專利名稱：：一種針對人opn基因用于腫瘤基因治療的短的干擾核糖核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種具有特異性腫瘤治療的RNA干擾片段制備方法。眾議不RNAi的高度特異性和相對寬松的設(shè)計條件，使RNAi不僅可以應(yīng)用于基因功能研究，更廣泛的，RNAi將被應(yīng)用到基于基因組序列的核酸藥物研究和藥物耙標驗證中。截止2000年末，共計215個基于基因水平治療的藥物在研，其中87個為基因治療藥物，62個為DNA疫苗，35個為針對RNA的反義核酸和核酶。具體數(shù)據(jù)見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>截止2000年底，基于基因組的在研藥物分布表由上表可見，RNA攻擊核酸制藥迄今為止是以反義核酸為主，核酶技術(shù)為輔的一個領(lǐng)域。1997年ISIS制藥公司的抗病毒反義核酸藥物得到美國醫(yī)藥食品管理局的批準，為反義核酸藥物的發(fā)展提供了先例。近年高等動物功能基因組研究正在以更快的速度為反義核酸藥物的發(fā)展提供靶基因，使反義核酸藥物的適用范圍從癌癥向傳染病，心血管疾病，炎癥及自身免疫等多方面擴張。2001年8月ISIS將蛋白激酶C的反義核酸藥物以2億美元的高價轉(zhuǎn)讓給大制藥公司EliLilly,2002年4月，世界第二大反義核酸藥物公司Genta將其bc1-2的反義核酸藥物以4.8億美元的高價轉(zhuǎn)讓給大制藥公司Aventis標志了反義核酸藥物的發(fā)展走向成熟并進入制藥業(yè)的主流。這不僅是反義核酸的成功，而更重要的是以RNA攻擊為手段的制藥思路和領(lǐng)域的成功。與反義核酸藥物相比，siRNA在體外顯示了非常優(yōu)越的性質(zhì)。siRNA和非常好的反義核酸對基因的表達抑制都可以達到在80-90%以七，但篩選這樣的siRNA要相對容易的多。而且，達到同樣水平的表達抑制所需的siRNA比反義核酸濃度低10—IOO倍。不僅如此，siRNA對基因表達抑制的有效時間也比反義核酸有較大的延長(從兩天延長到5-7天)。siRNA在體外顯示的這些優(yōu)越性質(zhì)，如果能在RNA攻擊制藥中體現(xiàn)出來，將為著-領(lǐng)域注入強大的生命力和價值。從哲學的角度，siRNA這一有效的基因操作手段和RNA攻擊這一成熟的制藥領(lǐng)域的結(jié)合是不可避免的。siRNA—旦進入制藥，首先將在病毒性傳染病如HIV和癌癥如白血病的治療方面形成巨大的經(jīng)濟效益。中國在這兩個方面有以百億計的市場，世界在癌癥和病毒性傳染病的治療方面還存在大的空白，siRNA的介入可以產(chǎn)生很好的社會作用。如果中國在這一領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)突前發(fā)展，對提高中國制藥業(yè)在加入WTO后的競爭力有重要意義。吉凱基因早在2002年就開始RNA干擾開發(fā)和相關(guān)技術(shù)研究，針對OPN基因制備的可以抑制腫瘤細胞生長的siRNA是長期研究的結(jié)果之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于利用RNA干擾技術(shù)，制備一種可以用于腫瘤基因治療的核心分子，這種核心基因治療分子是以RNA干擾技術(shù)作為基礎(chǔ)的。本發(fā)明的上述目的是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的A.從genebank中調(diào)取humanOPN基因序列；B.利用GeneChem軟件預(yù)測有效的siRNA位點；C.合成12個針對0PN基因的siRNA;D.12個siRNA轉(zhuǎn)染293T細胞；E.RT-PCR檢測這些siRNA對OPN基因的mRNA的抑制作用；F.Western檢測這些siRNA對OPN基因的蛋白表達水平的抑制作用；G.篩選mRNA水平和蛋白質(zhì)水平抑制作用超過90%的siRNA。H.該siRNA是本權(quán)利要求書要求的專利材料。I.對該siRNA進行LNA化學修飾，增加其穩(wěn)定性。J.將該siRNA構(gòu)建入病毒載體，進行細胞學和動物水平實驗研究。所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對human0PN基因)，其特征在于其序列為5，GCAGCTTTACMCMATACCC3，5'TCTCCTTGCGCCACAGMT3'5，GGACAGTTATGAAACGAGT3，5'GCATTCCGATGTGATTGAT3'5'CCATTCTGATGAATCTGAT3，5，GCCTTATATCGTGATCTGC3'5，GATGCCMCGATTCCTCCT3，5，CTCTTCGGGATTGTTTCCA3，5，ACACCTGAMTTTCGTATT3'5，Tcaggccagttgcagccttct3，5'GTTGTCCAGCMTTMTM3，5，GCATCTTCTGAGGTCMTTA3'所述的siRNA結(jié)構(gòu)為s畫5，p,N隨剛,國國湖,國TT3，本發(fā)明的優(yōu)選方案為所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對human0PN基因)基于RNA干擾原理；所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對human0PN基因)針對OPN基因；和傳統(tǒng)基因抑制技術(shù)相比較，本發(fā)明具有以下有益效果使用RNA干擾技術(shù)，可以提高對目的基因的特異性，可以提高對目的基因的抑制效率，可以對目的基因的抑制效率實施不同抑制效率的選擇。