專利名稱：：一種羥基苯甲酸酐二聚體類化合物、制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種具有對(duì)稱或不對(duì)稱結(jié)構(gòu)的羥基苯甲酸酐類化合物，更具體地說，涉及一種含兩個(gè)及兩個(gè)以上羥基取代的苯甲酸縮合生成的酸酐二聚體化合物或其類似物、其制備方法，及其作為高效HIV-1整合酶抑制劑，用于制備抗人乳頭瘤病毒、皰滲病毒、艾滋病毒和抗腫瘤藥物的用途。
背景技術(shù)：
：艾滋病毒(HIV)、皰瘆病毒(HSV)、人乳頭瘤病毒(HPV)都具有整合進(jìn)入人體細(xì)胞染色體的特征，但各自又有不同的遺傳和代謝特性。HIV-1是導(dǎo)致艾滋病的病毒，它編碼三種酶逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase,RT，)、蛋白酶(Protease，PR)和整合酶(Integrase,IN)。這三種酶是HIV復(fù)制和感染所必需的基本酶。目前臨床上用于治療艾滋病的藥物都是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，但這兩類藥均不能根除HIV，并出現(xiàn)了毒性、病人的并發(fā)癥和多重抗藥性等副作用，因此，具有新穎作用機(jī)制的整合酶抑制劑有望提高療效，并能與已有的抗艾滋病藥物產(chǎn)生協(xié)同作用，組成新的有效的聯(lián)合療法。HIV-1整合酶(IN)是病毒復(fù)制所必需的三大基本酶之一，逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA在整合酶的催化下插入宿主染色體內(nèi)，使之與人類染色體連成一體后，病毒便可以復(fù)制，整合酶控制HIV侵入染色體，整合酶抑制劑能夠阻止HIV侵入正常細(xì)胞的染色體?，F(xiàn)在認(rèn)為，這是抗艾滋病藥物研制領(lǐng)域的一大突破。而且HIV-1整合酶以單一的活性部位與病毒和宿主兩種不同構(gòu)象的DNA底物作用，有可能限制HIV對(duì)整合酶抑制劑藥物產(chǎn)生抗藥性；加之整合酶只存在于病毒中，哺乳動(dòng)物均無此類酶，因此HIV-1整合酶成為大有前景的抗HIV藥物設(shè)計(jì)的新型靶蛋白(Curr.Opin.Drug.Discov.Devel.2001,4,402-410)。目前許多合成的化合物具有抑制HIV-1整合酶的效果，但這些化合物或是結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，或是合成工藝復(fù)雜，或是原料來源少，生產(chǎn)成本較高。都沒有進(jìn)入巿場(chǎng)，僅在進(jìn)行I期臨床研究。人乳頭瘤病毒(HPV)與誘發(fā)多種生殖器的炎癥和癌有密切關(guān)系，如尖銳濕疣、宮頸炎和宮頸癌。尖銳濕疣又稱生殖器疣或性病疣，是由人乳頭瘤病毒(HPV)引起的皮膚黏膜良性新生物，為目前最常見的性傳播病之一。人乳頭瘤病毒(HPV)有八十多種亞型，已經(jīng)證明，其中一些高危亞型如16、18型的病毒可以整合進(jìn)入宮頸黏膜細(xì)胞的DNA中，現(xiàn)有的藥物不能將病毒殺滅，其可誘發(fā)宮頸癌。近年研究結(jié)果表明(陳富強(qiáng)等，腫瘤防治雜志，2001,8(4)342-344;徐成康，中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998,19(3):223-226),29.3%的宮頸糜爛患者呈現(xiàn)HPV陽性，而正常宮頸陽性率只為11.1%。據(jù)報(bào)道(Ahnwsetal,JCellBiochemSuppl,1997;28-29:133-139),慢性宮頸炎中高危HPV(人乳頭瘤病毒)16、18型表達(dá)率為69%，高危型HPV16、18檢出率隨宮頸糜爛程度的增加呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，顆粒型或乳突型糜爛HPV16、18檢出率與正常宮頸比較差異顯著。用PCR可測(cè)得宮頸癌中HPV16、18陽性率達(dá)83.33%,高危型HPVDNA整合到宿主細(xì)胞染色體，可產(chǎn)生E6、E7腫瘤蛋白，它們分別抑制抑癌基因p53和Rb,使細(xì)胞逃脫p53和Rb的控制，導(dǎo)致細(xì)胞周期控制失常，使通常處于靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞增生活躍、胂瘤生長(zhǎng)。若HPV16持續(xù)存在，就可使宮頸病變進(jìn)展。宮頸HPV感染與外陰感染不同，宮頸中以HPV16/18型為主，常不發(fā)生濕疣改變，而是以隱性感染長(zhǎng)期存在，先引起不典型增生，當(dāng)有其他因子參與時(shí)而導(dǎo)致癌變?，F(xiàn)在較缺乏治療尖銳濕疣、宮頸糜爛的有效藥物，一些藥物如鬼臼毒素d，優(yōu)點(diǎn)是療程短，但存在刺激性、毒副作用大的問題。具體表現(xiàn)是疼痛、水腫、糜爛等。外用藥治療尖銳濕疣的重組人干擾素cc-2p凝膠是當(dāng)前公認(rèn)有效果的藥物。但由于這些藥物不能根除整合進(jìn)入人體細(xì)胞的病毒，使感染經(jīng)久不愈，轉(zhuǎn)化為惡性腫瘤。單純皰滲病毒(HSV)是雙股DNA病毒，其經(jīng)口腔、呼吸道、生殖道粘膜和破損皮膚等多種途徑侵入機(jī)體。