專利名稱：：高親和力hivt細(xì)胞受體的制作方法髙親和力HIVT細(xì)胞受體本發(fā)明涉及對(duì)HIVGag多肽衍生的SLYNTVATL-HLA-A*0201具有結(jié)合特性的T細(xì)胞受體(TCR)。該TCR包含至少一個(gè)TCRa鏈可變區(qū)和/或至少一個(gè)TCR|3鏈可變區(qū)，其對(duì)于所述SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的Kd小于或等于lpM禾Q/或?qū)LYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的解離速率(k。ff)為1x10—3S"或更慢。發(fā)明背景人免疫缺陷病毒(HIV)是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的致病因子。該病毒是屬于慢病毒群(gro叩)中的一種被膜逆轉(zhuǎn)錄病毒。SLYNTVATL(SEQIDNO:16)肽衍生自Gag基因的gl7基因產(chǎn)物，Gag基因是構(gòu)成人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的九個(gè)基因中的一個(gè)。該肽由HLA-A*0201負(fù)載，并呈遞到HIV感染細(xì)胞的表面。因此，SLYNTVATL-HLA-A2*0201復(fù)合物提供了一種TCR可靶向的HIV標(biāo)記，例如為將細(xì)胞毒劑或免疫刺激劑遞送到感染細(xì)胞的目的。然而，對(duì)于該目的，如果TCR對(duì)肽-HLA復(fù)合物具有高親和力和/或慢的解離速率將是有利的。發(fā)明概述本發(fā)明首次提供了對(duì)SLYNTVATL-HLA-A1110201復(fù)合物的親和力(Ko)小于或等于lpM禾n/或解離速率(k。ff)為lxl(T3S—'或更慢的TCR，前提是當(dāng)所述TCR由細(xì)胞遞呈且包含SEQIDNO:1禾B2時(shí)，所述細(xì)胞不是天然T細(xì)胞。此類TCR不論單用或是與治療劑一起使用對(duì)于靶向遞呈該復(fù)合物的HIV感染細(xì)胞都是很有利的。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種T細(xì)胞受體(TCR)，其對(duì)SLYNTVATL-HLA-A*0201具有結(jié)合特性，并包含至少一個(gè)TCRa鏈可變區(qū)和/或至少一個(gè)TCR|3鏈可變區(qū)，它的特征在于所述TCR對(duì)于所述SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的Kd小于或等于lpM和/或?qū)τ赟LYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的解離速率(k。ff)為lxl(T3S"或更慢，前提是當(dāng)所述TCR由細(xì)胞遞呈且包含SEQIDNO:1和2時(shí)，該細(xì)胞不是天然T細(xì)胞。可采用任何已知的方法測(cè)定KD和/或(k。ff)。一種優(yōu)選的方法是實(shí)施例4中的表面等離子共振(SurfacePlasmonResonance,Biacore)方法。為了比較，通過(guò)實(shí)施例4的基于Biacore方法測(cè)定親本HIVgagTCR(TCRa鏈見(jiàn)SEQIDNO:9，TCR]3鏈見(jiàn)SEQIDNO:IO)的二硫鍵連接的可溶性變體與SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物相互作用的KD約為85nM，解離速率(koff)為2.21X10—2S-l，半衰期為0.17分鐘。SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的特異性親本HIVGagTCR具有以下的V。鏈和Ve鏈基因用途a鏈-TRAV12.2P鏈-TRBV5.6可將親本HIVGagTCR用作模板來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的其它TCR，所述其它TCR對(duì)于所述TCR與SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物之間的相互作用的高親和力高和/或解離速率慢。因此，相對(duì)于親本HIVGagTCRa鏈可變區(qū)(參見(jiàn)圖la和SEQIDNo:1)和/或p鏈可變區(qū)(參見(jiàn)圖lb和SEQIDNO:2)，本發(fā)明的TCR在其至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和/或可變區(qū)框架區(qū)發(fā)生突變。本發(fā)明也考慮了本發(fā)明TCR可變區(qū)中的其它超變區(qū)(例如超變4(HV4)區(qū))可在高親和力突變TCR中發(fā)生突變。噬菌體展示為產(chǎn)生TCR變體文庫(kù)提供了一種手段。