專利名稱：：用于免疫抗分枝桿菌的組合物的制作方法用于免疫抗分枝桿菌的組合物本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生宿主T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法。該方法包括施用載體疫苗的步驟，所述載體疫苗包含非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體，所述病毒載體表達(dá)分枝桿菌抗原85A基因(在本文還稱為"Ag85A"基因)的翻譯產(chǎn)物。本文引用的所有公布、專利和專利申請(qǐng)通過(guò)引用全部結(jié)合入本文。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病是由呼吸病原體結(jié)核分沖支桿菌(Afyc<96"cter/"w7^^/rw/osz:y)引起的，每年導(dǎo)致2百萬(wàn)人死亡，主要在發(fā)展中世界(http:〃www.who.int/gtb/publications/globrep01/index.html)?？谂e一4尋至ll"i午可的抗結(jié)核分枝桿菌的疫苗，即卡介苗(BCG)(Calmette,A.,C.Guerin.(1924)Ann.Inst.Pasteur.38:371),是牛分沖支4干菌(腳cokcfeWMw6ov/s)的減毒株，其在發(fā)展中國(guó)家通常作為單次劑量皮內(nèi)施用于新生兒。許多研究的綜述表明，BCG免疫保護(hù)性抵抗兒童腦膜結(jié)核和系統(tǒng)形式的疾病。然而，針對(duì)全球主要的結(jié)核病死亡原因一一成人肺部疾病的保護(hù)效力是可變的(范圍為0-80%)(Colditz,G.A.等，(1994).JAMA271:698),并隨時(shí)間而減弱(Sterne,J.A.等，(1998)Int.J.Tuberc.LungDis.2:200)。變化的基礎(chǔ)是不確定的。即使如此，每年全球有80%的嬰兒接受BCG(http://www.who.int/inf-fs/en/fact104.html)。結(jié)核分枝桿菌是一種細(xì)胞內(nèi)病原體，對(duì)抗其的保護(hù)效力與以下因素有關(guān)保持強(qiáng)烈的細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)感染的反應(yīng)，所述反應(yīng)涉及CD4+和CD8+T細(xì)胞；和與Thl-型細(xì)胞因子(特別是IFN-力反應(yīng)的能力(Flynn，J.L.,J.Chan.(2001)Annu.Rev.Immunol.19:93)。BCG免疫誘導(dǎo)分泌IFN-y的T細(xì)胞，主要是CD4+T細(xì)胞表型，其與結(jié)核分枝桿菌蛋白交叉反應(yīng)(LaunoisP等,(1994)InfectionandImmunity62(9):3679-87)。近期研究表明，胃腸外纟合藥的BCG未能誘導(dǎo)可能是保護(hù)性抵抗肺部疾病的關(guān)鍵的肺粘膜T細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此，需要開發(fā)其他的抵抗分枝桿菌疾病的疫苗。
發(fā)明內(nèi)容令人驚訝的是，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)表達(dá)分枝桿菌抗原85A(Ag85A)的病毒載體在作為免疫原性組合物施用時(shí)，可以誘導(dǎo)人類患者的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明提供了一種在人類患者中誘導(dǎo)針對(duì)分枝桿菌抗原的T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，該方法包括為患者施用免疫原性組合物的步驟，所述組合物包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。優(yōu)選地，所述免疫原性組合物是載體疫苗。該新型疫苗方法顯著提高了所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。優(yōu)選地，所述T細(xì)胞反應(yīng)是i己憶T細(xì)月包反應(yīng)。85A抗原(Ag85A)(登記號(hào)CAA17868和BX842584)是Ag85復(fù)合體的成員。Ag85復(fù)合體是由結(jié)核分枝桿菌、BCG和許多其他種類的分枝桿菌分泌的蛋白質(zhì)家族，包括Ag85A、Ag85B和Ag85C(Harth,G.等，(1996)Infect.Immun.64:3038-3047)?？乖?5A(Ag85A)在所有分枝桿菌種類之中是高度保守的，并且在動(dòng)物和人類研究中是免疫顯性的。Ag85A(Ag85A)由基因編碼。來(lái)自結(jié)核分枝桿菌的85A抗原(Ag85A)在本文列于SEQIDNO1和SEQIDNO2)。在結(jié)核疫苗研究中，誘導(dǎo)加強(qiáng)的T細(xì)胞反應(yīng)的近期策略已經(jīng)利用了使用質(zhì)粒、細(xì)菌或病毒載體的重組DNA技術(shù)和重組蛋白質(zhì)來(lái)表達(dá)結(jié)核分枝桿菌抗原。已經(jīng)顯示，在結(jié)核分枝桿菌攻擊后，使用表達(dá)Ag85A的MVA載體加強(qiáng)的Ag85ADNA對(duì)小鼠的免疫提供了相當(dāng)于BCG的保護(hù)程度(McShane,H.等，(2002).Infect.Immun.70:1623-1626)。然而，單獨(dú)使用重組MVA載體單次或反復(fù)免疫所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)是弱的。對(duì)于針對(duì)分枝桿菌疾病(例如結(jié)核病)的長(zhǎng)期保護(hù)，認(rèn)為重要的是保持可持續(xù)刺激保護(hù)性免疫數(shù)十年的"記憶T細(xì)胞"。所述T淋巴細(xì)胞直接產(chǎn)生于分化的效應(yīng)T細(xì)胞，并保持一致的休眠狀態(tài)。認(rèn)為效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞分布至機(jī)體的所有組織，特別是病原體可能再次相遇的上皮表面(例如，皮膚和消化道)。記憶T細(xì)胞已經(jīng)顯示為異質(zhì)的，并包括至少兩種具有不同遷移能力和效應(yīng)功能的亞型(Reinhardt,R丄.等，(2001)Nature.410,101-105)。第一亞型細(xì)胞類似于初次應(yīng)答中產(chǎn)生的效應(yīng)細(xì)胞，因?yàn)槠淙狈α馨徒Y(jié)-歸巢受體L-選擇蛋白和CCR7，并表達(dá)用于遷移入發(fā)炎組織的受體。當(dāng)與抗原再次相遇后，這些"效應(yīng)記憶T細(xì)胞"(TEM)可以快速產(chǎn)生IFN-y或IL-4,或釋放預(yù)先存儲(chǔ)的穿孔蛋白。第二亞型細(xì)胞表達(dá)L-選擇蛋白和CCR7，并缺乏直接的效應(yīng)功能。這些"中央記憶T細(xì)胞"(TCM)具有低的活化閾值，并且在次級(jí)淋巴樣器官中再次刺激后，增殖并分化為效應(yīng)細(xì)胞(Iezzi,G.等,(2001).J.Exp.Med.193,987-994)。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)單獨(dú)用于BCG首次健康志愿受試者時(shí)，復(fù)制受損的表達(dá)Ag85A(Ag85A)的病毒載體(在這種情況下，示例為"MVA85A，，)可以誘導(dǎo)高水平的抗原特異性分泌干擾素y的記憶T細(xì)胞-效應(yīng)記憶T細(xì)胞和中心記憶T細(xì)胞兩者。在過(guò)去的10年，已經(jīng)建立了用于檢測(cè)和定量T細(xì)胞反應(yīng)的新的免疫測(cè)定法。本發(fā)明的發(fā)明人利用干擾素y(IFN-y)ELISPOT測(cè)定法作為使用MVA85A的臨床實(shí)驗(yàn)的主要的免疫讀數(shù)，因?yàn)镮FN-y從抗原特異性T細(xì)胞的分泌是保護(hù)性對(duì)抗結(jié)核分支桿菌的最佳的可利用的相關(guān)因素。而且，ELISPOT測(cè)定法是非?？芍噩F(xiàn)且靈壽文的定量分泌IFN-y的抗原特異性T細(xì)胞數(shù)目的方法。本發(fā)明的發(fā)明人利用了兩種ELISPOT測(cè)定法體外(新鮮)ELISPOT測(cè)定，其中使用抗原培養(yǎng)外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)18小時(shí)，以測(cè)定CCR7-循環(huán)效應(yīng)T細(xì)胞的水平；和培養(yǎng)的ELISPOT測(cè)定，其中^f吏用抗原培養(yǎng)PBMC10至14天，以檢測(cè)CCR7+中央記憶T細(xì)胞的水平(Godkin等，JI,2002)。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用MVA85A的免疫誘導(dǎo)特異性針對(duì)抗原85A(Ag85A)的強(qiáng)烈的中央記憶T細(xì)胞反應(yīng)，在免疫3周后，當(dāng)循環(huán)效應(yīng)幾乎不可4全測(cè)到T細(xì)胞反應(yīng)時(shí)，依然可4企測(cè)到抗原85A。這首次證明可以通過(guò)施用表達(dá)分枝桿菌抗原的免疫原性組合物而顯著提高患者的長(zhǎng)期中央記憶T細(xì)胞群。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"記憶T細(xì)胞"意于包括T細(xì)胞的兩個(gè)亞型一一CCR7-(效應(yīng)記憶T細(xì)胞)和CCR7+(中央記憶T細(xì)胞)。該定義還包4舌II類限制的CD4記憶T細(xì)胞和I類限制的CD8記憶T細(xì)胞。優(yōu)選地，由本發(fā)明載體疫苗誘導(dǎo)的記憶T細(xì)胞的特征為CCR7+的細(xì)胞表面表達(dá)。這些細(xì)胞在本文被稱為中央記憶T細(xì)胞。優(yōu)選地，由本發(fā)明免疫原性組合物誘導(dǎo)的記憶T細(xì)胞反應(yīng)是保護(hù)性T細(xì)胞反應(yīng)?？梢酝ㄟ^(guò)免疫測(cè)定IFN-y分泌，優(yōu)選抗原特異性T細(xì)胞的IFN-y分泌，來(lái)檢測(cè)保護(hù)性免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，所述記憶T細(xì)胞反應(yīng)是長(zhǎng)期的，并持續(xù)至少1、2、5、10、15、20、25或更多年。最優(yōu)選地，所述保護(hù)性免疫反應(yīng)是終生的。優(yōu)選地，在病毒載體中表達(dá)Ag85A基因。優(yōu)選地，在非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體中表達(dá)Ag85A基因。術(shù)語(yǔ)"載體疫苗"是本領(lǐng)域公知的。在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的載體是非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。如本文使用的術(shù)語(yǔ)"非復(fù)制的"或"復(fù)制受損的，，意思是在多數(shù)正常人類細(xì)胞中不能復(fù)制至任何顯著的程度。非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒可以天然(即，其可以作為這樣的病毒從自然界分離)或人工(例如，通過(guò)體外培養(yǎng)或通過(guò)基因操作，例如刪除對(duì)復(fù)制關(guān)鍵的基因)變成。