專利名稱：倍半萜類化合物及其組合物和從植物中提取的方法與其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物化學領域，更具體而言，涉及從金粟蘭科植物中提取的倍半萜類化合物及其組合物、提取方法和在制備抗真菌藥物中的應用，本發(fā)明還涉及具有抗真菌活性的金粟蘭科植物的提取物。

背景技術：
近年來，隨著腫瘤及艾滋病患者的不斷增加，器官移植、導管插管及內窺鏡技術的普遍開展，高效廣譜抗生素、免疫抑制劑及皮質激素的廣泛應用，真菌感染率不斷增高，特別是深部真菌感染率急劇增加。并且，隨著抗真菌藥物的大量應用，真菌耐藥性不斷出現，使真菌感染的治療變得越來越困難。因此，加強對真菌、真菌感染及抗真菌藥物作用特點與作用機制的了解與認識，對提高真菌感染治療效果，減緩真菌耐藥性的出現，促進抗真菌藥物的開發(fā)，具有重要意義。
目前真菌感染主要分為兩類，一是淺部真菌感染，通常由皮膚真菌引起，主要侵犯毛發(fā)、皮膚、指(趾)甲，俗稱癬病，如頭癬、體癬、股癬、手足癬、花斑癬等；而黏膜通常易受念珠菌屬真菌感染，產生口腔炎、腸道炎、老年性陰道炎等疾病。另一類是深部真菌感染，包括皮下組織感染及全身真菌感染。最嚴重的是全身真菌感染，主要侵犯內臟、骨骼和中樞神經系統(tǒng)，可危及生命。
引起感染的真菌通常分為致病性真菌和條件致病菌。常見的致病性真菌包括引起深部真菌感染的申克孢子絲菌(Sporotrichqm schenckii)、巴西副球孢子菌(Paracoccidiodies brasiliensis)、莢膜組織孢漿菌(Histoplasmacapsulatum)、粗球孢子菌(Coccidides immitis)及引起皮膚、毛發(fā)及指(趾)甲感染的皮膚癬菌等；常見的條件致病菌包括念珠菌(Candida)、隱球菌(Cryptococcus)、曲霉菌(Aspergillus)、毛霉菌(Mucor)等。目前臨床深部真菌感染多為此類真菌所致，其中新型隱球菌(Cryptococcus Neoformans)又名溶組織酵母菌(Torula Histolytica)，是土壤、鴿類、牛乳、水果等的腐生菌，也可存在于人口腔中。曲霉菌在自然界分布廣泛，常在機體免疫力低下時繼發(fā)感染引起疾病，最常見的有煙曲霉菌(A.gumigatus)、黑曲霉菌(A.niger)，黃曲霉菌(A.flarus)等。毛霉菌，主要菌種為叢生毛霉菌(M.corymbifer)可侵犯血管壁，引起血栓，組織壞死。在條件致病菌中最常見的為白色念珠菌(Monilia albican或Candida albicans)，20世紀80年代，院內感染的主要致病菌以革蘭氏陰性菌為主(綠膿桿菌、大腸桿菌)，念珠菌排在第9位。90年代念珠菌所占的比例上升，超過了大腸桿菌，在美國念珠菌在院內血液培養(yǎng)菌中排在第4位。念珠菌是引起真菌感染的主要致病菌，約占80％，而在念珠菌屬中白色念珠菌占有相當的比例。但近年來隨著氟康唑的大量應用，白色念珠菌分離率有所下降，而對氟康唑敏感性差的光滑念珠菌、近平滑念珠菌與克柔念珠菌分離率有所提高，給念珠菌感染的治療提出了新的挑戰(zhàn)。
目前常用的抗真菌藥物，根據作用機制主要分為4大類①、直接作用于真菌細胞膜，損害細胞膜脂質結構和功能的抗真菌藥物(如多烯類)；麥角固醇是真菌如念珠菌細胞膜的主要固醇，參與多種細胞功能，對維持真菌細胞膜的流動性和完整性以及許多膜結合酶的功能的維護至關重要。多烯類藥物(兩性霉素B、制霉菌素、那它霉素)就是通過直接與麥角固醇結合而起殺菌作用的。在多烯類藥物中，兩性霉素B(AmB)為唯一能夠全身用藥治療深部真菌感染的藥物。此藥物具有大分子結構，與真菌細胞膜麥角固醇結合形成固醇-多烯復合物后，細胞膜脂質雙層去極化，在細胞膜上形成許多微孔，使細胞膜的通透性發(fā)生改變，最終導致鉀、鎂等離子及基質外漏而起殺菌作用。AmB特殊的作用方式決定了其具有廣譜抗真菌活性，但從其作用機制也可以預期AmB對宿主細胞具有潛在的毒性。因為雖然麥角固醇是真菌細胞膜特有的脂質，但它與哺乳動物細胞膜的成份膽固醇的結構具有相似性，因此AmB用于人體時表現出嚴重的腎毒性。所以雖然多烯類抗真菌藥為廣譜殺真菌劑，但嚴重的腎毒性使其臨床應用受到限制。目前多用于治療曲霉菌以及其他絲狀真菌引起的感染，而且，對那些危及生命的真菌感染，如球孢子菌、莢膜組織胞漿菌和皮炎芽生菌，以及一些對氮唑類藥物不敏感的念珠菌感染，AmB仍然是最有效的藥物。為了克服其腎毒性，已開發(fā)上市了一系列AmB脂質體新劑型。這些新的劑型通過降低AmB到達腎臟的速率；增加空間障礙，減少AmB與膽固醇的親和力而使其腎毒性降低?，F在已有3個不同的AmB的脂類復合物用于臨床。
