專利名稱：Pi3k酶抑制劑－5－(3－氨基苯)煙酸甲酯類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PI3K酶抑制劑，尤其涉及一種5-(3-氨基苯)煙酸甲酯類似物。
背景技術(shù)：
癌癥、高血壓和血栓病都是人類目前最難克服的幾種頑癥，亦是世界醫(yī)學(xué)的幾大難題。癌癥是世界上奪走生命最多的疾病，每年死亡人數(shù)有七百萬左右。我國癌癥年新發(fā)病例為200萬，因癌癥死亡人數(shù)為140萬，每死亡5人中，即有1人死于癌癥。癌癥已成為我國城市的第一殺手，農(nóng)村的第二大死因。高血壓是常見高發(fā)疾病，據(jù)統(tǒng)計到2025年全世界將有超過15億高血壓患者，其中四分之三的患者將來自發(fā)展中國家。高血壓會導(dǎo)致心血管、腦血管、腎血管以及大血管等病變。血栓病亦是困擾人們的常見疾病。因此針對上述幾種疾病的藥物開發(fā)與研制已成為近年來的重要課題。
PI3K家族與眾多生理、病理過程(尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展)密切相關(guān)，使其日益成為關(guān)注的研究熱點和多種疾病藥物治療的靶點，尤其是被認為是設(shè)計腫瘤特異性藥物的潛在靶點。
研究表明，體內(nèi)持續(xù)高水平的PI(3，4，5)P3會激活其下游蛋白，從而導(dǎo)致極度炎癥。由于PI3Kγ酶在細胞轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用，因此PI3Kγ酶抑制劑可用于很多炎癥疾病的治療，如哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥以及大腸發(fā)炎性疾病。此外，PI3Kγ酶抑制劑能夠用于抗血栓的治療，且能夠通過降低心肌細胞中cAMP的水平調(diào)控心肌功能，改善其心臟收縮性。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)PI3Ks酶在調(diào)控血管緊張度、心肌收縮力以及細胞大小方面有十分重要的作用。一些PI3Ks依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路功能障礙則是導(dǎo)致其它心血管疾病(如高血壓)發(fā)病的重要因素。高血壓引發(fā)得自發(fā)性緊張能夠為PI3K酶抑制劑LY294002和wortmannin消除，而患有高血壓的老鼠動脈中PI3K酶活性增強同時伴隨著p110β、p110δ亞基的高表達。由此可見，PI3K酶抑制劑對于高血壓的治療也是大有裨益的。
PI3K酶作為藥物靶標在多種癌癥治療方面也有著廣闊的前景。1998年，Phillips等人發(fā)現(xiàn)，直腸腫瘤中PI3K酶脂產(chǎn)物水平大大增高。1999年，Gershtein也觀察到乳腺癌中也存在相同現(xiàn)象。據(jù)Myers報道，磷酸酶PTEN催化的PI3K酶脂產(chǎn)物去磷酸化能夠阻礙腫瘤的形成。
此外，由于PI3K/Akt信號通路在引起生物體產(chǎn)生耐藥性方面起著重要的作用，而PI3K酶抑制劑對于增強化療藥物的藥效將大有益處。因此近年來PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為腫瘤病靶向治療的潛在靶點受到了廣泛關(guān)注。
