專利名稱：：新型高等植物的制作方法以及高等植物的生長促進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在葉綠體的類嚢體腔內(nèi)具有細(xì)胞色素C6的新型高等植物的制作(作出)方法、以及使細(xì)胞色素C6存在于上述類嚢體腔中從而促進(jìn)高等植物生長的方法、或促進(jìn)高等植物的固碳能力的方法。
背景技術(shù)：
：以往，關(guān)于促進(jìn)陸地植物等所謂高等植物生長的技術(shù)，有提高核酮糖二磷酸羧化酶等酶的活性等與光合作用暗反應(yīng)(Calvin-Bensoncycle,卡爾文本森循環(huán))相關(guān)的報(bào)告的例子，具體有通過導(dǎo)入相關(guān)酶基因使葉增大的報(bào)告例(Shigeoka等人.，Naturebiotechnology,19，965-969(2001))等。但是，在對各種高等植物應(yīng)用方面上述技術(shù)的通用性非常欠缺。已知細(xì)胞色素C6是光合作用光反應(yīng)中的電子傳遞蛋白質(zhì)，本來只存在于一部分藻類(藍(lán)藻類等)中，其電子傳遞能力極為優(yōu)異(即氧化還原電位是高電位)(圖l)。因此人們強(qiáng)烈希望開發(fā)出能夠在各種高等植物的葉綠體中(具體來說在類嚢體腔內(nèi))中表達(dá)細(xì)胞色素c6并發(fā)揮其功能，從而提高光合作用能力的通用性優(yōu)異的技術(shù)。作為在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)細(xì)胞色素c6的4支術(shù)，例如已知有F.P.Molina-Heredia等人.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，243，302-306(1998);T.Satoh等人.，F(xiàn)EBSlett.，531，543-547(2002);R.Gupta等人.，Nature,417,567-571(2002);D.R.Hickey等人.，Gene,105，73-81(1991)等文獻(xiàn)中記載的技術(shù)。但是，這些技術(shù)均使用大腸桿菌、酵母或藍(lán)藻等非高等植物的宿主細(xì)胞，其目的只是大量生產(chǎn)上述細(xì)胞色素C6或與其類似的蛋白質(zhì)或進(jìn)行功能分析，其包含在以往本領(lǐng)域技術(shù)人員通常進(jìn)行的基因表達(dá)方法中。在高等植物中，關(guān)于使細(xì)胞色素C6發(fā)揮光合作用光反應(yīng)的電子傳遞體功能，也就是說，使細(xì)胞色素C6存在于高等植物細(xì)胞內(nèi)的葉綠體中的類嚢體腔內(nèi)的成功的例子，目前完全未見，被認(rèn)為是極為困難的
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的課題在于提供在葉綠體的類嚢體腔內(nèi)具有細(xì)胞色素C6的新型高等植物的制作方法，進(jìn)而提供促進(jìn)高等植物生長的方法，促進(jìn)選自ATP、NADPH、淀粉和蛋白質(zhì)中的至少一種的合成的方法，以及促進(jìn)固碳的方法。本發(fā)明人為解決上述課題進(jìn)行了深入的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果將附加有特定信號肽的細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)的基因?qū)敫叩戎参锏幕蚪MDNA中并使其表達(dá)，則可以使以往被認(rèn)為不可能的細(xì)胞色素"向葉綠體被膜內(nèi)和類嚢體膜內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)(通過)成為可能，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明如下(1)在葉綠體類嚢體腔內(nèi)具有細(xì)胞色素C6的高等植物的制作方法，其特征在于將編碼融合蛋白的基因?qū)敫叩戎参锏幕蚪M中，其中所述融合蛋白是在細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)上附加有50-80個(gè)氨基酸殘基的信號肽的融合蛋白。(2)高等植物的生長促進(jìn)方法，其特征在于將編碼融合蛋白的基因?qū)敫叩戎参锏幕蚪M中并使其表達(dá)，使細(xì)胞色素C6存在于葉綠體的類嚢體腔內(nèi)，其中所述融合蛋白是在細(xì)胞色素c6蛋白質(zhì)上附加有50-80個(gè)氨基酸殘基的信號肽的融合蛋白。(3)促進(jìn)高等植物的選自ATP、NADPH、淀粉和蛋白質(zhì)中的至少一種的合成的方法，其特征在于將編碼融合蛋白的基因?qū)敫叩戎参锏幕蚪M中并使其表達(dá)，使細(xì)胞色素C6存在于葉綠體的類嚢體腔內(nèi)，其中所述融合蛋白是在細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)上附加有50-80個(gè)氨基酸殘基的信號肽的融合蛋白。(4)促進(jìn)高等植物固碳的方法，其特征在于將編碼融合蛋白的基因?qū)敫叩戎参锏幕蚪M中并使其表達(dá)，使細(xì)胞色素"存在于葉綠體的類嚢體腔內(nèi)，其中所述融合蛋白是在細(xì)胞色素"蛋白質(zhì)上附加有50-80個(gè)氨基酸殘基的信號肽的融合蛋白。上述(l)-(4)的方法中，上述融合蛋白可以是以下的(a)、(b)、(c)或(d)的蛋白質(zhì)。(a)含有SEQIDN0.2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)(b)含有下述氨基酸序列，且具有通過高等植物的葉綠體被膜和類嚢體膜的能力的蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸序列為SEQIDNO,2所示氨基酸序列中的相當(dāng)于上述信號肽的氨基酸序列有l(wèi)或多個(gè)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列。(C)含有下述氨基酸序列，且具有電子傳遞能力的蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸序列為SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相當(dāng)于上述細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)的氨基酸序列有1或多個(gè)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列。(d)含有下述氨基酸序列，且具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力，以及電子傳遞能力的蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸序列為SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相當(dāng)于上述信號肽的氨基酸序列和相當(dāng)于上述細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別有1或多個(gè)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列。上述(l)-(4)的方法中，上述基因可以是含有以下(a)或(b)的DNA的基因。(a)含有SEQIDNO.l所示堿基序列的DNA(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與含有互補(bǔ)堿基序列的DNA雜交的DNA，且是編碼具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力、以及電子傳遞能力的蛋白質(zhì)的DNA，其中所述互補(bǔ)堿基序列是與含有SEQIDNO.1所示堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列。(5)在細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)上附加50-80個(gè)氨基酸殘基的信號肽而成的融合蛋白。上述(S)的融合蛋白可以是以下(a)、(b)、(c)或(d)的蛋白質(zhì)。(a)含有SEQIDNO.:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)(b)含有下述氨基酸序列，且具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力的蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸序列為SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相當(dāng)于上述信號肽的氨基酸序列有l(wèi)或多個(gè)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列(c)含有下述氨基酸序列，且具有電子傳遞能力的蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸序列是SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相當(dāng)于上述細(xì)胞色素Q蛋白質(zhì)的氨基酸序列有1或多個(gè)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列(d)含有下述氨基酸序列，且具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力，以及電子傳遞能力的蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸序列為SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相當(dāng)于上述信號肽的氨基酸序列和相當(dāng)于上述細(xì)胞色素"蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別有l(wèi)或多個(gè)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列。(6)編碼上述(5)的融合蛋白的基因。(7)含有以下(a)或(b)的DNA的基因。(a)含有SEQIDNO.l所示堿基序列的DNA(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與含有互補(bǔ)堿基序列的DNA雜交的DNA，且是編碼具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力、以及電子傳遞能力的蛋白質(zhì)的DNA，其中所述互補(bǔ)堿基序列是與含有SEQIDNO.l所示堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列。(8)含有上述(6)或(7)的基因的重組載體。(9)轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體是將上述(8)的重組載體導(dǎo)入宿主而成。上述(9)的轉(zhuǎn)化體可以是宿主為土壤桿菌的轉(zhuǎn)化體。(10)轉(zhuǎn)化高等植物，其中，上述(6)或(7)的基因被導(dǎo)入到植物基因組中。上述(10)的轉(zhuǎn)化高等植物優(yōu)選在植物細(xì)胞葉綠體類嚢體腔中具有細(xì)胞色素C"圖l是表示葉綠體類嚢體膜的光合作用電子傳遞系統(tǒng)的圖。圖2是表示本發(fā)明的經(jīng)由土壤桿菌的細(xì)胞色素"基因?qū)牒椭参飪?nèi)細(xì)胞色素C6表達(dá)方式的模式圖。圖3是表示藍(lán)細(xì)菌和藻類與高等植物間電子傳遞系統(tǒng)的區(qū)別的圖。圖4是表示條斑紫菜(Porphyrayezoensis)細(xì)胞色素"的cDNA堿基序列以及推定的氨基酸序列的圖。圖5是表示通過PCR擴(kuò)增條斑紫菜細(xì)胞色素C6基因的成熟蛋白質(zhì)區(qū)的結(jié)果圖。圖6是表示在植物導(dǎo)入用細(xì)胞色素C6基因的構(gòu)建中使用的pBluescriptIISK+A栽體的圖。圖7是表示來自擬南芥(Arabidopsisthaliana)的質(zhì)體藍(lán)素的信號肽和來自條斑紫菜的細(xì)胞色素C6成熟蛋白質(zhì)區(qū)融合得到的基因堿基序列和推定的氨基酸序列的圖。圖8是表示通過三親本雜交進(jìn)行的根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的轉(zhuǎn)化法的模式圖。圖9是表示通過PCR確定導(dǎo)入到植物中的細(xì)胞色素C6基因的電泳結(jié)果圖。(A)是使用基因組DNA作為模板時(shí)的結(jié)果，(B)是使用總RNA作為模板時(shí)的結(jié)果。圖10是表示通過電泳確定在植物內(nèi)表達(dá)的細(xì)胞色素C6的結(jié)果圖。(A)是CBB染色的結(jié)果，(B)是與細(xì)胞色素c6抗體反應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。圖ll是表示伴隨生長天數(shù)的增加，野生型(O)和轉(zhuǎn)化擬南芥(，)的高度的變化圖。圖的各數(shù)值表示平均土S.D.(標(biāo)準(zhǔn)偏差)(n-20)。星號(*)表示在5%顯著水平下可見顯著差異的值。圖12是表示伴隨生長天數(shù)的增加，野生型(0)和轉(zhuǎn)化擬南芥(*)的根長的變化圖。圖表的各值表示平均土S.D.(標(biāo)準(zhǔn)偏差)(1^20)。星號(*)表示在5%顯著水平下可見顯著差異的值。圖13是表示伴隨生長天數(shù)的增加，野生型(O)和轉(zhuǎn)化擬南芥(，)的葉的大小的變化圖。圖的各值表示平均土S.D.(標(biāo)準(zhǔn)偏差)(n-20)。星號(*)表示在5%顯著水平下可見顯著差異的值。圖14是表示伴隨生長天數(shù)的增加，野生型和轉(zhuǎn)化擬南芥在光照射3小時(shí)后葉綠素含量變化的圖。圖的各值表示平均±S.D.(標(biāo)準(zhǔn)偏差)(11=8)。星號(*)表示在5%顯著水平下可見顯著差異的值。圖15是表示伴隨生長天數(shù)的增加，野生型和轉(zhuǎn)化擬南芥在光照射3小時(shí)后ATP含量變化的圖。圖的各值表示平均土S.D.(標(biāo)準(zhǔn)偏差)(n-8)。星號(*)表示在5%顯著水平下可見顯著差異的值。圖16是表示伴隨生長天數(shù)的增加，野生型和轉(zhuǎn)化擬南芥在光照射3小時(shí)后NADPH含量變化的圖。圖的各值表示平均±S.D.(標(biāo)準(zhǔn)偏差)(11=8)。星號(*)表示在5°/。顯著水平下可見顯著差異的值。圖17是表示伴隨生長天數(shù)的增加，野生型和轉(zhuǎn)化擬南芥在光照射3小時(shí)后二氧化碳同化能力的變化圖。圖的各值表示平均±S.D.(標(biāo)準(zhǔn)偏差)(11=10)。星號(*)表示在5%顯著水平下可見顯著差異的值。圖18是表示伴隨生長天數(shù)的增加，野生型和轉(zhuǎn)化擬南芥在光照射3小時(shí)后淀粉量的變化圖。圖的各值表示平均土S.D.(標(biāo)準(zhǔn)偏差)(n-10)。星號(*)表示在5%顯著水平下可見顯著差異的值。圖19是表示伴隨生長天數(shù)的增加，野生型和轉(zhuǎn)化擬南芥在光照射3小時(shí)后蛋白質(zhì)量變化的圖。圖的各值表示平均±S.D.(標(biāo)準(zhǔn)偏差)(11=8).星號(*)表示在5%顯著水平下可見顯著差異的值。具體實(shí)施方式以下對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明的范圍并不受限于這些說明，對于以下所列舉的內(nèi)容以外的內(nèi)容，可以在不損害本發(fā)明宗旨的范圍適當(dāng)變更實(shí)施。本說明書包含本申請優(yōu)先權(quán)主張的基礎(chǔ)-日本特愿2005-27012號說明書整體。本說明書中所引用的全部現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)、以及公開公報(bào)、專利公報(bào)及其它專利文獻(xiàn)可作為參考引入本說明書中。1.本發(fā)明的概要本發(fā)明涉及將編碼細(xì)胞色素C6與信號肽的融合蛋白的基因?qū)敫叩戎参飪?nèi)，使發(fā)揮光合作用光反應(yīng)電子傳遞體作用的細(xì)胞色素C6在高等植物細(xì)胞內(nèi)的葉綠體類嚢體腔中表達(dá)，且發(fā)揮功能，由此促進(jìn)高等植物生長的方法(圖2)。根據(jù)本發(fā)明，高等植物細(xì)胞內(nèi)的ATP、NADPH、淀粉和蛋白質(zhì)的合成得到促進(jìn)，與其相伴，將二氧化碳(C02)轉(zhuǎn)換為碳水化合物的光合作用暗反應(yīng)(固碳反應(yīng))也得到促進(jìn)。