②、影響真菌細胞膜麥角固醇的生物合成的抗真菌藥物(如唑類、烯丙胺類和嗎啉類) 麥角固醇的生物合成有多個酶參與，每一個酶的抑制劑都可能抑制真菌的生長，目前臨床上常用的作用于麥角甾醇合成的藥物主要有唑類(酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等)，唑類抗真菌藥為全化學合成藥物，于60年代末開發(fā)上市，為抑菌劑，對酵母菌和霉菌有效。其作用機制是通過競爭性抑制真菌羊毛甾醇14a-脫甲基酶，干擾細胞膜麥角固醇的合成，導致麥角固醇耗竭，使膜完整性、通透性和膜上許多酶活性改變，胞漿內容物滲出而起抑菌作用。在此類藥物中，咪康唑與益康唑由于作用較差且副作用大，目前臨床上主要是局部用藥。酮康唑抗真菌活性強，但由于其明顯的肝毒性限制了其臨床應用。以氟康唑和伊曲康唑為代表的第三代抗真菌藥物是目前臨床上治療深部真菌感染的首選藥物。氟康唑的抗菌譜相對較窄，主要用于念珠菌、隱球菌所致的感染，對曲霉菌等活性低，且易產生耐藥性。伊曲康唑抗菌譜廣一些，對曲霉菌感染的治療亦有效，但伊曲康唑存在口服生物利用度不穩(wěn)定的問題。伊曲康唑為脂溶性藥物，難溶于水，最先以膠囊劑上市。由于本品具有很強的嗜角質性，主要用于灰指甲炎等淺部真菌感染的治療。隨著制劑工藝的改進，伊曲康唑口服液和注射劑相繼問世，給深部真菌感染的治療帶來了更多的選擇。近年來又上市了新的三唑類抗真菌藥物伏立康唑(Voriconazole)，此藥對很多條件致病性真菌，包括曲霉菌、克魯斯念珠菌等耐氟康唑的真菌顯示出較好的抗真菌活性。需要注意的是唑類抗真菌藥物為肝藥酶抑制劑，易與其他藥物發(fā)生相互作用，因此，臨床應用時應特別注意。另一類為烯丙胺類(特比萘芬)，此類藥物作用于麥角固醇生物合成較早的步驟，對角鯊烯環(huán)氧化酶有可逆的非竟爭性抑制作用，導致真菌細胞角鯊烯累積，麥角固醇耗竭而死亡。由于高濃度的角鯊烯可增加細胞膜的滲透性，導致正常細胞膜結構破壞，因此，細胞膜中角鯊烯的累積可能是導致真菌死亡的主要原因。此類藥物臨床上常用的品種為特比萘芬和布替奈芬。本品對大多數絲狀菌包括曲霉菌有殺滅作用，并能濃集在指(趾)甲及皮膚角質層中，因此，對皮膚真菌及一些局部真菌感染有效。
③、作用于真菌細胞壁，主要影響幾丁質、葡聚糖、甘露聚糖和甘露-蛋白質復合體的抗真菌藥物，如抑制真菌細胞壁主要成分1，3-β葡聚糖合成的棘白菌素類藥物caspofungin，以及抑制幾丁質合成的日光霉素和多氧霉素等；真菌細胞壁是真菌特有的一種細胞器，在維持細胞的生長和正常生理功能中起重要作用，它已成為抗真菌藥物一個新的作用靶點。真菌細胞壁的主要成分為β-葡聚糖、幾丁質和甘露糖蛋白，通過抑制或干擾這些成分的合成便能有效地抑制和殺滅真菌。根據作用靶位的不同這類藥物可分為3大類 β-(1，3)葡聚糖合成酶抑制劑Echinocandin(棘球白素)類化合物為真菌次級代謝產物，是一類含有六肽環(huán)的脂肪酸衍生物，能夠非竟爭性抑制真菌β-(1，3)葡聚糖合成酶，阻止β-(1，3)葡聚糖的合成，使真菌細胞壁結構異常，細胞壁破裂，內溶物滲漏而死亡，為殺菌劑。此類藥物對多種念珠菌和曲霉菌有效，但對新生隱球菌效果不佳，其副作用是導致溶血。對其結構進行改造形成了一系列半合成衍生物。其中Caspofungin acetate(卡泊芬凈)是一個水溶性半合成棘球白素B衍生物，由美國默克公司研制開發(fā)，為棘白菌素類中第一個被美國FDA批準上市的抗真菌藥物。此藥物對念珠菌和曲霉菌有效，體外實驗表明對粗球孢子菌和假膜組織胞漿菌等雙相真菌亦有效。由于此類藥物作用于細胞壁，而人體細胞沒有細胞壁，因此，可增加作用的選擇性，減少副作用。加之由于作用機制不同，可與氟康唑和AmB聯(lián)合應用，已成為抗真菌藥物開發(fā)的熱點。目前，已有不少具有臨床應用價值的棘白菌素類藥物，處于研究階段。
幾丁質合成酶抑制劑幾丁質是β-(1，4)糖苷鍵連接的N-乙酰胺基葡萄糖的鏈狀聚合物，是細胞壁的支架結構。尼可霉素(Nikkomycin Z)和多氧霉素(Polyoxins)是兩類幾丁質合成酶抑制劑，因其結構與幾丁質合成前體相似，可竟爭性抑制真菌細胞壁幾丁質的合成而起殺菌作用。幾丁質合成酶抑制劑的抗菌譜較窄，尼可霉素對富含幾丁質合成酶的二態(tài)真菌活性高，對釀酒酵母和絲狀真菌的活性不佳。研究發(fā)現，該類化合物的體外活性難以轉化成體內活性，其原因可能是不易透過細胞膜和易被酶水解，另外，許多能作為抗病原真菌的抗生素或用于殺蟲的抗生素，多數具有抑制幾丁質生物合成的作用。多氧霉素(polyoxins)和日光霉素都能抑制真菌細胞壁的合成，其中多氧霉素D是真菌細胞壁幾丁質合成酶最有效的競爭性抑制劑。日光霉素的結構類似于多氧霉素，能抑制真菌幾丁質的合成，是一個很有前途的殺蟲、殺菌農用抗生素。近期研究表明，此藥有可能作為抗真菌藥用于臨床。