(Li箏，(2005)7Vfl&"23(3):349-354)和WO2004/04404詳述了適于噬菌體展示和隨后的TCR變體文庫(kù)篩選的方法，所述TCR變體各含有非天然鏈間二硫鍵。天然TCR以異二聚化的ap或^形式存在。然而，現(xiàn)已顯示由單條TCRTCRa或TCRp鏈組成的重組TCR可結(jié)合肽MHC分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的TCR包括a鏈可變區(qū)和TCR(3鏈的可變區(qū)。TCRa鏈序列和/或TCRp鏈序列中的突變可為一個(gè)或多個(gè)取代、缺失或插入，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的?？捎萌魏魏线m的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)這些突變，這些方法包括但不限于基于聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法、基于限制性內(nèi)切酶的克隆方法、或不依賴于連接反應(yīng)的克隆(LIC)方法。這些方法在許多標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)教材中有所詳述。關(guān)于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)誘變法和基于限制性內(nèi)切酶的克隆法更為詳盡的描述可參見(jiàn)(Sambrook&Russell，(2001)MolecularCloning-ALaboratoryManual(3rdEd.)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》第三版，CSHLPress)。關(guān)于LIC法的進(jìn)一步描述可見(jiàn)于(Rashtchian，(1995)CwatOp/"腸tecA"o/6(1):30-6)。應(yīng)注意到包含相似Va和VP基因應(yīng)用并由此氨基酸序列與HIVGag相似的任何a卩TCR可用來(lái)制作便利的模板TCR。然后可能將產(chǎn)生本發(fā)明突變的高親和力TCR所需的改變引入編碼模板apTCR的一個(gè)或兩個(gè)可變區(qū)的DNA中。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知道可通過(guò)許多方法，例如定點(diǎn)誘變引入所需的突變。與圖la和SEQIDNo:1的親本HIVGagTCRa鏈可變區(qū)序列中這些位置的氨基酸相比，本發(fā)明TCR包含那些在對(duì)應(yīng)于以下所列的一個(gè)或多個(gè)TCRa鏈可變區(qū)的氨基酸發(fā)生突變的TCR。除非另有相反陳述，本文的TCR氨基酸序列一般含有N-末端甲硫氨酸(Met或M)殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知該殘基在重組蛋白產(chǎn)生過(guò)程中可以除去。本領(lǐng)域技術(shù)人員也顯然知道，可將其C-末端和/或N-末端的序列截短1、2、3、4、5個(gè)或更多個(gè)殘基，而基本不影響該TCR的pMHC結(jié)合性能，本發(fā)明包括所有這些不重要的變體。本文所用的術(shù)語(yǔ)"可變區(qū)"應(yīng)理解為包括給定TCR的不包含在由TCRa鏈的TRAC基因或TCR(3鏈的TRBCl或TRBC2基因所編碼的恒定區(qū)內(nèi)的所有氨基酸(序列)。(《T細(xì)胞受體手冊(cè)》(TcellreceptorFactsbook)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科學(xué)出版社，ISBN0-12-441352-8)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"可變域"應(yīng)理解為包括給定TCR的由TCRa鏈的TRAC基因或TCR(3鏈的TRBV基因所編碼的所有氨基酸(序列)。(《T細(xì)胞受體手冊(cè)》(TcellreceptorFactsbook)，(2001)，LeFranc禾口LeFranc,科學(xué)出版社，ISBN0-12-441352-8)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，在本文定義的可變區(qū)和恒定區(qū)之間交界處由密碼子所編碼的氨基酸中發(fā)生變異可導(dǎo)致TCR庫(kù)(r印ertoire)的部分多樣性。例如，存在于親本HIVGagTCR序列中該交界處的密碼子(突變)導(dǎo)致本文可變區(qū)序列的C-末端存在組氨酸(H)殘基。該組氨酸取代了圖8a所示，TRAC基因編碼的N-末端天冬酰胺(N)殘基。