本發(fā)明包含上述促進(jìn)高等植物中ATP等的合成或固碳的方法，還包含可促進(jìn)生長、促進(jìn)ATP等的合成、以及促進(jìn)固碳的高等植物的制作方法。通常，在光合作用光反應(yīng)(光合作用電子傳遞反應(yīng))中，葉綠素的電子獲得太陽光的能量，使類嚢體腔內(nèi)(類嚢體膜中)的電子傳遞鏈依次轉(zhuǎn)移，此時(shí)，葉綠素由水獲得電子，使氧(02)游離，伴隨上述電子傳遞反應(yīng)，經(jīng)由類嚢體膜吸收H+，并通過由此產(chǎn)生的質(zhì)子的驅(qū)動(dòng)力，在葉綠體基質(zhì)內(nèi)合成ATP。一系列反應(yīng)的結(jié)果是入0+(與H+—起)接受高能量電子，合成NADPH。與此相對，在光合作用的暗反應(yīng)(固碳反應(yīng))中，在光合作用光反應(yīng)中合成的ATP和NADPH分別作為能量來源和還原力發(fā)揮作用，由此在葉綠體基質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)中，C02轉(zhuǎn)化成碳水化合物。通過該固碳反應(yīng)，在植物的葉等中合成蔗糖。蔗糖被轉(zhuǎn)運(yùn)到其它組織中，作為各種有機(jī)分子的合成材料、繼而作為植物自身生長所需的能量來源使用。通常，高等植物的光合作用光反應(yīng)的電子傳遞體(電子傳遞蛋白)是質(zhì)體藍(lán)素(PC)，關(guān)于電子傳遞能力(氧化還原電位的高低)，已知作為藻類的電子傳遞體的細(xì)胞色素C6明顯優(yōu)異(圖3)。因此，以往為了使該細(xì)胞色素"在高等植物內(nèi)表達(dá)或發(fā)揮功能，從而促進(jìn)光合作用光反應(yīng)和暗反應(yīng)，作了各種嘗試。但是，上述嘗試在實(shí)際應(yīng)用時(shí)極為困難，目前尚未有成功的例子。高等植物中，為了使基于細(xì)胞內(nèi)的基因組信息而表達(dá)的蛋白質(zhì)發(fā)揮光合作用光反應(yīng)電子傳遞體的功能，存在于類嚢體腔中是必須條件。為此，通常需要通過"葉綠體被膜"和"類嚢體膜"兩種膜。這一點(diǎn)是細(xì)胞色素C6在高等植物中表達(dá)功能極為困難的主要原因。因此，本發(fā)明人通過基因重組技術(shù)，將細(xì)胞色素C6基因?qū)敫叩戎参锏幕蚪M中時(shí)，在構(gòu)建了預(yù)先附加有信號肽序列的基因的基礎(chǔ)上進(jìn)行上述導(dǎo)入，使細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)以附加有特定的信號肽(特定長度或特定氨基酸序列的信號肽)的融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果，導(dǎo)入該基因而制作的植物體中，可見在類嚢體腔中有細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)(沒有信號肽)的存在，結(jié)果顯示，表達(dá)的融合蛋白通過其信號肽的作用，可通過上述兩種膜，從而完成了本發(fā)明。(1)PYC6基因?qū)胂到y(tǒng)的研究目前已知PYC6的氧化還原電位是高電位，另外，該P(yáng)YC6基因序列已經(jīng)解明。本發(fā)明中，首先將PYC6基因連接到雙元載體("^于U^^夕夕^)上，制備轉(zhuǎn)化用土壤桿菌。擬南芥(Arabidopsisthaliana)在播種后進(jìn)行低溫處理，然后在長日照條件下生長，在抽苔(抽臺(tái))階段通過減壓浸潤進(jìn)行轉(zhuǎn)化。接著對所得轉(zhuǎn)化物進(jìn)行基因?qū)牒捅磉_(dá)的分析，以從植物體提取的基因組DNA和RNA作為模板，分別進(jìn)行PCR、RT-PCR。結(jié)果，可見PYC6基因的擴(kuò)增，通過DNA測序儀確認(rèn)該堿基序列與PYC6基因相同。接著，為了分析轉(zhuǎn)化體中確認(rèn)的PYC6基因是否作為蛋白質(zhì)表達(dá)，從植物體提取葉綠體蛋白質(zhì)級分，進(jìn)行電泳，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。結(jié)果確認(rèn)了PYC6蛋白質(zhì)的表達(dá)。另外，對所得轉(zhuǎn)化體中的PYC6蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果，與導(dǎo)入的PYC6氨基酸序列(PIRaccessionNo.:JC5849)—致。該結(jié)果表明，在高等植物A.thaliana內(nèi)成功地表達(dá)了來自藻類的cytc6(PYC6)。(2)PYC6導(dǎo)入對植物體的影響如后述實(shí)施例所示，觀察導(dǎo)入PYC6的植物的生長，發(fā)現(xiàn)葉的大小比野生型(WT)增大約1.2-1.3倍，高度增大約1.5倍。導(dǎo)入PYC6的植物在生長初期階段與WT比較，生長速度提高。對導(dǎo)入PYC6的植物中的葉綠素量進(jìn)行測定，結(jié)果為WT的大約1.1-1.2倍。該通過導(dǎo)入PYC6而在植物體中觀察到的現(xiàn)象的原因推測可能是由于利用了作為光反應(yīng)最終產(chǎn)物的能量物質(zhì)，光合作用的反應(yīng)整體活化。為此，通過螢光素■螢光素酶法對導(dǎo)入PYC6的植物的ATP量進(jìn)行測定，結(jié)果與WT比較，約增大1.7倍。這被認(rèn)為是由于除了在擬南芥(A.thaliana)中發(fā)揮功能的質(zhì)體藍(lán)素之外，紅藻CytC6作為新的電子傳遞體發(fā)揮了功能，由此光反應(yīng)的電子傳遞被活化，其最終產(chǎn)物ATP量增加，并且植物整體的生長被活化。該融合蛋白通過上述兩種膜時(shí)，在通過第一膜(葉綠體被膜)時(shí)使用了信號肽的一部分，在通過第二膜(類嚢體膜)時(shí)使用了其余的部分，分別使用后脫離，PYC6最終以沒有信號肽的狀態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)到類嚢體腔內(nèi)。該轉(zhuǎn)運(yùn)的PYC6蛋白質(zhì)在該類嚢體腔內(nèi)與血紅素(、厶)(血紅素c)結(jié)合，且通過折疊，形成可發(fā)揮電子傳遞體功能的細(xì)胞色素C6。2.新型高等植物的制作方法本發(fā)明的制作方法如上所述，是在葉綠體的類嚢體腔內(nèi)具有細(xì)胞色素C6的新型高等植物的制作方法，該方法的特征在于將編碼融合蛋白的基因?qū)氲礁叩戎参锏幕蚪M中，其中所述融合蛋白是細(xì)胞色素"蛋白質(zhì)上附加有50-80個(gè)氨基酸殘基的信號肽的融合蛋白。(1)作為制作對象的高等植物可在本發(fā)明的制作方法中使用的高等植物、即可轉(zhuǎn)化為在葉綠體的類嚢體腔內(nèi)具有細(xì)胞色素C6的高等植物并沒有限定，例如可以是以下高等植物。本發(fā)明中，作為對象的植物是指植物整體、植物器官(例如葉、花瓣、莖、根、種子等)、植物組織(例如表皮、韌皮部、薄壁組織、木質(zhì)部、維管束、柵欄組織、海綿組織等)或植物培養(yǎng)細(xì)胞(包含愈傷組織等的組織培養(yǎng))的任意一種。轉(zhuǎn)化使用的植物包括C3、C4、CAM植物和它們的中間植物等，例如有屬于十字花科、茄科、禾本科、豆科、藜科、薔薇科、菊科、百合科、石竹科、葫蘆科、旋花科、莧科、鳳梨科、仙人掌科和聲薈科等的植物(包含果實(shí)、蔬菜、花卉等)(參照下述)，但并不限于這些植物。[C3植物十字花科擬南芥(Arabidopsisthaliana)、蘿卜(Raphanus)等.茄科煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanum)等.禾本科水稻(Oryzasativa)、玉米(zeamays)、小麥(Triticun)等豆科大豆(Glycinemax)、豌豆(Pisum)等-藜科菠菜(Spinacia)等.薔薇科山櫻(Prunus)、薔薇(Rosa)等菊科一年蓬(飛蓬屬)、蒲公英(Taraxacun)等-葫蘆科南瓜(Cucurdida)、黃瓜(Cucumis)等-旋花科紅薯(Ipomea)等-蘭科羽蝶蘭(Poneorchis)等[C4植物禾本科玉米(Zeamays)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、谷子(Setariaitarica)等莧科尾穗莧(Amaranthaceae)等[CAM植物鳳梨科菠蘿(Ananascomosus)等.仙人掌科翠冠玉(，7-—廿)(Lophophoradifusa)、仙人掌屬(Opuntiaspp.)等，薈科木立，薈(Aloearborescens)、蘆薈(Aloevera)等[C3-C4中間植物-蕃杏科輪生粟米草(Mollugoverticillata)等禾本科黍子(Panicummilioides)等其中，作為本發(fā)明的制作方法的效果，從可獲得促進(jìn)生長效果高的植物考慮，例如對于市場性高的植物本發(fā)明的利用價(jià)值高，具體優(yōu)選列舉食葉植物(菠菜、巻心菜等)、賞花植物(薔薇、蝴蝶蘭等)、食莖植物(馬鈴薯、藕等)、食根植物(牛蒡、蘿卜等)、谷物(水稻、小麥等)、果實(shí)植物(菠蘿、葡萄等)、觀賞植物(松樹、楓樹等)、木材(杉樹、柏樹等)等。(2)融合蛋白本發(fā)明的制作方法中，向高等植物的基因組中導(dǎo)入編碼特定融合蛋白的基因，該融合蛋白是在細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)上附加有特定長度的信號肽的融合蛋白，這是非常重要的。對于上述融合蛋白，信號肽的長度為50-80個(gè)氨基酸殘基是重要的。這樣，由于信號肽足夠長，因此細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)葉綠體被膜和類嚢體膜均可通過。信號肽的序列通過由高等植物進(jìn)行基因克隆來確定。上述融合蛋白中的信號肽通常優(yōu)選附加在細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)的N末端。本發(fā)明中，上述融合蛋白例如優(yōu)選為以下(a)、(b)、(c)或(d)的蛋白質(zhì)。(a)含有SEQIDNO.:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)(b)含有下述氨基酸序列，且具有通過高等植物的葉綠體被膜和類嚢體膜能力的蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸序列為SEQIDNO.2所示氨基酸序列中的相當(dāng)于上述信號肽的氨基酸序列有l(wèi)或多個(gè)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列(c)含有下述氨基酸序列，且具有電子傳遞能力的蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸序列為SEQIDNO,2所示氨基酸序列中的相當(dāng)于上述細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)的氨基酸序列有1或多個(gè)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列(d)含有下述氨基酸序列，且具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力，以及電子傳遞能力的蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸序列為SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相當(dāng)于上述信號肽的氨基酸序列和相當(dāng)于上述細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別有1或多個(gè)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列上述(a)的蛋白質(zhì)如SEQIDN0.2所示，是共含有157個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該157個(gè)氨基酸是在含有構(gòu)成細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)的85個(gè)氨基酸(SEQIDN0.6)的序列的N末端一側(cè)附加(連接)含有構(gòu)成信號肽的72個(gè)氨基酸(SEQIDN0.4)的序列而成的；也可以是含有SEQIDN0.2所示氨基酸序列的融合蛋白。信號肽并不限于上述72個(gè)。這里，對細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)的來源沒有特別限定，可以使用紅藻(Porphyrayezoensis,條斑紫菜)、藍(lán)藻、褐藻、硅藻和綠藻等，優(yōu)選來自紅藻(P.yezoensis)的蛋白質(zhì)。來自P.yezoensis的細(xì)胞色素c^蛋白質(zhì)的氨基酸序列是公知的(PIRaccessionNo.:JC5849)，可通過數(shù)據(jù)庫檢索獲得。上述(b)的蛋白質(zhì)只要是含有下述氨基酸序列，且具有通過高等植物的葉綠體被膜和類嚢體膜的能力即可，沒有限定，所述氨基酸序列為構(gòu)成上述(a)的蛋白質(zhì)的全部氨基酸序列中的相當(dāng)于上述信號肽的72個(gè)氨基酸序列(SEQIDNO.4)有l(wèi)或多個(gè)(例如l個(gè)-10個(gè)左右，優(yōu)選l個(gè)-5個(gè)左右)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列。上述(b)的蛋白質(zhì)與上述(a)的蛋白質(zhì)同樣，是具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力的蛋白質(zhì)，這點(diǎn)是^f艮重要的，因此優(yōu)選第53號-第72號的氨基酸等被認(rèn)為是對通過上述葉綠體被膜或類嚢體膜重要的部分的氨基酸序列不被從上述(a)蛋白質(zhì)的氨基酸序列中突變置換。上述(c)的蛋白質(zhì)只要是含有下述氨基酸序列、且具有(光合作用光反應(yīng))電子傳遞能力的蛋白質(zhì)即可，沒有限定，所述氨基酸序列為構(gòu)成上述(a)的蛋白質(zhì)的全部氨基酸序列中的相當(dāng)于上述細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)的85個(gè)氨基酸序列(SEQIDNO.2)有l(wèi)個(gè)或多個(gè)(例如l個(gè)-10個(gè)左右，優(yōu)選l個(gè)-5個(gè)左右)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列。這里，上述"具有電子傳遞能力的蛋白質(zhì)"在本發(fā)明中是指含有氨基酸序列的氨基酸序列的i白;，是指在與血紅"^(血紅素，)結(jié)合后具有電子傳遞能力的蛋白質(zhì)。上述(C)的蛋白質(zhì)與細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)同樣，是具有電子傳遞能力的蛋白質(zhì)，這是非常重要的，因此，優(yōu)選例如第14號-第18號氨基酸、以及第47號-第60號氨基酸等被認(rèn)為對于在高等植物的光合作用光反應(yīng)中發(fā)揮電子傳遞功能而言重要的部分的氨基酸序列不被從上述(a)蛋白質(zhì)的氨基酸序列中突變置換。上迷(d)的蛋白質(zhì)只要是含有下述氨基酸序列，且有通過高等植物的葉綠體被膜和類嚢體膜的能力，以及(光合作用光反應(yīng))電子傳遞能力即可，沒有限定，所述氨基酸序列為構(gòu)成上述(a)的蛋白質(zhì)的全部氨基酸序列中的相當(dāng)于上述信號肽的72個(gè)氨基酸序列(SEQIDN0.4)有1個(gè)或多個(gè)(例如1個(gè)-10個(gè)左右、優(yōu)選l個(gè)-5個(gè)左右)氨基酸缺失、置換或附加，而且相當(dāng)于上述細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)的85個(gè)氨基酸序列(SEQIDN0.6)有l(wèi)個(gè)或多個(gè)(例如1個(gè)-10個(gè)左右、優(yōu)選l個(gè)-5個(gè)左右)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列。這里，上述"具有電子傳遞能力的蛋白質(zhì)"的含義與上述(c)蛋白質(zhì)的情形相同。上迷(d)的蛋白質(zhì)與上述(a)的蛋白質(zhì)同樣，是具有通過高等植物的葉綠體被膜和類嚢體膜能力的蛋白質(zhì)，除此之外，還與細(xì)胞色素"蛋白質(zhì)同樣，是具有電子傳遞能力的蛋白質(zhì)，這也是非常重要的，因此，優(yōu)選例如第53號-第72號的氨基酸等被認(rèn)為對通過上述葉綠體被膜或類嚢體膜而言重要的部分的氨基酸序列、第14號-第18號氨基酸和笫47號-第60號氨基酸等被認(rèn)為對在高等植物的光合作用光反應(yīng)中發(fā)揮電子傳遞體功能而言重要的氨基酸序列不被從上述(a)蛋白質(zhì)的氨基酸序列中突變置換?？