人感染非常普遍，感染率達(dá)80~90%,常見的臨床表現(xiàn)是粘膜或皮膚局部集聚的皰疹，偶而也可發(fā)生嚴(yán)重的全身性疾病，累及內(nèi)臟。研究表明HSV-1和HSV-2可能分別與唇癌、外陰癌及子宮頸癌有關(guān)，曾受到人們重視(孫荷等，中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2001，17(7):407-409)。目前治療藥物有皰疹凈、阿糖胞苷、阿糖腺苷、溴乙烯尿苷和無環(huán)鳥苷等，但治療時(shí)間較長(zhǎng)，需要5至7天。惡性胂瘤嚴(yán)重威脅人類健康和生命。目前臨床應(yīng)用的化療藥物毒性較大,對(duì)實(shí)體瘤效果較差，接受化療的病人絕大多數(shù)最終都死于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。因此，尋找低毒性而能抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的藥物是腫瘤化療研究的重要任務(wù)。人們一直在研究開發(fā)抗HIV、HSV和HPV病毒感染以及抗腫瘤的新藥。3，4.5-三羥基苯甲酸及其葡萄糖生成的衍生物具有抑制HIV-l整合酶的作用(KaneCJ等PlantaMed2002May;68(5):457-9)，但活性不高。CN1234353C公開了3，4,5-三羥基苯甲酸用于抗腫瘤的用途，具體來說是抗肝癌和宮頸癌方面的用途。但已知3，4,5-三羥基苯甲酸在人體環(huán)境條件下不穩(wěn)定。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一類具有高效抗病毒、抗腫瘤活性的羥基苯甲酸酐二聚體化合物，該類化合物具有抗人乳頭瘤病毒、皰瘆病毒和具有HIV-1整合酶抑制劑活性，可抗一類能夠整合進(jìn)入人體細(xì)胞染色體的病毒、能夠抑制整合進(jìn)入染色體病毒的繁殖，阻止病毒感染的復(fù)發(fā)。本發(fā)明的另一目的是提供一類羥基苯甲酸酐二聚體化合物的制備方法。本發(fā)明的再一目的是提供羥基苯甲酸酐二聚體類化合物在制備治療和預(yù)防病毒性疾病、腫瘤的藥物上的應(yīng)用。本發(fā)明基于HIV-1整合酶與其抑制劑相互作用的晶體結(jié)構(gòu)和構(gòu)效關(guān)系，由于HIV-1整合酶表現(xiàn)出以二聚或四聚體形式起催化作用(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，13040-13043)，但低聚體的精確性質(zhì)仍未知，因此，發(fā)明人從具有抗病毒活性的羥基苯甲酸類化合物出發(fā)，通過縮合生成羥基苯甲酸酐二聚體類化合物，以獲取高活性的抗病毒劑。本發(fā)明具有結(jié)構(gòu)式(I)的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物為<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中R1、R2、R3、R4、R5和R1'、R'2、R3'、R4'、R5'各獨(dú)立地選自O(shè)H或H并其中一個(gè)苯環(huán)上至少含二個(gè)OH。優(yōu)選的為，R2、R3、R4、R5和R1'、R'2、R3'、R4'、R5'中苯環(huán)上各獨(dú)立包括三個(gè)以上的OH。更優(yōu)選的為，3，3',4，4',5，5'-六羥基二苯甲酸酐、2,2'，3,3'-四羥基二苯甲酸酐或3,3',4，4'-四羥基二苯甲酸酐。具有結(jié)構(gòu)式(I)的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物是通過下列反應(yīng)制備的<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其制備過程為以各種具有不同取代位置和數(shù)量羥基(-OH)的苯甲酸為原料，原料包括但不限于對(duì)羥基苯甲酸、鄰羥基苯甲酸、2，3-二羥基苯甲酸、2,4-二羥基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸、2，3，4-三羥基苯甲酸、3，4,5-三羥基苯甲酸、2，4，5-三羥基苯甲酸。先將苯環(huán)上具有二個(gè)或二個(gè)以上羥基的羥基苯甲酸溶解于有機(jī)溶劑中，在催化劑及加熱的條件下進(jìn)行縮合反應(yīng)，然后將溶劑、雜質(zhì)去除而成。所述的有機(jī)溶劑為l，4-二氧六環(huán)、苯或甲苯，所述的催化劑為濃硫酸、對(duì)甲苯磺酸或乙酸酐和磷酸的混合物中的任意一種，優(yōu)選濃硫酸，催化劑的量為羥基苯甲酸量的0.5~20%。本發(fā)明所述加熱溫度為加熱的溫度范圍10020(TC?？梢酝ㄟ^水洛、油洛或微波進(jìn)行加熱，優(yōu)選微波加熱。本發(fā)明縮合反應(yīng)后的溶劑、雜質(zhì)去除過程為先將縮合反應(yīng)中的有機(jī)溶劑蒸干，用丙酮進(jìn)行重結(jié)晶、過濾、烘干，得提純的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物。其中重結(jié)晶、過濾均可釆用本領(lǐng)域常用的方式。采用DMSO溶解縮合產(chǎn)物，通過核磁共振測(cè)試證明產(chǎn)物為羥基苯甲酸酐二聚體類化合物。采用有效劑量的本發(fā)明羥基苯甲酸酐二聚體類化合物與藥學(xué)上可接受的載體制成藥劑?？蔀槠瑒?