本發(fā)明的實(shí)施方式中包括含有對(duì)應(yīng)于以下一個(gè)或多個(gè)a鏈可變區(qū)氨基酸發(fā)生突變的突變性TCR:95T、96N、97S、98G和100A，例如以下氨基酸95S或G96A97H98D100S以上的編號(hào)與圖la和SEQIDNo:l中所示的編號(hào)一致。本發(fā)明的實(shí)施方案也包括對(duì)應(yīng)于以下所列的一個(gè)或多個(gè)TCRP鏈可變區(qū)氨基酸相對(duì)于圖lb和SEQIDNo:2的天然HIVGagTCRP鏈可變區(qū)中這些位置的氨基酸發(fā)生突變的TCR。所指示的可能發(fā)生突變的氨基酸是51Y、52E、53E和54E，例如51V或A52R或L53G54V以上的編號(hào)與圖lb和SEQIDNo:2中所示的編號(hào)一致。本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方式是含有圖6所示突變的a鏈可變區(qū)氨基酸序列之一的TCR。(SEQIDNo:11到13)。這種TCR的表型沉默變體也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方式是含有圖7所示突變的3鏈可變區(qū)氨基酸序列之一的TCR。(SEQIDNo:14和15)。這種TCR的表型沉默變體也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。天然TCR存在異源二聚體a(3或yS形式。然而，目前已顯示由aa或即同源二聚體構(gòu)成的重組TCR能與肽MHC分子結(jié)合。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是TCRaoc或TCR卩(5同源二聚體。本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方式是含有下列a鏈可變區(qū)氨基酸序列和(3鏈可變區(qū)氨基酸序列組合的本發(fā)明的TCR，這類TCR的表型沉默變體也構(gòu)成本發(fā)明的一部分<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，含有以上詳述的可變區(qū)組合的本發(fā)明TCR還含有圖8a所示a鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:19)以及圖8b和8c所示J3鏈氨基酸恒定區(qū)序列之一(SEQIDNO:20和21)或其表型沉默變體。本文所用的術(shù)語(yǔ)"表型沉默變體"應(yīng)理解為指對(duì)所述SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的Kd小于或等于1jiM禾口/或具有1X10—3S"或更慢的解離速率(k。ff)的那些TCR。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可能產(chǎn)生與以上詳述的那些TCR相比，在其恒定和/或可變區(qū)中摻入了較小變化但不改變與SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物相互作用的親和力和/或解離速率的TCR。本發(fā)明范圍包括這類不重要的變體。其中含有一個(gè)或多個(gè)保守取代的那些TCR也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。就廣義而言，本發(fā)明TCR可以如WO04/033685和WO03/020763所述為單鏈TCR(scTCR)或二聚體TCR(dTCR)形式。合適的scTCR形式包括由對(duì)應(yīng)于TCRcc鏈可變區(qū)的氨基酸序列構(gòu)成的第一區(qū)段，由對(duì)應(yīng)于TCRp鏈可變區(qū)序列并與對(duì)應(yīng)于TCRp鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構(gòu)成的第二區(qū)段，和連接該第一區(qū)段C末端與該第二區(qū)段N末端的接頭序列。或者，所述第一區(qū)段可由對(duì)應(yīng)于TCR(3鏈可變區(qū)氨基酸序列構(gòu)成，所述第二區(qū)段可由對(duì)應(yīng)于TCRa鏈可變區(qū)序列并與對(duì)應(yīng)于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構(gòu)成。以上scTCR在第一和第二鏈之間還含有二硫鍵，所述二硫鍵在天然apT細(xì)胞受體中沒(méi)有等價(jià)物，其中該接頭序列的長(zhǎng)度和該二硫鍵的位置應(yīng)使第一和第二區(qū)段的可變區(qū)序列的相互取向基本上如天然a卩T細(xì)胞受體中的那樣。