專利名稱：：從血漿或血漿組分中分離純化抗乙肝免疫球蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，是一種從血漿或血漿組分中分離純化抗乙肝免疫球蛋白的方法。技術(shù)背景慢性乙型肝炎已成為嚴重威脅人類健康的世界性疾病，也是我國目前流行最為廣泛，危害最為嚴重的一種傳染病。目前全世界有3.5億慢性乙肝病毒(HBV)攜帶者，我國HBV攜帶者達1.21億,占全國人口的9.75%。慢性乙肝患者約3000萬，每年死亡人數(shù)達30萬。而且，我國每年乙肝新發(fā)病人約50萬人，約占全國傳染病發(fā)病人數(shù)的1/4。目前全國每年用于肝病的防治費用高達1000多億元，給社會造成極大的負擔。在乙肝的預防和治療方面國家投入了大量的研究力量，抗乙肝免疫球蛋白在臨床應已用于肝移植手術(shù)和阻斷乙肝病毒母嬰兩個方面，并取得了很好的效果。肝移植后HBV的感染率可達到80%，再感染的患者病情進展迅速而且難以治療，預后極差。抗乙肝免疫球蛋白可以使乙肝復發(fā)的幾率降到30%左右，和其他藥物，如拉米夫定聯(lián)合使用，復發(fā)幾率可降低到20%。乙肝病毒表面抗原陽性和e抗原陽性的懷孕婦女，所生嬰兒乙肝病毒的感染率可高達88.1%，單項乙肝表面抗原陽性所生嬰兒乙肝病毒的感染率為38%。而且嬰兒旦感染乙肝病毒，他們中85%—90%會發(fā)展成慢性帶乙肝病毒狀態(tài)，其中25%于成年后將死于肝硬化和肝癌。臨床上應用抗乙肝免疫球蛋白，對新生兒的保護率可達86.65%。如果在出生后立即及生后一個月在注射乙肝疫苗的同時注射1支抗乙肝免疫球蛋白，則保護率可高達97.13%。因此，在肝移植手術(shù)和阻斷乙肝病毒母嬰傳播兩個方面，抗乙肝免疫球蛋白是非常重要的治療藥物?？挂腋蚊庖咔虻鞍椎闹苽涫怯媒?jīng)乙型肝炎表面抗原疫苗免疫的健康人血漿，經(jīng)提取、滅活病毒等步驟完成。藥物劑型一般為肌肉注射和靜脈注射兩種。目前我國市場上銷售的只有肌注型制劑，每瓶抗乙肝抗體效價約為200國際單位(IU)，濃度為50IU/ml，蛋白濃度約為18%。全國有四家血液制品廠正在開發(fā)靜注型制劑，每瓶2000IU，濃度為50IU/ml，蛋白濃度約為10%，預計2007年初可以投放市場。由于目前抗乙肝免疫球蛋白的制備是延用成熟的正常免疫球蛋白的純化工藝，只是增加了蛋白的濃縮倍數(shù)，沒有針對抗乙肝免疫球蛋白進行純化，因此，制劑只有小于1%的免疫球蛋白分子是抗乙肝表面抗原的，其余大部分免疫球蛋白都沒有抗乙肝效果。對于肝移植手術(shù)的病人，由于病人肝臟功能已經(jīng)很低，大量輸入這些沒有抗乙肝效果的免疫球蛋白有可能增加病人的負擔，對病人造成不良影響。在防止乙肝病毒母嬰傳播方面，大量輸入外源性免疫球蛋白對嬰兒的正常生長發(fā)育不利。閑此，開發(fā)純化的抗乙肝的免疫球蛋白制劑非常有必要。另外，由于血漿是一種特殊的稀缺資源，來源隨著人們生活水平的提高日益緊張。而且隨著血制品臨床廳量的進一步擴大，要采集經(jīng)過乙肝疫苗免疫后的特免血漿更加的困難。傳統(tǒng)的抗乙肝免疫球蛋白制造工藝要求原料混合血漿乙型肝炎表面抗體效價每毫升不得低于8IU。這使得大量效價低于8IU/ml但明顯高于普通血漿的血漿原料不能用做抗乙肝免疫球蛋白的制備，從而造成血漿原料的浪費，血漿資源的利用率大大降低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種從血漿或血漿組分中分離純化抗乙肝免疫球蛋白的方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是，該方法包含以下步驟A.從經(jīng)乙肝疫苗免疫過的獻血員采得的血漿中，篩選出抗乙肝免疫球蛋白效價不小于2IU/ml的血漿；B.以含有多糖類高分子親水性物質(zhì)為基質(zhì)，對基質(zhì)上羥基進行化學修飾引入高反應活性的小分子化學基團，得到層析基質(zhì)懸浮液；c.將含有抗原決定族的乙肝表面抗原溶液，加入到層析基質(zhì)懸浮液中進行偶聯(lián)，得到可用于純化抗乙肝免疫球蛋白的親和層析介質(zhì)；D.將步驟A中的血漿混合后經(jīng)冷乙醇沉淀得到含有丙種免疫球蛋白的組分(通常為組分II)，或直接以步驟A中的血漿作為生產(chǎn)純化抗乙肝免疫球蛋白的原料；E.