專(zhuān)利名稱(chēng)：重組日本七鰓鰻口腔腺分泌l-250蛋白抗凝血功效的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
日本七鰓鰻口腔腺分泌具組胺釋放因子活性的TCTP模體蛋白一L-250的基因克隆與表達(dá)屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域。涉及日本七鰓鰻口腔腺分泌L-250蛋白的cDNA序列及克隆，與其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)氨基酸序列及其 在大腸桿菌或畢赤酵母中的表達(dá)，及L-250蛋白作為組胺釋放因子，剌激嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺。組胺能 增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)凝血酶調(diào)節(jié)素TM, —方面它能與凝血酶結(jié)合，降低凝血酶活性；另一方面能 夠活化蛋白C，從而觸發(fā)抗凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這提示，L-250蛋白的組胺釋放因子活性在抗凝及心腦血管疾 病治療方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
日本七鰓鰻a。附/7e^ayaj5o"!'ca)系圓口綱(Cycpostomata)、七鰓鰻目(Petromyzoniformes)、七鰓鰻 科(Petromyzontidae)、七鰓鰻屬"W/je"tero")。在進(jìn)化上因連接著脊椎與無(wú)脊椎動(dòng)物而具有極高的研究 價(jià)值。在海水中營(yíng)半寄生生活，以其特有的口吸盤(pán)吸附在其他魚(yú)類(lèi)軀體上，靠吸食其血肉生存，并使宿主 流血不止，提示在其口腔腺中存在某種抗凝機(jī)制。
血管內(nèi)壁主要存在兩種抗凝機(jī)制，分別為蛋白酶類(lèi)凝血抑制機(jī)制和蛋白酶抑制劑類(lèi)抑制機(jī)制。在蛋白 酶類(lèi)凝血抑制機(jī)制中，蛋白C起主要作用。蛋白C (PC)為絲氨酸蛋白酶，是由肝臟分泌的一種生理性抗 凝劑，它以酶原形式存在于血漿中，PC在自然狀態(tài)下是無(wú)活性的，經(jīng)凝血酶的激活，可成為活化的蛋白C (APC)。 APC通過(guò)使已活化的VI1I因子、V因子等凝血因子滅活，從而抑制凝血過(guò)程。然而，凝血酶對(duì)PC 的激活是相當(dāng)慢的、凝血酶只有與存在于內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的血栓調(diào)節(jié)蛋白，又叫做凝血酶調(diào)節(jié)素(TM) 形成復(fù)合物后，才能有效地激活PC。 TM是內(nèi)皮細(xì)胞膜上的凝血酶受體之一，與凝血酶結(jié)合，會(huì)降低凝血 酶活性，并加強(qiáng)凝血酶激活蛋白C的作用。因此，TM是使凝血酶由促凝轉(zhuǎn)向抗凝的重要的血管內(nèi)凝血抑 制成份。
翻譯控制腫瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)又叫做組胺釋放因子，被認(rèn)為在慢 性過(guò)敏性疾病中起重要作用。該家族蛋白具有2個(gè)特征結(jié)構(gòu)域，即 TCTP-1([IFAEHGAHGAS]-N-[PAK〗-S-[GTA〗-E-[GDEV]-[PAGEQV]-[DEQGAV〗和TCTP-2 ([FLIV]-x(4)-[FLVH〗-[FY]-[MIVCT]-G-E-x(4,7)-[DENP]-[GAST]-x-[LIVM]-[GAVI〗-x(3HFYWQ])，這2個(gè)區(qū)域在不同物種間具有高度的序列同源性。1995年MacDonald等首次發(fā)現(xiàn)了這一蛋白家族的細(xì)胞外生物學(xué)
功能，通過(guò)對(duì)過(guò)敏病人體液中和遺傳過(guò)敏癥兒童淋巴細(xì)胞中存在的Ig-E依賴(lài)性組胺釋放因子進(jìn)行氨基酸末 端序列分析，發(fā)現(xiàn)組胺釋放因子與小鼠和人的翻譯控制腫瘤蛋白具有同源性，TCTP能夠刺激人嗜堿性粒 細(xì)胞釋放組胺，人血吸蟲(chóng)和瘧原蟲(chóng)等多種寄生蟲(chóng)可分泌TCTP至宿主血液中，刺激宿主細(xì)胞釋放組胺，從 而影響宿主免疫應(yīng)答。此外，組胺還能夠引起血管擴(kuò)張效應(yīng)，增強(qiáng)局部血流；使血管內(nèi)皮細(xì)胞表面凝血酶 調(diào)節(jié)素TM的表達(dá)增高，它一方面能與凝血酶結(jié)合，降低其活性；另一方面能夠活化蛋白C，活化的蛋白 C能夠阻礙凝血因子X(jué)a與血小板的結(jié)合，并刺激纖溶酶原激活物的釋放而促進(jìn)纖維蛋白溶解，還能在其 輔因子蛋白S的作用下滅活凝血因子Va和Vffla，這三條通路最終都能夠引起抗凝血反應(yīng)的發(fā)生。