附閨說明圖1為RNA干擾作用原理圖圖2為siRNA結(jié)構(gòu)圖圖3為siRNA制備流程圖具體實施方式從genbank調(diào)取目的基因信息LOCUSDEFINITIONACCESSIONVERS腦KEYWORDSSOURCEORGANISMREFERENCEAUTHORSTITLEJOURNALPUBMEDREMARKREFERENCEAUTHORSTTLEJOURNALPUBMED0005821616bpmRNAlinearPRI03-DEC-2006Homosapienssecretedphosphoprotein1(osteopontin,bonesialoproteinI,earlyT-lymphocyteactivation1)(SPP1),transcriptvariant2，.NM—000582—000582.2GI:38146097Homosapiens(human)HomosapiensEukaryota:Metazoa;Chordata;Craniata;Vertebrata;Euteleostomi;Mammalia;Eutheria;Euarchontoglires;Primates;H即lorrhini;Catarrhini;Hominidae;Homo.1(bases1to1616)Kita，Y.,Natsugoe，S.，0kumura，H.,Matsumoto,M.,Uchikado，Y.,Setoyama,T.,Owaki，T.，Ishigami,S.andAikou,T.ExpressionofosteopontininoesophagealsquamouscellcarcinomaBr.J.Cancer95(5)，634-638(2006)16880782GeneRIF:TheevaluationofOsteopontinexpressionisusefulforpredictingthemalignantpropertiesofesophagealsquamouscelcarcinoma.2(bases1to1616)Cook，A丄，Chambers,A.F.，Turley,E.A.andTuck,A.B.Osteopontininductionofhyaluronansynthase2expressionpromotesbreastcancermalignancyJ.Biol.Chem.281(34),24381-24389(2006)16807238REMARKGeneRIF:.OPN-transfectedcellsexpresshighlevelsofhyaluronansynthase2,whichisassociatedwithincreasedHAproductionandmatrixretentionandisnecessaryfortumorcelladhesiontobonemarrowendothelialcellsandanchorage-independentgrowthREFERENCE3(bases1to1616)AUTHORSSeth,D.,Gorrell，M.D.,Cordoba,S.,McCaughan，G.W.andHaber，P-S.TITLEIntrahepaticgeneexpressioninhumanalcoholichepatitisJOURNALJ.H印atol.45(2),306-320(2006)PUBMED16797773REMARKGeneRIF:Real-timeRT-PCRconfirmedup-regulationofIL-8,osteopontin,andTNFRSF14anddown-regulationofSAMeSandCD209inAH,REFERENCE4(bases1to1616)AUTHORSMaeno,Y.,Nakazawa，S.,Daole,D.,VanTuan，N.，Giang,N.D.，VanHanh,T.andTaniguchi，K.TITLEOsteopontinisinvolvedinThl-mediatedimmunityagainstPlasmodiumfalciparuminfectioninaholoendemicmalariaregioninVietnamJOURNALActaTrop.98(3)，305-310(2006)PUBMED16765311REMARKGeneRIF:resultssuggestthatOPNmightsuppressmultiplicationofPlasmodiumfalciparumthroughThelper1cells-mediatedimmuner6spons6sREFERENCE5(bases1to1616)AUTHORSNakamura,H.，Honda，H.,Inada，Y.