隨著對PI3K酶在多種疾病發(fā)病中的作用的逐步認識，PI3Ks酶抑制劑作為疾病治療藥物的價值，引起了國內(nèi)外的關(guān)注并開展了廣泛研究。這些藥物可直接抑制與PI3K酶相關(guān)通路中過渡活化的PI3K酶，從而起到阻斷致病環(huán)節(jié)的作用。Wortmannin和LY294002是其中幾種較為廣泛應(yīng)用的PI3K抑制劑。然而Wortmannin屬于脂溶性化合物，在水相環(huán)境中不穩(wěn)定，從而限制了其在臨床上的應(yīng)用，且Wortmannin不可逆地同PI3Ks酶發(fā)生相互作用，因此作為藥物其毒性不言而喻。LY294002是目前唯一進入臨床研究的PI3K酶抑制劑藥物，然其活性太強，對正常細胞毒性大。此外，國外已有幾篇關(guān)于PI3Ks酶選擇性抑制劑的專利，然而至今都未能應(yīng)用于臨床治療。它們均屬于傳統(tǒng)藥物發(fā)現(xiàn)。首先，大量篩選化合物尋找先導(dǎo)化合物。其次，對先導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)改造。此法具有很大的盲目性，且成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種新的PI3K酶抑制劑及其應(yīng)用，以滿足PI3Ks酶抑制劑藥物開發(fā)的需要。
本發(fā)明所說的PI3K酶抑制劑為具有通式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽 其中-R1選自-NH2，-NO2，-CN，-COOH或-X(X為鹵素中的一種)；-R2為有取代基的六元雜芳環(huán)基；-R3為-H或-COOH。
優(yōu)選的R2選自 或 中的一種；-R4，-R5均為-X-R6，其中-X-為-，-O-， 或 中的一種；-R6為-H或C1-C3的烷基。
優(yōu)選的酶抑制劑為2-(3-氨基苯基)-4，6-二甲氧基嘧啶、
2-甲氧基-5-(3-氨基苯基)吡啶、2-(3-氨基苯基)-5-甲基吡啶、3-(3-氨基苯基)-6-甲氧基噠嗪、3-(3-氨基苯基)-6-異丙氧基噠嗪或2-甲氧基-5-(3-硝基-5-羧基苯基)吡啶測活試驗證明，本發(fā)明的PI3K酶抑制劑對PI3K酶活性過高導(dǎo)致的疾病如炎癥、血栓、自身免疫性疾病、高血壓、心功能不全性疾病和腫瘤有十分顯著的療效，可用于制備治療PI3K酶活性過高導(dǎo)致疾病的藥物；本發(fā)明的PI3K酶抑制劑毒性低。
本發(fā)明的PI3K酶抑制劑，活性高，水溶性適中，預(yù)示具有較大的臨床應(yīng)用前景。


圖1為六種目標化合物對PI3Ks酶活性的影響。
具體實施例方式
PI3K酶抑制劑類新藥的計算機設(shè)計與篩選1、采用計算機輔助藥物設(shè)計(computer-aided drug design，CADD)技術(shù)研究PI3K酶抑制劑在三維空間中與PI3K酶的結(jié)合模式，揭示其生物活性的分子機制，從而闡明PI3K酶抑制劑構(gòu)效關(guān)系。
2、將已知PI3Kγ抑制劑和PI3Kγ進行分子對接，獲得已知抑制劑與PI3Kγ的理論結(jié)合自由能，從而得到已知抑制劑同PI3Kγ的理論結(jié)合自由能與它們對PI3Kγ的生物活性(IC50)的線性關(guān)系方程并以此建立PI3K酶抑制劑的虛擬篩選模型。利用該模型篩選化合物數(shù)據(jù)庫，以獲得新的先導(dǎo)化合物(此項工作已完成，具體方法步驟見專利5-(3-氨基苯)煙酸甲酯及其類似物作為PI3K酶抑制劑的應(yīng)用，申請?zhí)?00610024237.9，公開號CN1850081A.)。
PI3K酶抑制劑類新藥的結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化采用計算機輔助藥物設(shè)計(computer-aided drug design，CADD)技術(shù)合理改造所發(fā)現(xiàn)的PI3K酶抑制劑新藥的結(jié)構(gòu)進行以下工作1、探討已知PI3K酶抑制劑結(jié)構(gòu)與藥效之間的相互關(guān)系，獲得PI3K酶抑制劑藥效團模型；2、其次，探尋新型PI3K酶抑制劑在三維空間中與PI3K酶的結(jié)合模式，揭示其生物活性的分子機制3、再次，根據(jù)其分子機制以及PI3K酶抑制劑藥效團模型設(shè)計并合成得到一系列新化合物，對新合成化合物生物測活并研究該類型化合物的構(gòu)效關(guān)系；對新合成目標化合物生物測活方法如下A.