專利名稱：氨轉(zhuǎn)運蛋白基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氨轉(zhuǎn)運蛋白(Ammonia transporter)基因及其用途，特別涉及氨同化作用良好的釀造酵母、使用該酵母制造的酒精飲料以及所述酒精飲料的制造方法等。更具體地說，本發(fā)明涉及編碼釀造酵母的氨轉(zhuǎn)運蛋白Mep1的基因MEP1，特別涉及通過控制啤酒酵母的特征基因nonScMEP1或基因ScMEP1的表達量從而控制氨同化能力的酵母，以及使用該酵母的酒精飲料的制造方法等。
背景技術(shù)：
已知氨、氨基酸是酵母增殖所必需的氮源，在釀造過程中原料中含有的氨、氨基酸也作為酵母增殖的氮源而被同化。
一般認為氨基酸是酒精飲料的重要呈味成分，是影響產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素。因此，結(jié)合目標酒精飲料的質(zhì)量對氨基酸的量進行控制對于新型酒精飲料的開發(fā)很重要。例如，通過增加酒精飲料的氨基酸含量能夠使酒味香醇。
但是，如上所述，在發(fā)酵過程中氨基酸與氨被酵母作為氮源同化，因此，控制發(fā)酵結(jié)束時的氨基酸的含量極其困難。
酵母要將細胞外的氨基酸、氨作為氮源利用時必須將氨基酸、氨轉(zhuǎn)運到菌體內(nèi)，并且已證明酵母細胞膜內(nèi)存在的氨轉(zhuǎn)運蛋白、氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白參與這種氨基酸、氨的轉(zhuǎn)運。
已知酵母的氨轉(zhuǎn)運蛋白有底物親和性不同的3種轉(zhuǎn)運蛋白(Mep1，Mep2，Mep3)(Mol Cell Biol174282-93，1997)，氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白有底物特異性低的Cap1、底物特異性不同的大量的其它氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白(精氨酸轉(zhuǎn)運蛋白Can1、脯氨酸轉(zhuǎn)運蛋白Put4等)(Curr Genet36317-28，1999)。
到目前為止，為了控制酒精飲料中氨基酸含量，已報導有使用其中參與氨基酸轉(zhuǎn)運的基因(gap1，shr3，can1，put4，uga4)發(fā)生突變的酵母變種的例子(日本國特開2001-321159號公報)。

發(fā)明內(nèi)容
在上述狀況下，在酒精飲料制造過程中為了控制氨基酸的含量，期望有氨基酸的同化得到控制的酵母。但是，為了控制酒精飲料中殘存的氨基酸量，必須控制氨基酸以外的其它氮源的同化。因此，期望有氨的同化得到控制，從而氨基酸的同化得到控制的酵母。
本發(fā)明人為了解決上述課題進行了積極研究，結(jié)果從啤酒酵母中成功鑒定、分離出編碼氨轉(zhuǎn)運蛋白的基因，并且已經(jīng)制備出了用所得基因(用于表達)轉(zhuǎn)化的酵母，同時確認了該酵母會促進氨同化，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及啤酒酵母中存在的氨轉(zhuǎn)運蛋白基因、該基因編碼的蛋白質(zhì)、該基因的表達受到調(diào)控的轉(zhuǎn)化酵母、使用該基因表達受到調(diào)控的酵母制造酒精飲料的方法等。具體來說，本發(fā)明提供下述所示的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、導入該載體的轉(zhuǎn)化酵母、使用該轉(zhuǎn)化酵母制造酒精飲料的方法等。
(1)多核苷酸，其選自由下述(a)～(f)組成的群組(a)多核苷酸，其含有具有序列號1的堿基序列的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有序列號2的氨基酸序列；(c)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有在序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個或多個氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；(d)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；(e)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該多核苷酸在嚴格條件下，與具有與序列號1的堿基序列互補的堿基序列的多核苷酸進行雜交，且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)；以及(f)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該多核苷酸在嚴格條件下，與具有與編碼具有序列號2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列互補的堿基序列的多核苷酸進行雜交，且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)。
(2)如上述(1)所述的多核苷酸，其選自下述(g)～(i)組成的群組(g)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有序列號2的氨基酸序列或具有在序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10個氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；(h)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；以及(i)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該多核苷酸在高嚴格條件下，與具有序列號1的堿基序列的多核苷酸進行雜交或與具有與序列號1的堿基序列互補的堿基序列的多核苷酸進行雜交，且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)。
(3)如上述(1)所述的多核苷酸，其含有具有序列號1的堿基序列的多核苷酸。
(4)如上述(1)所述的多核苷酸，其含有編碼具有序列號2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
(5)如上述(1)～(4)中任一項所述的多核苷酸，其為DNA。
(6)蛋白質(zhì)，其為由上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。
(7)載體，其含有上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸。
(7a)上述(7)所述的載體，其包括表達盒，該表達盒包括下述構(gòu)成要素(x)～(z)(x)在酵母細胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動子；(y)上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸，其連接在該啟動子的正義方向或反義方向；以及(z)涉及RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷化作用，并在酵母內(nèi)起作用的信號。
(8)載體，其含有下述(j)～(l)中任一項多核苷酸，(j)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有序列號4的氨基酸序列或具有在序列號4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10個氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；
(k)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；以及(1)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該多核苷酸在高嚴格條件下，與具有序列號3的堿基序列的多核苷酸進行雜交或與具有與序列號3的堿基序列互補的堿基序列的多核苷酸進行雜交，且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)。
(9)多核苷酸，其選自下述(m)～(q)組成的群組(m)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA具有與上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的堿基序列；(n)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA通過RNAi效應抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表達；(o)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA對上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有特異切割的活性；(p)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA通過共抑制效應抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表達；以及，(q)多核苷酸，其編碼具有與下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的堿基序列的RNA；多核苷酸，其編碼通過RNAi效應抑制下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)表達的RNA；多核苷酸，其編碼對下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有特異切割活性的RNA；或多核苷酸，其編碼通過共抑制效應抑制下述(q1)、(q2)、或(q3)所述的多核苷酸(DNA)表達的RNA；(q1)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有序列號4的氨基酸序列或具有在序列號4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10個氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；(q2)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；以及(q3)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該多核苷酸在高嚴格條件下，與具有序列號3的堿基序列的多核苷酸進行雜交或與具有與序列號3的堿基序列互補的堿基序列的多核苷酸進行雜交，且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)。
(10)載體，其含有上述(9)所述的多核苷酸。
(11)酵母，其為導入了上述(7)、(7a)、(8)或(10)所述的載體的酵母。
(12)如上述(11)所述的酵母，其中，通過導入上述(7)、(7a)或(8)所述的載體，氨同化能力增強。
