專利名稱：不對(duì)稱多孔吸附珠粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適合于色譜應(yīng)用的不對(duì)稱多孔珠粒。
背景技術(shù)：
諸如蛋白質(zhì)、多肽和生物分子片段的生物分子已經(jīng)成為制藥和診斷應(yīng)用的重要試劑。目前，生物分子的純化經(jīng)常涉及包括色譜處理的多個(gè)步驟。用于生物分子分離的多孔色譜介質(zhì)的合成和使用有完善的文獻(xiàn)記錄。所述色譜步驟經(jīng)常通過使用珠粒填充床來進(jìn)行，產(chǎn)品和雜質(zhì)得以與原料流分離。這些珠粒通常為含有官能或用官能改性的基體(如多醣、合成聚合物或材料、陶瓷、玻璃或上述材料的復(fù)合物)，官能通過化學(xué)或物理方法與生物分子相互作用；它提供結(jié)合或相互作用的“驅(qū)動(dòng)力”。該復(fù)雜組合的相互作用導(dǎo)致介質(zhì)在要求的分離中的表現(xiàn)。介質(zhì)影響生物分子間特定分離的能力經(jīng)常被稱作“介質(zhì)的選擇性”。通常這些基體表現(xiàn)出可使所關(guān)心的生物分子進(jìn)入粒子內(nèi)部容積的孔隙。所述內(nèi)部的孔隙率在粒子內(nèi)是均勻的。
色譜分離典型地在填充有微粒型珠粒形式的分離基體的柱子內(nèi)進(jìn)行。介質(zhì)粒子的大小支配分離動(dòng)力學(xué)，但較小的粒子會(huì)產(chǎn)生高的反壓。為了能夠分離大分子，所述粒子應(yīng)具有大的孔隙，但大的孔隙降低所述粒子的機(jī)械穩(wěn)定性，尤其是對(duì)于諸如瓊脂糖的多糖而言。多糖是具有優(yōu)勢(shì)的，因?yàn)橥ǔＫ鼈兣c蛋白的結(jié)合力低，易于官能化，并且能夠形成多孔結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)上，多糖珠粒由一種多糖與在整個(gè)珠粒內(nèi)具有均勻的或“對(duì)稱的”多孔結(jié)構(gòu)制得。這些“對(duì)稱”珠粒的實(shí)例包括Cellufine(纖維素)、Sepharose(瓊脂糖)和Sephadex(葡聚糖)。所述對(duì)稱的珠粒在珠粒的整個(gè)內(nèi)部結(jié)構(gòu)內(nèi)與分子結(jié)合。內(nèi)部結(jié)構(gòu)內(nèi)的化學(xué)環(huán)境(孔徑大小、疏水性、配體類型和配體密度)基本上是均勻的。因此所述珠粒的整個(gè)結(jié)合環(huán)境的性質(zhì)是均勻的。在這些體系中，分離的驅(qū)動(dòng)力來自被吸附生物分子間結(jié)合強(qiáng)度的差異。典型地當(dāng)使用對(duì)稱樹脂時(shí)，通過控制緩沖條件優(yōu)化結(jié)合強(qiáng)度是實(shí)現(xiàn)所要求分離的唯一驅(qū)動(dòng)力。此外，多糖材料內(nèi)在是可壓縮的，并經(jīng)常要求進(jìn)行化學(xué)改性如通過交聯(lián)來減少其可壓縮性。
對(duì)稱樹脂的另一特性是介質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度，機(jī)械強(qiáng)度是由材料、孔隙結(jié)構(gòu)和化學(xué)改性等所造成的。典型地對(duì)于多糖而言，介質(zhì)孔徑越小，則由于較高的固體材料濃度(孔隙率更低)而使其機(jī)械強(qiáng)度越高。然而，孔徑越小，較大物種(如IgG)進(jìn)入吸附劑的傳質(zhì)就越容易受阻。因此，對(duì)稱介質(zhì)的設(shè)計(jì)經(jīng)常涉及粒子剛性和生物分子傳質(zhì)的優(yōu)化/妥協(xié)。事實(shí)上，由于對(duì)稱珠粒的滲透率是所述粒子的尺寸及粒徑分布所造成的，所以該優(yōu)化問題更加復(fù)雜。隨著粒子尺寸變小，粒子的外表面積增大，因此傳質(zhì)也增加。在洗提期間，較小的粒子可使離開介質(zhì)的擴(kuò)散時(shí)間更短，因此產(chǎn)生更集中和窄的洗脫峰。然而，傳質(zhì)的該改進(jìn)是以滲透率為代價(jià)的，這就限制了柱的大小和介質(zhì)的物料通過量。
在許多生物分子的分離中，考慮的物種(目標(biāo)分子)是原料中濃度最高的物種。換言之，雜質(zhì)只占要分離的全部混合物中的很小比例。對(duì)于對(duì)稱的色譜介質(zhì)，分離經(jīng)常受目標(biāo)分子與一些雜質(zhì)結(jié)合的影響，然后通過應(yīng)用洗提條件來區(qū)分所述物種，以分離雜質(zhì)。如果兩個(gè)物種與介質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度十分相似，那么即使蛋白質(zhì)的大小不同，分離也十分困難。在某些情況下，分離的困難狀態(tài)是由有限數(shù)量的影響純化的驅(qū)動(dòng)力因素所造成的。最終結(jié)果是，由于分離不完全，純化蛋白的收率低，或者還必須需要另一個(gè)色譜步驟使用具有不同分離驅(qū)動(dòng)力的不同介質(zhì)來進(jìn)一步純化目標(biāo)分子。這樣的方法費(fèi)時(shí)、低效且昂貴。