目標化合物處理人前列腺腫瘤細胞PC-3細胞，提取處理后PC-3細胞的總蛋白，用western印跡法顯示總蛋白提取液中的磷酸化AKT酶，再用生物電泳圖像分析系統(tǒng)定量掃描磷酸化AKT酶條帶；目標化合物對PC-3細胞中PI3K酶的抑制率為 ......式IIB.用目標化合物濃度對PI3K酶抑制率作圖，計算目標化合物的IC50C.判斷IC50≤150μM，結(jié)果為陽性，IC50＞150μM，結(jié)果為陰性，陽性的化合物即為有效的PI3K抑制劑。
4、基于構(gòu)效關(guān)系合成新化合物，如此反復(fù)循環(huán)以獲得較理想的PI3K酶抑制劑類新藥。
本發(fā)明采用的PI3Kγ三維結(jié)構(gòu)來自Protein Data Bank庫，采用文本編輯軟件將水和配體除去，目標化合物的三維結(jié)構(gòu)用Cerius2軟件建立，AutoDock 3.0版本來源于the Scripps Research Institute Office of ThechologyDevelopment。
PC-3腫瘤細胞株購于中國科學(xué)研究院；各目標化合物參照文獻(J.Org.Chem.1984，495237-5243)方法合成，槲皮素購于Sigmma公司，磷酸化AKT抗體購于Biosourc公司；western-blot印跡法結(jié)果采用復(fù)日Smartview生物電泳圖像分析系統(tǒng)進行定量分析。
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明做進一步地說明，但本發(fā)明并不受限于下述實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 2-(3-氨基苯基)-4，6-二甲氧基嘧啶的合成步驟A合成2-(3-硝基苯基)-4，6-二甲氧基嘧啶。
具體方法為將2-氯-4，6-二甲氧基嘧啶1.41g(8mmol)和間硝基苯硼酸1.366g(8mmol)放入三頸瓶中，加入甲醇5ml，甲苯35ml后磁力攪拌溶解。加入碳酸鈉1.7g及蒸餾水8ml于三頸瓶中，通氮氣20min后，加入0.48g(4mmol催化劑Pd(pph3)4，繼續(xù)通氮氣15min后油浴加熱(70V)，待穩(wěn)定回流時，開始計時，反應(yīng)24h，期間一直通氮氣保護。反應(yīng)結(jié)束后，將三頸瓶中的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸干后再用乙酸乙酯(80ml)提取，抽濾得濾液。將濾液用硅膠層析柱分離(石油醚∶乙酸乙酯＝6∶4)，Rf＝0.80。得1g中間產(chǎn)物2-(3-硝基苯基)-4，6-二甲氧基嘧啶，產(chǎn)率為50％。
熔點白色固體，129-131℃；
MS(EI)m/z 260([M-H]+，100％)，m/z 261(M+，87％)；1H-NMR(CDCl3)4.10(s，6H)，6.08(s，1H)，7.64(t，J＝8.0Hz，1H)，8.32(d，J＝8.0Hz，1H)，8.79(d，J＝8.0Hz，1H)，9.26(s，1H)；元素分析C12H11N3O4實測值(理論值)/％為C 55.25(55.17)，H 4.01(4.02)，N 16.33(16.09)。
步驟B將2-(3-硝基苯基)-4，6-二甲氧基嘧啶的硝基還原，得到2-(3-氨基苯基)-4，6-二甲氧基嘧啶。