赏ㄟ^立體結(jié)構(gòu)分析和氧化還原電位的測定來確認(rèn)上述(c)和(d)的蛋白質(zhì)是否具有電子傳遞能力，以及具有電子傳遞能力時(shí)進(jìn)行測定。細(xì)胞色素C6的氧化還原電位大約是350-370mV左右。編碼上述SEQIDN0.2所示氨基酸序列有l(wèi)或多個(gè)氨基酸缺失、插入或附加的氨基酸序列的多核苷酸可按照"MolecularCloning,ALaboratoryManual2nded."(ColdSpringHarborPress(1989))、"CurrentProtocolsinMolecularBiology"(JohnWiley&Sons(1987-1997))、Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-92、Kunkel(1988)Method.Enzymol.85:2763-6)等記載的位點(diǎn)專一性誘變法等方法制備。制備編碼上述氨基酸缺失、置換或附加等的突變型的基因時(shí)，例如可通過Kunkel法或缺口雙鏈體法等公知的方法，4吏用利用位點(diǎn)專一性誘變法的突變導(dǎo)入用試劑盒、例如QuikChangeTMSite-DirectedMutagenesisKit(只h歹夕司制)、GeneTailorTMSite-DirectedMutagenesisSystem(47匕*卜口^工7公司制)、TaKaRaSite-DirectedMutagenesisSystem(Mutan-K、Mutan國SuperExpressKm等夕力，,《4才公司制)等進(jìn)行。(3)基因本發(fā)明的制作方法中，向高等植物的基因組中導(dǎo)入的基因是編碼上述融合蛋白的基因，這是很重要的。本發(fā)明中，上述基因例如優(yōu)選是含有下述(a)或(b)的DNA的基因。要說明的是，以下的(a)和(b)的DNA均是上述融合蛋白的結(jié)構(gòu)基因(即，編碼信號肽的基因與細(xì)胞色素C6或與其具有同樣的電子傳遞能力的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因相連接而成的基因)，含有這些DNA的基因可以只含有這些DNA，還可以含有這些DNA作為一部分，除此之外，還可以含有該融合蛋白的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)所必須的公知的堿基序列(轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、SD序列、Kozak^列、終止子等)，沒有限定。編碼細(xì)胞色素C6的堿基序列例如在日本DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ)中已經(jīng)公開發(fā)表，為公知的(accessionnumber:AB40818)。(a)含有SEQIDNO.l所示堿基序列的DNA(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與含有互補(bǔ)堿基序列的DNA雜交的DNA,且是編碼具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力、以及電子傳遞能力的蛋白質(zhì)的DNA，其中所述互補(bǔ)堿基序列是與含有SEQIDNO.1所示堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列。上述(b)的DNA可使用含有上述(a)的DNA或與其互補(bǔ)的堿基序列的DNA、或者它們的片斷作為探針，實(shí)施集落雜交、噬菌斑雜交、以及DNA印跡等公知的雜交方法，由cDNA文庫或基因組文庫獲得。文庫可以利用按照z〉知方法所制備的文庫，也可以利用市售的cDNA文庫或基因組文庫，沒有限定。編碼信號肽部分的堿基序列(SEQIDN0.3)、編碼細(xì)月包色素C6的堿基序列(SEQIDN0.5)兩者或其中一方的一部分可以發(fā)生突變。雜交方法的詳細(xì)步驟可適當(dāng)參照MolecularCloning,ALaboratoryManual2nded.(ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))等，實(shí)施雜交法中，"嚴(yán)謹(jǐn)條件"是指雜交后洗滌時(shí)的條件，是指緩沖液的鹽濃度為15-750mM、溫度為25-65*€，優(yōu)選鹽濃度為15-150mM、溫度為45-55t:的條件。具體來說，可列舉例如50mM、50t)等的條件。并且，除上述鹽濃度、溫度等條件之外，還可以考慮探針濃度、探針長度、反應(yīng)時(shí)間等各條件，適當(dāng)設(shè)定獲得上述(b)的DNA的條件。上述(b)的DNA可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法，使用適當(dāng)?shù)钠瑪嘀苽涮结?，使用該探針，通過集落雜交、噬菌斑雜交、DNA印跡等公知的雜交方法，由cDNA文庫和基因組文庫獲得。上述雜交中，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件例如可列舉lxSSC-2xSSC、0.10/o-0.5。/。SDS以及30lC-80t:的條件，更具體地說可列舉以下條件在60-68X:下進(jìn)行30分鐘以上的預(yù)雜交，然后添加探針，在68C保持1小時(shí)以上，形成雜種，然后在2xSSC、0.:r/。SDS中、在室溫下洗滌5-15分鐘，進(jìn)行l(wèi)-2次。雜交的DNA優(yōu)選為與上述(a)的DNA堿基序列至少具有70%以上同源性的堿基序列，更優(yōu)選80%以上，進(jìn)一步優(yōu)選90/。以上，更進(jìn)一步優(yōu)選95%以上。上述(b)的DNA是編碼具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力以及電子傳遞能力的蛋白質(zhì)的DNA，這是很重要的，因此在考慮翻譯后的氨基酸序列時(shí)，優(yōu)選具有下述堿基序列使例如第53號-第72號氨基酸等被認(rèn)為對通過上述葉綠體被膜或類嚢體膜而言重要的部分的氨基酸序列、或者第14號-第18號氨基酸以及第47號-第60號氨基酸等被認(rèn)為是對在高等植物的光合作用光反應(yīng)中發(fā)揮電子傳遞功能重要的部分的氨基酸序列沒有被從上述(a)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中突變置換的堿基序列。上述(b)的DNA例如并不與上述(a)的DNA完全相同，可優(yōu)選列舉將其中的第103號的堿基由"T(胸腺嘧啶)"置換為"A(腺嘌呤)"，所翻譯的氨基酸由"Ser(絲氨酸)"變異為"Thr(蘇氨酸)"的DNA;第216號的堿基由"C(胞嘧啶)"置換為"T(胸腺嘧啶)"，但所翻譯的氨基酸不變化的DNA;以及將這些堿基置換組合而變異的DNA等。本發(fā)明中，上述基因是在高等植物中表達(dá)，因此與氨基酸對應(yīng)的密碼子必須含有在轉(zhuǎn)錄后顯示通常的植物中使用的密碼子(優(yōu)選使用頻率高的密碼子)的DNA。(4)基因的導(dǎo)入方法不改變高等植物的其它形態(tài)，向其基因組中導(dǎo)入編碼上述融合蛋白的基因(目標(biāo)基因)，制作新型高等植物(轉(zhuǎn)化高等植物)，對該方法沒有特別限定，可以任意采用土壤桿菌法、電穿孔法、以及基因槍法等公知的基因重組技術(shù)。例如優(yōu)選采用導(dǎo)入了含有目標(biāo)基因的雙元載體的土壤桿菌屬細(xì)菌(根癌種病菌(根頭力s厶種病菌))的減壓浸潤法等。以下進(jìn)行詳細(xì)說明。(i)重組栽體對含有編碼上述融合蛋白的基因的重組栽體沒有限定，優(yōu)選可作為上述雙元載體使用的栽體。具體來說，優(yōu)選將要整合入植物基因組中的目標(biāo)基因(取代GUS基因)插入到具有因Vir區(qū)基因的作用而切取的T-DNA區(qū)的載體的該T-DNA區(qū)中，從而構(gòu)建的載體。上述具有T-DNA區(qū)的載體優(yōu)選pBI121載體(Clontech公司制；以卡那霉素耐性基因作為選擇標(biāo)志(選択7—力一)，在35S啟動(dòng)子的下游含有GUS基因)、pBI101栽體(Clontech公司制；以卡那霉素耐性基因作為選擇標(biāo)志，含有GUS基因)等。另外，雖然不能用于減壓浸潤法，但向適合宿主細(xì)胞的公知的表達(dá)載體中插入目標(biāo)基因而構(gòu)建的重組栽體也包含在本發(fā)明的重組載體中。還可根據(jù)需要，通過PCR等，在該基因的上游附加轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或SD序列(宿主為原核細(xì)胞時(shí))或Kozak序列(宿主為真核細(xì)胞時(shí))，在下游附加終止子。上述轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子等融合蛋白表達(dá)所必須的各要素可以含在目標(biāo)基因中，原本含在表達(dá)載體中時(shí)也可以使用其，沒有限定。上述重組栽體例如可以用于上述融合蛋白的大量生產(chǎn)等。這些各種重組載體的制備中，可以適當(dāng)采用使用限制酶的方法、使用拓樸異構(gòu)酶的方法等公知的基因重組技術(shù)和條件等進(jìn)行。(ii)導(dǎo)入重組栽體而成的轉(zhuǎn)化體對導(dǎo)入重組栽體的宿主沒有限定，最終進(jìn)行減壓浸潤法時(shí)，作為導(dǎo)入雙元載體的宿主，可使用土壤桿菌屬細(xì)菌(Agrobacteriumtumefaciens，根癌土壤桿菌等)。使用土壤桿菌屬細(xì)菌時(shí)，通常使用預(yù)先進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的菌體(土壤桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化體)，即，該細(xì)菌原本所具有的Ti質(zhì)粒上的T-DNA區(qū)中的癌基因被破壞或者被除去等。除此之外，作為重組栽體，導(dǎo)入表達(dá)載體時(shí)，可以使用公知的宿主，例如大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、霉菌、人或小鼠等各種動(dòng)物細(xì)胞等。對宿主的轉(zhuǎn)化方法沒有限定，可以考慮宿主與重組栽體的組合，由公知的方法中適當(dāng)選擇實(shí)施。例如可優(yōu)選實(shí)施電穿孔法、脂轉(zhuǎn)染法、熱休克法、PEG法、磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法等。所得轉(zhuǎn)化體中，實(shí)際使用的宿主與重組載體中所含有的EBNA1突變體基因的密碼子型的宿主可以一致，也可以不同，沒有限定。(iii)高等植物的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化高等植物對向高等植物的基因組中導(dǎo)入目標(biāo)基因，制備轉(zhuǎn)化高等植物的方法沒有限定，優(yōu)選上述減壓浸潤法。另外，進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物體的狀態(tài)優(yōu)選使用成體或愈傷組織。通過減壓浸潤法進(jìn)行高等植物的轉(zhuǎn)化的方法，具體如下(a)使含有重組載體(雙元栽體)的轉(zhuǎn)化細(xì)菌(土壤桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化體)感染高等植物的葉片，其中所述重組載體中插入有編碼上述融合蛋白的基因；(b)在含有卡那霉素等抗生素的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(c)形成不定芽愈傷組織，栽培，得到轉(zhuǎn)化高等植物。進(jìn)行減壓浸潤法時(shí)，各處理步驟的方法和處理?xiàng)l件等都可由公知的范圍適當(dāng)選擇進(jìn)行，沒有限定。上述所得到的轉(zhuǎn)化高等植物中，其基因組中導(dǎo)入了編碼上述融合蛋白的基因。以該基因?yàn)榛A(chǔ)表達(dá)的融合蛋白具有上述信號肽，具有通過植物細(xì)胞中的葉綠體被膜和類囊體膜的能力。從而，所得轉(zhuǎn)化高等植物在類嚢體腔內(nèi)具有細(xì)胞色素"(優(yōu)選作為光合作用光反應(yīng)的電子傳遞體的細(xì)胞色素C6)。所得轉(zhuǎn)化高等植物中，作為光合作用光反應(yīng)的電子傳遞體，不僅質(zhì)體藍(lán)素(PC)，細(xì)胞色素C6也發(fā)揮該功能，有效地實(shí)現(xiàn)了促進(jìn)生長。轉(zhuǎn)化高等植物成體的大小(高度、根長、葉的大小等)沒有限定，與野生型相比，例如可以是l.l倍以上，優(yōu)選1.2倍以上，進(jìn)一步優(yōu)選1.5倍以上(例如約1.9倍)。轉(zhuǎn)化高等植物中，與促進(jìn)生長的效果同樣，也可得到使各細(xì)胞中各種分子數(shù)增加的效果。例如葉綠素分子的量與野生型相比例如約為l.l倍以上，優(yōu)選1.2倍以上，進(jìn)一步優(yōu)選1.5倍以上(例如約1.6倍)，光合作用能力進(jìn)一步提高，但并不限于此。所得轉(zhuǎn)化高等植物中，光合作用效率提高，對其產(chǎn)物ATP的合成量沒有限定，與野生型相比例如為l.l倍以上，優(yōu)選1.2倍以上，進(jìn)一步優(yōu)選1.5倍以上(例如約1.7倍)，同樣，對NADPH的合成量沒有限定，與野生型相比例如為l.l倍以上，優(yōu)選1.2倍以上，進(jìn)一步優(yōu)選1.5倍以上(例如約1.7倍)。所得轉(zhuǎn)化高等植物中，由于ATP和NADPH的合成量增加，它們發(fā)揮了能量源或還原力的作用，因此光合作用暗反應(yīng)效率也提高.例如，轉(zhuǎn)化高等植物中，將二氧化碳(C02)轉(zhuǎn)換為碳水化合物的固碳能力與野生型的相比例如為l.l倍以上，優(yōu)選1.2倍以上，進(jìn)一步優(yōu)選1.4倍或以上。并且，所得轉(zhuǎn)化高等植物中，光合作用的光反應(yīng)、暗反應(yīng)效率得到促進(jìn)，由此蛋白質(zhì)合成效率也提高。例如，轉(zhuǎn)化高等植物的蛋白質(zhì)含量例如為l.l倍以上，優(yōu)選1.2倍以上，進(jìn)一步優(yōu)選1.5倍以上。也有望獲得硫酸和硝酸代謝或者各種氨基酸合成、脂類合成量、色素以及花的增加等。所得轉(zhuǎn)化高等植物中，優(yōu)選至少具有一種上述各種作用效果，更優(yōu)選其有兩種以上，進(jìn)一步優(yōu)選具有所有效果。3.高等植物的生長促進(jìn)方法，促進(jìn)ATP、NADPH、淀粉和蛋白質(zhì)合成的方法以及促進(jìn)固碳的方法如上所述，在所得轉(zhuǎn)化高等植物中，可見(i)促進(jìn)生長、(ii)促進(jìn)ATP、NADPH、淀粉和蛋白質(zhì)的合成、以及(iii)促進(jìn)固碳的效果。因此，本發(fā)明也包含高等植物生長促進(jìn)方法，促進(jìn)高等植物的選自ATP、NADPH、淀粉和蛋白質(zhì)中的至少一種的合成的方法，以及高等植物的固碳促進(jìn)方法。這些方法的具體特征是將編碼融合蛋白的基因?qū)敫叩戎参锏幕蚪M中使其表達(dá)，使細(xì)胞色素C6存在于葉綠體的類嚢體腔內(nèi)，其中所述融合蛋白是在細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)上附加有50-80個(gè)氨基酸殘基的信號肽的融合蛋白。這些方法中，對于融合蛋白、編碼該蛋白質(zhì)的基因、該基因向高等植物基因組中導(dǎo)入的方法、以及所得轉(zhuǎn)化高等植物的各種作用效果等均與上述本發(fā)明的高等植物的制作方法中的說明和列舉等同樣。以下給出實(shí)施例，更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限定。[實(shí)施例l]導(dǎo)入用細(xì)胞色素^基因和植物表達(dá)用載體的構(gòu)建(1)來自條斑紫菜的細(xì)胞色素C6成熟蛋白質(zhì)區(qū)基因的制備本實(shí)施例中，通過克隆得到來自條斑紫菜的細(xì)胞色素C6基因，與載體連接，制備質(zhì)粒.以該質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增本說明中的目標(biāo)DNA—來自條斑紫菜的細(xì)胞色素"成熟蛋白質(zhì)區(qū)基因。然后進(jìn)行電泳，通過凝膠提取，提取目標(biāo)基因，然后用限制酶(SacI，Pstl)消化，制備基因。反應(yīng)液按照以下的組成，在0.5ml輔助PCR用離心管(777卜PCR用于二一7，)中制備。