、膠囊、軟膠囊、散劑、顆粒劑、細(xì)粒劑、丸劑、微乳液、懸濁劑或泡騰片等口服制劑，亦可為凍干粉、注射液、栓劑、軟膏、硬膏、貼劑、噴霧劑或滴眼劑等非口服制劑。這些制劑都可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知常用的制備方法而獲得。本發(fā)明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物可用于制備預(yù)防和治療病毒性感染疾病，其中病毒性感染是指人和動(dòng)物人乳頭瘤病毒、皰滲病毒、艾滋病毒感染?？捎糜谥苽渲委熑撕蛣?dòng)物病毒性疾病藥物，特別是用于治療人和動(dòng)物人乳頭瘤病毒(HPV)、皰瘆病毒(HSV)、艾滋病毒等病毒性疾病，包括艾滋病、尖銳濕疣、單純皰瘆、陰道炎、宮頸炎及宮頸糜爛。本發(fā)明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物可用于制備預(yù)防和治療腫瘤的藥物，包括但不限于腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、人子宮內(nèi)膜癌、腎癌、胃癌細(xì)胞株、宮頸癌。本發(fā)明通過基本骨架羥基苯甲酸及其類似物與具有二個(gè)或二個(gè)以上羥基取代的羥基苯甲酸縮合成具有母核對(duì)稱結(jié)構(gòu)、苯環(huán)上具有相同或不同數(shù)目羥基取代的羥基苯甲酸酐二聚體(如結(jié)構(gòu)式(I))，經(jīng)皰滲病毒感染患者局部外用，證明具有非常顯著的抗皰瘆病毒活性，經(jīng)過對(duì)各個(gè)化合物的HIV-1整合酶抑制活性以及抗HPV、HSV和抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性等進(jìn)行測(cè)定，藥理試驗(yàn)證明其具有非常高的抗人乳頭瘤病毒和具有HIV-1整合酶抑制劑活性，其對(duì)于底物的3'端切斷和鏈轉(zhuǎn)移的半抑制濃度IC50均在88.92-10.20ing/ml范圍內(nèi)；且能有效地殺滅和抑制HPV6/11、16/18型，可用于制備治療HPV的病毒感染和的藥物，治療尖銳濕疣、陰道、宮頸炎及宮頸糜爛和輔助治療子宮頸癌。同時(shí)利用藍(lán)四唑法，檢測(cè)羥基苯甲酸酸酐二聚體類化合物對(duì)體外培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞增殖具有非常高的腫瘤細(xì)胞抑制活性。因此，本發(fā)明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物可抗一類能夠整合進(jìn)入人體細(xì)胞染色體的病毒、能夠抑制整合進(jìn)入染色體病毒的繁殖，阻止病毒感染的復(fù)發(fā)。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所采用的主要材料(含量均大于99%)及其來源材料來源2，3-二羥基苯甲酸臺(tái)州巿中大化工有限公司3，4-二羥基苯甲酸臺(tái)州巿中大化工有限公司3，4，5-三羥基苯甲酸南京龍?jiān)刺烊欢喾雍铣蓮S微波爐2M0(MHz)三洋電機(jī)(中國)有限公司實(shí)施例l3，3’，4,4’，5,5’-六羥基二苯甲酸酐取200毫升燒杯，將3，4，5-三羥基苯甲酸20克溶解在1，4-二氧六環(huán)100克中，在溶液中加入濃硫酸1克(5%)，在三洋微波爐2450(MHz)加熱至全部溶解后，再加熱3分鐘(200℃),再將1,4-二氧六環(huán)蒸干，用丙酮進(jìn)行重結(jié)晶，再進(jìn)行過濾，70℃烘干，得紅橙色狀物，產(chǎn)率96%。1HNMR(400MHz，DMSO):δ6.901(6H)，δ2.486-2.494(4H).IR(KBr，CM-1):3463.6，3059.2，2667.5，1917.4,1867.5，1828.9，1794.6，1657.6,1614.7，1542.6，1454.5，1434.8，1318.0，1265.5，1227.4，1170.1-471.2。實(shí)施例23,3'，4,4'—四羥基二苯甲酸酐取200亳升燒杯，將3，4-二羥基苯甲酸20克溶解在甲苯100克中，在溶液中加入對(duì)甲苯磺酸0.5克，在三洋微波爐2450(MHz)加熱至全部溶解后，再加熱5分鐘(150℃),然后，將甲苯蒸干，用丙酮進(jìn)行重結(jié)晶，再進(jìn)行過濾，70℃烘干，得橙色狀物，3,3，,4，4，-四羥基二苯甲酸酐，產(chǎn)率86%。'HNMR(400MHz,DMSO):δ6.756-7.321(4H)，δ2.485-2.494(2H).IR(KBr，CM-1):3546.2,3205.5,2652.6，1871.2，1845.1，1676.3,1600.8,1526.6，1466.8,1419.6，1380.0，1346.1，1298.24，1190.6，1126.9-450.9。實(shí)施例32,2'3,3'-四羥基二苯甲酸酐取200亳升燒杯，將2，3-二羥基苯甲酸20克溶解在100克苯中，在溶液中加入磷酸2克和乙酸酐2克，在三洋微波爐2450(MHz)加熱至全部溶解后，再加熱6分鐘(100℃)，然后，將苯蒸干，用丙酮進(jìn)行重結(jié)晶，再進(jìn)行過濾，70℃烘干，得橙色狀物，2，2，,3,3，-四羥基二苯甲酸酐，產(chǎn)率82%。'