以步驟C中的親和層析介質(zhì)，收集步驟D中的原料中的抗乙肝免疫球蛋白組分-,F.將純化后的抗乙肝免疫球蛋白濃縮后進行兩步病毒滅活，第一步為低pH條件下的孵化，第二歩為納米膜過濾，得到純化抗乙肝免疫球蛋白經(jīng)添加保護劑和灌裝，制成藥物制劑。所述的基質(zhì)是采用葡聚糖、瓊脂糖、或其它多孔性的多糖類高分子親水性物質(zhì)；或采用多孔剛性支撐、表面覆蓋為多糖類高分子親水性物的介質(zhì)。所述的高反應活性的小分子化學基團是溴化氰、環(huán)氧基團或巰基。在步驟C中，含有抗原決定簇的乙肝表面抗原(HbsAg)材料來源于基因工程重組方法，即從乙肝疫苗生產(chǎn)廠家或乙肝表面抗原試劑(所述的乙肝表面抗原是adr亞型，adw亞型，ayr亞型或ayw亞型中的-種或其組合)生產(chǎn)廠家獲得利用哺乳動物細胞或酵母菌表達乙肝表面大S抗原及S1,S2抗原的蛋白溶液進行透析、超濾、濃縮、緩沖液置換，調(diào)節(jié)pH至8.0—10.0、蛋白濃度每毫升1—IO毫克后，加入到歩驟B中的層析基質(zhì)懸浮液中進行偶聯(lián)；在4'C一4(TC溫度條件下，偶聯(lián)反應1一24小時后，乙肝表面抗原通過活化基團與層析基質(zhì)完成共價偶聯(lián)；洗滌去除游離、未參與偶聯(lián)的乙肝表面抗原，封閉多余未參與偶聯(lián)反應的活化基團，再對層析介質(zhì)進行穩(wěn)定化處理，得到可用于純化抗乙肝免疫球蛋白的親和層析介質(zhì)。純化抗乙肝免疫球蛋白的工藝是采用親和層析的方法，理論上對于原料血漿中的抗體最低效價沒有要求。但是，從實用的方面考慮，此項發(fā)明將乙肝抗體陽性且效價不低于2IU/ml的合格血漿作為原料，用一種親和層析的方法從這些血漿或其組分中來分離純化抗乙肝免疫球蛋白，將大大提高血槳的綜合利用率，并提供更安全高效的抗乙肝免疫球蛋白藥物。從經(jīng)乙肝疫苗免疫過的獻血員采得的血漿中，篩選出抗乙肝免疫球蛋白效價不小于2IU/ml的血漿。將篩選出的血漿混合后經(jīng)低溫乙醇法沉淀得到組分II，將組分II用pH7.0-pH8.0的緩沖溶液復溶，調(diào)節(jié)樣品溶液pH7.0—pH8.0后，上樣連接了基因工程乙肝表面抗原的親和層析柱。若血漿不經(jīng)低溫乙醇法沉淀，也可將血漿pH調(diào)至7.0-8.0后直接上樣親和層析柱。上樣流速為每分鐘0.5—100毫升，然后用pH2.0—pH5.0緩沖鹽溶液洗脫，收集抗乙肝免疫球蛋白組分。將純化后的抗乙肝免疫球蛋白濃縮到至蛋白濃度每毫升1一200毫克后進行兩個病毒滅活步驟。第一步為低pH條件下的孵化，即用濃度為1M的鹽酸將蛋白溶液得pH調(diào)至4.0，并在室溫孵化21天。然后用1M濃度的NaOH將pH回調(diào)至7.0-8.0。第二步病毒滅活為納米膜過濾，即使用Pali公司生產(chǎn)的DV50過濾膜進行過濾。兩步病毒滅活后的成品添加1%山梨醇和1%甘氨酸作為保護劑后，即可分裝為肌注和靜注兩種劑型的純化抗乙肝免疫球蛋白。本發(fā)明所用的制備親和介質(zhì)由基因工程方法制備的乙肝表面抗原以共價鍵方式連接在層析材料基質(zhì)上而成，具有安全性好、親和力高的特點。而且，由于基因工程乙肝表面抗原具有多抗原決定簇，可以免疫吸附多克隆的抗乙肝丙種免疫球蛋白。最終獲得的抗乙肝免疫球蛋白在功能上與從傳統(tǒng)血漿級分工藝制備的抗乙肝免疫球蛋白基本保持一致，具有很高的純度和抗體效價。本發(fā)明通過用親和層析的方法從血漿或其組分中來分離純化抗乙肝免疫球蛋白，將大大提高血漿的綜合利用率，并提供更安全高效的抗乙肝免疫球蛋白藥物。具體實施例方式實施例1親和層析介質(zhì)的制備層析介質(zhì)的基質(zhì)可采用葡聚糖、瓊脂糖、或其它多孔性的多糖類高分子親水性物質(zhì)；或采用多孔剛性支撐、表面覆蓋為多糖類高分子親水性物的介質(zhì)。通過控制化學反應條件，對基質(zhì)上羥基進行化學修飾引入高反應活性的小分子化學基團溴化氰、環(huán)氧基團或巰基等。洗滌去除未反應完全的小分子化學基團，穩(wěn)定反應活性基團后，完成對層析介質(zhì)基質(zhì)的化學活化。