模板(質(zhì)粒DNA(細(xì)胞色素Ce全長))1.0"I引物(1)(10pmol/〃D1.0引物(2)(10pmol/"l)1.010xExTaq緩沖液(1^2、1115)(1^2+濃度20mM)2.5"IdNTP混合物(各2.5mM)2.0"IDMSO1.25//1滅菌水16.1"1TaKaRaExTaq(5U///I)0.15"1總體積25.0#1引物(1):PYC6-Oter邁SacI(lOpmol/jil)(30邁er，GC-Cont.:43.3%)5'-GGAGCTCTTACCAACCTTTTTCAGATTGAG-3'(SEQIDNo.7)引物(2):Cyt-SD(10pmol/pl)(29邁er，GOCont,:48.2%)5'-GCGGGGAGAGGTTAAATTGAAGAAGAAGG-3'(SEQIDNo.8)在上述反應(yīng)液中鋪15jil的礦物油。然后用PTC-10()TM可控?zé)嵫h(huán)控制儀(ProgrammableThermalController)進(jìn)4亍反應(yīng)。反應(yīng)是以94"C48秒、62t)48秒、72X:i分24秒的反應(yīng)為一個(gè)循環(huán)，進(jìn)行31個(gè)循環(huán)。反應(yīng)終止后，通過2y。(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行確認(rèn)。向20nl所得PCR產(chǎn)物中加入4fil凝膠加樣緩沖液，制成電泳樣品。電泳是使用電泳緩沖液(lxTBE)，在100V下進(jìn)行30分鐘。電泳終止后，用0.1mg/ml溴化乙錠進(jìn)行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進(jìn)行了脫色的凝膠置于UV透射儀上，用帶有手動(dòng)遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機(jī)記錄在照片上。從2。/。(w/v)瓊脂糖凝膠中切取被認(rèn)為是目標(biāo)DNA的條帶，盡量切細(xì)。然后將該凝膠裝入AmiconUltrafree(注冊商標(biāo))DA中，以7，300rpm、4"C離心10分鐘。離心后，取下UltrafreeMC(上側(cè)的柱部分)，向洗脫出來的溶液中加入等量的TE-飽和苯盼，使用渦流攪拌器(求少??？夕只)進(jìn)行充分?jǐn)嚢琛Ｈ缓笠?4,000rpm、4X:離心10分鐘。將水層轉(zhuǎn)移到新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5Y。乙醇2vo1.。充分?jǐn)嚢?，然后?20t:下放置30分鐘。然后以14，000rpm、4"C離心10分鐘，棄去上清。向沉淀中加入500pl75%乙醇，將沉淀充分洗滌。再以14,000rpm、4"C離心5分鐘，棄去上清。將沉淀風(fēng)干一定程度，然后溶解于50jilTE中。接著，按照下述所示組成，在1.5ml微量離心管中制備樣品，通過在37X:下溫育120分鐘，用限制酶SacI進(jìn)行消化。凝膠提取后樣品5.0#110XL緩沖液2.0/ilSac10.5滅菌水12.5//I總體積20.0jUl向溫育后的樣品溶液中加入等量的TE-飽和苯酚，使用渦流攪拌器充分?jǐn)嚢琛Ｈ缓笠?4，000rpm、4TC離心10分鐘。將水層轉(zhuǎn)移到新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分?jǐn)嚢韬?，?20TC下放置30分鐘。然后以14,000rpm、4"C離心10分鐘，棄去上清。向沉淀中加入500jil75%乙醇，充分洗滌沉淀。再以14,000rpm、4*€離心5分鐘，棄去上清。將沉淀風(fēng)干一定程度，然后溶解于20nl的TE中。接著，按照以下所示組成，在1.5ml微量離心管中制備樣品，通過在37t:下溫育120分鐘，用限制酶PstI進(jìn)行消化。限制酶消化后樣品5.0AM10XH緩沖液2.0Pstl0.5/il滅菌水12.5jul總體積20.0/iI反應(yīng)終止后，通過2。/o(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行確認(rèn)。向20nl所得PCR產(chǎn)物中加入4nl凝膠加樣緩沖液，制成電泳樣品。電泳是使用電泳緩沖液(lxTBE)，在IOOV下進(jìn)行30分鐘。電泳終止后，用0.1mg/ml溴化乙錠進(jìn)行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進(jìn)行了脫色的凝膠置于UV透射儀上，用帶有手動(dòng)遮光革的一次成形(寶麗來)照相機(jī)記錄在照片上。然后，從2。/o(w/v)瓊脂糖凝膠中切取被認(rèn)為是目標(biāo)DNA的條帶，盡量切細(xì)。然后將該凝膠裝入AmiconUltrafree(注冊商標(biāo))DA中，以7，300rpm、4t:離心10分鐘。離心后，取下UltrafreeMC(上側(cè)的柱部分)，向洗脫出來的溶液中加入等量的TE-飽和苯酚，使用渦流攪拌器進(jìn)行充分?jǐn)嚢琛Ｈ缓笠?4,000rpm、4"C離心10分鐘。將水層轉(zhuǎn)移到新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分?jǐn)嚢?，然后?20C下放置30分鐘。然后以14，000rpm、4t:離心10分鐘，棄去上清。向沉淀中加入500jil75%乙醇，將沉淀充分洗滌。再以14,000rpm、4TC離心5分鐘，棄去上清。將沉淀進(jìn)行一定程度的風(fēng)干，然后溶解于20jilTE中。結(jié)果如下所示。以插入了來自條斑紫菜的細(xì)胞色素C6基因(全長)的質(zhì)粒作為模板，通過PCR擴(kuò)增細(xì)胞色素C6成熟蛋白質(zhì)區(qū)(PYC6)基因(圖4)。然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行2。/c(w/v)瓊脂糖凝膠(TBE)電泳，在357bp附近可見單一的條帶(圖5)。該條帶可認(rèn)為是PYC6基因.將該P(yáng)YC6基因用兩種限制酶(SacI、Pstl)消化，進(jìn)行2%(w/v)瓊脂糖凝膠(TBE)電泳，將被認(rèn)為是PYC6基因(保有SacI、PstI位點(diǎn))的265bp附近的條帶從凝膠中提取，用苯酚提取，用乙醇進(jìn)行沉淀，得到保有SacI、Pstl位點(diǎn)的PYC6基因。(2)向細(xì)胞色素C6附加通過葉綠體被膜和類嚢體膜的肽的基因本項(xiàng)中，是將進(jìn)行了BamHI和PstI限制酶處理和脫磷酸化(BAP處理)的通過葉綠體被膜和類嚢體膜的肽的基因、與進(jìn)行了SacI和PstI限制酶處理的來自條斑紫菜的細(xì)胞色素C6成熟蛋白質(zhì)區(qū)的基因進(jìn)行連接。然后與克隆載體(pBluescript(注冊商標(biāo))IISK+)連接，進(jìn)行亞克隆，確認(rèn)植物導(dǎo)入用細(xì)胞色素C6(sp+PYC6)基因的堿基序列。DNA測序時(shí)使用下述通用引物。FITC化通用正向引物(M13Fw引物)(2pmol/iil)5'-GGCCAGGGTTTTGCGAGTCACGAC-3'(SEQIDNo.9)FITC化通用正向引物(M13Rv引物)(2pmol/pl)5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'(SEQIDNo.10)(2-1)植物導(dǎo)入用細(xì)胞色素C6基因的制備按照以下組成制備反應(yīng)液。通過葉綠體被膜和類囊體膜的肽的基因(經(jīng)BAP處理)4.0JLMP.yezoensis細(xì)胞色素ce成熟蛋白質(zhì)區(qū)基因4.0/iI10x連接緩沖液2.0〃I2mg/mlBSA溶液2,5〃I酶溶液(T4DNA連接酶)1.0〃I滅菌水6.5〃I總體積20.0jul將制備的反應(yīng)液在低溫恒溫槽(161C)下溫育過夜，進(jìn)行連接反應(yīng)。接著，向該溶液中加入堿性磷酸酶，進(jìn)行脫磷酸化。按照以下組成，在1.5ml微量離心管中制備樣品，在37X:下溫育3小時(shí)，通過細(xì)菌堿性磷酸酶進(jìn)行脫磷酸化處理。連接后樣品10.0/il10xBAPBuffer10.0#1細(xì)菌堿性褲酸酶(BAP)2.5jUl滅菌水77.5/il總體積100.0jUl向溫育后的樣品溶液中加入等量的PE-飽和苯酚，用渦流攪拌器充分?jǐn)嚢?。然后?4，000rpm、4t:離心10分鐘。將水層轉(zhuǎn)移到新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)l/20vo1.、99.5%乙醇2vol.。充分?jǐn)嚢?，?20t:下放置30分鐘。然后以14，000rpm、4"C離心10分鐘，棄去上清。向沉淀中加入500nl75%乙醇，將沉淀充分洗滌。再以14,000rpm、4"C離心5分鐘，棄去上清，將沉淀風(fēng)干一定程度，然后溶解于20fil的TE中。(2-2)克隆載體pBluescript(注冊商標(biāo))IISK+的制備按照以下組成，在1.5ml微量離心管中制備樣品，通過在37C下溫育5小時(shí)，用限制酶SacI進(jìn)行消化。pBluescriptG主冊商標(biāo))IISK+20//110xL緩沖液5//1Sac12/iI滅菌水23//I總體積50;Ul向溫育后的樣品溶液中加入等量的TE-飽和苯酚，用渦流攪拌器充分?jǐn)嚢琛Ｈ缓笠?4，000rpm、4t:離心10分鐘。將水層轉(zhuǎn)移到新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分?jǐn)嚢韬螅?20"C下放置30分鐘。然后以14，000rpm、4t:離心10分鐘，棄去上清，向沉淀中加入500nl75。/。乙醇，將沉淀充分洗滌。再以14,000rpm、4X:離心5分鐘，棄去上清。將沉淀風(fēng)干一定程度，然后溶解于20jU的TE中。接著，按照以下組成，在1.5ml微量離心管中制備樣品，通過在37t:下溫育5小時(shí)，用限制酶BamHI進(jìn)行消化。限制酶消化后樣品20A<l10xH緩沖液5julBamH12jUl滅菌水23jul總體積50//1反應(yīng)終止后，通過1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行確認(rèn)。向20jd所得PCR產(chǎn)物中加入4nl凝膠加樣緩沖液，制成電泳樣品。電泳是使用電泳緩沖液(lxTAE)，在IOOV下進(jìn)行30分鐘。電泳終止后，用0.1mg/ml溴化乙錠進(jìn)行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進(jìn)行了脫色的凝膠置于UV透射儀上，用帶有手動(dòng)遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機(jī)記錄在照片上。然后，從1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠中切除認(rèn)為是目標(biāo)DNA的條帶，將100jig凝膠換算成100jil，向其中加入3vo1.Nal溶液，充分?jǐn)嚢?，?5TC下溫育5分鐘，使凝膠溶解。向其中加入10nlGLASSMILK，在室溫下劇烈攪拌15分鐘，以14，000rpm、4t:離心5秒鐘，回收沉淀。向該沉淀中加入300(AlNEWWASH,充分?jǐn)嚢韬?，?4,000rpm、4t:離心5秒鐘，回收沉淀。將該操作重復(fù)三次，使所得沉淀干燥，溶解于20nl滅菌水中。然后將溶液轉(zhuǎn)移至0.5ml輔助PCR用離心管中，以14,000rpm、4t:離心30秒鐘。將所得上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)l/20vo1.、99.5%乙醇2vol.,充分?jǐn)嚢?，然后?20"C下放置30分鐘，然后以14，000rpm、4"C離心10分鐘，棄去上清。向沉淀中加入500^175%乙醇，將沉淀充分洗滌。再以14,000rpm、4t:離心5分鐘，棄去上清。將沉淀風(fēng)干一定程度，然后溶解于20jil的TE中，(2-3)植物導(dǎo)入用細(xì)胞色素C6基因的亞克隆細(xì)胞色素C6基因的亞克隆按照公知方法進(jìn)行(Hanahan，D.，J.Mol.Biol"166(4)，557-580(1983).;中山廣樹等、乂《4才45久卜l^4^'7卜*11遣伝子解析O基礎(chǔ):，秀潤社，83-88(1996))。植物導(dǎo)入用基因和克隆載體按照以下組成制備。導(dǎo)入用細(xì)胞色素c6(BamH1,SacI消化后)(BAP處理)5〃1pBluescript(注冊商標(biāo))11SK+(BamHI,Sac1消化后)5//110X連接緩沖液2/7l2mg/mlBSA溶液2.5#I酶溶液(T4DNA連接酶)11滅菌水4.5〃1總體積20VI將制備的反應(yīng)液在低溫恒溫槽(i6x:)中溫育過夜，進(jìn)行連接反應(yīng)。對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化如下進(jìn)^f于。首先在冰上將150jil感受態(tài)細(xì)胞(DH5a)溶解一定程度，向其中緩慢加入4nl進(jìn)行了連接的反應(yīng)液，用移液器吸頭的尖端輕輕攪拌混合，在冰上放置30分鐘。放置結(jié)束后，在42t:下進(jìn)行20秒鐘的熱休克。然后在冰上靜置3分鐘，在LB-Ampicillin-X-Gal-IPTG板上，按照Vector:Insert-l:l、1:3，使用接種環(huán)(=>>9一^棒)將100ji1、50|11菌體液分別涂抹在整個(gè)板上，在37C下培養(yǎng)過夜。(2-4)通過堿-SDS法制備質(zhì)粒堿-SDS法按照公知的方法進(jìn)行(Weiss.B，等人.，J.Biol.Chem.，243,4543-4555(1968)、Birnboim，H.C.，MethodsEnzymol.，100,243(1983))。即，向1.5ml微量離心管中分別注入1.5ml在3mlLB-氨芐青霉素液體培養(yǎng)基中以200rpm、37*C振蕩培養(yǎng)16小時(shí)得到的菌體液，以6,000rpm、4"C離心10分鐘，用吸氣器吸引上清并除去。向沉淀(菌體)中加入100jd溶液I(50mM葡萄糖、25mMTris國鹽酸(pH8.0)、10mMEDTA)，用渦流攪拌器充分?jǐn)嚢瑁尤?00fi1溶液II，輕輕地顛倒攪拌。在室溫下放置5分鐘后，再加入150(il溶液III(0.2NNaOH-l。/oSDS)，在冰上放置30分鐘，然后加入IOOjil氯仿，以14，000rpm、4"C離心10分鐘。將上清回收到新的管中，向其中加入2倍量的99.5%乙醇，輕輕地顛倒攪拌，在室溫下放置15分鐘。然后加入5001170%乙醇，以14，000rpm、4"C離心10分鐘，將所得沉淀用TOMYMICROVac干燥3-5分鐘，溶解于20ji1TE中。為了確認(rèn)在所得質(zhì)粒中整合了目標(biāo)DNA,按照下述組成，在1.5fi1微量離心管中制備樣品，通過在37"C下溫育120分鐘，用限制酶SacI、BamHI進(jìn)行消化。質(zhì)粒DNA5.0/il10XL緩沖液2.0/ilSacI0.5AHBamHI0.5/il1mgAnlRNaseA0.5/il滅菌水11.5/il總體積20.0/il反應(yīng)終止后，通過2y。(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行確認(rèn)。向10jil所得PCR產(chǎn)物中加入2fil凝膠加樣緩沖液，制成電泳樣品。電泳是使用電泳緩沖液(lxTBE)，在IOOV下進(jìn)行30分鐘。電泳終止后，用0.1mg/ml溴化乙錠進(jìn)行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進(jìn)行了脫色的凝膠置于UV透射儀上，用帶有手動(dòng)遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機(jī)記錄在照片上。結(jié)果，只對整合了目標(biāo)DNA的樣品，從在3mlLB-氨千青霉素液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的殘余的菌體液(1.5ml)中取100Hl，接種于5mlLB-氨芐青霉素液體培養(yǎng)基中，以200rpm、37C振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。(2-5)通過QIAGENSpinMiniprepKit制備質(zhì)粒將在5mlLB-氨節(jié)青霉素液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌體液以6,000rpm、4"C離心10分鐘，用吸氣器吸引上清并除去。向沉淀(菌體)中加入試劑盒(QIAGENSpinMiniprepKit(250)(QIAGEN))中包含的緩沖液P1250ji1，使其充分混懸。