HNMR(400MHz，DMSO):δ6.99-7.24(4H)，δ2.49(2H).IR(KBr，CM"):IR(KBr，CM"):3377.2，3243.0，3096.5,2578.6，1916.3，1847.1,1794.7，1678.8，1656.6，1598.9，1559.8，1540.9,1474.7，1433.7,1382.37，1354.0，1301.7，1258.0,1233.46,1158.65,1070.3-419.3實(shí)施例4抗HPV病毒微乳液的制備取1，2-丙二醇30ml、吐溫8020ml、氮酮5ml混合，加滅菌蒸餾水至總體積為100ml，得外用制劑溶液。取3,3'，4,4',5,5'-六羥基二苯甲酸酐10g,加外用制劑溶液50ml，調(diào)節(jié)pH至5.5，然后加外用制劑溶液至100ml，得10%本發(fā)明的抗HPV病毒微乳液。實(shí)施例5抗HPV病毒3,3'，4，4'，5,5'六羥基二苯甲酸酐注射液的制備取3，3',4，4'，5，5'六羥基二苯甲酸酐10g、氯化鈉8.5g、1，2-丙二醇10ml、吐溫8010ml,混合后加滅菌蒸餾水使其溶解，并加滅菌蒸餾水至100ml,調(diào)節(jié)pH至7.4，濾過，灌封，在10(TC滅菌30min。即得3,3，,4,4，，5,5，六羥基二苯甲酸酐注射液。實(shí)施例6復(fù)方3,3',4，4',5，5'六羥基二苯甲酸酐泡騰片的制備取3,3，，4，4，,5,5，六羥基二苯甲酸酐0.25g、聚肌胞O.Olg、酒石酸0.45g分別過80目篩，以95%乙醇制成軟材，過12目篩制濕粒，于5(TC干燥，備用。另取碳酸氫鈉0.65g、糊精0.02g加無菌蒸餾水制軟材，過12目篩制濕粒，于5(TC干燥，然后與上述干?；旌?，整粒，加適量滅菌蒸餾水，烘片刻，加O.OlgPEG6000?；靹颍瑝浩?，即得。實(shí)驗(yàn)例1本實(shí)驗(yàn)例在于研究本發(fā)明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物的HIV-1整合酶抑制活性。一、HIV-1整合酶抑制試驗(yàn)的測(cè)試原理HIV-1整合酶的作用機(jī)制是兩步反應(yīng)1)3，端加工(3'Processing):整合酶結(jié)合前病毒DNA的長(zhǎng)末端重復(fù)區(qū)域(LTR)的特定序列形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后進(jìn)行核苷3'端的內(nèi)切核苷酸解加工，特異性地切掉序列…CAGT-3，末端的GT二核苷酸，露出凹進(jìn)的3，位羥基；2)鏈轉(zhuǎn)移(StrandTransfer):加工過的DNA/整合酶預(yù)整合復(fù)合物穿過核膜進(jìn)入核子中心，與宿主的DNA結(jié)合，然后整合酶催化病毒DNA凹進(jìn)的3'位羥基通過酯交換反應(yīng)嵌入宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)，成為成熟的前病毒。因此，整合酶抑制劑的活性表現(xiàn)在對(duì)病毒DNA的3'端切除的抑制或鏈轉(zhuǎn)移的抑制，以半抑制濃度ICs。來表征。用合成的30個(gè)寡核苷酸作供體底物，用合成的20個(gè)寡核苷酸作為靶底物，在96孔板包被供體底物加入純化的HIV-1整合酶，進(jìn)行ELISA反應(yīng)，檢測(cè)靶DNA的鏈轉(zhuǎn)移的產(chǎn)物，以生物素標(biāo)記的堿性磷酸酶系統(tǒng)顯色，酶標(biāo)儀測(cè)定0D值。在反應(yīng)體系中加入樣品可用于篩選該酶的抑制劑。二、測(cè)試材料和方法1.HIV-1整合酶中國國家新藥篩選中心和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提取并保存。2.樣品處理樣品配置濃度按表l，臨用前溶于DMSO配成適當(dāng)濃度，再作5倍稀釋，4個(gè)稀釋度。供體底物和靶底物上海生工合成。3.測(cè)試方法樣品稀釋后加入供體底物包被96孔板中，并加入含有整合酶和biotin-靶底物的反應(yīng)緩沖液中，在最佳反應(yīng)條件下孵育，以生物素標(biāo)記的堿性磷酸酶系統(tǒng)顯色，測(cè)定405nm吸收值OD值。三、測(cè)試結(jié)果見表l。表1HIV-1整合酶抑制試驗(yàn)結(jié)果<table><row><column>樣品編號(hào)</column><column>初始濃度(pg/ml)</column><column>IC50(ng/ml)</column></row><row><column>3，3'，4,4，,5,5'-六羥基二苯甲酸酐</column><column>109</column><column>10.20±3.08</column></row><row><column>3，4,5-三羥基苯甲酸</column><column>109</column><column>100.46</column></row><row><column>3，3，,4，4，-四羥基二苯甲酸酐</column><column>109</column><column>35.42±14.61</column></row><row><column>3,4-二羥基苯甲酸</column><column>109</column><column>-</column></row><row><column>2，2'，3，3'-四羥基二苯甲酸酐</column><column>109</column><column>88.92</column></row><row><column>2，3-二羥基苯甲酸</column><column>109</column><column>-</column></row><table>注表中"-"表示樣品在初始濃度抑制HIV-1IN活性的百分率小于50呢。