一般存在一種或幾種可以培養(yǎng)所述病毒的細(xì)胞類型，例如用于經(jīng)修飾的Ankara病毒(MVA)的CEF細(xì)胞。通常，所述病毒載體應(yīng)該能夠刺激T細(xì)胞反應(yīng)?？稍谶@里使用的病毒載體的實(shí)例是牛痘(vaccinia)病毒載體，例如MVA或NYVAC。優(yōu)選的病毒載體是牛痘株MVA或從MVA衍生的毒抹。牛痘載體的替代物包括其他痘病毒(poxvirus)載體，包括禽痘(avipox)載體，例如雞痘(fowlpox)或金絲雀痘(canarypox)載體。特別適合作為禽痘載體的是已知為ALVAC(可作為Kanapox商購(gòu)獲得)的金絲雀痘抹，和從ALVAC衍生的毒抹，和已知為FP9的雞痘抹。其他替代物是曱病毒屬載體、腺病毒載體、皰滲病毒載體、黃病毒屬載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和流感病毒載體。例如，所述載體可以是非人類腺病毒載體。已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，腺病毒載體的使用除了誘導(dǎo)非常強(qiáng)的CD4記憶T細(xì)胞反應(yīng)外，還誘導(dǎo)了非常強(qiáng)的CD8記憶T細(xì)胞反應(yīng)。同一疫苗誘導(dǎo)CD8和CD4兩種記憶T細(xì)胞反應(yīng)，可能在預(yù)防和治療分枝桿菌疾病中都是有益的。因此，本申請(qǐng)的范圍內(nèi)還包括使用腺病毒載體誘導(dǎo)針對(duì)抗原的CD8和CD4記憶T細(xì)胞反應(yīng)的方法，所述腺病毒載體表達(dá)所述抗原或其免疫原性片段。由所述腺病毒載體表達(dá)的抗原優(yōu)選為上述分枝桿菌抗原，最優(yōu)選為Ag85A，但可選地，可以是任何其他適當(dāng)抗原。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括:表達(dá)抗原或其免疫原性片段的腺病毒載體在制備用于誘導(dǎo)針對(duì)所述抗原的CD8和CD4記憶T細(xì)胞反應(yīng)的藥劑中的用途。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了表達(dá)分枝桿菌抗原或其免疫原性片段的腺病毒載體在制備用于治療或預(yù)防分枝桿菌疾病的藥劑中的用途。所述抗原優(yōu)選為上述分枝桿菌抗原，最優(yōu)選為Ag85A，但可選地，可以是任何其他適當(dāng)抗原。優(yōu)選的是，所述病毒載體不能在人類患者中導(dǎo)致嚴(yán)重的感染。一般通過(guò)兩種方法檢測(cè)病毒的復(fù)制1)DNA合成和2)病毒滴度(viraltitre)。更準(zhǔn)確地i兌，如本文4吏用的并當(dāng)用于痘病毒時(shí)，術(shù)語(yǔ)"非復(fù)制或復(fù)制受損的"表示滿足下述標(biāo)準(zhǔn)的任一或兩者的病毒1)與牛痘病毒Copenhagen抹相比，表現(xiàn)出在MRC-5細(xì)胞(人類細(xì)胞系)中的DNA合成減少1log(10倍)；2)與牛痘病毒Copenhagen抹相比，表現(xiàn)出在HELA細(xì)胞(人類細(xì)胞系)中的病毒滴度減少21og。落入該定義的痘病毒的實(shí)例為MVA、NYVAC和禽痘病毒，而在該定義之外的病毒是減毒的牛痘林M7。枝桿菌疾病的藥劑中的用途，所述免疫原性組合物包含非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體，該病毒載體表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因的翻譯產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述免疫原性組合物是載體疫苗。所述免疫原性組合物和載體疫苗通過(guò)在所述患者中誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)而起作用。根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以是預(yù)防性的(即，防止感染)、暴露后的(即，在感染后但在疾病前治療)或治療性的(即，治療疾病)，但通常是預(yù)防性或暴露后的?？梢酝ㄟ^(guò)本發(fā)明的載體疫苗治療或預(yù)防的分枝桿菌疾病包括結(jié)核病、麻風(fēng)病、鳥分枝桿菌(綺co^cten'wmaWwm)感染、非結(jié)核分枝桿菌感染、布魯利(Buruli)潰瘍、牛分枝桿菌(MycoMcteWMmZwv/s)感染或疾病、副結(jié)核分枝桿菌(綺co6(2Cfe"'wm/7ara^6e/rw/a^)感染或相關(guān)疾病。其他疾病(即，非分枝桿菌疾病)包括炎性腸病、克隆氏病、自身免疫疾病、癌癥、力旁力光癌、天花和賓吳痘?？梢允褂脤ｉT的病毒載體構(gòu)建體來(lái)幫助所述載體疫苗的制備和利用。本文描述的所有載體構(gòu)建體形成了本發(fā)明的方面。包含這些病毒構(gòu)建體的載體疫苗也作為本發(fā)明的方面被涵蓋。例如，一種或多種抗原基因可以在所述基因的羧基端或氨基端被截短。這可以具有促進(jìn)克隆和構(gòu)建所述載體疫苗的作用，并且可選地或另外，可以導(dǎo)致效力提高。用于截短的方法將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。實(shí)現(xiàn)這種截短的最簡(jiǎn)單的方法是使用各種公知的基因工程技術(shù)，以選4奪性刪除所述抗原基因任一端的編碼核酸序列，然后將所需的編碼序列插入所述病毒載體。例如，分別使用3'和/或5'核酸外切酶策略選擇性地侵蝕所述編碼核酸的3'和/或5'端，生成所述候選蛋白的截短。優(yōu)選地，野生型基因序列被截短，這樣所表達(dá)的抗原相對(duì)于母抗原被截短了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個(gè)氨基酸。最優(yōu)選地，抗原基因是相對(duì)于野生型Ag85A抗原在羧基端被截短了15個(gè)氨基酸的Ag85A(SEQIDNO:3，SEQIDNO:4的表達(dá)產(chǎn)物)。適用于本發(fā)明的抗原還包括所述母抗原的片段，條件是那些片段具有與母抗原共同的抗原決定簇或表位，或者與母抗原是免疫可識(shí)別的。編碼這些片段的多核苷酸也適用于本發(fā)明的免疫原性組合物和載體疫苗。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"片段"指多肽，該多肽的氨基S菱序列與衍生該多肽的母抗原或其一個(gè)功能等同物的氨基酸序列部分但非全部相同。所述片段應(yīng)該包括至少n個(gè)來(lái)自所述序列的連續(xù)氨基酸，并且根據(jù)特定的序列，n優(yōu)選為7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20或更多)。小的片段可以形成抗原決定簇。本發(fā)明的抗原基因還可以編碼所述母抗原的變異體或功能等同物。這種核酸分子可以是天然存在的變異體，例如天然存在的等位基因變異體，或者所述分子可以是未知天然存在的變異體。所述核酸分子的這種非天然存在的變異體可以通過(guò)誘變技術(shù)制備，包括應(yīng)用于核酸分子、細(xì)胞或有機(jī)體的那些技術(shù)。在這點(diǎn)上，所述變異體是通過(guò)核苷酸置換、缺失或插入而不同于前述抗原基因序列的變異體。所述置換、缺失或插入可以涉及一個(gè)或多個(gè)核苷的變更可以生成保守或非保守的氨基酸置換、缺失或插入?？蛇x地，或除了使用基因平截以外，編碼所述抗原的基因可以包括編碼標(biāo)簽多肽的核酸，這樣所述標(biāo)簽多肽在翻譯后共價(jià)連接至所述抗原。優(yōu)選地，所述標(biāo)簽多肽選自PK標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、MYC標(biāo)簽、多組氨酸標(biāo)簽或任何可以#皮單克隆抗體4企測(cè)的標(biāo)簽組成的組。其他實(shí)例將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是清楚的。如果被使用，所述PK標(biāo)簽優(yōu)選地具有Pro-Asn-Pro-Leu-Gly-Leu-Asp序列。這種類型的標(biāo)簽可以有助于4企測(cè)抗原表達(dá)和表達(dá)所述抗原的克隆，并可選地或另外，可以導(dǎo)致效力的提高?？梢远ㄎ痪幋a所述標(biāo)簽多肽的核酸，這樣，在翻:^奪后，所述標(biāo)簽位于所表達(dá)的抗原的羧基端或氨基端，或者可以在所表達(dá)的抗原的內(nèi)部。優(yōu)選地，所述標(biāo)簽位于所表達(dá)抗原的羧基端。編碼連接子序列的核香酸可以插入編碼所述標(biāo)簽多肽的核酸與編碼所表達(dá)的抗原的核酸之間。優(yōu)選地，當(dāng)-陂表達(dá)時(shí)，所述連接子序列包含氨基酸Gly-Ser-Ile。更優(yōu)選地，氨基酸Gly-Ser-Ile插入抗原序列氨基端和所表達(dá)的抗原的標(biāo)簽之間。最優(yōu)選地，所表達(dá)的抗原是Ag85a(Ag85A),且PK標(biāo)簽位于Ag85a(Ag85A)基因的羧基端。編碼抗原的基因還可以包括前導(dǎo)序列。所述前導(dǎo)序列可以影響初級(jí)轉(zhuǎn)錄物加工為mRNA、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。優(yōu)選地，所述前導(dǎo)序列提高所述抗原的表達(dá)和/或免疫原性。提高的免疫原性可以通過(guò)例如培養(yǎng)和體外ELISPOT測(cè)定法測(cè)定。提高的表達(dá)水平可以通過(guò)例如使用單克隆抗體檢測(cè)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量來(lái)測(cè)定。優(yōu)選地，當(dāng)與未使用所述前導(dǎo)序列表達(dá)的抗原相比較時(shí)，表達(dá)和/或免疫原性被提高了2倍、3倍或更多。適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)序列的實(shí)例是t-PA(組織纖溶酶原激活物)(MalinA.S.等，(2000)MicrobesInfect.2000Nov;2(14):1677-85)。優(yōu)選地，所述病毒載體構(gòu)建體包括與TPA前導(dǎo)序列融合的羧基端截短了的Ag85A序列。而在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的病毒載體表達(dá)與TPA前導(dǎo)序列和與PK標(biāo)簽序列融合的羧基端截短的Ag85A序列。優(yōu)選地，所述前導(dǎo)序列與所述抗原的氨基端融合，且所述標(biāo)簽序列融合至所述蛋白質(zhì)的內(nèi)部或羧基端。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病毒載體的構(gòu)建體包括編碼羧基端截短了15個(gè)氨基酸的Ag85a(Ag85A)的多核苷酸，所述Ag85a融合至TPA序列并帶有Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp序列的羧基端PK標(biāo)簽，其中氨基酸殘基Gly-Ser-Ile存在于所述Ag85A序列和所述PK標(biāo)簽之間(SEQIDNO:5)。優(yōu)選地，病毒載體的表達(dá)產(chǎn)物具有SEQIDNO:6的氨基酸序列。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的發(fā)明人注意到的保護(hù)性T細(xì)胞的作用在之前已經(jīng)暴露于分枝桿菌抗原的人類患者中特別有效。