專利名稱：人類抗體和蛋白質的制作方法
人類抗體和蛋白質
本發(fā)明涉及生成抗體和蛋白質，其在最終的抗體或蛋白質分子中結合 了兩個或多個來自人類抗體或蛋白質的氨基酉踏列的片段。尤其是，本發(fā)
明提供了這樣的序列片段組合，以使最終抗體或蛋白質分子中的T細胞 表位數(shù)目得到減少或消除。本發(fā)明尤其涉及生成作為藥劑或體內診斷試劑 在人類中應用的抗體和蛋白質。
過去20年，已經(jīng)在生成作為潛在藥物在人中應用的重組單克隆抗體 中取得了巨大進步。通過嵌合、人源化和噬菌體展示或轉基因小鼠的人類 抗體克隆技術已經(jīng)提供了在施用至人時一般良好耐受的抗體，且比使用非 人類單克隆抗體具有更小的免疫原性。然而，即使當所述抗體的遺傳起源 是人類時，通過這些技術生成的幾種抗體已經(jīng)顯示在患者中引發(fā)免疫原 性。例如，人類抗體Humira⑧在12%的類風濕性關節(jié)炎患者引發(fā)免疫原 性，而人源化抗體CAMPATH⑧在約50°/。的患者中引發(fā)免疫原性。這種免 疫原性的誘導有可能起因于抗體可變區(qū)內存在痕量的非自身氨基酸序列， 在一些情況下，所述非自身氨基酸序列可以形成誘導T細胞反應的T細 胞表位，導致免疫原性。因此，需要改進的技術和抗體組合物，所述抗體 具有高度的人類起源，但盡可能避免形成可能誘導T細胞反應的序列。
在最終抗體分子中結合了兩個或多個來自人類抗體的氨基酸序列片段的 抗體(本文稱為"復合抗體")。
因此，第一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的抗體或其抗原結合片段，其 中所述修飾抗體或抗原結合片段的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)各自由來自 一種或多種其他抗體或抗原結合片段的兩個或多個氨基酸序列片段組成， 從而所述片段既不是完整的CDR也不是完整的框架區(qū)。
在本發(fā)明的上下文中，術語"片段"指抗體分子內存在的連續(xù)的氨基
酸序列，這種片段的大小范圍從2至125個氨基酸長，優(yōu)選從2至31個 氨基酸長，其中這種片段既不是完整的CDR也不是完整的框架區(qū)。為治 療用途，本發(fā)明的復合抗體通常將在所述復合抗體的可變區(qū)結合兩個或多 個來自不同人類抗體的氨基g吏序列片段。尤其是，本發(fā)明涉及復合抗體的 重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)(分別為VH和VL),其中VH和VL各自完全由 來自兩個或多個人類抗體可變區(qū)的序列片段組成，其中復合的VH和VL 通常各自包括人類可變區(qū)序列片段，其位置相應于其起源的人類抗體VH 和VL的位置，例如，所述復合VH序列中的氨基酸1至IO將來源于人 類抗體的氨基酸1至10?；蛘?，不論所述序列在所述起源人類抗體VH 或VL中的位置，所述復合抗體中的人類VH或VL序列的片段可以位于 任何序列位置。例如，如人類單克隆抗體V區(qū)序列的數(shù)據(jù)庫中所提供的，
基酸序列，并可以包括來自具有V區(qū)體細胞突變和其他非種系變異的 親和力成熟的抗體的序列；來自種系V區(qū)的序列；來自人工構建抗體V 區(qū)的序列，所述V區(qū)產生于來自所述物種的抗體的序列片段，所述抗體 例如具有一組固定V區(qū)框架但具有可變CDR的抗體；選自人類抗體文庫 (例如噬菌體展示文庫)的序列；和衍生自轉基因動物的人類抗體序列， 所述動物表達編碼人類抗體或抗體片段的基因。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，通過結合多個人類VH和VL序列片段 于組合物中來構建本發(fā)明的治療用途的復合抗體，所述組合物限制或消除 了最終復合抗體V區(qū)中的人類T細胞表位。
該方面的人類T細胞表位是可以結合人類II類MHC分子并通過呈 遞至CD4+ T細胞來誘導輔助T細胞反應的氨基酸序列。可以選擇在最終 復合抗體中限制或消除了 T細胞表位的人類VH和VL序列片段及片段組 合。其可以通過使用不含T細胞表位的片段(例如來自人類種系序列) 實現(xiàn)，并通過連接相鄰的片段來生成不含T細胞表位的新序列，例如 通過在兩個片段接頭處生成非MHC結合序列，通過生成另一人類種系序 列，或通過生成不誘導輔助T細胞反應的序列，不論是否為非種系序列。
在本發(fā)明的另 一優(yōu)選實施方案中，可以在所述復合抗體分子中增加或
形成其他氨基酸序列，其供給一個或多個調節(jié)T細胞表位("Tr表位")。 為本發(fā)明的目的，Tr表位是刺激CD4+CD25+T細胞的MHC結合肽，所 述細胞通過分泌抑制性細胞因子(例如IL-10和TGF-P)以及接觸依賴性機 制而具有調節(jié)免疫反應的能力。像這樣，在本發(fā)明的范圍內，調節(jié)T細 胞表位可以包括已知在體外或體內誘導一種或多種活性的肽，所述活性可 促進在某些條件下的免疫反應調節(jié)。例如，調節(jié)T細胞表位將包括具 有誘導或激活CD4+ CD25+ T細胞的作用的肽，具有誘導抑制性細胞因子 (如IL-10和/或TGF-p)釋》文的作用的肽，或者在體外或體內具有其他 可測的免疫抑制相關活性的肽，在所有情況下，所述作用與CD4+CD25+ T細胞的作用有關。因此，這樣的Tr表位可以提供限制或消除所述復合 抗體中免疫原性的附加量度。可以通過摻入含有這些表位的人類VH和 VL片段、或者通過組合兩個或多個人類序列片段而生成這樣的表位、或 者例如從相應于人類抗體或蛋白質序列片段的肽篩選新Tr表位，將Tr 表位導入所述復合抗體VH或VL,用于誘導或激活CD4+ CD25+ T細胞， 例如通過檢測抑制性細胞因子(例如IL-10和/或TGF-卩)的釋》文(例如Hall 等，Blood, vol.100 (2002) p4529-36)?；蛘?，已知的Tr表位可以摻入復合 抗體V區(qū)的VH和/或VL內，其不抑制所述復合抗體的結合或功能或表 達，或者可以摻入復合VH或VL序列的一個末端，例如在VH的N端。 或者，Tr可以摻入復合抗體的一個或兩個恒定區(qū)，其摻入位置不干擾所 述復合抗體的功能(例如，在鉸鏈區(qū)內)或導致其他有害作用，例如表達 缺乏。或者，對于抗體融合蛋白、抗體軛合物、Fab和Fv-型式(包括具 有連接的VH和VL的單鏈抗體(SCA))、單結構域抗體或同型二聚體抗 體內的一個或兩個復合VH和VL， Tr表位可以4參入不干擾所述復合抗體 功能或導致其他有害作用(例如表達缺乏)的位置。例如，在SCA中， 用于Tr表位的特別優(yōu)選的位置是連接VH和VL的連接區(qū)。最佳地，Tr 表位的側翼將使用適當序列，以優(yōu)化調節(jié)T細胞表位在II類MHC分子 上的釋放和展示，例如通過在所述表位的側翼使用對內吞蛋白酶作用敏感 的序列。通常，側翼殘基的位置從P-20至P30(具有定義為Pl-P9的核心 單體)，如果需要使用其它的人類抗體序列片段，其將在引入抗原加工過 程中耙向蛋白酶的作用。
如本文所討論的，本發(fā)明還提供了生成經(jīng)修飾的抗體或復合抗體的方 法。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了用于生成修飾抗體的方法，該方法
包括步驟
(1) 通過結合來自 一系列其他抗體可變區(qū)的氨基酸序列片段來制備 抗體可變區(qū)基因，以生成不同可變區(qū)基因文庫；
(2) 將所述抗體可變區(qū)基因文庫克隆入表達載體；
(3) 篩選所述抗體可變區(qū)基因文庫并回收具有期望性質的所述文庫 成員。
在本發(fā)明的第一優(yōu)選的方法'A，中，生成復合人類抗體的文庫并篩 選具有期望性質(例如與特異抗原結合)的抗體。該方法涉及如下6個步 驟
(1) 設計復合的VH和VL基因
(2) 克隆復合的VH和VL基因
(3) 表達復合的VH和VL基因
(4) 篩選和選擇具有期望性質的復合抗體
(5) 優(yōu)化前導的復合抗體
(6) (任選的)消除T細胞表位
關于步驟(l),復合VH和VL序列文庫的設計是通過從已知的人類V 區(qū)序列(例如可以在 Kabat 抗體數(shù)據(jù)庫 (www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html)、 NCBI數(shù)才居庫(www.ncbi.nlm.nih.gov) 獲得的那些序列)和蛋白質凄t據(jù)庫(例如UniProt (www. ebi.uniprot.org) 和PRF/SEQDB (www.prf.or.jp))中選取VH和VL序列片段。另外，可以 通過收集人類VH和VL序列來補充這些文庫，通過直接測序來自 一個或 多個個體供體的擴增VH和VL的mRNA?？梢钥紤]序列片段的各種組合 來設計VH和VL基因。所使用的一個方法是固定所述復合VH和VL序 列的長度，并使用來自不同人類V區(qū)中相應Kabat編號位置的固定長度 的序列片段來設計這些基因。
例如，所述文庫將分別包括121和107個氨基酸的VH和VL區(qū)，例 如，將包括使用Kabat編號的VH氨基酸1-27的不同片段的分配。對于 具有相應于Kabat編號CDRl:30-35、 CDR2:50-66和CDR3:95-106的CDR 的VH,下述Kabat位置的序列片段作為一個選擇1-27、 28-31、 32-36、 37—42、 43-50、 51-56、 57-60、 61-63、 64-69、 70-82a、 82b-96、 97-98、 99-101、 102-117。對于具有相應于Kabat編號CDRl:24-34 、 CDR2:50-56、 CDR3:89-97的CDR的VL,下述Kabat位置的序列片段作為一個選擇 1-22、 23-27、 28-30、 31-33、 34-35、 36-47、 48-52、 53-55、 56-59、 60-87、 88-92、 93-94、 95-107。因此，在該例中，復合VH由14個人類片段組成， 復合VL由13個人類片段組成。在實踐中，使用計算機程序來產生這些 片段的組合。優(yōu)選地，所述程序包括避免某些片段的非優(yōu)選組合的算法， 例如，所述非優(yōu)選組合可能消除CDR的某些纟及限結構(canonical structures)或可能破壞VH和/或VL折疊或VH/VL相互作用。作為任選 的補充，所述程序可以包括限制所述序列片段組合形成的T細胞表位數(shù) 目的算法(參見下述步驟(6)中的計算積4莫擬(/" w7/co)方法)。
關于步驟(2),已經(jīng)設計了復合人類序列的文庫，然后優(yōu)選使用合成 寡核苷酸生成了復合VH和VL基因。通常，編碼較長的V區(qū)序列片段的 合成寡核苷酸將與編碼兩個或多個連續(xù)的V區(qū)序列片段的寡核苷酸混合 物相連接?；蛘?，可使用現(xiàn)有的人類VH和VL基因作為模板，通過其他 方法(例如重疊PCR或其他擴增技術)裝配復合V區(qū)。例如，使用PCR, 可以分別擴增小的V區(qū)片段，然后通過重疊PCR反應連接。
在其他方法中，可以生成混合的合成寡核苷酸以生成 一 系列序列片 段，優(yōu)選使用摻雜方法以富集編碼特定V區(qū)片段的序列。使用本領域技 術人員已知的才支術(例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 3rd Ed., vols. 1-3 (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press中7>開的那些才支術)并 使用用于免疫球蛋白的標準PCR方法(例如Orlandi等，Proc Natl Acad Sci U S A.,86 (1989) 3833-3837描述的那些方法)，可以許多方式裝配具有廣 泛的人類V區(qū)片段表現(xiàn)度變異性的復合人類VH和VL基因。
關于步驟(3),復合人類VH和VL基因一經(jīng)生成，其可以被克隆入多
種表達載體，用于生成完整抗體分子或抗原結合片^a，例如Fv's、 Fab's、 Fab2、 SCA、單結構域抗體(例如僅含有VH)及其各自的多聚體衍生物。 或者，VH和VL基因可融合至編碼其他分子的基因，以生成融合蛋白。 還可以包括編碼可測標志(例如在Fv或Fab的一條鏈的C端的聚組氨酸 標簽)的序列。表達載體包括那些用于在哺乳動物細胞、細菌細胞、細菌 噬菌體、酵母、真菌和其他微生物中表達的載體。這樣的載體還包括那些 經(jīng)由轉基因動物體內表達的載體和那些使用體外系統(tǒng)(例如使用核糖體制 品體外翻譯)表達的載體。
關于步驟(4),通常從復合人類抗體文庫中篩選結合至一個或多個感 興趣的特異抗原的復合人類抗體。有許多本領域技術人員已知的篩選方 法，其選擇將依賴于所述復合人類抗體的表達形式和所述抗體分子的組 成，即完整抗體或Fab、 Fv、 SCA、單結構域抗體等。在可獲得與興趣抗 原結合的現(xiàn)有抗體的一些情況下，來自該抗體的VH或VL可以分別與復 合人類VL或VH組合，并4全測結合。