對(duì)于包括膨脹床或流化珠粒色譜的應(yīng)用，填充的多糖珠粒相當(dāng)成熟。通常這些材料通過在珠粒形成期間向多糖(典型地為瓊脂糖)加入實(shí)心的或非多孔的小球而制造。這樣，就可以形成包裹在多糖材料內(nèi)的具有一個(gè)或多個(gè)非多孔粒子的珠粒。另一種常用的技術(shù)是用最終要成為吸收劑材料的涂敷固體粒子。所述固體粒子對(duì)珠粒的蛋白容量或分離性能沒有作用。通常粒子的作用僅在于改善珠粒的密度，以便所述材料可用于非填充床的應(yīng)用。在某些情況下，固體粒子提供剛性和/或減少的凝膠體積。
最近，為了避免大分子的結(jié)合及同時(shí)保持對(duì)較小物種的容量，已經(jīng)開發(fā)了帶有所謂非吸收性多糖的“蓋子”或外層材料來限制進(jìn)入的多孔結(jié)構(gòu)。這些材料具有非常低的對(duì)大分子的容量，因?yàn)槠鋬?nèi)表面積不能同時(shí)供兩個(gè)物種結(jié)合。
以前的工作表明可以以不對(duì)稱的方式用化學(xué)改性來改進(jìn)對(duì)稱多糖的結(jié)構(gòu)。該技術(shù)可以在珠粒內(nèi)產(chǎn)生變化的化學(xué)環(huán)境。典型地，所述改性可用于在珠粒外面上提供中性層。這可防止在珠粒外面堵塞，尤其是在臟的原料流如在膨脹床吸收(EBA)中所遇到的。然而，該技術(shù)不改變珠粒的孔徑，因此在整個(gè)珠粒內(nèi)產(chǎn)生的是對(duì)稱的孔徑。
也開發(fā)了改進(jìn)多孔色譜介質(zhì)孔徑的方法。使用這些技術(shù)可以產(chǎn)生雙峰分布的孔徑尺寸。然而，孔隙結(jié)構(gòu)在整個(gè)珠粒內(nèi)是均勻分布的，因此不能在珠粒內(nèi)產(chǎn)生化學(xué)上獨(dú)特的區(qū)域來調(diào)節(jié)/改變所觀察的選擇性。
相應(yīng)地，需要一種更好的介質(zhì)設(shè)計(jì)以改善生物分子的純化，其中所述分離受多于一種的生物分子特性所驅(qū)動(dòng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明已克服現(xiàn)有技術(shù)的問題，并可提供適合分離應(yīng)用的不對(duì)稱色譜介質(zhì)，尤其是作為填充床、流化床或磁化床的色譜介質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，不對(duì)稱色譜介質(zhì)包括優(yōu)選為珠粒的不對(duì)稱粒子，其具有至少兩個(gè)截然不同的層，通常各層具有截然不同的受控制的孔徑分布。優(yōu)選其中一個(gè)截然不同的孔徑分布在所述粒子的內(nèi)部區(qū)域中，另一個(gè)在外部區(qū)域中或粒子的涂層上?？梢杂镁鶆虻幕蛘呖蛇x獨(dú)特的官能團(tuán)或官能團(tuán)的混合物來改良這些截然不同的孔徑分布。通過提供優(yōu)選珠粒形式的截然不同的內(nèi)部區(qū)域及優(yōu)選珠粒上涂層形式的截然不同的外部區(qū)域，本發(fā)明使得可以控制不對(duì)稱多孔粒子的孔徑分布。
本發(fā)明的不對(duì)稱珠粒提供了剛性，并且可以控制填充床介質(zhì)的傳質(zhì)路徑。剛性介質(zhì)可以裝填得更高，因此可取得全面更高的柱吸收或交換能力。通過縮短擴(kuò)散路徑，可以以比均質(zhì)珠粒高得多的效率使用凝膠。在某些操作條件下，帶芯核珠粒可以產(chǎn)生更尖的洗脫峰及更少的緩沖液消耗。
本發(fā)明的另一方面是具有兩個(gè)截然不同區(qū)域的珠粒，其各自具有一個(gè)或多個(gè)彼此不同的特征。例如，所述特征可以僅僅是第一和第二區(qū)域之間的不同孔徑。可選地和/或另外地，其可以是在各個(gè)區(qū)域中使用的不同的配體類型、配體密度或配體混合物、介質(zhì)材料和/或瓊脂糖百分?jǐn)?shù)(當(dāng)制備瓊脂糖珠粒時(shí))。
本發(fā)明帶芯核珠粒的另一個(gè)應(yīng)用是用于流化床色譜或磁色譜，其中所述芯核提供要求的密度(用于流化床)或者為磁色譜提供磁特性。


圖1所示為對(duì)稱瓊脂糖珠粒及不對(duì)稱瓊脂糖珠粒的剖面圖；以及圖2所示為根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的不對(duì)稱珠粒的陣列。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)本發(fā)明的不對(duì)稱色譜介質(zhì)可以實(shí)現(xiàn)介質(zhì)機(jī)械性能和選擇性能的調(diào)節(jié)，提供特別適合于生物分子分離的改進(jìn)的材料。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述介質(zhì)包括兩個(gè)截然不同的、受控制的孔徑分布，每個(gè)孔徑區(qū)域都具有獨(dú)特的化學(xué)改進(jìn)。一個(gè)截然不同的孔徑分布位于介質(zhì)的內(nèi)部區(qū)域，另一個(gè)位于諸如涂層的外部區(qū)域。雖然在兩個(gè)區(qū)域中孔徑尺寸可以相同，由此產(chǎn)生局部區(qū)域經(jīng)過不同化學(xué)改良的對(duì)稱色譜介質(zhì)，但優(yōu)選兩個(gè)區(qū)域中的孔隙尺寸不同。最優(yōu)選內(nèi)部區(qū)域的孔隙尺寸小于外部區(qū)域的孔隙尺寸。對(duì)于孔隙的尺寸沒有特別限定；例如，內(nèi)孔隙尺寸可以小到足以僅能有效吸附小的生物分子(如小于10KD的分子量)，或者可以大到足以接受大的生物分子。內(nèi)部和外部的孔隙尺寸可以在一定必要的范圍內(nèi)擴(kuò)展，以影響改善的色譜分離。