本發(fā)明旨 次發(fā)現(xiàn)了存在于日本七鰓鰻口腔腺中的TCTP模體蛋白新基因，并將其命名為L(zhǎng)-250，而且本項(xiàng)目的日本 七鰓鰻口腔腺中TCTP模體蛋白-L250具有組胺釋放因子活性，能夠刺激嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺，從而引 發(fā)一系列抗凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，提示L250蛋白將在臨床抗凝治療方面具有應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本項(xiàng)發(fā)明在日本七鰓鰻口腔腺cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了 L-250蛋白的開(kāi)放閱讀框，經(jīng)對(duì)其mRNA全長(zhǎng)的 進(jìn)行釣取、測(cè)序、及cDNA克隆，對(duì)其重組蛋白在大腸桿菌中進(jìn)行高效誘導(dǎo)表達(dá)。L-250重組蛋白生物學(xué) 活性涉及作為組胺釋放因子，刺激嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺。
本發(fā)明涉及日本七鰓鰻口腔腺分泌L-250蛋白的cDNA序列及克隆、與之對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列及其在大 腸桿菌或畢赤酵母中的表達(dá)，及其刺激嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺的生物學(xué)活性，以及抗凝血方面的應(yīng)用。
本發(fā)明從日本七鰓鰻口腔腺中分離提取mRNA，利用前期構(gòu)建的cDNA文庫(kù)、EST庫(kù)中獲得的生物學(xué) 信息及mRNA全長(zhǎng)釣取的測(cè)序結(jié)果選取開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物,采用RT-PCR方法獲得了 L-250蛋白的cDNA 及其序列，本發(fā)明還提供了 L-250蛋白在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)的蛋白及其序列，L-250蛋白具有組 胺釋放因子的生物學(xué)活性，在臨床上抗凝血方面有巨大的應(yīng)用潛能。
L-250蛋白cDNA序列以其推導(dǎo)的蛋白質(zhì)氨基酸序列如下
L-250蛋白cDNA序列519 bp，其蛋白質(zhì)由172個(gè)氨基酸組成，含有一個(gè)TCTP模體，蛋白分子量為 22,408 kDa。
atg atc atctacaag gac ateetc acc ggg gac gag atgttcteg45
Met lie lieTyr Lys Asp lieLeu Thr Gly Asp Glu MetPheSer
gac ate tacate aag gagacg gcg gac ggc gec tgcttcgag90
Asp lie TyrLyslie Lys GluThr Ala Asp Gly Ala CysPheGlu
gtg gaa ggcatg gtg tecegg gtg gaa ggc gac ategac135
Val Glu GlyThrMet Val SerArg Val Glu Gly Asp lieAsp Aspgcg gtctttggcgg3gettcggcaggggg3g33tttgat180
Ala ValPheGlyGlyAsnAlaSerAlaGluGlyGlyGluPheAsp
tcg tcggagtcgtctacagtgtecggcgtggacategtgetc225
Ser SerGluSerSerThrValSerGlyValAsplieValLeuAsn
C3C ￡1犯ctgcagaccagettc鄉(xiāng)gagtacattgec270
His LysLeuGinGluThrSerPheSerLysGluLysTyrlieAla
tac ategectacattctgatggag315
Tyr lieLysAlaTyrMetLysThrlieLysGluAsnLeuMetGlu
aaa cacccggag卿gtgg幼cccttcatgactgetgetgec360
Lys HisProGluLysValGluProPheMetThrAlaAlaAlaLys
卿gtt33agtcttaaagcaattc卿gatttccagtttttc405