(13)酵母，其為通過下述(A)、(B)或(C)方式使選自上述(5)所述的多核苷酸(DNA)和下述(q1)～(q3)的多核苷酸的表達受到抑制的酵母(A)通過導入上述(10)所述的載體；(B)通過破壞下述多核苷酸(DNA)的基因，即，上述(5)所述的多核苷酸(DNA)；(q1)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有序列號4的氨基酸序列或具有在序列號4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10個氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；(q2)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；或(q3)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該多核苷酸在高嚴格條件下，與具有序列號3的堿基序列的多核苷酸進行雜交或與具有與序列號3的堿基序列互補的堿基序列的多核苷酸進行雜交，且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)；或(C)通過使啟動子突變或通過重組啟動子。
(14)如上述(12)所述的酵母，其中，通過增加上述(6)所述的蛋白質(zhì)的表達量，氨同化能力得到增強。
(15)酒精飲料的制造方法，其使用上述(11)～(14)中任一項所述的酵母。
(16)如上述(15)所述的酒精飲料的制造方法，其中，釀造的酒精飲料是麥芽飲料。
(17)如上述(15)所述的酒精飲料的制造方法，其中，釀造的酒精飲料是葡萄酒。
(18)酒精飲料，其為采用上述(15)～(17)中任一項所述的方法制造的酒精飲料。
(19)評價被檢酵母的氨同化能力的方法，其包括使用根據(jù)具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的基因的堿基序列設(shè)計的引物或探針。
(19a)利用上述(19)所述的方法，選擇氨同化能力得到增強的酵母的方法。
(19b)利用上述(19a)所述的方法選擇的酵母制造酒精飲料(如啤酒)的方法。
(20)評價被檢酵母的氨同化能力的方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母；測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的基因的表達量。
(20a)選擇氨同化能力增強或降低的酵母的方法，其包括利用上述(20)所述的方法評價被檢酵母，選擇編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的基因的表達量高或低的酵母。
(20b)利用上述(20a)所述方法選擇的酵母制造酒精飲料(如啤酒)的方法。
(21)酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母；對上述(6)所述的蛋白質(zhì)進行定量或測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的基因的表達量；以及選擇其中所述蛋白質(zhì)的生成量或所述基因表達量與目標氨同化能力相應的被檢酵母。
(21a)酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母；測定氨同化能力或氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；選擇具有目標氨同化能力的被檢酵母。
(22)如上述(21)所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標準酵母和被檢酵母；測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的基因在各酵母中的表達量；以及選擇基因表達高于或低于標準酵母的被檢酵母。
(23)如上述(21)所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標準酵母和被檢酵母；對各酵母中的上述(6)所述的蛋白質(zhì)進行定量；以及選擇蛋白質(zhì)的量多于或低于標準酵母的被檢酵母。
(24)酒精飲料的制造方法，其包括使用上述(11)～(14)任一所述的酵母或使用根據(jù)上述(21)～(23)所述的方法所選擇的酵母中的任一種酵母，進行制造酒精飲料的發(fā)酵，以及調(diào)節(jié)氨及氨基酸的含量。
根據(jù)本發(fā)明的使用轉(zhuǎn)化酵母的酒精飲料的制造方法，氨同化得到控制、氨基酸同化得到控制，所以能夠控制酒中氨基酸含量，可以制造味道得到調(diào)節(jié)的酒精飲料。


圖1表示啤酒釀造試驗中酵母增殖量的經(jīng)時變化，橫軸表示發(fā)酵時間，縱軸表示在660nm處的光密度值(OD660)。
圖2表示啤酒釀造試驗中浸出物(糖)消耗量的經(jīng)時變化，橫軸表示發(fā)酵時間，縱軸表示表觀浸出物濃度(W/W％)。
圖3表示啤酒釀造試驗中的酵母中nonScMEP1基因的表達行為，橫軸表示發(fā)酵時間，縱軸表示檢出的信號強度。
圖4表示啤酒釀造試驗中酵母增殖量的經(jīng)時變化，橫軸表示發(fā)酵時間，縱軸表示在660nm處的光密度值(OD660)。
圖5表示啤酒釀造試驗中浸出物(糖)消耗量的經(jīng)時變化，橫軸表示發(fā)酵時間，縱軸表示表觀浸出物濃度(W/W％)。
圖6表示啤酒釀造試驗中氨濃度的經(jīng)時變化，橫軸表示發(fā)酵時間，縱軸表示氨濃度(mg/L)。
圖7表示啤酒釀造試驗中游離氨基氮(FAN)濃度的經(jīng)時變化，橫軸表示發(fā)酵時間，縱軸表示游離氨基氮(FAN)的濃度(mg/100ml)。
圖8表示啤酒釀造試驗中的酵母中ScMEP1基因的表達行為，橫軸表示發(fā)酵時間，縱軸表示檢出的信號強度。
圖9表示啤酒釀造試驗中酵母增殖量的經(jīng)時變化，橫軸表示發(fā)酵時間，縱軸表示在660nm處的光密度值(OD660)。
圖10表示啤酒釀造試驗中浸出物(糖)消耗量的經(jīng)時變化，橫軸表示發(fā)酵時間，縱軸表示表觀浸出物濃度(W/W％)。
圖11表示啤酒釀造試驗中氨濃度的經(jīng)時變化，橫軸表示發(fā)酵時間，縱軸表示氨濃度(mg/L)。
圖12表示啤酒釀造試驗中游離氨基氮(FAN)濃度的經(jīng)時變化，橫軸表示發(fā)酵時間，縱軸表示游離氨基氮(FAN)的濃度(mg/100ml)。
具體實施例方式
本發(fā)明人認為，增大酵母的氨轉(zhuǎn)運蛋白的活性，可以進一步高效同化氨。本發(fā)明人在這種構(gòu)思基礎(chǔ)上反復研究，根據(jù)日本國特開2004-283169公開的方法中解讀的啤酒酵母基因組的信息，分離、鑒定出啤酒酵母特有的編碼氨轉(zhuǎn)運蛋白的non-ScMEP1基因。該基因的堿基序列用序列號1表示，此外由該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列用序列號2表示。
進而，本發(fā)明人分離、鑒定出了ScMEP1基因，其堿基序列用序列號3表示，由該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列用序列號4表示。
1.本發(fā)明的多核苷酸首先，本發(fā)明提供(a)多核苷酸，其含有具有序列號1或序列號3的堿基序列的多核苷酸；以及(b)多核苷酸，其含有編碼具有序列號2或序列號4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。
作為本發(fā)明對象的多核苷酸，并不限定于編碼上述來源于啤酒酵母的氨轉(zhuǎn)運蛋白的多核苷酸，而且還包括編碼與該蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)的其他多核苷酸。作為具有同等功能的蛋白質(zhì)，其包括例如(c)蛋白質(zhì)，其具有在序列號2或序列號4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個或多個氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性。
此類蛋白質(zhì)包括具有在序列號2或序列號4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1～100個、1～90個、1～80個、1～70個、1～60個、1～50個、1～40個、1～39個、1～38個、1～37個、1～36個、1～35個、1～34個、1～33個、1～32個、1～31個、1～30個、1～29個、1～28個、1～27個、1～26個、1～25個、1～24個、1～23個、1～22個、1～21個、1～20個、1～19個、1～18個、1～17個、1～16個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個(1～數(shù)個)、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、或1個氨基酸殘基后的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)。上述缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸殘基的個數(shù)，一般優(yōu)選小的數(shù)目。并且此類蛋白質(zhì)還包括(d)蛋白質(zhì)，其具有與序列號2或序列號4的氨基酸序列有約60％或以上、約70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上的同一性的氨基酸序列、且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性。上述同源性的數(shù)值一般優(yōu)選大的數(shù)值。
氨轉(zhuǎn)運蛋白的活性，例如可根據(jù)Mol Cell Biol 174282-93，1997上記載的方法進行測定。
本發(fā)明還包括(e)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該含有的多核苷酸在嚴格條件下，與具有與序列號1或序列號3的堿基序列互補的堿基序列的多核苷酸進行雜交，且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)；以及(f)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該含有的多核苷酸在嚴格條件下，與具有與編碼序列號2或序列號4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列互補的堿基序列的多核苷酸進行雜交，且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)。
這里所述的“嚴格條件下進行雜交的多核苷酸”，是指將具有與序列號1或序列號3的堿基序列互補的堿基序列的多核苷酸的全部或一部分、或?qū)⒕幋a序列號2或序列號4的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分作為探針，使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法、southern雜交法等得到的多核苷酸，例如DNA。雜交方法可以利用如Molecular Cloning 3rd Ed.，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley&Sons 1987-1997等所述的方法。
