專利名稱：用于鼻咽癌篩查、診斷和治療效果預(yù)測的elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及含有EB病毒裂解復(fù)制期立即早期基因BRLF1部分序列基因工程菌株的建立，其中兩種重組質(zhì)粒表達(dá)蛋白的純化、其單克隆抗體的制備及應(yīng)用。

背景技術(shù)：
EB病毒是一種γ皰疹病毒，全球接近95％的成人感染有該病毒。EB病毒感染可分為潛伏感染期和裂解復(fù)制期兩種狀態(tài)，在初次感染后，該病毒可在宿主體內(nèi)建立起終身潛伏感染，持續(xù)性的EB病毒裂解復(fù)制狀態(tài)感染可導(dǎo)致一系列的人類惡性腫瘤(Rickinson AB，Lee SP，Steven NM.Cytotoxic T lymphocyte responses to Epstein-Barr virus.Curr Opin Immunol.1996 Aug；8(4)492-7)。BRLF1基因位于EB病毒基因組ORF50，是EB病毒進(jìn)入裂解復(fù)制狀態(tài)早期表達(dá)的立即早期基因。BRLF1基因編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白Rta(又稱EB1)，長度為1818bp。有研究表明BRLF1基因能夠在B淋巴細(xì)胞以及上皮細(xì)胞中有效的激活EB病毒進(jìn)入裂解復(fù)制狀態(tài)(Zalani S，Holley-Guthrie E，Kenney S.Epstein-Barr viral latency is disrupted by theimmediate-early BRLF1 protein through a cell-specific mechanism.Proc NatlAcad Sci U S A.1996 Aug 20；93(17)9194-9；Ragoczy T，Heston L，Miller G.The Epstein-Barr virus Rta protein activates lytic cycle genes and can disruptlatency in B lymphocytes.J Virol.1998 Oct；72(10)7978-84)。Rta蛋白可以激活多種病毒基因的啟動子，如BMLF1，BaRF1，BALF5等(Ragoczy T，Heston L，Miller G.The Epstein-Barr virus Rta protein activates lytic cyclegenes and can disrupt latency in B lymphocytes.J Virol.1998Oct；72(10)7978-84)。因此由BRLF1基因表達(dá)的Rta蛋白是EB病毒進(jìn)入裂解復(fù)制狀態(tài)必需的激活元件。
EB病毒終生在口咽部產(chǎn)生并通過口腔傳染，初始感染可引起傳染性單核細(xì)胞增多癥，多發(fā)于兒童和年輕成人。經(jīng)多年研究發(fā)現(xiàn)EB病毒與鼻咽癌、胃癌、肺癌以及一系列常見淋巴瘤均有相關(guān)。其中鼻咽癌與EB病毒關(guān)系最為密切，近年來通過對腫瘤上皮細(xì)胞中的病毒基因組與抗原的檢測證實(shí)了二者的密切相關(guān)性(zur Hausen H，Schulte-Holthausen H，Klein G，Henle W，Henle G，Clifford P，Santesson L.EBV DNA in biopsies of Burkitttumours and anaplastic carcinomas of the nasopharynx.Nature.1970 Dec12；228(5276)1056-8；Yeung WM，Zong YS，Chiu CT，Chan KH，Sham JS，Choy DT，Ng MH.Epstein-Barr virus carriage by nasopharyngeal carcinoma insitu.Int J Cancer.1993 Mar 12；53(5)746-50)。鼻咽癌是東南亞地區(qū)常見腫瘤，與食道癌、肝癌并稱中國三大腫瘤，且高發(fā)于我國南方數(shù)省，在南方各種惡性腫瘤中占第一位。對于EB病毒相關(guān)腫瘤控制的主要策略為1、早期檢測診斷后進(jìn)行治療，2、將疾病的發(fā)生理想的推遲至平均壽命之外，3、預(yù)防。由于EB病毒無法單獨(dú)在體外培養(yǎng)，而大量細(xì)胞培養(yǎng)以及純化帶來的困難和不安全因素使直接從形態(tài)學(xué)檢測EB病毒很難在臨床上實(shí)現(xiàn)，更無法應(yīng)用于大規(guī)模篩查工作。因此早期診斷多應(yīng)用病毒特異性的抗原、抗體或遺傳物質(zhì)對EB病毒相關(guān)腫瘤進(jìn)行早期診斷是目前控制EB病毒相關(guān)腫瘤行之有效的方法，現(xiàn)在診斷EB病毒相關(guān)疾病的主要指標(biāo)為EB病毒殼抗原(VCA)、早期抗原(EA)、核抗原(EBNA)、及其抗體。其中EBNA1在EB病毒潛伏期和裂解期均有表達(dá)，而VCA與EA雖然在鼻咽癌(Nasopharngeal carcinoma)(NPC)病人中檢出率高，但其特異性不好，在健康人群中仍有較高的檢出率。因此選擇靈敏度與特異性好的檢測指標(biāo)是現(xiàn)在本研究領(lǐng)域急需解決的問題之一。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述本領(lǐng)域急需解決的問題，利用EB病毒裂解復(fù)制期立即早期基因BRLF1的生物學(xué)特性，提供了具有高靈敏度和特異性的，可應(yīng)用于診斷EB病毒相關(guān)疾病以及大規(guī)模人群篩查的新型檢測指標(biāo)及方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案為 提供2種重組有部分EB病毒裂解復(fù)制期立即早期基因BRLF1序列的質(zhì)粒。提供兩種由重組質(zhì)粒pGEX-R185與pGEX-R150表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，通過對序列進(jìn)行軟件抗原性分析獲得上述兩種蛋白質(zhì)分子含有大部分由BRLF1基因編碼Rta蛋白的表面抗原決定簇。將重組質(zhì)粒pGEX-R185與pGEX-R150轉(zhuǎn)染至大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)，純化后獲得GST-R185和GST-R150融合蛋白。該融合蛋白可以單獨(dú)或組合用于EB病毒抗體的檢測。
技術(shù)效果使用GST-R185和GST-R150融合蛋白分別及混合作為抗原以一定濃度包被ELISA反應(yīng)板，檢測抽取自人體的未抗凝靜脈血血清中EBV BRLF1蛋白的抗體，檢測鼻咽癌病人血清和正常人群血清。使用GST-R185蛋白與GST-R150蛋白的等比混合物作為診斷抗原組合進(jìn)行ELISA檢測后，鼻咽癌病人的陽性檢出率，即靈敏度為94％；正常人群檢測的陰性率為92.7％，均高于常規(guī)使用的EBNA、EA、VCA抗體的檢測。這兩種蛋白質(zhì)分子為鼻咽癌診斷提供新的高特異性的檢測指標(biāo)。因此，本檢測試劑盒適用于對鼻咽癌病人進(jìn)行輔助診斷以及正常人群的大規(guī)模篩查之用。
更詳細(xì)地，本發(fā)明提供下列各項 1.一種含有EB病毒抗原決定簇的抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO3或SEQ ID NO4所示。
2.一種含有EB病毒抗原決定簇的融合抗原蛋白，其含有如SEQ IDNO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)以上2的融合抗原蛋白，其為GST融合蛋白。
4.編碼以上1的抗原蛋白的核苷酸序列。
5.根據(jù)以上4的核苷酸序列，如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示。
6.含有根據(jù)以上4或5的核苷酸序列的重組質(zhì)粒，優(yōu)選為pGEX-R185或pGEX-R150。
7.一種鼻咽癌診斷試劑，其含有根據(jù)以上1-3中任何一項的抗原蛋白。
8.一種用于檢測EB病毒抗體的組合診斷試劑，其包含 1)氨基酸序列如SEQ ID NO3所示的抗原蛋白或含有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的融合抗原蛋白；和 2)氨基酸序列如SEQ ID NO4所示的抗原蛋白或含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的融合抗原蛋白。
9.一種用于鼻咽癌診斷的試劑盒，其包括根據(jù)以上7或8的診斷試劑。
10.一種體外檢測EB病毒的方法，包括以下步驟 (1)使用以上7或8所述的診斷試劑包被ELISA反應(yīng)孔板； (2)洗凈反應(yīng)孔板，用封閉液封閉； (3)洗凈反應(yīng)孔板，加入待測血清并孵育； (4)洗凈反應(yīng)孔板，加入標(biāo)記二抗； (5)洗凈反應(yīng)孔板，通過二抗相應(yīng)檢測方法判定結(jié)果。
更具體地，本發(fā)明包括以下內(nèi)容 1.一種含有EB病毒裂解狀態(tài)早期基因BRLF1部分序列的質(zhì)粒，其特征在于它具有附圖1所述B95-8細(xì)胞源EB病毒BRLF1基因序列中514～1068bp的堿基序列，并重組于pGEX-5X-3質(zhì)粒中。
2.一種含有EB病毒裂解狀態(tài)早期基因BRLF1部分序列的質(zhì)粒，其特征在于它具有附圖1所述B95-8細(xì)胞源EB病毒BRLF1基因序列中1153～1603bp的堿基序列，并重組于pGEX-5X-3質(zhì)粒中。150 3.一種適用于EB病毒相關(guān)疾病診斷的含有EB病毒抗原決定簇的重組蛋白，其特征在于由權(quán)利要求書1所述質(zhì)粒的堿基序列所編碼的GST融合蛋白。
4.一種適用于EB病毒相關(guān)疾病診斷的含有EB病毒抗原決定簇的重組蛋白，其特征在于由權(quán)利要求書2所述質(zhì)粒的堿基序列所編碼的GST融合蛋白。
5.一種以上1所述重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于依次包括以下步驟 將用TPA刺激過的B95-8細(xì)胞株內(nèi)感染的EBV基因組進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得BRLF1全長序列； 將上述BRLF1基因序列用末端補(bǔ)平連接法與質(zhì)粒載體重組； 轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)菌中擴(kuò)增，篩選含有插入片段的陽性克??； 限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析陽性克隆，篩選出含有插入片段順序正確的質(zhì)粒的陽性克隆； 以所得陽性克隆所含重組質(zhì)粒為模板，用PCR法擴(kuò)增獲得位置為514～1818bp的堿基序列。測序法檢測序列的正確性； 將上述獲得的堿基序列用末端補(bǔ)平連接法與質(zhì)粒載體重組； 轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)菌中擴(kuò)增，篩選含有插入片段順序正確的陽性克??； 限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析陽性克隆，篩選出含有插入片段順序正確的陽性克?。? 以所述重組質(zhì)粒為模板，用限制性內(nèi)切酶酶切法獲得位置為514～1068bp的堿基序列。測序法驗證序列的正確性； 將上述獲得的堿基序列用末端補(bǔ)平連接法與表達(dá)型質(zhì)粒載體重組； 轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)菌中擴(kuò)增，篩選含有插入片段的陽性克??； 限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析陽性克隆，篩選出含有插入片段順序正確的陽性克??； 獲得陽性克隆中所含質(zhì)粒即為以上1所述質(zhì)粒。
6.一種以上2所述重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于依次包括以下步驟 將用TPA刺激過的B95-8細(xì)胞株內(nèi)感染的EBV基因組進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得BRLF1全長序列。
以所得BRLF1全長為模板，用PCR法擴(kuò)增獲得位置為1153～1818bp的堿基序列。測序法檢測序列的正確性。
將上述獲得的堿基序列用末端補(bǔ)平連接法與質(zhì)粒載體重組。
轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)菌中擴(kuò)增，篩選含有插入片段順序正確的陽性克隆。
限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析陽性克隆，篩選出含有插入片段順序正確的陽性克隆。
以所述重組質(zhì)粒為模板，用限制性內(nèi)切酶酶切法獲得位置為1153～1068bp的堿基序列。測序法驗證序列的正確性。
將上述獲得的堿基序列用末端補(bǔ)平連接法與表達(dá)型質(zhì)粒載體重組。
轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)菌中擴(kuò)增，篩選含有插入片段的陽性克隆。
限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析陽性克隆，篩選出含有插入片段順序正確的陽性克隆。
獲得陽性克隆中所含質(zhì)粒即為以上2所述質(zhì)粒。
7.根據(jù)以上3、4所述的適用于EB病毒相關(guān)疾病診斷的含有EB病毒抗原決定簇的蛋白的制備方法，其特征在于 (1)制備重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染所用工程菌的具體步驟 A、制備感受態(tài)細(xì)菌。
B、將以上1、2所述的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌的細(xì)胞中。
C、通過Amp抗性培養(yǎng)平皿篩選轉(zhuǎn)染成功的工程菌。
(2)上述適用于EB病毒相關(guān)疾病診斷的含有EB病毒抗原決定簇的蛋白表達(dá)與純化的具體步驟 A、將含有重組質(zhì)粒的工程菌接種于Amp抗性的培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。
B、加入適用于該工程菌的蛋白表達(dá)誘導(dǎo)試劑。
C、收集高效表達(dá)的工程菌菌落，進(jìn)行破菌處理后獲得以上4、5所述蛋白的粗提物， D、用Glutahione Sepharose 4B或親和層析柱對上述粗提物進(jìn)行純化。獲得以上4、5所述蛋白質(zhì)。
E、測定含有重組質(zhì)粒的工程菌的表達(dá)效率。
8.一種用于檢測EB病毒抗體的診斷抗原組合，其特征在于含有至少一種以上3、4所述重組蛋白。
9.一種用于檢測EB病毒抗體，診斷EB病毒相關(guān)疾病的檢測方法，其特征在于使用以上8所述的診斷抗原組合通過ELISA法檢測EB病毒抗體。其特征在于依次包括以下步驟 (1)使用以上8所述診斷抗原組合包被ELISA反應(yīng)孔板。
(2)洗凈反應(yīng)孔板，用封閉液封閉。
(3)洗凈反應(yīng)孔板，加入待測血清，37℃孵育至少30分鐘。
(4)洗凈反應(yīng)孔板，加入標(biāo)記二抗。
(5)洗凈反應(yīng)孔板，通過二抗相應(yīng)檢測方法判定結(jié)果。
本發(fā)明公開了一種以鼻咽癌特異基因BRLF1的蛋白產(chǎn)物Rta為抗原，用于鼻咽癌篩查、早期診斷和治療效果預(yù)測的ELISA試劑盒NPC-TARCINETM。試劑盒內(nèi)設(shè)有Rta抗原檢測板，酶結(jié)合物工作液，陽性對照，陰性對照，樣品稀釋液，10×濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液，其中，抗原檢測板為吸附兩個特異性基因重組Rta抗原(GST-R185和GST-R150)的可拆96孔酶標(biāo)板，酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗人IgG，陽性對照Rta抗體陽性的血清，陰性對照為牛血清白蛋白溶液。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為簡單，敏感，特異，適用于鼻咽癌的早期診斷和預(yù)后，以及高危人群的大規(guī)模篩查，易于大范圍推廣應(yīng)用，使用安全而且無污染，具有廣闊的市場前景。