QIAGENSpinMiniprepkit(250)(QIAGEN)中含有采集管(Collectiontube)、QIApr印Spin柱、緩沖液P1、緩沖液P2、緩沖液N3、緩沖液PB、緩沖液PE、緩沖液EB。向上述懸浮液中加入250fil緩沖液P2，輕輕地顛倒，攪拌使溶液均勻。再加入350jil緩沖液N3，輕輕地顛倒攪拌，以13，000rpm、4"C離心10分鐘。將這里所得到的上清轉(zhuǎn)移至預(yù)先設(shè)置于采集管的QIApr印Spin柱中，以13，000rpm、4"C離心1分鐘。棄去積在采集管中的濾液，向QIAprepSpin柱中加入500jil的緩沖液PB，以13，000rpm、4"C離心1分鐘，再次棄去濾液。再向QIAprepSpin柱中加入750jil緩沖液PE，以13，000rpm、4E離心1分鐘，棄去濾液，再次以13，000rpm、4*C離心1分鐘，只將QIAprepSpin柱轉(zhuǎn)移至新的1.5ml微量離心管中，向QIAprepSpin柱的中央加入50[il緩沖液EB，在室溫下放置l分鐘，以13，000rpm、4t:離心l分鐘，將該濾液作為質(zhì)粒樣品。為了確認(rèn)所得質(zhì)粒中整合了目標(biāo)DNA，按照以下所示組成，在1.5ml微量離心管中制備樣品，通過在37"C下溫育120分鐘，用限制酶SacI、BamHI進(jìn)行消化。質(zhì)粒DNA5.0//I10XL緩沖液2.0jUlSacl0.5/ilBamHI0.5jUl滅菌水12.0#1總體積20.0反應(yīng)終止后，通過2。/。(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行確認(rèn)。向10jil所得PCR產(chǎn)物中加入2[il凝膠加樣緩沖液，制成電泳樣品。電泳是使用電泳緩沖液(lxTBE)，在IOOV下進(jìn)行30分鐘。電泳終止后，用0.1mg/ml溴化乙錠進(jìn)行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進(jìn)行了脫色的凝膠置于UV透射儀上，用帶有手動(dòng)遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機(jī)記錄在照片上。這里，將整合了目標(biāo)DNA并確認(rèn)其單一性的DNA作為測序樣品。(2-6)通過雙脫氧法確定堿基序列堿基序列的確定使用自動(dòng)測序儀，按照公知的方法(Sanger，F(xiàn).，Sanger,F.，DeterminationofnucleotidesequenceinDNA.，Science,214，1205-1210(1981))確定。堿基序列確定后，《吏用分析軟件GENETYX-MAC進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。(2-7)結(jié)果將進(jìn)行了兩種限制酶(BamHI、PstI)消化和脫磷酸化(BAP處理)的sp基因與進(jìn)行了兩種限制酶(SacI、Pst1)消化的PYC6基因連接，再次進(jìn)行BAP處理，用苯酚提取，用乙醇沉淀，由此可以制備植物導(dǎo)入用細(xì)胞色素"(sp+PYC6)基因。為了確認(rèn)該sp+PYC6基因的堿基序列，將克隆載體pBluescriptIISK+(圖6)用兩種限制酶(BamHI、SacI)消化，將sp+PYC6基因與其連接，進(jìn)行亞克隆，然后通過雙脫氧法進(jìn)行測序，確定sp+PYC6基因的全部堿基序列474bp(圖7)。使用GENETYX-MAC將測序結(jié)果與已知的sp基因與PYC6基因進(jìn)行比較，除信號肽序列中第103號的T(胸腺嘧啶堿基)突變成A(腺嘌呤堿基)之外，其余完全一致。另外，附加到引物序列中的限制酶位點(diǎn)也得到確認(rèn)(圖7)。其中所確認(rèn)的堿基的突變是將所編碼的氨基酸由Ser變成Thr，但其性質(zhì)和分子量均類似，由此導(dǎo)致的二級機(jī)構(gòu)(a螺旋等)沒有變化，對信號肽的通過膜的功能沒有影響，因此可以將該樣品(sp+PYC6)用于以后的實(shí)驗(yàn)。(3)植物導(dǎo)入用細(xì)胞色素C6表達(dá)載體的制備本實(shí)施例中，將確認(rèn)了堿基序列的植物導(dǎo)入用細(xì)胞色素C6(sp+PYC6)基因插入表達(dá)栽體pBI121中，構(gòu)建用于導(dǎo)入植物的細(xì)胞色素C6表達(dá)載體(pBICytc6)。(3-1)植物表達(dá)用載體pBI121的制備在1.5ml微量離心管中制備樣品，使組成如下，通過在37t:溫育5小時(shí)，用限制酶SacI進(jìn)行消化。pB"2120jUl10XL緩沖液5#lSacI滅菌水23jWl總體積50#l向溫育后的樣品溶液中加入等量的PE-飽和苯酚，用渦流攪拌器充分?jǐn)嚢?。然后?4，000rpm、4"C離心10分鐘。將水層轉(zhuǎn)移到新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)l/20vo1.、99.5。/o乙醇2voL。充分?jǐn)嚢韬螅?20"C下放置30分鐘，然后以14，000rpm、4C離心10分鐘，棄去上清。向沉淀中加入500fil75。/o乙醇，將沉淀充分洗滌。再以14,000rpm、4t:離心5分鐘，棄去上清。將沉淀風(fēng)干一定程度，然后溶解于20jil的TE中。接著，在1.5ml微量離心管中制備樣品，使組成如下，通過在37匸溫育5小時(shí)，用限制酶BamHI進(jìn)行消化。限制酶消化后的樣品20jul10xH緩沖液5/ilBamHI2#1滅菌水23/il總體積50/il反應(yīng)終止后，通過1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行確認(rèn)。向20jil所得PCR產(chǎn)物中加入4jil凝膠加樣緩沖液，制成電泳樣品。電泳是4吏用電泳緩沖液(lxTAE)，在IOOV下進(jìn)行30分鐘。電泳終止后，用0.1mg/ml溴化乙錠進(jìn)行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進(jìn)行了脫色的凝膠置于UV透射儀上，用帶有手動(dòng)遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機(jī)記錄在照片上。然后從1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠中切除認(rèn)為是目標(biāo)DNA的條帶，將IOOng凝膠換算成100向其中加入3vo1.Nal溶液，充分?jǐn)嚢?，?51C下溫育5分鐘，使凝膠溶解。向其中加入IOfilGLASSMILK，在室溫下劇烈攪拌15分鐘，以14,000rpm、4"C離心5秒鐘，回收沉淀。向該沉淀中加入300piNEWWASH,充分?jǐn)嚢?，然后?4,000rpm、4TC離心5秒鐘，回收沉淀。將該操作重復(fù)三次，干燥所得沉淀，溶解于20jil滅菌水中。然后將溶液轉(zhuǎn)移至0.5ml輔助PCR用的離心管中，以14，000rpm、4X:離心30秒鐘。將所得上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分?jǐn)嚢?，然后?20t:下放置30分鐘。然后以14，000rpm、4"C離心10分鐘，棄去上清。向沉淀中加入500^1175%乙醇，將沉淀充分洗滌。再以14，000rpm、4"C離心5分鐘，棄去上清。將沉淀風(fēng)干一定程度，然后溶解于20jil的TE中。(3-2)植物表達(dá)用細(xì)胞色素C6表達(dá)載體(pBIcyt")的制備用如上制備的導(dǎo)入用細(xì)胞色素C6(sp+PYC6)基因制備反應(yīng)液，使組成如下。sp+PYC6基因(BamHI,SacI消化后)(BAP處理)4.0j(iIpBI121(BamHI,Sac1消化后)8.0/yI10X連接緩沖液2.0AH2mg/mlBSA溶液2.5"I酶溶液(T4DNA連接酶)1.0jliI滅菌水2.5jul總體積20.0//I將制備的反應(yīng)液在低溫恒溫槽中(161C)溫育過夜，進(jìn)行連接反應(yīng)。結(jié)果如下所示。將確認(rèn)了堿基序列的sp+PYC6基因(BamHI、Sacl消化、BAP處理過的)與用兩種限制酶(BamHI、SacI)消化植物表達(dá)用栽體(pBI121)所得物質(zhì)連接，制備植物導(dǎo)入用細(xì)胞色素C6表達(dá)載體(pBIcytc6)。[實(shí)施例2轉(zhuǎn)化植物(導(dǎo)入細(xì)胞色素q的擬南芥)的制備(1)用于感染植物的根癌土壤桿菌的制備(1-1)導(dǎo)入細(xì)胞色素C6表達(dá)栽體(pBIcytC6)的大腸桿菌的制備本實(shí)施例中，將植物表達(dá)用載體(pBIcytC6)轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌HB101,其中所述植物表達(dá)用栽體中插入了植物導(dǎo)入用細(xì)胞色素C6基因。然后選擇幾個(gè)集落，在3ml的LB-卡那霉素液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過堿-SDS法進(jìn)行質(zhì)粒的制備，確認(rèn)載體的構(gòu)建以及對宿主大腸桿菌HB101轉(zhuǎn)化的有無。如下對大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。首先，在水上將150jil的感受態(tài)細(xì)胞(HB101)溶解一定程度，向其中緩慢加入連接了的反應(yīng)液4jil，用移液器吸頭的先端輕輕攪拌混合，在冰上放置30分鐘。放置結(jié)束后，在42X:下進(jìn)行20秒鐘的熱休克。然后在冰上靜置3分鐘，使用接種環(huán)，在LB-卡那霉素上，分別將100ji1、50nl菌體液涂抹在整個(gè)板上，在37"C下培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后，隨機(jī)挑取20個(gè)克隆轉(zhuǎn)化體(集落)，將該集落接種于3mlLB-卡那霉素培養(yǎng)基中，以200rpm、37t:振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。將各1.5ml培養(yǎng)的菌體液分注到1.5ml微量離心管中，以6，000rpm、4C離心10分鐘，用吸氣器吸引上清并除去。向沉淀(菌體)中加入100nl溶液I(同前)，用渦流攪拌裝置充分?jǐn)嚢瑁尤?00jil溶液II(0.2NaOH-l°/。SDS)，輕輕地顛倒攪拌。在室溫下放置5分鐘后，再加入150jil溶液III(同前)，在水上放置30分鐘，然后加入IOOjil的氯仿，以14,000rpm、4"C離心10分鐘。回收上清，向其中加入2倍量的99.5%乙醇，輕輕地顛倒攪拌，在室溫下放置15分鐘。然后加入500jd的70。/。乙醇，以14，000rpm、4"C離心10分鐘，將所得沉淀用TOMYMICROVac干燥3-5分鐘，溶解于20nlTE中。為了確認(rèn)所得質(zhì)粒中整合了目標(biāo)DNA，在1.5ml微量離心管中制備樣品，使組成如下，通過在37"C下溫育120分鐘，用限制酶BamHI和SacI進(jìn)行消化。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>反應(yīng)終止后，通過1.5"/。(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行確認(rèn)。向10fil所得PCR產(chǎn)物中加入2jil凝膠加樣緩沖液，制成電泳樣品。電泳是使用電泳緩沖液(lxTAE)，在100V下進(jìn)行30分鐘。電泳終止后，用0.1mg/ml溴化乙錠進(jìn)行7分鐘染色，用超純水脫色I(xiàn)O分鐘.將進(jìn)行了脫色的凝膠置于UV透射儀上，用帶有手動(dòng)遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機(jī)記錄在照片上。結(jié)果如下所示。將植物導(dǎo)入用細(xì)胞色素C6表達(dá)載體(pBIcytC6)轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌HBIOI(圖8)。然后隨機(jī)挑取20個(gè)克隆轉(zhuǎn)化體(集落)。結(jié)果，可以確認(rèn)20個(gè)樣品中的3個(gè)克隆在被認(rèn)為是sp+PYC6基因的大小(474bp)附近具有單一條帶。從而顯示，該質(zhì)粒內(nèi)插入了sp+PYC6基因。將保有該質(zhì)粒的大腸桿菌HB101用于以后的實(shí)驗(yàn)。(1-2)轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌的制備和篩選本項(xiàng)中，為了制備向高等植物擬南芥中導(dǎo)入目標(biāo)基因所必須的宿主土壤桿菌(根癌土壤桿菌)，進(jìn)行三者混合培養(yǎng)(三親本雜交(hy^:r^y夕^吖7—>歹))，在所得的轉(zhuǎn)化體中選多個(gè)集落，在3mlLB-卡那霉素液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過堿-SDS法進(jìn)行質(zhì)粒的制備，由此確認(rèn)是否對宿主土壤桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。(1-2-1)各種菌體的培養(yǎng)(a)根癌土壤桿菌(LBA4404^保有pAL4404用白金環(huán)，將菌體的甘油原種(to—少7卜、;/夕)溶液在YEP-鏈霉素瓊脂培養(yǎng)基(板)(30(ig/ml鏈霉素)上，在整個(gè)板上劃線涂布，在301C下培養(yǎng)約40小時(shí)。培養(yǎng)后挑取集落，將該集落在5mlYEP-鏈霉素(:30ng/ml鏈霉素)培養(yǎng)基中，以100rpm、30"€振蕩培養(yǎng)30小時(shí)。(b)大腸桿菌(HBIOI)六保有pRK2013用白金環(huán)將菌體的甘油原種溶液在LB-卡那霉素瓊脂培養(yǎng)基(板)(40嗎/ml卡那霉素)上，在整個(gè)板上劃線涂布，在37r下培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)后挑取集落，將該集落在5mlLB-卡那霉素(40嗎/ml卡那霉素)培養(yǎng)基中，以200rpm、37"C振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。(c)大腸桿菌(HBIOI)A保有pBIcytc6用白金環(huán)將菌體的甘油原種溶液在LB-卡那霉素瓊脂培養(yǎng)基(板)(40ng/ml卡那霉素)上，在整個(gè)板上劃線涂布，在37t:下培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)后挑取集落，將該集落在5mlLB-卡那霉素(40嗎/ml卡那霉素)培養(yǎng)基中，以200rpm、37"C振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。(1-2-2)三親本雜交三親本雜交可按照公知方法進(jìn)行(駒嶺穆、野村港二"生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)法41，，植物細(xì)胞工學(xué)入門，學(xué)會(huì)出版電y夕一，298-302(1998))。即，將在5mlYEP-Sm.液體培養(yǎng)基或LB-Km.液體培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)的三種菌體液(根癌土壤桿菌(LBA4404)頭保有pAL4404、大腸桿菌(HBIOI)*保有pBIcyt&、大腸桿菌(HB101)頭保有pRK2013)以5，000rpm、4"C離心5分鐘，用吸氣器吸引上清并除去。為了進(jìn)行洗滌，將培養(yǎng)時(shí)使用的液體培養(yǎng)基(YEP培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基)加入到沉淀(菌體)中，充分?jǐn)嚢?，再一次?,000rpm、4t:離心5分鐘。離心后，將菌體溶解于培養(yǎng)時(shí)所使用的液體培養(yǎng)基(YEP培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基)3ml中。接著滴加各菌體液各30pl，覆蓋在MinA-卡那霉素瓊脂培養(yǎng)基(板)上，以靜置的狀態(tài)、在30C培養(yǎng)三天。培養(yǎng)后，將在極限培養(yǎng)基(最少培地)MinA-卡那霉素瓊脂培養(yǎng)基(板)上生長的菌體用白金環(huán)全部挑取，將該菌體溶解于IOmMMgSO4200fil。然后用白金環(huán)將該菌體溶液再次在MinA-卡那霉素瓊脂培養(yǎng)基(板)上、在整個(gè)板上劃線涂布，在30"C下培養(yǎng)大約三天。培養(yǎng)后挑取集落，將該集落在5mlYEP-卡那霉素(40嗎/ml卡那霉素)培養(yǎng)基上以200rpm、30"C振蕩培養(yǎng)40小時(shí)。