合適的介質(zhì)材料包括那些典型用于色譜珠粒的材料，其包括玻璃、天然或合成的聚合物如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、瓊脂糖、瓊脂糖衍生物、瓊脂、藻酸鹽、纖維素、纖維素衍生物、葡聚糖、淀粉、角叉菜膠、瓜爾膠、阿拉伯膠、印度膠、黃蓍膠、刺梧桐樹膠、槐豆膠、黃原膠、果膠、粘蛋白、肝硫酯和明膠。尤其優(yōu)選瓊脂糖。珠粒可全部由相同的材料形成，或者可以是兩種或多種材料的復(fù)合物，優(yōu)選為多孔材料。例如，所述珠?？梢园úＡЩ蚝铣删酆衔锏闹榱＃蛘邇?nèi)部有芯核外部有瓊脂糖涂層的珠粒。舉例來說，還可以包含填料來控制密度。當(dāng)瓊脂糖為內(nèi)部和外部區(qū)域的介質(zhì)材料時(shí)，可以通過改變瓊脂糖濃度來控制孔徑分布。例如，較高的瓊脂糖濃度會(huì)產(chǎn)生較小的孔隙尺寸，因此內(nèi)部區(qū)域可以是15％的瓊脂糖，而外涂層可以是6％的瓊脂糖。這樣的外涂層因此可以吸附大的蛋白如IgG，而內(nèi)部的芯核層則可有效地(在色譜分離的時(shí)間尺度內(nèi))排除大的蛋白。
更具體地，本發(fā)明粒子的芯核可以由任何可用于色譜法的材料制成。例如，所述芯核可以是交聯(lián)的瓊脂糖珠、塑料、金屬、玻璃或陶瓷。當(dāng)最終珠粒要具有高的剛度時(shí)，所述芯核優(yōu)選選自不會(huì)在制造過程中的使用溫度下熔化的自支撐材料。合適的材料包括但不限于塑料，如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯和聚丙烯的共混物、多層聚乙烯/聚丙烯珠、丙烯酸樹脂、聚砜、聚醚砜、PVDF或PTFE；玻璃，如硼硅酸鹽玻璃、耐堿玻璃和受控制的多孔玻璃；金屬，如不銹鋼、鎳、鈦、鈀及鈷，或各種鐵、含鐵或其它磁性金屬的合金和混合物；以及陶瓷，如硅酸鹽材料、氧化鋯和各種陶瓷混合物。
所述芯核優(yōu)選基本上為球形的或不規(guī)則微粒形式的。其直徑依賴于所要求的珠粒的大小，但優(yōu)選直徑為約30微米～約150微米。
如瓊脂糖珠粒生產(chǎn)中所常見的，可以使用各種添加劑改善生產(chǎn)或增加珠粒的性能。一類添加劑包括可與溶劑混溶的揮發(fā)性有機(jī)物。實(shí)例有一元醇，如甲醇、乙醇和丙醇。其使用濃度可高至產(chǎn)生略微渾濁的溶液。也可以使用諸如丙酮的可混溶的酮。但必須小心，因?yàn)榄傊窃谕?水混合物中的溶解度要低一些。還可以考慮兩種或更多種這類物質(zhì)的任何混合物。
另一類添加劑包括非揮發(fā)性的可混溶有機(jī)物。其非限定性實(shí)例包括甘油、乙二醇、甲基戊二醇、二甘醇、丙二醇、三甘醇、乙二醇的甲基、乙基或正丁基醚、乙二醇的二甲基或二乙基醚、乙二醇二甲基醚醋酸酯、乙二醇二乙基醚醋酸酯、二甘醇甲基醚、二甘醇乙基醚、二甘醇正丁基醚、二甘醇二甲基醚、二甘醇二乙基醚、二甘醇二甲基醚醋酸酯、二甘醇二乙基醚醋酸酯、N-甲基嗎啉和N-乙基嗎啉等。這類物質(zhì)的實(shí)例還有低分子量的聚乙二醇。還可以考慮兩種或更多種這類物質(zhì)的任何混合物。
另一類添加劑包括水溶性聚合物，包括例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇、葡聚糖和水溶性聚酰胺，包括取代的聚酰胺如聚二甲基酰胺。這些聚合物添加劑可以作為與瓊脂糖的混合物在最初的溶解步驟中使用，或可以在瓊脂糖加入和溶解后再溶解在所述溶液中。必須小心不要加入過量的聚合物，因?yàn)榭赡軙?huì)產(chǎn)生溶液聚沉。聚合物和瓊脂糖的比例可以是約0.1～10。優(yōu)選的聚合物是聚乙烯醇、葡聚糖和聚酰胺。
若有需要，尤其是包括瓊脂糖時(shí)，可以使用工業(yè)上常用于如多糖珠粒的含多羥基材料交聯(lián)的任何化學(xué)物對(duì)介質(zhì)進(jìn)行交聯(lián)，這些化學(xué)物的非限定性實(shí)例有表氯醇或其它多官能環(huán)氧化物、各種溴(bromyl)化學(xué)物或其它多官能鹵化物；甲醛、戊二醛(gluteraldehyde)及其它多官能醛、二(2-羥乙基)砜、二甲基二氯硅烷、二羥甲基脲、二羥甲基亞乙基脲、二異氰酸酯或多異氰酸酯等。
介質(zhì)上也可以具有與其連接的包括配體的一個(gè)或多個(gè)官能，如A蛋白或G蛋白，每一種為天然型或重組衍生型的，以及使它們對(duì)腐蝕更穩(wěn)定的A蛋白或G蛋白的改進(jìn)型等，各種化學(xué)配體如2-氨基苯并咪唑(AMI)、氨甲基苯并咪唑(AMBI)、巰基乙基吡啶(MEP)或巰基苯并咪唑(MBI)，或各種使瓊脂糖呈陽離子的、陰離子的、親的、疏的或帶電荷的化學(xué)物，如在介質(zhì)形成技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知的。
液相色譜中所使用的適用于本發(fā)明的官能團(tuán)包括，但不限于離子交換、生物親合、疏水基團(tuán)、可用于共價(jià)色譜的基團(tuán)、親硫的相互作用基團(tuán)、螯合物或螯合基團(tuán)、與目標(biāo)化合物有所謂π-π相互作用的基團(tuán)、氫鍵鍵合的和親水的基團(tuán)等。