，Kato,N.,Kato，K.，Kitazawa，LandSugisaki,T.TITLEOsteopontinexpressioninvascularsmoothrausclecellsinpatientswithend-stagerenaldiseaseJOURNALTherApherDial10(3),273-277(2006)PUBMED16817793REMARKGeneRIF:hyperphosphatemiaorazotemiaisassociatedwiththeexpressionofosteopontininvascularsmoothmusclecellsinpatientswithESRDREFERENCE6(bases1to1616)AUTHORSKohri,K.,Suzuki'Y.，Yoshida，K.,Yam畫to,K.，Amasaki，N.'Yamate，T.,Umekawa，T.,Iguchi，M.，Sinohara,H.andKurita,T.TITLEMolecularcloningandsequencingofcDNAencodingurinarystoneprotein,whichisidenticaltoosteopontinJOURNALBiochem.Biophys.Res.Commun.184(2)，859—864(1992)PUBMED1575754REFERENCE7(bases1to1616)AUTHORSShiraga，H.，Min,W.'VanDusen，W.丄，Clayman,M.D.,Miner,D.,Terrell,C.H.,Sherbotie，J.R.,Foreman,J.W.,Przysiecki,C.,Neiison,E.G.etal.■TITLEInhibitionofcalciumoxalatecrystalgrowthinvitrobyuropontin:anothermemberoftheasparticaci.d-richproteinsuperfamilyJOURNALPr()c.Natl.Acad.ScLU.S.A.89(1),426-430(1992)PUBMED1729712REFERENCE8(bases1to1616)AUTHORSYoung,M.F.，Kerr，J.M.,Termine，J.D.，Wewer,U.M.,Wang,M.G.，McBride，0.W.andFisher,L.W.TITLEcDNAcloning,mRNAdistributionandheterogeneity,chromosomallocation,andRFLPanalysisofhumanosteopontin(OPN)JOURNALGenomics7(4)，491-502(1990)PUBMED1974876REFERENCE9(bases1to1616)AUTHORSFisher,L.W.,McBride,0.W.，Termine,J.D.andYoung，M.F.TITLEHumanbonesialoprotein.DeducedproteinsequenceandchromosomallocalizationJOURNALJ.Biol.Chem.265(4)，2347-2351(1990)PUBMED2404984REFERENCE10(bases1to1616)AUTHORSEtheridge，L.L.TITLEInmemoriam:EllaThompsonJOURNALJPractNurs26(3)，10(1976)PUBMED1107524COMMENTVALIDATEDREFSEQ:Thisrecordhasundergonepreliminaryreviewofthesequence,buthasnotyetbeensubjecttofinalreview.ThereferencesequencewasderivedfromCB117856.1,BF699765.1，BX648003.1andAF052124.1.OnNov3,2003thissequenceversionreplacedgi:4759165.PublicationNote:ThisRefSeqrecordincludesasubsetofthepublicationsthatareavailableforthisgene.PleaseseetheEntrezGenerecordtoaccessadditionalpublications.FEATURESLocation/Qualifierssource1..1616/organism="Homosapiens*"/mol—type="mRNA〃/db—xref=〃taxon:9606w/chromosome=〃4w/map="4q21-q25〃gene1..1616/gene="SPPl〃/note=〃secretedphosphoprotein1(osteopontin,bonesialoproteinI,earlyT-lymphocyteactivationi);synonyms:OPN,BNSP，BSPI，ETA-1,MGC110940"/db—xref="GeneID:6696"/db—xref="HGNC:11255〃/db—xref=〃HPRD:01325"/db—xref="MW:166490"CDS166..1068