圖1.BRLF1的cDNA全序列(SEQ ID NO5)； 圖2.BRLF1基因表達(dá)產(chǎn)物Rta蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO6)； 圖3.pGEX-5X-3質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖； 圖4.重組質(zhì)粒的酶切鑒定及電泳觀察(M標(biāo)記；1pGEX-R185原核表達(dá)載體；2pGEX-R185原核表達(dá)載體Sal I酶切結(jié)果；3pGEX-R185原核表達(dá)載體Sal I與EcoR I雙酶切結(jié)果；4pGEX-R185原核表達(dá)載體；5pGEX-R150原核表達(dá)載體SalI酶切結(jié)果；6pGEX-R185原核表達(dá)載體SalI與EcoRI雙酶切結(jié)果)； 圖5.重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增鑒定(重組BRLF-R185I及BRLF-R150I序列擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖M標(biāo)記；1BRLF1-R185I擴(kuò)增產(chǎn)物；2BRLF1-R150I擴(kuò)增產(chǎn)物)； 圖6.pGEX-R185原核表達(dá)載體重組部分的測序鑒定結(jié)果； 圖7.pGEX-R150原核表達(dá)載體重組部分的測序鑒定結(jié)果； 圖8.pGEX-R185原核表達(dá)載體插入序列在GeneBank中Blast比較結(jié)果(圖為查詢結(jié)果的截屏圖，圖中Query為提交的測序序列，Sbjct為基因庫中收存序列，結(jié)果顯示插入序列的堿基與GeneBank中的B95-8細(xì)胞株中EBV基因組104116～104670序列的匹配率為100％，基因庫號為GI59074。結(jié)果表明本研究構(gòu)建的pGEX-R185為正確的重組載體)； 圖9.GST-R185.重組蛋白誘導(dǎo)前后的時序性表達(dá)(M標(biāo)記；1pGEX-R185誘導(dǎo)前細(xì)菌蛋白組；2pGEX-R185誘導(dǎo)后1h細(xì)菌蛋白組；3pGEX-R185誘導(dǎo)2h細(xì)菌蛋白組；4pGEX-R185誘導(dǎo)3h細(xì)菌蛋白組；5pGEX-R185誘導(dǎo)4h細(xì)菌蛋白組。白色三角所在條帶為誘導(dǎo)后出現(xiàn)的重組蛋白；白色方形所在條帶為誘導(dǎo)后出現(xiàn)的GST條帶)； 圖10.GST-R150.重組蛋白誘導(dǎo)前后的時序性表達(dá)(M標(biāo)記；1pGEX-R150誘導(dǎo)前細(xì)菌蛋白組；2pGEX-R150誘導(dǎo)后1h細(xì)菌蛋白組；3pGEX-R150誘導(dǎo)2h細(xì)菌蛋白組；4pGEX-R150誘導(dǎo)3h細(xì)菌蛋白組；5pGEX-R150誘導(dǎo)4h細(xì)菌蛋白組。白色三角所在條帶為誘導(dǎo)后出現(xiàn)的重組蛋白；白色方形所在條帶為誘導(dǎo)后出現(xiàn)的GST條帶)； 圖11.GST抗體Western Blot檢測R185I誘導(dǎo)前后的時序性表達(dá)(1pGEX-R185誘導(dǎo)后1h；2pGEX-R185誘導(dǎo)2h；3pGEX-R185誘導(dǎo)3h；4pGEX-R185誘導(dǎo)4h；5pGEX-R185誘導(dǎo)前細(xì)菌蛋白組。細(xì)箭頭所指條帶為誘導(dǎo)后出現(xiàn)的重組蛋白；空心箭頭所指條帶為誘導(dǎo)后出現(xiàn)的GST條帶)； 圖12.GST抗體Western Blot檢測R150I誘導(dǎo)前后的時序性表達(dá)(1pGEX-R150誘導(dǎo)后1h；2pGEX-R150誘導(dǎo)2h；3pGEX-R150誘導(dǎo)3h；4pGEX-R150誘導(dǎo)4h；5pGEX-R150.誘導(dǎo)前細(xì)菌蛋白組。細(xì)箭頭所指條帶為誘導(dǎo)后出現(xiàn)的重組蛋白；空心箭頭所指條帶為誘導(dǎo)后出現(xiàn)的GST條帶)； 圖13.R185I親和層析前后電泳圖(M標(biāo)記；1pGEX-R185破菌后離心上清；2空白對照；3pGEX-R185洗脫時收集的前3ml；4pGEX-R185洗脫時收集的4～6ml；5pGEX-R185洗脫時收集的前7～9ml。細(xì)箭頭所指條帶為目的重組蛋白；空心箭頭所指條帶為降解后剩余的GST條帶)； 圖14.R185I親和層析前后電泳圖(M標(biāo)記；1pGEX-R185洗脫時收集的前3ml.；2pGEX-R185破菌后離心上清)； 圖15.R185I、R150I純化后的GST抗體Western Blot檢測(1pGEX空質(zhì)粒誘導(dǎo)檢測；2R150I純化后檢測；3R185I純化前檢測；4R185I誘導(dǎo)前檢測；5R185I純化后檢測；6pGEX空質(zhì)粒誘導(dǎo)檢測。細(xì)箭頭所指條帶為純化前后目的蛋白；空心箭頭所指條帶為純化前后的GST條帶)； 圖16.R185I、R150I HPLC-分子篩純化后電泳圖(M標(biāo)記；1R185IHPLC-分子篩純化前；2空白對照；3R185I HPLC-分子篩純化后峰尖部分；4R185I HPLC-分子篩純化后峰尖后下降部分；5R150I HPLC-分子篩純化后峰尖后下降部分；6R150I HPLC-分子篩純化后峰尖部分；7R185I、R150I HPLC-分子篩純化后等比混合檢測。細(xì)箭頭所指條帶為目的重組蛋白；空心箭頭所指條帶為降解后剩余的GST條帶)； 圖17.GST-R150不同濃度包板檢測NPC及正常血清結(jié)果； 圖18.GST-R150不同濃度包板檢測NPC及正常血清結(jié)果(圖為均數(shù)曲線圖，上部曲線表示NPC血清檢測結(jié)果均數(shù)，下部曲線表示正常血清檢測結(jié)果均數(shù))； 圖19.不同包板濃度時NPC病人血清同正常血清檢測結(jié)果比值圖(圖AGST-R185在不同包板濃度時NPC同正常血清檢測結(jié)果比值曲線；圖BGST-R150在不同包板濃度時NPC同正常血清檢測結(jié)果比值)； 圖20.正常組同NPC病人組之間檢測結(jié)果(圖為兩組人群檢測結(jié)果的散點(diǎn)圖，橫坐標(biāo)為兩組組內(nèi)的隨機(jī)分組，左，NPC組，右，正常組)； 圖21.被測樣本的EA抗體濃度(圖為被測樣本中EA抗體濃度的檢測結(jié)果繪制的散點(diǎn)圖)； 圖22.被測樣本的VCA抗體濃度(圖為被測樣本中VCA抗體濃度的檢測結(jié)果繪制的散點(diǎn)圖，橫坐標(biāo)為被測樣本的隨機(jī)分組)。