這些基團(tuán)可以在瓊脂糖珠粒形成和交聯(lián)后加入，也可以加入到初始溶液中，初始溶液的組成作相應(yīng)的改變，如減小或增大pH值，這樣可在交聯(lián)反應(yīng)的同時(shí)發(fā)生反應(yīng)，使官能團(tuán)結(jié)合到瓊脂糖上。
這些官能通常以兩種方式加以應(yīng)用。第一種是可以在加入具有所要求官能團(tuán)或其前體的含親電體分子時(shí)應(yīng)用這些官能。典型地，用氫氧化鈉活化含羥基的基體，這可使基體與以上提及的親電體發(fā)生有效反應(yīng)。非限定性的實(shí)例包括溴丙烷磺酸、丙磺酸內(nèi)酯、烯丙基縮水甘油醚、烯丙基溴、縮水甘油基三甲基氯化銨、丁二醇二縮水甘油醚、氯醋酸鈉?；蛘撸梢赃x擇以所述領(lǐng)域中的已知方法向基體中加入親核基團(tuán)，如胺或硫醇，然后使用上述親電試劑改良基體。其次，這些官能在使用時(shí)用親電子基團(tuán)活化基體，親電基團(tuán)包括以下非限定性實(shí)例溴化氰、活化的羧酸、醛、酯、如丁二醇二縮水甘油醚的環(huán)氧化物、表氯醇、烯丙基溴和烯丙基縮水甘油醚，然后含所選官能的合適的親核分子與活化基體進(jìn)行反應(yīng)。這些親核體可以是如氨基丙烷磺酸的小分子，或可以是如聚乙烯亞胺或蛋白及肽的大的實(shí)體。此外，所有上述化學(xué)物可以在如葡聚糖的親水隔臂或“觸角”附著到基體上之后加入珠粒中。這可以為結(jié)合提供更多的表面積，并且可進(jìn)一步在珠粒的不對(duì)稱結(jié)構(gòu)內(nèi)改變孔徑和化學(xué)環(huán)境。
與對(duì)稱珠粒相比，本發(fā)明的不對(duì)稱色譜介質(zhì)可提供改善的機(jī)械性能。許多形成于多糖的常用色譜介質(zhì)是可壓縮的。該可壓縮性最初是由材料的孔隙率決定的。例如，商用瓊脂糖珠粒典型地是4～6％的瓊脂糖，這意謂粒子有96～94％是多孔的。若不進(jìn)行化學(xué)改性，這些材料的色譜應(yīng)用將十分有限。盡管通過廣泛的交聯(lián)，這些材料可以有足夠的剛性用于許多應(yīng)用，但是初始的瓊脂糖珠粒越是多孔，其機(jī)械性能越是受到限制。對(duì)于本發(fā)明的不對(duì)稱介質(zhì)，如果珠粒內(nèi)部比外部多孔結(jié)構(gòu)的孔隙少得多，則內(nèi)部區(qū)域的機(jī)械強(qiáng)度比外部區(qū)域的要高得多。在機(jī)械應(yīng)力下，外部區(qū)域會(huì)十分類似于其對(duì)應(yīng)的對(duì)稱珠粒發(fā)生壓縮。然而，在最初的壓縮之后，鄰近珠粒的內(nèi)部區(qū)域會(huì)開始相互接觸，如圖2中所圖示。內(nèi)部區(qū)域的該“點(diǎn)接觸”帶來具有內(nèi)部珠粒結(jié)構(gòu)機(jī)械可壓縮性的填充床。因?yàn)樵搩?nèi)部結(jié)構(gòu)可以孔隙較少、剛性較高，其實(shí)際效果是具有剛性高得多的材料的機(jī)械可壓縮性的更多孔或更敞開的外部結(jié)構(gòu)。如果用不可壓縮材料作為內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)，那么得到的色譜床在內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生“點(diǎn)接觸”后將會(huì)不可壓縮。
色譜介質(zhì)對(duì)于給定生物分子或其混合物的選擇性是由多因素的復(fù)雜組合所決定的，這些因素包括配體類型、配體密度、介質(zhì)孔徑和介質(zhì)的疏水性等。對(duì)稱珠粒的選擇性可以看作是“一維的”，因?yàn)橹榱Ｖ械慕Y(jié)合環(huán)境是均勻的。因此，驅(qū)動(dòng)介質(zhì)選擇性的是由每個(gè)單獨(dú)的生物分子在相同結(jié)合環(huán)境中相互作用的能力所驅(qū)動(dòng)的。換言之，是“分子的比相互作用”(物種的凈電荷、疏水性、氫結(jié)合等)，而不是分子的大小驅(qū)動(dòng)了不同生物分子的分離。不對(duì)稱色譜珠粒的優(yōu)點(diǎn)是材料含有至少兩種截然不同的化學(xué)/結(jié)合環(huán)境，物種可在此環(huán)境中可以進(jìn)行結(jié)合。該結(jié)構(gòu)可以通過以下步驟產(chǎn)生改變1)內(nèi)部和外部孔隙結(jié)構(gòu)間的孔隙尺寸，2)配體類型、配體密度和/或配體混合物，3)介質(zhì)材料(如外部的更親/內(nèi)部的更疏)，以及1)、2)和3)的組合。這些材料提供“兩維的”選擇性，因?yàn)榉蛛x不僅由分子的比相互作用所驅(qū)動(dòng)，也由介質(zhì)內(nèi)的至少兩種截然不同的區(qū)域所驅(qū)動(dòng)。例如，結(jié)合較弱的物種易于在結(jié)合較強(qiáng)的環(huán)境中集中，或較大的物種可以被排除在內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)之外。