異源初始-加強(qiáng)(prime-boost)免疫策略在動(dòng)物和人類中誘導(dǎo)了比使用相同疫苗的同源性加強(qiáng)更高水平的效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)(Schneider,J.等，(1998)Nat.Med.4,397-402,McShane,H.等，(2001)Infect.Immim.69，681-686)。對(duì)BCG的效力在(新生接種的)個(gè)體年齡到達(dá)10至15歲時(shí)逐漸消失的潛在機(jī)制還了解甚少。一個(gè)可能的假設(shè)是，BCG產(chǎn)生的免疫性已經(jīng)消失，而所述個(gè)體變得等同于首次用于實(shí)驗(yàn)的宿主，其可以使用設(shè)計(jì)成誘導(dǎo)初次免疫的新候選疫苗進(jìn)行免疫。盡管使用BCG重復(fù)免疫沒(méi)有表現(xiàn)出進(jìn)一步提高對(duì)抗TB的保護(hù)(參考RodriguesL等，Lancet2005)，但BCG結(jié)合入異源初次-加強(qiáng)方案將維持BCG的保護(hù)效應(yīng)。使用表達(dá)抗原85A(Ag85A)的病毒載體加強(qiáng)的BCG在幾種動(dòng)物模型中的免疫原性和保護(hù)效力之前已經(jīng)有記載(Goonetilleke,N.R等，(2003)J.Immunol.171,1602-1609;WilliamsA等，InfectionandImmunity(73(6):3814-6),但沒(méi)有記載保護(hù)性記憶T細(xì)胞反應(yīng)的誘導(dǎo)。因此，本發(fā)明還提供了一種用于提高人類患者中T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，其包括聯(lián)合載體疫苗為患者施用至少一種分枝桿菌抗原的步驟，所述載體疫苗包含表達(dá)分枝桿菌85a(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。優(yōu)選地，所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)是記憶T細(xì)胞免疫反應(yīng)。本發(fā)明還提供了(a)至少一種分枝桿菌抗原和(b)包含表達(dá)分枝桿菌85a(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗，在制備用于施用至患者以誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)的藥劑中的用途。可以同時(shí)、順序或分開施用包含表達(dá)分枝桿菌85a(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗和分枝桿菌抗原。例如，可以在施用所述載體疫苗之前，施用所述分枝桿菌抗原以對(duì)患者進(jìn)行預(yù)免疫，或者在施用所述載體疫苗之后，施用所述分枝桿菌抗原以加強(qiáng)患者對(duì)所述載體疫苗的免疫反應(yīng)。另外，本發(fā)明還提供了一種在人類患者中誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，其包括給人類患者施用免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包括表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體，其中所述患者已經(jīng)預(yù)先暴露于至少一種分枝桿菌抗原。優(yōu)選地，所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)是記憶T細(xì)胞免疫反應(yīng)。本發(fā)明還提供了包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或中分枝桿菌疾病的藥劑中的用途，所述患者已經(jīng)預(yù)先暴露于分支桿菌抗原。分枝桿菌抗原可以來(lái)自結(jié)核分枝桿菌和/或可以來(lái)自一種或多種其他分枝桿菌，例如鳥胞內(nèi)分枝桿菌(M"Www-/"/race〃w/flre)、堪薩斯分枝桿菌(A/!femsos7'/)、海分枝桿菌(Mwan'm/w)和/或潰瘍分枝桿菌w/cerara)。當(dāng)患者已經(jīng)預(yù)先暴露于僅一種抗原時(shí)，所述抗原可以是賦予針對(duì)分枝桿菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)先暴露于患者的抗原不是Ag85A?？蛇x地或另外，患者可以預(yù)先暴露于一種或多種分枝桿菌本身。例如，患者預(yù)先暴露于至少一種分枝桿菌抗原可以包括預(yù)先暴露于結(jié)核分枝桿菌?？蛇x地或另外，患者預(yù)先暴露于至少一種分枝桿菌抗原可以包括預(yù)先暴露于環(huán)境分枝桿菌，例如鳥胞內(nèi)分枝桿菌(Mm^wwWrace〃w/aw)、堪薩斯分枝桿菌(似.A:a"mw7)、海分枝桿菌(Mmon'wwm)和/或潰瘍分枝桿菌(Mw/ceram)。優(yōu)選地，患者潛伏感染所述分枝桿菌。例如，患者可以預(yù)先暴露于結(jié)核分枝桿菌并潛伏感染結(jié)核。當(dāng)所述藥劑用于治療潛伏感染了所述分枝桿菌的患者時(shí)，所述治療優(yōu)選根除所述分枝桿菌感染?？蛇x地或另外，預(yù)先暴露可以包括使用BCG的新生期免疫或預(yù)免疫。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在先前使用BCG免疫和然后接受加強(qiáng)劑量的本發(fā)明載體疫苗的志愿者中，誘導(dǎo)了顯著較高水平的抗原特異性的分泌干擾素y的T細(xì)胞，并且在免疫后24周，所述水平比施用單獨(dú)BCG免疫的受免疫者中高5-30倍。因此，本發(fā)明的該方面提供了一種在人類患者中誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，該方法包括以下步驟使所述患者暴露于至少一種分枝桿菌抗原，和通過(guò)施用包括免疫原性組合物的加強(qiáng)組合物加強(qiáng)所述免疫反應(yīng)，所述免疫原性組合物包含表達(dá)分枝桿菌85a(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。本發(fā)明的該方面還涉及一種用于在人類患者中產(chǎn)生T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，該方法包括以下步驟i)使所述患者暴露于至少一種分枝桿菌抗原；ii)給所述患者施用至少一次劑量的包括載體疫苗的加強(qiáng)組合物，所述載體疫苗包含表達(dá)分枝桿菌85a(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述患者在步驟i)中僅暴露于一種分枝桿菌抗原，所述抗原是賦予保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原，但不是Ag85A。步驟i)可以在任何年齡的患者中進(jìn)行，例如，在新生期、嬰兒期、青春期或成人期過(guò)程中。優(yōu)選地，所述患者在新生期暴露于所述至少一種分枝桿菌抗原。免疫原性組合物的施用可以發(fā)生在預(yù)先暴露于至少一種分枝桿菌抗原之后的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多周或者0.25、0.5、0.75、1、5、10、15、20、25、30、35或40或更多年。優(yōu)選地，當(dāng)步驟i)在患者處于嬰兒期時(shí)進(jìn)行時(shí)，則步驟ii)在嬰兒期或青春期進(jìn)行。當(dāng)步驟ii)包括給所述患者施用超過(guò)一次劑量的加強(qiáng)組合物時(shí)，所述超過(guò)一次的劑量可以以短時(shí)間周期或長(zhǎng)時(shí)間周期施用。例如，所述加強(qiáng)組合物劑量可以以小時(shí)、天、周、月或年的周期施用。例如，第二次加強(qiáng)劑量可以在下述時(shí)間施用在第一次加強(qiáng)劑量之后0.5小時(shí)和24小時(shí)之間，在第一次加強(qiáng)劑量之后1天和7天之間，在第一次加強(qiáng)劑量之后1周和1個(gè)月之間，在第一次加強(qiáng)劑量之后的l個(gè)月和6個(gè)月之間，在第一次加強(qiáng)劑量之后的6個(gè)月和1年之間，或者在第一次加強(qiáng)劑量之后的1至2年之間、2至5年之間、6至10年之間或超過(guò)10年。加上適當(dāng)?shù)男拚?mwta^swwto^fo)，這些時(shí)間間隔優(yōu)選還應(yīng)用于任何隨后劑量之間的周期。在本發(fā)明的第二方面中，除了誘導(dǎo)的抗85a(Ag85A)抗原的免疫反應(yīng)以外，所述病毒載體刺激載體特異性的T細(xì)胞反應(yīng)。4艮據(jù)本發(fā)明的該方面，本發(fā)明的載體疫苗的施用促進(jìn)了抗病毒的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，所述病毒載體從所述病毒衍生。例如，在本發(fā)明的載體疫苗中使用MVA載體促進(jìn)抗牛痘病毒的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，該T細(xì)胞反應(yīng)是保護(hù)性的T細(xì)胞反應(yīng)。該類型的作用在之前已經(jīng)被報(bào)道并且是明顯有利的，因?yàn)樗鲚d體疫苗在以下兩個(gè)方面具有雙重作用首先在保護(hù)性抵抗分枝桿菌疾病中，和第二在保護(hù)性抵抗所述載體相關(guān)病毒介導(dǎo)的疾病中。在MVA載體的情況中，這樣的疾病是天花。可以通過(guò)本發(fā)明載體疫苗治療或預(yù)防的病毒衍生疾病對(duì)于本領(lǐng)域^支術(shù)人員是清楚的；實(shí)例包括天花、猴痘和播散性牛痘感染。因此，本發(fā)明的該方面提供了一種在人類患者中誘導(dǎo)抗分枝桿菌抗原和病毒的T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，包括給所述人類患者施用包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的免疫原性組合物。優(yōu)選地，所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)是記憶T細(xì)胞反應(yīng)。本發(fā)明的該方面還提供了包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的免疫原性組合物，在制備用于在人類患者中誘導(dǎo)抗分枝桿菌抗原和病毒的T細(xì)胞免疫反應(yīng)的藥劑中的用途。本發(fā)明的疫苗遞送免疫有效量的至少一種抗原至患者。對(duì)于"免疫有效量"，其意思是該量以單次劑量或作為一系列劑量的部分對(duì)個(gè)體的施用，對(duì)于治療或預(yù)防是有效的。該量根據(jù)所述待治療個(gè)體的健康和身體狀況、年齡、所述個(gè)體免疫系統(tǒng)的能力、希望保護(hù)的程度、所述疫苗的組成、治療醫(yī)生對(duì)醫(yī)療情境的評(píng)價(jià)和其他相關(guān)因素而變化。預(yù)期所述量將處于可以通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定的相對(duì)寬的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的第三個(gè)方面，所述病毒載體可進(jìn)一步表達(dá)一種或多種附加抗原基因的翻譯產(chǎn)物，所述抗原基因可用以誘導(dǎo)針對(duì)這類附加抗原的抗原特異性免疫反應(yīng)。所述免疫反應(yīng)可以是CD8+、CD4+和/或抗體反應(yīng)。