作用于甘露聚糖和甘露聚糖-蛋白質復合物的藥物甘露聚糖和甘露聚糖-蛋白質復合物是真菌細胞壁的中外層結構。普那米星類(Pradimicin)和Benanomicin類化合物在鈣離子的條件下，可與真菌細胞表面上的甘露聚糖-蛋白質復合物的多糖部分絡合，導致細胞壁結構異常，細胞膜通透性增加，胞內鉀外漏而致細胞死亡。該類抗真菌藥物具有廣譜的體內外活性，對念珠菌及曲霉菌有效，并對三唑類耐藥的菌株有活性。雖然該類藥物的活性只有AmB的1/50到1/40，但其毒性僅為AmB的1/130，且對病毒有活性，Benanomicin A目前已用于艾滋病患者機會性真菌感染的預防和治療。
④、干擾真菌核酸合成的抗真菌藥物，如5-氟胞嘧啶，可干擾真菌DNA的合成。氟胞嘧啶具有溶于水、吸收率高、蛋白結合率低、副反應少等特點。其作用機制是在胞嘧啶透性酶和胞嘧啶脫氨基酶作用下轉化成5-氟脲嘧啶，然后在脲嘧啶間磷酸焦磷化酶(UMDP)作用下，轉化成5-單磷酸氟代去氧脲嘧啶。后者能夠抑制DNA合成。人體組織缺乏胞嘧啶脫氨基酶，而不受該藥的影響。由于絲狀真菌大都缺乏這些酶，因此，此類藥物僅對念珠菌和新形隱球菌有效。
雖然目前對于真菌感染出現了很多的藥物，但是這些藥物有的是毒性比較大，有的是治療范圍比較窄，而且對于目前臨床上常用的抗真菌感染藥物產生耐藥性的真菌也越來越多，因此需要藥學工作者不斷的開發(fā)出新的具有良好抗真菌活性的藥物或者藥物前體。


發(fā)明內容
為了解決上述存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一類具有抗真菌活性的從金粟蘭科植物中提取的倍半萜類化合物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含有治療有效量的上述倍半萜類化合物的組合物。
本發(fā)明的又一目的是提供一種從金粟蘭科植物中提取倍半萜類化合物的提取方法。
本發(fā)明的再一目的是提供上述倍半萜類化合物在制備抗真菌藥物中的應用。
本發(fā)明的又一目的是提供具有抗真菌活性的金粟蘭科植物的提取物。
本發(fā)明提供的一類具有抗真菌活性的從金粟蘭科植物中提取的倍半萜類化合物，其具有如下化學式I所示的結構
其中 R1為氫、羧基、羥基或醛基；R2為氫、羧基、羥基或醛基；R3為氫或羥基；R4為氫、羥基或酮基；R5為異丙基；R6為甲基； 或者，C8和C9之間鍵斷開，其中R1是醛基，R2是氫，R3是羥基，R4是氫，R5為異丙基，R6為甲基； 或者，C5和C10之間鍵斷開，其中R1是氫，R2是醛基或羧基，R3是氫，R4是β-羥基、α-羥基或酮基，R5為異丙基，R6為甲基。
本發(fā)明提供一種含有治療有效量的具有結構式I的倍半萜類化合物的藥物組合物，該藥物可進一步包含藥物上常規(guī)的輔料，例如藥物學上的常規(guī)載體。
本發(fā)明又提供一種具有抗真菌活性的金粟蘭科植物總提取物，該總提取物是通過如下步驟制得(1)用醇、水或其混合物浸漬金粟蘭科植物樣品，過濾后得到提取液，其中所述的醇為甲醇或乙醇；(2)將步驟(1)中得到的提取液通過蒸發(fā)除去溶劑，得到具有抗真菌活性的提取物。
本發(fā)明進一步提供了一種具有抗真菌活性的金粟蘭科植物活性部位的提取物，該提取物是通過如下步驟制得(a)用醇、水或其混合物浸漬金粟蘭科植物樣本，過濾后得到提取液；(b)將提取液中的溶劑蒸發(fā)形成漿狀物；(c)將該漿狀物用水溶解，得到總提取物的水混懸液；(d)用乙酸乙酯對上述混懸液進行液液萃取，得到乙酸乙酯萃取物；(e)對乙酸乙酯萃取物進行硅膠柱層析，用溶劑石油醚/丙酮按體積比100∶0、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1依次進行梯度洗脫，特定比例5∶1的有機混和溶劑洗下的流份為具有抗真菌活性的總倍半萜提取物；和(f)蒸發(fā)上述具有抗真菌活性的總倍半萜提取物至干形成具有抗真菌活性的活性部位提取物。
本發(fā)明進一步提供了從上述的活性部位提取物中制備具有抗真菌活性的本發(fā)明的金粟蘭倍半萜化合物的方法，該方法采用柱層析工藝，根據不同化合物在硅膠上的吸附能力的差異來進行分離、提純活性部位提取物，得到六種具有抗真菌活性的金粟蘭倍半萜，化合物與硅膠之間的吸附作用越強，越需要用極性更強的溶劑才能從硅膠上把它洗脫下來。
本發(fā)明提供的從金粟蘭科植物中提取的倍半萜類化合物及其組合物以及金粟蘭科植物的提取物，具有抗真菌活性，可用于制備抗真菌藥物。



圖1為金粟蘭科植物的總提取物和活性部位提取物抗新生隱球菌的活性結果。
圖2為金粟蘭科植物的總提取物和活性部位提取物抗清酒假絲酵母菌的活性結果。

具體實施例方式 下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述，但不作為對本發(fā)明的限定。
I.概要 本發(fā)明提供抗真菌化合物如金粟蘭倍半萜類化合物、植物提取物、金粟蘭倍半萜類化合物的組合物，及其制備方法和應用。該抗真菌化合物、植物提取物和組合物能有效殺滅各類致病菌。在此，詞語“抗真菌活性”是指殺滅或抑制細菌的生長。
