專利名稱：一種促血管生成素-2單體型抗體的制備及應(yīng)用技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
免疫檢測技術(shù) 技術(shù)背景
血管生成素(angiopoietin， ANP)是參與腫瘤血管生成的一組主要細(xì)胞因子， 對(duì)調(diào)控新生血管的形成，維持血管管腔的穩(wěn)定性具有重要作用。目前發(fā)現(xiàn)的ANP有 四種，分別為ANP-1 、 ANP-2、 ANP-3和ANP-4，其中研究得較為清楚的是ANP-1和 ANP-2，而對(duì)ANP-3和ANP-4的了解不多。ANP-1由498個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，分 子量為70KD，廣泛分布于全身各器官和組織的血管平滑肌。ANP-2是由496個(gè)氨基 酸組成的糖蛋白，分子量約為75KD,與ANP-1的同源性為60%。 ANP-2主要在腫瘤 組織和瘤旁組織表達(dá)，位于腫瘤侵襲的最前沿，被認(rèn)為是腫瘤血管生成的早期分子 標(biāo)志。ANP-1和ANP-2通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的酪氨酸激酶受體一一Tie-2結(jié)合而產(chǎn) 生生物學(xué)作用。ANP-1能引起Tie-2的活化，促進(jìn)血管周圍支持細(xì)胞(平滑肌細(xì)胞) 與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，維持血管的成熟和穩(wěn)定。ANP-2與Tie-2的親和力更高，但不 激活Tie-2，有拮抗ANP-1的作用。胂瘤及癌旁組織高表達(dá)ANP-2，新生血管完整性 降低、通透性增高，與血管的遷移及腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。檢測血清中ANP-1 和ANP-2的水平有助于早期診斷惡性腫瘤，判斷轉(zhuǎn)移與否，評(píng)價(jià)治療效果。
ANP-1和ANP-2主要以聚合體的形式存在。ANP-1多數(shù)形成多聚體，少數(shù)形成三 聚體。ANP-2則更易形成二聚體，少數(shù)形成多聚體。以生理性的ANP-1和ANP-2蛋
白免疫動(dòng)物制備單克隆抗體往往產(chǎn)生空間構(gòu)象抗體，即針對(duì)多聚體或二聚體空間構(gòu) 象表位的抗體。以這種抗體通過免疫學(xué)方法來檢測ANP-1和ANP-2等蛋白含量，會(huì) 把多聚體或二聚體作為一個(gè)分子，在定量上出現(xiàn)偏差。而如果采用針對(duì)線性抗原的 抗體來檢測ANP-1和ANP-2等易形成聚合體的蛋白，會(huì)特異性識(shí)別每一個(gè)ANP-1分 子，定量的準(zhǔn)確性會(huì)大大提高。在理論上，檢測的靈敏度也會(huì)有所提高。因此，有 必要探討制備ANP-1和MP-2等聚合體蛋白單體抗體的方法。

發(fā)明內(nèi)容
此專利技術(shù)描述了一種促血管生成素2 (ANP-2)線性單體抗體的技術(shù)方法及其 臨床應(yīng)用?；驹硎堑鞍踪|(zhì)在酸性環(huán)境下會(huì)發(fā)生溫和的變性，蛋白聚合體會(huì)分 離成為游離單體。用酸性緩沖液溶解ANP-2蛋白，使之變成線性單體，然后再先后 與福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑混合，免疫接種小鼠、大鼠、兔子、羊等動(dòng)物， 制備多克隆抗體或單克隆抗體。生產(chǎn)的多抗或單抗簡單純化后，用于定量檢測血清 中ANP-2的含量，作為臨床上惡性腫瘤早期診斷、轉(zhuǎn)移判斷及治療效果評(píng)價(jià)的指標(biāo)。 具體的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)路線如下
(1) 抗原準(zhǔn)備從國內(nèi)外生物醫(yī)藥公司購買ANP-2蛋白凍干粉，或利用原核細(xì)胞 表達(dá)系統(tǒng)或真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組ANG-2蛋白，常規(guī)方法純化目的蛋白 后，-2(TC凍存?zhèn)溆茫?br> (2) 用甘氨酸緩沖液(200mM甘氨酸、0. 2% Towen-20， PH3. 2 )溶解ANP-2蛋白,
破壞其聚合體結(jié)構(gòu)，使之形成游離線性單體；