具體實(shí)施例方式 下文將參考實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是意圖舉例說明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求具體限定。
實(shí)施例1、重組質(zhì)粒pGEX-R185與pGEX-R150的獲得 1、BRLF1基因的獲得 (1)引物的設(shè)計與合成根據(jù)已知BRLF1序列(GenBank號gi94734074)設(shè)計的PCR引物序列為 F5′-CCGGAATTCATGAGGCCTAAAAAGGATGGCTT-3′； R5′-TGCTCTAGACTAAAATAAGCTGGTGTCAAAAATAG-3′ (2)RT-PCR擴(kuò)增 使用12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate，12-o-十四烷酰佛波醋酸酯-13(Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA，USA)誘導(dǎo)B95-8細(xì)胞(ATCC NumberCRL-10624TM)中的EBV進(jìn)入裂解期(Feng.P，Chan.SH，Soo.MY，etc.Antibody response to Epstein-Barr virus Rta protein in patientswith nasopharyngeal carcinomaa new serologic parameter for diagnosis.Cancer 2001 Oct 1；92(7)1872-80.)，采用RT-PCR方法獲得BRLF1基因的cDNA，具體方法如下 PCR反應(yīng)管、吸頭、擴(kuò)增用水等均按常規(guī)進(jìn)行DEPC處理。
采用TaKaRa公司兩步法RT-PCR試劑盒(商品目錄中的商品號TAK_RR019A)，以B95-8細(xì)胞總RNA為模板(提取方法見上述參考文獻(xiàn))，先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)，反應(yīng)體系如下 混合均勻，置于PCR儀((Bio-Rad公司，my cyclerTM thermal cycle))中，30℃10min，42℃30min，99℃5min，5℃5min。
再進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)體系如下 PCR擴(kuò)增條件如下94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，擴(kuò)增32個循環(huán)；72℃延伸10min。使用Omega公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒按試劑盒說明回收并純化上述擴(kuò)增產(chǎn)物。使用TOPO TACloning Kit(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，將1818bp全長BRLF1 cDNA片段克隆到質(zhì)粒pTOPO-R605(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中。
2.BRLF1基因表達(dá)產(chǎn)物Rta蛋白的基本信息分析結(jié)果 2.1氨基酸序列 使用Vector NT VI軟件對獲得的基因序列進(jìn)行密碼子翻譯，獲得BRLF1基因表達(dá)產(chǎn)物Rta蛋白的氨基酸序列(GenBank號gi94734074) MRPKKDGLEDFLRLTPEIKKQLGSLVSDYCNVLNKEFTAGSVEITLRSYKICKAFINEAKAHGREWGGLMATLNICNFWAILRNNRVRRRAENAGNDACSIACPIVMRYVLDHLIVVTDRFFIQAPSNRVMIPATIGTAMYKLLKHSRVRAYTYSKVLGVDRAAIMASGKQVVEHLNRMEKEGLLSSKFKAFCKWVFTYPVLEEMFQTMVSSKTGHLTDDVKDVRALIKTLPRASYSSHAGQRSYVSGVLPACLLSTKSKAVETPILVSGADRMDEELMGNDGGASHTEARYSESGQFHAFTDELESLPSPTMPLKPGAQSADCGDSSSSSSDSGNSDTEQSEREEARAEAPRLRAPKSRRTSRPNRGQTPCPSNAAEPEQPWIAAVHQESDERPIFPHPSKPTFLPPVKRKKGLRDSREGMFLPKPEAGSAISDVFEGREVCQPKRIRPFHPPGSPWANRPLPASLAPTPTGPVHEPVGSLTPAPVPQPLDPAPAVTPEASHLLEDPDEETSQAVKALREMADTVIPQKEEAAICGQMDLSHPPPRGHLDELTTTLESMTEDLNLDSPLTPELNEILDTFLNDECLLHAMHISTGLSIFDTSLF 2.2Rta蛋白的基本理化性質(zhì)分析結(jié)果 數(shù)據(jù)庫Swiss-Prot中查詢Rta蛋白氨基酸序列，分析其基本理化性質(zhì)，得到以下初步結(jié)果