結(jié)論體外藥物抑制HIV-1整合酶實(shí)驗(yàn)初篩結(jié)果顯示樣品3，3',4,4，,5,5'六羥基二苯甲酸酐、3,3',4,4'四羥基二苯甲酸酐和2，2，,3,3，-四羥基二苯甲酸酐抑制HIV-1整合酶的半數(shù)有效濃度(IC5o)分別為(10.20士3.08μg/ml、(35.42士14.61)μg/ml和(88.92)μg/ml。3，4，5-三羥基苯甲酸抑制HIV-1整合酶的IC50為100.46μg/ml，其它樣品抑制HIV-1整合酶活性的IC50>109μg/ml。藥理數(shù)據(jù)顯示，這類羥基苯甲酸酐二聚體類化合物具有非常高的HIV-1整合酶抑制活性，對(duì)于底物的3'端切斷和鏈轉(zhuǎn)移的半抑制濃度ICso均在88.92-10.20μg/ml范圍內(nèi)，其中最好的化合物為3,3，,4,4，,5,5，六羥基二苯甲酸酐。2，2，,3,3，-四羥基二苯甲酸酐和3，3，,4，4，-四羥基二苯甲酸酐的抑制活性高于原羥基苯甲酸的單體化合物。實(shí)驗(yàn)例2本實(shí)驗(yàn)例在于研究本發(fā)明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物抑制HPV病毒的活性。本發(fā)明通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HPV病毒的量的改變來觀察活性成分和產(chǎn)品效果，該方法已在數(shù)篇公開發(fā)表的文獻(xiàn)中應(yīng)用(蔡有齡等，中國性病艾滋病防治，2002,8:2,108;吳元?jiǎng)?、范瑞?qiáng)等，實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2003,3:2,1)。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)HPV病毒篩選藥物實(shí)驗(yàn)，按表2分組，各取樣品5克，分別加入1,2-丙二醇30毫升、吐溫80試劑20毫升，加至IOO毫升，制備成微乳液為供試樣品，生理鹽水空白對(duì)照。HPV病毒來源來自多位病人臨床標(biāo)準(zhǔn)的尖銳濕疣標(biāo)本，切取后，用生理鹽水洗去血液，在無菌條件下，將標(biāo)本剪碎，加入3倍體積生理鹽水混勻、研磨成勻漿放置-40℃?zhèn)溆?。試?yàn)方法取每種供試藥品微乳液及生理鹽水各50ul，分別加入尖銳濕疣組織勾漿50ul，37℃溫育24小時(shí)，然后按達(dá)安基因診斷中心提供的HPV6,11和16，18型FQ-PCR診斷試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)，采用常規(guī)堿裂解法提取DNA0.2ml入薄壁反應(yīng)管中，同時(shí)加入一定濃度的引物、F-PROBE、DNTP、DNA聚合酶及緩沖液等，用ABIPRISM7700熒光定量PCR擴(kuò)增儀，93℃2min予變性后，按93℃45s，55℃l20s，反復(fù)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，定量測(cè)得結(jié)果。數(shù)據(jù)見表2。表2熒光定量PCR檢測(cè)HPV病毒篩選藥物實(shí)驗(yàn)<table><row><column>管號(hào)</column><column>病毒HPV6/11(拷貝/ml)</column><column>HPV16/18(拷貝/ml)</column></row><row><column>空白對(duì)照管</column><column>1.45x106</column><column>1.40x105</column></row><row><column>3,4,5-三羥基苯甲酸</column><column>0</column><column>0</column></row><row><column>沒食子酸丙酯</column><column>0</column><column>0</column></row><row><column>3，4-二羥基苯甲酸</column><column>1.90x104</column><column>8.50x104</column></row><row><column>2,3-二羥基苯甲酸</column><column>2.30x104</column><column>3.20x103</column></row><row><column>3，3，,4，4'，5,5，六羥基二苯甲酸酐</column><column>0</column><column>0</column></row><row><column>3,3'，4，4'四羥基二苯甲酸酐</column><column>0</column><column>0</column></row><row><column>2,2，,3，3，-四羥基二苯甲酸酐</column><column>0</column><column>0</column></row><table>結(jié)果顯示尖銳濕疣的組織勻漿在加入受試化合物后24小時(shí)后，3,3，，4，4，，5，5，六羥基二苯甲酸酐、3，3',4,4'四羥基二苯甲酸酐、2，2，,3，3，-四羥基二苯甲酸酐、沒食子酸丙酯、3,4，5-三羥基苯甲酸組，F(xiàn)Q-POVR不能再檢出HPV6/11和HPV16/18病毒；3，4-二羥基苯甲酸和2，3-二羥基苯甲酸組卻具有較高濃度的HPV6/11和HPV16/18病毒量，空白組有很高的HPV6/11和HPV16/18病毒量，說明本發(fā)明的化合物在體外細(xì)胞培養(yǎng)具有能快速有效地殺滅HPV病毒的能力。