篩選方法的范圍從固定這類成員的文庫或池的單個成員至固相，到或 單獨或以池來固定興趣抗原。其中抗體是固定的，然后添加興趣抗原，并 可通過添加一種或多種其他試劑直接或間接檢測所述抗原。例如，如果所 述抗原是與酶(例如堿性磷酸酶)的融合蛋白或軛合物，則可通過隨后添 加各種底物(其產生顏色、熒光或化學發(fā)光信號)來實現(xiàn)檢測。當抗體池 固定于一個位置(例如，微量滴定盤的孔)且經(jīng)由添加抗原而產生信號時， 則該池可以在再次篩選所述池的單個成員或更小的池之前被再次復制 (dereplicated )。當興趣抗原被固定時，可通過幾種方式篩選所述復合抗 體文庫，所述方式范圍從添加單個抗體至固定于特定位置的興趣抗原，到 添加抗體池，到添加完整的復合體文庫，和隨后回收與所述興趣抗原結合 的抗體。在最后的情況下，普通策略是固定抗原于固相上(例如柱中或 小珠上)，添加所述文庫，隨后例如使用低鹽緩沖液洗滌所述固相(以除 去松散結合的文庫成員)，然后例如使用高鹽緩沖液洗脫結合至所述抗原 的抗體。用于表達為此目的的文庫成員的常用形式是噬菌體展示、酵母展 示、核糖體展示和珠展示，在每種情況下，編碼復合VH和VL鏈的核酸
與結合所述抗原的復合V區(qū)保持連接。
篩選方法還將包括功能或生物學試驗，其可替代直接抗原結合試驗， 其中例如在體外試驗或者體內試驗中檢測功能活性或生物學活性，所述體 外試驗涉及細胞生長、細胞生長抑制、細胞分化或細胞遷移，所述體內試 驗涉及在完整生物體水平上檢測針對抗原的反應，例如小鼠中血細胞數(shù)目
的變化或移^i腫瘤的生長抑制。
關于步驟(5)，選擇一個或多個具有期望性質(例如結合至興趣抗原) 的"前導"復合人類抗體之后，任選地可以例如通過提高與抗原結合的親 和力或者將所述抗體融合至其他部分來改進所述前導抗體的性質?？赏ㄟ^ 誘變復合可變區(qū)序列來實現(xiàn)提高的親和力，以選擇在選定復合V區(qū)序列 中以期望的方式提高或改變結合的突變。本發(fā)明包括用于誘變可變區(qū)序列 的新方法，通過使用來自 一個或多個人類抗體序列的相應序列片段取代來
自前導抗體的一個或多個單個V區(qū)序列片段。特別地，與CDR區(qū)域重疊 的片段或CDR區(qū)域內重疊的片段可以被一個或多個來自其它人類抗體的 包含不同長度的替代片段所取代。在本發(fā)明的范圍內，可以包括來自具有 與選定的前導抗體相關性質的人類抗體的特定片段，例如來自與相同抗原 結合的抗體，或者來自具有相關性質的非人類抗體，或者來自具有保持某 些關鍵氨基酸的序列片段的人類抗體，所述關鍵氨基酸顯示對具有相關序 列的非人類抗體功能是重要的。然后，可以根據(jù)改進的性質來篩選經(jīng)受這 種誘變的一個或多個復合人類抗體。
關于任選的步驟(6)，在選擇前導復合人類抗體之后，當需要時，通 過將促進或編碼T細胞表位的V區(qū)片段替換為消除T細胞表位的替代片 段來限制或消除T細胞表位。這樣的T細胞表位可以通過一系列方法檢 測。例如，相應于復合V區(qū)序列中的一個或多個基因座的肽可以被合成 并在T細胞測定中測試以測定T細胞表位的存在。通常，這樣的肽長度 為15個氨基酸，并且，當期望測試較長的連續(xù)V區(qū)序列時，使用來自例 如具有12個氨基酸重疊的15mers序列的重疊肽。為檢測T細胞表位， 可以使用一系列不同的T細胞測定法來檢測CD4+T細胞的活化或增殖， 例如那些檢測細胞因子釋放、增殖(例如，通過3H-胸普攝取)、Ca2+通
量、表面標志表達、基因轉錄等的方法。
或者，在每種情況下，使用體外方法或計算機模擬方法來分析相應于
復合V區(qū)序列的重疊肽對人類II類MHC分子的結合，以測定可以誘導T 細胞反應的潛在T細胞表位，即MHC結合肽。計算機模擬方法將包括 涉及模擬肽一II類MHC結合相互作用的方法；涉及鑒定普遍用于結合II 類MHC的基序的方法；和，使用具有已知的體外MHC結合性質的肽或 肽內特定氨基酸數(shù)據(jù)庫的方法?？梢允褂闷渌椒?，例如從復合V區(qū)序 列或含有復合V區(qū)序列的完整抗體生成較長的肽并在T細胞測定或MHC 結合測定中測試這些肽，例如通過測試MHC-肽四聚體，或者通過在已知 的人類T細胞表位數(shù)據(jù)庫中檢索所提出或構建的序列。還可以通過消除 II類MHC結合基序或消除將肽與II類MHC的結合錨定的特定氨基酸， 來輔助消除復合人類V區(qū)中的T細胞表位。在從一個或多個前導復合人 類抗體消除T細胞表位的優(yōu)選方法中，計算機模擬方法被最初用以分析 復合人類抗體V區(qū)的潛在T細胞表位，當其被鑒定時，導入人類VH或 VL序列的新片段以消除這些表位并避免新T細胞表位的引入。
隨著任何新人類V區(qū)片段的這種導入和再次篩選期望性質的這種修 飾前導復合人類抗體，則可以通過測試長度通常為15至45個氨基酸的重 疊肽(例如來自復合人類V區(qū)序列(完整V區(qū)或其部分)的具有12個氨 基酸重疊的15mer肽)或者通過直接在人類T細胞測定中測試完整的復 合人類抗體，在人類T細胞測定中進一步測試一個或多個最終的前導復 合人類V區(qū)?？紤]到針對完整抗體的T細胞活化的直接測試，優(yōu)選使用 T細胞測定的最終分析用于測試完整的復合人類抗體。
在本發(fā)明第二優(yōu)選的方法'B，中，生成復合人類抗體文庫以包括來 自一個或多個具有期望性質的參考抗體的期望氨基酸。該方法涉及如下7 個步驟
(1) 一個或多個參考抗體的序列分析
(2) 設計復合VH和VL基因
(3) (任選的)消除T細胞表位
(4) 克隆復合VH和VL基因
(5) 表達復合VH和VL基因
(6) 篩選和選擇具有期望性質的復合抗體
(7) 優(yōu)化前導復合抗體，包括任選消除T細胞表位
在步驟(l)中，通常的參考抗體是嚙齒類動物特別是小鼠的，具有在 人類形式的抗體中所期望的性質和/或結合特異性。當可獲得一個或多個 參考抗體V區(qū)序列時，分析這些序列以確定CDR序列并鑒定可能對抗體 的期望性質(例如結合特異性)重要的氨基酸。對于參考抗體，這樣的分 析可以例如通過參考V區(qū)序列與同物種的其他序列的比對來進行，并且 如果所述參考抗體是非人類的，則與人類V區(qū)序列比對。例如，使用 CLUSTAL程序(Thompson等，Nucleic Acids Res. 22 (1994) p4673-80)進行 這種比對。這種比對可以鑒定參考抗體的V區(qū)和同源V區(qū)家族中的非普 通或稀有氨基酸。另外，可以使用例如Protein Data Bank (Berman等The Protein Data Bank, Nucleic Acids Research, 28 (2000) 235-242)來鑒定保守 的V區(qū)結構，例如CDR的典型結構。另外，當結構未知時，可以使用模 擬軟件(例如MODELLER (Sali和Blundell, J. Mol. Biol. 234 (1993) p779-815)) ^t擬參考抗體可變區(qū)，并且在一些情況下，可以產生抗體-抗 原相互作用的模型。這種參考抗體V區(qū)的分析可用以指導為復合人類抗 體選擇人類V區(qū)序列片段。
關于步驟(2),已經(jīng)確定了可能對復合人類抗體的期望性質重要的氨 基酸，然后選擇人類V區(qū)序列的片段，以包括這些氨基酸的一些或全部。 從而設計復合人類V區(qū)序列的文庫包括在特定基因座具有通常一個或多 個替代人類V區(qū)片段的選定片段，其中所述片段對所述復合人類抗體的 性質的作用是不確定的。與參考抗體一樣，可通過與其他人類抗體序列和 保守結構的比對來進一步分析這種復合人類抗體序列，另外，如果需要， 可以進行進一步的復合人類抗體V區(qū)結構模擬以精制用于復合人類抗體 的人類V區(qū)片段的組合，以消除蛋白質結構缺陷、復合V區(qū)中的分子間 和分子內相互作用和重要氨基酸的不正確結構定向。
關于任選的步驟(3)，作為片段選擇的附加標準，選擇限制或消除了 最終的復合人類V區(qū)內T細胞表位的那些片段。使用計算機模擬或體外
方法，通過方法A步驟(6)中描述的方法分析T細胞表位，優(yōu)選通過在設 計復合人類V區(qū)序列的階段使用計算機模擬方法。
關于步驟(4),已經(jīng)設計了復合人類序列的文庫，然后優(yōu)選使用合成 寡核苷酸生成復合VH和VL基因。通常，編碼較長的V區(qū)序列片段的合 成寡核苦酸將與編碼替代序列片段的寡核苦酸混合物相連接，以生成復合 人類V區(qū)文庫的不同成員。或者，將使用編碼特定人類V區(qū)序列的寡核 苷酸分別生成所述復合人類V區(qū)文庫的每個成員。或者，可使用現(xiàn)有的 人類VH和VL基因作為模板或者使用 一個或多個參考抗體V區(qū)基因作為 模板，通過其他方法(例如重疊PCR或其他擴增技術)裝配復合V區(qū)。
方法B的步驟(5)和(6)如方法A的步驟(4)和(5)中所描述的。
任選的步驟(7)將如方法A步驟(6)進行，其中在前導復合人類抗體中 要求進一步消除T細胞表位。考慮到直接檢測經(jīng)由整個抗體的T細胞活 化，使用T細胞測定的最終分析用于測試整個復合人類抗體是優(yōu)選的。
本領域技術人員應該理解，除了方法A和B之外，還有其他用于生 成并測試復合人類抗體和用于優(yōu)化這類抗體的性質的方法。本發(fā)明的復合 人類抗體是新的，并且作為V區(qū)的完全人類來源的結果，其應該比含有 非人類序列的其他抗體在人類中具有較小的免疫原性。復合人類抗體的附 加任選特征，即T細胞表位的消除和/或Tr表位的添力。也可以促成較^f氐的 免疫原性。本領域技術人員應該理解可以使用次優(yōu)選的含有非全部人類 序列片段的V區(qū)的復合抗體來實現(xiàn)較低免疫原性的目的，例如在復合 人類抗體中包括在不同于在其起源人類抗體序列位置的序列位置的片段 的復合人類抗體；僅部分摻入人類V區(qū)序列片段的復合抗體；具有非人 類序列的復合抗體；或具有已經(jīng)突變了的人類序列的復合抗體，所述突變 例如以增加對抗原的結合親和力或消除T細"包表4立。
應該理解，復合人類抗體中的V區(qū)序列片段及其組合可以被選擇以 符合上述包括任選消除T細胞表位的一系列標準。例如，可以選擇人類V 區(qū)序列片段及其組合，為避免B細胞表位和其他表位(例如I類MHC限
制的表位)，為避免可能對復合抗體表達有害的氨基酸序列，為避免可能 導致復合抗體不適當修飾(例如N-糖基化)的序列，為加入某些功能(例
如加入輔助T細胞表位和/或B細胞表位(例如，在疫苗應用中))，為隨
后結合至其他部分(例如一個或多個表面賴氨酸殘基)，和為一系列其他 標準。
本領域技術人員還應理解，除了人類，還可以生成具有全部或部分來
自其他物種的V區(qū)片段的復合抗體，并應該視為本發(fā)明的范圍之內。例 如，有關小鼠的研究，可以生成包含全部或部分小鼠來源的V區(qū)序列片
段的復合小鼠抗體。
從而，本發(fā)明還應用于用于治療用途的不同于抗體的蛋白質，這種蛋 白質(本文稱為"復合蛋白質")在最終的蛋白質分子中組合了來自人類 蛋白的兩個或多個氨基酸序列片段。
因此，在進一步的方面，本發(fā)明提供了通過插入一個或多個氨基酸序 列片段而具有改進的免疫原性的修飾蛋白質。
關于蛋白質，術語"片段"指蛋白質分子中存在的連續(xù)氨基S吏序列， 例如大小范圍從2至250個氨基酸長度的片段。為治療用途，本發(fā)明的復 合蛋白質通常將在所述復合蛋白質中組合兩個或多個來自不同人類蛋白 的氨基^列片段。特別地，本發(fā)明涉及具有完全由來自兩個或多個人類 蛋白的序列片段組成的插入物的復合蛋白質。當人類蛋白質存在與所述復 合蛋白質的同源性或者存在所述復合蛋白質的區(qū)的同源區(qū)時，可以使用相 應于其在來源人類蛋白中序列位置的復合蛋白質中序列位置處的人類蛋 白序列片段，例如復合蛋白質序列中的氨基酸l至IO將來自起源人類蛋 白的氨基酸1至10?；蛘?，人類蛋白序列片段可以所述復合蛋白中任何 位置處置于所述復合蛋白質，而不論所述序列在起源人類蛋白中的位置。 所述起源人類蛋白可以是任何現(xiàn)有人類蛋白氨基酸序列，例如人類蛋白質 序列數(shù)據(jù)庫中所提供的，并且可以包括來自天然突變或重排形式的人類蛋 白質和不同于種系的其他變異的序列、來自人工構建的人類衍生蛋白質的 序列和來源于人類基因或RNA的序列，不論相應的蛋白質是否被表達。
在本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施方案中，用于治療用途的復合蛋白質的構
建是通過在組合物中組合或插入人類蛋白質序列片段,其限制或消除了最 終復合蛋白質中的人類T細胞表位。如應用至復合蛋白質的本發(fā)明的優(yōu) 選方面是通過插入人類蛋白序列片段來修飾現(xiàn)有的參考蛋白質(例如非人 類蛋白質)，目的是限制或消除最終復合蛋白質中的T細胞表位。