本發(fā)明新型介質(zhì)應(yīng)用的一個(gè)具體實(shí)例是Mab與宿主細(xì)胞蛋白(HCP)的分離。Mab是分子量較高的蛋白(160kD)，不易在15％的瓊脂糖凝膠中擴(kuò)散。相應(yīng)地，含有15％瓊脂糖的內(nèi)部珠粒的6％的瓊脂糖珠粒提供了雜質(zhì)“槽(sink)”，其中HCP可以被吸附在一個(gè)區(qū)域(具有可能唯一的化學(xué)改性)中，而Mab被吸收在6％的結(jié)構(gòu)中。這可以提供增強(qiáng)的對(duì)普通HCP雜質(zhì)的去除。為了使所要求蛋白(Mab)的結(jié)合容量最大化，孔徑較小的區(qū)域(槽區(qū))可以最小化至總體積的20％，瓊脂糖珠?？紫侗容^敞開的區(qū)域可以用如葡聚糖的親水配體載體的“觸角”來改良。這可以使用于Mab的瓊脂糖珠粒的容量翻倍。
另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，對(duì)外部區(qū)域的厚度可以進(jìn)行限制(1～15微米)，以使洗脫期間的擴(kuò)散路徑更短。這可以提供更窄的洗脫峰以及可能更佳的分辨率。
制造本發(fā)明介質(zhì)的合適方法涉及在合適的液體中溶解/熔化介質(zhì)材料如瓊脂糖，加入優(yōu)選珠粒形式的芯核，由此使所述芯核可以由瓊脂糖涂敷，將涂敷的芯核與疏水液體混合形成乳液，并將該乳液保持在等于或高于瓊脂糖熔點(diǎn)的溫度，使其通過靜態(tài)混合器產(chǎn)生瓊脂糖小滴，在疏水液的第二浴器中固化所述瓊脂糖小滴。然后可以如本領(lǐng)域所已知的洗滌珠粒、使用珠?；蜻M(jìn)一步處理以交聯(lián)瓊脂糖，和/或?qū)⒏鞣N官能加到瓊脂糖上。
實(shí)施例實(shí)施例1A具有獨(dú)特化學(xué)環(huán)境和均勻孔徑的不對(duì)稱瓊脂糖珠粒根據(jù)以下方法，用10～15微米的6％瓊脂糖層涂敷SP-SepharoseFast Flow(6％的交聯(lián)瓊脂糖)將50ml珠?；烊氲?00ml 6％的瓊脂糖溶液(來自Hispanagar的D-5瓊脂糖)中，得到漿液。將瓊脂糖-珠?；旌衔锛尤?0℃下的1000ml的礦物油中，在不斷攪拌下得到其中油相為連續(xù)的乳液。然后以3L/min的流速泵送乳液通過直徑0.5英寸(12.7mm)、長度6英寸(152.4mm)的Kenics靜態(tài)混合器(KMR-SAN-12)，進(jìn)入5℃的礦物油中。得到的瓊脂糖珠粒具有預(yù)計(jì)10微米的外涂層厚度，珠粒的種群大多數(shù)為單芯核的(＞50％)。使珠粒沉積，用水、乙醇洗滌，然后再用水洗滌。根據(jù)Porath，Jerher和Janson，Jan-Christer和Lass，Torgny，Journal of Chromatography，60(1971)167-177頁公開的方法對(duì)珠粒進(jìn)行交聯(lián)，此公開內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。然后用溴丙烷(bromoporane)磺酸(BPSA)對(duì)珠粒進(jìn)行改性。向罐中加入10g珠粒、30ml 5M NaOH和7.2g BPSA，在50℃下攪拌一夜。用500ml Milli-Q品質(zhì)的水洗滌珠粒，第二次重復(fù)BPSA方法。用500ml的Milli-Q水洗滌珠粒，然后將其保存在20％的乙醇中。
實(shí)施例1B如用實(shí)施例1A所討論的，用10～15微米的6％瓊脂糖層涂敷SP-Sepharose Fast Flow(6％的交聯(lián)瓊脂糖)。根據(jù)Porath，Jerher和Janson，Jan-Christer和Lass，Torgny，Journal of Chromatography，60(1971)167-177頁公開的方法對(duì)珠粒進(jìn)行交聯(lián)。然后用溴丙烷磺酸(BPSA)對(duì)珠粒進(jìn)行改性。向罐中加入10g珠粒、30ml 5M的NaOH和7.2g BPSA，在50℃下攪拌一夜。用500ml Milli-Q品質(zhì)的水洗滌珠粒，并且另外重復(fù)BPSA方法三次。用500ml的Milli-Q水洗滌珠粒，然后將其保存在20％的乙醇中。
實(shí)施例1C如用實(shí)施例1A所討論的，用10～15微米的6％瓊脂糖層涂敷SP-Sepharose Fast Flow(6％的交聯(lián)瓊脂糖)。根據(jù)Porath，Jerher和Janson，Jan-Christer和Lass，Torgny，Journal of Chromatography，60(1971)167-177頁公開的方法對(duì)珠粒進(jìn)行交聯(lián)。然后用烯丙基縮水甘油醚(AGE)對(duì)珠粒進(jìn)行改性。向罐中加入10g珠粒、10ml 8M的NaOH、2g AGE和2g Na2SO4，在25℃下攪拌一夜。用500ml Milli-Q品質(zhì)的水洗滌珠粒，然后將其保存在20％的乙醇中。
選擇性的測試使用具有不同凈電荷和分子量的兩種蛋白，在典型的陽離子交換(CEX)條件下則是選擇性或分離因子。將含有0.5mg/ml多克隆IgG(Sigma)和0.5mg/ml溶菌酶(Sigma)的蛋白混合物在pH 4.5下得到10mS的電導(dǎo)率的含NaCl的50mM醋酸鹽緩沖液中，以脈沖輸送方式以200cm/hr(7cm的床高，0.66cm直徑)施加到每個(gè)樣品柱。然后用20CV的NaCl梯度從10mS開始至80mS結(jié)束，以200cm/hr洗脫脈沖。每種蛋白的峰從洗脫梯度變化曲線的起點(diǎn)開始(對(duì)死體積進(jìn)行修正)，以柱體積(CV)的方式記錄。峰分離的數(shù)據(jù)如表1所示表1