本文所述的“嚴格條件”，可以為低嚴格條件、中嚴格條件、高嚴格條件中的任一種?！暗蛧栏駰l件”，如為5×SSC、5×Dendardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的條件；此外，“中嚴格條件”，如為5×SSC、5×Dendardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的條件；“高嚴格條件”，如為5×SSC、5×Dendardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的條件。在這些條件中，認為溫度越高越能有效得到同源性高的多核苷酸(例如DNA)。當然，一般認為影響雜交的嚴格度的因素有溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等多個因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過適當選擇這些要素實現(xiàn)相似的嚴格度。
使用市售的試劑盒進行雜交時，如可以使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制造)。這種情況下，可按照試劑盒中附帶的說明書，與標記探針過夜溫育后，在55℃的條件下用含有0.1％(w/v)SDS的首次洗滌緩沖液將膜洗滌后，由此檢測被雜交的多核苷酸(如DNA)。
除此之外，可被雜交的多核苷酸還包括，，與編碼序列號2或序列號4的氨基酸序列的多核苷酸具有約60％或以上、約70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸，上述同一性是通過例如FASTA、BLAST等同源性搜索軟件，利用默認參數(shù)所計算得。
氨基酸序列、堿基序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873，1993)來確定。以BLAST算法為基礎(chǔ)的稱為BLASTN、BLASTX的程序也已開發(fā)出來(Altschul SF，etalJ Mol Biol215403，1990)。使用BLASTN分析堿基序列時，如使參數(shù)為score＝100、wordlength＝12；此外使用BLASTX分析氨基酸序列時，如使參數(shù)為score＝50、wordlength＝3；使用BLAST和Gapped BLAST程序時，采用各程序的系統(tǒng)設(shè)定默認參數(shù)值。
本發(fā)明的多核苷酸還包括下述多核苷酸，即，(m)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA具有與上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的堿基序列；(n)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA通過RNAi效應抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表達；(o)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA對上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有特異切割的活性；(p)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA通過共抑制效應抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表達；以及(q)多核苷酸，其編碼具有與下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的堿基序列的RNA；多核苷酸，其編碼通過RNAi效應抑制下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)表達的RNA；多核苷酸，其編碼對下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有特異切割活性的RNA；或多核苷酸，其編碼通過共抑制效應抑制下述(q1)、(q2)、或(q3)所述的多核苷酸(DNA)表達的RNA，其中，(q1)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有序列號4的氨基酸序列或具有在序列號4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10個氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；(q2)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；以及(q3)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該多核苷酸在高嚴格條件下，與具有序列號3的堿基序列的多核苷酸進行雜交或與具有與序列號3的堿基序列互補的堿基序列的多核苷酸進行雜交，且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)。將這些多核苷酸整合到載體內(nèi)，進而在導入該載體的轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)能夠抑制上述(a)～(1)的多核苷酸(DNA)的表達。因此，這些多核苷酸能夠期望在抑制上述多核苷酸(DNA)表達時優(yōu)選使用。
本文中所述的“編碼具有與DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的堿基序列的RNA的多核苷酸”，指的是反義DNA。反義技術(shù)是公知的抑制特定內(nèi)源基因表達的方法，在各種文獻中都有記載(如參照平島及井上新生化學實驗講座2核酸IV基因的復制和表達(日本生化學會編，東京化學同人)pp.319-347，1993等)(平島および井上新生化學実験講座2核酸IV遺伝子の複製と発現(xiàn)(日本生化學會編，東京化學同人)pp.319-347，1993)。反義DNA的序列，優(yōu)選為與內(nèi)源基因的全部或其中的一部分互補的序列，但只要能夠有效抑制基因表達，不完全互補也可以。被轉(zhuǎn)錄的RNA，優(yōu)選其與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有90％或以上的互補性，更優(yōu)選有95％或以上的互補性。反義DNA的長度至少為15個堿基以上，優(yōu)選為100個堿基以上，更優(yōu)選為500個堿基以上。
本文中所述的“編碼通過RNAi效應抑制DNA表達的RNA的多核苷酸”，指的是通過RNA interference(RNAi)來抑制內(nèi)源基因表達的多核苷酸?！癛NAi”是指將具有與靶基因序列相同或類似的序列的雙鏈RNA導入細胞內(nèi)，導入的外源基因及內(nèi)源靶基因的表達均被抑制的現(xiàn)象。這里使用的RNA，例如可以為21～25堿基長的產(chǎn)生RNA干擾的雙鏈RNA，如dsRNA(doublestrand RNA)、siRNA(small interfering RNA)或shRNA(short hairpin RNA)。此類RNA可以通過脂質(zhì)體等輸送系統(tǒng)局部輸送到所需的部位，并且使用可生成上述雙鏈RNA的載體使其局部表達。這種雙鏈RNA(dsRNA、siRNA或shRNA)的制備方法、使用方法等，在多種文獻中是公知的(參照日本國特表2002-516062號公報；US2002/086356A；Nature Genetics，24(2)，180-183，2000 Feb.；Genesis，26(4)，240-244，2000April；Nature，4076802，319-20，2002Sep.21；Genes&Dev.，Vol.16，(8)，948-958，2002Apr.15；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99(8)，5515-5520，2002Apr.16；Science，296(5567)，550-553，2002Apr.19；Proc Natl.Acad.Sci.USA，999，6047-6052，2002Apr.30；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，497-500，2002May；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，500-505，2002May；NucleicAcids Res.，3010，e46，2002 May15等)。
本文中所述的“編碼對DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有特異切割活性的RNA的多核苷酸”，一般是指核酶(Ribozyme)。核酶是指具有催化活性的RNA分子，其通過切割靶DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物來阻斷其基因功能。關(guān)于核酶的設(shè)計可以參照各種公知文獻(如參照FEBS Lett.228228，1988；FEBS Lett.239285，1988；Nucl.Acids.Res.177059，1989；Nature323349，1986；Nuel.Acids.Res.196751，1991；Protein Eng3733，1990；Nucl.Acids Res.193875，1991；Nucl.Acids Res.195125，1991；Biochem Biophys Res Commun1861271，1992等)。此外，“編碼通過共抑制效應抑制DNA表達的RNA的多核苷酸”，是指通過“共抑制”來阻斷靶DNA功能的核苷酸。
本文中所述的“共抑制”，是指通過轉(zhuǎn)化作用在細胞中導入具有與內(nèi)源靶基因相同或類似序列的基因，導入的外源基因和內(nèi)源靶基因的表達均被抑制的現(xiàn)象。具有共抑制效應的多核苷酸的設(shè)計也可以參照各種公知文獻(例如參照Smyth DRCurr.Biol.7R793，1997；Martienssen RCurr.Biol.6810，1996等)。
2.本發(fā)明的蛋白質(zhì)本發(fā)明還提供由上述(a)～(e)中任一種多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)選蛋白質(zhì)包括具有在序列號2或序列號4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個或多個氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)。
此類蛋白質(zhì)包括具有在序列號2或序列號4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加上述數(shù)量的氨基酸殘基后的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)。此外，此類蛋白質(zhì)還包括具有與序列號2或序列號4的氨基酸序列有上述同源性的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)。
此類蛋白質(zhì)可通過使用《Molecular Cloning3》、《Current ProtocolsinMolecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，106487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，796409(1982)”、“Gene，34315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，134431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488(1985)”等記載的定點誘變法獲得。