II.化合物 本發(fā)明提供一類具有抗真菌活性的從金粟蘭科植物中提取的倍半萜類化合物。本領域技術人員不難理解，本發(fā)明的擁有不對稱碳原子(手性中心)或雙鍵的某些化合物；消旋物、非對映體、對映體、幾何異構體和單體異構體都在本發(fā)明的保護范圍之內。
本發(fā)明提供的一類具有抗真菌活性的從金粟蘭科植物中提取的倍半萜類化合物，其具有如下化學式I所示的結構
其中 R1為氫、羧基、羥基或醛基；R2為氫、羧基、羥基或醛基；R3為氫或羥基；R4為氫、羥基或酮基；R5為異丙基；R6為甲基； 或者，C8和C9之間鍵斷開，其中R1是醛基，R2是氫，R3是羥基，R4是氫，R5為異丙基，R6為甲基； 或者，C5和C10之間鍵斷開，其中R1是氫，R2是醛基或羧基，R3是氫，R4是β-羥基、α-羥基或酮基，R5為異丙基，R6為甲基。
表1列出了最優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明倍半萜類六種具體的化合物的化學結構式，即A、B、C、D、E、F。
表1

本發(fā)明的化合物為天然產物。在一優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的天然產物具有如下結構式
即C5和C10之間鍵斷開，其中R1為氫；R2為醛基或羧基；R3為氫；R4為氫、羥基(包括α-羥基和β-羥基兩種構型)或酮基；R5為異丙基；R6為甲基；進一步優(yōu)選，R4是α-羥基，R2是醛基，也就是指化合物A；R4是β-羥基，R2是醛基，也就是指化合物B；R4是酮基，R2是羧基，也就是指化合物F。
在又一優(yōu)選的實施方案中，通式I的化合物具有結構式Ib。

其中，R1為羧基或羥基，R2為氫或羥基；當R1是羧基，R2是氫，也就是指化合物D；當R1是羥基，R2是羥基，也就是指化合物E。
在又一優(yōu)選的實施方案中，通式I的化合物具有結構式Ic，結構式如下
也就是指化合物C。
本發(fā)明的倍半萜類化合物的制備方法 如上所述，本發(fā)明的化合物為天然產物。天然產物如具有結構式Ia、Ib或Ic的化合物能從金粟蘭科植物提取物中提取。屬于金粟蘭科的屬選自Sarcandra、Chloranthus或Hedyosmum。Chloranthus屬的種類優(yōu)選選自C.angustifoliu、C.oldhami、C.spicatus、C.holostegius、C.anhuiensis、C.tianmushanensis、C.henryi、C.sessilifolius、C.fortunei、C.elatior、C.japonicas、C.serratus和C.multistachys。在一個優(yōu)選實施方案中，Chloranthus種類是Chloranthus spicatus。這些天然產物能從活性部位提取物中獲得。使用根據本發(fā)明的方法能產生一種活性部位提取物。
因此，本發(fā)明提供了一種從金粟蘭科植物中提取倍半萜類化合物的提取方法，該方法包括(a)用醇、水或其混合物浸漬金粟蘭科植物樣本，過濾后得到提取液；(b)將提取液中的溶劑蒸發(fā)形成漿狀物；(c)將該漿狀物用水溶解，得到總提取物的水混懸液；(d)用乙酸乙酯對上述混懸液進行液液萃取，得到乙酸乙酯萃取物；(e)對乙酸乙酯萃取物進行硅膠柱層析，用溶劑石油醚/丙酮按體積比100∶0、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1依次進行梯度洗脫，特定比例5∶1的有機混和溶劑洗下的流份為具有抗真菌活性的總倍半萜提取物；(f)蒸發(fā)上述具有抗真菌活性的總倍半萜提取物至干形成具有抗真菌活性的活性部位提取物；和(g)采用在硅膠柱上進行連續(xù)梯度洗脫的方法用來生產含本發(fā)明倍半萜的組份。該組份此后可再用硅膠柱層析來分離生產化合物A，B，C，D，E和F。該方法的主要原理就是根據不同化合物在硅膠上的吸附能力的差異來進行分離，化合物與硅膠之間的吸附作用越強，越需要用極性更強的溶劑才能從硅膠上把它洗脫下來。
III.金粟蘭科植物提取物 本發(fā)明提供具有抗真菌活性的金粟蘭科植物總提取物，本發(fā)明還提供了具有抗真菌活性的金粟蘭科植物活性部位提取物。屬于金粟蘭科的屬是例如Sarcandra、Chloranthus或Hedyosmum，優(yōu)選Chloranthus。Chloranthus屬的種可以是例如C.angustifolius，C.oldhami，C.spicatus，C.holostegius，C.anhuiensis，C.tianmushanensis，C.henryi，C.sessilifolius，C.fortunei，C.elatior，C.japonicas，C.serratus和C.multistachys。優(yōu)選的Chloranthus種是Chloranthus spicatus。