該表報(bào)告了IgG和溶菌酶兩者在洗脫梯度變化曲線中的峰位置。洗脫中延遲越長(CV越大)，物種與介質(zhì)的結(jié)合越牢固。介質(zhì)被設(shè)計(jì)成具有不同的化學(xué)環(huán)境，主要是磺丙基配體的密度。配體密度在外部瓊脂糖區(qū)域和內(nèi)部區(qū)域之間的差異按照以下順序增加實(shí)施例1C＜實(shí)施例1B＜實(shí)施例1A。實(shí)施例1C中內(nèi)部配體密度和外部配體密度間差異極小，每個(gè)基本上具有相同的化學(xué)配置。IgG峰位置符合該一般趨勢(shì)。IgG峰洗脫首先發(fā)生在外層中具有最低配體密度的珠粒，而對(duì)于實(shí)施例1C，洗脫只單獨(dú)相同地在內(nèi)部珠粒結(jié)構(gòu)上(SP-Sepharose控制)發(fā)生。令人感興趣的是，溶菌酶和峰分離沒有表現(xiàn)出相同的簡單趨勢(shì)。然而，很清楚珠粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)帶有獨(dú)特化學(xué)區(qū)域的不對(duì)稱珠粒的峰分離更大。
實(shí)施例2根據(jù)以上Porath等對(duì)含有10％瓊脂糖的瓊脂糖珠粒(ABTTechnologies)進(jìn)行交聯(lián)。然后用溴丙烷磺酸(BPSA)對(duì)珠粒進(jìn)行改性。向罐中加入100g珠粒、300ml 5M NaOH和72g BPSA，在50℃下攪拌一夜。用1500ml Milli-Q品質(zhì)的水洗滌珠粒，另外再重復(fù)BPSA方法兩次。用1500ml Milli-Q水洗滌珠粒，然后將其保存在20％的乙醇中。根據(jù)以下方法將珠粒涂敷上6％的瓊脂糖層，形成不對(duì)稱瓊脂糖珠粒將100ml的珠?；烊氲?00ml的6％瓊脂糖溶液(來自Hispanagar的D-5瓊脂糖)中，得到漿液。將瓊脂糖-珠?；旌衔锛尤?0℃下的2000ml礦物油中，在不斷攪拌下得到其中油相為連續(xù)的乳液。然后以3L/min的流速泵送乳液通過直徑0.5英寸(12.7mm)、長度6英寸(152.4mm)的Kenics靜態(tài)混合器(KMR-SAN-12)，進(jìn)入5℃的礦物油中。得到的瓊脂糖珠粒具有預(yù)計(jì)10微米的外涂層厚度，珠粒的種群大多數(shù)為單芯核的(＞50％)。使珠粒沉積，用水、乙醇洗滌，然后再用水洗滌。根據(jù)以上Porath等的方法交聯(lián)珠粒。然后用縮水甘油基三甲基氯化銨(GTMAC)處理珠粒。在罐中將100ml珠粒加入100ml 75％的GTMAC中。經(jīng)混合后，加入3.3ml 50％的NaOH，在25℃下?lián)u動(dòng)反應(yīng)一夜。用1500ml Milli-Q水洗滌珠粒。然后將珠粒再次涂敷上另一層6％的瓊脂糖。此時(shí)珠粒在Milli-Q水中顯示為兩種染料的混合物亞甲藍(lán)(1mg/ml)和麗春紅S(1mg.ml)。將僅顯示出亞甲藍(lán)的珠粒樣品作為對(duì)比。用Milli-Q水洗滌珠粒三次(100ml)。用裝在顯微鏡頭上的數(shù)碼相機(jī)記錄染料的位置。
BPSA(負(fù)電荷)中心10％的瓊脂糖區(qū)域結(jié)合有亞甲藍(lán)染料。第二區(qū)域帶有正電荷(含GTMAC)，沒有結(jié)合亞甲藍(lán)。然而，當(dāng)暴露珠粒于亞甲藍(lán)和帶負(fù)電荷的麗春紅S染料的混合物時(shí)，藍(lán)色中心區(qū)域觀察到在GTMAC區(qū)域的位置上有強(qiáng)烈的紅色色帶。中性的最外層區(qū)域含有一些不完全洗滌后殘留的紅色染料，但紅色不如預(yù)期的強(qiáng)烈。
實(shí)施例3實(shí)施例3A有獨(dú)特化學(xué)環(huán)境和兩個(gè)截然不同的孔徑區(qū)域的不對(duì)稱瓊脂糖珠粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)的制備使用以下方法制造15％瓊脂糖的珠粒將1000ml 15％的瓊脂糖溶液(來自Hispanagar的D-5瓊脂糖)加入含有120ml Span 80乳化劑、第一油浴中的80℃的2000ml礦物油中，在不斷攪拌下得到其中油相為連續(xù)的乳液。然后以3L/min的流速泵送乳液通過直徑0.5英寸(12.7mm)、長度6英寸(152.4mm)的Kenics靜態(tài)混合器(KMR-SAN-12)，進(jìn)入5℃的第二礦物油浴中。得到的是最大的粒徑為200微米的球形的均質(zhì)瓊脂糖珠粒。使珠粒沉積，用水、乙醇洗滌，然后再用水洗滌，篩分得到粒徑75～125微米的珠粒。然后根據(jù)Porath，Jerher和Janson，Jan-Christer和Lass，Torgny，Journal ofChromatography，60(1971)167-177頁公開的方法對(duì)珠粒進(jìn)行交聯(lián)，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。然后用烯丙基縮水甘油醚(AGE)對(duì)珠粒進(jìn)行改性。向罐中加入120g珠粒、150ml 8M NaOH、30g硫酸鈉和100g AGE，在45℃下攪拌一夜。用3×500ml Milli-Q品質(zhì)的水洗滌珠粒。