更具體地說(shuō)，所述第一區(qū)段可由對(duì)應(yīng)于TCRa鏈可變區(qū)序列并與對(duì)應(yīng)于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構(gòu)成，第二區(qū)段可由對(duì)應(yīng)于TCR卩鏈可變區(qū)序列并與對(duì)應(yīng)于TCR卩鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構(gòu)成，和在第一和第二鏈之間可以存在天然apT細(xì)胞受體中沒(méi)有等價(jià)物的二硫鍵。在以上scTCR形式中，接頭序列可連接第一區(qū)段C末端和第二區(qū)段N末端，其可如式-PGGG-(SGGGGVP-所示，其中n是5或6，P是脯氨酸，G是甘氨酸，S是絲氨酸。-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P(SEQIDNO:17)-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG陽(yáng)P(SEQIDNO:18)本發(fā)明TCR的合適dTCR形式包括第一多肽，其中對(duì)應(yīng)于TCRa鏈可變區(qū)的序列的一條序列與對(duì)應(yīng)于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合；第二多肽，其中對(duì)應(yīng)于TCRP鏈可變區(qū)序列的一條序列與對(duì)應(yīng)于TCRp鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合；該第一和第二多肽通過(guò)在天然a卩T細(xì)胞受體中沒(méi)有等價(jià)物的二硫鍵相連。所述第一多肽可含有與對(duì)應(yīng)于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的的N末端相融合的TCRa鏈可變區(qū)序列，而第二多肽中對(duì)應(yīng)于TCR(3鏈可變區(qū)序列的一條序列與對(duì)應(yīng)于TCR(3鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合，該第一和第二多肽通過(guò)取代TRAC*01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01或其非人等價(jià)物的外顯子1的Ser57的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵相連。("TRAC"等在本文根據(jù)《T細(xì)胞受體手冊(cè)》(TcellreceptorFactsbook)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科學(xué)出版社，ISBN0-12-441352-8命名)。本發(fā)明TCR的dTCR或scTCR形式可具有對(duì)應(yīng)于人apTCR胞外恒定區(qū)和可變區(qū)序列的氨基酸序列，在天然TCR中沒(méi)有等價(jià)物的二硫鍵可連接所述恒定區(qū)序列的氨基酸殘基。所述二硫鍵存在于與在天然TCR中其卩碳原子距離小于0.6nm的氨基酸殘基相對(duì)應(yīng)的半胱氨酸殘基之間，例如在取代TRA(^01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01或其非人等價(jià)物的外顯子1的Ser57的半胱氨酸殘基之間。就TCRa鏈而言，可引入半胱氨酸形成二硫鍵的其它位點(diǎn)是TRACMl外顯子l中的以下殘基，就TCRP鏈而言，是TRBCPOl或TRBC2M1外顯子1中的以下殘基<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>除了以上提及的非天然二硫鍵以外，本發(fā)明TCR的dTCR或scTCR形式可在對(duì)應(yīng)于天然TCR中通過(guò)二硫鍵連接的殘基的殘基之間含有二硫鍵。本發(fā)明TCR的dTCR或scTCR形式優(yōu)選不含有對(duì)應(yīng)于天然TCR的跨膜或胞質(zhì)序列的序列。本發(fā)明的TCR與SLYNTVATL-HLA-A2*0201牢固結(jié)合。當(dāng)用HLA-A*0201負(fù)載時(shí)，這些TCR還可與HIVGag衍生的SLYNTVATL天然變體相結(jié)合，其結(jié)合程度雖然發(fā)生改變但仍然有用。已從AIDS患者中分離的SLYNTVATL變體包括下述變體(Sewell箏，(1997)￡wJ27:2323-2329):SL[NTVATLSL￡NTVAYLslyntvatlS處NTVATLSLLNTVATLSLYNTIATLSL￡NTIATLSL￡NTIAYLSL￡N￡VATL突變的氨基酸用下劃線表示。尸五g化游rci単沐在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的TCR與至少一條聚亞垸基二醇鏈結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知有許多方法可產(chǎn)生這種結(jié)合。