(1-2-3)通過堿-SDS法制備Ti質(zhì)粒將在5mlYEP-卡那霉素(40jig/ml卡那霉素)液體培養(yǎng)基上以200rpm、30t:振蕩培養(yǎng)40小時(shí)的菌體液各1.5ml分注到1.5ml微量離心管中，以5000rpm、4匸離心10分鐘，用吸氣器吸引上清并除去。將lml的S-緩沖液加入到沉淀(菌體)中，用渦流攪拌器充分?jǐn)嚢瑁?，000rpm、4X:離心10分鐘，用吸氣器吸引上清并除去。S-緩沖液如下制備稱量13.512gC6H1206(葡萄糖(M.W.:180.16))，加入12.5ml1MTris-鹽酸(pH8.0)、10ml0.5MEDTA(pH8.0)，用超純水定容為500ml，進(jìn)行高壓釜處理(121t:、IO分鐘)。再向沉淀中加入S-緩沖液IOOnl和10mg/ml溶菌酶5jil，在室溫下放置10分鐘。向其中加入200jil溶液II、30jilTE-飽和苯紛，輕輕地顛倒攪拌。在室溫下放置5分鐘后，再加入150fil溶液III，在-20"C下放置15分鐘，然后以12，000rpm、4t:離心10分鐘。將水層轉(zhuǎn)移到新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分?jǐn)嚢?，然后?20t:下放置30分鐘。然后以14,000rpm、4"C離心10分鐘，棄去上清。向沉淀中加入500nl75。/。乙醇，將沉淀充分洗滌。再以14，000rpm、4匸離心5分鐘，棄去上清。將沉淀進(jìn)行一定程度的風(fēng)干，然后溶解于20nlTE中。向所得質(zhì)粒中加入lmlRNaseA,在37"C下溫育卯分鐘以進(jìn)行RNase處理。反應(yīng)結(jié)束后，通過1.5。/。(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行確i人。向10jil所得PCR產(chǎn)物中加入2nl凝膠加樣緩沖液，制成電泳樣品。電泳是使用電泳緩沖液(lxTAE)在100V下進(jìn)行30分鐘。電泳結(jié)束后，用O.lmg/ml溴化乙錠進(jìn)行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進(jìn)行了脫色的凝膠置于UV透射儀上，用帶有手動(dòng)遮光罩的一次成形(寶麗來)照相才幾記錄在照片上。結(jié)果如下所示。根癌土壤桿菌(LBA4404)在YEP-Sm.培養(yǎng)基中培養(yǎng)，大腸桿菌(HB101)在LB-Km.培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后通過三親本雜交(三者混合培養(yǎng))向根癌土壤桿菌(LBA4404)中導(dǎo)入pBIcytc6，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。接著，隨機(jī)挑取10個(gè)克隆的通過三親本雜交導(dǎo)入了Ti質(zhì)粒(pBIcytc6)的轉(zhuǎn)化體根癌土壤桿菌。將該集落在3mlYEP-Km.培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后通過堿-SDS法制備質(zhì)粒，將其進(jìn)行l(wèi)。/。(w/v)瓊脂糖凝膠(TAE)電泳。結(jié)果，在1個(gè)克隆中，在被認(rèn)為是pBIcytC6大小(13.5kbp)處確i人到條帶。由此顯示，Ti質(zhì)粒(pBIcytC6)導(dǎo)入到轉(zhuǎn)化體根癌土壤桿菌中。(2)轉(zhuǎn)化植物(導(dǎo)入細(xì)胞色素C6的擬南芥)的制備(2-1)擬南芥的栽培將蛭石裝入經(jīng)充分水洗的7.5x7.5圓形盆(pot)中，裝滿至九成。接著，將HYPONeX原液稀釋2，000倍，準(zhǔn)備500ml所得的溶液，然后加入用刀切成厚度為lcm左右的石棉。用鑷子夾取充分含水分而潤濕的石棉，在7.5x7.5圓形盆上各放3個(gè)。將廚房用的濾水三角網(wǎng)袋(三角3一于一0,"y-)裁成可覆蓋盆口的大小，充分水洗，覆蓋盆口，用橡膠圏固定。向該盆中各播種一粒種子。播種種子后，在4TC下進(jìn)行三天低溫處理，低溫處理結(jié)束后，轉(zhuǎn)移至植物培養(yǎng)用光照射培養(yǎng)室內(nèi)，在22"C、長日照條件下栽培。發(fā)芽后，每兩天澆一次水，每周給予一次稀釋l,000倍的HYPONeX作為液體肥料。進(jìn)行適當(dāng)?shù)拈g苗，大約三周后植物體開始抽苔，此時(shí)掐芯，利用竹棍(支柱)支撐生長的植物，待種子完全成熟后采種，在干燥狀態(tài)下保存。(2-2)轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌對植物體的感染接著，為了向高等植物擬南芥(col-O)中導(dǎo)入植物導(dǎo)入用的細(xì)胞色素c6(sp+PYC6基因)，通過土壤桿菌法之一的減壓浸潤法制備轉(zhuǎn)化植物(Bechtold，N.，Pelletier，G.，MethodsinMolecularBiology,82(1998))。具體如下。(2-2-1)根癌土壤桿菌的培養(yǎng)用白金環(huán)，將菌體的甘油原種溶液在MinA-Km.瓊脂培養(yǎng)基(板)(40jig/ml卡那霉素)上，在整個(gè)板上劃線涂布，在30t:下培養(yǎng)約40小時(shí)。培養(yǎng)后挑取集落，將該集落在10mlYEP-Km.(40嗎/ml卡那霉素)培養(yǎng)基中，以200rpm、30"C振蕩培養(yǎng)30小時(shí)(預(yù)培養(yǎng))，將該培養(yǎng)液全量地加入到新的100mlYEP-Km.(40ng/ml卡那霉素)培養(yǎng)基上，再以200rpm、30n振蕩培養(yǎng)30小時(shí)(正式培養(yǎng))，(2-2-2)植物體擬南芥(col-0)的栽培作為進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物使用的擬南芥(col-O)由播種直到采集種子期間的栽培條件如下，低溫處理4t;(暗處)下靜置三天。植物培育溫度22匸照射光長日照條件(100nEmY1)液體肥料HYPONeX(l/l，000倍稀釋)根據(jù)植物個(gè)體而多少有些差異，當(dāng)為野生型植林時(shí)，在播種后7天(包括低溫處理的3天)發(fā)芽，發(fā)芽后20天前后植物抽苔。然后進(jìn)行掐芯處理，5-6天側(cè)枝開始伸長，同時(shí)開始最初開花、結(jié)果.采種是從綠色的角果(§々)變?yōu)闇\茶色、并且開始縱向裂開的之中回收。從一個(gè)角果大約獲得約50粒種子?；厥盏姆N子在播種之前在干燥的狀態(tài)下保存。(2-2-3)對植物體的感染將感染用植物體擬南芥(coI-0)按照上述(2-2-2)所述的方法栽培，培育至開始抽苦。然后，在由莖誘導(dǎo)出莖生葉(莖葉)時(shí)進(jìn)行掐芯，切除已經(jīng)開花、結(jié)果的花。實(shí)驗(yàn)是將該植物體和上述(2-2-l)菌體培養(yǎng)液的準(zhǔn)備調(diào)節(jié)得同步進(jìn)行。首先，在進(jìn)行浸潤操作的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪無塵室抹布(年A夕才》)。接著，將根癌土壤桿菌培養(yǎng)液用浸潤用混懸培養(yǎng)基稀釋大約2/3倍，加入到容量為lL的燒杯中。將該燒杯放在吸引鐘(吸引鐘)內(nèi)，為了使植物體不過分吸收培養(yǎng)混懸液而使其在之前充分吸水，將各個(gè)栽種了剛充分吸水的植物體擬南芥的盆倒放于燒杯上固定，將植物體浸漬在培養(yǎng)混懸液中。在減壓浸潤法中使用的根癌土壤桿菌培養(yǎng)液是使用用浸潤用混懸培養(yǎng)基稀釋約2/3倍，使OD60(^1.2-1.5變?yōu)镺D6Q(H).8的培養(yǎng)液。以減壓浸潤時(shí)間為30秒、l分鐘、5分鐘、IO分鐘進(jìn)行研究，結(jié)果5分鐘最佳。這是由于，減壓浸潤時(shí)間越長，則之后植物體的生長變得越差，處理5分鐘時(shí)，其生長發(fā)育未見顯著惡化，花數(shù)和結(jié)果的角果(種子)數(shù)也與處理l分鐘的沒有大的差異。接著將浸漬在培養(yǎng)混懸液中的植物體放入吸引鐘內(nèi)，通過吸氣器進(jìn)行減壓。減壓結(jié)束后，由吸引鐘內(nèi)取出植物體，用無塵室抹布除去多余的培養(yǎng)混懸液，將該植物體橫放在塑料托盤內(nèi)，向其端部滴加水，蓋上蓋子，在20X:放置2-3天(其間不給予水)。然后將盆扶起，在植物培養(yǎng)用光照射培養(yǎng)箱內(nèi)、在22t:、長日照條件下進(jìn)行通常的栽培。每兩天進(jìn)行一次澆水，作為液體肥料，每周給予一次稀釋l，OOO倍的HYPONeX。進(jìn)行適當(dāng)?shù)拈g苗，大約3周后植物體開始抽莒，掐芯，利用竹棍(支柱)支撐生長的植物體，待種子完全成熟時(shí)進(jìn)行采種，在干燥狀態(tài)下保存。[實(shí)施例3轉(zhuǎn)化植物中的細(xì)胞色素"基因?qū)牒捅磉_(dá)的分析(1)使用PCR法對基因組DNA中的導(dǎo)入基因進(jìn)行分析本實(shí)施例中，由轉(zhuǎn)化體擬南芥中提取基因組DNA，以該基因組DNA為模板，通過PCR確認(rèn)是否有導(dǎo)入基因擴(kuò)增，從而確認(rèn)是否導(dǎo)入到植物體內(nèi)。(1-1)由轉(zhuǎn)化體提取基因組DNA將葉為2-3片左右的轉(zhuǎn)化體擬南芥放入到預(yù)先冷卻的乳缽中，迅速加入液氮，勻漿至植物體呈粉末狀。然后將呈粉末狀的試樣放入1.5ml微量離心管中稱量。向Washbuffer中加入2-巰基乙醇，使終濃度為0.5%,將lml該溶液加入到上迷稱量后的試樣中，充分混合。以12，500rpm、4t:離心10分鐘后，棄去上清。向溶液I中加入2-巰基乙醇，使終濃度為1%，向上述離心沉淀物中加入300fil所得溶液，用渦流攪拌器充分混合。接著加入1%NaBH430fil、溶液II150fil，用渦流攪拌器攪拌數(shù)秒鐘，在50t:溫育10分鐘，向該溶液中加入ISOPLANTII(NIPPONGENE)中含有的100jil溶液III-A和120jil溶液III-B，在冰上放置10分鐘。以12,500rpm、4X:離心10分鐘，回收水相，向其中加入2倍量的99.5%乙醇，立即以8，000rpm、室溫離心l分鐘，棄去上清。再加入lml70°/。乙醇，以8，000rpm、室溫離心l分鐘，棄去上清。將沉淀物風(fēng)干至一定程度，溶解于50jil的TE中。向該溶液中加入1mg/mlRNaseA1Hl，在37"C溫育30分鐘。然后，為了確認(rèn)基因組DNA的提取，向5nl所得基因組DNA中加入1jil凝膠加樣緩沖液，使用3iHindlII作為標(biāo)志、用1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。電泳使用電泳緩沖液(lxTAE)，在100V下進(jìn)行30分鐘。電泳結(jié)束后，用O.lmg/ml溴化乙錠進(jìn)行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進(jìn)行了脫色的凝膠置于UV透射儀上，用帶有手動(dòng)遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機(jī)記錄在照片上。通過電泳確認(rèn)基因組DNA存在后，為了測定其濃度，將基因組DNA溶液稀釋100倍，用分光光度計(jì)進(jìn)行UV測定。根據(jù)計(jì)算的濃度制備基因組DNA溶液，使其濃度為10ng/111，用于今后的實(shí)驗(yàn)。(l畫2)PCRPCR按照公知的方法進(jìn)行(Sambrook，J.D.，W.Russell,MolecularCloning:aLaboratoryManual，3rdedn.CorldSpringHarborLaboratoryPress,CorldSpringHarbor,NewYork)。在0.5ml輔助PCR用離心管中制備以下組成的反應(yīng)液。模板(基因組DNA(10ng))1.0jul引物(1)(10pmol///l)1.0AM引物(3)(10pmol/jul)1.0"I10XExTaq緩沖液(Mg2+plus)(Mg2"濃度20mM)2.5"IdNTP混合物(各2.5mM)2.0//IDMSO1,25"I滅菌水16.1"ITaKaRaExTaq(50,15JUI總體積25'0"1向該反應(yīng)液鋪15(U的礦物油。然后使用PTC-10()TM可控?zé)嵫h(huán)控制儀進(jìn)行反應(yīng)。使用的引物如下。引物(3)ATP-NA1Ba邁(10pmol/pl)(31mer,GC-Cont.:54.8%)5'-GGATGCATGGCCGCAATTACATCAGCTACCG-3'加QIDNo.ll)引物(l)PYC6.C-termSacl(10pmol/pl)(30mer，GOCont.:43.3%)5'-GGAGCTCTTACCAACCTTTTTCAGATTGAG-3'(SEQIDNo.7)FITC化通用正向引物(M13Fw引物)(2pmol/ji1)5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCA(;GAC-3'(SEQIDNo.9)FITC化通用反向引物(M13Rv引物)(2pmol/nl)5'-GAGCGGATAACAATTTCACAC;AGG-3，(SEQIDNo.10)反應(yīng)是在(94XM8秒、64XM8秒、72*Cl分24秒)x31個(gè)循環(huán)的條件下進(jìn)行。反應(yīng)終止后，通過2。/。(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行確i^。向10jil所得PCR產(chǎn)物中加入2nl凝膠加樣緩沖液，制成電泳樣品。電泳是4吏用電泳緩沖液(lxTBE)，在100V下進(jìn)行30分鐘。電泳結(jié)束后，用0.1mg/ml溴化乙錠進(jìn)行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進(jìn)行了脫色的凝膠置于UV透射儀上，用帶有手動(dòng)遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機(jī)記錄在照片上。(1-3)PCR產(chǎn)物的凝膠提取從2。/。(w/v)瓊脂糖凝膠中切取認(rèn)為是目標(biāo)DNA的條帶，盡量切細(xì)。然后將該凝膠裝入AmiconUltrafree(注冊商標(biāo))DA中，以7，300rpm、4"C離心10分鐘。離心后，取下UltrafreeMC(上側(cè)的柱部分)，向洗脫出來的溶液中加入等量的TE-飽和苯酚，使用渦流攪拌器進(jìn)行充分?jǐn)嚢?。然后?4，000rpm、4t:離心10分鐘。將水層轉(zhuǎn)移到新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分?jǐn)嚢?，然后?20C下放置30分鐘。然后以14，000rpm、4TC離心10分鐘，棄去上清。向沉淀中加入500jil75%乙醇，將沉淀充分洗滌。再以14,000rpm、4t:離心5分鐘，棄去上清。將沉淀進(jìn)行一定程度的風(fēng)干，然后溶解于20jilTE中。為了確認(rèn)該溶液中是否有目標(biāo)DNA被單一地提取、純化，進(jìn)行2％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳。向10jil所得樣品中加入2jil凝膠加樣緩沖液，電泳是使用電泳緩沖液(lxTBE)，在IOOV下進(jìn)行30分鐘。電泳結(jié)束后，用0.1mg/ml溴化乙錠進(jìn)行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進(jìn)行了脫色的凝膠置于UV透射儀上，用帶有手動(dòng)遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機(jī)記錄在照片上。(1-4)PCR產(chǎn)物的亞克隆PCR產(chǎn)物的亞克隆按照公知方法進(jìn)行(Hanahan，D.，J.Mol.Biol.，166(4)，557-580(1983).;中山廣樹等乂W才,，7卜1/一亍;yKII遣伝子解析cD基礎(chǔ)，秀潤社，83-88(1996))。將PCR產(chǎn)物調(diào)制成以下組成，<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>將制備的反應(yīng)液在低溫恒溫槽(i6t;)中溫育過夜，進(jìn)行連接反應(yīng)。對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化如下進(jìn)行。首先在冰上將150nl感受態(tài)細(xì)胞(DH5a)溶解一定程度，向其中緩慢加入4nl連接了的反應(yīng)液，用移液器吸頭的先端輕輕攪拌混合，在冰上放置30分鐘。放置結(jié)束后，在42TC進(jìn)行20秒鐘的熱休克。