本發(fā)明所述的在蛋白質(zhì)的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個或以上的氨基酸殘基，是指在同一序列中的任意1個或多個氨基酸序列中的位置上缺失、取代、插入及/或添加1個或多個氨基酸殘基，并且缺失、取代、插入及添加中的2種以上可同時發(fā)生。
下面列舉可互相取代的氨基酸殘基，同一組中包含的氨基酸殘基可互相取代，所述組如下所示。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯丙氨酸、酪氨酸。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化學合成法制造，并且也可以利用Advanced ChemTech公司、PerkinElmer公司、Pharmacia公司、Protein Technology Installment公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、Shimazu公司等制造的肽合成儀進行化學合成。
3.本發(fā)明的載體及導入該載體的轉(zhuǎn)化酵母本發(fā)明提供含有上述多核苷酸的載體。本發(fā)明的載體含有上述(a)～(q)中所述的任一多核苷酸(DNA)。并且，構(gòu)成的本發(fā)明的載體通常包括表達盒，該表達盒包括的組成要素為(x)在酵母細胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動子，(y)上述(a)～(q)任一項所述的多核苷酸(DNA)，其與該啟動子以正義方向或反義方向連接，以及(z)涉及RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷化作用，并在酵母內(nèi)起作用的信號。在本發(fā)明中，在下述酒精飲料(例如啤酒)的釀造過程中，要使上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)進行高表達時，將上述(a)～(l)中任一項所述的多核苷酸(DNA)以正義方向?qū)胫猎搯幼?，以促進這些多核苷酸(DNA)的表達。此外，在下述酒精飲料(例如啤酒)的釀造過程中，要抑制上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達時，將上述(a)～(l)中任一項所述的多核苷酸(DNA)以反義方向?qū)胫猎搯幼?，以抑制這些多核苷酸(DNA)的表達。此外，要抑制上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達時，也可將上述(m)～(q)中任一項所述的多核苷酸導入其能夠表達的載體內(nèi)。此外，在本發(fā)明中，通過破壞作為靶基因的上述基因(DNA)，可以抑制上述多核苷酸(DNA)的表達或上述蛋白質(zhì)的表達?；蚱茐目赏ㄟ^下述方式進行，即，通過在與靶基因的基因產(chǎn)物表達相關(guān)的區(qū)域如編碼區(qū)或啟動子區(qū)添加或缺失一個或多個堿基，或使上述區(qū)域整體缺失來進行。上述基因破壞的方法可參照公知文獻(例如參照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，4951(1979)、Methods in Enzymology，101，202(1983)、日本國特開平6-253826號公報等)。
此外，在本發(fā)明中，通過使啟動子突變或通過同源重組對啟動子進行基因重組，能夠控制靶基因的表達量。這種突變的導入方法在Nucleic AcidsRes.29，4238-4250(2001)上有記載，此外，通過改變啟動子來控制基因表達的方法如在Appl Environ Microbiol.，72，5266-5273(2006)上有記載。
導入酵母時使用的載體可以是多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、染色體整合型(YIp型)中的任一種。例如作為YEp型載體，已知有YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，Academic Press，New York，83，1983)；作為YCp型載體，已知有YCp50(M.D.Rose et al.，Gene，60237，1987)；作為YIp型載體，已知有YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，761035，1979)，且容易獲得。
用于調(diào)節(jié)酵母中的基因表達的啟動子/終止子，只要在釀造用酵母中起作用的同時不受發(fā)酵液中的成分影響，可以任意組合。例如可使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(TDH3)的啟動子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的啟動子等。這些基因均已克隆，如在M.F.Tuite et al.，EMBOJ.，1，603(1982)中有詳細記載，通過已知的方法能夠容易地獲得。
因釀造用酵母不能利用營養(yǎng)缺陷型標記，因而轉(zhuǎn)化時使用的選擇性標記可利用如氨基糖苷類抗生素(Geneticin)抗性基因(G418r)、銅抗性基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)或淺藍菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(Junji Inokoshi et al.，Biochemistry，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)。
上述構(gòu)建的載體被導入宿主酵母內(nèi)。作為宿主酵母可以為可在釀造中使用的任何酵母，如啤酒、葡萄酒、清酒等釀造用酵母等，具體可以為如酵母屬(Saccharomyces)等酵母。在本發(fā)明中，可使用啤酒酵母，如巴斯德酵母W34/70(Saccharomyces pas torianus W34/70)等、Saccharomycescarlsbergensis NCYC453或NCYC456等、或Saccharomyces cerevisiaeNBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。并且還可使用威士忌酵母如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等，葡萄酒酵母如日本協(xié)會的葡萄酒用1號、葡萄酒用3號、葡萄酒用4號等，清酒酵母如日本協(xié)會的酵母清酒用7號、清酒用9號等，但并不限于這些酵母。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用啤酒酵母例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。
酵母的轉(zhuǎn)化方法可利用一般使用的公知方法，如電穿孔法“Meth.Enzym.，194182(1990)”、原生質(zhì)球法(Spheroplast)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，751929(1978)”、乙酸鋰法“J.Bacteriology，153163(1983)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p1929(1978)、Methods in yeastgenetics”和2000 EditionA Cold Spring Harbor Laboratory CourseManual”等中所述的方法，但并不限于這些方法。
更具體地說，將宿主酵母在標準酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基(如YEPD培養(yǎng)基(Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)等)中培養(yǎng)至OD600nm值為1～6。將該培養(yǎng)酵母離心分離并收集，洗凈，用濃度約為1M～2M的堿性金屬離子，優(yōu)選鋰離子進行預處理。上述細胞在約30℃下，靜置約60分鐘后，與要導入的DNA(約1μg～20μg)同時在約30℃下，再靜置約60分鐘。添加聚乙二醇，優(yōu)選添加約4,000道爾頓的聚乙二醇，使最終濃度約為20％～50％。約30℃下靜置約30分鐘后，將上述細胞在約42℃下加熱處理約5分鐘。優(yōu)選用標準酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基將上述細胞懸浮液洗凈，加入到規(guī)定量的新鮮標準酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在約30℃下靜置約60分鐘。然后，將其接種于含有作為選擇性標記使用的抗生素或其類似物的標準瓊脂培養(yǎng)基上，獲得轉(zhuǎn)化體。
一般的克隆技術(shù)可參照《Molecular Cloning》第三版、“Methods in YeastGenetics，A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)”等。
4.本發(fā)明的酒精飲料制造方法以及根據(jù)該方法得到的酒精飲料將上述本發(fā)明的載體導入適于釀造目標酒精飲料的酵母中，通過使用該酵母，能夠制造氨含量得到控制、氨基酸含量得到控制的酒精飲料。此外，同樣也可以使用根據(jù)下述本發(fā)明的酵母的評價方法選擇出的酵母。目標酒精飲料可以為啤酒、發(fā)泡酒(happoushu)等啤酒味飲料、葡萄酒、威士忌、清酒等，但并不限于這些。此外在本發(fā)明中，如果需要的話，通過使用靶基因的表達受到抑制的釀造用酵母，也能夠制造所期望的氨含量升高的酒精飲料。即，使用導入上述本發(fā)明載體的酵母、上述本發(fā)明多核苷酸(DNA)的表達受到抑制的酵母或根據(jù)下述本發(fā)明的酵母評價方法選擇的酵母，進行制造酒精飲料的發(fā)酵，通過調(diào)節(jié)(增加或減少)氨的生成量，能夠制造所期望的氨含量得到調(diào)節(jié)(增加或減少)的酒精飲料。
制造上述酒精飲料時，除使用本發(fā)明得到的釀造酵母代替親株之外，可利用公知的方法。由于原料、制造設(shè)備、制造管理控制等可與以往的方法完全相同，所以不會增加酒精飲料的制造成本。即，根據(jù)本發(fā)明，能夠使用已有的設(shè)備進行制造而不增加成本。
5.本發(fā)明的酵母的評價方法本發(fā)明涉及評價方法，該評價方法使用根據(jù)具有序列號1或3的堿基序列的氨轉(zhuǎn)運蛋白基因的堿基序列設(shè)計的引物或探針，評價被檢酵母的氨同化能力。上述評價方法的一般方法是公知的，例如在WO01/040514號公報、日本國特開平8-205900號公報等中有記載。下面，對該評價方法進行簡單說明。
首先，制備被檢酵母的基因組。制備方法可采用Hereford法或乙酸鉀法等任何一種公知方法(如Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，130(1990))。使用根據(jù)氨轉(zhuǎn)運蛋白基因的堿基序列(優(yōu)選ORF序列)設(shè)計的引物或探針，檢測被檢酵母的基因組中是否存在其基因或其基因的特異序列?？刹捎霉姆椒ㄔO(shè)計引物或探針。