/gene="SPPl〃/go—component=〃extracellularmatrix(sensuMetazoa)[pmid1107524];extracellularregion[pmid1107524];extracellularspace"/go—function=〃cytokineactivity;growthfactoractivity[pmid1107524];integrinbinding;proteinbinding"/go_process=〃anti—鄰optosis;celladhesion;cell—cellsignaling[pmid1107524];cell-matrixadhesion;inductionofpositivechemotaxis[pmid1107524];leukocytechemotaxis[pmid1107524];negativeregulationofbonemineralization[pmid1729712];ossification[pmid10766759]:positiveregulationofTcellproliferation[pmid1107524];regulationofmyeloidcelldifferentiation[pmid1107524];T-helper1typeimmuneresponse[pmid1107524]"/note="isoformbisencodedbytranscriptvariant2;osteopontin;secretedphosphoprotein-1(osteopontin,bonesialoprotein);SPP1/CALPHA1fusion;osteopontin/iramunoglobulinalpha1heavychainconstantregionfusionprotei,/codon—start=l/product=wsecretedphosphoprotein1isoformb〃/protein—id="NP—000573.1〃/db—xref=〃GI:4759166〃/db—xref=〃CCDS:CCDS3626.1"/db—xref=〃GeneID:6696"/db—xref="HGNC:11255"/db_xref=〃HPRD:01325〃Mb—xref=〃MIM:166490"/translation=〃MRIAVICFCLLGITCAIPVKQADSGSSEEKQLYNKYPMVATWLNPDPS諷QNLLAPQTLPSKSNESHD剛DD船DEDDDDHVDSQDSIDSNDSDDVDDTDDSHQSDESHHSDESDELVTDFPTDLPATEVFTPVVPTVDTYDGRGDSVVYGLRSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHMESEELNGAYKAIPVAQDLNAPSDTOSRGKDSYETSQLDDQSAETHSHKQSRLYKRKANDESNEHSDVIDSQELSKVSREFHSHEFHSHEDMLVVDPKSKEEDKHLKFRISHELDSASSEVN"STS416..611/gene=〃SPPl〃/standard—腦e-〃PMC351321P4〃/db—xref="UniSTS:273245"STS662..1313/gene=〃SPPl〃/standard—name=〃SPPl—3239〃/db—xref=〃UniSTS:462569〃STS756..994/gene=〃SPPl"/standard—n柳e-〃SHGC—59479〃/db一xref=〃UniSTS:41951〃STSSTSSTSORIGIN6〗12〗18〗24]30〗36〗42]48]54〗60〗66〗72〗78〗8490〗96J102〗腦114〗120〗126〗132138]144]15015611156..1288/gene=〃SPPl〃/standard—name="D4S3132"/db—xref=〃UniSTS:81923"1266..1475/genesppi"/standard—nameSHGC4-1078"/db—xref=〃UniSTS:77951"1359..1485/gene=〃SPPl〃/standard—翻e:〃SHGC-36594〃/dbxref="UniSTS:4033"ctccctgtgtcagcagcagcttgcagccttEltttgCttttagttctg鄉(xiāng)cctgacccatgaaagccatgcaggactccatctgatgagtctgccagc朋ggtgatagtgcagtaccctgggtgcatacacgtgggaaggC3C33gC3gtgtgattgatatttcgtattttacaatttctaacatga犯ttaactaatgtaasgcttcagttaatatttgcccacttaaatgtat3tttttaagaatttgtggtggagg3agg鄉(xiāng)aggcCtC8gCC8朋gcctcctaggaaaagcagctctcagaagcattgactcg朋ctcaccattcccgaagtttttggtttatggaggccatcccacagttatgagtcaggaactstatgctggtCtC3tg犯ttcactttgcatgcttctttctgtttgataatggttstgtctttattctctcgttgtgstt已gtggtgtc犯tttttactgctgtctgcagcagagcscagccgccgacc肌catcacctgtttacaacaaag犯tctcctatgattgttggatcgactctgattgatgaatctcsctccagttactgaggtcEtcgaggacatccgttgcccagaacggigtcagt33gCgg333ttccaaagtctgtagacccc￡lg￡lt3gtgC3cagtttattgtagtttagttatgttcattcaacattt;tattctttttgtgttgcttatttagcatttaaa3tCgtCggg3gg朋aactcagccataccagtacccagatggccccacagagatga卿tggatgt柳tggatgaactgggtccccacaggacctgaacgctggatg獄gccaatgatgagccgtgaattcttctgaggggtaaaaatgcgttg組gtgtgtggcttcagtcactataagtgtg犯t犯gttttcccac狐記33鄉(xiāng)詔ttctggg鄉(xiāng)ccagactcgtctsccatgagttaaacaggcctgtggccaccccttccaagatg8tg3ccaacactgatgatc過ctgatttagtttcgcetgtgg,gcgacgccttctgaagagtgctgatccacagccatttatagcaiatatctatttgtggaaactccatgca朋cta犯gca^ieic犯tcttttgtttatctUtatxggttgt:ccaggcttggttgtctcaggccag幼ttgC3gtgtgattctggaatggct犯actaagtccaactgtggacagcttctcaccagtcccacggactgatggccgaacctgacatcttgggacagc^CCC3C3gCgcattccgattga3tttcm;;Hgtctgga^Ctgt犯3CUlt:cactgtattaatetcttttHttgaatgt肌針對OPN設(shè)計可能有效的siRNA靶點:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>GTCAGGMCTTTCCAMGT274542.86%GCMTGAGCATTCCGATGT271847.62%TGCTGGTTGTAGACCCCAA280847.62%CCCTTCCMGTAAGTCCM217552.38%GATTATATMGCGG嵐GC1.568833.33%TGTAGATGACACTGATGAT1.528738.腦AAGCTAATGATGAGAGCAA1.570338.應(yīng)ATGATGAGAGCAATGAGCA1.570938.10%ACGACTCTGATGATGTAGA1.527442.86%ACCGMGTTTTCACTCCAG1.538442.86%AGGACAGTTATGAAACGAG1.562242.86%ATGAGCATTCCGATGTGAT1.572142.86%TTGACTCGMCGACTCTGA1.526547.62%CACTGATGATTCTCACCAG1.529647.62%CTGATGATTCTCACCAGTC1.529847.62%TTCTCACCAGTCTGATGAG1.530547.62%GTCTGATGAGTCTCACCAT1.531447.62%CATATGATGGCCGAGGTGA1.542147.62%CTCCATTGACTCGMCGAC1.526052.38%CCTGCCAGCMCCGMGTT1.537452.38%CACATGGMAGCGAGGAGT1.553152.38%GATGCTGTGGCCACATGGC1.511157.14%CAGCCAGGACTCCATTGAC1.525157.14%GACCTGACATCCAGTACCC1.548457.14%CCTGAACGCGCCTTCTGAT1.558757.14%CAGCCGTGGGAAGGACAGT1.561157.14%GCCGTGGGMGGACAGTTA1.561357.14%GCCGTGAATTCCACAGCCA1.576657.14%GATAMCACCTG織TTTC1.584033.33%GTAAGGAAGMGAT総CA1.582938.10%GGMGAAGATAAACACCTG1.583338.應(yīng)TTAGATAGTGCATCTTCTG1.587338.10%TGATATCGATGATGMGAT1.521533.33%TATGGATGATGAAGATGAT1.521833.33%TTCTGATGMTCTGATGAA1.533233.33%合成12對siRNA;耙序列為5，GCAGCTTTACAACMATACCC3，5'TCTCCTTGCGCCACAGAAT3'5，GGACAGTTATGAAACGAGT3，5'GCATTCCGATGTGATTGAT3，5'CCATTCTGATGMTCTGAT3，5，GCCTTATATCGTGATCTGC3，5，GATGCCAACGATTCCTCCT3'5，CTCTTCGGGATTGTTTCCA3，5，ACACCTG嵐TTTCGTATT3'5，Tcaggccagttgcagccttct3，5，GTTGTCCAGCMTTAATM3，5，GCATCTTCTGAGGTCMTTA3，轉(zhuǎn)染293細胞；活細胞計數(shù)用無血清培養(yǎng)基把細胞懸液稀釋到2002000個/毫升(一般稀釋倍數(shù)為100倍)，在0.1毫升的細胞懸液中加入0.1毫升的0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計數(shù)板計數(shù)細胞?