本發(fā)明提供的具有抗真菌活性的金粟蘭科植物總提取物或活性部位提取物的制備方法如上所述，該植物提取物可包括倍半萜類化合物天然產物，例如具有結構式Ia、Ib、Ic的化合物或其混合物，更具體地說具有表1中描述的化合物或其混合物。
實施例 1.使用儀器 熔點由Fisher Scientific儀器測量。樣品在甲醇溶液中的旋光度用Perkin-Elmer 341旋光計測定。EI-MS(電子轟擊質譜)采用直接進樣，由Finnegan MAT-95質譜儀測定，而ESI-MS(電噴霧質譜)用FinneganLCQ-DECA儀器測定。1H和13C NMR核磁共振(CDCl3)由Varian INOVA500型和Bruker AM-400型核磁共振儀測定。化學位移δ(ppm)以TMS為內標，耦合常數(J)以Hz給出。薄層層析(TLC)硅膠板，柱層析用硅膠為青島海洋化工廠生產(200～300目)；斑點用試劑噴霧顯色。
2.植物材料 下述實驗中所用的Chloranthus spicatus干根莖從中國貴州省采集，經中國科學院上海藥物研究所沈金貴副教授鑒定是Chloranthus spicatus。植物樣本保存在中國科學院上海藥物研究所植物標本室。
3.真菌樣本 白色念珠菌(Candida albicans)ATCC 17372華山醫(yī)院提供 新生隱球菌(Cryptococus neoformans) ATCC 76615長征醫(yī)院提供 光滑球擬酵母菌(Torulopsis glabrata) 華山醫(yī)院提供 清酒假絲酵母菌(Candida sake) 華山醫(yī)院提供 4.培養(yǎng)基 固態(tài)培養(yǎng)基SDA 液態(tài)培養(yǎng)基YNB(氮源復合氨基酸) 5.陽性對照 兩性霉素B(1000ug/ml)。備用，-20℃保存。
實施例1 具有抗真菌活性的金粟蘭科植物總提取物 將Chloranthus spicatus干燥全草(10kg)粉碎成粉，用乙醇室溫下浸漬提取3次，每次3天，過濾后乙醇溶液蒸干得到乙醇總提物(475g)。
實施例2 具有抗真菌活性的金粟蘭科植物活性部位提取物 將實施例1中的總提取物溶于20L蒸餾水中，制成混懸液，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到乙酸乙酯萃取物300g；乙酸乙酯萃取物300g進行硅膠柱層析，用石油醚-丙酮按體積比100∶0、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1和1∶1進行梯度洗脫，共接收六個流份，每個流份接收1500ml；蒸干體積比為5∶1洗脫下的流份有機溶液，得到活性部位提取物(16.9g)。
實施例3 六種金粟蘭倍半萜(化合物A-F)的分離 實施例2的活性部位提取物(16.9g)溶于5L氯仿中進行溶解，而后進行MCI柱層析，用體積百分比5％，10％，15％，20％，30％，40％，60％，70％，80％，95％的乙醇水溶液梯度洗脫，每個濃度洗脫1000ml，減壓濃縮后，依次得到相應的10個部位(Bw-B1～B10)， 其中，15％乙醇溶液洗脫后得到的Bw-B3部分(2.227g)，進行硅膠柱層析，用石油醚-氯仿(1∶1)洗脫，共接收7個流份，每個流份接收500ml，其中流份3減壓濃縮，得到BW-B3C部位，再用制備型HPLC(色譜柱RP18柱，ODS鍵合相；流動相CH3CN/H2O，混合比例在30min內從5％線性變化到95％；流速3ml/min)進行分離，收集保留時間9.6min時的流份，減壓濃縮后得到化合物A(30mg)，收集10.2min時的流份，減壓濃縮后得到化合物B(90mg)； 40％乙醇溶液洗脫后得到的Bw-B6部分(0.264g)，進行硅膠柱層析，用石油醚-丙酮(6∶1)洗脫，共接收2個流份，每個流份接收200ml，其中流份1減壓濃縮，得到BW-B6A，再用制備型HPLC進行分離(色譜柱RP18柱，ODS鍵合相；流動相CH3CN/H2O，混合比例在30min內從10％線性變化到90％；流速3ml/min)，收集保留時間11.1min時的流份，減壓濃縮后得到化合物C(42mg)，收集保留時間12.9min時的流份，減壓濃縮后得到化合物F(17mg)； 70％乙醇溶液洗脫后得到的Bw-B8部分(1.409g)，進行硅膠柱層析，用氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，共接收6個流份，每個流份接收400ml，其中流份4減壓濃縮，得到化合物D(45mg)； 95％乙醇溶液洗脫后得到的Bw-B10部分(5g)，行MCI柱層析，95％乙醇-水洗脫，共接收5個流份，每個流份接收700ml，其中流份3合并后減壓濃縮，再進行硅膠柱層析，用氯仿-甲醇(200∶1)洗脫，共接收6個流份，每個流份接收250ml，其中流份3減壓濃縮，得到BW-B10C，再用硅膠柱層析，石油醚-丙酮(6∶1)洗脫，共接收10個流份，每個流份接收100ml，其中流份5減壓濃縮，得到BW-B10C5，再行MCI柱層析，95％乙醇-水洗脫，共接收4個流份，每個流份接收100ml，其中流份1減壓濃縮，得到BW-B10C5A，再用硅膠柱層析，用氯仿-甲醇(200∶1)洗脫，共接收7流份，每個流份接收50ml，其中流份3減壓濃縮，得到化合物E(85mg)。