具體方法為將1g中間產(chǎn)物2-(3-硝基苯基)-4，6-二甲氧基嘧啶與7g氯化亞錫一同加入到盛有45ml異丙醇的圓底燒瓶中，再加入15ml濃鹽酸，磁力攪拌，油浴加熱至50℃，反應(yīng)8h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用5％的冰NaOH溶液中和至中性，抽濾，所得固狀物用乙酸乙酯提取，抽濾，濾液加無水硫酸鈉干燥，靜置過夜。旋轉(zhuǎn)蒸干，冷卻，得到預(yù)期產(chǎn)物2-(3-氨基苯基)-4，6-二甲氧基嘧啶0.66g，產(chǎn)率為74％，Rf(石油醚∶乙酸乙酯＝6∶4)＝0.65。
熔點黃色固狀物，100-102℃；MS(EI)m/z 231[M+，100％]；1H-NMR(CDCl3)3.99(s，6H)，5.35(br s，2H)，6.18(s，1H)，6.76(d，J＝8.0Hz，1H)，7.17(t，J＝8.0Hz，1H)，7.58(d，J＝7.0Hz，1H)，7.75(s，1H)；元素分析C12H10N2O2實測值(理論值)/％為C 62.60(62.33)，H 5.51(5.67)，N 17.96(18.17)；HPLC分析純度約為98％。
實施例2 2-甲氧基-5-(3-氨基苯基)吡啶的合成步驟A合成2-甲氧基-5-(3-硝基苯基)吡啶，具體方法同實施例1中步驟A，使用1.51g(8mmol)5-溴-2-甲氧基吡啶；硅膠層析柱分離(石油醚∶乙酸乙酯＝7.5∶2.5)，Rf值為0.65；得到1.15g中間產(chǎn)物2-甲氧基-5-(3-硝基苯基)吡啶，產(chǎn)率為56％。
熔點黃色固體，94℃-96℃；MS(EI)m/z 230[M+，100％]；1H-NMR(CDCl3)4.10(s，3H)，6.88(d，J＝8.0Hz，1H)，7.63(t，J＝8.0Hz，1H)，7.84(d，J＝8.0Hz，1H)，7.87(d，J＝8.0Hz，1H)，8.2 1(d，J＝8.0Hz，1H)，8.39(s，1H)，8.45(s，1H)；元素分析C12H10N2O3實測值(理論值)/％為C 62.85(62.61)，H 4.11(4.38)，N 12.01(12.17)。
步驟B硝基還原，得到預(yù)期產(chǎn)物2-甲氧基-5-(3-氨基苯基)吡啶。具體方法同實施例1中步驟B，使用1.06g中間產(chǎn)物2-甲氧基-5-(3-硝基苯基)吡啶，得到0.7g預(yù)期產(chǎn)物2-甲氧基-5-(3-氨基苯基)吡啶，產(chǎn)率為80％，其Rf(石油醚∶乙酸乙酯＝5∶5)＝0.65。
熔點黃色油狀物；MS(EI)m/z 200[M+，100％]；HR-MS(EI)C12H12N2O實測值(理論值)為200.0964(200.0950)；1H-NMR(CDCl3)3.75(br s，2H)，3.98(s，3H)，6.68(d，J＝8.0Hz，1H)，6.78(d，J＝9.0Hz，1H)，6.85(s，1H)，6.92(d，J＝8.0HZ，1H)，7.21(m，J＝9.0HZ，1H)，7.75(d，J＝9.0Hz，1H)，8.41(s，1H)；HPLC分析純度約為99％。
實施例3 2-(3-硝基苯基)-5-甲基吡啶的合成步驟A合成2-(3-氨基苯基)-5-甲基吡啶，具體方法同實施例1中步驟A，使用2-溴-5-甲基吡啶；硅膠層析柱分離(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)，Rf值為0.6；得到0.55g中間產(chǎn)物3-甲基-6-(3-硝基苯基)吡啶，產(chǎn)率為32％。
熔點白色固體，82℃-84℃MS(EI)m/z 214[M+]；
1H-NMR(CDCl3)2.41(s，3H)，7.63(t，J＝8.0Hz，2H)，7.71(d，J＝8.0Hz，1H)，8.24(d，1H)，8.34(d，1H)，8.56(s，1H)，8.84(s，1H)；元素分析C12H10N2O2實測值(理論值)/％為C 67.11(67.28)，H，4.45(4.71)，N，13.05.(13.08)。