Lys ValLysAspValLeuLysGinPheLysAspPheGinPhePhe
aca ggtgagageatg紛ccccgacggcatggtcgetcttctt450
Thr GlyGluSerMetGinProAspGlyMetValAlaLeuLeuGin
ttc cgcgaggacggaateacgccctacatgcttttcttc肪ggat495
Phe ArgGluAspGlylieThrProTyrMetLeuPhePheLysAsp
ggc ctgattgagaaatgc519
Gly LeuGlulieGluLysCys
L-250蛋白刺激嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺生物學(xué)活性如下:
本發(fā)明采用大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞系RBL-2H3評(píng)價(jià)L-250蛋白釋放組胺的能力，釆用r-biopharm公 司的酶免疫測(cè)定試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液上清中組胺的濃度。將1 X 105 RBL-2H3細(xì)胞于鄰孔板中孵育，直至細(xì)胞 匯合，L-250以不同的濃度梯度(0.3,4.8，10 pg/ml)，加至96孔板中孵育，不加蛋白的板孔作為對(duì)照，收集上 清，采用r-biopharm公司的酶免疫測(cè)定試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液上清中組胺的濃度。測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。 結(jié)果顯示，當(dāng)L-250濃度為0.3 ^g/ml時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液中組胺的量是對(duì)照組的2.2倍，之后隨著L-250濃度 的增強(qiáng)，組胺的量也隨之增大，說(shuō)明L-250蛋白能夠刺激RLB-2H3細(xì)胞釋放組胺，并且在痕量下就可起 作用。L250蛋白的組胺釋放因子活性，使其具有潛在的抗凝藥用價(jià)值。


圖I、本發(fā)明實(shí)驗(yàn)流程 圖2、 pET23b質(zhì)粒圖譜
圖3、重組pET23b-L251雙酶切鑒定
圖4、 L-250純化蛋白SDS-PAGE
圖5、 L-250蛋白剌激RBL-2H3細(xì)胞釋放組胺實(shí)驗(yàn)結(jié)果
具體實(shí)施例方式
1. 總RNA的提取采用G舊COBRL的Trizol試劑。具體如下
(1) 取日本七鰓鰻口腔腺迅速置于液氮中研磨；
(2) 稱(chēng)取0.2 g腺體組織及分泌物，加lml Trizol試劑制備勻漿，4'C孵育5 min;
(3) 加0.2ml氯仿，蓋緊蓋后用力振搖15sec，然后置于冰上5 min;
(4) 4°C, 12000g，離心15min;
(5) 將上層水相移入另一離心管，加0.5ml異丙醇，并在冰上孵育10min;
(6) 4°C, 12000g，離心15min;
(7) 棄上清，在沉淀(含RNA)中加lml75。/。乙醇洗滌，旋渦混勻；
(8) 4°C， lOOOOg，離心5min，得到RNA沉淀；
(
9) 空氣干燥后，用適量TE或無(wú)RNase水溶解備用。
2. 以自行設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，以獲得日本七鰓鰻口腔腺L-250蛋白的cDNA;按以下條件進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42°C 20min, 99°C 5 min， 5'C 5 min
引物序列如下-
Pl- 5， -XXcatatgatcatctacaaggacatcctc-3，
P2: 5， -XXaagcttgcatttctcaatttccaggcc-3，
3. 將獲取的目的cDNA與pET23b載體相連接，轉(zhuǎn)化入克隆菌DH5 a后進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定；為 產(chǎn)生帶有組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白，選擇pET-23b(+)作為基因克隆的載體，克隆具體操作如下
(1) 目的基因的回收與測(cè)序目的基因的回收采用TaKaRa PCR Fragment Recovery Kit進(jìn)行；對(duì)回收 DNA進(jìn)行測(cè)序，此項(xiàng)工作由寶生物工程(大連)有限公司完成；