氨基酸數(shù)目605個

分子量66594.6Da

等電點(diǎn)理論值6.14

氨基酸組成、數(shù)目及百分比 Ala(A)528.6％Arg(R)396.4％Asn(N)193.1％ Asp(D)325.3％Cys(C)122.0％Gln(Q)162.6％ Glu(E)467.6％Gly(G)335.5％His(H)172.8％ Ile(I)24 4.0％Leu(L)559.1％Lys(K)315.1％ Met(M)17 2.8％Phe(F)203.3％Pro(P)538.8％ Ser(S)55 9.1％Thr(T)366.0％Trp(W)5 0.8％ Tyr(Y)10 1.7％Val(V)335.5％Asx(B)0 0.0％ Glx(Z)0 0.0％Xaa(X)0 0.0％ 在NCBI網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov域名下Neucleotide選項中查找EBV BRLF1基因cDNA全序列，應(yīng)用軟件Vector NTI Suit9進(jìn)行整理并分析其基本構(gòu)成及性質(zhì)。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/域名下進(jìn)行BLAST分析。
全BRLF1基因表達(dá)的蛋白的氨基酸數(shù)目達(dá)600多個，分子量大于60kDa，這么大的蛋白質(zhì)在水溶液中的可溶性差，純化難，從技術(shù)角度上看，不適合作為ELISA檢測試劑使用。為此，可以選擇該蛋白序列中較小的含不同抗原決定簇的蛋白質(zhì)片段來用作ELISA檢測試劑。將這些片段用于重組表達(dá)，不僅目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量高，而且容易純化。
根據(jù)BLAST分析結(jié)果了解到在BRLF1基因序列中365-386同人類Ras干擾蛋白(RASIP1)mRNA中1315-1336部分序列相匹配，且該部位經(jīng)抗原性分析發(fā)現(xiàn)有抗原決定簇，因此我們在篩選重組抗原時沒有選擇這一段，以免在檢測人血清時發(fā)生交叉反應(yīng)。在發(fā)明人的先前研究中，對BRLF1基因不同部分進(jìn)行體外表達(dá)產(chǎn)生含不同抗原決定簇的蛋白質(zhì)片段，對多個BRLF1基因擴(kuò)增陽性病人的血清進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)檢測，篩選抗原決定簇較好的蛋白質(zhì)片段，發(fā)現(xiàn)BRLF1基因514～1068位置(SEQ ID NO1)及1153～1602位置(SEQ ID NO2)經(jīng)過體外表達(dá)后同上述血清的反應(yīng)性最好。因此根據(jù)上述兩種原因，我們選擇了514～1068位置及1153～1602位置進(jìn)行重組融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建，以求獲得較好的抗原。
3、重組質(zhì)粒pGEX-R185與pGEX-R150的獲得。
3.1引物合成 根據(jù)以BRLF1的cDNA序列設(shè)計合成引物，在514～1068bp位置(編碼Rta蛋白第171～356位氨基酸)(SEQ ID NO3)以及1153～1602bp位置(編碼Rta蛋白第384～594位氨基酸)(SEQ ID NO4)中設(shè)計引物，分別在上游引物中導(dǎo)入限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切位點(diǎn)，在下游引物中導(dǎo)入限制性內(nèi)切酶Sal I酶切位點(diǎn)。以克隆在pTOPO-R605中的BRLF1基因為模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因BRLF1-R185I和BRLF1-R150I。引物序列如下 BRLF1-R185I F15′-

gtagtggaacacctgaacaggat-3′ (引物全長30bp，方框內(nèi)為酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基) R15′-

ggcccgcaggcgcggggcctc-3′ (引物全長31bp，方框內(nèi)為酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基) BRLF1-R150I F25′-

gcagcggtccaccaagagagcg-3′ (引物全長29bp，方框內(nèi)為酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基) R25′-