優(yōu)選地，所述一種或多種附加抗原來(lái)源于結(jié)核分枝桿菌、癡原蟲(P/^m^Z/wwW)、流感病毒、HIV、丙型肝炎病毒(T/epa"'toCWn^)、細(xì)胞巨化病毒(Qvto附ega/ov/n^)、人IL頭瘤病毒(//wwaw/qp/〃omov/ras)、癡疾、利什曼寄生蟲(leishmaniaparasites),或優(yōu)選地，4壬<可分4支桿菌亞種(mycobacteriaspp)。優(yōu)選地，所述一種或多種附加抗原基因編碼的抗原選自來(lái)自任何分枝桿菌的抗原85家族的抗原或任何由分枝桿菌亞種表達(dá)的抗原組成的組；更優(yōu)選地，一種或多種潛伏抗原，例如16kDa抗原或肝素結(jié)合血細(xì)胞凝集素(haemagglutinin)(HBHA)或ESAT6或稱為72F的融合蛋白。還預(yù)期，所述附加抗原可以是內(nèi)源衍生的，這樣所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)定向抵抗腫瘤。適合本發(fā)明使用的內(nèi)源衍生抗原是人類熱激蛋白，和肺瘤相關(guān)抗原，例如CEA、PSA、Muc畫1、Her2neu。所述病毒載體可以凈皮設(shè)計(jì)為表達(dá)作為表位串(epitopestring)的Ag85A基因和一種或多種附加抗原基因。有利地，一串多個(gè)表位中的表位連接在一起而沒(méi)有間插序列，這樣避免不必要的核酸和/或氨基酸物質(zhì)。所述表位串的生成可優(yōu)選通過(guò)使用重組DNA構(gòu)建體來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述重組DNA構(gòu)建體編碼所述表位串的氨基酸序列，且編碼Ag85A的DNA與編碼所述附加抗原的DNA在同一閱讀框?；蛘?，Ag85A和所述附加抗原可以作為分離的多肽#:表達(dá)。本發(fā)明的該方面還提供了包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗，在制備通過(guò)在所述患者中誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)用于治療或預(yù)防人類患者中分枝桿菌疾病和至少一種其他疾病的藥劑中的用途。根據(jù)本發(fā)明的該方面，所述載體疫苗可用以通過(guò)在人類患者中誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)來(lái)保護(hù)性抵抗分枝桿菌疾病和一種或多種選自HIV、瘧疾和天花組成的組的疾病，所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)優(yōu)選記憶T細(xì)胞免疫反應(yīng)。盡管本發(fā)明的載體疫苗可單獨(dú)使用，但其也可以與其他免疫或治療方案結(jié)合用于治療或預(yù)防其他疾病。因此，除提供上述載體疫苗之外，本發(fā)明還提供了一種包含本發(fā)明載體疫苗和一種或多種衍生于致病因子的其他抗原或表位的組合物。適用于本發(fā)明的組合物的抗原和表位可以是細(xì)菌或病毒來(lái)源的。適當(dāng)?shù)目乖梢赃M(jìn)一步被分類為蛋白質(zhì)抗原、糖類抗原或糖軛合物抗原。本發(fā)明的組合物可以包括一種或多種其他抗原或表位。實(shí)例為-不同的分枝桿菌抗原或表位。-fflV抗原或表位；。-疾原蟲抗原或表位。-疾疾抗原或表4立。一來(lái)自月申炎4連J求菌(Sfreptococcws/wewmo"/ae)的灃唐4元原。-來(lái)自肺炎鏈球菌(例如，來(lái)自PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Spl25、Spl01、Spl28、Spl30和Spl33)的蛋白質(zhì)抗原。-來(lái)自甲型肝炎病毒(例如滅活病毒)的抗原或表位。-來(lái)自乙型肝炎病毒(例如表面抗原和/或核心抗原)的抗原或表位。-來(lái)自丙型肝炎病毒的抗原或表位。-來(lái)自b型流感嗜血桿菌的糖抗原。-脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原或表位(例如IPV中)。-白喉疫苗或其組成性表位或抗原或類毒素。-破傷風(fēng)疫苗或其組成性表位或抗原或類毒素。-麻滲、流行性腮腺炎和/或風(fēng)滲抗原或表位。-流感抗原或表位，例如血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶表面蛋白。所述流感抗原可以選自廣泛流行的毒抹，例如禽流感，例如H5N1抹。-來(lái)自金黃色葡萄球菌(及，/ococc船)的#元原或表4立。-癌抗原或表4立。當(dāng)使用糖抗原時(shí)，其優(yōu)選與載體軛合，以提高免疫原性。當(dāng)必要時(shí)，毒性蛋白抗原可以通過(guò)化學(xué)和/或遺傳方法脫毒。糖抗原優(yōu)選為軛合物形式。用于軛合物的優(yōu)選載體蛋白是細(xì)菌毒素或類毒素，例如白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素。當(dāng)為白喉類毒素時(shí)，白喉毒素的CRM197突變體是特別優(yōu)選的載體。其他適當(dāng)?shù)妮d體蛋白包括腦膜炎奈瑟菌(TV.we"/"g/^fe)外膜蛋白、合成肽、熱激蛋白、百日咳蛋白、細(xì)胞因子、淋巴因子、激素、生長(zhǎng)因子、人工蛋白質(zhì)，所述人工蛋白質(zhì)包括多種來(lái)自各種病原體衍生抗原的人類CD4+T細(xì)胞表位，例如N19蛋白、來(lái)自流感嗜血桿菌(/"ywew加e)的蛋白D、肺炎球菌表面蛋白PspA、肺炎球菌溶血素、鐵吸收蛋白質(zhì)、來(lái)自艱難梭菌(C.^爐cZ/e)的毒素A或B，等。所述組合物中的其他抗原通常每種以至少1嗎/ml的濃度存在。一舶二而言，任何給定抗原的濃度足以引發(fā)針對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)。作為在所述混合物中使用其他蛋白質(zhì)抗原的替代，可以使用編碼所述抗原的核酸。因此，所述混合物的蛋白質(zhì)組分可以由編碼所述蛋白質(zhì)的核酸(優(yōu)選DNA,例如，以質(zhì)粒形式)所取代。類似地，本發(fā)明的組合物可以包含模擬糖抗原的蛋白質(zhì)，例如模擬表位或抗獨(dú)特型抗體。另外，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明載體疫苗和一種或多種抗微生物化合物的組合物。適用于本發(fā)明的組合物的抗微生物劑的實(shí)例是抗結(jié)核的化療劑，例如利福平、異煙肼、乙胺丁醇、吡。秦酰胺(pyrizinamide)等。因此，本發(fā)明提供了一種在人類患者中提高針對(duì)至少一種抗原的T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，該方法包括以下步驟結(jié)合至少一種其他抗原和/或抗微生物劑，給所述患者施用包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗。本發(fā)明還提供了(a)包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗和(b)至少一種其他抗原和/或微生物，在制備用于施用至人類患者以誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)的藥劑中的用途?？梢酝瑫r(shí)、順序或分開施用包括表達(dá)分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗和其他抗原和/或抗微生物劑。例如，可以在施用所述抗原/抗樣i生物劑之前施用所述載體疫苗至以對(duì)患者進(jìn)行預(yù)免疫，或施用所述抗原之后，施用所述載體疫苗以加強(qiáng)患者對(duì)所述抗原的免疫反應(yīng)。所述載體疫苗和抗原/抗微生物劑優(yōu)選混合施用。本發(fā)明還提供了至少一種抗原和/或抗微生物劑在制備用于誘導(dǎo)患者T細(xì)胞免疫反應(yīng)的藥劑中的用途，其中所述藥劑與載體疫苗一起施用，所述載體疫苗包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。類似地，本發(fā)明提供了包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗在制備用于誘導(dǎo)患者T細(xì)胞免疫反應(yīng)的藥劑中的用途，其中所述藥劑與至少一種其他抗原和/或抗微生物劑一起施用。本發(fā)明還提供了至少一種抗原和/或抗微生物劑在制備用于誘導(dǎo)患者T細(xì)胞免疫反應(yīng)的藥劑中的用途，其中所述患者已經(jīng)用包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗預(yù)處理。本發(fā)明還提供了包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗在制備用于誘導(dǎo)患者T細(xì)胞免疫反應(yīng)的藥劑中的用途，其中所述患者已經(jīng)用至少一種抗原和/或抗微生物劑預(yù)處理。如上所述，本發(fā)明可用以誘導(dǎo)或提高多種免疫反應(yīng)。特別地，本發(fā)明的目的是確定免疫抵抗涉及分枝桿菌的疾病的有效方法。所述疾病包括漢森氏病、結(jié)核病、骨髓炎、克隆氏病、麻風(fēng)病、淋巴腺炎、約尼氏病。本發(fā)明的上述方面適用于多種不同的患者，包括例如兒童；患有HIV、AIDS的患者，免疫妥協(xié)/免疫抑制的患者，或經(jīng)歷過(guò)器官移植、骨髓移植的患者，或患有遺傳免疫缺陷的患者。當(dāng)所述疫苗用于預(yù)防用途時(shí)，所述患者可以是兒童(例如新生兒或1-5歲的兒童)、年長(zhǎng)的兒童或青少年；當(dāng)所述疫苗用于治療用途時(shí)，所述患者優(yōu)選為成年人。預(yù)期用于兒童的疫苗也可以施用至成年人，例如以評(píng)價(jià)安全性、劑量、免疫原性等。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，該組合物包含(l)本發(fā)明的免疫原性組合物和(2)藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明提供了一種制備藥物的方法，該方法包括以下步驟(i)制備本發(fā)明的載體疫苗；和(ii)將所述免疫原性組合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體混合。載體(2)可以是本身不誘導(dǎo)生成對(duì)接受所述組合物的患者有害的抗體并且其施用沒(méi)有異常毒性的任何物質(zhì)。適當(dāng)?shù)妮d體可以是大的緩慢代謝的大分子，例如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和無(wú)活性的病毒顆粒。這樣的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。藥學(xué)上可接受載體可包括液體，例如水、鹽水、甘油和乙醇。這類載體中還可以存在輔助物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。還可以存在穩(wěn)定劑(例如海藻糖)或允許室溫下水溶性糖玻璃形成的物質(zhì)。后者包括使用混合的可溶性玻璃穩(wěn)定技術(shù)，以微球形式懸浮于全氟碳液體中。脂質(zhì)體也是適當(dāng)?shù)妮d體。藥物載體的全面討論可獲自Gennaro(2000)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy.第20版,ISBN:0683306472。本發(fā)明的藥物組合物還可預(yù)防性應(yīng)用于例如下述情況希望與微生物接觸時(shí)和要防止建立感染時(shí)。