然后在冰上靜置3分鐘，使用接種環(huán)，在LB-Ampicilin-X-Gal畫IPTG板上，按照Vector:insert=1:1、1:3,將IOOjil、50jil菌體液分別涂抹在整個(gè)板上，在37"C下培養(yǎng)過夜。(1-5)利用堿-SDS法制備質(zhì)粒本項(xiàng)中的質(zhì)粒制備按照與實(shí)施例l(2-4)所述內(nèi)容同樣進(jìn)行。(l畫6)通過QIAGENSpinMiniprepKit制備質(zhì)粒本項(xiàng)的質(zhì)粒制備按照與實(shí)施例l(2-5)所述內(nèi)容同樣進(jìn)行。(1-7)雙脫氧法確定堿基序列本項(xiàng)的堿基序列的確定按照與實(shí)施例1(2-6)的方法同樣進(jìn)行。結(jié)果如下所示。使用ISOPLANTII，從轉(zhuǎn)化體擬南芥的2-3片葉中提取純度高的基因組DNA。以該基因組DNA溶液為模板，為了確認(rèn)植物導(dǎo)入用細(xì)胞色素C6基因是否導(dǎo)入，通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因。然后將該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行2。/n(w/v)瓊脂糖凝膠(TBE)電泳，在474bp附近確認(rèn)了單一條帶(圖9)。為了確認(rèn)該擴(kuò)增的基因的堿基序列，在凝膠提取后進(jìn)行亞克隆，通過雙脫氧法進(jìn)行測序，由此確定了擴(kuò)增的基因的全部堿基序列474bp。使用GENETYX-MAC，由該測序結(jié)果與已知的sp基因序列和PYC6基因序列進(jìn)行比較，與導(dǎo)入基因同樣信號肽基因序列中第103號的T(胸腺嘧啶堿基)突變?yōu)锳(腺嘌呤堿基)，除此之外完全一致。以上結(jié)果顯示，植物體(擬南芥)內(nèi)導(dǎo)入了sp+PYC6基因。(2)使用RT-PCR法對總RNA中的表達(dá)基因進(jìn)行分析本項(xiàng)是由轉(zhuǎn)化體擬南芥中提取總RNA，以該總RNA為模板，通過RT-PCR，確認(rèn)是否有導(dǎo)入基因的擴(kuò)增，從而確認(rèn)植物體內(nèi)的基因的表達(dá)。引物(3)ATP.NAlBam(lOpmol/pl)(31mer，GC.Cont.:54.8%)5'-GGATCCATGGCCGCAATTACATCAGCTACCG-3'卿IDNo.8)引物(l)PYC6-Oter邁Sacl(10pmol/pl)(30mer，GOCont.:43.3%)5'-GGAGCTCTTACCAACCTTTTTCAGATTGAG-3'(SEQIDNo.3)FITC化通用正向引物(M13Fw引物)(2p邁ol/pl)5'-CGCCAGGGTTTTCGGAGTCAGGAC-3'(SEQIDNo.6)FITC化通用反向引物(M13Rv引物)(2pmol/ji1)5'-GAGCGGATAACAATTTCACAGAGG-3'(SEQIDNo.7)(2-l)由轉(zhuǎn)化體中提取總RNA由轉(zhuǎn)化體中提取總RNA是使用市售的試劑盒(RNeasyPlantMiniKit(QIAGEN)),按照說明書進(jìn)行。(2-2)PCRPCR按照7i^知方法進(jìn)4亍(Sambrook，J.D"W.Russell,MolecularCloning:aLaboratoryManual,3rdedn.CorldSpringHarborLaboratoryPress,CorldSpringHarbor,NewYork),在0.5ml輔助PCR用離心管中制備以下組成的反應(yīng)液。模板(總RNA(10ng))1.0//1引物(1)(10pmol/jUl)1,0^1引物(3)(10pmol///l)1.0jt/l10xExTaq緩沖液(Mg"plus)(Mg2+濃度20mM)2.5〃ldNTP混合物(各2.5mM)2.0//1DMSO1.25)Ul滅菌水16.1jUlTaKaRaExTaq(5U///I)0.15"I總體積25.0//I向該反應(yīng)液鋪15nl礦物油。然后使用PTC-10()TM可控?zé)嵫h(huán)控制儀進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)終止后，通過2y。(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行確認(rèn)。向ioni所得PCR產(chǎn)物中加入2fil凝膠加樣緩沖液，作為電泳用樣品。電泳是使用電泳緩沖液(lxTBE)，在100V下進(jìn)行30分鐘。電泳終止后，用O.lmg/ml溴化乙錠進(jìn)行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進(jìn)行了脫色的凝膠置于UV透射儀上，用帶有手動(dòng)遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機(jī)記錄在照片上。(2-3)PCR產(chǎn)物的凝膠提取本項(xiàng)中的PCR產(chǎn)物的凝膠提取與實(shí)施例3(l-3)同樣進(jìn)行。(2-4)PCR產(chǎn)物的亞克隆本項(xiàng)中的PCR產(chǎn)物的亞克隆按照實(shí)施例3(l-4)的方法同樣進(jìn)行。(2-5)通過堿-SDS法制備質(zhì)粒本項(xiàng)中的堿-SDS法按照公知方法，與實(shí)施例1(2-4)的方法同樣進(jìn)行(Weiss.B，等人"J.Biol.Chem.，243，4543-4555(1968);Birnboim,H.C"MethodsEnzymol.，100，243(1983))。(2-6)通過QIAGENSpinMiniprepKit制備質(zhì)粒本項(xiàng)中的通過QIAGENSpinMiniprepKit制備質(zhì)粒是與實(shí)施例1(2-5)的方法同樣進(jìn)行。(2-7)通過雙脫氧法確定堿基序列本項(xiàng)中的堿基序列的確定與實(shí)施例1(2-6)的方法同樣進(jìn)行(Sanger,F.，Sanger,F.，DeterminationofnucleotidesequenceinDNA.，Science,214，1205-1210(1981))。(2-8)結(jié)果使用RNeasyPlantMiniKit,從已確認(rèn)導(dǎo)入了基因的轉(zhuǎn)化植物(PYC6導(dǎo)入植物)的2-3片葉中提取表達(dá)的總RNA。以該總RNA溶液為模板，為了確認(rèn)有否sp+PYC6基因的表達(dá)，通過RT-PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因。然后將該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行2。/。(w/v)瓊脂糖凝膠(TBE)電泳，在474bp附近確認(rèn)了單一條帶(圖9)。為了確認(rèn)該擴(kuò)增的基因的堿基序列，在凝膠提取后進(jìn)行亞克隆，通過雙脫氧法進(jìn)行測序，由此確定了擴(kuò)增的基因的全部堿基序列474bp。使用GENETYX-MAC，由該測序結(jié)果與已知的sp基因序列和PYC6基因序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與導(dǎo)入基因同樣信號肽基因序列中第103號的T(胸腺嘧啶堿基)突變?yōu)锳(腺嘌呤堿基)，除此之外完全一致。以上結(jié)果顯示，sp+PYC6基因在植物體(擬南芥)內(nèi)表達(dá)。(3)使用蛋白質(zhì)印跡法對表達(dá)蛋白質(zhì)的分析本項(xiàng)中，由轉(zhuǎn)化體擬南芥中提取葉綠體，確認(rèn)了在由此得到的葉綠體蛋白質(zhì)級分中導(dǎo)入的細(xì)胞色素C6表達(dá)。(3-1)葉綠體級分的制備葉綠體級分按照公知方法制備(中村研三等(監(jiān)修)，植物的蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)手冊(植物0夕^八。夕質(zhì)実験y口卜3—小)，細(xì)胞工學(xué)系列(細(xì)胞工學(xué)^y—X、)第9巻，秀潤社，114-117(1998))。將5-6g左右轉(zhuǎn)化體擬南芥裝入預(yù)先冷卻的乳缽中，迅速加入液氮，勻漿至植物體成粉末狀。然后向粉末狀的試樣中加入20ml冰冷卻的破碎Buffer(破砕Buffer)，充分?jǐn)嚢瑁?層Miracloth(5，夕口只)過濾。將所得濾液轉(zhuǎn)移到15ml容積的Corningtube中，以7,000rpm、4上清。向沉淀中加入5vol.破碎Buffer，混合至均勻，輕輕地倒入預(yù)先加入了10ml30。/o珀可(八。一3—々)的玻璃離心管中，以2,000rpm、4"C離心3分鐘。結(jié)束后除去上清中的珀可，將沉淀用5ml破碎Buffer混合至均勻，再以2,000rpm、4t:離心3分鐘(將該操作重復(fù)兩次)。最后將沉淀溶解于lml破碎Buffer中，將該溶液作為葉綠體級分。(3-2)蛋白質(zhì)印跡向上述(3-l)所得葉綠體級分溶液中加入lmlCelLyticPPlantCellLysis/Extractionreagent,以10，000rpm、4t:離心10分鐘，將所得上清作為葉綠體蛋白質(zhì)提取溶液。向1.5ml微量離心管中加入1fig/nl分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記5fil和超純水5nl，加入葉綠體蛋白質(zhì)提取溶液，分別向管中加入等量的試樣用緩沖液，充分?jǐn)嚢琛⒅苽涞墓茉?0t:下、熱水浴中培養(yǎng)30分鐘，作為電泳用試樣。在電泳槽中加入陽極和陰極電極液、SDS-PAGE凝膠，向孔(Well)中小心加入20jd電泳用試樣，在30V的恒定電壓下將電泳用試樣電泳至分離凝膠的上端，在100V的恒定電壓下，使標(biāo)記由凝膠的下端電泳約5mm左右。電泳過程中，預(yù)先將濾紙各兩張浸漬在印跡緩沖液A、B、C中，將PVDF膜在少量的甲醇中浸漬5秒，再浸漬到印跡C液中。電泳結(jié)束后，將凝膠從玻璃板上取下，浸漬在印跡C液中約5分鐘。在半干印跡裝置中，從下面開始依次重疊兩張A的濾紙、兩張B的濾紙、PVDF膜、凝膠、兩張C的濾紙，設(shè)置后，以60mA的恒定電流轉(zhuǎn)印卯分鐘。印跡結(jié)束后，立即按照以下所示操作進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的操作。(i)將PVDF膜浸在TBS中，振蕩5分鐘(兩次)。(ii)浸漬在含5。/。BSA的TBS中l(wèi)小時(shí)，振蕩過夜。(iii)浸在TBS中，振蕩5分鐘。(iv)浸在st-抗體中，振蕩2小時(shí)。(v)浸在TTBS中，振蕩5分鐘(兩次)。(vi)浸在第二抗體中，振蕩1小時(shí)30分鐘。(vii)浸在TTBS中，振蕩5分鐘(兩次)。(viii)浸在TBS中，振蕩5分鐘(兩次)。(ix)浸在第二抗體展開試劑中，振蕩20分鐘(避光)，(X)用超純水洗滌。(3-3)結(jié)果通過珀可的密度梯度離心，從PYC6導(dǎo)入植物中分離葉綠體級分，將所得葉綠體蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE進(jìn)行電泳，通過分子量進(jìn)行篩分。接著將分離的所有的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，然后使用識(shí)別來自條斑紫菜的細(xì)胞色素C6的第一抗體(兔抗體)和抗兔抗體(第二抗體)進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，可以只在PYC6導(dǎo)入植物中檢測出抗原抗體反應(yīng)(圖10),由以上結(jié)果表明，在PYC6導(dǎo)入植物中導(dǎo)入的PYC6在葉綠體中表達(dá)。(4)表達(dá)的細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列分析本項(xiàng)中，對在上述(3)中顯示抗原抗體反應(yīng)的PYC6蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列進(jìn)行分析，確認(rèn)是否有信號肽的切斷。向上述(3-l)中得到的葉綠體級分溶液中加入lmlCelLyticPPlantCellLysis/Extractionreagent,以10，000rpm、4匸離心10分鐘，將所得上清作為葉綠體蛋白質(zhì)提取溶液。向1.5ml微量離心管中加入1ng/jil分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記5jil和超純水5fil，加入葉綠體蛋白質(zhì)提取溶液，分別向各管中加入等量的試樣用緩沖液，充分?jǐn)嚢?。將制備的管?0"C、熱水浴中培養(yǎng)30分鐘，作為電泳用試樣。在電泳槽中加入陽極和陰極電極液、SDS-PAGE凝膠，向孔中小心加入20fil電泳用試樣，在30V的恒定電壓下將電泳用試樣電泳至分離凝膠的上端，在100V的恒定電壓下使標(biāo)記由凝膠的下端電泳約5mm左右。電泳過程中，預(yù)先將濾紙各兩張浸漬在印跡緩沖液A、B、C中，PVDF膜在少量的曱醇中浸漬5秒，再浸漬到印跡C液中。電泳結(jié)束后，將凝膠從玻璃板上取下，浸漬在印跡C液中約5分鐘。在半干印跡裝置中，從下面開始依次重疊兩張A的濾紙、兩張B的濾紙、PVDF膜、凝膠、兩張C的濾紙，設(shè)置后，以60mA的恒定電流轉(zhuǎn)印90分鐘。印跡結(jié)束后，進(jìn)行CBB染色、脫色操作，將目標(biāo)蛋白質(zhì)部分切成lmmx5mm大小，轉(zhuǎn)移至1.5ml微量離心管中。將其作為測序樣品，用A卯liedBiosystemsProteinSequencer492型進(jìn)行氨基酸序列分析，通過埃德曼法，對與由轉(zhuǎn)化植物得到的與PYC6抗體顯示抗原抗體反應(yīng)的分子量約為9.1kDa的蛋白質(zhì)N末端氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果，該序列是從其N末端笫1個(gè)殘基開始依次為ADLDNGEKVF(SEQIDNo.l2)(參照下表)。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>這與PYC6成熟蛋白質(zhì)區(qū)的N末端氨基酸序列完全一致，表明在植物體內(nèi)進(jìn)行了信號肽的切斷，正確地通過了葉綠體類嚢體膜，在腔內(nèi)一側(cè)表達(dá)。即，由所得轉(zhuǎn)化體中PYC6蛋白質(zhì)N末端氨基酸序列的分析結(jié)果可以證實(shí)，與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)信號被切斷后的成熟區(qū)的氨基酸序列一致，由此表明sp+PYC6基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體中。[實(shí)施例4轉(zhuǎn)化植物的生長發(fā)育測定和表現(xiàn)型(表現(xiàn)型)的觀察(1)生長發(fā)育觀察(高度、根長、葉的大小)本項(xiàng)中，對轉(zhuǎn)化體擬南芥播種后的生長發(fā)育情況進(jìn)行觀察。播種轉(zhuǎn)化體后，每隔10天觀察測定植物體的"高度"、"根長"和"葉的大小"。植物試樣是對野生林和轉(zhuǎn)化體共20個(gè)個(gè)體進(jìn)行，計(jì)算其平均值，通過統(tǒng)計(jì)處理求出顯著差異。對PYC6導(dǎo)入植物的生長(表現(xiàn)型)進(jìn)行觀察，結(jié)果，PYC6導(dǎo)入植物的高度最大比野生型(WT)大1.9倍(播種后40天)，約第60天時(shí)增大1.3倍(圖ll)。根長最大比WT大1.35倍(播種后40天)，約第60天時(shí)增大1.17倍(圖12)。葉的大小最大有1.9倍(播種后40天)的差異，在約第60天增大1.3倍(圖13)。可以認(rèn)為，在這些PYC6導(dǎo)入植物中觀察到的現(xiàn)象是由于植物體內(nèi)的PYC6的表達(dá)，以某種形式激活了對于植物的生長發(fā)育非常重要的光合作用反應(yīng)，由于該影響使植物體的生長發(fā)育速度提高。(2)總?cè)~綠素量的測定本項(xiàng)中，用丙酮從轉(zhuǎn)化體擬南芥中提取總?cè)~綠素，并定量。將轉(zhuǎn)化體擬南芥的葉用葉片打孔采樣器(i;一7Ay亍)采集，稱量。將試樣放入預(yù)先冷卻的乳缽中，迅速加入液氮，勻漿至植物體呈粉末狀。然后向呈粉末狀的試樣中加入80%丙酮，定容至4ml。用分光光度計(jì)UV-VISIBLESPECTROPHOTOMETER測定該溶液在663nm和645nm下的吸光度。將所得663nm和645nm下的吸光值代入以下所示式子中，計(jì)算葉綠素量。總?cè)~綠素量(jig/ml)-8.02xABS(663)+20.21xABS(645)測定PYC6導(dǎo)入植物中的葉綠素量，結(jié)果，在播種后40天-70天期間，比WT增大1.1-1.2倍(圖14)。