在本發(fā)明用于生成復合蛋白質的優(yōu)選方法中，生成復合人類蛋白質文 庫，以包括來自一個或多個具有期望性質(例如不含T細胞表位)的參
考蛋白質的期望的氨基酸序列。該方法涉及如下7個步驟
(1) 一個或多個參考蛋白質的序列分析，包括任選的T細胞表位分析
(2) 設計復合蛋白質基因
(3) (任選的)消除T細胞表位
(4) 克隆復合蛋白質基因
(5) 表達復合蛋白質基因
(6) 篩選和選擇具有期望性質的復合蛋白質
(7) 優(yōu)化前導復合蛋白質，包括任選消除T細胞表位
在步驟(l)中，通常的參考蛋白是非人類的，具有在復合蛋白質中期 望的性質。為治療用途，通常減少或消除復合蛋白質中的免疫原性是目的。 當可獲得一個或多個參考蛋白序列時，分析這些序列以鑒定可能對所述蛋 白質的期望性質重要的氨基酸。另外，可以分析所述參考蛋白的任何已知 結構，或者，使用模擬軟件模擬結構。當可獲得所述參考蛋白質的同系物 時，種間或種內，這些同系物有時可用以確定同系物間序列差異和性質差 異之間的關系。當所述蛋白質與另一分子相互作用時，有時可以產生該相 互作用的模型并確定對該相互作用重要的氨基酸。作為步驟1的任選的補 充，特別使用上述關于復合人類抗體所具體描述的體外人類T細胞測定 法來測定所述參考蛋白質中T細胞表位的序列位置?；蛘?，可以使用用 于分析T細胞表位的計算機模擬方法。所述參考蛋白的這種分析用以指 導為復合蛋白質選擇人類蛋白質序列片段。對于復合蛋白質，當目的為減 少或消除與參考蛋白質(特別是非人類的)相比較的免疫原性時，通常在 所述復合蛋白質中使用一個或多個相應于T細胞表位位置的人類序列片
段，結合來自參考蛋白沒有T細胞表位的位置的序列片段。
關于步驟(2),已經(jīng)確定了可能對復合蛋白質的期望性質重要的氨基 酸，然后選擇蛋白質序列的片段以包括這些氨基酸的一些或全部。從而設 計復合蛋白質序列的文庫包括在特定基因座具有通常一個或多個替代蛋 白質片段的選定片段，其中所述片段對所述復合蛋白質的性質的作用是不 確定的。與參考抗體一樣，可通過與任何同系物的比對或通過復合蛋白質 結構的模擬或通過其他分析來進一步分析這種復合蛋白質序列，目的是精
制(如果需要)用于復合人類蛋白質的人類蛋白質片段的組合，以消除蛋 白質結構缺陷和重要氨基酸的不正確結構定向。
關于任選的步驟(3),作為片段選擇的附加標準，選擇限制或消除最 終復合蛋白質內T細胞表位的那些片段或片段組合。使用計算沖/l^莫擬或 體外方法，通過上述針對復合人類抗體所描述的方法來分析T細胞表位。
關于步驟(4),已經(jīng)設計了復合蛋白質的文庫，然后優(yōu)選使用合成寡 核苷酸生成復合蛋白質基因。通常，編碼較長的蛋白質序列片段的合成寡 核苷酸將與編碼替代序列片段的寡核苷酸混合物相連接，以生成復合蛋白 質文庫的不同成員。或者，將使用編碼特定復合蛋白質序列的寡核苷酸分 別生成復合蛋白質文庫的每個成員?；蛘?，可使用現(xiàn)有的人類蛋白質基因 作為模板或者使用一個或多個參考蛋白質基因作為模板，通過其他方法 (例如重疊PCR或其他擴增技術)裝配復合蛋白質。
關于步驟(5)， 4艮據(jù)所述復合蛋白質的一個或多個期望的性質，篩選 復合蛋白質文庫。有許多本領域技術人員已知的篩選方法，其選擇將依賴 于所述復合蛋白質的表達形式和蛋白質功能。篩選方法的范圍從固定這類 成員的文庫或池的單個成員至固相，到在溶液相中篩選所述文庫的成員， 到單獨或以池來固定所述蛋白質祐:設計通過結合與之相互作用的另一分 子。篩選方法還可以包括功能或生物學試驗，其中例如在體外試驗或者體 內試驗中檢測功能活性或生物學活性，所述體外試驗涉及細胞生長、細胞 生長抑制、細胞分化或細胞遷移，所述體內試驗涉及在完整生物體水平上 檢測針對所述復合蛋白質的反應，例如小鼠中血細胞數(shù)目的變化或移植腫 瘤的抑制。關于步驟(6)，在選擇一個或多個具有期望性質的"前導"復合蛋白 質之后，任選地，可以例如通過增加酶的特異活性或通過增加蛋白質配基 與受體的結合來改進所述前導蛋白質的性質?？赏ㄟ^誘變復合蛋白質序列 來實現(xiàn)提高的親和力，以選擇以期望的方式改變所述復合蛋白質性質的突 變。本發(fā)明包括用于誘變可變區(qū)序列的新方法，通過用來自一個或多個人 類蛋白質的序列片段取代來自所述蛋白質的一個或多個單個蛋白質序列 片段。然后，可以根據(jù)改進的性質來篩選屬于這種突變的一個或多個復合 蛋白質。
關于步驟(7)，在選擇前導復合蛋白質之后，當需要時，通過將促成
或編碼T細胞表位的蛋白質序列片段替換為消除T細胞表位的替代片段， 來限制或消除T細胞表位。這樣的T細胞表位可以通過一系列方法枱r測。 例如，相應于復合蛋白質中的一個或多個位置的肽可以被合成并在T細 胞測定中測試，以測定T細胞表位的存在。通常，這樣的肽長度為15個 氨基酸，并且，當期望測試較長的連續(xù)序列時，使用來自例如具有12個 氨基酸重疊的15mers序列的重疊肽?；蛘撸诿糠N情況下，使用體外方 法或計算機模擬方法來分析相應于所述復合蛋白質序列的重疊肽對人類 II類MHC分子的結合，以測定可以誘導T細胞反應的潛在T細胞表位， 即MHC結合肽。計算機模擬方法將包括涉及模擬肽-II類MHC結合相 互作用的方法；涉及鑒定普遍用于結合II類MHC的基序的方法；和，使 用具有已知的體外MHC結合性質的肽或肽內特定氨基酸數(shù)據(jù)庫的方法。 可以使用其他方法，例如從復合蛋白質序列或完整的復合蛋白質生成較長 的肽并在T細胞測定或MHC結合測定中測試抗原遞呈細胞上的這些肽。 還可以通過消除II類MHC結合基序或消除將肽與II類MHC的結合錨定 的特定氨基酸，來輔助消除復合蛋白質中的T細胞表位。在從一個或多 個前導復合蛋白質消除T細胞表位的優(yōu)選方法中，計算機模擬方法被最 初用以分析復合蛋白質的潛在T細胞表位，當其被鑒定時，導入新的人 類蛋白質序列片段以消除這些表位并避免新T細胞表位的引入。在任何 新人類片段的這種導入(如果需要消除T細胞表位)和篩選期望性質的 修飾前導復合蛋白質之后，可以通過測試長度通常為15至45個氨基S交的 重疊肽(例如來自復合蛋白質序列(完整蛋白質或其部分)的具有12個
氨基酸重疊的15mer肽)或者通過直接在人類T細胞測定中測試完整的 復合蛋白質，任選地在人類T細胞測定中進一步測試一個或多個最終的 前導復合蛋白質。考慮到針對完整蛋白質的T細胞活化的直接測試，優(yōu) 選使用T細胞測定的最終分析，用于測試完整的復合蛋白質。
本領域技術人員應該理解，還有其他用于生成并測試復合蛋白質和用 于優(yōu)化這類蛋白質的性質的方法。本發(fā)明的復合蛋白質是新的，并且當用 于治療目的時，人類來源的一些或全部蛋白質序列片段應該比含有非人類 序列的其他可比的或非人類參考蛋白質在人類中具有較小的免疫原性。復 合蛋白質的附加任選特征，即T細胞表位的消除和/或Tr表位的添加也可 以促成較低的免疫原性。本領域技術人員應該理解可以使用含有非全部 人類序列片段的復合蛋白質實現(xiàn)較低免疫原性的目的，并且可以包括具有 已經(jīng)突變了的人類序列的復合蛋白質，所述突變以消除T細胞表位或與 參考蛋白同源的非人類蛋白質片段。應該理解，復合蛋白質中的序列片段 及其組合可以被選擇以符合上述包括任選消除T細胞表位的一系列標準。 例如，可以選擇人類蛋白質序列片段及其組合，為避免B細胞表位和其 他表位(例如I類MHC限制的表位)，為避免可能對復合蛋白質表達有 害的氨基酸序列，為避免可能導致復合蛋白質不適當修飾(例如N-糖基 化)的序列，為加入某些功能(例如加入輔助T細胞表位和/或B細胞表 位(例如，在疫苗應用中))，為隨后結合至其他部分，和為一系列其他標 準。
本領域技術人員還應理解，除了人類，還可以生成具有全部或部分來 自其他種的序列片段的復合蛋白質，并應該視為本發(fā)明的范圍之內。例如， 有關小鼠內的研究，可以生成包含全部或部分小鼠來源的蛋白質序列片段 的復合蛋白質。還應該理解，復合蛋白質可以包括來自一個物種的蛋白質 序列片段，其與來自相同種物內同源蛋白質的其他蛋白質序列片段相組 合。例如，本發(fā)明將包括植物I型RIP (核糖體抑制蛋白)的構建，其中 使用來自可獲得的多個植物I型RIP序列的序列片段來裝配RIP。這種復 合RIP將通過引入保持RIP活性的序列片段的組合來裝配，并且如果用 于人類，則將包括在最終的復合序列中消除人類T細胞表位。
在抗體情況下，本發(fā)明包括這樣的選擇通過復合蛋白質的隨機、半 隨機或定向誘變來對復合蛋白質序列進一步修飾，以獲得最終蛋白質的一 個或多個其他性質的進一步改善。應該理解，本發(fā)明特別適合于生成在用 于人類或由人類使用時具有低免疫原性的蛋白質，例如用于藥物用途的蛋 白質，或者用于食物、去污劑、化妝品和其他消費產品中的蛋白質，其中 通過使用本發(fā)明的組合物限制或消除了變態(tài)反應。應該理解，本發(fā)明特別 適合于生成在人類中具有低免疫原性的蛋白質，特別是通過生成變態(tài)反應
相關的T細胞表位由非變態(tài)反應相關的表位所取代的蛋白質(例如，TH2 取代THl T細胞誘導表位)和/或添加Tr表位以抑制變態(tài)反應性個體中的 免疫反應。應該理解，本發(fā)明特別適合于生成在人類中具有減少的炎性性 質的蛋白質，特別是通過生成炎癥相關的T細胞表位由非炎癥相關的表 位所耳又代的蛋白質(例如，TH2取代TH1 T細胞誘導表位)和/或添加Tr 表位以抑制炎性反應。
如本文所討論的，本發(fā)明的修飾的/復合的蛋白質和抗體用于治療疾 病，并表現(xiàn)出較小的免疫原性。因此，在進一步的方面，本發(fā)明提供了包 含如權利要求1至18任一項所限定的修飾的抗體、抗原結合片段或蛋白 質的藥物制劑，任選含有一種或多種藥物可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
本發(fā)明的組合物可以每劑量含有預定量的各活性成分的單位劑量形 式存在。這樣的單位可適以提供5-100 mg/天的化合物，優(yōu)選5-15 mg/天、 10-30 mg/天、25-50 mg/天、40-80 mg/天或60-100 mg/天。對于式I的4匕 合物，提供了范圍100-1000 mg/天的劑量，優(yōu)選100-400 mg/天、300-600 mg/天或500-1000 mg/天。這樣的劑量可以單次劑量或者作為多個分開劑 量提供。當然，最終劑量將取決于治療的疾患、給藥途徑和患者的年齡、 體重和狀態(tài)，并將在醫(yī)生的指導下進行。
本發(fā)明的組合物可適以通過任何適當途徑給藥，例如通過經(jīng)口(包括 口腔或舌下)、直腸、鼻、表面(包括口腔、舌下或經(jīng)皮)、陰道或胃腸外 (包括皮下、肌內、靜脈或皮內)途徑。這樣的制劑可以通過藥學領域已 知的任何方法制備，例如通過將活性成分與載體或賦形劑形成結合。
適于經(jīng)口給藥的藥物制劑可以分開的單位存在，例如膠嚢或片劑；粉
劑或顆粒劑；水或非水液體中的溶液劑或懸浮劑；可食用的泡沫或霜 (whips);或者水包油型液體乳劑或油包水型液體乳劑。
適于經(jīng)皮給藥的藥物制劑可以分開的貼劑存在，目的是保持與受體表 皮的長期緊密接觸。例如，如Pharmaceutical Research, 3(6)， 318 (1986)中 總體描述的，可以通過離子電滲療法從所述貼劑遞送活性成分。
適于表面給藥的藥物制劑可以是軟膏、乳油、懸浮劑、洗劑、粉劑、 溶液劑、糊劑、凝月交劑、噴霧劑、氣溶膠或油劑。
為應用至眼或其他外部組織(例如口和皮膚)，制劑優(yōu)選作為表面軟 膏或乳油應用。當制成軟膏時，活性成分可以與石蠟或水混溶性乳油基質 一起使用?；蛘撸钚猿煞挚梢耘c水包油乳油基質或油包水基質制成乳油。
適于表面給藥至眼的藥物制劑包括滴眼劑，其中活性成分溶解或分散 于適當?shù)妮d體中，特別是水溶劑中。
適于在口中表面給藥的藥物制劑包括糖劑、錠劑和漱口劑。
適于直腸給藥的藥物制劑可以栓劑或灌腸劑(enemas)存在。
適于鼻內給藥的藥物制劑(其中載體是固體)包括顆粒大小范圍例如 20微米至500微米的粗粉，其給藥方式中使用鼻煙，即，通過鼻道從靠
近鼻的粉末容器快速吸入。作為鼻腔噴霧或作為滴鼻劑給藥的適當制劑 (其中載體是液體)包括活性成分的水溶液或油溶液。
適于吸入給藥的藥物制劑包括精細顆粒的粉劑或霧劑，其可以通過各 種類型的預定劑量的增壓氣溶膠、噴霧器或吸入器所生成。
適于陰道給藥的藥物制劑可作為陰道栓劑、棉塞、乳油、凝膠、糊劑、 泡沫劑或噴霧劑存在。
適于胃腸外給藥的藥物制劑包括水和非水的無菌注射溶液劑，其可 以含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使制劑與預期受體的血液等滲的溶質； 和水和非水的無菌懸浮液，其可以包括懸浮劑和增稠劑。所述制劑可以存 在于單位劑量或多次劑量的容器中(例如密封的安瓿和管形瓶)，并可以 冷凍干燥(低壓凍干)狀態(tài)保存，只需要在即將使用之前添加用于注射的
無菌液體載體(例如水)?？梢詮臒o菌粉末、顆粒和片劑制備臨時注射溶液 和懸浮液。