例如，可在外科手術(shù)之前施用所述組合物。所述藥物組合物優(yōu)選是無(wú)菌的。其優(yōu)選是無(wú)熱原的。其優(yōu)選是緩沖的，例如介于pH6和pH8之間，通常約pH7。優(yōu)選地，所述組合物基本是與人類等滲的。本發(fā)明的組合物可通過(guò)多種不同的途徑施用。某些途徑對(duì)于某些組合物是更有利的，因?yàn)閷?dǎo)致生成更有效的反應(yīng)，或者因?yàn)檩^少可能誘導(dǎo)副作用，或者因?yàn)楦菀捉o藥。例如，本發(fā)明使用的組合物可以通過(guò)任何幾種途徑施用，包括j旦不限于經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)皮或經(jīng)皮膚應(yīng)用(transdermalortranscutaneousapplication)、皮下、腹月莫內(nèi)、鼻內(nèi)、腸內(nèi)、局部、舌下、陰道內(nèi)或直腸方式。所述組合物可制備用于鼻內(nèi)給藥，作為鼻腔噴霧、滴鼻劑、凝膠或粉末，注射劑(液體溶液或懸浮劑)；也可制備成在適合于在注射前溶解于或懸浮于液體載體中的固體形式。所述組合物的直接給藥一般將通過(guò)皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射完成，或者遞送至組織的細(xì)胞間隙。劑量治療可以是單次劑量方案或多劑量方案?，F(xiàn)在將通過(guò)參考下述附圖以舉例方式更詳細(xì)描述本發(fā)明的各方面和實(shí)施方案附圖簡(jiǎn)述圖1:各免疫組中免疫后的平均IFN-yELISPOT反應(yīng)單獨(dú)BCG;單獨(dú)MVA85A;BCG預(yù)免疫-MVA85A加強(qiáng)。(a)各組中免疫的適當(dāng)時(shí)間(周)；(b)結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(PPD)反應(yīng)；(c)純化的抗原85(Ag85A)蛋白反應(yīng)；(d)累加的池肽反應(yīng)；(e)對(duì)于三種受測(cè)蛋白的每一種，使用Mann-Whitney統(tǒng)計(jì)值比較各疫苗組在各時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)。表明了統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著對(duì)照；(f)在BCG免疫的個(gè)體中MVA加強(qiáng)之后的T細(xì)胞表位展示。所有單個(gè)肽的反應(yīng)被CD4+T細(xì)胞清除所消除；圖2:免疫之前，對(duì)于單獨(dú)MVA85A研究中的4名志愿者，篩查針對(duì)結(jié)核分枝桿菌PPD、鳥分枝桿菌PPD和重組抗原85A(Ag85A)的血液培養(yǎng)的ELISPOT反應(yīng)。通過(guò)代碼TXXXXXX識(shí)別每個(gè)志愿者，其中前3個(gè)X相應(yīng)于試驗(yàn)號(hào)，后3個(gè)X相應(yīng)于志愿者號(hào)，例如T002022意思為T002是試驗(yàn)號(hào)，022是志愿者號(hào)；圖3:5名志愿者(每個(gè)通過(guò)代碼TXXXX識(shí)別，其中XXXX是四位數(shù)，第l位相應(yīng)于試驗(yàn)號(hào)，第2、3和4位相應(yīng)于志愿者號(hào)，例如T2003意思為T2是試驗(yàn)號(hào)，而003是志愿者號(hào)(T2與上述圖2中的T002相同》在單獨(dú)MVA85A免疫給藥3周后，針對(duì)多池Ag85A肽(使用大寫字母標(biāo)記)的培養(yǎng)的(標(biāo)記為"培養(yǎng)")和體外ELISPOT反應(yīng)。免疫后的反應(yīng)非常高，并高于免疫前的反應(yīng)。志愿者之前沒(méi)有使用BCG免疫；圖4:隨訪在第1周接受免疫的MVA-85A免疫的健康志愿者中針對(duì)MVA-Lac-z的T細(xì)胞反應(yīng)，所述MVA-Lac-z用作體外ELISPOT測(cè)定中的抗原。志愿者之前沒(méi)有使用BCG免疫；圖5(a):在潛伏感染結(jié)核分枝桿菌的受試者中單獨(dú)使用MVA85A免疫后對(duì)PPD、重組抗原85A(Ag85A)和累加抗原85A(Ag85A)肽池的平均Elispot反應(yīng)；圖5(b):在BCG預(yù)免疫的受試者(T005,即實(shí)-驗(yàn)5;參見實(shí)施例1)和潛伏感染結(jié)核分枝桿菌的受試者(T007,即實(shí)驗(yàn)7)中MVA85A誘導(dǎo)的累加抗原85A(Ag85A)池肽反應(yīng)的比較；圖5(c):在BCG預(yù)免疫的受試者(T005)和潛伏感染結(jié)核分枝桿菌的受試者(T007)中MVA85A誘導(dǎo)的重組抗原85A(Ag85A)反應(yīng)的比較；圖6(a):在預(yù)免疫(BCG)和加強(qiáng)(MVA85A)之間長(zhǎng)(超過(guò)10年)間隔的受試者組免疫后至少1年的MVA85A誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的持久性；圖6(b):在預(yù)免疫(BCG)和加強(qiáng)(MVA85A)之間短(一個(gè)月)間隔的受試者組免疫后至少1年的MVA85A誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的持久性；圖7(a):BCG和MVA85A免疫之間的間隔與MVA85A后1周針對(duì)抗原85A(Ag85A)累加肽池的T細(xì)胞反應(yīng)之間相關(guān)性的缺乏；圖7(b):BCG和MVA85A免疫之間的間隔與MVA85A后24周針對(duì)抗原85A(Ag85A)累加肽池的T細(xì)胞反應(yīng)之間相關(guān)性的缺乏；圖8(a)顯示了免疫后IFN-y的平均水平；圖8(b)顯示了攻擊后IFN-y的平均水平；圖9(a)顯示了BCG預(yù)免疫的英國(guó)志愿者中針對(duì)MVA85A的體外IFN-丫Elispot反應(yīng)；和圖9(b)顯示了BCG預(yù)免疫的剛比亞志愿者中針對(duì)MVA85A的體外IFN畫yElispot反應(yīng)。實(shí)施例實(shí)施例1MVA85A疫苗之前已經(jīng)描述了MVA85A的構(gòu)建(McShane，H.等，(2002)Infect.Immun.70,1623-1626)。臨床級(jí)的MVA85由ImpfstoffwerkeDessau-Tomau生產(chǎn)，達(dá)到良好操作規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于臨床試驗(yàn)中使用MVA85A，藥物和保健產(chǎn)品監(jiān)管署(MedicinesandHealthcareproductsRegulatoryAgency,London)頒發(fā)了醫(yī)師和牙醫(yī)害谷免"i正書(DoctorsandDentistsExemptionCertificate)。臨床實(shí)驗(yàn)在OxfordshireResearchEthicsCommittee批準(zhǔn)的協(xié)議下招募志愿者用于免疫研究，并且只有在獲得書面知情同意之后才可以使志愿者加入。包括的年齡范圍是18-55,并且所有受試志愿者在篩查中對(duì)HIV、HBV和HCV血清反應(yīng)陰性。在免疫之前進(jìn)行常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室血液學(xué)和生物化學(xué)檢查，且所有值均在正常范圍之內(nèi)。隨訪全部志愿者6個(gè)月，并在規(guī)律時(shí)間點(diǎn)采:f又血樣。接受了MVA85A免疫的那些志愿者完成日志卡，記錄了免疫后7天的局部和全身副作用以及體溫。免疫首先的兩項(xiàng)研究在BCG預(yù)免疫的健康志愿者中進(jìn)行，所述BCG預(yù)免疫的志愿者使用Heaf試驗(yàn)確定。Heaf試驗(yàn)包括將結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(PPD)置于皮膚上，然后使用噴槍生成多個(gè)刺傷。在72小時(shí)在刺傷部位超過(guò)4個(gè)丘滲的為陽(yáng)性反應(yīng)。陽(yáng)性皮試表明活性結(jié)核感染或之前的BCG免疫。陰性(0級(jí))Heaf試驗(yàn)(相當(dāng)于結(jié)核菌素皮試為Omm)的志愿者使用BCG(使用BCGGlaxo抹單次免疫，皮內(nèi)注射100n41)或MVA85A(皮內(nèi)注射5xl07pfu,相隔3周2次免疫，n44)免疫。在第三項(xiàng)研究中，招募了之前已經(jīng)用BCG免疫的志愿者(n=17)。BCG免疫和MVA85A免疫之間的平均時(shí)間為18年(范圍為0.5-38年)。Heaf試驗(yàn)強(qiáng)度不超過(guò)11級(jí)(相當(dāng)于結(jié)核菌素皮試<15mm)的志愿者加入該研究，并使用單次劑量的5xl07pfliMVA85A皮內(nèi)注入BCG免疫的對(duì)側(cè)手臂的三角肌上的皮膚。總計(jì)，31名健康志愿者使用MVA85A免疫。14名首次接觸BCG的志愿者中有l(wèi)l名接受了2次免疫，相隔3周進(jìn)行。其他3名志愿者接受單次免疫。全部17名BCG預(yù)免疫的志愿者接受了單次MVA85A免疫。所有志愿者完成了6個(gè)月的隨訪期，且在任何這些研究中沒(méi)有嚴(yán)重或劇烈的不良事件。免疫原性的測(cè)量用以確定疫苗免疫原性的主要免疫測(cè)量是體外IFN-yELISPOT測(cè)定法。其針對(duì)在下述時(shí)間點(diǎn)采取的血樣進(jìn)行在結(jié)核菌素皮試之前的篩查時(shí)，和然后在免疫后的1、4、12和24周。這些測(cè)量針對(duì)新鮮的PBMC進(jìn)行，使用結(jié)核菌素PPD(20jig/ml，SSI)、純化的抗原85(Ag85A)復(fù)合體(10pg/ml)和7個(gè)池的9-10條15-mer肽，所述肽有IO個(gè)氨基酸重疊(各肽在ELISPOT孔中的終濃度為10(ig/ml)。簡(jiǎn)言之，300,000PBMC/孔的lOO(ilR10(RPMI加10%胎兒小牛血清)直接鋪板于存在抗原的ELISPOT板(MAIPS4510,Millipore)，并培養(yǎng)18小時(shí)。所有測(cè)定中使用鏈激酶(250U/ml)/鏈道酶(12.5U/ml)和植物血細(xì)胞凝集素(10嗎/ml)作為陽(yáng)性對(duì)照。測(cè)定進(jìn)行兩次，結(jié)果取平均。表位作圖根據(jù)免疫后的首次樣品或隨后樣品測(cè)試針對(duì)單個(gè)肽的反應(yīng)。對(duì)單個(gè)肽的反應(yīng)進(jìn)行磁珠清除(Dynal)。通過(guò)與軛合亞鐵珠的抗CD4和CD8的單克隆抗體一起培養(yǎng)30分鐘來(lái)進(jìn)行CD4+和CD8+T細(xì)胞清除，所述珠與細(xì)胞的比例為5:1，所述培養(yǎng)使用M-450(Dynal，Oslo,Norway)于200jilR10中在水上培養(yǎng)。使用磁體(Dynal)去除抗體包裹的細(xì)胞。根據(jù)未清除的、CD4+清除的和CD8+T細(xì)胞清除的組來(lái)分析樣品。細(xì)胞清除通過(guò)FACS掃描證實(shí)，并通常對(duì)于CD8+T細(xì)胞〉90Q/c),對(duì)CD4+T細(xì)胞>97%(數(shù)據(jù)未顯示)。免疫原性的分析ELISPOT數(shù)據(jù)的分析是通過(guò)從帶有抗原或肽池和細(xì)胞的孔中斑點(diǎn)的平均計(jì)^:扣除介質(zhì)中平均^:目的斑點(diǎn)和單獨(dú)對(duì)照孔的細(xì)胞。