實(shí)施例3B具有獨(dú)特化學(xué)環(huán)境和兩個(gè)截然不同的孔徑區(qū)域的不對(duì)稱瓊脂糖珠粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)的制備改進(jìn)實(shí)施例3A所制得的部分珠粒生成陽離子交換材料。用焦亞硫酸納對(duì)珠粒進(jìn)行改性。向罐中加入60g珠粒、47ml Milli-Q水、7.9g 50重量％的NaOH和23.4g焦亞硫酸納，在室溫下攪拌一夜。用3×500ml Milli-Q品質(zhì)的水洗滌珠粒。
實(shí)施例3C具有獨(dú)特化學(xué)環(huán)境和兩個(gè)截然不同的孔徑區(qū)域的不對(duì)稱瓊脂糖珠粒外部結(jié)構(gòu)的制備根據(jù)以下方法將實(shí)施例3B的珠粒涂敷上6％的瓊脂糖將50ml的珠?；烊?00ml的6％瓊脂糖溶液(來自Hispanagar的D-5瓊脂糖)中，得到漿液。將瓊脂糖-珠粒混合物加入90℃的1000ml礦物油中，在不斷攪拌下得到其中油相為連續(xù)的乳液。然后以3L/min的流速泵送乳液通過直徑0.5英寸(12.7mm)、長度6英寸(152.4mm)的Kenics靜態(tài)混合器(KMR-SAN-12)，進(jìn)入5℃的礦物油中。得到的瓊脂糖珠粒具有預(yù)計(jì)10微米的外層厚度，珠粒種群大多數(shù)為單芯核的(＞50％)。使珠粒沉積，用水、乙醇洗滌，然后再用水洗滌，篩分得到粒徑為75～125微米的珠粒。根據(jù)Porath、Jerher和Janson、Jan-Christer和Lass、Torgny，Journal of Chromatography，60(1971)167-177頁公開的方法對(duì)珠粒進(jìn)行交聯(lián)，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。用3×500ml Milli-Q品質(zhì)的水洗滌珠粒。
實(shí)施例3D有獨(dú)特化學(xué)環(huán)境和兩個(gè)截然不同的孔徑區(qū)域的不對(duì)稱瓊脂糖珠粒向外部結(jié)構(gòu)加入陽離子交換配體其后用溴丙烷磺酸(BPSA)改性實(shí)施例3C的部分珠粒。向罐中加入10g珠粒、30ml 5M NaOH和7.2g BPSA，并且在50℃下攪拌一夜。用500ml Milli-Q品質(zhì)的水洗滌珠粒，然后將其保存在20％的乙醇中。
實(shí)施例3E有獨(dú)特化學(xué)環(huán)境和兩個(gè)截然不同的孔徑區(qū)域的不對(duì)稱瓊脂糖珠粒向外部結(jié)構(gòu)加入陽離子交換配體其后，用溴丙烷磺酸(BPSA)改性實(shí)施例3C的部分珠粒。向罐中加入10g珠粒、30ml 5M NaOH和7.2g BPSA，并且在50℃下攪拌一夜。用500ml Milli-Q品質(zhì)的水洗滌珠粒，另外重復(fù)BPSA方法一次。用500ml的Milli-Q水洗滌珠粒，然后將其保存在20％的乙醇中。
實(shí)施例3F有獨(dú)特化學(xué)環(huán)境和兩個(gè)截然不同的孔徑區(qū)域的不對(duì)稱瓊脂糖珠粒向外部結(jié)構(gòu)加入陽離子交換配體其后，用溴丙烷磺酸(BPSA)改性實(shí)施例3C的部分珠粒。向罐中加入10g珠粒、30ml 5M NaOH和7.2g BPSA，并且在50℃下攪拌一夜。用500ml Milli-Q品質(zhì)的水洗滌珠粒，另外重復(fù)BPSA方法兩次。用500ml的Milli-Q水洗滌珠粒，然后將其保存在20％的乙醇中。
選擇性的測試使用具有不同凈電荷和分子量的兩種蛋白，在典型的陽離子交換(CEX)條件下測試選擇性或分離因子。將含有0.5mg/ml多克隆IgG(Sigma)和0.5mg/ml溶菌酶(Sigma)的蛋白混合物在pH 4.5下得到10mS電導(dǎo)率的含NaCl的50mM醋酸鹽緩沖液中，以脈沖輸送方式以200cm/hr(床高7cm，直徑0.66cm)施加到每個(gè)樣品柱，以使負(fù)載在介質(zhì)上的凈蛋白為10mg/mL。然后用30CV的NaCl梯度從10mS開始至80mS結(jié)束以200cm/hr洗脫蛋白混合物。每種蛋白的峰從洗脫梯度變化曲線的起點(diǎn)開始(對(duì)死體積進(jìn)行修正)，以柱體積(CV)的方式記錄。峰分離的數(shù)據(jù)如表2所示
表2

該表報(bào)告了IgG和溶菌酶兩者在洗脫梯度變化曲線中的峰位置。洗脫中延遲越長(CV越大)，物種與介質(zhì)的結(jié)合越牢固。所述介質(zhì)被設(shè)計(jì)成具有不同的化學(xué)和物理環(huán)境，主要是磺丙基配體的密度和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的孔徑。對(duì)于實(shí)施例3D而言，選擇性類似于標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)樹脂的(SP-Sepharose Fast Flow)選擇性。然而，實(shí)施例3E和3F表現(xiàn)出兩種蛋白峰分離的增加，這是具有獨(dú)特化學(xué)和孔徑區(qū)域的不對(duì)稱珠粒結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的結(jié)果。