優(yōu)選單位劑量的制劑是含有如上文所述的日劑量或亞劑量或者其適 當分數(shù)的活性成分的制劑。
應該理解，除了上面特別提到的成分，所述制劑還可以包括與討論的 制劑類型有關的本領域其他常規(guī)物質，例如那些適于經(jīng)口給藥的物質可以 包括調味劑。
下述實施例不應被視為對本發(fā)明范圍的限制。附圖和表格與下述實施
例有關，并3口下


圖1/2-用于復合人類抗HER2抗體的VH(圖l)和VL(圖2)基因序列
圖3-人類SK-BR-3細胞在使用嵌合4D5 IgGl/K、復合人類抗HER2 抗體和表位消除的抗HER2 "EACHAB"培養(yǎng)8天后的增殖抑制，對照為 嵌合抗IgE (參見實施例4)
圖4/5-用于復合人類抗Lewis Y抗體的VH(圖4)和VL (圖5)基因序
列
圖6/7-用于復合人類抗人類IgE抗體的VH(圖6)和VL (圖7)基因序
列
圖8-用于復合小鼠抗人類TNFa抗體的VH和VL基因序列，包括人 類T細胞表位的消除
圖9-ELISA檢測復合小鼠和嵌合抗人類TNFa抗體對人類TNFa的結
合
圖10-抗TNFa抗體A2的V區(qū)序列 圖11-復合人類抗TNFa變體的序列 圖12-復合人類抗TNFaVL變體的序列
圖13/14-用于構建嵌合小鼠:人類抗TNFa VH(圖13)和VL(圖14)的
寡核苷酸
圖15/16-用于構建初級復合人類抗TNFa VH (圖15;相應于SEQ ID
No.3圖ll)和VL(圖16;相應于SEQIDNo.4圖12)的寡核苷酸
圖17-用于構建二級復合人類抗TNFa VH和VL變體的寡核苷酸
圖18-針對復合人類抗TNFa抗體的WEHI-164保護測定
圖19-前導復合人類抗TNFa的時間-過程人類T細胞測定
圖20-具有插入的人類序列片段的復合bouganin分子的活性
表1-3-復合人類抗體scFv文庫中使用的CDR,包括186 x 9殘基長 的VH CDR3(表1)、 77 x 8殘基長的VL CDR3(表2)和153 x 10殘基長的 VL CDR3沐3)。
表4-用于初級復合人類抗TNFa VH和VL變體的人類序列片段
表5-復合人類抗TNFa變體的活性
表6- bouganin的免疫原性肽序列和bouganin變體中的人類片段的取
代
實施例l-復合人類抗-HER2抗體的構建
為生成人類可變區(qū)序列片段文庫，來自 一系列人類免疫球蛋白的氨基 酸序列被收集入一個包含計算機模擬人類可變區(qū)序列文庫的數(shù)據(jù)庫，所述 文庫包括重鏈可變區(qū)(VH )和輕鏈可變區(qū)(VL)序列。序列來源包括了 NCBI Igblast凄丈4居庫(www.ncbi.nih.gov)、 Kabat數(shù)據(jù)庫(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH publication 91-3242， 5th ed. (1991) (及其之后的最新資料))、Vbase (www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt.doc)、 Genbank(Benson 等，Nucl. Acids Res. 25 (1997) pi-6 或通過 www.bioinf.org.uk/abs)數(shù)據(jù)庫。使用的參考抗體可變區(qū)序列是人源化的抗 HER2抗體，已知為Herceptin (Carter等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA， vol 89 (1992) p4285, US5821337)。根據(jù)與Herceptin⑧可變區(qū)序列中相應氨基酸的 同 一性來選擇來自計算機模擬人類可變區(qū)序列文庫的片段并組合生成分 別在圖1和2中所示的復合人類VH和VL序列。
使用現(xiàn)有技術公知的方法，以及適當?shù)?，使用供應商針對這些方法中
使用的酶的使用說明書，進行重組DNA技術。 一般的方法來源包括 Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第3版，第1-3巻，eds. Sambrook 和Russel (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press; 和Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel， John Wiley禾口 Sons。 下述實施例7中還 描述了詳細的實驗室方法。針對每條鏈，使用長度為30-60個氨基酸的編 碼完整復合人類VH和VL序列的8個合成寡核苷酸生成了相應于 Herceptin⑧的復合人類VH和VL序列。平行地，作為對照試劑，還使用 每鏈8個合成寡核苷酸生成了嵌合形式的小鼠單克隆抗體4D5 (Hudziak 等，Mol. Cell. Biol., (March 1989) pll65-1172))。分開的VH和VL寡核苷 酸首先被磷酸化，等摩爾比例混合，在熱循環(huán)儀中加熱至94。C持續(xù)5分 鐘，隨后冷卻至65。C,然后在65。C下保溫2分鐘。然后繼續(xù)保溫在45。C 下2分鐘、35。C下2分鐘、25。C下2分鐘和4。C下30分鐘。然后^f吏用T4 DNA連接酶(Life Technologies, Paisley UK)在14°C下連接寡核苦酸，持續(xù) 18小時。
向VH和VL寡核苷酸混合物各添加編碼5'側翼序列和3'側翼序列的 附加寡核苦酸并如上退火，所述5'側翼序列包括Kozak序列、前導信號 肽序列和前導內含子，所述3'側翼序列包括剪接位點和內含子序列。將所 生成的復合人類Vh和Vk和4D5表達盒從歷m/in至B"mffl片段克隆入 質粒載體pUC19，并確證了完整的DNA序列。這些被轉移至表達載體 pSVgpt和pSVhyg，其分別包括人類IgGl (Vh)或k (Vjc)恒定區(qū)和哺乳動 物細胞中的篩選標記。在表達載體中證實了復合人類VH和VK和4D5VH 和VK的DNA序列是正確的。
用于抗體表達的宿主細胞系是NS0 (無免疫球蛋白生成的小鼠骨髓 瘤)，其獲自歐洲動物細胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures ) , Porton, UK (ECACC No 85110503)。通過電穿孔將重鏈和 輕鏈的表達載體共轉染進入NS0細胞。在補加了 10%胎兒牛血清、0.8 嗎/ml麥考酚酸和250 jig/ml黃噤呤的達爾伯克改進伊格爾培養(yǎng)基 (DMEM)中選取表達gpt基因的集落。通過針對人類IgG的ELISA篩選用 于生成人類抗體的共轉染細胞克隆。擴增分泌抗體的細胞系，選取最高產 者并在液氮中冷凍。使用Prosep -A (Bioprocessing Ltd, Northumberland, UK)純化經(jīng)修飾的抗體。通過針對人類IgGK抗體的ELISA測定濃度。
嚴格按照Hudziak等(同上)描述的來測試復合人類抗體和嵌合4D5抗 體對HER2+人類胸腺腫瘤細胞系SK-BR-3增殖的抑制，結合陰性對照非 -Her-2結合人類IgGl/K抗體。結果(圖3)顯示，復合人類抗體和嵌合4D5 抗體在抑制SK-BR-3細胞生長中是等效的。圖3還顯示了如下生成的"表 位消除的"復合人類抗體替代物的數(shù)據(jù)。
為測試本發(fā)明的表位消除選擇，使用 Peptide Threading (www.csd.abdn.ac.uk/ gjlk/MHC-thread)分析了復合人類重鏈可變區(qū)和輕 鏈可變區(qū)序列的非自身人類II類MHC黏合劑。該軟件預測肽的氨基酸側 鏈與II類MHC結合槽(binding groove )內特異結合袋(binding pocket) 之間的有利相互作用。通過II類MHC異型數(shù)據(jù)庫延展所有來自復合人類 重《連和輕鏈可變序列的重疊13mers,并才艮據(jù)其與II類MHC分子的匹配 和相互作用評分。預測結合II類MHC的肽是開始于VH中殘基16和67 以及VL中殘基9和44的13mers。作為結果，選擇人類可變區(qū)序列文庫 的新片段代替那些在圖1的復合人類序列中使用的片段，以引入氨基酸改 變VH 18L-A/69I-G; VL 11L-A, 46L-A。通過取代用以制備相應于圖1序 列的抗體的一些寡核苷酸來制備相應的"表位消除的，，復合人類抗體 ("EACHAB"=表位消除的復合人類抗體)，并且EACHAB如上述方法制 備并測試表明對SK-BR-5的抑制等效于標準的復合人類抗體(圖3)。該數(shù) 據(jù)表明，復合人類抗體可以被成功構建，且等效于對照嵌合抗Her-2抗體， 并且表明可以生成復合人類抗體的EACHAB版本，且沒有效價損失。
實施例2-復合人類抗HER2抗體的免疫原性
進行了 T細胞增殖測定來比較復合人類抗HER2抗體、EACHAB變 體和嵌合4D5抗體的免疫原性(參見實施例1 )。從NS0細胞制備這些抗 體，所述NS0細胞培養(yǎng)于不含血清的、不含動物衍生組分的、不含蛋白 質的培養(yǎng)基，補加了 HyQ LS1000 Lipid Supplement (Hyclone Cat No: SH30554 和丙酮酸鈉(Gibco Cat No: 11360-039)的 HyClone
HyQ ADCF-Mab (Hyclone Cat No: Cat no: SH30349)。緩沖液在 Sephadex G25 (PD10柱)上更換為50 mM MES pH6后，抗體各自穿過陽離 子交換柱(Mono-S 10/10),并使用氯化鈉梯度(0至0.5M)洗脫。然后將含 有餾分的抗體應用至Superdex 200制備柱(XK16/60)， PBS洗脫。收集峰 餾分并在4。C下貝i存。通過針對人類IgG的ELISA測定抗體濃度。
使用從健康人類供體血液分離并冷藏于液氮中的PBMC (外周血單 核細胞)進行免疫原性分析。使用基于Allset PCR的組織分型試劑盒 (Dynal, Wirral, UK)對各供體進行組織分型，并根據(jù)單個MHC單倍型選擇 20個健康供體。使用測試肽(終濃度5mM)于24孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)2ml 含有4 x 106 PPMC于AIM V(Invitrogen, Paisley, UK)的大塊培養(yǎng)物，并在 第5、6、7和8天通過輕輕重懸所述大塊培養(yǎng)物并轉移三份100^1的PBMC 樣品至U底的96孔板來評價增殖。使用Tomtec Mach III板收集器 (Receptor Technologies, UK)將培養(yǎng)物收集入玻璃纖維濾網(wǎng)，并使用Wallac Microbeta TriLux讀板器通過閃爍計數(shù)測定每分鐘計數(shù)(cpm )值(使用 paralux高效計數(shù)方案)。計算各測試抗體的刺激指數(shù)(SI)為測試抗體每 分鐘計數(shù)(cpm):陰性對照cpm的比值，且認為SI>2是顯著的T細胞 表位反應。結果顯示在20個健康受試供體中基于至少一個四天增殖測 試中，嵌合4D5抗體5個受試供體(25 % )中誘導了顯著的增殖反應(SI 大于2 )，復合人類抗HER2抗體在3個受試供體(15 % )中誘導了 SI>2, 而EACHAB抗HER2抗體沒有在一個受試供體(0% )中誘導了 SI>2。 這些結果表明，免疫原性的次序為嵌合4D5〉復合人類抗HER2>EACHAB 抗HER2，且后者在任何受試供體血樣中顯示無免疫原性跡象。
實施例3-復合人類抗Lewis Y抗體的構建
如實施例l所描述的，使用人源化3S193抗體(Scott等，Cancer Res., 60 (2000) p3254-3261, US5874060)作為參考抗體可變區(qū)序列構建了特異 性針對唾液酸化的Lewis Y抗原的復合人類抗體。從計算機模擬人類可變 區(qū)序列文庫選^^了與人源化3S193抗體可變區(qū)序列中相應氨基酸同一性 的片段，并組合以分別生成如圖4和5所示的復合人類VH和VL序列。平行地，從參考V區(qū)序列制備了參考嵌合抗Lewis Y抗體。在復合人類 抗Lewis Y抗體和嵌合參考抗體上都使用了人類IgGl (Vh)或k (Vk)恒定 區(qū)，并如US5874060所述，通過針對合成Lewis Y-HSA復合物的ELISA 測試了抗體。數(shù)據(jù)顯示，與0.15嗎/ml復合人類抗體相比，在測定中產生 結合信號的嵌合抗體的最小濃度為0.1嗎/ml,這與US5874060的數(shù)據(jù)一 致。
實施例4-復合人類抗IgE抗體的構建