(2) 質(zhì)粒的提取采用寶生物的質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行；
(3) 目的基因DNA片段與載體pET23b的連接由于所設(shè)計(jì)的引物分別帶有M/e I和III酶切位 點(diǎn)，而這兩個(gè)酶切位點(diǎn)也是pET23b的多克隆位點(diǎn)，這使得將目的基因DNA片段與載體pET23b 的連接成為可能；
(4) 將連接產(chǎn)物CaCl2法轉(zhuǎn)化至克隆菌E.coZ/BL21中；
(5) 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定利用T7通用引物法和雙酶切法進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定。
4. 對(duì)陽(yáng)性重組子進(jìn)行終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)條件為28'C,低溫過(guò)夜誘導(dǎo)。
5. 對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行組氨酸親和層析純化。
(1) 7000g離心15min收集菌體，棄上清，并使殘液盡量流出。以每100ml的原培養(yǎng)液加4 ml冰冷的 1 X Binding Buffer的比例重懸細(xì)胞；
(2) 將上述樣品置于冰上超聲裂解細(xì)胞，直至溶液不再粘稠；
(3) 4°C， 14000g，離心20min以去除細(xì)胞碎片；
(4) 上清以0.45um的濾膜過(guò)濾；
(5) 吸去His.BindColumn上室的貯液，并打開(kāi)下面管口；
(6) 用10 ml 1 X Binding Buffer對(duì)柱子進(jìn)行平衡；
(7) 將過(guò)濾好的上清液上樣；
(8) 用10 ml 1 X Binding Buffer洗柱；
(9) 用10 ml 1 X Wash Buffer洗柱；
(10) 用5 ml IXEluteBuffer洗脫目的蛋白。
6. 重組蛋白剌激嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺活性鑒定采用大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞系RBL-2H3評(píng)價(jià)重組蛋白 的組胺釋放能力，采用r-biopharm公司的酶免疫測(cè)定試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液上清中組胺的濃度。具體如下
(1) 1X1()S個(gè)RBL-2H3細(xì)胞于96孔板中孵育，直至細(xì)胞匯合；
(2) 將重組蛋白以不同的濃度梯度，分別為0.3， 4.8, 10ug/ml加至板中孵育，以不加任何蛋白的板孔 作為對(duì)照；
(3) 收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，并將其稀釋10倍；
(4) 取100ul標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)控及樣品加至?；逯?，之后向板孔中加25ul?；噭?br> (5) 加200ul?；彌_液至?；逯?，輕輕搖板并混合均勻，室溫孵育15min;
(6) 取25"1?；臉?biāo)準(zhǔn)，質(zhì)控及樣品到包被有組胺的微孔中；
(7) 力卩100ul組胺抗體到每一微孔中，混勻，室溫孵育40min;
(8) 倒出孔中液體，用250y l洗滌緩沖液充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重復(fù)兩次上述操作；
(9) 加IOO"I酶標(biāo)記物到每一微孔中，充分混合并在室溫下孵育20min;
(10) 洗板。重復(fù)(8)的操作；
(11) 加100ul底物/發(fā)色劑到每一微孔中，充分混合，室溫暗處孵育15min;
(12) 加100ul反應(yīng)終止液到每一微孔中，輕輕混合后于450nm處測(cè)定吸光值。
7. 使用r-biopharm公司專(zhuān)用的RIDA SOFT Win計(jì)算軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。
權(quán)利要求