結(jié)論本發(fā)明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物能有效地殺滅和抑制HPV6/11、16/18型，可用于制備治療HPV的病毒感染的藥物，治療尖銳濕疣、陰道、宮頸炎及宮頸糜爛和輔助治療子宮頸癌。本發(fā)明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物可用于制備治療人和動(dòng)物病毒性疾病藥物，特別是用于治療人和動(dòng)物人乳頭瘤病毒(HPV)、皰瘆病毒(HSV)、艾滋病等病毒性疾病，包括艾滋病、尖銳濕疣、單純皰瘆、陰道、宮頸炎及宮頸糜爛和子宮頸癌。實(shí)驗(yàn)例3臨床外用治療單純皰滲病毒(HSV)感染選經(jīng)臨床診斷單純皰麥病毒(HSV)感染者36人，隨機(jī)平均分為3組取無環(huán)鳥苷軟膏、10%沒食子酸丙酯消毒液(10g沒食子酸丙酯、20ml1，2-丙二醇、15ml吐溫80和5ml氮酮，加蒸餾水至100亳升)和實(shí)施例4所得，每曰用藥三次，外用涂抹患處。結(jié)果顯示3,3，,4,4，，5，5，-六羥基二苯甲酸酐微乳液組平均痊愈天數(shù)為2天，而沒食子酸丙酯消毒液組平均痊愈天數(shù)為3天、無環(huán)鳥苷軟膏組平均痊愈天數(shù)為5.5天，3，3，,4,4，，5，5，-六羥基二苯甲酸酐微乳液組與另外兩組比較有顯著差異。3，3，，4，4，,5，5，-六羥基二苯甲酸酐組效果優(yōu)于無環(huán)鳥苷軟膏組和沒食子酸丙酯組。實(shí)驗(yàn)例4本實(shí)驗(yàn)例在于研究本發(fā)明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制的活性。本發(fā)明利用藍(lán)四氮唑法，檢測(cè)羥基苯甲酸酐二聚體類化合物對(duì)體外培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。一、材料1.腫瘤細(xì)胞株人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(U251),人結(jié)腸癌細(xì)胞株(LOVO)，人肝癌細(xì)胞株(HepG2)，人肺癌細(xì)胞株(PC84045),人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株(JEC),人腎癌細(xì)胞株(GRC)，人胃癌細(xì)胞株(MCG804),人宮頸癌細(xì)胞株(HeLa),人肝癌細(xì)胞株(BEL-7402)、人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304)均購自中山醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，由本室保存。2.主要儀器和試劑C02濕化孵箱Sheldon公司；超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備廠；酶標(biāo)儀Biored公司；胰蛋白酶(Trypsin):Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)液Gibco公司；96孔培養(yǎng)板，Coming公司；新生牛血清杭州四季清公司。二、方法1.細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞系按常規(guī)方法培養(yǎng)于含15%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置37C含5%0)2濕化孵箱內(nèi)培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察生長(zhǎng)情況。約3-5天傳代一次，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定細(xì)胞活力，細(xì)胞活力>95%用于正式實(shí)驗(yàn)。2.嚷唑鹽(MTT)比色法該方法是一種細(xì)胞活力的檢測(cè)方法，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可使外源的MTT(2.5-二苯基四氮唑溴鹽，又稱P塞唑鹽)，還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物，并沉淀于細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能，可用二甲基亞砜(DMSO)異丙醇或10%酸化SDS(十二烷基硫酸鈉)將顆粒溶解，用酶標(biāo)儀在A570波長(zhǎng)處測(cè)OD值，可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，該法用于細(xì)胞因子生物活性檢測(cè)，抗腫瘤藥物及腫瘤放射敏感性及細(xì)胞毒試驗(yàn)的測(cè)定，特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，無需采用放射性核素。