含有抗原決定簇的乙肝表面抗原(HbsAg)材料來源于基因工程重組方法，即從乙肝疫苗生產(chǎn)廠家或乙肝表面抗原試劑生產(chǎn)廠家獲得利用哺乳動物細胞或酵母菌表達乙肝表面大S抗原及S1,S2抗原的蛋白溶液進行透析、超濾、濃縮、緩沖液置換，調(diào)節(jié)pH8.0—10.0、蛋白濃度每毫升1一10毫克后，加入到活化好的層析基質(zhì)懸浮液中進行偶聯(lián)。在4。C一4(TC溫度條件下，偶聯(lián)反應1一24小時后，乙肝表面抗原通過活化基團與層析基質(zhì)完成共價偶聯(lián)。洗滌去除游離、未參與偶聯(lián)的乙肝表面抗原，封閉多余未參與偶聯(lián)反應的活化基團，再對層析介質(zhì)進行穩(wěn)定化處理，得到可用于純化抗乙肝免疫球蛋白的親和層析介質(zhì)。實施例2組分n親和層析分離抗乙肝免疫球蛋白蛋白含量為18.2%的組分11樣品畫ml，加入100mlpH7.4的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩沖溶液稀釋均勻，作為親和層析純化前樣品?；蚬こ桃腋伪砻婵乖H和層析柱50ml經(jīng)pH7.4的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩沖溶液平衡5個柱體積，上樣組分II稀釋液200ml，收集穿透峰300ml。上樣完畢后，用磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩沖溶液淋洗至基線。采用pH2.5的甘氨酸/鹽酸緩沖溶液洗脫抗乙肝免疫球蛋白，收集洗脫抗乙肝免疫球蛋白組分峰80ml。從乙肝抗體活性試驗結(jié)果(表一)可以看出，組分n經(jīng)親和層析純化后抗乙肝免疫球蛋白回收率接近100%，抗乙肝免疫球蛋白比活性被提高274倍(表二)。因此，新的純化工藝達到并超過技術(shù)設(shè)計要求。表一、酶標法對倍稀釋活性檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例3血衆(zhòng)親和層析分離抗乙肝免疫球蛋白抗乙肝活性為8IU/ml的血漿樣品2000ml，加入2000mlpH7.4的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩沖溶液稀釋均勻，作為親和層析純化前樣品?；蚬こ桃腋伪砻婵乖H和層析柱50ml經(jīng)pH7.4的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩沖溶液平衡5個柱體積，上樣血漿樣品稀釋液4000ml，收集穿透峰4150ml。上樣完畢后，用磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩沖溶液淋洗至基線。采用pH2.5的甘氨酸/鹽酸緩沖溶液洗脫抗乙肝免疫球蛋白，收集洗脫抗乙肝免疫球蛋白組分峰94ml。從乙肝抗體活性檢測結(jié)果(表三)可以看出，活性為8IU/ml的血漿樣品經(jīng)親和層析純化后抗乙肝免疫球蛋白回收率接近95%(表四)。因此，新的純化工藝達到并超過技術(shù)設(shè)計要求。表三、酶標法對倍稀釋活性檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表四、活性單位比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>以上對本發(fā)明所提供的從血漿或血漿組分中分離純化抗乙肝免疫球蛋白的方法進行了詳細介紹，本文中應用了具體個例對本發(fā)明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時，對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實施方式及應用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應理解為對本發(fā)明的限制。權(quán)利要求1.一種從血漿或血漿組分中分離純化抗乙肝免疫球蛋白的方法，其特征在于，包含以下步驟A.從經(jīng)乙肝疫苗免疫過的獻血員采得的血漿中，篩選出抗乙肝免疫球蛋白效價不小于2IU/ml的血漿；B.