ggctgcttcctccttctgg-3′ (引物全長29bp，方框內(nèi)為酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基) 3.2PCR擴(kuò)增目的基因 兩種插入片段的擴(kuò)增體系相同 3.3PCR擴(kuò)增條件如下 BRLF1-R185I94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s；擴(kuò)增32個循環(huán)；72℃延伸10min。
BRLF1-R150I94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸40s；擴(kuò)增32個循環(huán)；72℃延伸10min。
使用Omega公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒按試劑盒說明回收并純化上述擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.4載體構(gòu)建 3.4.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切處理 參照Takara公司使用說明，采用雙酶切方法，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I(NewEngland公司)酶切載體目的基因。
反應(yīng)體系如下 3.4.2原核表達(dá)載體pGEX-5X-3的酶切處理 pGEX-5X-3質(zhì)粒(商購自Amersham Biosciences，商品號27-4586-01，GenBank Accession No.U13858，GST(glutathione S-transferase)GeneFusion System)(附圖3)是一個含tac啟動子，能夠進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)的高表達(dá)質(zhì)粒載體，誘導(dǎo)劑可選用IPTG。該質(zhì)粒含有l(wèi)ac Iq基因，能夠以各種大腸桿菌為宿主菌進(jìn)行高效表達(dá)，并可以用Glutathione Sepharose 4B對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。該質(zhì)粒系統(tǒng)的純化條件非常溫和，能夠?qū)⒓兓瘯r對所表達(dá)融合蛋白的抗原性及功能活性的影響降至最低。而且能夠通過凝血酶或Xa蛋白酶對相應(yīng)位置的識別剪切作用獲得非融合的目的蛋白。本發(fā)明選用該質(zhì)粒作為重組BRLF1基因表達(dá)蛋白的原核表達(dá)載體，能夠?qū)Ⅲw外表達(dá)所產(chǎn)生的抗原性損失降到最低。
用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I酶切載體pGEX-5X-3。反應(yīng)體系如下 上述酶切產(chǎn)物經(jīng)10g/L的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)的紫外燈照射下，按膠回收試劑盒(Takara公司D601)的說明回收目的片段。
3.4.3重組質(zhì)粒的連接反應(yīng) 上述酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化后在T4 DNA連接酶(Takara公司D2011A)作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，插入片段與載體分子摩爾數(shù)比3～10∶1的比例16℃反應(yīng)過夜，連接產(chǎn)物按照常規(guī)步驟轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109(商購Promega L2001)，挑陽性克隆(抗Amp)擴(kuò)增，提質(zhì)粒。連接反應(yīng)設(shè)立陰性對照。連接反應(yīng)體系如下 將在EcoR I和Sal I酶切位點(diǎn)插入R185I片段/R150I片段的pGEX-5X-3的重組載體分別命名為pGEX-R185和pGEX-R150。將pGEX-R185和pGEX-R150表達(dá)的重組融合蛋白分別命名為GST-R185蛋白和GST-R150蛋白。
3.4.4重組質(zhì)粒的鑒定 3.4.4.1重組質(zhì)粒的酶切鑒定及電泳觀察 用本實(shí)驗室常規(guī)酶切方法將提取的重組質(zhì)粒pGEX-R185與pGEX-R150酶切。分別采用內(nèi)切酶Sal I和EcoR I將質(zhì)粒DNA進(jìn)行單酶切及雙酶切鑒定。
通過內(nèi)切酶Sal I和EcoR I對重組質(zhì)粒pGEX-R185進(jìn)行雙酶切后在555bp左右應(yīng)該產(chǎn)生一條帶，對重組質(zhì)粒pGEX-R150進(jìn)行雙酶切后在450bp左右應(yīng)該產(chǎn)生一條帶。實(shí)驗結(jié)果與預(yù)計相符。見圖4。
對pGEX-R185重組表達(dá)載體進(jìn)行內(nèi)切酶Sal I單酶切，未見有酶切產(chǎn)物條帶產(chǎn)生，而對其進(jìn)行內(nèi)切酶Sal I和EcoR I雙酶切后發(fā)現(xiàn)在555bp左右位置出現(xiàn)條帶。
pGEX-R150重組表達(dá)載體進(jìn)行內(nèi)切酶Sal I單酶切，未見有酶切產(chǎn)物條帶產(chǎn)生，而對其進(jìn)行內(nèi)切酶Sal I和EcoR I雙酶切后發(fā)現(xiàn)在450bp左右位置出現(xiàn)條帶。
3.4.4.2重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增鑒定 將獲得的重組質(zhì)粒pGEX-R185與pGEX-R150經(jīng)1∶1000倍稀釋后作為模板，用上述R185與R150特異性的引物F1、R1和F2、R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
pGEX-R185擴(kuò)增產(chǎn)物位于BRLF1基因514～1068位置，應(yīng)為555bp長。pGEX-R150擴(kuò)增產(chǎn)物位于BRLF1基因1153～1602位置，應(yīng)為450bp長。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在400～500bp中間及500～600bp中間各出現(xiàn)了一條片段(圖5)。根據(jù)電泳圖中兩個片段的大小推測，可以認(rèn)為獲得的重組質(zhì)粒pGEX-R185與pGEX-R150包含需要的BRLF-R185I及BRLF-R150I片段。
3.4.4.3重組BRLF-R185I及BRLF-R150I原核表達(dá)載體的測序鑒定 用質(zhì)粒提取試劑盒提取兩種質(zhì)粒pGEX-R185與pGEX-R150后將重組質(zhì)粒送往上海博亞生物技術(shù)公司進(jìn)行測序鑒定(圖6，圖7)。測序結(jié)果通過Chromas軟件的查詢功能找到引物設(shè)計部位，其間序列即為本研究中的插入序列，將插入序列提交基因數(shù)據(jù)庫GeneBank進(jìn)行BLAST比較，證實(shí)兩個插入質(zhì)粒pGEX-5X-3的片段是我們設(shè)計的引物所擴(kuò)增的二種BRLF1基因中的514～1068及1153～1602片段(圖8)。上述結(jié)果提示，我們獲得了正確的目的基因，同時正確的構(gòu)建了EB病毒BRLF1基因中的514～1068及1153～1602片段的原核表達(dá)載體。
實(shí)施例2、GST-R150與GST-R185蛋白的制備與純化 1重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 分別將上述pGEX-R185和pGEX-R150重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(商購Promega L1191)后，LB平板篩選單克隆，挑選單克隆小量培養(yǎng)過夜，37℃150rpm過夜，按1∶500擴(kuò)大，1∶1000加入100mg/mlAMP，37℃，180rpm(臺式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司))，4h培養(yǎng)(全溫振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián)廠，HZQ-F))。1mmol/L IPTG(TaKaRa公司)按1∶1000比例加入培養(yǎng)基，誘導(dǎo)4h。取誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后1h、2h、3h、4h的菌體經(jīng)13000rpm離心取沉淀，加入變性Loading Buffer(商購Promega)沸煮后，做SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化有PGEX-R185和PGEX-R150重組質(zhì)粒的大腸桿菌在誘導(dǎo)后分別有分子量為49.2kDa、45kDa左右的蛋白質(zhì)高表達(dá)，誘導(dǎo)后4h可達(dá)到表達(dá)高峰期(圖9，10)。用抗GST抗體(GST單克隆抗體的制備見Amersham Biosciences，GST GeneFusion System說明手冊)做Western-Blot，檢測GST-R185蛋白質(zhì)，在高表達(dá)蛋白質(zhì)條帶處出現(xiàn)染色條帶，另外有GST條帶出現(xiàn)(圖11，12)。
2重組表達(dá)融合蛋白的純化 2.1重組融合蛋白的親和層析純化 純化步驟為

重懸GST Sepharase4B(商購自Amersham Biosciences)，取1ml裝柱，使用4ml PBS(pH 7.0)緩沖液平衡。


濾去PBS，打開柱底蓋，取出瓊脂珠，置于一干凈的3ml離心管中

加入已經(jīng)獲得的上述重組大腸桿菌的細(xì)胞裂解液上清((JY92-II型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，200W，15s×10次))1ml輕輕混勻，置于室溫5～10min，其間混勻數(shù)次，

500rpm離心10min，去上清。


加入2ml PBS重懸，置于室溫5～10min，其間混勻數(shù)次500rpm離心10min，去上清。


重復(fù)1次。


離心管內(nèi)加入200μl谷胱甘肽洗脫液(10mM)，輕輕混勻，置于室溫5～10min，其間混勻數(shù)次

500rpm離心10min，取上清收集，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 上清為純化的GST-R185與GST-R150融合蛋白。
使用SDS-PAGE電泳及WesternBlot檢測獲得的蛋白。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別在GST-R185蛋白和GST-R150蛋白均出現(xiàn)了同Western-Blot帶型類似的條帶，使用抗GST抗體做WesternBlot，檢測GST-R185蛋白質(zhì)，在蛋白質(zhì)條帶處出現(xiàn)染色條帶，以及一些GST蛋白條帶，分子量49.2kDa的條帶為目的重組融合蛋白質(zhì)。同樣，GST-R150重組融合蛋白質(zhì)也出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象，分子量45kDa的條帶為目的重組融合蛋白質(zhì)(圖13，14，15)。
2.2HPLC-分子篩純化 純化步驟