目前已廣泛用于臨床前抗癌藥物篩選及新鮮腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性檢測(cè)。方法如下(1)用0.25%胰蛋白酶消化法制備的腫瘤細(xì)胞懸液，用10%小牛血清的RPMI1640整細(xì)胞濃度為105/ml,于96孔板中每孔加100ul，培養(yǎng)24小時(shí)后加不同劑量藥物100ul/孔，設(shè)陰性對(duì)照組，陽性對(duì)照組和調(diào)零孔，每組4個(gè)平行孔。(2)37。C5呢C02繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，實(shí)驗(yàn)終止前，每孔加入MTT溶液(5g/L)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)A570nm的OD值，以不加藥的陰性對(duì)照組A570的OD值均數(shù)作為對(duì)照，按下式計(jì)算細(xì)胞存活率及藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage16</formula>細(xì)胞抑制率(％)=(1-試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)x100%用細(xì)胞存活率對(duì)劑量對(duì)數(shù)作圖，并按作圖法求出IQo值。具體的實(shí)驗(yàn)方法如下配液將化合物分別用代號(hào)進(jìn)行標(biāo)記，PBS溶解每種化合物，細(xì)菌過濾器除去細(xì)菌，每種化合物配成l(T3g/ml,10—4g/ml,10—5g/ml,保存在4。C待用。MTT法取培養(yǎng)4-5天，處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)一瓶，加入適量Trypsin-EDTA液，使貼壁細(xì)胞脫落，用10ml含15%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成懸液；用臺(tái)盼藍(lán)染色后再血球計(jì)數(shù)板上做細(xì)胞計(jì)數(shù)，使活細(xì)胞在97%以上；用完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液配成每100ml含5000~400000個(gè)細(xì)胞；用96孔平板，每孔加細(xì)胞懸液200ul。將96孔板置于37°C,5%C02溫箱24小時(shí)；受試化合物作3個(gè)稀釋度，每種濃度平行五個(gè)孔；同時(shí)設(shè)無血清RPMI1640為對(duì)照組。將96孔板在37。C,5%032及100%濕度的溫箱中孵育3天；MTT用無血清RPMI1640培養(yǎng)液配成lmg/ml溶液，每孔加50ul,37。C溫育4小時(shí)，使MTT還原成甲臜(Formazan);吸出上清液，加入200ulDMSO使甲臜溶解，用平板搖床振蕩5分鐘搖勻；用酶標(biāo)儀計(jì)測(cè)量吸光值，測(cè)量波長(zhǎng)570nm,參比波長(zhǎng)630nm處測(cè)定每個(gè)小孔的吸光度值，所獲數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)算細(xì)胞的抑制率。抑制率％=(1-樣品組吸光度平均值/溶劑組吸光度平均值)xlOO%結(jié)果判斷抑制率〉50%為敏感；30%~50%為中度敏感；<30%為不敏感三.結(jié)果與分析表3化合物體外對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制<table>complextableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>結(jié)果顯示在加入受試化合物后3天后，2,2，,3,3，-四羥基二苯甲酸酐對(duì)各種腫瘤細(xì)胞都有明顯抑制、但同時(shí)對(duì)正常的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304)有抑制；3,3，,4,4，,5,5，六羥基二苯甲酸酐對(duì)各種腫瘤細(xì)胞也都有不同的抑制率，人肺癌細(xì)胞株(PC84045)，人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株(JEC)，人腎癌細(xì)胞株(GRC),人宮頸癌細(xì)胞株(HeLa)，人肝癌細(xì)胞株(BEL-7402)的抑制較明顯，而對(duì)正常的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304)沒有抑制，另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3，4，5-三羥基苯甲酸組在濃度為10—3g/ml、10—4g/ml時(shí)，對(duì)正常的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304)有抑制，分別為80.22和42.81。因此，3，3，，4，4，,5，5，六羥基二苯甲酸酐比其單體3,4,5-三羥基苯甲酸組的副作用要低。3,3，,4,4，四羥基二苯甲酸酐對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制，效果低于3，3，,4,4，，5,5，六羥基二苯甲酸酐。