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，一條或多條聚亞烷基二醇鏈與TCR共價(jià)相連。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明該方面的聚乙二醇鏈含有至少兩個(gè)聚乙烯重復(fù)單位。多份rc7復(fù)會(huì)激本發(fā)明一方面提供含有至少兩個(gè)本發(fā)明TCR的多價(jià)TCR復(fù)合物。在該方面的一個(gè)實(shí)施方式中，至少兩個(gè)TCR分子經(jīng)接頭部分相連形成多價(jià)復(fù)合物。這些復(fù)合物優(yōu)選為水溶性的，所以應(yīng)照此(標(biāo)準(zhǔn))選擇接頭部分。此外，接頭部分優(yōu)選能與TCR分子上確定的位置相連，從而盡可能降低所形成復(fù)合物的結(jié)構(gòu)多樣性。該方面的一個(gè)實(shí)施方式所提供的本發(fā)明TCR復(fù)合物中聚合物鏈或肽接頭序列延伸于各TCR中不位于該TCR可變區(qū)序列中的氨基酸殘基之間。由于本發(fā)明復(fù)合物可用作藥物，接頭部分應(yīng)該適當(dāng)考慮它們的藥學(xué)適用性，例如它們的免疫原性來(lái)選擇。本領(lǐng)域己知符合以上所需標(biāo)準(zhǔn)的接頭部分的例子，例如連接抗體片段的技術(shù)。兩類接頭優(yōu)選用于產(chǎn)生本發(fā)明的多價(jià)TCR分子。其中的TCR通過(guò)聚亞烷基二醇鏈相連的本發(fā)明TCR復(fù)合物提供了該方面的一個(gè)實(shí)施方式。第一類是親水性聚合物，例如聚亞垸基二醇。此類中最常用的是聚乙二醇或PEG，其結(jié)構(gòu)如下式所示。HOCH2CH20(CH2CH20)n-CH2CH2OH其中n大于2。然而其它聚合物可以基于其它合適的、任選取代的聚亞烷基二醇，包括聚丙二醇，和乙二醇與丙二醇的共聚物。這種聚合物可用于處理或偶聯(lián)治療劑，特別是多肽或蛋白質(zhì)治療劑來(lái)有益地改變?cè)摨焺┑腜K分布，例如降低腎廓清率、提高血漿半衰期、降低免疫原性和提高溶解性。據(jù)信，一個(gè)或多個(gè)PEG分子在治療劑周圍形成的"外殼"能在立體上阻礙治療劑與免疫系統(tǒng)反應(yīng)并降低其蛋白酶降解，從而改善PEG-治療劑偶聯(lián)物的PK分布。(Casey等，(2000)，TumorTargetting，4235-244)。所用親水性聚合物的分子大小可根據(jù)TCR復(fù)合物預(yù)定的治療應(yīng)用來(lái)具體選擇。已有許多綜述文章和書籍詳細(xì)描述了PEG和類似分子在藥物制劑中的應(yīng)用。例如，參見(jiàn)Harris,(1992)，《聚乙二醇化學(xué)-生物技術(shù)和生物醫(yī)藥應(yīng)用》(PolyethyleneGlycolChemistry-BiotechnicalandBiomedicalApplications),Plenum,紐約，紐約州或Harris和Zalipsky，(1997)，《聚乙二醇化學(xué)和生物學(xué)應(yīng)用ACS手冊(cè)》(ChemistryandBiologicalApplicationsofPolyethyleneGlycolACSBooks),華盛頓，哥倫比亞特區(qū)。所用的聚合物可具有線形或分支構(gòu)型。可通過(guò)加入分支部分，包括甘油和甘油寡聚物、季戊四醇、山梨醇和賴氨酸來(lái)誘生分支PEG分子或其衍生物。該聚合物一般在其結(jié)構(gòu)中，例如在其一端或兩端，和/或骨架的支鏈處具有化學(xué)反應(yīng)活性基團(tuán)而使該聚合物能與PCR中的靶位點(diǎn)相連。如下所示，這種化學(xué)反應(yīng)活性基團(tuán)可與親水性聚合物直接相連，或者在親水性聚合物或反應(yīng)活性化學(xué)(基團(tuán))之間可以具有間隔基團(tuán)/部分反應(yīng)活性化學(xué)(基團(tuán))-親水性聚合物-反應(yīng)活性化學(xué)(基團(tuán))反應(yīng)活性化學(xué)(基團(tuán))-間隔基團(tuán)-親水性聚合物-間隔基團(tuán)-反應(yīng)活性化學(xué)(基團(tuán))用于形成以上概述的該類型構(gòu)建物的間隔基團(tuán)可以是無(wú)反應(yīng)活性、化學(xué)穩(wěn)定的、鏈狀的任何有機(jī)部分。這種間隔基團(tuán)包括但不限于以下基團(tuán)-(CH2)n-，其中n=2至U5-(CH2)3NHCO(CH2)2其中二價(jià)亞烷基間隔基團(tuán)位于聚亞垸基二醇鏈和其與該復(fù)合物的TCR連接點(diǎn)之間的本發(fā)明TCR復(fù)合物是該方面的另一種實(shí)施方式。其中聚亞烷基二醇鏈含有至少兩個(gè)聚乙二醇重復(fù)單位的本發(fā)明TCR復(fù)合物是該方面的另一實(shí)施方式。