基因或特異序列的檢測可采用公知的方法實施。例如，用含有特異序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有與其堿基序列互補的堿基序列的一部分或全部多核苷酸作為一個引物，而用含有該序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有與其堿基序列互補的堿基序列的一部分或全部多核苷酸作為另一個引物，通過PCR法擴增酵母的核酸，測定擴增產(chǎn)物的有無、擴增產(chǎn)物分子量大小等。引物使用的多核苷酸的堿基數(shù)通常為10bp以上，優(yōu)選15bp～25bp。此外，夾在兩引物間的堿基數(shù)通常以300bp～2000bp為宜。
PCR法的反應條件無特別限定，如可采用變性溫度90℃～95℃，退火溫度40℃～60℃，延伸溫度60℃～75℃，循環(huán)數(shù)10次以上等條件。得到的反應生成物可通過使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等進行分離，測定擴增產(chǎn)物的分子量。通過該方法，根據(jù)擴增產(chǎn)物的分子量包含特定DNA分子的大小，預測、評價該酵母的氨同化能力。并且，通過分析擴增產(chǎn)物的堿基序列，可以更準確地預測、評價上述能力。
在本發(fā)明中，也可通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的基因的表達量，評價被檢酵母的氨同化能力。此外，編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的基因的表達量的測定，可通過培養(yǎng)被檢酵母，對編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA或蛋白質(zhì)進行定量來進行。mRNA或蛋白質(zhì)的定量可采用公知的方法進行。mRNA的定量例如可通過Northern雜交法、定量RT-PCR進行，蛋白質(zhì)的定量例如可通過Western印跡法進行(Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons 1994-2003)。此外，通過測定培養(yǎng)被檢酵母時得到的發(fā)酵液中的氨濃度，也可預測該被檢酵母中上述基因的表達量。
培養(yǎng)被檢酵母，通過測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的基因的表達量，選擇基因表達量與目標氨轉(zhuǎn)運蛋白活性相應的酵母，借此能夠選擇出適于釀造所期望酒精飲料的酵母。此外，也可以通過培養(yǎng)標準酵母及被檢酵母，測定各酵母中上述基因的表達量，比較標準酵母和被檢酵母中上述基因的表達量，從而選擇所期望的酵母。具體來說，例如培養(yǎng)標準酵母及被檢酵母，測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的基因在各酵母中的表達量，通過選擇與標準酵母相比該基因為高表達或低表達的被檢酵母，能夠選擇出適于釀造所期望酒精飲料的酵母。
培養(yǎng)被檢酵母，通過選擇氨轉(zhuǎn)運蛋白活性高或低的酵母，能夠選擇出適于釀造所期望酒精飲料的被檢酵母。
所述情況下，作為被檢酵母或標準酵母，可以使用如導入上述本發(fā)明載體的酵母、本發(fā)明的多核苷酸(DNA)的表達受到控制的酵母、實施突變處理的酵母或發(fā)生自然突變的酵母等。氨轉(zhuǎn)運蛋白活性可以根據(jù)如Mol Cell Biol174282-93，1997所述方法進行測定。對于突變處理，例如可以使用紫外線照射、放射線照射等物理方法，以及如EMS(甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亞硝基胍等試劑處理的化學方法等任何方法(如參照大嶋泰治編著、生物化學實驗法39酵母分子遺傳學實驗法、p67-75、學會出版中心等)(大嶋泰治編著、生物化學実験法39酵母分子遺伝學実験法、p67-75、學會出版センタ一)。
能夠作為標準酵母、被檢酵母使用的酵母，可以為可在釀造中使用的任意酵母，如啤酒、葡萄酒、清酒等釀造用酵母等。具體可以為酵母屬(Saccharomyces)等酵母(例如Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces cerevisiae及Saccharomyces carlsbergensis)，在本發(fā)明中可以使用啤酒酵母，如Saccharomyces pastorianus W34/70等、Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、NCYC456等、Saccharomycescerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。并且也可以使用葡萄酒酵母如日本協(xié)會的葡萄酒用1號、葡萄酒用3號、葡萄酒用4號等，清酒酵母如日本協(xié)會酵母清酒用7號、清酒用9號等，但并不限于這些酵母。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用啤酒酵母如巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)。標準酵母、被檢酵母也可以從上述酵母中任意組合選擇。
實施例以下根據(jù)實施例對本發(fā)明詳細描述，但本發(fā)明不限于以下實施例。
實施例1氨轉(zhuǎn)運蛋白(nonScMEP1)的克隆使用日本國特開2004-283169所述的比較數(shù)據(jù)庫進行檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)啤酒酵母中特有的氨轉(zhuǎn)運蛋白基因nonScMEP1(序列號1)。根據(jù)獲得的堿基序列信息，分別設(shè)計用于擴增全長基因的引物nonScMEP1_F(序列號5)/nonScMEP1_R(序列號6)，通過以基因組解讀株Saccharomyces pastorianusWeihenstepan34/70株(簡稱“W34/70株”)的染色體DNA為模板的PCR，取得包括nonScMEP1的全長基因的DNA片段。
將上述得到的nonScMEP1基因片段，通過TA克隆插入pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen公司制造)。用Sanger法(F.Sanger，Science，2141215，1981)分析并確定nonScMEP1基因的堿基序列。
實施例2啤酒釀造中nonScMEP1基因表達分析使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株進行試釀造，從發(fā)酵中的啤酒酵母菌體中提取的mRNA通過啤酒酵母DNA微陣列進行分析。
麥芽汁浸出物濃度12.69％麥芽汁體積 70L麥芽汁中溶解氧濃度 8.6ppm發(fā)酵溫度15℃酵母添加量 12.8×106cells/mL對發(fā)酵液進行經(jīng)時采樣，觀察酵母增殖量(圖1)、表觀浸出物濃度(圖2)的經(jīng)時變化。與此同時對酵母菌體進行采樣，制備的mRNA用生物素進行標記，使其與日本國特開2004-283169所述的啤酒酵母DNA微陣列進行雜交。用GeneChip Operating System(GCOS；GeneChip Operating Software1.0，Affymetrix公司制造)進行信號檢測，nonScMEP1基因的表達模式如圖3所示。根據(jù)該結(jié)果確認在通常的啤酒發(fā)酵中nonScMEP1基因進行表達。
實施例3nonScMEP1高表達株的構(gòu)建將實施例1所述的nonScMEP1/pCR2.1-TOPO用限制性內(nèi)切酶SacI及NotI酶解，制備包括蛋白質(zhì)編碼區(qū)全長的DNA片段。將該片段連接于經(jīng)限制酶SacI及NotI處理的pYCGPYNot上，由此構(gòu)建nonScMEP1高表達載體nonScMEP1/pYCGPYNot。pYCGPYNot為YCp型酵母表達載體，導入的基因通過丙酮酸激酶基因PYK1的啟動子進行高表達。酵母的選擇性標記包括氨基糖苷類抗生素(Geneticin)抗性基因G418r，大腸菌的選擇性標記包括氨芐青霉素抗性基因Ampr。
使用上述方法制作的高表達載體，采用日本國特開平07-303475所述的方法，對Saccharomyces pasteurianus Weihenstepan34/70株進行轉(zhuǎn)化。采用含有氨基糖苷類抗生素(Geneticin)300mg/L的YPD平板培養(yǎng)基(1％酵母浸出物，2％多聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％瓊脂)選擇轉(zhuǎn)化體。
實施例4啤酒釀造試驗中氨及氨基酸同化量的測定使用親株及實施例3得到的nonScMEP1高表達株的發(fā)酵試驗在下述條件下進行。
麥芽汁浸出物濃度12％麥芽汁體積 1L麥芽汁中溶解氧濃度 約8ppm發(fā)酵溫度15℃恒定酵母添加量 5g濕酵母菌體/L麥芽汁對發(fā)酵液進行經(jīng)時采樣，分析酵母增殖量(OD660)(圖4)、浸出物消耗量(圖5)、氨濃度(圖6)、游離氨基氮(FAN)濃度(圖7)的經(jīng)時變化。如圖6所示，與親株相比，nonScMEP1高表達株的氨同化得到促進，而游離氨基氮(FAN)的同化受到抑制(如圖7所示)。其結(jié)果如表1所示，對于nonScMEP1高表達株，發(fā)酵結(jié)束后啤酒中的總氨基酸量增加，氨量減少。


實施例5氨轉(zhuǎn)運蛋白(ScMEP1)的克降使用日本國特開2004-283169所述的比較數(shù)據(jù)庫進行檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)啤酒酵母中特有的氨轉(zhuǎn)運蛋白基因ScMEP1(序列號3)。根據(jù)獲得的堿基序列信息，分別設(shè)計用于擴增全長基因的引物ScMEP1_F(序列號7)/ScMEP1_R(序列號8)，通過以基因組解讀株Saccharomyces pastorianus Weihenstepan34/70的染色體DNA為模板的PCR，獲得包括ScMEP1的全長基因的DNA片段。
將上述方法得到的ScMEP1基因片段，通過TA克隆插入pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen公司制造)。用Sanger法(F.Sanger，Science，2141215，1981)分析并確定ScMEP1基因的堿基序列。
實施例6啤酒釀造中ScMEP1基因表達分析使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株進行試釀造，從發(fā)酵中的啤酒酵母菌體中提取的mRNA通過啤酒酵母DNA微陣列進行分析。
麥芽汁浸出物濃度12.69％麥芽汁體積 70L麥芽汁中溶解氧濃度 8.6ppm發(fā)酵溫度15℃酵母添加量 12.8×106cells/mL對發(fā)酵液進行經(jīng)時采樣，觀察酵母增殖量(圖1)、表觀浸出物濃度(圖2)的經(jīng)時變化。與此同時對酵母菌體進行采樣，制備的mRNA用生物素進行標記，使其與日本國特開2004-283169所述的啤酒酵母DNA微陣列進行雜交。用GeneChip Operating System(GCOS；GeneChip Operating Software1.0，Affymetrix公司制造)進行信號檢測，ScMEP1基因的表達模式如圖8所示。根據(jù)該結(jié)果確認在通常的啤酒發(fā)酵中ScMEP1基因進行表達。