這可能是由于PYC6的導(dǎo)入使光反應(yīng)活化，由此增大的光反應(yīng)最終產(chǎn)物一能量物質(zhì)(ATP)被用于葉綠素的合成。[實(shí)施例5轉(zhuǎn)化植物的光合作用活性測定(1)方法和結(jié)果分別按以下所示方法測定作為光合作用活性指標(biāo)的三磷酸腺苷(ATP)含量、NADPH量、二氧化碳同化能力、淀粉量和蛋白質(zhì)的量。(1-1)總ATP含量的測定本實(shí)施例中，由轉(zhuǎn)化體擬南芥中提取總ATP，通過螢光素■螢光素酶法進(jìn)行定量。預(yù)先稱量轉(zhuǎn)化體擬南芥的葉。稱量后，裝入預(yù)先冷卻的乳缽中，迅速加入液氮，用乳缽棒勻漿至植物體成粉末狀。然后向粉末狀的試樣中加入2ml0.25M高氯酸，將該溶液回收到15ml容量的Corningtube中。以10，000rpm、4"C離心10分鐘，將所得上清轉(zhuǎn)移到另外的15ml容量Corningtube中，用1NKOH調(diào)節(jié)至pH7.0。制備后，用0.2M磷酸緩沖液(pH7.2)定容至5ml，將其作為ATP提取液。將100nlATP提取液裝入1.5ml微量離心管中，添加20jilENLITEN螢光素酶/螢光素試劑，然后在90秒后用發(fā)光計(jì)(GENELIGHT55)累積計(jì)算10秒鐘內(nèi)反應(yīng)液的發(fā)光強(qiáng)度，由所得的RLU值計(jì)算溶液的ATP濃度，由此換算成單位植物重量的ATP量。結(jié)果，PYC6導(dǎo)入植物的總ATP量最大增大1.93倍(播種后60天X圖15)。這可能是由于PYC6導(dǎo)入植物中，除發(fā)揮功能的質(zhì)體藍(lán)素之外，還有作為新的電子傳遞體的紅藻cyt"(PYC6)發(fā)揮功能，由此光反應(yīng)的電子傳遞被活化，使最終產(chǎn)物ATP的量增加。(1-2)總NADPH含量的測定本實(shí)施例中，由轉(zhuǎn)化體擬南芥中提取總NADPH進(jìn)行定量，預(yù)先稱量轉(zhuǎn)化體擬南芥。然后加入在70t:左右的熱水浴中加溫的O.lNNaOH,用求y卜口少勻漿器破碎。然后轉(zhuǎn)移到冰浴中，加入約2ml的0.1NHC1，調(diào)節(jié)至用pH試紙測pH為7.5。接著加入O.lml甘氨酰甘氨酸緩沖液(pH7.5)，充分?jǐn)嚢瑁D(zhuǎn)移到量筒中測定液量。測定后，轉(zhuǎn)移至15ml容量的Corningtube中，以10，000rpm、4t:離心20分鐘。離心后，將上清回收至15ml容量的Corningtube中，在-80"C下冷卻過夜，溶解后，以10，000rpm、4t:離心20分鐘，用于定量。將IOO.OnlNADPH提取液、346.0fil0.1M甘氨酰甘氨酸緩沖液(pH7.4)、200.0nl0.2M煙酰胺、82.0jd3.2mg/ml吩溱硫酸甲酯(PMS)、67.0fil5mg/ml嚷唑藍(lán)、200jd葡萄糖-6-磷酸二鈉水合物混合，設(shè)置于分光光度計(jì)U3310上，在570nm、25"C下測定。在U3310上安裝溫度控制單元，設(shè)定成25t:。然后每隔30秒測定570nm下的吸光度變化，測定2分鐘。由所得吸光值的差計(jì)算NADPH的量，由其計(jì)算單位植物重量的NADPH量。結(jié)果，導(dǎo)入PYC6植物的總NADPH量在播種后40-70天增大1.2-1.4倍(圖16)。這可能是由于將PYC6導(dǎo)入高等植物，電子比野生型更多地傳遞，最終產(chǎn)物NADPH的量增加。(I-3)二氧化碳同化能力的測定本實(shí)施例中，使用轉(zhuǎn)化體擬南芥的葉測定二氧化碳的同化能力。二氧化碳的同化能力是使用C02氣體分析儀CIRAS-1(小絲工業(yè)制造)進(jìn)行。另外，二氧化碳的供應(yīng)量設(shè)定為350ppm，在飽和光下測定。結(jié)果，PYC6導(dǎo)入植物的二氧化碳同化能力最大增加2.2倍(播種后天)(圖17)。這可能是由于PYC6對高等植物的導(dǎo)入使得ATP或NADPH的量增加，由此利用該能量的暗反應(yīng)(卡爾文本森循環(huán))被活化，二氧化碳的同化能力增加。(1-4)淀粉量的測定本實(shí)施例中，從轉(zhuǎn)化體擬南芥中提取淀粉，進(jìn)行定量。采集植物葉后進(jìn)行干燥(70度、2天)。稱量約5mg放入乳缽中，加入3ml32%高氯酸，用乳缽棒充分破碎。然后全部轉(zhuǎn)移到試管中，在20匸下靜置20分鐘。接著，用6.0cm的WhatmanGF/Agrassfibredisk過濾，向?yàn)V液中加入5ml硤溶液，充分混合，在約4"C靜置30分鐘。然后用1.5cm的WhatmanGF/Agrassfibredisk過濾，使濾器干燥。將干燥的濾器放入試管中，加入4ml0.75M硫酸，在沸騰水浴中溫育30分鐘。然后回收上清，通過苯酚硫酸法進(jìn)行顯色，使用分光光度計(jì)測定485nm下的吸收。結(jié)果，PYC6導(dǎo)入植物的淀粉量在播種后40-70天時(shí)增大1.15-1，25倍(圖18)。這可能是由于向高等植物導(dǎo)入PYC6，C02的同化能力增加，與此相伴，淀粉的合成也得到促進(jìn)。(1-5)蛋白質(zhì)的量的測定本實(shí)施例中，由轉(zhuǎn)化體擬南芥提取蛋白質(zhì)，使用Lowry法進(jìn)行定量。測定植物體的重量并記錄，將適量的植物體放入乳缽中，在液氮下，用乳缽棒充分破碎。恢復(fù)至常溫后，向每lg植物體中加入2mlCelLyticP(Sigma制)，用乳缽棒充分磨碎，轉(zhuǎn)移至試管中。在室溫下顛倒混合15分鐘，然后離心。將該上清作為提取蛋白質(zhì)，接著，制備LowryA液0.1N的氫氧化鈉溶液中加入碳酸鈉，使?jié)舛葹?%;LowryB液0.5%硫酸銅五水合物和1%檸檬酸鈉；LowryC液1N苯酚溶液；LowryD液LowryA液+LowryB液，然后向O.lml提取的蛋白質(zhì)溶液中加入l.OmlLowryD液，用渦流攪拌器進(jìn)行攪拌，然后在30"C下溫育15分鐘。接著加入O.lmlLowryC液，迅速用渦流攪拌器攪拌，然后在30TC下溫育30分鐘，測定770nm下的吸光值。結(jié)果，PYC6導(dǎo)入植物的蛋白質(zhì)量最大增加1.3倍(播種后50天)(圖19)。這可能是由于向高等植物導(dǎo)入PYC6，增產(chǎn)的ATP或NADPH激活了蛋白質(zhì)的合成。(2)考察作為由本發(fā)明得到的認(rèn)識(shí)，PYC6導(dǎo)入植物與WT比較，生長速度提高。推測原因如下由于PYC6導(dǎo)入植物中的ATP和NADPH增加，因此，除了在擬南芥中發(fā)揮功能的質(zhì)體藍(lán)素之外，新導(dǎo)入的電子傳遞體紅藻cytC6也發(fā)揮功能，由此，光反應(yīng)的電子傳遞形成兩個(gè)回路，其最終產(chǎn)物ATP和NADPH的量增加，并且植物整體的生長發(fā)育活化。目前，關(guān)于通過對陸地植物暗反應(yīng)(卡爾文'本森循環(huán))相關(guān)酶的補(bǔ)強(qiáng)來促進(jìn)成份量增加的研究正在進(jìn)行，但象本發(fā)明這樣的使光反應(yīng)活化的例子尚未見到。目前，以發(fā)揮cyt"功能為目的導(dǎo)入植物的例子尚未見到，本發(fā)明的內(nèi)容在其它種類的植物中也可以應(yīng)用，可以說是作為有用的植物生長促進(jìn)方法或植物生產(chǎn)技術(shù)(果實(shí)植物(果実物)、葉片植物(葉物)、鮮花(生花)等)等的基礎(chǔ)的通用性高的發(fā)明。并且，通過利用在植物體內(nèi)增產(chǎn)的ATP和NADPH,其它物質(zhì)代謝也被活化，在污染物(C02等)的除去方法領(lǐng)域中也極為有效。產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明可提供在葉綠體的類嚢體腔內(nèi)具有細(xì)胞色素C6的新型高等植物的制作方法，進(jìn)而提供高等植物的生長促進(jìn)方法，促進(jìn)ATP、NADPH、淀粉和蛋白質(zhì)合成的方法，以及促進(jìn)固碳的方法，本發(fā)明還提供可以轉(zhuǎn)運(yùn)至葉綠體類囊體腔內(nèi)的、附加有信號肽的細(xì)胞色素"蛋白質(zhì)，編碼該蛋白質(zhì)的基因，含有該基因的重組載體，含有該重組栽體的轉(zhuǎn)化體，以及該基因?qū)氲街参锘蚪M中得到的轉(zhuǎn)化高等植物。序列表文本SEQIDNo.7:引物SEQIDNo.8:引物SEQIDNo.9:引物SEQIDNo.l0:引物SEQIDNo.ll:引物權(quán)利要求1.葉綠體類囊體腔內(nèi)具有細(xì)胞色素c6的高等植物的制作方法，其特征在于，將編碼融合蛋白的基因?qū)敫叩戎参锏幕蚪M中，其中所述融合蛋白是在細(xì)胞色素c6蛋白質(zhì)上附加有50-80個(gè)氨基酸殘基的信號肽的融合蛋白。2.高等植物的生長促進(jìn)方法，其特征在于，將編碼融合蛋白的基因?qū)敫叩戎参锏幕蚪M中并使其表達(dá)，使細(xì)胞色素C6存在于葉綠體的類嚢體腔內(nèi)，其中所述融合蛋白是在細(xì)胞色素c6蛋白質(zhì)上附加有50-80個(gè)氨基酸殘基的信號肽的融合蛋白。3.促進(jìn)高等植物的選自ATP、NADPH、淀粉和蛋白質(zhì)中的至少一種的合成的方法，其特征在于，將編碼融合蛋白的基因?qū)敫叩戎参锏幕蚪M中并使其表達(dá)，使細(xì)胞色素C6存在于葉綠體類嚢體腔內(nèi)，其中所述融合蛋白是在細(xì)胞色素c"6蛋白質(zhì)上附加有50-80個(gè)氨基酸殘基的信號肽的融合蛋白。4.促進(jìn)高等植物固碳的方法，其特征在于，將編碼融合蛋白的基因?qū)敫叩戎参锏幕蚪M中并使其表達(dá)，使細(xì)胞色素C6存在于葉綠體類嚢體腔內(nèi)，其中所述融合蛋白是在細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)上附加有50-80個(gè)氨基酸殘基的信號肽的融合蛋白。5.權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，上述融合蛋白是以下的(a)、(b)、(c)或(d)的蛋白質(zhì)(a)含有SEQIDNO.:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)(b)含有下述氨基酸序列，且具有通過高等植物的葉綠體被膜和類嚢體膜能力的蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸序列為SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相當(dāng)于上述信號肽的氨基酸序列有l(wèi)或多個(gè)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列；(c)含有下述氨基酸序列，且具有電子傳遞能力的蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸序列為SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相當(dāng)于上述細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)的氨基酸序列有1或多個(gè)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列；(d)含有下述氨基酸序列，且具有通過高等植物的葉綠體被膜和類嚢體膜能力、以及電子傳遞能力的蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列為SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相當(dāng)于上述信號肽的氨基酸序列和相當(dāng)于上述細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別有1或多個(gè)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列。6.權(quán)利要求l-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，上述基因是含有以下(a)或(b)的DNA的基因(a)含有SEQIDNO.l所示堿基序列的DNA(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與含有互補(bǔ)堿基序列的DNA雜交的DNA，且是編碼具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力、以及電子傳遞能力的蛋白質(zhì)的DNA，其中所述互補(bǔ)堿基序列是與含有SEQIDNO.1所示堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列。7.融合蛋白，該融合蛋白是在細(xì)胞色素￡"6蛋白質(zhì)上附加50-80個(gè)氨基酸殘基的信號肽而成的。8.權(quán)利要求7所述的融合蛋白，該融合蛋白是以下(a)、(b)、(c)或(d)的蛋白質(zhì)(a)含有SEQIDNO.!2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)含有下述氨基酸序列，且具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜能力的蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸序列為SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相當(dāng)于上述信號肽的氨基酸序列有l(wèi)或多個(gè)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列；(c)含有下述氨基酸序列，且具有電子傳遞能力的蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸序列為SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相當(dāng)于上述細(xì)胞色素C6蛋白質(zhì)的氨基酸序列有1或多個(gè)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列；(d)含有下述氨基酸序列，且具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜能力、以及電子傳遞能力的蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸序列為SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相當(dāng)于上述信號肽的氨基酸序列和相當(dāng)于上述細(xì)胞色素"蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別有l(wèi)或多個(gè)氨基酸缺失、置換或附加的氨基酸序列。9.基因，該基因編碼權(quán)利要求7或8所述的融合蛋白。10.基因，該基因含有以下(a)或(b)的DNA:(a)含有SEQIDNO.l所示堿基序列的DNA;(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與含有互補(bǔ)堿基序列的DNA雜交的DNA,且是編碼具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力、以及電子傳遞能力的蛋白質(zhì)的DNA，其中所述互補(bǔ)堿基序列是與含有SEQIDNO.1所示堿基序列的DNA互補(bǔ)的堿基序列。11.重組載體，該重組載體含有權(quán)利要求9或10所述的基因。12.轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體是將權(quán)利要求ll所述的重組栽體導(dǎo)入宿主而成。13.權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主為屬于土壤桿菌屬的微生物。14.轉(zhuǎn)化高等植物，其中，權(quán)利要求9或10所述的基因?qū)氲街参锘蚪M中。15.權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)化高等植物，其中，在植物細(xì)胞的葉綠體類嚢體腔中具有細(xì)胞色素C6。全文摘要本發(fā)明提供在葉綠體的內(nèi)囊體腔內(nèi)具有細(xì)胞色素c₆的高等植物的制作方法，其特征在于將編碼融合蛋白的基因?qū)敫叩戎参锏幕蚪M中，其中所述融合蛋白是在細(xì)胞色素c₆蛋白質(zhì)上附加50-80個(gè)氨基酸殘基的信號肽而成。文檔編號C07K19/00GK101111595SQ20068000378公開日2008年1月23日申請日期2006年2月1日優(yōu)先權(quán)日2005年2月2日發(fā)明者中澤愛子,千田浩隆,奧忠武,河內(nèi)隆,西尾俊幸申請人:學(xué)校法人日本大學(xué)