如實施例1所述，使用已知為Xolair⑧的人源化抗IgE抗體(Presta 等，J. Immunol., 151(5) (1993) p2623-2632)作為參考抗體可變區(qū)序列構建 了復合人類抗IgE抗體。從計算機模擬人類可變區(qū)序列文庫選擇了與 Xolair 可變區(qū)序列中相應氨基酸同 一性的片段，并組合以分別生成如圖 6和7所示的復合人類VH和VL序列。平行地，從參考V區(qū)序列制備了 參考嵌合抗IgE抗體。在復合人類抗IgE抗體和嵌合參考抗體上都使用了 人類IgGl (Vh)或k (Vk)恒定區(qū)。
通過表面等離子共振(BIAcore 2000, Biacore AB, Uppsala， Sweden)進 一步表征了 Fab的特異性。如Flicker等，J. Immunol" 165 (2000) p3849-3859所描述的，生成了重組人類IgE Fab。使用NHS/EDC試劑盒 (Biacore)將測試抗體純化并固定于CM芯片流動細胞上，以獲得2010 RU 的嵌合抗IgE和2029 RU的復合人類抗IgE。于Hepes緩沖的鹽水(10 mM Hepes, 3.4 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v)表面活性劑P20， pH 7.4) 中的10和25nM重組人類IgE Fab以5 pl/分鐘的流速在受試抗體上流過 10分鐘。結果顯示，對于10和25nMIgEFab兩者而言，都檢測到了針 對嵌合抗IgE和復合人類抗IgE抗體的等效的SPR (表面等離子共振)曲 線，表明后者成功獲得了等效于參考抗IgE抗體的結合效力。
實施例5-復合人類scFv文庫的生成和篩選
開始構建人類scFv (單鏈Fv)文庫的策略是構建7個共有的人類VH
基因和4個共有的人類VL(k)基因(如Knappik等，J. Mol. Biol., 296 (2000) 57-86所描述的)，并將來自人類可變區(qū)數(shù)據(jù)庫的大量VH和VL的CDR3 片段克隆入這些基因。該系列CDR3顯示于表1為VH的CDR3，表2 為VL的8個氨基酸的CDR3,表3為VL的10個氨基酸的CDR3。對于 主要的VH和VL構建，合成了編碼VH和VL至框架3末端的6個重疊 合成寡核苷酸(如Knappik等，同上所詳細描述的)，并使其經(jīng)受回歸 PCR(Prodromou和Pearl, Protein Engineering, 5 (1992) 827-829)。這些被連 接入￡coRV消化的pZero-1載體(Invitrogen, Paisley, UK)。關于添加CHI 和C k,開始都使用4D5 CDR3(Carte等，Bio/Technology, 10 (1992) 163-167),按照Knappik等，同上的方案，除了 VH-CH1 5I-5coRI和VL-C k7V^I-S; /zI片段都是平末端克隆入五coRV消化的pZero-l。
#名稱H3
MUCl-l'CliDFLSGYLDY
VRGSGSFDY
AIil/7-l'CLDRGGNYFDY
L36'CLMYNTCNFFDY
5.Ml3 'CLAGIjGMIFDY
Au2.1'CLRGFNGQIiIF
M71' CL'
E55 6-X'CLiRYGGFY節(jié)Y
■S55 6,11'CIjGYSNEG膨V
VH6.A5'CLSWDGYSY工Y
孤6-ex8 '.c:lqmgaeyfqh
E54 4.2'CLDMSLDAPDI
RF-SJ4'CLGSVGATLGE
3,A290'CIiYGDYHYFDY
A95■GVGSSGWDH
,2 ' CIjKGSLYtFDY
E55 3.6'CLPNWNDAFDI
■■■E55 :3.16'CL
333'C!L
1H1 CIjPPEVESLRS
3311' CIj
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112'CLPPEVESLRS
2C12'CLPPEVESIjRS
2A12 'CIiPPEVESIiRS
BOT ■DLAAAfiLF
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BM2 'CLDL GLWEY
CM29 'CL.
長度-H3亞組(H) 9工
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E3-MPO'CIj Eev9Fd,'CL' ■NMnJC-l'CL
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WG1' CIj RF-ET5'CL RF-ETIO' CL EW-Dl' EW-D3'CL KN-D6'CIi HH-M2' AK-D8 'Cli
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b2 'clhkg:lryfdy9工工工
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表2
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III
長度-l3 類別
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D11K3 'CLi8I徵
D17K2'CL8IGM
F21K1 'CliQQYDNLPP8IGM
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SC跳98'CL8KAPPA
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BCPBIi6 ' CIiQQNKDWPL8KAPPA
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21H9'CLQQSYNTIiSIiT10工GGl-KAPPA
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FONT' CL10
Hu PR1A310KAPPA
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MEVQQSYTNPEVT10KAPPA
SONQQYGSSPPYT10
HEW, , CL<10
HEW'CLQQYGSSPRYT10KA艦
cm'QQFGNSPIPIj 10IGG2-kap狄
HG2B10K'CLiQQYAGSPPW10IC5G-KAPPA
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M3.5N'CLQQRSNWPPGT10KAPPA
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GA3.4'CL16
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ga3 . i' c:lqqygssppyt10kappa
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GA3 .5 'CIiQQYGNSKLFS10KAPPA
QQYGGSPtFS10KAPPA
E29,lQQYNNWPTWT10IGM-KAPPA
kappa'cl
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工工工.5 'CIjQQYNDWPPWT10■KAPPA
工.18'clqqyngnsp:lt10kappa<formula>formula see original document page 38</formula><formula>formula see original document page 39</formula>
蛋白表面。然后，通過與重組人類IgE Fab培養(yǎng)來篩選10000個獨立克隆 的固定化的初始scFv文庫(參見實施例4 )。使用PBS/3% BSA室溫下封 閉孔1小時，PBS中洗滌3次，并使用于PBS/3% BSA的5嗎/ml人類IgE Fab處理1小時。然后將孔在PBS中進一步洗滌3次，并使用于PBS/3% BSA的5嗎/ml堿性磷酸酶標記的嵌合抗IgE (實施例4 )處理1.5小時。 孔在PBS中進一步洗滌5次，并使用底物5-溴-l-氯-3-吲哚基磷酸酯和氮 藍四唑(RocheMolecular)顯色，用于成像。顯示以1/9600孔的頻率觀察 到的強力信號來自都含有E25 CDR3的VH和VL對。
實施例6-復合鼠抗TNFa抗體的構建
如實施例1關于人類文庫所述的，使用NCBI Igblast、 Kabat和Genbank 數(shù)據(jù)庫生成鼠可變區(qū)序列。使用的參考抗體可變區(qū)序列是嵌合抗TNFa 抗體，已知為使用了鼠cA2抗體可變區(qū)的Remicade (Le等，US6277969)。 來自計算機模擬鼠可變區(qū)序列文庫的片段部分選擇為Remicade⑧可變區(qū) 中的相應氨基酸，但包括有意避免序列(以非自身人類II類MHC黏合劑 的形式)中的人類T細胞表位的變化，如實施例1中所檢測的。圖8中 顯示了與嵌合抗體中使用的序列相比較的復合鼠VH和VL序列，表明了 兩種抗體間VH和VL中各自9和16個氨基酸的差異，這是為消除復合 鼠抗體中表位的片段選擇的結果。
如實施例1所述，生成了復合鼠和嵌合抗TNFa抗體。純化抗體在標 準ELISA中對結合固定化人類TNFa的比較(WO 03/042247 A2中描述) 顯示，復合鼠抗體保留了嵌合抗TNFa抗體的全部結合能力(圖9)。然 后，如實施例2所描述，比較了這些抗體的免疫原性，使用24 HLA-DR 型人類血液樣品用于T細胞測定。結果顯示，嵌合抗TNFa抗體在在24 名健康受試供體的9名(37.5%)中誘導了顯著的增殖反應(SI大于2)，復 合鼠抗TNFa抗體與之比較，其中24名供體中沒有一名(0% )被誘導 SI>2。這些結果表明，包含完全來自鼠V區(qū)的可變區(qū)序列片段(選擇這 樣的片段以消除人類T細胞表位)的復合鼠抗體可以除去在人類T細胞 測定中沒有任何表位消除措施的相應嵌合抗體所展示的免疫原性。
實施例7:復合人類抗TNFa抗體的構建
根據(jù)美國專利5656272獲得了靶向針對人類TNFa的抗體A2的參考 鼠可變區(qū)重鏈和輕鏈序歹'J(圖10.分別為SEQ ID No.l和SEQ ID No.2)。 結構模型由鼠參考可變區(qū)構成，對CDR構象關鍵的氨基酸基于其與CDR 的距離(〈3A)和其靠近CDR的可能的堆積而被鑒定。重要但次關鍵的殘 基基于其與CDR的距離(〉3A 〈6A)和其對更靠近CDR堆積的更關鍵殘基 的可能的影響而凈皮鑒定。其他組的殘基基于其在鼠抗體序列中的出現(xiàn)頻率 而被鑒定，即特定位置的氨基酸出現(xiàn)頻率小于1%。
包含盡可能多的這些殘基的人類V區(qū)序列片段被選擇(表4 )以生成 全長的VH和VL序列。對這些序列進行改變以包括所有經(jīng)鑒定的結構上 重要的殘基，以生成作為模板的序列，用于表位消除和復合人類抗體設計。 用于各復合VH和VL的優(yōu)選序列被設計以包括來自參考鼠抗體的重要殘 基。這些可變重鏈和輕鏈氨基酸序列顯示于圖11和12。分別為SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4。
表4:用于初級CHAB變體的序列片段的人類抗體數(shù)據(jù)庫衍生
(a)重鏈 Genbank
登錄號 序列片段CAA61442 C細8676 CAB37182 aas纖8 cac43592 ABB54411 AAL96548 AAK51359 CAA67405 C細7447 AAD30769 CAC15703 AAQ05509 AAT96742 AAD20526 CAB44788 aa038724 AAK14004 AAD20470 AAB32435
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSC
LSCVASGFIFS
FSNHWM
HWMNWVRQAPGKGLEWVA
AEI
IRSKS
SIN
NSA
SAT
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HYAESVKGRFTISRD
RPTISRDE)SKS工
工VYLQM
YIjQMTDIjR
LRTEDTGVYYC
VYYCSKNY
NYYGS
GSTY
DYWGQGT5"VTVSS'
(b)輕鏈
Genbank
登錄號序列片段
CAC06686
aax57564LTQSPAIIiSIiSPGERATIiSC
X72820IjSIiSPGERATLSCRASa
AAC15439■QFV
AAZ0鄉(xiāng)8':VGSS
Z,7SS工
AAL鵬5工HWYQQK
AAQ21835QQK卿SPKLLIK
M27751
AAY1砲2VASE.
