如權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其中該豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區(qū)的核酸序列為SEQIDNO.10。10、一種可作為疫苗的醫(yī)藥組合物，其包含一豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORP6及部分ORF5的N端融合蛋白區(qū)；一綠膿桿菌外毒素A移位功能部位；一含KDEL-KDEL-KDEL(KDEL3)序列的羧基終端部份；以及一藥學(xué)上可接受的載體。11、如權(quán)利要求10所述的醫(yī)藥組合物，其中該P(yáng)RRSV為美洲株。12、如權(quán)利要求10所述的醫(yī)藥組合物，其中該P(yáng)RRSV為歐洲株。13、如權(quán)利要求ll所述的醫(yī)藥組合物，其中該P(yáng)RRSV的該部分ORF6為SEQIDN0.13。14、如權(quán)利要求ll所述的醫(yī)藥組合物，其中該P(yáng)RRSV的該部分ORF5為SEQIDN0.12。15、如權(quán)利要求ll所述的醫(yī)藥組合物，其中該豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區(qū)的核酸序列為SEQIDNO.l。16、如權(quán)利要求12所述的醫(yī)藥組合物，其中該P(yáng)RRSV的該部分ORF6為SEQIDN0.15。17、如權(quán)利要求12所述的醫(yī)藥組合物，其中該P(yáng)RRSV的該部分ORF5為SEQIDN0.14。18、如權(quán)利要求12所述的醫(yī)藥組合物，其中該豬生殖和呼吸道征候群病毒(PRRSV)的部分ORF6及部分ORF5的N端融合蛋白區(qū)的核酸序列為SEQIDNO.IO。19、如權(quán)利要求10所述的醫(yī)藥組合物，其中該載體包含一福氏佐劑、乳化劑二縮甘露醇單油酸鹽(mannidemono-oleateemulsifier，ISA720，ISA206)佐劑。20、如權(quán)利要求15所述的醫(yī)藥組合物，其中該載體包含一ISA206佐劑。全文摘要本發(fā)明提供一種具中和力價(jià)融合蛋白組成的次單位PRRS疫苗，PE-PQGAB-K3，其由綠膿桿菌外毒素部位I(結(jié)合部位-轉(zhuǎn)位部位(II))架移PRRSVORF5及ORF6N-端與細(xì)胞接受器結(jié)合的PQGAB結(jié)構(gòu)勝肽，并于此融合蛋白羧基端添加一個(gè)KDEL-RDEL-KDEL(KEDL3)的訊碼。本發(fā)明PE-PQGAB-K3免疫在小鼠或豬只后所得的血清可抑制PRRSV在MAC-10A細(xì)胞的生長(zhǎng)及繁殖，其中和力價(jià)可達(dá)16至32。文檔編號(hào)C07K14/435GK101104641SQ20061009881公開日2008年1月16日申請(qǐng)日期2006年7月11日優(yōu)先權(quán)日2006年7月11日發(fā)明者廖朝,章修綱申請(qǐng)人:生寶生物科技股份有限公司