以含有多糖類高分子親水性物質(zhì)為基質(zhì)，對基質(zhì)上羥基進行化學修飾引入高反應活性的小分子化學基團，得到層析基質(zhì)懸浮液；C.將含有抗原決定族的乙肝表面抗原溶液，加入到層析基質(zhì)懸浮液中進行偶聯(lián)，得到可用于純化抗乙肝免疫球蛋白的親和層析介質(zhì)；D.將步驟A中的血漿混合后經(jīng)冷乙醇沉淀得到含有丙種免疫球蛋白的組分，或直接以步驟A中的血漿作為生產(chǎn)純化抗乙肝免疫球蛋白的原料；E.以步驟C中的親和層析介質(zhì)，收集步驟D中的原料中的抗乙肝免疫球蛋白組分；F.將純化后的抗乙肝免疫球蛋白濃縮后進行兩步病毒滅活，第一步為低pH條件下的孵化，第二步為納米膜過濾，得到純化抗乙肝免疫球蛋白經(jīng)添加保護劑和灌裝，制成藥物制劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從血漿或血漿組分中分離純化抗乙肝免疫球蛋白的方法，其特征在于所述的基質(zhì)是采用葡聚糖、瓊脂糖、或其它多孔性的多糖類高分子親水性物質(zhì)；或采用多孔剛性支撐、表面覆蓋為多糖類高分子親水性物的介質(zhì)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從血漿或血漿組分中分離純化抗乙肝免疫球蛋白的方法，其特征在于所述的高反應活性的小分子化學基團是溴化氰、環(huán)氧基團或巰基。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從血漿或血漿組分中分離純化抗乙肝免疫球蛋白的方法，其特征在于在步驟C中，含有抗原決定簇的乙肝表面抗原HbsAg材料來源于基因工程重組方法，是從乙肝疫苗生產(chǎn)廠家或乙肝表面抗原試劑生產(chǎn)廠家獲得利用哺乳動物細胞或酵母菌表達乙肝表面大S抗原及S1,S2抗原的蛋白溶液；所述的乙肝表面抗原是adr亞型，adw亞型，ayr亞型或ayw亞型中的一種或其組合。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從血漿或血漿組分中分離純化抗乙肝免疫球蛋白的方法，其特征在于在步驟C中，含有抗原決定族的乙肝表面抗原HbsAg溶液進行透析、超濾、濃縮、緩沖液置換，調(diào)節(jié)pH至8.0—10.0、蛋白濃度每毫升1一10毫克后，加入到步驟B中得到的層析基質(zhì)懸浮液屮進行偶聯(lián)；在4。C一4(TC溫度條件下，偶聯(lián)反應l一24小時后，乙肝表面抗原通過活化基團與層析基質(zhì)完成共價偶聯(lián)；洗滌去除游離、未參與偶聯(lián)的乙肝表面抗原，封閉多余未參與偶聯(lián)反應的活化基團，再對層析介質(zhì)進行穩(wěn)定化處理，得到可用于純化抗乙肝免疫球蛋白的親和層析介質(zhì)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從血漿或血槳組分中分離純化抗乙肝免疫球蛋白的方法，其特征在于在步驟D中，用來分離純化抗乙肝免疫球蛋白的原料為從乙肝疫苗免疫過的人群中采得的效價不小于2IU/ml的血槳，或者是該血漿經(jīng)低溫乙醇法制備的含有丙種免疫球蛋白的組分。全文摘要本發(fā)明公開了從血漿或血漿組分中分離純化抗乙肝免疫球蛋白的方法。該方法是將篩選出抗乙肝免疫球蛋白效價不小于2IU/ml的血漿并進行混合；對多糖類高分子親水性物質(zhì)基質(zhì)上的羥基引入高反應活性的小分子化學基團，得到層析基質(zhì)懸浮液；將含有抗原決定簇的乙肝表面抗原溶液，加入到層析基質(zhì)懸浮液中進行偶聯(lián)，得到親和層析介質(zhì)；將混合血漿經(jīng)低溫乙醇法得到的含有丙種免疫球蛋白的組分，或直接以血漿作為生產(chǎn)純化抗乙肝免疫球蛋白的原料；利用親和層析介質(zhì)，收集抗乙肝免疫球蛋白組分；將純化后的抗乙肝免疫球蛋白濃縮后進行兩步病毒滅活，加入穩(wěn)定劑后灌裝，得到純化抗乙肝免疫球蛋白藥用制劑。該方法的抗乙肝免疫球蛋白回收率接近100％。文檔編號C07K1/36GK101113177SQ20061009926公開日2008年1月30日申請日期2006年7月25日優(yōu)先權(quán)日2006年7月25日發(fā)明者許賢豪申請人:許賢豪