每種化合物的特性如下。
化合物A無色油狀物。

(c，0.1；MeOH)；IRVmaxKBrcm-13399.9，2960.2，16970，1604.5，1212.0；HI-MS m/z234.1622；EI-MS m/z(％強度)234[M]+(5)，174(100)。1H NMR(500MHz，CDCl3)和13CNMR(125MHz，CDCl3)分別見表2和表3。
化合物B無色油狀物。

(c，0.1；MeOH)；IRVmaxKBrcm-13399.9 2960.2 1700.9 1604.5 1215.0；HI-MS m/z234.1609；EI-MS m/z(％強度)234[M]+(5)，174(100)。1H NMR(500MHz，CDCl3)和13CNMR(125MHz，CDCl3)分別見表2和表3。
化合物C無色油狀物。

(c，0.1；MeOH)；IRVmaxKBrcm-13353.72935.2 1606 12690 871.7 798.4；HI-MS m/z220.1457；EI-MS m/z(％強度)220[M]+(5)，177(100)。1H NMR(500MHz，CDCl3)和13CNMR(125MHz，CDCl3)分別見表2和表3。
化合物D無色油狀物。IRVmaxKBrcm-13407.7 2960.2 1689.4 1286.3777.2；HI-MS m/z2232.1463；EI-MS m/z(％強度)232[M]+(5)，190(100)。1HNMR(500 MHz，CDCl3)和13C NMR(125MHz，CDCl3)分別見表2和表3。
化合物E無色油狀物。

(c，0.1；MeOH)；IRVmaxKBrcm-12958.3 1714.4 1610.3 1282.5；HI-MS m/z248.1919；EI-MS m/z(％強度)248[M]+(5)，190(100)。1H NMR(500MHz，CDCl3)和13CNMR(125MHz，CDCl3)分別見表2和表3。
化合物F無色油狀物。IRVmaxKBrcm-13419.22958.31699.01606.41215.0831.2；HI-MS m/z234.1603；EI-MS m/z(％強度)248[M]+(5)，190(100)。1H NMR(500MHz，CDCl3)和13C NMR(125MHz，CDCl3)分別見表2和表3。
表2為化合物A、B、C、D、E、F的1H NMR(CDCl3)的數據 表3為化合物A、B、C、D、E、F的13C NMR(CDCl3)的數據 試驗實施例 試驗實施例1 抗真菌活性的測定(微量稀釋法) 取以上真菌于YNB固態(tài)培養(yǎng)基內于35℃培養(yǎng)24小時后取大于1mm直徑的5個菌落，用滅菌生理鹽水(0.85％)或者YNB溶液稀釋。調菌量為1×107cfu/ml，最終調試菌量為5×105cfu/ml。
隨后配制待測化合物樣品，先用少量DMSO(二甲基亞砜)助溶，再加一定量體積的蒸餾水或磷酸緩沖液，配制成濃度為10mg/ml或者1mg/ml的溶液。
再配制陽性對照標準樣品兩性霉素B0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液調節(jié)至pH7.0，配制樣品量濃度為1mg/ml，-20℃?zhèn)溆谩?br> 測試步驟(微量稀釋法) 96孔平底板經系列消毒及紫外線照射30min后，于每板第1孔到第10孔加入YNB培養(yǎng)液50μl，第10孔為空白對照，每一板的第四排第1孔到第10孔做陽性對照。每孔加入系列稀釋濃度的待測樣品液20μl，最終樣品液濃度為100～0.3906μg/ml，最后加入上述制備的真菌菌懸液50μl，孔內最終培養(yǎng)液為100μl，使最終菌量為5×105cfu/ml，振蕩5min，使各液充分混勻，于35℃培養(yǎng)24小時(C.neoformans為48小時)，觀測其最低抑菌濃度(MIC)。
從金粟蘭中分到的倍半萜化合物的抗真菌活性鑒定 按試驗實施例1所述的方法對化合物A，C，D，E，F抗真菌活性進行測試，測試結果如表4所示，表4為五種金粟蘭倍半萜抗真菌活性數據(最小抑菌濃度)。
表4
試驗實施例2 金粟蘭總提物和活性部位抗真菌活性的測定(WHO)標準改良的Kirby-Bauer紙片法
取上述幾株真菌24小時培養(yǎng)(35℃)后，挑取新鮮大小形態(tài)相同菌落3～5只于0.85％生理鹽水中混合，對照0.5麥氏濁光表調節(jié)菌濃度為1×107cfu/ml，15分鐘內用畢。