說明本發(fā)明多羥基取代的化合物抑制腫瘤細(xì)胞的效果較好。而效果最明顯的是2，2'，3,3，-四羥基二苯甲酸酐。因此，本發(fā)明的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物或含有該化合物的組合物作為活性成分的有效劑量，可用于制備治療人和動(dòng)物腫瘤的藥物，這類羥基苯甲酸酸酐二聚體類化合物具有非常高的腫瘤細(xì)胞抑制活性。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。權(quán)利要求1.具有結(jié)構(gòu)式(I)的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物，id="icf0001"file="A2006101611790002C1.gif"wi="121"he="42"top="39"left="42"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中R1、R2、R3、R4、R5和R’1、R’2、R’3、R’4、R’5各獨(dú)立地選自O(shè)H或H，并其中一個(gè)苯環(huán)上至少含二個(gè)OH。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物，其特征在于苯環(huán)上各獨(dú)立包括三個(gè)以上的OH。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物，其特征在于化合物為3，3，，4，4，，5,5'-六羥基二苯甲酸酐、3，3，,4，4,-四羥基二苯甲酸酐或2,2',3,3'-四羥基二苯甲酸酐。4.一種制備權(quán)利要求l-3任意一項(xiàng)所述的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物的方法，其特征在于，包括如下步驟先將苯環(huán)上具有二個(gè)或二個(gè)以上羥基的羥基苯甲酸溶解于有機(jī)溶劑中，在催化劑及加熱的條件下進(jìn)行縮合反應(yīng)，然后將溶劑、雜質(zhì)去除而成。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述羥基苯甲酸酐二聚體類化合物的制備方法，其特征在于，所述的有機(jī)溶劑為l,4-二氧六環(huán)、苯或甲苯，所述的催化劑為濃硫酸、對(duì)甲苯磺酸或乙酸酐和磷酸的混合物中的任意一種，催化劑的量為羥基苯甲酸量的0.5~20%,所述加熱溫度為10020(TC。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述羥基苯甲酸酐二聚體類化合物的制備方法，其特征在于，所述的催化劑為濃硫酸。7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任意一項(xiàng)中所述羥基苯甲酸酐二聚體類化合物的制備方法，其特征在于，所述溶劑、雜質(zhì)去除過程為先將縮合反應(yīng)中的有機(jī)溶劑蒸干，用丙酮進(jìn)行重結(jié)晶，過濾、烘干，得提純的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物。8.根據(jù)權(quán)利要求l-3任意一項(xiàng)所述的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物在制備預(yù)防和治療病毒性感染疾病的藥物中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物的應(yīng)用，其特征在于，所述病毒性感染為人或動(dòng)物人乳頭瘤病毒、皰瘆病毒、艾滋病毒感染，特別是用于治療人和動(dòng)物人乳頭瘤病毒、皰瘆病毒、艾滋病的病毒性疾病，包括艾滋病、尖銳濕疣、單純皰疹、陰道炎、宮頸炎及宮頸糜爛。10.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的羥基苯甲酸酐二聚體類化合物在制備預(yù)防和治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用，所述的腫瘤為腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、人子宮內(nèi)膜癌、腎癌、胃癌、宮頸癌。全文摘要本發(fā)明提供了一類具有結(jié)構(gòu)式(I)的對(duì)稱或不對(duì)稱結(jié)構(gòu)的羥基苯甲酸酐二聚體化合物、制備方法和用途。該類化合物通過基本骨架羥基苯甲酸及其類似物與具有相同或不同羥基取代的羥基苯甲酸縮合成具有母核對(duì)稱結(jié)構(gòu)、苯環(huán)上具有相同或不同數(shù)目羥基取代的羥基苯甲酸酐二聚體，藥理試驗(yàn)證明它具有抗人乳頭瘤病毒、皰疹病毒和具有HIV-1整合酶抑制劑活性，可抗一類能夠整合進(jìn)入人體細(xì)胞染色體的病毒、能夠抑制整合進(jìn)入染色體病毒的繁殖，阻止病毒感染的復(fù)發(fā)，同時(shí)具有抗腫瘤活性。文檔編號(hào)C07C65/00GK101200426SQ200610161179公開日2008年6月18日申請(qǐng)日期2006年12月11日優(yōu)先權(quán)日2006年12月11日發(fā)明者李健誠,秦衛(wèi)華,黃海蓮申請(qǐng)人:盛華(廣州)醫(yī)藥科技有限公司