選用層析柱為Sephorose-100已裝柱(Amersham Biosciences公司)。


用2倍柱床體積已除菌PBS平衡層析柱。


將經(jīng)過親和層析純化獲得的蛋白3ml上樣加入柱中。


A260nm波長觀察柱內(nèi)流出液體的蛋白含量。


收集峰前肩、峰尖、峰后肩部分蛋白質(zhì)。
用SDS-PAGE電泳觀察純化后蛋白。結(jié)果見圖16。
實(shí)施例3應(yīng)用ELISA法檢測血清中EB病毒BRLF1基因表達(dá)抗原的抗體 檢測原理利用本發(fā)明制備的重組抗原(濃度用考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒測定)包板，加入待檢測血清，待檢測血清中抗體與包板抗原結(jié)合后，應(yīng)用辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人二抗與血清抗體結(jié)合，顯色測定結(jié)果。檢測步驟如下 (1)將以上HPLC-分子篩純化的GST-R185，GST-R150或GST-R185與GST-R150的等比(體積比1∶1)混合物作為不同的三種抗原組合分別進(jìn)行ELISA檢測。
(2)抗原包被用包被稀釋液(pH 9.6碳酸鈉緩沖液)分別將上述不同診斷抗原或其等比組合稀釋十倍。ELISA酶標(biāo)板上每孔加入100μl，37℃反應(yīng)2h。PBST洗板五次，每次每孔300μl，洗5min。
(3)封閉加入1％牛血清白蛋白(BSA)(成都溶海公司)封閉液(PBST配制)100μl/孔，37℃封閉1h，PBST(0.1M磷酸鹽緩沖液+0.05％吐溫-20，pH7.0)洗板五次，每次每孔300μl，洗5min。
(4)待測血清血清1∶80稀釋后加入反應(yīng)孔中，100μl/孔，37℃孵育1h，洗板五次，每次每孔300μl，洗5min。
(5)酶標(biāo)物加入酶標(biāo)羊抗人工作液(Amersham Biosciences公司)100μl/孔，37℃反應(yīng)1h，，每次每孔300μl，洗5min。
(6)顯色加入TMB(四甲基聯(lián)苯胺，武漢博士德公司)顯色工作液(1ml TMB原液加9ml去離子水和250μl雙氧水)，100μl/孔，顯色10min。
(7)中止加入1滴中止液(1N濃硫酸)中止顯色。
(8)結(jié)果檢測使用450nm波長檢測各孔吸光度(OD)值。
根據(jù)上述檢測步驟，分別對確診的鼻咽癌(NPC)患者的血清91例和健康人血清49例(這些血清樣品來源于四川大學(xué)華西醫(yī)院)進(jìn)行血清中EB病毒BRLF1基因表達(dá)抗原的抗體的檢測。
GST-R185以濃度2.67μg/ml、1.335μg/ml、0.6675μg/ml、0.334μg/ml、0.167μg/ml分別包被酶聯(lián)免疫反應(yīng)板，GST-R150以濃度2.31μg/ml、1.155μg/ml、0.578μg/ml、0.289μg/ml、0.144μg/ml分別包被酶聯(lián)免疫反應(yīng)板，檢測數(shù)個NPC血清和正常血清，結(jié)果見圖17、18。GST-R185和GST-R150在不同包板濃度時NPC病人血清同正常血清檢測結(jié)果比值圖如圖19?？梢悦黠@看出，GST-R185和GST-R150蛋白分別作為抗原可以用于檢測血清中EB病毒BRLF1基因表達(dá)抗原的抗體的檢測，并且能夠顯著區(qū)分正常人和鼻咽癌患者。
通過上述檢測方法，對上述確診的鼻咽癌(NPC)患者的血清91例和健康人血清49例中Rta抗體檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，認(rèn)為在檢測抗原濃度為1μg/ml下，OD450nm值大于0.49為陽性，小于0.49為陰性(P＜0.05)。即C.O.(cut-off value，陽性分界值)值為0.49。
另外，分別將GST-R185(1μg/ml)、GST-R150(1μg/ml)以及二者的等體積混合包被酶聯(lián)免疫反應(yīng)板，檢測7個鼻咽癌未治療組病人血清(1∶80稀釋)，結(jié)果見(表1)。從表中結(jié)果可以看出，每組病人血清中的Rta抗體含量通過兩種重組融合蛋白混合包板檢測結(jié)果最好，單獨(dú)使用一種重組融合蛋白檢測值均較低。
表1 NPC病人血清初步檢測結(jié)果 185單包-GST-R185單獨(dú)包被； 150單包-GST-R150單獨(dú)包被； 雙包-GST-R185和GST-R150組合包被 按照上述方法，使用兩種重組融合蛋白(1μg/ml)等比混合包板方式對收集的所有49例正常人血清和所有91例NPC病人的血清中Rta抗體進(jìn)行檢測。正常人血清的檢測結(jié)果中，有一例明顯偏移了全組的整體趨勢，檢測值為0.9，除此值以外，最高值為0.435，最低值為0.11，檢測值主要分布于0.1～0.4之間，小于C.O.(cut-off value，陽性分界值)值0.49。正常人血清和NPC病人血清的檢測結(jié)果的平均值分別為0.278和0.571。用t檢驗對正常組和NPC病人組進(jìn)行假設(shè)檢驗，結(jié)果為，T值＝8.334，P值＜0.005，說明兩組數(shù)據(jù)間有差異(圖20)。鼻咽癌病人的陽性檢出率，即靈敏度為94％；正常人群檢測的陰性率為92.7％。
部分樣本血清中VCA及EA抗原的檢測 為進(jìn)一步確立本研究建立檢測方法的診斷價值，使用臨床上常用的EBV檢測指標(biāo)EA抗體和VCA抗體對本研究中部分樣本進(jìn)行了檢測。
被檢測樣本有NPC樣本中隨機(jī)抽取的50例，正常樣本中隨機(jī)抽取的6例。
上述樣本中EA抗體的檢測結(jié)果 根據(jù)EA抗體檢測試劑盒(商購自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院病毒學(xué)研究所)使用說明書操作步驟對標(biāo)準(zhǔn)樣本及上述樣本血清進(jìn)行檢測。根據(jù)試劑盒中5個標(biāo)準(zhǔn)樣本的檢測結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并出計算標(biāo)準(zhǔn)曲線公式。標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為Abs＝(-0.0145-2.44)/[1+(Conc/41.8)0.909]+2.44。用標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算出所有被測樣本中的EA抗體濃度(圖21)，得到以下結(jié)果。說明書中的判定值范圍小于8U/ml為陰性結(jié)果，8U/ml～12U/ml為可疑結(jié)果，大于12U/ml為陽性結(jié)果。根據(jù)上述結(jié)果對被測樣本進(jìn)行分析。共有22個樣本為陽性，其中22個樣本大于12U/ml，為陽性結(jié)果，一例為正常人樣本，其余21例均為NPC樣本，占所有NPC樣本的約40％。有7例樣本介于8U/ml～12U/ml間，其中有2例為NPC樣本，占所有NPC樣本的約4％。剩余36例樣本均小于8U/ml。
上述樣本中VCA抗體的檢測結(jié)果 根據(jù)VCA抗體檢測試劑盒(商購自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院病毒學(xué)研究所)使用說明書操作步驟對標(biāo)準(zhǔn)樣本及上述樣本血清進(jìn)行檢測。根據(jù)試劑盒中5個標(biāo)準(zhǔn)樣本的檢測結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并出計算標(biāo)準(zhǔn)曲線公式。標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為Abs＝(0.0482-2.45)/(1+[Conc/52.1)0.996]+2.45。用標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算出所有被測樣本中的VCA抗體濃度(圖22)，得到以下結(jié)果。說明書中的判定值范圍小于8U/ml為陰性結(jié)果，8U/ml～12U/ml為可疑結(jié)果，大于12U/ml為陽性結(jié)果。根據(jù)上述結(jié)果對被測樣本進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)所有被測樣本中的VCA濃度均小于8U/ml，分布于1～7.778之間，無陽性結(jié)果發(fā)現(xiàn)。
結(jié)論使用GST-R185蛋白與GST-R150蛋白的等比混合物作為診斷抗原組合進(jìn)行ELISA檢測后，鼻咽癌病人的陽性檢出率，即靈敏度為94％；正常人群檢測的陰性率為92.7％，均高于常規(guī)使用的EBNA、EA、VCA抗體的檢測。因此，本檢測試劑盒適用于對鼻咽癌病人進(jìn)行輔助診斷以及正常人群的大規(guī)模篩查之用。
序列表
<110>同昕生物技術(shù)(北京)有限公司
<120>用于鼻咽癌篩查、診斷和治療效果預(yù)測的ELISA試劑盒
<130>IB065546
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>555
<212>DNA
<213>1
<400>1
gtagtggaac acctgaacag gatggagaag gaaggcctcc taagctccaa gttcaaggcc 60
ttttgcaagt gggtgttcac ctatcccgtc ctcgaggaga tgttccagac tatggtctcg120
tccaagacag gccatctgac ggacgatgtt aaggatgtca gggctctgat taagacactg180
ccccgggcct cctactccag ccacgccgga cagaggagct acgtgagcgg cgtgcttccc240
gcgtgcctgc tgtcaaccaa gtccaaggca gtggaaactc ctatcctcgt gtccggagcc300