；罴毎懦馀_盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞。細胞株的凍存取培養(yǎng)23天生長旺盛的細胞，用細胞培養(yǎng)液將細胞配成2X1062X107/ml。在lml細胞凍存管中加入0.5ml細胞懸液，0.4ral小牛血清和0.lml二甲基亞砜(或甘油)，混勻后密封。置4-Cl小時，一2(TC2小時，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上過夜后浸入液氮中。細胞復(fù)蘇從液氮罐中取出細胞凍存管，應(yīng)帶有防護眼睛和手套。迅速放入盛有5(TC水的水浴中，并不時搖動，盡快解凍。用70%酒精擦拭消毒后，移至凈化臺上，吸出細胞懸液至培養(yǎng)瓶中，補加3ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置溫箱培養(yǎng)。次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。細胞傳代棄去舊培養(yǎng)液，加入5mL滅菌PBS溶液，輕輕晃動，洗滌細胞生長面，然后棄去PBS溶液。加入2mL胰酶消化液，消化l-2min直到細胞完全消化下來。加入含10%胎牛血清和100U/ml雙抗的DMEM培養(yǎng)基5ml，用刻度吸管吹打數(shù)次，將瓶壁上的細胞沖洗下來。混勻細胞后分至兩個新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。裝染棄去細胞液，加5mlPBS洗一次。加2ml胰酶消化1-2分鐘。棄去胰酶，加3-4mlMEM(不含血清)吹打均勻。將細胞滴加于6孔培養(yǎng)板中(每孔2ml)，使培養(yǎng)24小時后，細胞融合度控制在4050%。對于6孔板的每個孔，用2ug質(zhì)粒DNA與245plDMEM混合。將LipofectAMINE2000試劑輕柔搖勻，取5jxiLipofect層INE2000試劑在另一管中與245ji1DMEM混合，在室溫下溫育5分鐘。把稀釋后的shRNA與稀釋后的LipofectAMINE2000進行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。必須在5分鐘之內(nèi)混合?；旌虾?，在室溫下溫育20分鐘，以便形成shRNA與LipofectAMINE2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。把shRNA與LipofectAMINE2000的混合液加入培養(yǎng)細胞，輕柔前后推搖培養(yǎng)板以混勻液體。然后將培養(yǎng)板送入細胞培養(yǎng)箱。在檢測RNAi效果(即檢測靶基因的mRNA和蛋白質(zhì)水平)之前，一般無需換培養(yǎng)液。但如果以上轉(zhuǎn)染試劑用量時有明顯細胞毒性(如黏附細胞在轉(zhuǎn)染4小時后出現(xiàn)明顯較多細胞死亡)，那么可以在轉(zhuǎn)染滿3小時但不滿4小時，將培養(yǎng)板中所有培養(yǎng)基棄去，并加入新鮮培養(yǎng)基(可以使用含血清的培養(yǎng)基)。RT-PCR檢測0PN的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；RT1HiOligodT(O.5ug/ul)+2TotalRNA(lug/ul)+6PiDEPC-H20(mixwell470°C,lOmin4立即插入(TC冰水浴中4addllMlmixture4W5XRTbuffer2Wl關(guān)d證s0.5RNasin1PiMLV-RTase3.514DEPCH20I42°C，lhr470°C,lOmini0°C42ul用于PCR，其余jC:存在-20°CPCRPCR引物退火溫度55°CPCR循環(huán)數(shù)目28cycles目的片斷大小400bpWestern檢測0PN的蛋白表達水平；1.加入適量預(yù)冷的6XLysisBuffer。2.用預(yù)冷的刮刀將細胞刮下，冰上裂解細胞10—15miri。3.超聲破碎儀破碎細胞(200W共4次，每次5秒，間隔2秒)4.4。C，12000g，離心15min。5.取上清，測蛋白濃度后，調(diào)整為2Pg/W的蛋白終濃度，取20-40Pg蛋白，加入6Xloading上樣緩沖液，10(TC煮5-10min。6.SDS-PAGE:根據(jù)目的蛋白大小及表達豐度，取一定量蛋臺總樣品進行相應(yīng)分離膠濃度的SDS-PAGE。采用Bio-Rad電泳裝置將總蛋白進行分離。7.電轉(zhuǎn)移電泳結(jié)束后，使用轉(zhuǎn)移電泳裝置(Bio-Rad，Richraoad，CA)，在4°C，400mA恒流條件下電轉(zhuǎn)移120分鐘，將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。