忽略小于5斑點(diǎn)/孔的計(jì)數(shù)。如果所述計(jì)數(shù)是陰性對(duì)照孔的至少兩倍并且比陰性對(duì)照孔多至少5個(gè)斑點(diǎn)，則認(rèn)為該孔是陽(yáng)性的。對(duì)于肽池孔，累加各志愿者在各時(shí)間點(diǎn)的所有肽池的結(jié)果。例如，當(dāng)有7個(gè)肽池時(shí)，每個(gè)含有9-10個(gè)肽，每個(gè)池測(cè)試兩次。計(jì)算每個(gè)池的兩次測(cè)試的平均值，然后減去陰性對(duì)照孔的平均值，以生成該池的結(jié)果。然后將7個(gè)單個(gè)池的結(jié)果加在一起。這將可能對(duì)于對(duì)任何10-mer重疊區(qū)反應(yīng)的T細(xì)胞計(jì)數(shù)兩次，所述重疊區(qū)出現(xiàn)于具有相鄰肽的兩個(gè)池中。數(shù)據(jù)分析基于對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化的數(shù)據(jù)，使用篩查時(shí)的基線結(jié)果作為協(xié)變量進(jìn)行重復(fù)測(cè)量的變量分析，以比較各組。然后使用Mann-Whitney檢驗(yàn)用于組間的所有比較，使用Wilcoxon檢驗(yàn)用于篩查和BCG預(yù)免疫-MVA85A加強(qiáng)組的24周樣品之間的配對(duì)比較。培養(yǎng)的ELISPOT方法對(duì)于培養(yǎng)的ELISPOT,使用20ng/ml的結(jié)核分支桿菌PPD("PPD-T，，)、鳥分枝桿菌PPD("PPD-A，，)或10嗎/ml重組抗原85A(Ag85A)在24孔板中刺激1x10"令藏保存的PBMC。經(jīng)過(guò)+37。C、5%(:02大氣下的3天培養(yǎng)期之后，去除500pl的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，并由R10中5IU/ml的Lymphocult-T(Biotest,Dreieich,Germany)取代。這在第7天重復(fù)。在第9天，細(xì)胞經(jīng)三次洗滌，于+37。C、5。/。C02大氣下R10中靜置過(guò)夜。在第10天，細(xì)胞經(jīng)洗滌并懸浮于2ml的R10中，將50jil經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞(2.5x104最初鋪板的細(xì)胞)轉(zhuǎn)移至ELISPOT板的復(fù)孔，并用PPD-T(20|ig/ml)、PPD-A(20嗎/ml)和Ag85A(10pg/ml)刺激18小時(shí)。然后如之前所描述的培養(yǎng)ELISPOT板。結(jié)果使用MVA85A的免疫是安全并良好耐受的(表1)。比較了使用單獨(dú)BCG、單獨(dú)MVA85A和BCG預(yù)免疫-MVA85A加強(qiáng)免疫所誘導(dǎo)的抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和強(qiáng)度。在測(cè)定中使用PPD-T、抗原85(Ag85A)蛋白或來(lái)自抗原85(Ag85A)的重疊肽作為抗原，全部三種免疫方案都誘導(dǎo)了顯著的免疫反應(yīng)(表2,圖1)。在PPD-T(F=3.624;P=0.037)、抗原85(Ag85A)(F=16.605;PO.OOl)和累力。的池抗原85A(Ag85A)肽組(F=39.982;PO.001)中存在顯著的疫苗主要作用。使用BCG的免疫誘導(dǎo)了中等水平的抗原特異性IFN-y分泌T細(xì)胞，其在免疫后4周達(dá)到峰值(表2,圖lb-d)。在BCG免疫后，針對(duì)池抗原85A(Ag85A)肽的反應(yīng)是顯著弱的(圖ld)。11名志愿者中只有4名志愿者在體外ELISPOT測(cè)定中對(duì)任何7肽池反應(yīng)。這些肽池反應(yīng)可全部歸因于肽12、13、27和28，并完全由CD4+T細(xì)胞清除所消除。表l:使用MVA85A免疫后訴求的不良事件在首次接觸BCG和BCG預(yù)免疫的組之間，所報(bào)道的不良事件的頻率和嚴(yán)重度沒(méi)有差異。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>所有全身癥狀在7天內(nèi)消退b范圍37.7-38.1°C;全部在24小時(shí)內(nèi)自發(fā)消退在首次接觸BCG的志愿者中，在13/14個(gè)志愿者中，使用MVA85A單次免疫誘導(dǎo)了高水平的抗原特異性分泌IFN-y的T細(xì)胞，其在免疫后7天達(dá)到峰值(表2，圖lb-c)。經(jīng)過(guò)4周，該反應(yīng)已經(jīng)降至僅在基線之上的水平。在第3周使用MVA85A第二次免疫，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)加強(qiáng)作用。一個(gè)志愿者在用MVA85A免疫后沒(méi)有生成插入特異性T細(xì)胞，然而，雖然其沒(méi)有牛痘免疫既往史，但該志愿者確實(shí)生成了針對(duì)的MVA載體的特異性T細(xì)胞反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)進(jìn)行使用MVA-lac-Z抗原的體外ELISPOT測(cè)定來(lái)進(jìn)一步考察MVA85A免疫的志愿者中對(duì)MVA-lac-Z的反應(yīng)。測(cè)定方法如上"免疫原性測(cè)量，，中所討論的。MVA85A免疫的健康志愿者表現(xiàn)了在免疫后持續(xù)達(dá)24周的強(qiáng)烈的抗MVAT細(xì)胞反應(yīng)。與BCG免疫相比，在所有13/14反應(yīng)志愿者中，MVA85A免疫誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的針對(duì)幾個(gè)肽池的反應(yīng)(表2,圖ld)。觀察到對(duì)跨越抗原85A(Ag85A)全長(zhǎng)的大范圍的肽的反應(yīng)。這些個(gè)體肽反應(yīng)都完全被〔04+T細(xì)胞清除所消除(數(shù)據(jù)未顯示)。在BCG預(yù)免疫-MVA85A加強(qiáng)組的16/17志愿者中，免疫后1周觀察到抗原特異性T細(xì)胞的顯著增加(表2,圖1)。BCG預(yù)免疫-MVA85A加強(qiáng)組在免疫后1周的峰值反應(yīng)顯著高于單獨(dú)BCG或MVA85A組(圖lb-e)。這些反應(yīng)以比單獨(dú)BCG或MVA85A免疫后顯著更高的水平維持至少24周(圖le)。如預(yù)期的，之前已經(jīng)用BCG免疫的志愿者在篩查時(shí)的基線反應(yīng)高于首次接觸BCG的組。然而，在BCG預(yù)免疫-MVA85A加強(qiáng)組中使用MVA85A免疫后24周的反應(yīng)顯著高于該組關(guān)于PPD(Wilcoxonz=-3.010,P=0.003)、抗原85(Ag85A)(Wilcoxonz=-3.516,PO.001)和累加的池肽(Wilcoxonz=-3.408,P二O.OOl)的基線計(jì)數(shù)。單獨(dú)MVA85A組(未顯示)和BCG預(yù)免疫-MVA85A加強(qiáng)組(圖If)中觀察到的肽反應(yīng)的寬度非常相似。然而，BCG預(yù)免疫-MVA85A加強(qiáng)組中的反應(yīng)強(qiáng)度顯著更高(圖le)。4吏用來(lái)自抗原85A(Ag85A)的全部66個(gè)肽測(cè)定了BCG預(yù)免疫-MVA85A加強(qiáng)組中12名志愿者的PBMC。這些肽的幾個(gè)被超過(guò)50。/。的受試者識(shí)別(圖lf),說(shuō)明了這些肽由不同的HLAII類分子的泛宿主識(shí)別，如之前所報(bào)道的(Launois,R等，(1994)Infect.Immun.62,3679-3687)。表2.各免疫組在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)PPD、抗原85(Ag85A)和累加的池肽的ELISPOT反應(yīng)的算術(shù)平均值(SE)和中值(IQR)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>在單獨(dú)MVA85A組中觀察到的T細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度比迄今使用的其他重組MVA強(qiáng)約10倍(McConkey,SJ.等，"EnhancedT-cellimmunogenicityofplasmidDNAvaccinesboostedbyrecombinantmodifiedvacciniavirusAnkarainhumans，，，Nat.Med.,9，729-735(2003》；Mwau，M.等，"Ahumanimmunodeficiencyvirus1(HIV-1)cladeAvaccineinclinicaltrials:stimulationofHIV-specificT-cellresponsesbyDNAandrecombinantmodifiedvacciniavirusAnkara(MVA)vaccinesinhumans",J.Gen.Virol"85,911-919(2004))。表達(dá)來(lái)自熱帶疾原蟲(P/fl/c—謂)的抗原的重組MVA在免疫后7天誘導(dǎo)了90SFC/106PBMC的平均累加的肽反應(yīng)(McConkey,SJ.等，(2003)Nat.Med.9,729-735)。相比之下，在MVA85A免疫后7天觀察到對(duì)1365SFC/106PBMC7的累加肽的平均反應(yīng)(表2)。對(duì)此的一個(gè)解釋是這些志愿者具有一些預(yù)先存在的抗分枝桿菌免疫性，其經(jīng)由MVA85A的免疫而被加強(qiáng)。我們使用了培養(yǎng)的而非體外ELISPOT測(cè)定法，來(lái)進(jìn)一步對(duì)其考察。已經(jīng)顯示培養(yǎng)的ELISPOT測(cè)定法測(cè)量中央記憶型T細(xì)胞而非由體外ELISPOT測(cè)量的活化效應(yīng)T細(xì)胞(Reece,W.H.等，(2004)NatMed.10,406-410,Godkin，AJ.等，(2002)J.Immunol.169,2210-2214)。針對(duì)來(lái)自單獨(dú)MVA85A組的4名志愿者的預(yù)免疫篩查PBMC進(jìn)行培養(yǎng)的IFN-yELISPOT測(cè)定。細(xì)胞用結(jié)核分枝桿菌PPD、鳥分枝桿菌PPD和重組抗原85A(Ag85A)進(jìn)行培養(yǎng)。全部4名志愿者對(duì)鳥分枝桿菌PPD反應(yīng)，2/4對(duì)結(jié)核分枝桿菌PPD反應(yīng)，而2/4對(duì)重組抗原85A(Ag85A)反應(yīng)(圖2)。根據(jù)篩查體外ELISPOT,這些志愿者沒(méi)有一個(gè)對(duì)結(jié)核分枝桿菌PPD或純化的抗原85(Ag85A)具有任何基線反應(yīng)。為進(jìn)一步考察MVA85A免疫后的記憶T細(xì)胞反應(yīng)的誘導(dǎo)，對(duì)免疫后3周的PBMC進(jìn)行體外和培養(yǎng)的ELISPOT測(cè)定。細(xì)胞使用結(jié)核分枝桿菌PPD、鳥分枝桿菌PPD和重組抗原85A(Ag85A)進(jìn)行培養(yǎng)。在第3周的體外反應(yīng)是非常低或檢測(cè)不到的，然而，根據(jù)培養(yǎng)的ELISPOT,在全部5名受試志愿者中存在強(qiáng)烈的反應(yīng)，這表明經(jīng)由特異性針對(duì)抗原85A(Ag85A)的中央記憶T細(xì)胞的免疫的誘導(dǎo)(圖3)。