(3) 取一定量(0. 01 - lmg) ANP-2蛋白溶液與等體積的福氏完全佐劑充分混合形 成粘稠乳液；
(4) 選取健康小鼠、大鼠、兔子、羊等動(dòng)物，根據(jù)動(dòng)物的體重，以1.0ml/Kg動(dòng)物 的劑量頸背部皮下多點(diǎn)注射ANP-2蛋白溶液與福氏完全佐劑混合乳液，免疫
動(dòng)物；
(5) 3-4周后，取一定量(0. 01-lmg) MP-2蛋白溶液與等體積的福氏不完全佐 劑充分混合形成粘稠乳液，以1.0ml/Kg動(dòng)物的劑量，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物頸背部皮下 多點(diǎn)注射ANP-2蛋白溶液與福氏不完全佐劑混合液加強(qiáng)免疫；
(6) 再過3-4周后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物頸背部皮下多點(diǎn)注射相同劑量的ANP-2蛋白溶液與
福氏不完全佐劑混合液加強(qiáng)免疫；
(7) 1-2周后取動(dòng)物外周血0. 5-l.Oml，用純化抗原免疫吸附法(EIA)測定免疫 動(dòng)物血清抗體滴度；
(8) 如果免疫動(dòng)物血清抗體滴度超過l: 16000,則處死動(dòng)物。如果是制備多克隆 抗體，則采用頸動(dòng)脈插管方法采取免疫動(dòng)物血清；如果要制備單克隆抗體， 則取出脾臟，分離脾細(xì)胞；
(9) 多克隆抗體采用辛酸-硫酸銨方法純化抗體。調(diào)節(jié)抗體滴度為1: 10'， 4-8 'C保存；
(10) 單克隆抗體的制備:取免疫BABL/c小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞融合 的方法，有限稀釋法分離并鑒定分泌抗ANP-2抗體的雜交瘤細(xì)胞；
(11) 選用8-10個(gè)抗體滴度較高的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng),用分型抗體鑒定單克隆抗 體的亞型；竟?fàn)幰种品ㄨb定抗體與ANP-2的親和力；根據(jù)ANP-2的線性表位 分析，人工合成典型表位多肽序列，分析各個(gè)單克隆抗體主要結(jié)合哪種線性 表位；
(12) 與ANP-1、 ANP-3、 ANP-4及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子
(PDGF)、血管生成素(angiogenin)等蛋白質(zhì)交叉結(jié)合實(shí)驗(yàn)，分析親和力較 高的幾個(gè)單克隆抗體的特異性；
(13) 單克隆抗體的規(guī)模生產(chǎn)采用雜交瘤細(xì)胞小鼠腹腔注射,誘導(dǎo)產(chǎn)生腹水的方法。 抗體的純化采用辛酸-硫酸銨沉淀方法。
(14) 選用4-5個(gè)特異性較高的單抗兩兩組合，其中一個(gè)包被在微孔板上， 一個(gè)作 為檢測抗體，雙抗體夾心ELISA法用于ANP-2定量檢測，綜合分析哪兩種抗 體組合檢測ANP-2的靈敏度較髙，而且特異性較好。用于制備ANP-2ELISA檢 測試劑盒；
(15) 選用親和力及特異性好的幾個(gè)抗體與粒徑為0.2(jm的氨基化聚苯乙烯微球 交聯(lián)，交聯(lián)劑為1.25%的戊二醛，IOOKD超濾膜分離純化抗體交聯(lián)微球，用 于制備ANP-2免疫比濁定量檢測試劑盒；
(16) 對(duì)上述試劑盒進(jìn)行臨床考核臨床選取正常人血清及惡性腫瘤患者血清各 500份，用上述ANP-2 ELISA檢測試劑盒或免疫比濁定量檢測試劑盒檢測正 常人血清及惡性腫瘤患者血清中ANP-2的含量，用梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)ANP-2制 作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。
總之，本發(fā)明介紹了一種對(duì)ANP-2等存在聚合體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行酸處理，使