aar89別■ES
aad19534sm
aav71416msg
AAZ0卿8GIP
cag27043PSRPSGSGSGTDPTLTINSLE
AAQ油7SLESEDAA
aa6h卿
AAY33370YYCQQSHS
AAD19457HSWP
AAQ55271■WPPTFGQGT
aaw69118TFGQGTNIiEIK
復合重鏈和輕鏈可變區(qū)序列使用多種計算機模擬方法(例如Propred [http:〃imtech.res.in/raghava/propred/index.html] 、 Peptide Threading [www.csd.abdn.ac.uk/ gjl固HC畫thread] 、 SYFPEITHI (www.syfpeithi.de)、
MHCpred(www.jenner.ac.uk/MHCPred/)掃描潛在T細胞表位的存在，并與 同源人類種系框架區(qū)序列(結合了參考鼠CDR)相比較。
制成了下述重鏈可變區(qū)變體(參見圖11):
SEQIDNo.5與SEQIDNo.3相比含有下述改變T82aN + R83K
SEQ ID No.6與SEQ ID No.3相比含有下述改變T82aN + R83K + D82bS
SEQ ID NO.7與SEQ ID No.3相比含有下述改變T82aN + R83K + D82bS + V23A
SEQ ID No.8與SEQ ID No.3相比含有下述改變T82aN + R83K + D82bS + V23A + V78A
制成了下述輕鏈可變區(qū)變體(參見圖12):
SEQIDNo.9與SEQIDNo.4相比含有下述改變I10T + N103R
SEQ ID No.10與SEQ ID No.4相比含有下述改變I10T + N103R + S80A
SEQ ID No.ll與SEQ ID No.4相比含有下述改變:I10T + N103R + S80A + N41D
為構建對照嵌合抗體，使用一系列重疊40mer合成寡核苷酸構建了 翻譯生成SEQ IDNo.l和SEQIDNo.2的核苷酸序列。V區(qū)序列側翼具有 附加的5'和3'序列，以促進克隆入哺乳動物表達載體。所述寡核苷酸的序 列顯示于圖13和圖14。
寡核苦酸購自Sigma-Genosys (Poole, UK)并以100 的濃度懸浮。1 pi的各重鏈有義鏈寡核香酸(除了多數(shù)5'寡核香酸)混合在一起，使用多 核苷酸激酶(PNK, Invitrogen, Paisley UK)在20 pi反應物中處理1.5 pi (約 l嗎)所述混合物，所述20 pi反應物還含有2 pi 10 x PNK緩沖液、2 jal 10 mMATP、 14jilH20、 0.5 pi (5單位)PNK。所述反應在37。C下進行30分 鐘，并且通過在70。C下加熱20分鐘失活所述酶。反義重鏈、有義輕鏈和 反義寡核苷酸類似地被磷酸化。來自各組的5'寡核苷酸以1: 9稀釋于水
中，添加1.5 pl至適當?shù)姆磻旌衔铩Ｈ缓髮⒏鞣磻锵♂屩?.5ml，并 在Amicon microcon YM3濃縮器中于8000 rpm下旋轉透析90分鐘，直至 體積不超過44 pl。
重鏈的有義和反義混合物以及輕鏈的有義和反義混合物被合并，并加 水至88 pl。向各反應添加10 pl的10 x連接酶鏈式反應(LCR)緩沖液 和2 pl Pfu連接酶(8單位，Stratagene, Cambridge UK),如下在程序控制的 加熱塊中保溫94°C 、 4分鐘然后60°C 、 3分鐘，持續(xù)一個循環(huán)；隨后94°C 、 39秒然后60。C、 2分鐘，持續(xù)20個循環(huán)。最后，反應物在60。C下保溫5 分鐘。10pl的各LCR跑過溴化乙錠染色的1%瓊脂糖凝膠，與1Kb梯狀 標準參照(Invitrogen)相比較。在各泳道觀察到連接DNA的成片條帶，圍 繞著約400 bp的暗特異性條帶。
通過PCR擴增重鏈和輕鏈LCR，使用SEQIDNo.l2和SEQIDNo.22 作為重鏈的引物，并使用SEQ ID No.33和SEQ ID No.43作為輕鏈的引物。 各反應中包括下述5 |il LCR、 5 pi 10 x Expand HiFi buffer (Roche， Lewes UK)、 1 pi 10mMNTP混合物、0.25 pi各引物(來自IOOjxM原液)、0.5 pi Expand HiFi聚合酶(3單位，Roche)和38 pi H20。反應循環(huán)如下94°C 、 2分鐘，隨后20個循環(huán)的94°C、 30秒，60°C、 30秒和72。C、 30秒。最 后反應物在72。C下保溫5分鐘。如上，通過瓊脂糖凝膠電泳確認反應的 產率和特異性。各反應在約400 bp觀察到特異性尖銳條帶。
使用Qiagen PCR純化試劑盒純化所述反應產物，各稀釋于30 pi H20 中。在標準反應中使用限制酶Mw I和歷wd III消化重鏈產物，并使用 II and BamH I消化輕鏈產物。使用Qiagen PCR純化試劑盒再次純化反應 產物，各稀釋于30 pi H20中。
輕鏈表達載體pANT08基于pAT153骨架并含有下述次序CMV直 接/早期增強啟動子-590至+7，來自高表達鼠抗體輕鏈RNA的30nt 5' UTR,靠近可變區(qū)起始密碼子加入5^HI1限制位點的鼠共有輕鏈信號序 列，連接至人類復合內含子的含有從可變區(qū)剪接位點至SamHI限制位點 33nt的短連接體(替代可變區(qū))，隨后是含有343 nt內含子的人類基因組 DNA，前面的人類恒定k(CK)區(qū)基因、CK基因和CK聚腺苷酸。
重鏈表達載體pANT09類似pANT08穿過啟動子區(qū)，其跟隨有來 自上述的重鏈相似物的62nt 5' UTR,靠近可變區(qū)起始密碼子加入Mw I 限制位點的鼠重鏈共有信號序列，連接至緊隨有人類基因組片段的可變區(qū) 剪接位點的短連接體(替代可變區(qū))，從位于CH1基因上游內含子211nt 的歷>^ III限制位點至CH區(qū)聚腺苷酸位點末端。該片段包括人類IgGl 的CH1、鉸鏈、CH2和CH3內含子和外顯子。該載體還包括受S V40啟 動子和聚腺苷酸信號控制的二氫葉酸還原酶基因，用于抵抗氨曱喋呤。
在總體積為30 nl的標準反應中使用相關限制酶消化2嗎各載體。各 反應物如上跑過1%瓊脂糖凝膠，從凝膠切出載體特異性條帶(6.0 Kbp 重鏈和4.2 Kbp輕鏈)，使用Qiagen凝膠提取試劑盒純化并稀釋于30 pl H20中。
使用Ligafast試劑盒(Promega, Southampton UK)將1 jxl各消化載體連 接至3 pl相應的消化可變基因PCR產物。如生產商說明，將2.5^d各連 接反應物轉化入亞克隆效率感受態(tài)XLl-blue (Stratagene)，并鋪板于含有 100嗎/ml氨千西林的LB瓊脂平板上，37。C培養(yǎng)過夜。來自各連接的IO 個細菌菌落接種入10 ml含有100嗎/ml氨千西林的2 x YT肉湯培養(yǎng)基， 37。C振蕩培養(yǎng)過夜。使用Qiagen質粒制備試劑盒從1.5 ml各過夜培養(yǎng)物 中純化質粒并各自稀釋于50 ^ H20中。所述質粒被送至合同(contract)測 序裝置，并使用標準CMV啟動子引物測序并鑒定具有正確V區(qū)基因序列 的克隆。
為構建復合人類抗體，使用一系列重疊40mer合成寡核苷酸構建了 翻譯生成SEQIDNo.3和SEQIDNo.4的核苷酸序列。所述寡核苷酸的序 列顯示于圖15和圖16。通過重疊PCR構建了翻譯生成SEQ ID No.5的 核香酸序列，使用了寡核香酸引物SEQ ID No.94和SEQ ID No.95 (圖17) 以及寡核香酸SEQ ID No.53和SEQ ID No.63和初級復合人類抗體重鏈變 體的質粒DNA作為模板。使用SEQ ID No.53和SEQ ID No.95或者SEQ ID No.94和SEQ ID No.63作為引物對，完成了兩個PCR反應。各反應中 包括下述1 (xl(100ng)質粒模板、5)all0xExpandHiFi緩沖液(Roche)、 1 pi 10 mM NTP混合物、0.25 |J各引物(來自100 原液)、0.5 jil ExpandHiFi聚合酶(3單位，Roche)和42 (il H20。反應循環(huán)如下94°C、 2分鐘， 隨后20個循環(huán)的94°C、 30秒，60°C、 30秒和72。C、 30秒。最后反應物 在72。C下保溫5分鐘。全部反應物電泳遷移通過1%瓊脂糖凝膠，切出 295bp和126bp的特異性條帶，并使用Qiagen凝膠提取試劑盒純化。DNA 稀釋于30 pi H20中。
使用寡核苷酸引物SEQ ID No.53和SEQ ID No.63在PCR反應中連 接兩個純化的片段，使用上述PCR條件，除了使用的模板是l^il 295bp 產物和1 pi 126bp產物，因此H20量減至41 |al。使用Qiagen PCR純化 試劑盒純化396bp的結合PCR產物，并稀釋于30 ^ H20中。
通過重疊PCR構建了翻譯生成SEQ ID No.6的核苷酸序列，使用了 寡核苷酸引物SEQ ID No.96和SEQ ID No.97 (圖17)以及寡核苷酸SEQ ID No.53和SEQ ID No.63和初級復合人類抗體重鏈變體的質粒DNA作 為模板。使用SEQ ID No.53和SEQ ID No.97或者SEQ ID No.96和SEQ ID No.63作為引物對，完成了兩個PCR反應。如上所述完成第一階段PCR 并生成295bp和126bp片段。還如上所述，這些片段經(jīng)純化、結合在一起 和再次純化。
通過重疊PCR構建了翻譯生成SEQ ID No.7的核苷酸序列，使用了 寡核苷酸引物SEQ ID No.98和SEQ ID No.99 (圖17)以及寡核苷酸SEQ ID No.53和SEQ ID No.63和SEQ ID No.6的PCR產物作為模板。使用 SEQ ID No.53和SEQ ID No.99或者SEQ ID No.98和SEQ ID No.63作為 引物對，完成了兩個PCR反應。如上所述完成第一階段PCR并生成98 bp 和318bp片段。還如上所述，這些片段經(jīng)純化、結合在一起和再次純化。
通過重疊PCR構建了翻譯生成SEQ ID No.8的核苷酸序列，使用了 寡核苦酸引物SEQIDNo.lOO和SEQIDNo.lOl (圖17)以及寡核苷酸SEQ ID No.53和SEQ ID No.63和SEQ ID No.7的PCR產物作為模板。使用 SEQ ID No.53和SEQ ID No.101或者SEQ ID No.100和SEQ ID No.63作
為引物對，完成了兩個PCR反應。如上所述完成第一階段PCR并生成 270 bp和155 bp片段。還如上所述，這些片段經(jīng)純化、結合在一起和再 次純化。
使用Mw I和III消化上述各PCR產物，并連接入同樣消化的 pANT09。全部如上所述，所述連接經(jīng)轉化和鋪板，挑選菌落，質粒制備 和測序。
通過重疊PCR構建了翻譯生成SEQ ID No.9的核苦酸序列，使用了 寡核苷酸引物SEQ ID No.102和SEQ ID No.103 (圖17)和初級復合人類抗 體輕鏈變體的質粒DNA作為模板。如上針對重鏈變體所描述的，完成一 個PCR反應，并生成383 bp的產物。全部反應物電泳遷移通過1%瓊脂 糖凝膠，切出特異性條帶，并使用Qiagen凝膠提取試劑盒純化。DNA稀 釋于30H20中。