步驟B硝基還原反應(yīng)，得到預(yù)期產(chǎn)物2-(3-氨基苯基)-5-甲基吡啶。具體方法同實施例1中的步驟B，使用1.1g中間產(chǎn)物3-甲基-6-(3-硝基苯基)吡啶，得到0.72g預(yù)期產(chǎn)物3-甲基-6-(3-氨基苯基)吡啶，產(chǎn)率為76％，Rf(石油醚∶乙酸乙酯＝7∶3)＝0.48。
熔點黃色油狀液體MS(EI)m/z 184[M+，100％]；HR-MS(EI)C12H12N2實測值(理論值)為184.1005(184.1000)；1H-NMR(CDCl3)2.39(s，3H)，3.29(br s，2H)，6.75(s，1H)，7.25(m，J＝4.0Hz，1H)，7.30(d，J＝8.0Hz，1H)，7.35(s，1H)，7.53(d，J＝8.0Hz，1H)，7.59(d，J＝8.0Hz，1H)，8.50(s，1H)；HPLC分析純度約為97％。
實施例43-(3-氨基苯基)-6-甲氧基噠嗪的合成步驟A合成3-氯-6-甲氧基噠嗪。
具體方法為將11.92g(0.08mol)3，6-二氯噠嗪置于三頸燒瓶中，加入少量無水甲醇，磁力攪拌溶解。另將4.32g的甲醇鈉溶于200ml無水甲醇中，置于50ml恒壓漏斗中，并緩緩滴加到三頸燒瓶中，油浴加熱(70V)，待回流時，開始計時，反應(yīng)1小時。抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸干，得到白色固狀粉末，用蒸餾水洗滌，抽濾，真空干燥，再將之溶于適量甲醇中，抽濾，濾液用無水硫酸鈉干燥，靜置。待其中有機溶劑揮發(fā)，抽濾，干燥，用甲醇重結(jié)晶，得到預(yù)期的中間產(chǎn)物1(3-氯-6-甲氧基噠嗪)。
熔點82℃-83℃；
MS(EI)m/z 144，146[M+]。
步驟B合成3-(3-硝基苯基)-6-甲氧基噠嗪。
具體方法同實施例1中步驟A，使用1.19g(8mmol)中間產(chǎn)物1(3-氯-6-甲氧基噠嗪)；硅膠層析柱分離(石油醚∶乙酸乙酯＝5∶5)，Rf值為0.71。得到1.18g中間產(chǎn)物2(3-(3-硝基苯基)-6-甲氧基噠嗪)，產(chǎn)率為64％。
熔點白色固體，154℃-155℃MS(EI)m/z 231[M+，100％]；1H-NMR(CDCl3)4.22(s，3H)，7.13(d，J＝9.0Hz，1H)，7.71(t，J＝8.0Hz，1H)，7.88(d，J＝9.0Hz，1H)，8.32(d，J＝9.0Hz，1H)，8.44(d，J＝8.0Hz，2H)，8.85(s，1H)；元素分析C12H10N2O2實測值(理論值)/％為C 57.23(57.14)，H 3.76(3.92)，N 18.38(18.17)。
步驟C硝基還原，得到預(yù)期產(chǎn)物3-(3-氨基苯基)-6-甲氧基噠嗪。
具體方法同實施例1中的步驟B，使用0.97g中間產(chǎn)物2(3-(3-硝基苯基)-6-甲氧基噠嗪)，得到0.31g預(yù)期產(chǎn)物3-(3-氨基苯基)-6-甲氧基噠嗪，產(chǎn)率為37％，Rf(石油醚∶乙酸乙酯＝6∶4)＝0.44。
熔點94℃-95℃MS(EI)m/z 201[M+]；HR-MS(EI)C11H11N3O實測值(理論值)為201.0889(201.0902)；1H-NMR(CDCl3)3.68(br s，2H)，4.199(s，3H)，6.77(d，J＝8.0Hz，1H)，7.02(d，J＝10.0HZ，1H)，7.28(m，J＝8.0Hz，2H)，7.44(s，1H)，7.73(d，J＝10.0Hz，1H)；HPLC分析純度約為98％。
實施例5 3-(3-氨基苯基)-6-異丙氧基噠嗪的合成步驟A合成3-氯-6-異丙氧基噠嗪。
在三頸燒瓶中加入200ml異丙醇，加入2.012g金屬鈉，磁力攪拌，加入11.674g 3，6-二氯噠嗪，繼續(xù)攪拌，水浴加熱至60℃，反應(yīng)2.5h。抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸干，殘留物用蒸餾水洗至洗脫液呈無色，真空干燥，用石油醚重結(jié)晶，真空干燥，得到預(yù)期中間產(chǎn)物1(3-氯-6-異丙氧基噠嗪)。