實(shí)施例2潛伏感染結(jié)核分枝桿菌的受試者的安全性和免疫原性數(shù)據(jù)使用MVA85A對(duì)9名潛伏感染結(jié)核分枝桿菌(MA)的健康成人進(jìn)行免疫。在12個(gè)月的時(shí)期內(nèi)，以免疫后的規(guī)律的時(shí)間間隔測(cè)量每名受試者中的血漿炎性標(biāo)志物。在免疫前和免疫后10周，在每名受試者中進(jìn)行肺部高分辨率CT掃描。進(jìn)行這些測(cè)試以檢測(cè)肺炎的任何亞臨床病征。圖5a顯示了從所述9名潛伏感染的志愿者獲得的體外Elispot的結(jié)果。該組中MVA85A的安全性與在實(shí)施例1中描述的先期試-瞼中所觀察到的相同。沒(méi)有4企測(cè)到局部或全身副作用的增加，也沒(méi)有^r測(cè)到任何肺炎病征。炎性標(biāo)志物在免疫后沒(méi)有改變，并且通過(guò)免疫后CT掃描沒(méi)有^r測(cè)到肺炎。作為比較，17名在0.5至37年前已經(jīng)接受過(guò)BCG注射的健康成人-使用MVA85A免疫進(jìn)^"加強(qiáng)。實(shí)施例l描述了結(jié)果。在潛伏感染組(試驗(yàn)7,"T007")中觀察到的免疫后免疫反應(yīng)的強(qiáng)度類似于在BCG預(yù)免疫組(試驗(yàn)5，"T005")中觀察到的免疫反應(yīng)。結(jié)果顯示于圖5b和5c。該數(shù)據(jù)是顯著的，因?yàn)殍b于遍及發(fā)展中國(guó)家的潛伏感染的流行，重要的是任何新型的TB疫苗在潛伏感染的受試者中是安全的。另夕卜，加強(qiáng)的免疫原性支持該疫苗作為暴露后疫苗施用至潛伏感染的人的應(yīng)用，目的為消除這種潛伏感染。免^X應(yīng)的持續(xù)時(shí)間BCG預(yù)免疫的志愿者在MVA85A加強(qiáng)后的體外ELISPOT反應(yīng)在免疫后持續(xù)至少l年，且預(yù)免疫(BCG)和加強(qiáng)(MVA85A)之間既有短間隔(1個(gè)月)也有長(zhǎng)間隔(超過(guò)10年)。圖6中顯示了在BCG后超過(guò)10年使用MVA85A免疫的12名志愿者以及在BCG后1個(gè)月使用MVA85A免疫的IO名志愿者的長(zhǎng)期隨訪數(shù)據(jù)。來(lái)自兩組志愿者的數(shù)據(jù)顯示，免疫后1年時(shí)的免疫反應(yīng)的持久性與免疫后6個(gè)月時(shí)觀察到的持久性處于相同的強(qiáng)度。疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的持久性說(shuō)明記憶反應(yīng)的誘導(dǎo)。除非已經(jīng)誘導(dǎo)了記憶反應(yīng)，否則在使用非復(fù)制的疫苗免疫一年后預(yù)期不會(huì)看到持久的疫苗i秀導(dǎo)的反應(yīng)。預(yù)免疫-加強(qiáng)間隔與免^應(yīng)水平之間的相關(guān)性圖3中顯示的數(shù)據(jù)表明，在MVA85A加強(qiáng)免疫后看到的BCG誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的加強(qiáng)不依賴于BCG預(yù)免疫和MVA85A加強(qiáng)之間的間隔。短(1個(gè)月)和長(zhǎng)(超過(guò)10年)的加強(qiáng)間隔觀察到相等的加強(qiáng)。預(yù)免疫(BCG)和加強(qiáng)(MVA85A)免疫的間隔與峰(1周)或平高線(6個(gè)月)MVA85A誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)之間沒(méi)有相關(guān)性(圖7)。因此，在BCG免疫后不久(例如，在發(fā)展中國(guó)家的嬰兒期)或者在更后的時(shí)間點(diǎn)(例如，在青春期)，加強(qiáng)分枝桿菌免疫是同樣可行的。既在嬰兒期加強(qiáng)又在青春期加強(qiáng)是效力試驗(yàn)的可能選擇，并且是加強(qiáng)TB疫苗的潛在適應(yīng)癥。BCG預(yù)免疫-MVA85A加強(qiáng)在獼猴中的免疫原性和保護(hù)效力在免疫原性和攻擊實(shí)驗(yàn)中，使用以下物質(zhì)對(duì)獼猴(6/組)進(jìn)行免疫i)單獨(dú)BCG,ii)BCG并然后在9周后用MVA85A加強(qiáng)，或者iii)鹽水(對(duì)照組)。所有動(dòng)物在BCG免疫(或者給對(duì)照組鹽水免疫)后18周經(jīng)氣管內(nèi)攻擊，然后在安樂(lè)死之前被跟隨16周。免疫原性結(jié)果顯示于圖8中。圖8a顯示了該攻擊實(shí)驗(yàn)中的全部3個(gè)組免疫后的IFN-y平均水平(如3天淋巴細(xì)胞刺激試—險(xiǎn)所測(cè)量的)。而在BCG組和BCG預(yù)免疫-MVA85A組中，對(duì)PPD反應(yīng)中的IFN-y水平似乎是相當(dāng)?shù)?，而?duì)Ag85A的反應(yīng)在BCG預(yù)免疫-MVA85A加強(qiáng)組中明顯較高。因此，存在單獨(dú)BCG組(組i)中沒(méi)有只見察到的MVA85A免疫(組ii)后Ag85A特異性IFN葉分泌的顯著升高(圖8a)。圖8b顯示了該攻擊實(shí)驗(yàn)中全部3組攻擊后的IFN-y平均水平(如3天淋巴細(xì)胞刺激試驗(yàn)所測(cè)量的)。在使用結(jié)核分枝桿菌攻擊后，BCG-MVA85A組(組ii)比單獨(dú)BCG組(組i)具有顯著較高的Ag85A特異性反應(yīng)。同時(shí)，與鹽水組相比較，BCG組和BCG-MVA85A組中的ESAT6/CFP10反應(yīng)(早期分泌的抗原靶蛋白/培養(yǎng)物濾出液蛋白10)較低，所述ESAT6/CFP10反應(yīng)是結(jié)核分支桿菌特異性免疫反應(yīng)(強(qiáng)度與細(xì)菌免疫量有關(guān))。這兩組之間的PPD反應(yīng)是相當(dāng)?shù)?。ESAT6/CFP10結(jié)果是重要的(最底下的小圖)，因?yàn)檫@些抗原是TB特異性的，并且針對(duì)這些抗原的免疫反應(yīng)的水平與細(xì)菌免疫量相關(guān)(即，細(xì)菌免疫量越高(鹽水組)，則對(duì)ESAT6和CFP10的免疫反應(yīng)越高)。與鹽水組相比，BCG組和BCG-MVA85A組中較低水平的ESAT6/CFP10反應(yīng)意味著疫苗的保護(hù)效力。在尸4全時(shí)，在BCG-MVA85A組中觀察到比單獨(dú)BCG組中少很多的病理改變。這兩組中細(xì)菌免疫量的減少為BCG-MVA85A組，0.97;單獨(dú)BCG組，0.42。獼猴是良好的人類疾病模型，盡管動(dòng)物的數(shù)目小，但這一充滿前景的保護(hù)效力的提高表明，預(yù)期在人類中具有相似的效力結(jié)果。南非成人中ii期研究的安全性和免疫原性數(shù)據(jù)已經(jīng)在南非的西開普開始了II期安全性和免疫原性研究。該試驗(yàn)是在成人中進(jìn)行，且目標(biāo)是24名受試者。該研究排除了潛伏感染的受試者。目前，已經(jīng)對(duì)12名受試者進(jìn)行了免疫。根據(jù)其免疫后1周的Elispot測(cè)定，全部12名受試者具有顯著的MVA85A誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。目前的安全性特征與在英國(guó)和岡比亞研究中觀察到的安全性特征相同。圖l和圖9a顯示了英國(guó)研究的結(jié)果，圖9b顯示了岡比亞研究的結(jié)果?？傆?jì)，在岡比亞對(duì)11名BCG首次接觸志愿者和10名BCG預(yù)免疫志愿者進(jìn)行了免疫。BCG首次接觸組的免疫原性結(jié)果(圖9b)類似于在英國(guó)的BCG預(yù)免疫組的免疫原性結(jié)果(圖lb、lc、ld)，這是因?yàn)槠湓陔S訪期間保持在基線之上。這可能反映了較大程度的經(jīng)由處于基線的環(huán)境分枝桿菌的預(yù)免疫，還反映了正在暴露于維持所述反應(yīng)的環(huán)境分枝桿菌。在岡比亞的BCG首次接觸組和BCG預(yù)處理組之間沒(méi)有顯著差異，其如上解釋為該組中較大程度的環(huán)境預(yù)處理。相反，在英國(guó)，BCG首次接觸組的免疫原性結(jié)果在隨訪過(guò)程中返回至基線(圖9a和圖lb、lc和ld)，而BCG預(yù)處理組在隨訪期間保持在基線之上(圖lb、lc和ld)。貫穿BCG文獻(xiàn)，在不同國(guó)家和洲有許多保護(hù)效力廣泛差異性的實(shí)例。在英國(guó)、西非和南非，MVA85A—致的安全性和免疫原性特征是非常顯著的。小鼠中表達(dá)抗原85A(Ag85A)的腺病毒的免疫原性表達(dá)抗原85A(Ag85A)的重組腺病毒(人類株5，刪除了El和E3)已顯示在小鼠中單獨(dú)施用時(shí)誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)(CD4反應(yīng)c800斑/百萬(wàn)脾細(xì)胞；CD8反應(yīng)c1200斑/百萬(wàn)脾細(xì)胞)。當(dāng)施用至之前已經(jīng)接受過(guò)BCG的小鼠時(shí)，該表達(dá)抗原85A(Ag85A)的腺病毒刺激了甚至更強(qiáng)的反應(yīng)(CD4反應(yīng)c1400斑/百萬(wàn)脾細(xì)胞；CD8反應(yīng)c2500斑/百萬(wàn)脾細(xì)胞)。因此，值得注意地，顯示該腺病毒載體除了誘導(dǎo)非常強(qiáng)的CD4T細(xì)胞反應(yīng)外，還誘導(dǎo)非常強(qiáng)的CD8T細(xì)胞反應(yīng)，并且經(jīng)由相同疫苗對(duì)這些反應(yīng)的誘導(dǎo)可能在預(yù)防和治療分枝桿菌疾病中都有益處。之前，腺病毒載體已經(jīng)被視為誘導(dǎo)CD8T細(xì)胞反應(yīng)的良好方法，但在這里，表明CD4和CD8反應(yīng)都被強(qiáng)有力地誘導(dǎo)了。該數(shù)據(jù)表明腺病毒載體可以是BCG預(yù)免疫的T細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)有力加強(qiáng)劑。以上只是通過(guò)舉例的方式描述了本發(fā)明。應(yīng)該理解，可以在不背離本發(fā)明的范圍的情況下，作出細(xì)節(jié)的修改。