實施例7ScMEP1高表達株的構(gòu)建將實施例1所述的ScMEP1/pCR2.1-TOPO用限制性內(nèi)切酶SacI及NotI酶解，制備包括蛋白質(zhì)編碼區(qū)全長的DNA片段。將該片段連接于經(jīng)限制酶SacI及NotI處理的pYCGPYNot上，從而構(gòu)建出ScMEP1高表達載體ScMEP1/pYCGPYNot。pYCGPYNot為YCp型酵母表達載體，導入的基因通過丙酮酸激酶基因PYK1的啟動子進行高表達。酵母的選擇性標記包括氨基糖苷類抗生素(Geneticin)抗性基因G418r，大腸菌的選擇性標記包括氨芐青霉素抗性基因Ampr。
使用上述方法制作的高表達載體，采用日本國特開平07-303475所述的方法，對Saccharomyces pastorianus Weihenstepan34/70株進行轉(zhuǎn)化。采用含有氨基糖苷類抗生素(Geneticin)300mg/L的YPD平板培養(yǎng)基(1％酵母浸出物，2％多聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％瓊脂)選擇轉(zhuǎn)化體。
實施例8啤酒釀造試驗中氨及氨基酸同化量的測定使用親株及實施例7得到的ScMEP1高表達株的發(fā)酵試驗在下述條件下進行。
麥芽汁浸出物濃度12％麥芽汁體積 1L麥芽汁中溶解氧濃度 約8ppm發(fā)酵溫度15℃(恒定)酵母添加量 5g濕酵母菌體/L麥芽汁對發(fā)酵液進行經(jīng)時采樣，分析酵母增殖量(OD660)(圖9)、浸出物消耗量(圖10)、氨濃度(圖11)、游離氨基氮(FAN)(圖12)的經(jīng)時變化。如圖11所示，與親株相比，ScMEP1高表達株的氨同化得到促進，游離氨基氮(FAN)的同化受到抑制(如圖12所示)。其結(jié)果如表2所示，對于ScMEP1高表達株，發(fā)酵結(jié)束后啤酒中的總氨基酸量增加，氨量減少。


實施例9nonScMEP1基因或ScMEP1基因的破壞按照文獻(Goldstein et al.，yeast.15 1541(1999))的方法，通過以含有藥物抗性標記的質(zhì)粒(pFA6a(G418r)，pAG25(natl)，pAG32(hph))為模板的PCR，制備用于破壞基因的片段。
使用上述方法制備的用于破壞基因的片段，對W34/70株或孢子克隆株W34/70-2進行轉(zhuǎn)化，采用日本國特開平07-303475所述的轉(zhuǎn)化方法，選擇性試劑的濃度分別為氨基糖苷類抗生素(Geneticin)300mg/L、Nourseothricin50mg/L。
實施例10啤酒釀造試驗中氨及氨基酸同化量的測定使用親株及實施例9得到的nonScMEP1破壞株或ScMEP1破壞株的發(fā)酵試驗在下述條件下進行。
麥芽汁浸出物濃度12％麥芽汁體積 1L麥芽汁中溶解氧濃度 約7ppm發(fā)酵溫度12℃(恒定)酵母添加量 5g濕酵母菌體/L麥芽汁與實施例8相同，對發(fā)酵液進行經(jīng)時采樣，分析酵母增殖量(OD660)、浸出物消耗量、氨濃度、游離氨基氮(FAN)濃度的經(jīng)時變化。
根據(jù)本發(fā)明的酒精飲料制造方法，可增大酵母的氨同化能力，所以可以制造氨基酸的同化受到抑制、氨基酸含量多的酒精飲料。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110>三得利株式會社(Suntory Limited)<120>氨轉(zhuǎn)運蛋白基因及其用途(Ammonia transporter gene and use thereof)<130>G06-0088CN<150>JP2006-049062<151>2006-02-24<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1476<212>DNA<213>酵母屬(Saccharomyces sp.)<400>1atggaaagtc gatctacagg gcctcttacg acggaaattt acgatggccc cactgtggcc 60tttatgattt tgggtgccgc cttggttttt ttcatggtac ctgggctggg attcttgtac120tcaggactgg cgagaagaaa atccgcattg gcgttgattt gggtagtgct gatggcgacg180ctggtcggta tactgcaatg gtacttttgg ggttactctt tagccttttc caagtccgcc240accaacaaca aattcattgg aaacttggac tcgtttgggt ttaggaacgt atacgggaag300aaatccgacg gcgatgtcta tcctgaactt gcgtatgcga ccttccagat gatgttttcc360tgcgtcaact taagcattat cgcaggcgct acagctgaaa gaggtagatt gctaccgcac420
atggttttcc tcttcattct agccactatt gtgtactgtc cggtgacgta ctggatttgg480tctccgggcg gttgggctta ccaatgggga gtgctggact gggcaggcgg tgggaacatt540gagattctga gtgccgtttc cggattcgtc tactcttggt ttttaggcaa aagaaatgaa600aaactgctga taaacttcag acctcataat gtgtcgttgg tcactctagg cacgtccata660ctgtggtttg gttggttact cttcaattca gcctcgtcac tatcaccaaa tttgaggtca720gtttatgcct ttatgaacac gtgcctcagc gccattactg gcgggatgac atggtgcctc780ttggattata gatcagaaag gaaatggtcg actgtcggtt tgtgttctgg tatcatctca840ggattggtag cagccacacc aagttcagga tgtataactc tctacggctc gctaatccaa900ggcattgtgg cggggatcgt ctgtaatttt gccactaaat taaaatacta tgctaaagtg960gatgacgcca tggatattct tgctgagcac ggagtcgcag gcataatagg actaatattc 1020aatgctcttt tcgcggcaga ttgggtgatc ggtatggacg gagtcagcga acacgagggt 1080ggctggataa gtcataatta caagcaaatg tacaagcaga ttgcttatat tgccgcatca 1140ataggataca ctgccgttgt cacggcaatc atttgctttg tgctcgggta cattcctgga 1200atgacgctga gaatatctga tgaagcagaa gaacgtggta tggatgaaga ccaaattggt 1260gaattcgcat acgactatgt ggaggttaga agagattatt atttatgggg tgtagaagaa 1320gattctcaac agtctactgt aaatcaccgc agtactgaca ctcgctcaac tgttgaccat 1380agcagcagta ccaatagttc tttagacggg aacgaagaaa tggcccggtc ggaaaagata 1440acaccatctc atcaagaaaa gcctagcgat aggtga 1476<210>2<211>491<212>PRT<213>酵母屬(Saccharomyces sp.)<400>2Met Glu Ser Arg Ser Thr Gly Pro Leu Thr Thr Glu Ile Tyr Asp Gly1 5 10 15Pro Thr Val Ala Phe Met Ile Leu Gly Ala Ala Leu Val Phe Phe Met
20 25 30Val Pro Gly Leu Gly Phe Leu Tyr Ser Gly Leu Ala Arg Arg Lys Ser35 40 45Ala Leu Ala Leu Ile Trp Val Val Leu Met Ala Thr Leu Val Gly Ile50 55 60Leu Gln Trp Tyr Phe Trp Gly Tyr Ser Leu Ala Phe Ser Lys Ser Ala65 70 75 80Thr Asn Asn Lys Phe Ile Gly Asn Leu Asp Ser Phe Gly Phe Arg Asn85 90 95Val Tyr Gly Lys Lys Ser Asp Gly Asp Val Tyr Pro Glu Leu Ala Tyr100 105 110Ala Thr Phe Gln Met Met Phe Ser Cys Val Asn Leu Ser Ile Ile Ala115 120 125Gly Ala Thr Ala Glu Arg Gly Arg Leu Leu Pro His Met Val Phe Leu130 135 140Phe Ile Leu Ala Thr Ile Val Tyr Cys Pro Val Thr Tyr Trp Ile Trp145 150 155 160Ser Pro Gly Gly Trp Ala Tyr Gln Trp Gly Val Leu Asp Trp Ala Gly165 170 175Gly Gly Asn Ile Glu Ile Leu Ser Ala Val Ser Gly Phe Val Tyr Ser180 185 190Trp Phe Leu Gly Lys Arg Asn Glu Lys Leu Leu Ile Asn Phe Arg Pro195 200 205His Asn Val Ser Leu Val Thr Leu Gly Thr Ser Ile Leu Trp Phe Gly210 215 220Trp Leu Leu Phe Asn Ser Ala Ser Ser Leu Ser Pro Asn Leu Arg Ser225 230 235 240Val Tyr Ala Phe Met Asn Thr Cys Leu Ser Ala Ile Thr Gly Gly Met245 250 255
Thr Trp Cys Leu Leu Asp Tyr Arg Ser Glu Arg Lys Trp Ser Thr Val260 265 270Gly Leu Cys Ser Gly Ile Ile Ser Gly Leu Val Ala Ala Thr Pro Ser275 280 285Ser Gly Cys Ile Thr Leu Tyr Gly Ser Leu Ile Gln Gly Ile Val Ala290 295 300Gly Ile Val Cys Asn Phe Ala Thr Lys Leu Lys Tyr Tyr Ala Lys Val305 310 315 320Asp Asp Ala Met Asp Ile Leu Ala Glu His Gly Val Ala Gly Ile Ile325 330 335Gly Leu Ile Phe Asn Ala Leu Phe Ala Ala Asp Trp Val Ile Gly Met340 345 350Asp Gly Val Ser Glu His Glu Gly Gly Trp Ile Ser His Asn Tyr Lys355 360 365Gln Met Tyr Lys Gln Ile Ala Tyr Ile Ala Ala Ser Ile Gly Tyr Thr370 375 380Ala Val Val Thr Ala Ile Ile Cys Phe Val Leu Gly Tyr Ile Pro Gly385 390 395 400Met Thr Leu Arg Ile Ser Asp Glu Ala Glu Glu Arg Gly Met Asp Glu405 410 415Asp Gln Ile Gly Glu Phe Ala Tyr Asp Tyr Val Glu Val Arg Arg Asp420 425 430Tyr Tyr Leu Trp Gly Val Glu Glu Asp Ser Gln Gln Ser Thr Val Asn435 440 445His Arg Ser Thr Asp Thr Arg Ser Thr Val Asp His Ser Ser Ser Thr450 455 460Asn Ser Ser Leu Asp Gly Asn Glu Glu Met Ala Arg Ser Glu Lys Ile465 470 475 480Thr Pro Ser His Gln Glu Lys Pro Ser Asp Arg