待測提取物1號浸膏(金粟蘭總提物) 2號浸膏(實施例2中總提物乙酸乙酯萃取部分硅膠柱層析石油醚-丙酮20∶1洗下部分) 3號浸膏(實施例2中總提物乙酸乙酯萃取部分硅膠柱層析石油醚-丙酮10∶1洗下部分) 4號浸膏(實施例2中總提物乙酸乙酯萃取部分硅膠柱層析石油醚-丙酮5∶1洗下部分) 5號浸膏(實施例2中總提物乙酸乙酯萃取部分硅膠柱層析石油醚-丙酮3∶1洗下部分) 6號浸膏(實施例2中總提物乙酸乙酯萃取部分硅膠柱層析石油醚-丙酮1∶1洗下部分) 將待測提取物用乙醇配成1mg/ml、2mg/ml和3mg/ml濃度的待測溶液。
紙片制備新華一號濾紙，用打孔機制成直徑6mm紙片，121℃高溫滅菌，60℃烘干，每片紙片吸收10μl配制好的1mg/ml、2mg/ml和3mg/ml的浸膏物，30℃以下烘干備用。
培養(yǎng)皿制備用直徑90mm大小均一的玻璃培養(yǎng)皿，各吸取備好的YNB瓊脂培養(yǎng)基25ml，厚度約4mm，冷卻干燥后用面拭子浸蘸預先配制好的菌液均勻涂于YNB培養(yǎng)基表面數次，室溫放置30分鐘，干燥后加入浸膏濃度為1mg/ml、2mg/ml和3mg/ml等紙片，35℃培養(yǎng)24小時，其中新生隱球菌(C.neoformans)培養(yǎng)48小時，陽性對照兩性霉素B為10～20μg/ml。
取出培養(yǎng)好的培養(yǎng)皿，用游標卡尺測量抑菌圈的直徑。
金粟蘭總提取物和活性部位的抗真菌活性鑒定 按試驗實施例2所述的方法對金粟蘭總提物和活性部位的抗真菌活性進行測試，測試結果如圖1和圖2所示。
結果表明，樣品濃度為2mg/ml時能表現出明顯的對兩種真菌的抑制活性，其中2、3、4號浸膏部位抑菌圈明顯，尤其4號浸膏部位(活性部位)明顯大于1、2、3、6部位，結果表明金粟蘭總提物和活性部位都具有明顯的抗真菌活性。
在此描述的實施例和實施方式僅起說明目的，本領域科技人員會明白其各種改進和變化，各種改進和變化包含在本申請及所附權利要求的主旨和范圍內。在此引述的所有出版物、專利和專利申請包含在參考文獻內。
權利要求
1.一種從金粟蘭科植物中提取的倍半萜類化合物，其具有如下化學式I所示的結構
其中
R1為氫、羧基、羥基或醛基；R2為氫、羧基、羥基或醛基；R3為氫或羥基；R4為氫、羥基或酮基；R5為異丙基；R6為甲基；
或者，C8和C9之間鍵斷開，其中R1是醛基，R2是氫，R3是羥基，R4是氫，R5為異丙基，R6為甲基；
或者，C5和C10之間鍵斷開，其中R1是氫，R2是醛基或羧基，R3是氫，R4是β-羥基、α-羥基或酮基，R5為異丙基，R6為甲基。
2.根據權利要求1所述的倍半萜類化合物，其特征在于，該化合物具體為如下結構式Ib所述的化合物，其中R1為羧基或羥基；R2為氫或羥基；R3為氫；R4為氫；R5為異丙基；R6為甲基
3.根據權利要求1所述的倍半萜類化合物，其特征在于，該化合物具體為如下結構式Ia所示的化合物，其中R1為氫；R2為醛基或羧基；R3為氫；R4為氫、α-羥基、β-羥基或酮基；R5為異丙基；R6為甲基；
4.根據權利要求1所述的倍半萜類化合物，其特征在于，該化合物為
5.一種具有抗真菌活性的藥物組合物，其特征在于，包含治療有效量的權利要求1至4中任一項所述的從金粟蘭科植物中提取的倍半萜類化合物。
6.一種具有抗真菌活性的金粟蘭科植物總提取物，其特征在于，該總提取物是通過如下步驟制得(1)用醇、水或其混合物浸漬金粟蘭科植物樣品，過濾后得到提取液，其中所述的醇為甲醇或乙醇；(2)將步驟(1)中得到的提取液通過蒸發(fā)除去溶劑，得到具有抗真菌活性的提取物。
7.根據權利要求6所述的金粟蘭科植物總提取物，其特征在于，所述的金粟蘭科植物為Sarcandra、Chloranthus或Hedyosmum屬。
8.根據權利要求7所述的金粟蘭科植物總提取物，其特征在于，所述的金粟蘭科植物為Chloranthus屬，并選自C.angustifoliu、C.oldhami、C.spicatus、C.holostegius、C.anhuiensis、C.tianmushanensis、C.henryi、C.sessilifolius、C.fortunei、C.elatior、C.japonicas、C.serratus和C.multistachys。
9.一種具有抗真菌活性的金粟蘭科植物活性部位的提取物，其特征在于，該提取物是通過如下步驟制得(a)用醇、水或其混合物浸漬金粟蘭科植物樣本，過濾后得到提取液；(b)將提取液中的溶劑蒸發(fā)形成漿狀物；(c)將該漿狀物用水溶解，得到總提取物的水混懸液；(d)用乙酸乙酯對上述混懸液進行液液萃取，得到乙酸乙酯萃取物；(e)對乙酸乙酯萃取物進行硅膠柱層析，用溶劑石油醚/丙酮按體積比100∶0、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1依次進行梯度洗脫，特定比例5∶1的有機混和溶劑洗下的流份為具有抗真菌活性的總倍半萜提取物；和(f)蒸發(fā)上述具有抗真菌活性的總倍半萜提取物至干形成具有抗真菌活性的活性部位提取物。