AG85A特異序列SEQIDNO:1(AG85A多肽序列)GAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQGASEQIDNO:2(AG85A核苦,列)atgcagcttgttgacagggttcgtggcgccgtcacgggtatgtcgcgtcgactcgtggtcggggccgtcggcgcggccctagtgtcgggtctggtcggcgccgtcggtggcacgcccgccctgtacc'atcaacaccccggcgttcgagtggtacgaccagtcgggcctgtcggtggtcatgccgggttgccagacttacaagtgggagaccttcctgaccagcgagctgccggggtggctggcttcttcggcgctgacgctggcgatctatcacccccagcagttcgtctacgcgggagcgstgtcgggcctgttggscccctcccsggcgatgggtcccaccctgatcggcctggcgatgggtgacgctggcggctacaaggcctccgacatgtggggcccgsaggaggacacccgcgtctgggtgtsctgcggcsacggcaagccgtcggatctgggtggcaacMccacagctgggagtactggggcgcgcagctcaacgctatgaagcccgacctgcaacgggcsctgggtgccacgcccsacsccgggcccgcgccccngggcgcctagSEQIDNO:3(15#^酸AG85A平截多肽序列)GAQ，AMKPDLQRSEQIDNO:4(15氨基酸AG85A平截核苷酸序列)atgcagcttgttgacagggttcgtggcgccgtcacgggtatgtcgcgtcgactcgtggtcgg:acctgctcgacggcctgcgcgcgcaggacgacttcagcggctgggacatcaacaccccggcgttcgagtggtacgaccagtcgggcctgtcggtggtcatgccggtgggtggccagtcaagcttctactccgactggtaccagcccgcctgcggcasggccggttgccagacttacaagtgggagaccttcctgactcggtctttcgatggctgcttcttcggcgctgacgctggcgatctatcacccccagcagttccggcctggcgatgggtgacgctggcggctacaaggcctccgacstgtggggcccgaaggaggcgcgtctgggtgtactgcggcaacggcaagccgtcggatctgggtggcaacaacctgccggcgtggcggccacascggcgtgttcgacttcccggacagcggtacgcacagctgggagtactggggcgcgcsgctcaacgctstgsagcccgacctgcaacggSEQIDNO:51176核苦酸序列的插入片段如下(上例中表達(dá)的序列，下劃線的Ag85A編碼序列)tctgtacgggcccgtacggtaccgagctcggatctgcgcgccgccaccATGGATGCAGCGCAGCTCAACGCTATGAAGCCCGACCTGCAACGTGGATCCATTCCAAACCCTTTGCTGGGATTGGACtprctgcagatatccatcacactgSEQIDNO:6MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSQE工HARFRRGSMQLVDRVRGAVTGMSRRLVVGAVGAALVSGLVGAVGGTATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGANSPALYWGAiQLNAMKPDIjQRGSIPNPLLGLD權(quán)利要求1.一種在人類患者中誘導(dǎo)針對(duì)至少一種抗原的T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給所述患者施用免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫原性組合物是載體疫苗。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)是CCR7+反應(yīng)。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體選自痘病毒、腺病毒、皰滲病毒、曱病毒屬、黃病毒屬和流感病毒組成的組。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述非復(fù)制的病毒載體是MVA。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述非復(fù)制的病毒載體是腺病毒載體。7.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述病毒載體表達(dá)帶有PK羧基端標(biāo)簽的Ag85A。8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述病毒載體表達(dá)帶有TPA前導(dǎo)序列的Ag85A。9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述病毒載體表達(dá)帶有截短的羧基端的Ag85A。10.才艮據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述病毒載體表達(dá)SEQIDNO:5的翻i奪產(chǎn)物。11.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述病毒載體進(jìn)一步表達(dá)來(lái)自分枝桿菌的至少一種附加抗原基因的翻譯產(chǎn)物。12.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述免疫原性組合物與至少一種附加抗原和/或抗微生物劑一起施用。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述至少一種附加抗原和/或抗微生物劑同時(shí)、分開或順序施用。14.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述反應(yīng)是抗原特異性免疫反應(yīng)。15.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述反應(yīng)是治療性的或預(yù)防性的。16.免疫原性組合物在制備用于通過(guò)在患者中誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)而治療或預(yù)防所述患者分枝桿菌疾病的藥劑中的用途，所述免疫原性組合物包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。17.免疫原性組合物在制備用于通過(guò)在患者中誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)而治療或預(yù)防所述患者分枝桿菌疾病和至少一種其他疾病的藥劑中的用途，所述免疫原性組合物包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體和至少一種附加抗原基因的翻譯產(chǎn)物。18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的用途，其中所述免疫原性組合物進(jìn)一步誘導(dǎo)針對(duì)衍生所述病毒載體的病毒的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。19.包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的免疫原性組合物在制備用于通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)而治療或預(yù)防患者至少一種疾病的藥劑中的用途，其中所述藥劑與至少一種附加抗原一起施用。20.抗原在制備用于通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)而治療患者疾病的藥劑中的用途，其中所述藥劑與包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的免疫原性組合物一起施用。21.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)所述的方法或者權(quán)利要求16至20任一項(xiàng)所述的用途，其中所述T細(xì)胞反應(yīng)保護(hù)性抵抗疾病，所述疾病選自結(jié)核病、麻風(fēng)病、鳥分枝桿菌感染、非結(jié)核分枝桿菌感染、布魯利潰瘍、牛分枝桿菌感染或疾病、天花、猴痘、副結(jié)核分枝桿菌感染、炎性腸病、克隆氏病、自身免疫疾病、癌癥和膀胱癌組成的組。22.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)所述的方法或者權(quán)利要求16至20任一項(xiàng)所述的用途，其中所述患者選自兒童，患有HIV感染或AIDS的患者，免疫妥協(xié)的患者，或經(jīng)歷過(guò)器官移植的患者組成的組。23.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)所述的方法或者權(quán)利要求16至20任一項(xiàng)所述的用途，其中所述患者之前已經(jīng)暴露于分枝桿菌。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述患者之前已經(jīng)暴露于結(jié)核分枝桿菌。25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中所述患者潛伏感染了所述分枝桿菌。26.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)所述的方法或者權(quán)利要求16至20任一項(xiàng)所述的用途，其中所述患者已經(jīng)使用BCG預(yù)處理。27.—種載體疫苗，其包含表達(dá)核苷酸序列SEQIDNO:4的翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的載體疫苗，其中所述病毒載體表達(dá)另外包括PK羧基端標(biāo)簽的核苦酸序列SEQIDNO:4的翻譯產(chǎn)物。29.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的載體疫苗，其中所述病毒載體表達(dá)另外包括TPA前導(dǎo)序列的核苷S吏序列SEQIDNO:4的翻譯產(chǎn)物。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的載體疫苗，其中所述病毒載體表達(dá)核苷酸序列SEQIDNO:5的翻譯產(chǎn)物。31.根據(jù)權(quán)利要求27至30任一項(xiàng)所述的載體疫苗，其中所述非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體選自痘病毒、腺病毒、皰滲病毒、甲病毒屬、黃病毒屬和流感病毒組成的組。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的載體疫苗，其中所述非復(fù)制的病毒載體是MVA。33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的載體疫苗，其中所述非復(fù)制的病毒載體是腺病毒載體。34.根據(jù)權(quán)利要求27至33任一項(xiàng)所述的載體疫苗，其中所述病毒載體還表達(dá)來(lái)自分枝桿菌的至少一種附加抗原基因的翻譯產(chǎn)物。35.—種誘導(dǎo)針對(duì)抗原的CD8和CD4記憶T細(xì)胞反應(yīng)的方法，其使用表達(dá)抗原或其免疫原性片段的腺病毒載體。36.表達(dá)抗原或其免疫原性片段的腺病毒載體在制備用于誘導(dǎo)針對(duì)所述抗原的CD8和CD4記憶T細(xì)胞反應(yīng)的藥劑中的用途。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的用途，其中所述藥劑用于治療或預(yù)防分枝桿菌疾病。38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求36或37所述的用途，其中所述抗原是Ag85A。全文摘要一種用于產(chǎn)生宿主T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，該方法包括施用包含非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗，所述病毒載體表達(dá)分枝桿菌抗原85A基因的翻譯產(chǎn)物。還提供了載體疫苗及其用途。還提供了使用腺病毒載體誘導(dǎo)針對(duì)抗原的CD8和CD4記憶T細(xì)胞反應(yīng)的方法，所述腺病毒載體表達(dá)抗原或其免疫原性片段。文檔編號(hào)C07K14/35GK101115500SQ200680004501公開日2008年1月30日申請(qǐng)日期2006年1月5日優(yōu)先權(quán)日2005年1月5日發(fā)明者安薩·A·帕坦,海倫·麥克什,艾德里安·希爾,莎拉·C·吉爾伯特申請(qǐng)人:埃西斯創(chuàng)新有限公司