gacaggatgg acgaggagct catggggaat gatgggggtg cctctcacac cgaggcccgc360
tactcggagt ccggacagtt tcatgctttt acagatgaac tcgaaagtct cccgagcccg420
accatgcccc tgaagcccgg tgcccaaagc gccgactgcg gtgacagcag ttccagcagc480
agtgactcgg gcaacagtga caccgagcag agcgagcggg aagaggccag ggccgaggcc540
ccgcgcctgc gggcc 555
<210>2
<211>450
<212>DNA
<213>2
<400>2
gcagcggtcc accaagagag cgatgagaga cccatattcc cccacccctc aaagcccacc 60
tttcttcctc ccgttaaaag gaagaagggc ctcagggata gccgggaagg tatgttcctg120
ccaaagccgg aagcgggcag tgccatatct gacgtgttcg aggggcgaga ggtgtgtcag180
ccaaagagga tcaggccctt ccatccaccc ggatccccgt gggccaaccg gcccctgcct240
gcctctttgg ctcccacccc cacaggacct gtccatgaac cggtcggatc cctaacgcca300
gccccggtgc cccagccact tgacccggcc cccgcagtaa cccccgaggc aagtcatctg360
ttggaggacc ctgatgaaga aaccagtcag gccgtgaagg ccctaaggga gatggctgac420
actgttattc cccagaagga ggaagcagcc 450
<210>3
<211>185
<212>PRT
<213>3
<400>3
Val Val Glu His Leu Asn Arg Met Glu Lys Glu Gly Leu Leu Ser Ser
1 5 10 15
Lys Phe Lys Ala Phe Cys Lys Trp Val Phe Thr Tyr Pro Val Leu Glu
20 25 30
Glu Met Phe Gln Thr Met Val Ser Ser Lys Thr Gly His Leu Thr Asp
35 40 45
Asp Val Lys Asp Val Arg Ala Leu Ile Lys Thr Leu Pro Arg Ala Ser
50 55 60
Tyr Ser Ser His Ala Gly Gln Arg Ser Tyr Val Ser Gly Val Leu Pro
65 70 75 80
Ala Cys Leu Leu Ser Thr Lys Ser Lys Ala Val Glu Thr Pro Ile Leu
85 90 95
Val Ser Gly Ala Asp Arg Met Asp Glu Glu Leu Met Gly Asn Asp Gly
100 105 110
Gly Ala Ser His Thr Glu Ala Arg Tyr Ser Glu Ser Gly Gln Phe His
115 120 125
Ala Phe Thr Asp Glu Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr Met Pro Leu
130 135 140
Lys Pro Gly Ala Gln Ser Ala Asp Cys Gly Asp Ser Ser Ser Ser Ser
145 150 155 160
Ser Asp Ser Gly Asn Ser Asp Thr Glu Gln Ser Glu Arg Glu Glu Ala
165 170 175
Arg Ala Glu Ala Pro Arg Leu Arg Ala
180 185
<210>4
<211>150
<212>PRT
<213>4
<400>4
Ala Ala Val His Gln Glu Ser Asp Glu Arg Pro Ile Phe Pro His Pro
1 5 10 15
Ser Lys Pro Thr Phe Leu Pro Pro Val Lys Arg Lys Lys Gly Leu Arg
20 25 30
Asp Ser Arg Glu Gly Met Phe Leu Pro Lys Pro Glu Ala Gly Ser Ala
35 40 45
Ile Ser Asp Val Phe Glu Gly Arg Glu Val Cys Gln Pro Lys Arg Ile
50 55 60
Arg Pro Phe His Pro Pro Gly Ser Pro Trp Ala Asn Arg Pro Leu Pro
65 70 75 80
Ala Ser Leu Ala Pro Thr Pro Thr Gly Pro Val His Glu Pro Val Gly
85 90 95
Ser Leu Thr Pro Ala Pro Val Pro Gln Pro Leu Asp Pro Ala Pro Ala
100 105 110
Val Thr Pro Glu Ala Ser His Leu Leu Glu Asp Pro Asp Glu Glu Thr
115 120 125
Ser Gln Ala Val Lys Ala Leu Arg Glu Met Ala Asp Thr Val Ile Pro
130 135 140
Gln Lys Glu Glu Ala Ala
145 150
<210>5
<211>1818
<212>DNA
<213>5
<400>5
atgaggccta aaaaggatgg cttggaagac tttctgaggc taactcctga aatcaaaaag 60
cagctgggct ctctggtctc tgactactgc aacgtcctca acaaggaatt tacagccggg120
agtgtggaga ttactctgag atcctacaaa atatgcaagg catttataaa tgaggccaag180
gcccacgggc gagaatgggg cgggctaatg gccacgctca acatctgcaa tttttgggcc240
attctccgaa acaacagggt aagaagacgg gctgagaatg ccggcaacga cgcatgttcc300
atcgcgtgcc ctatagtgat gcgctacgtg ttagaccacc tgatagtggt cactgacaga360
ttcttcatcc aggcccccag caaccgggtg atgattcctg ccaccatagg caccgctatg420
tacaagctcc taaaacacag tcgggtgcgg gcctacacct acagcaaggt gctgggcgtg480
gaccgcgcgg ccatcatggc ctccggcaag caggtagtgg aacacctgaa caggatggag540
aaggaaggcc tcctaagctc caagttcaag gccttttgca agtgggtgtt cacctatccc 600
gtcctcgagg agatgttcca gactatggtc tcgtccaaga caggccatct gacggacgat 660
gttaaggatg tcagggctct gattaagaca ctgccccggg cctcctactc cagccacgcc 720
ggacagagga gctacgtgag cggcgtgctt cccgcgtgcc tgctgtcaac caagtccaag 780
gcagtggaaa ctcctatcct cgtgtccgga gccgacagga tggacgagga gctcatgggg 840
aatgatgggg gtgcctctca caccgaggcc cgctactcgg agtccggaca gtttcatgct 900
tttacagatg aactcgaaag tctcccgagc ccgaccatgc ccctgaagcc cggtgcccaa 960
agcgccgact gcggtgacag cagttccagc agcagtgact cgggcaacag tgacaccgag1020
cagagcgagc gggaagaggc cagggccgag gccccgcgcc tgcgggcccc aaagtcgcgc1080
cggacatcca ggcccaaccg tggtcaaact ccatgtcctt ccaacgcggc ggaacctgaa1140
cagccttgga tagcagcggt ccaccaagag agcgatgaga gacccatatt cccccacccc1200
tcaaagccca cctttcttcc tcccgttaaa aggaagaagg gcctcaggga tagccgggaa1260
ggtatgttcc tgccaaagcc ggaagcgggc agtgccatat ctgacgtgtt cgaggggcga1320
gaggtgtgtc agccaaagag gatcaggccc ttccatccac ccggatcccc gtgggccaac1380
cggcccctgc ctgcctcttt ggctcccacc cccacaggac ctgtccatga accggtcgga1440
tccctaacgc cagccccggt gccccagcca cttgacccgg cccccgcagt aacccccgag1500
gcaagtcatc tgttggagga ccctgatgaa gaaaccagtc aggccgtgaa ggccctaagg1560
gagatggctg acactgttat tccccagaag gaggaagcag ccatatgtgg acagatggac1620
ctgagccacc cgccccctcg tggccatttg gacgaactga ccacaacact agagtccatg1680