實(shí)施例5-瓊脂糖芯核的珠粒將75ml平均直徑100微米的15％的交聯(lián)瓊脂糖珠粒(使用同一天申請(qǐng)的方法專利制造)與100ml 4％的瓊脂糖溶液(Hispanagar的D5)混合，得到漿液。將瓊脂糖-珠?；旌衔锛尤?0℃的2000ml礦物油中，在不斷攪拌下得到其中油相為連續(xù)的乳液。然后以3L/min的流速泵送乳液通過直徑0.5英寸(12.7mm)、長度6英寸(152.4mm)的Ross ISG靜態(tài)混合器，進(jìn)入5℃的礦物油中。得到的不對(duì)稱珠粒具有預(yù)計(jì)10微米的外部區(qū)域厚度，珠粒種群大多數(shù)為單芯核的(＞60％體積)。
權(quán)利要求
1.一種不對(duì)稱色譜粒子，其包括具有第一孔徑分布的第一區(qū)域和具有不同于所述第一孔徑分布的第二孔徑分布的第二區(qū)域。
2.權(quán)利要求1的不對(duì)稱色譜粒子，其中所述第一區(qū)域?yàn)樗隽Ｗ拥膬?nèi)部區(qū)域，其中所述第二區(qū)域?yàn)樗隽Ｗ拥耐獠繀^(qū)域。
3.權(quán)利要求1的不對(duì)稱色譜粒子，其中所述粒子為珠粒。
4.權(quán)利要求3的不對(duì)稱色譜粒子，其中所述第一區(qū)域?yàn)樗鲋榱５男竞恕?br> 5.權(quán)利要求1的不對(duì)稱色譜粒子，其中所述粒子包括瓊脂糖。
6.權(quán)利要求5的不對(duì)稱色譜粒子，其中所述第一區(qū)域中的瓊脂糖濃度不同于所述第二區(qū)域中的瓊脂糖濃度。
7.權(quán)利要求5的不對(duì)稱色譜粒子，其中所述第一孔徑分布小于所述第二孔徑分布。
8.一種珠粒種群，其中所述珠粒包括具有第一孔徑分布的第一區(qū)域和具有不同于所述第一孔徑分布的第二孔徑分布的第二區(qū)域。
9.一種色譜粒子，其包括具有一個(gè)或多個(gè)第一特征的第一區(qū)域和具有一個(gè)或多個(gè)第二特征的第二區(qū)域，所述第一特征選自以下組中孔徑分布、配體密度、配體類型、配體混合物、介質(zhì)材料和瓊脂糖百分?jǐn)?shù)，所述第二特征選自以下組中孔徑分布、配體密度、配體類型、配體混合物、介質(zhì)材料和瓊脂糖百分?jǐn)?shù)，其中第一區(qū)域的第一特征與第二區(qū)域的第二特征不同。
10.權(quán)利要求9的粒子，其中所述第一和第二特征為孔徑分布。
11.權(quán)利要求9的粒子，其中所述第一和第二特征為配體密度。
12.權(quán)利要求9的粒子，其中所述第一和第二特征為配體類型。
13.權(quán)利要求9的粒子，其中所述第一和第二特征為配體混合物。
14.權(quán)利要求9的粒子，其中所述第一和第二特征為介質(zhì)材料。
15.權(quán)利要求9的粒子，其中所述第一和第二區(qū)域由瓊脂糖形成，并且所述第一和第二特征為瓊脂糖百分?jǐn)?shù)。
16.權(quán)利要求9的粒子，其中所述第一區(qū)域由15％的瓊脂糖形成，第二區(qū)域由6％的瓊脂糖形成。
17.權(quán)利要求9的粒子，其中所述第一區(qū)域由15％的瓊脂糖形成，第二區(qū)域由6％的瓊脂糖形成，其中所述第一區(qū)域是最里面的區(qū)域，第二區(qū)域是外面的區(qū)域。
18.權(quán)利要求9的粒子，其中所述第一區(qū)域由15％的瓊脂糖形成，第二區(qū)域由6％的瓊脂糖形成，其中所述第一區(qū)域是最外面的區(qū)域，第二區(qū)域是里面的區(qū)域。
19.權(quán)利要求9的粒子，其中所述第一和第二特征為孔徑分布，以及選自以下組中的附加特征配體密度、配體類型、配體混合物及瓊脂糖百分?jǐn)?shù)。
20.權(quán)利要求9的粒子，其中所述第一和第二特征為孔徑分布，以及選自以下組中的附加特征配體密度、配體類型、配體混合物及介質(zhì)材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及適合于分離應(yīng)用的不對(duì)稱色譜介質(zhì)，特別是作為填充床、流化床或磁化床的色譜介質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，所述不對(duì)稱介質(zhì)包括具有至少兩個(gè)截然不同的受控制的孔徑分布、優(yōu)選為珠粒的不對(duì)稱顆粒。優(yōu)選地，一個(gè)截然不同的孔徑分布在所述顆粒的內(nèi)部區(qū)域，另一個(gè)在外部區(qū)域或所述顆粒上的涂層中。這些截然不同的孔徑分布可以由均勻的或可選獨(dú)特的官能團(tuán)或官能團(tuán)混合物改性。通過提供優(yōu)選為珠粒形式的截然不同的內(nèi)部區(qū)域，及優(yōu)選為珠粒上涂層形式的截然不同的外部區(qū)域，本發(fā)明可以控制不對(duì)稱多孔粒子內(nèi)的孔徑分布。
文檔編號(hào)C07K1/16GK1939585SQ20061013880
公開日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2006年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月19日
發(fā)明者程國順, 森蒂庫馬爾·拉馬斯瓦米, 王陳, 卞南英, 布賴恩·加貢, 喬奎因·烏馬納, 丹尼斯·阿奎諾, 尼爾·P.·索伊斯, 安德魯·利德迪亞特 申請(qǐng)人:米利波爾公司