485490<210>3<211>1479<212>DNA<213>酵母屬(Saccharomyces sp.)<400>3atggagagtc gaactacagg gcctttaacg actgaaacct acgatggccc cactgtggcc 60ttcatgatat taggtgccgc cctagtattt tttatggtgc ccggatttgg attcttgtac120tccggattgg caagaaggaa gtctgcacta gcactaatct gggttgtatt aatggcgact180ttggtcggta tactgcaatg gtatttctgg ggttactctc tagctttttc aaagtccgct240ccgaataata aattcattgg gaatctagat tcgtttggct ttagaaacgt gtacggaaaa300aaattcgatg aagatgccta ccctgagctc gcgtatgcaa ccttccaaat gatgttttcg360tgcgtcaact taagtattat cgctggcgcc actgccgaaa gaggcaggct gctaccgcac420atggtttttc tctttattct agctaccatt ggatattgtc cagtgacgta ttggatttgg480tcaccaggtg gttgggcata ccaatgggga gtcctcgatt gggcaggcgg cggcaacatt540gaaatattaa gcgctgtttc egggtttgtt tactcttggt ttttgggcaa aagaaatgaa600aagttactga taaatttcag gcctcataat gtttcattgg tcactctagg cacatccata660ctgtggtttg gctggctgct atttaattct gcatcctcat tatccccaaa tttgaggtca720gtttatgcat tcatgaatac atgtctcagt gccattactg gtgggatgac gtggtgtctt780ctggattaca gatcggagaa gaaatggtcg acagttggtc tgtgctccgg tatcatttct840gggctggtgg ctgcaacgcc aagctcaggc tgtataaccc tttacggttc acttattcaa900ggcattgtgg cgggggtagt gtgtaacttt gcgacgaagt tgaaatacta cgctaaagta960gatgatgcca tggacattct agctgagcac ggggttgcag gcgtaatagg actaattttc 1020aatgcccttt ttggagcaga ctgggtcatt ggtatggatg gcactacaga gcacgagggc 1080ggctgggtaa ctcacaatta caagcaaatg tataagcaga tcgcttacat tgccgcatcc 1140attgggtaca ctgctgctgt aactgcaata atctgctttg tgctcggcta catacccggt 1200atgaggctaa gaatatcaga agaggcagag gaggcgggta tggacgaaga tcaaattggc 1260
gaatttgcgt acgattatgt ggaagtgaga agagattact atctatgggg tgtagacgaa 1320gattcacaac gctctgatgt aaatcaccgg gtgaacaacg ctcatttggc cgctgaacgt 1380agcagtagcg gtactaatag ttcctcggat gggaatggag aaatgattca atccgaaaag 1440atcctaccaa ttcatcaaga agatcctgcc aataggtaa 1479<210>4<211>492<212>PRT<213>酵母屬(Saccharomyces sp.)<400>4Met Glu Ser Arg Thr Thr Gly Pro Leu Thr Thr Glu Thr Tyr Asp Gly1 5 10 15Pro Thr Val Ala Phe Met Ile Leu Gly Ala Ala Leu Val Phe Phe Met20 25 30Val Pro Gly Phe Gly Phe Leu Tyr Ser Gly Leu Ala Arg Arg Lys Ser35 40 45Ala Leu Ala Leu Ile Trp Val Val Leu Met Ala Thr Leu Val Gly Ile50 55 60Leu Gln Trp Tyr Phe Trp Gly Tyr Ser Leu Ala Phe Ser Lys Ser Ala65 70 75 80Pro Asn Asn Lys Phe Ile Gly Asn Leu Asp Ser Phe Gly Phe Arg Asn85 90 95Val Tyr Gly Lys Lys Phe Asp Glu Asp Ala Tyr Pro Glu Leu Ala Tyr100 105 110Ala Thr Phe Gln Met Met Phe Ser Cys Val Asn Leu Ser Ile Ile Ala115 120 125Gly Ala Thr Ala Glu Arg Gly Arg Leu Leu Pro His Met Val Phe Leu
130 135 140Phe Ile Leu Ala Thr Ile Gly Tyr Cys Pro Val Thr Tyr Trp Ile Trp145 150 155 160Ser Pro Gly Gly Trp Ala Tyr Gln Trp Gly Val Leu Asp Trp Ala Gly165 170 175Gly Gly Asn Ile Glu Ile Leu Ser Ala Val Ser Gly Phe Val Tyr Ser180 185 190Trp Phe Leu Gly Lys Arg Asn Glu Lys Leu Leu Ile Asn Phe Arg Pro195 200 205His Asn Val Ser Leu Val Thr Leu Gly Thr Ser Ile Leu Trp Phe Gly210 215 220Trp Leu Leu Phc Asn Ser Ala Ser Ser Leu Ser Pro Asn Leu Arg Ser225 230 235 240Val Tyr Ala Phe Met Asn Thr Cys Leu Ser Ala Ile Thr Gly Gly Met245 250 255Thr Trp Cys Leu Leu Asp Tyr Arg Ser Glu Lys Lys Trp Ser Thr Val260 265 270Gly Leu Cys Ser Gly Ile Ile Ser Gly Leu Val Ala Ala Thr Pro Ser275 280 285Ser Gly Cys Ile Thr Leu Tyr Gly Ser Leu Ile Gln Gly Ile Val Ala290 295 300Gly Val ValCys Asn Phe Ala Thr Lys Leu Lys Tyr Tyr Ala Lys Val305310 315 320Asp Asp Ala Met Asp Ile Leu Ala Glu His Gly Val Ala Gly Val Ile325 330 335Gly Leu Ile Phe Asn Ala Leu Phe Gly Ala Asp Trp Val Ile Gly Met340 345 350Asp Gly Thr Thr Glu His Glu Gly Gly Trp Val Thr His Asn Tyr Lys355 360 365
Gln Met Tyr Lys Gln Ile Ala Tyr Ile Ala Ala Ser Ile Gly Tyr Thr370 375 380Ala Ala Val Thr Ala Ile Ile Cys Phe Val Leu Gly Tyr Ile Pro Gly385 390 395 400Met Arg Leu Arg Ile Ser Glu Glu Ala Glu Glu Ala Gly Met Asp Glu405 410 415Asp Gln Ile Gly Glu Phe Ala Tyr Asp Tyr Val Glu Val Arg Arg Asp420 425 430Tyr Tyr Leu Trp Gly Val Asp Glu Asp Ser Gln Arg Ser Asp Val Asn435 440 445His Arg Val Asn Asn Ala His Leu Ala Ala Glu Arg Ser Ser Ser Gly450 455 460Thr Asn Ser Ser Ser Asp Gly Asn Gly Glu Met Ile Gln Ser Glu Lys465 470 475 480Ile Leu Pro Ile His Gln Glu Asp Pro Ala Asn Arg485 490<210>5<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>5gagctcatag cggccatgga aacgatggaa agtcgatcta40<210>6
<211>42<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>6ggatcctatg cggccgcgta taaagcaaat gcagatctat ac42<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>7gagctcatag cggccatgga gagtcgaact acagggcctt40<210>8<211>42<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)
<400>8ggatcc tatg cggccgcatg cacatctata catatatgaa gg4權(quán)利要求