之成為游離單體抗原，用于制備ANP-2單體型抗體的技術(shù)方法。采用酸性甘氨酸緩 沖液對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酸化處理，可以破壞ANP-2的聚合體結(jié)構(gòu)，使之變成游離單體， 但不會(huì)影響ANP-2的免疫學(xué)活性和生物學(xué)活性。用單體型抗原免疫動(dòng)物，獲得的抗 體極大多數(shù)是針對(duì)ANP-2線性表位的抗體，可以提高ANP-2定量檢測的準(zhǔn)確性，并 在一定程度上提高檢測的靈敏度。我們已經(jīng)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示，此法制備的多抗和單 抗92%以上是針對(duì)ANP-2線性抗原表位的抗體。如果對(duì)待測ANP-2采用我們的另一 項(xiàng)發(fā)明技術(shù)(已申請(qǐng))，即樣品酸性預(yù)處理使之形成游離單體技術(shù)，則可以進(jìn)一步提 高ANP-2免疫檢測的靈敏度。
實(shí)現(xiàn)方式
采用本技術(shù)方法制備的ANP-2單體型多克隆抗體或單克隆抗體可用于生產(chǎn) ANP-2免疫檢測試劑盒，如ELISA檢測試劑盒、免疫比濁定量檢測試劑盒和發(fā)射免 疫及熒光免疫檢測試劑盒，用于臨床或科學(xué)研究中定量檢測ANP-2含量，適用于惡 性腫瘤皁期診斷，轉(zhuǎn)移判斷及療效評(píng)價(jià)。
此外，上述技術(shù)方法同樣適用于具有聚合體結(jié)構(gòu)的其它蛋白單體型抗體的制備， 用于臨床免疫學(xué)檢測及科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明技術(shù)涉及一種對(duì)ANP-2等存在聚合體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行酸處理，使之成為游離單體抗原，用于制備ANP-2單體型抗體的技術(shù)方法。其主要特征是采用酸性緩沖液對(duì)ANP-2蛋白質(zhì)進(jìn)行酸化處理，破壞聚合體結(jié)構(gòu)，使之變成游離單體，用單體型抗原免疫動(dòng)物，獲得針對(duì)ANP-2線性表位的單體型抗體，制備的抗體可用于生產(chǎn)ANP-2免疫學(xué)檢測試劑盒，用于ANP-2的檢測，適用于惡性腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷及療效評(píng)價(jià)。
2. 權(quán)利要求l所述的發(fā)明技術(shù)，其特征是酸性緩沖液的化學(xué)成分可以是甘氨 酸、檸檬酸、乙酸等各種酸性緩沖物質(zhì)，都可以達(dá)到預(yù)期的提高血清特異 性生長因子免疫學(xué)測定靈敏度效果。
3..權(quán)利要求l所述的發(fā)明技術(shù)，其特征是酸化處理ANP-2蛋白的酸性緩沖液在 低鹽的條件下ANP-2的聚合體結(jié)構(gòu)，使其變成游離單體，利于制備單體型抗 體。
4. 權(quán)利要求l所述的發(fā)明技術(shù)，其特征是酸性緩沖液樣品預(yù)處理技術(shù)方法同樣 適用于其他存在聚合體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的單體型抗體制備，應(yīng)用于臨床診斷 及科研檢測。
5. 權(quán)利要求l所述的發(fā)明技術(shù)，其特征是ANP-2蛋白酸性緩沖液處理技術(shù)同樣 適用于科學(xué)研究對(duì)ANP-2蛋白及其他有聚合體結(jié)構(gòu)蛋白的抗體制備及免疫 學(xué)測定。
全文摘要
本發(fā)明技術(shù)介紹了一種對(duì)ANP-2等存在聚合體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行酸處理，使之成為游離單體抗原免疫動(dòng)物，制備ANP-2單體型抗體的技術(shù)方法。其主要內(nèi)容是采用甘氨酸酸性緩沖液對(duì)ANP-2蛋白質(zhì)進(jìn)行酸化處理，破壞聚合體結(jié)構(gòu)，使之變成游離單體。用單體型抗原免疫動(dòng)物，獲得針對(duì)ANP-2線性表位的單體型抗體。制備的抗體可用于生產(chǎn)ANP-2免疫學(xué)檢測試劑盒，用于ANP-2的檢測，適用于惡性腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷及療效評(píng)價(jià)。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101100485SQ20061010106
公開日2008年1月9日 申請(qǐng)日期2006年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月7日
發(fā)明者曾位森, 虹 王 申請(qǐng)人:曾位森;王 虹