acagaggatt tgaatctgga ctcccccctg acccccgaac ttaatgaaat cttggataca1740
tttctaaatg atgaatgtct gctgcatgcc atgcatattt caactgggct gtctattttt1800
gacaccagct tattttag 1818
<210>6
<211>605
<212>PRT
<213>6
<400>6
Met Arg Pro Lys Lys Asp Gly Leu Glu Asp Phe Leu Arg Leu Thr Pro
1 5 10 15
Glu Ile Lys Lys Gln Leu Gly Ser Leu Val Ser Asp Tyr Cys Asn Val
20 25 30
Leu Asn Lys Glu Phe Thr Ala Gly Ser Val Glu Ile Thr Leu Arg Ser
35 40 45
Tyr Lys Ile Cys Lys Ala Phe Ile Asn Glu Ala Lys Ala His Gly Arg
50 55 60
Glu Trp Gly Gly Leu Met Ala Thr Leu Asn Ile Cys Asn Phe Trp Ala
65 70 75 80
Ile Leu Arg Asn Asn Arg Val Arg Arg Arg Ala Glu Asn Ala Gly Asn
85 90 95
Asp Ala Cys Ser Ile Ala Cys Pro Ile Val Met Arg Tyr Val Leu Asp
100 105110
His Leu Ile Val Val Thr Asp Arg Phe Phe Ile Gln Ala Pro Ser Asn
115 120 125
Arg Val Met Ile Pro Ala Thr Ile Gly Thr Ala Met Tyr Lys Leu Leu
130 135 140
Lys His Ser Arg Val Arg Ala Tyr Thr Tyr Ser Lys Val Leu Gly Val
145 150 155 160
Asp Arg Ala Ala Ile Met Ala Ser Gly Lys Gln Val Val Glu His Leu
165 170 175
Asn Arg Met Glu Lys Glu Gly Leu Leu Ser Ser Lys Phe Lys Ala Phe
180 185 190
Cys Lys Trp Val Phe Thr Tyr Pro Val Leu Glu Glu Met Phe Gln Thr
195 200 205
Met Val Ser Ser Lys Thr Gly His Leu Thr Asp Asp Val Lys Asp Val
210 215 220
Arg Ala Leu Ile Lys Thr Leu Pro Arg Ala Ser Tyr Ser Ser His Ala
225 230 235 240
Gly Gln Arg Ser Tyr Val Ser Gly Val Leu Pro Ala Cys Leu Leu Ser
245 250 255
Thr Lys Ser Lys Ala Val Glu Thr Pro Ile Leu Val Ser Gly Ala Asp
260 265 270
Arg Met Asp Glu Glu Leu Met Gly Asn Asp Gly Gly Ala Ser His Thr
275 280 285
Glu Ala Arg Tyr Ser Glu Ser Gly Gln Phe His Ala Phe Thr Asp Glu
290 295 300
Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr Met Pro Leu Lys Pro Gly Ala Gln
305 310 315 320
Ser Ala Asp Cys Gly Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Gly Asn
325 330 335
Ser Asp Thr Glu Gln Ser Glu Arg Glu Glu Ala Arg Ala Glu Ala Pro
340 345 350
Arg Leu Arg Ala Pro Lys Ser Arg Arg Thr Ser Arg Pro Asn Arg Gly
355 360 365
Gln Thr Pro Cys Pro Ser Asn Ala Ala Glu Pro Glu Gln Pro Trp Ile
370 375 380
Ala Ala Val His Gln Glu Ser Asp Glu Arg Pro Ile Phe Pro His Pro
385 390 395 400
Ser Lys Pro Thr Phe Leu Pro Pro Val Lys Arg Lys Lys Gly Leu Arg
405 410 415
Asp Ser Arg Glu Gly Met Phe Leu Pro Lys Pro Glu Ala Gly Ser Ala
420 425 430
Ile Ser Asp Val Phe Glu Gly Arg Glu Val Cys Gln Pro Lys Arg Ile
435 440 445
Arg Pro Phe His Pro Pro Gly Ser Pro Trp Ala Asn Arg Pro Leu Pro
450 455 460
Ala Ser Leu Ala Pro Thr Pro Thr Gly Pro Val His Glu Pro Val Gly
465 470 475 480
Ser Leu Thr Pro Ala Pro Val Pro Gln Pro Leu Asp Pro Ala Pro Ala
485 490 495
Val Thr Pro Glu Ala Ser His Leu Leu Glu Asp Pro Asp Glu Glu Thr
500 505 510
Ser Gln Ala Val Lys Ala Leu Arg Glu Met Ala Asp Thr Val Ile Pro
515 520 525
Gln Lys Glu Glu Ala Ala Ile Cys Gly Gln Met Asp Leu Ser His Pro
530 535 540
Pro Pro Arg Gly His Leu Asp Glu Leu Thr Thr Thr Leu Glu Ser Met
545 550 555 560
Thr Glu Asp Leu Asn Leu Asp Ser Pro Leu Thr Pro Glu Leu Asn Glu
565 570 575
Ile Leu Asp Thr Phe Leu Asn Asp Glu Cys Leu Leu His Ala Met His
580 585 590
Ile Ser Thr Gly Leu Ser Ile Phe Asp Thr Ser Leu Phe
595 600 60權(quán)利要求
1.一種含有EB病毒抗原決定簇的抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO3或SEQ ID NO4所示。
2.一種含有EB病毒抗原決定簇的融合抗原蛋白，其含有如SEQ IDNO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的融合抗原蛋白，其為GST融合蛋白。
4.編碼權(quán)利要求1的抗原蛋白的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的核苷酸序列，如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示。
6.含有根據(jù)權(quán)利要求4或5的核苷酸序列的重組質(zhì)粒，優(yōu)選為pGEX-R185或pGEX-R150。
7.一種鼻咽癌診斷試劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項的抗原蛋白。
8.一種用于檢測EB病毒抗體的組合診斷試劑，其包含
1)氨基酸序列如SEQ ID NO3所示的抗原蛋白或含有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的融合抗原蛋白；和
2)氨基酸序列如SEQ ID NO4所示的抗原蛋白或含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的融合抗原蛋白。
9.一種用于鼻咽癌診斷的試劑盒，其包括根據(jù)權(quán)利要求7或8的診斷試劑。
10.一種體外檢測EB病毒的方法，包括以下步驟
(1)使用權(quán)利要求7或8所述的診斷試劑包被ELISA反應(yīng)孔板；
(2)洗凈反應(yīng)孔板，用封閉液封閉；
(3)洗凈反應(yīng)孔板，加入待測血清并孵育；
(4)洗凈反應(yīng)孔板，加入標(biāo)記二抗；
(5)洗凈反應(yīng)孔板，通過二抗相應(yīng)檢測方法判定結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了鼻咽癌特異基因BRLF1的蛋白產(chǎn)物Rta的兩個抗原性蛋白片段，其編碼基因，重組載體，融合蛋白(GST-R185和GST-R150)，含有它們的鼻咽癌診斷試劑和ELISA試劑盒，以及它們在體外檢測EB病毒的方法中的應(yīng)用。本發(fā)明的ELISA試劑盒可以用于鼻咽癌篩查、早期診斷和治療效果預(yù)測，優(yōu)點(diǎn)是簡單、靈敏、特異、適用于鼻咽癌的早期診斷和預(yù)后，以及高危人群的大規(guī)模篩查，易于大范圍推廣應(yīng)用，使用安全而且無污染，具有廣闊的市場前景。
文檔編號C07K19/00GK101153059SQ20061011340
公開日2008年4月2日 申請日期2006年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月27日
發(fā)明者胡懷忠 申請人:同昕生物技術(shù)(北京)有限公司