10.根據權利要求9所述的金粟蘭科植物活性部位的提取物，其特征在于，所述的金粟蘭科植物為Sarcandra、Chloranthus或Hedyosmum屬。
11.根據權利要求10所述的金粟蘭科植物活性部位的提取物，其特征在于，所述的金粟蘭科植物為Chloranthus屬，并選自C.angustifoliu、C.oldhami、C.spicatus、C.holostegius、C.anhuiensis、C.tianmushanensis、C.henryi、C.sessilifolius、C.fortunei、C.elatior、C.japonicas、C.serratus和C.multistachys。
12.一種權利要求1至4任一項所述的倍半萜類化合物的制備方法，該方法包括(a)用醇、水或其混合物浸漬金粟蘭科植物樣本，過濾后得到提取液；(b)將提取液中的溶劑蒸發(fā)形成漿狀物；(c)將該漿狀物用水溶解，得到總提取物的水混懸液；(d)用乙酸乙酯對上述混懸液進行液液萃取，得到乙酸乙酯萃取物；(e)對乙酸乙酯萃取物進行硅膠柱層析，用溶劑石油醚/丙酮按體積比100∶0、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1依次進行梯度洗脫，特定比例5∶1的有機混和溶劑洗下的流份為具有抗真菌活性的總倍半萜提取物；(f)蒸發(fā)上述具有抗真菌活性的總倍半萜提取物至干形成具有抗真菌活性的活性部位提取物；和(g)上述步驟(f)中得到的活性部位提取物進行硅膠柱層析，用梯度洗脫的方法分離出倍半萜類化合物。
13.根據權利要求12所述的倍半萜類化合物的制備方法，其特征在于，所述的步驟(g)具體步驟為
將步驟(f)中得到的活性部位提取物進行MCI柱層析，用體積百分比5％，10％，15％，20％，30％，40％，60％，70％，80％，95％的乙醇水溶液梯度洗脫，各濃度下的洗脫液減壓濃縮后，依次得到相應的10個部位Bw-B1～B10；
其中15％乙醇溶液洗脫后得到的Bw-B3部分進行硅膠柱層析，用體積比1∶1的石油醚-氯仿洗脫，共接收7個流份，其中流份3減壓濃縮，得到BW-B3C部位，再用制備型HPLC進行分離，色譜柱RP18柱，ODS鍵合相，流動相CH3CN/H2O，混合比例在30min內從5％線性變化到95％，流速3ml/min，收集保留時間9.6min時的流份，減壓濃縮后得到化合物A，收集保留時間10.2min時的流份，減壓濃縮后得到化合物B；
40％乙醇溶液洗脫后得到的Bw-B6部分，進行硅膠柱層析，用體積比6∶1的石油醚-丙酮洗脫，共接收2個流份，其中流份1減壓濃縮，得到BW-B6A，再用制備型HPLC進行分離，色譜柱RP18柱，ODS鍵合相，流動相CH3CN/H2O，混合比例在30min內從10％線性變化到90％，流速3ml/min，收集保留時間11.1min時的流份，減壓濃縮后得到化合物C，收集保留時間12.9min時的流份，減壓濃縮后得到化合物F；
70％乙醇溶液洗脫后得到的Bw-B8部分，進行硅膠柱層析，用體積比1∶1的氯仿-甲醇洗脫，共接收6個流份，其中流份4減壓濃縮，得到化合物D；
95％乙醇溶液洗脫后得到的Bw-B10部分進行MCI柱層析，95％乙醇-水洗脫，共接收5個流份，其中流份3減壓濃縮，再進行硅膠柱層析，用體積比200∶1的氯仿-甲醇洗脫，共接收6個流份，其中流份3減壓濃縮，得到BW-B10C；BW-B10C再用硅膠柱層析，體積比6∶1的石油醚-丙酮洗脫，共接收10個流份，其中流份5減壓濃縮，得到BW-B10C5；BW-B10C5再進行MCI柱層析，95％乙醇-水洗脫，共接收4個流份，其中流份1減壓濃縮，得到BW-B10C5A；BW-B10C5A再用硅膠柱層析，用體積比200∶1的氯仿-甲醇洗脫，共接收7流份，其中流份3減壓濃縮，得到化合物E。
14.一種權利要求1至4任一項所述的倍半萜類化合物在制備抗真菌藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物化學領域，公開了一類從金粟蘭科植物中提取的倍半萜類化合物及其組合物、提取方法和在制備抗真菌藥物中的應用，本發(fā)明還公開具有抗真菌活性的金粟蘭科植物的提取物。本發(fā)明公開的倍半萜類化合物的結構式如下式I所示。本發(fā)明的倍半萜類化合物及其組合物以及金粟蘭科植物的提取物具有抗真菌活性。
文檔編號C07C13/48GK101209952SQ20061014880
公開日2008年7月2日 申請日期2006年12月31日 優(yōu)先權日2006年12月31日
發(fā)明者陽 葉, 徐勇將, 張繼寶, 沈金貴, 李希強, 唐春萍, 柯昌強 申請人:中國科學院上海藥物研究所