熔點56℃-58℃；MS(EI)m/z 172，174[M+]。
步驟B合成3-(3-硝基苯基)-6-異丙氧基噠嗪。
具體方法同實施例1中步驟A，使用1.38g(8mmol)中間產(chǎn)物1(3-氯-6-異丙氧基噠嗪)；硅膠層析柱分離(石油醚∶乙酸乙酯＝7.5∶2.5)，Rf值為0.65；得到1.70g中間產(chǎn)物2(3-(3-硝基苯基)-6-異丙氧基-噠嗪)，產(chǎn)率為82％。
熔點白色固體，109℃-112℃；MS(EI)m/z 259[M+]；HR-MS(EI)C13H13N3O3m/z實測值(理論值)259.0989(259.0967)。
步驟C將中間產(chǎn)物2(3-(3-硝基苯基)-6-異丙氧基-噠嗪)的硝基還原，得到最終產(chǎn)物3-(3-氨基苯基)-6-異丙氧基噠嗪。
具體方法同實施例1步驟B，使用1.81g中間產(chǎn)物2(3-(3-硝基苯基)-6-異丙氧基-噠嗪)，12.556g氯化亞錫，得到0.82g預(yù)期產(chǎn)物3-(3-氨基苯基)-6-異丙氧基噠嗪，產(chǎn)率為52％，Rf(石油醚∶乙酸乙酯＝6.5∶3.5)＝0.36。
熔點黃色油狀物；MS(EI)m/z 229[M+]；HR-MS(EI)C13H15N3O實測值(理論值)為229.1225(229.1215)；1H-NMR(CDCl3)1.45(s，6H)，3.72(br s，2H)，5.61(m，J＝6.0Hz，1H)，6.78(d，J＝7.0Hz，1H)，6.95(d，J＝9.0Hz，1H)，7.2-7.3(m，J＝7.0Hz，2H)，7.45(s，1H)，7.73(d，J＝9.0Hz，1H)；HPLC分析純度約為99％。
實施例6 2-甲氧基-5-(3-硝基-5-羧基苯基)吡啶步驟將5-溴-2-甲氧基吡啶1.51g(8mmol)和3-硝基-5羧基苯硼酸1.7g(8mmol)放入三頸瓶中，加入甲醇5ml，甲苯25ml后磁力攪拌溶解。加入碳酸鈉1.7g，蒸餾水8ml于三頸瓶中，計時，通氮氣20min后，加入0.48g(0.4mmol)催化劑Pd(pph3)4，繼續(xù)通氮氣15min后油浴加熱(70V)，待穩(wěn)定回流時，開始計時，反應(yīng)24h。反應(yīng)完后，將其轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸干后再用乙酸乙酯提取，抽濾得濾液。將濾液用硅膠層析柱分離(石油醚∶乙酸乙酯∶鹽酸＝30∶20∶3)，Rf＝0.62，得0.65g預(yù)期產(chǎn)物2-甲氧基-5-(3-硝基-5-羧基苯基)吡啶為白色固體，產(chǎn)率為30％。
MS(ESI-)m/z 273[M-H]；HNMR(CDCl3)3.99(s，3H)，6.99(d，J＝8.0Hz，1H)，8.22(d，J＝9.0Hz，1H)，8.62-8.75(m，4H)；HPLC分析純度約為96％。
實施例7 六種目標化合物對PI3Ks酶活性的抑制具體方法步驟mX10n個PC-3腫瘤細胞接種到35mm的培養(yǎng)皿上，加細胞培養(yǎng)液1ml。加入20μM和40μM濃度的5-(3-氨基苯)煙酸甲酯作為實驗組，加入槲皮素100μM作為陽性對照組，同時設(shè)置陰性對照，處理腫瘤細胞株6小時。
藥物處理后的細胞用PH＝7.4的冰浴PBS緩沖液洗滌兩次。用細胞刮片收集細胞，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，去上清液，加1ml冰浴PBS(含蛋白酶抑制劑)，洗滌沉淀，并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至Ep管，4℃，14000g離心15秒。細胞沉淀重新懸浮于RIPA細胞裂解液(150mM NaCl、pH8.0 100mM Tris、1％Triton X-100、1％deoxycholic acid、0.1％SDS和5mM EDTA)中，靜置20分鐘，12000g離心7分鐘，收集上清液于Ep管中備用。