8.封閉用TBST(TBS+0.05%Tween20)加5%牛奶配制成封閉液。室溫封閉PVDF膜1小時或4'C過夜。9.一抗孵育用含5X牛奶的TBST分別稀釋目的蛋白或者內(nèi)參Actin—抗。室溫下與封閉好的PVDF膜孵育2小時或4"C過夜。10.洗膜TBST洗膜3次，每次10分鐘。11.二抗孵育用含5X牛奶的TBST稀釋與一抗相應(yīng)的辣根過氧化物酶驢抗兔/小鼠二抗。于室溫下孵育2小時。12.洗膜TBST洗膜3次，每次10分鐘。TBS洗膜一次，10分鐘。13.ECL:采用Amersh柳公司ECL+plusTMWesternblottingsystem試劑盒進行顯色反應(yīng)，于暗房中曝光、顯影、過水、定影。X光片(柯達)晾千待分析。有效的siRNA使用LNA修飾；修飾后的siLNA轉(zhuǎn)染293細胞(流程描述同前)；RT-PCR檢測0PN的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(流程描述同前)；Western檢測OPN的蛋白表達水平(流程描述同前)；保留在mRNA水平和western水平抑制效率均達到90%的siLNA;進行動物實驗。權(quán)利要求1.一種針對人OPN基因用于腫瘤基因治療的短的干擾核糖核酸(shortinterferingRNA，siRNA)。制備方法包括如下步驟A.從genebank中調(diào)取humanOPN基因序列；B.利用GeneChem軟件預(yù)測有效的siRNA位點；C.合成12個針對OPN基因的siRNA；D.12個siRNA轉(zhuǎn)染293T細胞；E.RT-PCR檢測這些siRNA對OPN基因的mRNA的抑制作用；F.Western檢測這些siRNA對OPN基因的蛋白表達水平的抑制作用；G.篩選mRNA水平和蛋白質(zhì)水平抑制作用超過90％的siRNA。H.該siRNA是本權(quán)利要求書要求的專利材料。I.對該siRNA進行LNA化學修飾，增加其穩(wěn)定性。J.將該siRNA構(gòu)建入病毒載體，進行細胞學和動物水平實驗研究。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對h咖anOPN基因)，其特征在于所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對humanOPN基因)是化學合成的RNA干擾制品，針對OPN基因。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對humanOPN基因)，其特征在于其序列為5,GCAGCTTTACMCMATACCC3'5'TCTCCTTGCGCCACAGMT3'5'GGACAGTTATGAAACGAGT3，5'GCATTCCGATGTGATTGAT3'5，CCATTCTGATGAATCTGAT3:5'GCCTTATATCGTGATCTGC3，5，GATGCCMCGA竹CCTCCT3，5，CTCTTCGGGATTGTTTCCA3,5，ACACCTG嵐TTTCGTATT3，5，Tcaggccagttgcagccttct3，5,GTTGTCCAGCMTTMTM3,5，GCATCTTCTGAGGTCMTTA3，4、siRNA結(jié)構(gòu)為,5，pNN麵ll,繼國誦國TT3，5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對human0PN基因),其特征在于所述siRNA在mRNA水平的抑制效率大于90%。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對human0PN基因)，其特征在于所述siRNA在蛋白質(zhì)水平的抑制效率大于90%。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對h咖anOPN基因)，其特征在于所述siRNA對腫瘤細胞的生長有明顯抑制作用。全文摘要本發(fā)明公開了一種針對人OPN基因用于腫瘤基因治療的短的干擾核糖核酸(shortinterferingRNA，siRNA)。該siRNA使用RNA干擾技術(shù)，通過利用短片斷的雙鏈RNA促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷特定基因的表達，誘使細胞表現(xiàn)出特定基因沉默的表型，被研究人員應(yīng)用到疾病治療領(lǐng)域。OPN基因表達一種多功能蛋白質(zhì)，參與人腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。它廣泛存在于正常成人組織和體液中。我們通過實驗證明，抑制OPN基因表達之后，腫瘤細胞生長受到明顯抑制。文檔編號C07H21/02GK101210037SQ20061014796公開日2008年7月2日申請日期2006年12月26日優(yōu)先權(quán)日2006年12月26日發(fā)明者曹躍瓊申請人:上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司