通過重疊PCR構建了翻譯生成SEQIDNo.lO的核苷酸序列，使用了 寡核苦酸引物SEQ ID No.104和SEQ ID No.105 (圖17)以及寡核苷酸SEQ ID No.74和SEQ ID No.84和SEQ ID No.9的PCR產物作為模板。如上針 對重鏈變體所描述的，使用SEQ ID No.74和SEQ ID No.105或者SEQ ID No.104和SEQ ID No.84作為引物對，完成了兩個PCR反應并生成265 bp 和139bp片段。還如上針對重鏈變體所述的，這些片段經(jīng)純化、結合在 一起以生成383 bp的產物，并再次純化。
通過重疊PCR構建了翻譯生成SEQIDNo.ll的核苷酸序列，使用了 寡核苷酸引物SEQ ID No.106和SEQ ID No.107 (圖17)以及寡核苦酸SEQ ID No.74和SEQ ID No.84和SEQ ID No.10的PCR產物作為模板。如上 針對重鏈變體所描述的，使用SEQ ID No.74和SEQ ID No.107或者SEQ ID No.106和SEQ ID No.84作為引物對，完成了兩個PCR反應。如上針 對重鏈變體所描述的，完成第一階段PCR并生成148 bp和256 bp片段。 還如上針對重鏈變體所述的，這些片段經(jīng)純化、結合在一起以生成383 bp 的產物，并再次純化。
使用HII和B。w HI消化上述各PCR產物，并連接入同樣消化的 pANT08。全部如上所述，所述連接經(jīng)轉化和鋪板，挑選菌落，質粒制備 和測序。
在含有10%FCS、 L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉和L-脯氨酸的DMEM中增 殖CHO-K1細胞(ATCC弁CCL-61)。收集接近融合的培養(yǎng)物，用于如生產商(Invitrogen)所教導的使用Lipofectamine 2000轉染。在接種了 200 |al細 胞(3 x 105細胞/ml)的48孔板中進行轉染，使用了包含0.3嗎重鏈構建 物和0.2嗎輕鏈構建物的0.5 jig質粒DNA。
在收集上清液之前，轉染在37。C/5。/。C02下培養(yǎng)48至72小時。通過 ELISA定量抗體表達，使用鼠單克隆抗人類IgG捕獲抗體、人類IgGl/k 標準和HRP結合山羊抗人類k輕鏈作為檢測抗體(所有試劑來自Sigma)。
所有重鏈和輕鏈組合都被轉染(即6重鏈x 5輕鏈=30轉染)?？贵w表 達水平一4殳范圍為0.5至2.0嗎/ml,然而沒有觀察到重鏈SEQIDNo.8的 表達。
使用TNF-敏感的WEHI-164細胞(Espevik等，J. Immunol. Methods 1986， 95, 99-105)測試了所表達的抗體中和人類TNFa的能力。細胞鋪板 于1嗎/ml防線菌素D的96孔微孔滴定板中(每孔5 x 104細胞)，至3-4 小時。細胞暴露于40 pM人類TNFa,并改變嵌合抗體濃度(從1 ng/ml 至500 ng/ml)，以生成標準曲線。在25 ng/ml的單一濃度點測試重鏈和輕 鏈的各種組合，之前所述濃度點已經(jīng)被測定為嵌合抗體的ED5G。所有測 定進行三次?；旌衔镌?7。C培養(yǎng)過夜。測定細胞存活力，通過添加3-[4,5-二曱基-噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑翁染料(MTT)至終濃度為0.5 mg/ml， 37。C培養(yǎng)4小時，0.1MHC1、 0.1%SDS中裂解細胞，和在550 nm 波長處檢測光密度。
重鏈和輕鏈組合的光密度用以從標準曲線計算表觀抗體濃度。各變體 組合的表觀濃度除以嵌合表觀濃度生成倍差值(fold difference value )。低 于嵌合的值表明那些組合更有效保護細胞免受TNFa細胞毒性，而較高值 表明其較不有效。所有組合的值顯示于表5。
表5:復合人類抗體變體與嵌合抗體活性比例
SEQ ID No.135678
21.001.381.241.201.02ND
41.512.281.281.381.05ND91.282.141.321.770.95ND
101,312.511.171.630.98ND
1116.卯15.15196.49134.08105.61ND
下述復合人類抗體重鏈和輕鏈組合倍差值接近1.0: SEQ ID No.5/ SEQIDNo.lO、 SEQIDNo.7/SEQIDNo.4、 SEQ ID No.7/SEQ ID No.9、 SEQ ID No.7/ SEQ ID No. 10。選擇這些組合用于進一步研究。
帶有上述選擇序列的表達質粒轉染進入NSO細胞(ECACC No.85110503)。在含有L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、5%超低IgG FCS和pen/str印 的高葡萄糖DMEM中培養(yǎng)細胞。在對數(shù)生長期收集細胞并以5 x 106細胞 /ml懸浮于新鮮生長培養(yǎng)基中。750 ^細胞與總共30嗎的各質粒對(其 已經(jīng)用&p I線性化)混合于50 |il H20中。細胞/質?；旌衔镛D至4 mm間 距電擊杯(gap cuvette )，并使用Equibio Easyject Plus在250V、 1500 pF、 無限電阻下電穿孔。所述電穿孔立即轉至25ml預熱的生長培養(yǎng)基，并鋪 板于5 x 96孔平底板(100 pl/孔)。平板在37。C/5。/。C02下培養(yǎng)。電穿孔 后48小時，將50pl含有300nM氨曱喋呤的培養(yǎng)基添加至各孔，以形成 終濃度為100nM。電穿孔7天后，將另外50pl含有100nM氨曱喋呤的 培養(yǎng)基添加至各孔。
電穿孔后約2周， 一些孔內的培養(yǎng)基開始變黃，表明了轉染的集落生
長。使用抗人類IgG Fc捕獲/抗人類IgK輕鏈HRP結合物檢測ELISA來
測試這些孔的培養(yǎng)基的抗體表達。測試樣品與人類IgGl/K標準和估計的
抗體表達水平相比較。將表達有用量的抗體的集落在含有200nM氨曱喋 呤的培養(yǎng)基中擴增。
通過蛋白質A親和層析并隨后使用Sephacryl S200尺寸排阻層析從 500ml培養(yǎng)基中純化抗體。通過280nm處的UV吸收定量所述純化的抗 體，假設OD28。 1 = 1.4 mg/ml。
通過上述實施例4中描述的WEHI-164保護測定來測試純化的嵌合和 復合抗體的活性。測試了之前用以生成標準曲線的所有濃度范圍的各抗體 (見圖18)。發(fā)現(xiàn)復合人類抗體7/10 (即，含有SEQ ID No.7和SEQ ID No. 10)
是最有效的變體并具有與嵌合抗體相同的活性。復合人類抗體7/9和5/10 具有類似活性，其比嵌合抗體略有減少，并且復合人類抗體7/4活性最小。
因此，由于復合人類抗體7/10 #1預測具有最有利的II類MHC特征 并且是最有效的變體，所以其被選擇用于在時間過程T細胞增殖測定中 測試。通過兩圏Ficoll密度離心從來自人類捐贈血液的血沉棕黃層制備人 類PBMC。所制備的PBMC以3 x 10 細胞/ml的密度重懸于90%人類AB 血清/10。/。DMSO中(lml分裝)，并保存于液氮下。使用DynalAllset PCR 分型試劑盒對PBMC組織分型。
使用來自20名健康供體的人類PBMC在全蛋白T細胞測定中比較前 導復合人類抗體和嵌合抗體。來自各供體的PBMC經(jīng)融化、洗滌并懸浮 于不含AIM V血清的淋巴細胞生長培養(yǎng)基中。在第l天，將50嗎蛋白 質添加至2 ml大塊培養(yǎng)物(4 x 106PBMC于24孔板中)，在第6天至第 9天移出三份100 pl分裝，并轉至96孔板。在收集和檢測放射活性摻入 之前，使用75 含有l(wèi)|iCi氚標記的胸腺嘧啶脈沖各分裝。通過計算刺激 指數(shù)(SI)來標準化結果。通過根據(jù)單個MHC單倍型選擇供體來實現(xiàn)寬 范圍的HLADR異型覆蓋。
時間-過程測定的結果顯示于圖19,并且證明嵌合抗體(圖19(a))在至 少1天在20名供體的IO名中引發(fā)了 T細胞反應(SI〉-2)。相反，復合人 類抗體(圖19(b))未能在任何時間點的任何供體中引發(fā)反應。因此，使用 鼠抗TNFa抗體(A2)作為參考，成功地從人類抗體片段構建了無免疫 原性的復合人類抗體。
實施例8:復合I型核糖體抑制蛋白的構建
<吏用WO2005090579中描述的方法生成了植物I型核糖體抑制蛋白 (RIP) bouganin (來自葉子花(5owga/"v/〃ea ■spectoZ)//"))的復合變體。 如WO2005090579,通過分析重疊15mer肽測試了 bouganin中的T細胞 表位的位置，并且表6中SEQID 11-13的肽(相應于殘基121-135、 130-144 和148-162)被鑒定為表位。從來自葉子花植物的葉組織克隆了 Bouganin。
如生產商所教導的，使用聚腺普酸Tract System 1000試劑盒(Promega)從 100mg組織中提取了 mRNA。使用AccessQuick RT-PCR系統(tǒng)(Promega) 從 mRNA 模板合成 了 cDNA , 且引物如下 ATGTACAACACTGTGTCATTTAAC 和 TTATTTGGAGCTTTTAAACTTAAGGATACC。第一引物額外含有ATG 起始密碼子，且第二引物額外含有TAA終止密碼子。使用T/A克隆系統(tǒng) (pGEMTEasy,Promega)克隆了 PCR產物，并測序了幾個克隆以鑒定取向 為載體中含有的T7啟動子的轉錄方向的正確克隆。
表6: bouganin的免疫原性H)t^列和取代人類序列片段
SEQ ID No. 11: 121AKVDRKDLELGVYKL135
AAKAD—CAD39157 AKADR-A^01327 KADRK-XP—372046
AAKSDR-AAH47411 KSDRKD-Nf P—0 02678
AAKTD-B頻3704 AKTDil-AAD00450 KTDRK-CAH1'8368
SEQ ID恥.:L2:瀏LGVYKLEFS工蹄纖144
ED3PQ-BAC04852 li(3PQK-NP—056013
糊GK-AA工00815 LG<3KKL-BAD96533 GGKKbE—AAK68690
SLGNS-B幼14022 IjG郎KL，BAD98 114 GNSKLE-CAG糊75
ELgQAKIj-AAF42 3 2 5
歸QD-C幼71艦 IjGQDK-:BAC04773 QDKLE-ITO—004000
SEQ工D No. 13: 148H3QEIAKFFLIV:E(^I162
EQAKF-NP—079390
GQERA-AAH10634 QERAK-NP一O 0315 3
一系列變體被制成含有表6中所示的經(jīng)鑒定的人類序列片段。這些使
用具有高保真聚合酶(Expand Hi-Fi, Roche)的重疊PCR構建。5'和3'引物 如上，且PCR產物如上被克隆入T/A克隆載體，并且鑒定了取向為T7 啟動子轉錄方向的正確克隆。在配對的轉錄和翻譯反應中測定克隆的活 性，所述反應包括表達熒光素酶基因的對照DNA(Luciferase T7 Control,