1.多核苷酸，其選自下述(a)～(f)組成的群組(a)多核苷酸，其含有具有序列號1的堿基序列的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有序列號2的氨基酸序列；(c)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有在序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個或多個氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；(d)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；(e)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該多核苷酸在嚴格條件下，與具有與序列號1的堿基序列互補的堿基序列的多核苷酸進行雜交，且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)；以及(f)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該多核苷酸在嚴格條件下，與具有與編碼具有序列號2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列互補的堿基序列的多核苷酸進行雜交，且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其選自下述(g)～(i)組成的群組(g)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有序列號2的氨基酸序列或具有在序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10個氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；(h)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；以及(i)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該多核苷酸在高嚴格條件下，與具有序列號1的堿基序列的多核苷酸進行雜交或與具有與序列號1的堿基序列互補的堿基序列的多核苷酸進行雜交，且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其含有具有序列號1的堿基序列的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其含有編碼具有序列號2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
5.如權(quán)利要求1～4中任一項所述的多核苷酸，其為DNA。
6.蛋白質(zhì)，其為由權(quán)利要求1～5中任一項所述的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。
7.載體，其含有權(quán)利要求1～5中任一項所述的多核苷酸。
8.載體，其含有下述(j)～(l)中任一項所述的多核苷酸，(j)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有序列號4的氨基酸序列或具有在序列號4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10個氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；(k)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；以及(l)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該多核苷酸在高嚴格條件下，與具有序列號3的堿基序列的多核苷酸進行雜交或與具有與序列號3的堿基序列互補的堿基序列的多核苷酸進行雜交，且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)。
9.多核苷酸，其選自下述(m)～(q)組成的群組(m)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA具有與權(quán)利要求5所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的堿基序列；(n)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA通過RNAi效應抑制權(quán)利要求5所述的多核苷酸(DNA)的表達；(o)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA對權(quán)利要求5所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有特異切割活性；(p)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA通過共抑制效應抑制權(quán)利要求5所述的多核苷酸(DNA)的表達；以及，(q)多核苷酸，其編碼具有與下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的堿基序列的RNA；多核苷酸，其編碼通過RNAi效應抑制下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)表達的RNA；多核苷酸，其編碼對下述(q1)、(q2)或(q3)所述的多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有特異切割活性的RNA；或多核苷酸，其編碼通過共抑制效應抑制下述(q1)、(q2)、或(q3)所述的多核苷酸(DNA)表達的RNA；(q1)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有序列號4的氨基酸序列或具有在序列號4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10個氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；(q2)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；以及(q3)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該多核苷酸在高嚴格條件下，與具有序列號3的堿基序列的多核苷酸進行雜交或與具有與序列號3的堿基序列互補的堿基序列的多核苷酸進行雜交，且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)。
10.載體，其含有權(quán)利要求9所述的多核苷酸。
11.酵母，其為導入了權(quán)利要求7、8或10所述的載體的酵母。
12.如權(quán)利要求11所述的酵母，其中，通過導入權(quán)利要求7或8所述的載體，氨同化能力增強。
13.酵母，其為通過下述(A)、(B)或(C)方式使選自上述(5)所述的多核苷酸(DNA)和下述(q1)～(q3)的多核苷酸的表達受到抑制的酵母(A)通過導入權(quán)利要求10所述的載體；(B)通過破壞下述多核苷酸(DNA)的基因，即，權(quán)利要求5所述的多核苷酸(DNA)；(q1)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有序列號4的氨基酸序列或具有在序列號4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10個氨基酸后的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；(q2)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號4的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性；或(q3)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該多核苷酸在高嚴格條件下，與具有序列號3的堿基序列的多核苷酸進行雜交或與具有與序列號3的堿基序列互補的堿基序列的多核苷酸進行雜交，且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)；或(C)通過使啟動子突變或通過重組啟動子。
14.如權(quán)利要求12所述的酵母，其中，通過增加權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)的表達量，氨同化能力得到增強。
15.酒精飲料的制造方法，其使用權(quán)利要求11～14中任一項所述的酵母。
16.如權(quán)利要求15所述的酒精飲料的制造方法，其中，釀造的酒精飲料是麥芽飲料。
17.如權(quán)利要求15所述的酒精飲料的制造方法，其中，釀造的酒精飲料是葡萄酒。
18.酒精飲料，其為采用權(quán)利要求15～17任一項所述的方法制造的酒精飲料。
19.評價被檢酵母的氨同化能力的方法，其包括使用根據(jù)具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的基因的堿基序列設(shè)計的引物或探針。
20.評價被檢酵母的氨同化能力的方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母；測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的基因的表達量。
21.酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母；對權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)進行定量或測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的基因的表達量；以及選擇其中所述蛋白質(zhì)的生成量或所述基因的表達量與目標氨同化能力相應的被檢酵母。
22.如權(quán)利要求21所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標準酵母和被檢酵母；測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有氨轉(zhuǎn)運蛋白活性的蛋白質(zhì)的基因在各酵母中的表達量；以及選擇基因表達高于或低于標準酵母的被檢酵母。
23.如權(quán)利要求21所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標準酵母和被檢酵母；對各酵母中的權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)進行定量；以及選擇蛋白質(zhì)的量多于或少于標準酵母的被檢酵母。
24.酒精飲料的制造方法，其包括使用權(quán)利要求11～14所述的任一酵母和根據(jù)權(quán)利要求21～23所述的方法選擇的酵母中的任一種酵母，進行用于制造酒精飲料的發(fā)酵，以及調(diào)節(jié)氨及氨基酸的含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及氨轉(zhuǎn)運蛋白基因及其用途，特別涉及氨同化能力強的釀造酵母、使用該酵母制造的酒精飲料、其制造方法等。更加具體地說，本發(fā)明涉及編碼釀造酵母的氨轉(zhuǎn)運蛋白MEP1p的基因MEP1，特別涉及通過控制啤酒酵母的特征基因nonScMEP1、或基因ScMEP1的表達量從而控制氨同化能力的酵母、使用該酵母的酒精飲料的制造方法等。
文檔編號C07K14/37GK101024834SQ20061016883
公開日2007年8月29日 申請日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月24日
發(fā)明者中尾嘉宏, 兒玉由紀子, 下永朋子 申請人:三得利株式會社