按DC蛋白定量試劑盒(Bio-Rad公司)操作說明測定蛋白質(zhì)濃度。配制試劑A，每毫升試劑A中添加20μl試劑S。配制不同濃度的蛋白標準品。移取5μl不同濃度的蛋白標準品和樣品至Ep管，每管添加25μl試劑A’和250μl試劑B，搖均勻。15分鐘后，在波長750nm下測定吸光度，作標準曲線，測定蛋白質(zhì)含量。
取等量蛋白100μg，用7％SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，而后從SDS-聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜，封閉硝酸纖維素濾膜的免疫球蛋白結(jié)合位點。室溫下，將5ml一抗(磷酸化AKT抗體，Biosourc公司)溶液加入至自封袋中。4℃下過夜。按常規(guī)方法加入二抗，用ECL試劑顯影。結(jié)果見圖1。
western-blot印跡法結(jié)果采用復(fù)日Smartview生物電泳圖像分析系統(tǒng)進行定量分析，評價被篩選化合物的生物活性，新化合物合成實施例中六種目標化合物在30μM濃度下分別能抑制20％、30％、40％、27％、-40％及-50％的PI3Ks酶活性，體現(xiàn)出量效關(guān)系，實驗結(jié)果為正的化合物具有抑制性，實驗結(jié)果為負的化合物則具有刺激性。
權(quán)利要求
1.一種PI3K酶抑制劑，為具有通式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽 其中—R1選自—NH2，—NO2，—CN，—COOH或—X(X為鹵素中的一種)；—R2為有取代基的六元雜芳環(huán)基；—R3為—H或—COOH。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PI3K酶抑制劑，其特征在于，R2選自 中的一種；—R4，—R5均為—X—R6，其中—X—為 或 中的一種；—R6為—H或C1-C3的烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PI3K酶抑制劑，其特征在于，所說的酶抑制劑為2-(3-氨基苯基)-4，6-二甲氧基嘧啶、2-甲氧基-5-(3-氨基苯基)吡啶、2-(3-氨基苯基)-5-甲基吡啶、3-(3-氨基苯基)-6-甲氧基噠嗪、3-(3-氨基苯基)-6-異丙氧基噠嗪或2-甲氧基-5-(3-硝基-5-羧基苯基)吡啶
4.權(quán)利要求1、2或3所述的PI3K酶抑制劑在備治療PI3K酶活性過高導(dǎo)致疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一總PI3K酶抑制劑及其應(yīng)用。測活試驗證明，本發(fā)明的PI3K酶抑制劑對PI3K酶活性過高導(dǎo)致的疾病如炎癥、血栓、自身免疫性疾病、高血壓、心功能不全性疾病和腫瘤有十分顯著的療效，可用于制備治療PI3K酶活性過高導(dǎo)致疾病的藥物；本發(fā)明的PI3K酶抑制劑，活性高，水溶性適中，預(yù)示具有較大的臨床應(yīng)用前景。本發(fā)明的PI3K酶抑制劑毒性低。所說的PI3K酶抑制劑，為具有通式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
文檔編號C07D213/38GK1962644SQ20061011911
公開日2007年5月16日 申請日期2006年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月5日
發(fā)明者魏東芝, 吳娉娉, 匡榮仁 申請人:華東理工大學(xué)