Promega)。由于bouganin是核糖體失活蛋白，其顯著降低熒光素酶基因 的翻譯水平，這種降低常規(guī)使用熒光素酶4企測系統(tǒng)(例如Steady-Glo (Promega))測定。純化的野生型或突變體bouganin質粒用iVWI線性化， 并稀釋至10ng4d。熒光素酶T7對照DNA被稀釋至125 ng/Vl。 1 pl各 DNA與10 pl TnT混合物(Promega)、 0.25 pl蛋氨酸和0.25 pl不含核酸酶 的水(TnT試劑盒中提供的)混合。對照僅是wt (野生型)bouganin和熒光 素酶T7對照。反應進行三份，并于30。C下培養(yǎng)1小時。5(al各反應物轉 至黑色圍壁的96孔發(fā)光計板，并與45pl水和50WSteady-Glo試劑。在 Wallac Microbeta Trilux發(fā)光計中讀取發(fā)光?；钚员硎緸閺膯为殶晒馑孛?對照DNA觀察到的發(fā)光的百分比。
圖20描繪了許多不同變體的活性特征。這顯示最有效的變體是肽 41中的V123T;肽44中的132P/Y133Q;肽50中的I152Q。組合的突變 體被制成含有這4種突變，并在活性測定中再次測試。該突變體的活性由 圖20中的COMB表示，并保留了約75 %的wt蛋白活性。
活性COMB變體中含有相應于殘基121-135、 130-144和148-162的 人類序列片段的肽被合成，并如實施例7所述，在使用來自20個健康供 體的人類PBMC的時間-過程T細胞測定中與相應的野生型肽比較。結果 表明，含有人類序列片段的肽沒有在任何供體中的任何時間點誘導T細 胞增殖，而各野生型肽在至少一個時間點在>10°/。的所有供體中誘導了 SI>2的增殖。
實施例9:復合水蛭素(Hirudin)的構建
使用表7中SEQIDNo.l4的蛋白質作為野生型，使用WO2004113386 中描述的方法生成了凝血酶抑制劑水蛭素(來自醫(yī)蛭(///n^fo m^/c/加fe )) 的復合變體。如WO2004113386中，通過分析重疊15mer肽檢測了水蛭 素中T細胞表位的位置，并顯示肽27-41 CILGSDGEKNQCVTG產生與 來自20名健康供體的人類PBMC顯著的T細胞反應。來自黑素瘤相關抗 原(AAN40505.1)的人類序列片段KCRH被用以取代水蛭素26-29殘基， 如實施例8中l(wèi)吏用重疊PCR，生成28/29IL變?yōu)?8/29RH的變體水蛭素
分子，其保留了野生型水蛭素的全部活性，使用WO2004113386中描述 的測定法。與野生型肽27-41 CILGSDGEKNQCVTG—起，在如實施例8 中的T細胞測定中測試修飾肽27-41 CRHGSDGEKNQCVTG,證明了修 飾肽中T細胞表位活性的丟失。
實施例10:帶有Tr表位的復合人類抗IgE抗體的構建
根據(jù)Orlandi等，同上的標準聚合酶鏈式反應(PCR)方法，將來自 實施例4的復合人類抗IgE抗體的VH和VL基因克隆入分離的質粒載體， 作為用于使用寡核苷酸引物對的VL-和VH-特異性PCR的模板。重疊互 補序列被導入PCR產物，其在后續(xù)融合PCR中組合以形成20個氨基酸 (G4S!)4連接體或者20個氨基酸序列GGSNNLSCLTIP ASANNGGS的編碼 序列，所述20個氨基酸序列GGSNNLSCLTIP ASANNGGS含有來自丙型 肝炎核心蛋白(P19， MacDonald等，Journal of Infectious Diseases, 185 (2002) p720-727)的10個氨基酸Tr表位，每側具有兩個天冬酰胺殘基和GGS三 聯(lián)體。該最終擴增步驟使用引物對進行，用于限制酶五coRV和^pEl的 隨后剪切并克隆入bluescript KS載體(Stratagene)。然后通過Mack等，Proc Natl Acad Sci U S A., 92 (1995) p7021-7025的方法構建了 二聚體形式的復 合人類抗IgE單鏈抗體(scFvs)。 二聚的VL-連接體-VH-VL-連接體-VH片 段被亞克隆入表達載體pEF-DHFR (Mack等，同上)的五coRl/5Wl位點， 并通過電穿孔轉染入DHFR缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。如Mach 等，同上描述的進行篩選、基因擴增和蛋白質生成。經(jīng)由C末端組氨酸尾 通過在鎳-氨基三乙酸(Ni-NTA)柱上的親和層析純化二聚的scFv's,以 產生二聚Fvs指定的CHABIgEG4Slx4 (VL和VH之間的(G4S,)4連接體) 和CHABIgEHCVP19 (VL和VH之間的HCV Tr表位)。
使用來自20名健康供體的PBMC,嚴格如Hall等，Blood 100 (2002) p4529-4536所描述的，隨后在50 pg/ml人類T細胞測定中測試二聚scFvs。 結果顯示，CHABIgEG4Slx4或CHABIgEHCVP19都沒有顯著的T細胞 增殖，但顯示了經(jīng)CHABIgEHCVP19刺激的20名供體中的4名有顯著水 平的IL-10生成(SI〉2),而用CHABIgEG4Slx4刺激的則沒有(20名供體 中沒有一個SI〉2)。這說明抗體分子中包含的Tr表位用于誘導免疫抑制細 胞因子IL-10的作用。
權利要求
1.一種修飾抗體或其抗原結合片段，其中所述修飾抗體或抗原結合片段的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)各自由來自一種或多種其他抗體或抗原結合片段的兩個或多個氨基酸序列片段組成，從而所述片段既不是完整的CDR也不是完整的框架區(qū)。
2. 如權利要求1所述的修飾抗體或抗原結合片段，其中所述氨基酸 序列片段來自單一物種。
3. 如權利要求2所述的修飾抗體或抗原結合片段，其中所述氨基酸 序列片段是人類的。
4. 如權利要求1至3的任一項所述的修飾抗體或抗原結合片段，其 中各框架區(qū)包括兩個或多個片段，和/或各CDR包括兩個或多個片段。
5. —種具有改進的結合親和力的修飾抗體或抗原結合片段，其具有 插入可變區(qū)的 一個或多個氨基^列片段。
6. 如權利要求5所述的修飾抗體或抗原結合片段，其中所述插入的 氨基酉餅列片段是人類的。
7. 如權利要求1至6的任一項所述的修飾抗體或抗原結合片段，其 中通過在一個或多個可變區(qū)中插入一個或多個氨基酸序列片段而除去一 個或多個T細胞表位。
8. 如權利要求7所述的修飾抗體或抗原結合片段，其中所述一個或 多個插入的氨基酸序列片段是人類的。
9. 如權利要求1至8的任一項所述的修飾抗體或抗原結合片段，其 含有一個或多個編碼抑制免疫反應的調節(jié)T細胞表位的片段。
10. 如權利要求1至9的任一項所述的修飾抗體或抗原結合片段，其 是抗HER2抗體、抗Lewis Y抗原抗體、抗IgE抗體或抗TNF抗體。
11. 一種修飾蛋白質，其通過一個或多個氨基酸序列片段的插入而具 有改進的免疫原性。
12. 如權利要求11所述的修飾蛋白質，其中所述插入的氨基酸序列 片段是人類的。
13. 如權利要求11或12所述的修飾蛋白質，其中通過一個或多個氨 基酸序列片段的插入而除去一個或多個T細胞表位。
14. 如權利要求11至13的任一項所述的修飾蛋白質，其含有一個或 多個編碼抑制免疫反應的調節(jié)T細胞表位的片段。
15. 如權利要求11至14的任一項所述的修飾蛋白質，其是經(jīng)修飾的 I型核糖體抑制蛋白或經(jīng)修飾的水蛭素。
16. 如權利要求1至15的任一項所述的修飾抗體、抗原結合片段或 蛋白質，其中初始的抗體或蛋白質是非人類來源的。
17. 如權利要求16所述的修飾抗體或抗原結合片段，其中所述初始 抗體是小鼠抗體。
18. 如權利要求1至17的任一項所述的修飾抗體，其中所述修飾抗 體的全部V區(qū)是人類來源的。
19. 一種藥物制劑，其包含如權利要求1至18的任一項所述的修飾 抗體、抗原結合片段或蛋白質，及任選一種或多種藥學可接受的賦形劑、 載體或稀釋劑。
20. —種用于生成修飾抗體的方法，其包括步驟(1) 通過組合來自 一系列其他抗體可變區(qū)的氨基酸序列片段來制備 抗體可變區(qū)基因，以生成不同可變區(qū)基因文庫；(2) 將所述抗體可變區(qū)基因文庫克隆入表達載體；(3) 篩選所述抗體可變區(qū)文庫并回收具有期望性質的所述文庫成員。
21. —種用于生成修飾抗體的方法，其包括步驟(1) 通過組合來自 一 系列其他抗體可變區(qū)的氨基酸序列片段來制備 抗體可變區(qū)基因以生成不同可變區(qū)基因文庫，所述其他抗體可變區(qū)包括來 自 一種或多種具有期望性質的參考抗體的期望的氨基酸；(2) 將所述抗體可變區(qū)基因文庫克隆入表達載體； (3)篩選所述抗體可變區(qū)文庫并回收具有期望性質的所述文庫成員。
22. 如權利要求20或21所述的方法，其中所述氨基商拼列片段來自 單一物種。
23. 如權利要求22所述的方法，其中所述氨基酸序列片段是人類的。
24. 如權利要求20至23的任一項所述的方法，其中所述抗體可變區(qū) 由衍生自兩個或多個片段的框架區(qū)和/或衍生自兩個或多個片段的CDR 組成。
25. 如權利要求20至24的任一項所述的方法，其中通過置換一個或 多個氨基酸序列片段進入所述可變區(qū)來進一步改變從所述文庫回收的所 述一個或多個成員。
26. 如權利要求20至25的任一項所述的方法，其中通過置換一個或 多個氨基酸序列片段以減少或除去T細胞表位，來進一步改變從所述文 庫回收的所述一個或多個成員。
27. 如權利要求20至26的任一項所述的方法，其中通過插入或添加 一個或多個抑制免疫反應的調節(jié)T細胞表位來進一步改變從所述文庫回 收的所述一個或多個成員。
28. —種用于生成》務飾蛋白質的方法，其包括步驟(1) 通過組合來自 一 系列其他蛋白質的氨基酸序列片段來制備蛋白 質基因以生成不同蛋白質基因文庫，所述其他蛋白質包括來自 一種或多種 具有期望性質的參考蛋白質的期望的氨基酸；(2) 將所述蛋白質基因文庫克隆入表達載體；(3) 篩選所述蛋白質基因文庫并回收具有期望性質的所述文庫成員。
29. 如權利要求28所述的方法，其中所述氨基酸序列片段來自單一 物種。
30. 如權利要求29所述的方法，其中所述氨基^列片段是人類的。
31. 如權利要求28至30的任一項所述的方法，其中通過置換一個或 多個氨基酸序列片段進入所述可變區(qū)來進一步改變從所述文庫回收的一
32. 如權利要求28至29的任一項所述的方法，其中通過置換一個或 多個氨基酸序列片段以減少或除去T細胞表位，來進一步改變從所述文 庫回收的一個或多個成員。
33. 如權利要求28至32的任一項所述的方法，其中通過插入或添加 一個或多個抑制免疫反應的調節(jié)T細胞表位來進一步改變從所述文庫回 收的一個或多個成員。
34. —種用于生成具有改進的性質的修飾抗體或蛋白質的方法，其包 括步驟(1) 通過用來自其他抗體和蛋白質的可選片段置換現(xiàn)有氨基酸序列 片段來制備抗體基因或蛋白質基因，以生成不同的抗體基因文庫或蛋白質 基因文庫；(2) 將所述抗體基因文庫或蛋白質基因文庫克隆入表達載體；(3) 篩選所述抗體文庫或蛋白質文庫，并回收具有改進性質的所述文 庫成員。
35. 如權利要求20至34的任一項所述的方法，其中所述待修飾的抗 體是非人類抗體。
36. 如權利要求35所述的方法，其中所述待修飾的抗體是小鼠抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了包括抗體的復合蛋白質，其顯示降低的免疫原性。尤其是，提供了用于人類的復合抗體，特別是經(jīng)過修飾而除去一個或多個T細胞表位的抗體。還提供了用于生成這種蛋白質的方法。
文檔編號C07K19/00GK101115771SQ200680004068
公開日2008年1月30日 申請日期2006年2月3日 優(yōu)先權日2005年2月3日
發(fā)明者蒂莫西·大衛(wèi)·瓊斯, 馬太·保羅·貝克 申請人:安迪拓普有限公司