1.一條來(lái)源于日本七鰓鰻口腔腺分泌物具組胺釋放因子活性的TCTP模體蛋白的cDNA序列及由其推導(dǎo)的蛋白質(zhì)氨基酸序列，特將此蛋白命名為L(zhǎng)-250，其特征在于cDNA序列519bp長(zhǎng)，其蛋白質(zhì)由172個(gè)氨基酸組成，含有一個(gè)TCTP模體，蛋白分子量為22,408kDa，其cDNA序列推導(dǎo)的蛋白質(zhì)氨基酸序列為M I I Y K D I L T G D E M F SD I Y K I K E T A D G A C F EV E G T M V S R V E G D I D DA V F G G N A S A E G G E F DS S E S S T V S G V D I V L NH K L Q E T S F S K E K Y I AY I K A Y M K T I K E N L M EK H P E K V E P F M T A A A KK V K D V L K Q F K D F Q F FT G E S M N P D G M V A L L NF R E D G I T P Y M L F F K DG L E I E K C *
2. 編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本七鰓鰻口腔腺L-250蛋白的基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于其核苷酸序列如下1 atgatcatctacaaggacatcctcaccggggacgagatgttctcg 46 gacatctacaagatcaaggagacggcggacggcgcctgcttcgag 91 gtgggcacgatggtgtcccgggtgggcgtcgacgac 136 gcggtctttggcggaaacgcttcggcggggggatUgat 181 tcgtcggagtcgtctacagtgtccggcgtggacatcgtgctcaac 226 cacaaactgcaggagaccagcttcagcaaggagaagtacEittgcc 271 tacatcaaggcctacatgaagacgattaaggagaacctgatggag 319 aaaceicccggagaaggtggaacccttcatgactgctgctgccaag 361 aaggttaaagatgtcttaaagcaattcaaggatttccagtttttc 406 acaggtgagagcatgaaccccgacggcatggtcgctcttcttaac 451 ttccgcgaggacggaatcacgccctacatgcttttcttcaaggat 496 ggcctggaaattgagaaatgctaa 519
4. 一種重組質(zhì)粒，其特征在于它含有權(quán)利要求2或3的基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述基因連接于pET23b載體上。
6. —種基因工程菌，其特征在于它被根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。
7. 根據(jù)權(quán)利6要求所述的基因工程菌，其特征在于其宿主細(xì)胞為E.coliBL21。
8. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的日本七鰓鰻口腔腺L-250蛋白組胺釋放因子活性在抗凝血方面的應(yīng) 用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述用于抗凝血方面的藥物為抗凝藥物。
全文摘要
日本七鰓鰻口腔腺分泌具組胺釋放因子活性的TCTP模體蛋白-L-250的基因克隆與表達(dá)屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。涉及日本七鰓鰻口腔腺分泌L-250蛋白的cDNA序列及克隆，與其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)氨基酸序列及其在大腸桿菌或畢赤酵母中的表達(dá)，及L-250蛋白作為組胺釋放因子，刺激嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺。組胺能增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)凝血酶調(diào)節(jié)素TM，一方面它能與凝血酶結(jié)合，降低凝血酶活性；另一方面能夠活化蛋白C，從而觸發(fā)抗凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這提示，L-250蛋白的組胺釋放因子活性在抗凝及心腦血管疾病治療方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C07K14/46GK101195656SQ20061013468
公開(kāi)日2008年6月11日 申請(qǐng)日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月8日
發(fā)明者毓 吳, 晶 孫, 李慶偉, 王繼紅, 潔 白 申請(qǐng)人:遼寧師范大學(xué)