本發(fā)明可用的直接或經(jīng)間隔基團(tuán)與反應(yīng)活性化學(xué)物質(zhì)相連的親水性聚合物有許多商業(yè)供應(yīng)商。這些供應(yīng)商包括NektarTherapeutics(加利福尼亞州，美國(guó))、NOFCorporation(日本)、Sunbio(韓國(guó))和EnzonPharmaceuticals(新澤西州，美國(guó))。本發(fā)明可用的直接或經(jīng)間隔基團(tuán)與反應(yīng)活性化學(xué)物質(zhì)相連的親水性聚合物包括但不限于以下聚合物<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>髙級(jí)別TCR多聚體15K，3臂，Mal3(用于三聚體)NektarOJOON0320K,4臂，MaU(用于四聚體)NektarOJOOP0440K，8臂，Mals(用于八聚體)NsktarOJOOT08可利用各種偶聯(lián)化學(xué)(物質(zhì))將聚合物分子偶聯(lián)于蛋白質(zhì)和肽治療劑。選擇最合適的偶聯(lián)化學(xué)(物質(zhì))在很大程度上取決于所需的偶聯(lián)部位。例如，以下偶聯(lián)化學(xué)(物質(zhì))已用于連接PEG分子(來(lái)源Nektar分子工程目錄2003(NektarMolecularEngineeringCatalogue2003))的一個(gè)或多個(gè)末端N-馬來(lái)酰亞胺乙烯基砜苯并三唑碳酸酯琥珀酰亞胺丙酸酯(Succinimidylpropionate)琥珀酰亞胺丁酸酯(Succinimidylbutanoate)硫代酯乙醛丙烯酸酯生物素伯胺如上所述，非PEG基聚合物也可為本發(fā)明TCR的多聚化提供合適的接頭。例如，可以利用含有通過(guò)脂肪鏈相連的馬來(lái)酰亞胺末端的部分，例如BMH和BMOE(Pierce，產(chǎn)品號(hào)22330和22323)。肽接頭是另一類TCR接頭。這些接頭由氨基酸鏈組成，其作用為在可連接的TCR分子上產(chǎn)生簡(jiǎn)單接頭或多聚化結(jié)構(gòu)域。曾采用生物素/鏈霉親和素系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生體外結(jié)合研究用的TCR四聚體(參見(jiàn)WO/99/60119)。然而，鏈霉親和素是微生物來(lái)源的多肽，因此用于治療劑中并不理想。其中的TCR通過(guò)源自人多聚化結(jié)構(gòu)域的肽接頭連接的本發(fā)明TCR復(fù)合物提供了該方面的另一種實(shí)施方式。有許多含多聚化結(jié)構(gòu)域的人蛋白質(zhì)可用于產(chǎn)生多價(jià)TCR復(fù)合物。例如，p53四聚化結(jié)構(gòu)域，其已用于產(chǎn)生scFv抗體片段四聚體，該四聚體與單體scFV片段相比，顯示血清持久性增加和解離速率明顯降低。(Willuda等，(2001)J.Biol.Chem.276(17)14385-14392)。血紅蛋白的四聚化結(jié)構(gòu)域也可能用于該類應(yīng)用。含有至少兩個(gè)TCR的本發(fā)明多價(jià)TCR復(fù)合物提供了該方面的最后一種實(shí)施方式，該復(fù)合物中所述TCR的至少一個(gè)與治療劑結(jié)合。在一方面，本發(fā)明TCR(或其多價(jià)復(fù)合物)或者還可或額外還可在其cc或(3鏈的C-末端或N-末端包含反應(yīng)活性半胱氨酸。珍銜浙治/f應(yīng)^一方面，本發(fā)明TCR可以與治療劑或可檢測(cè)部分結(jié)合。例如，所述治療劑或可檢測(cè)部分可與TCR共價(jià)相連。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述治療劑或可檢測(cè)部分與一條或兩條TCR鏈的C-末端共價(jià)相連。一方面，可利用可檢測(cè)部分，例如適用于診斷目的的標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記本發(fā)明TCR的scTCR或一條或兩條dTCR鏈。這種標(biāo)記的TCR可用于檢測(cè)SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的方法，該方法包括使TCR配體與該TCR配體的特異性TCR(或多聚高親和力TCR復(fù)合物)接觸；和檢測(cè)與該TCR配體的結(jié)合情況。在例如利用生物素化的異源二聚體形成的四聚體TCR復(fù)合物中，可利用熒光鏈霉親和素來(lái)提供可檢測(cè)標(biāo)記。這種熒光標(biāo)記的TCR四聚體適用于FACS分析，例如檢測(cè)攜帶這些高親和力TCR的特異性SLYNTVATL-HLA-A*020l復(fù)合物的抗原呈遞細(xì)胞?？蓹z測(cè)本發(fā)明可溶性TCR的另一種方法是利用TCR特異性抗體，特別是單克隆抗體。有許多商業(yè)可購(gòu)得的抗-TCR抗體，例如ocFl和PF1可分別識(shí)別a和(3鏈的恒定區(qū)。在其它方面，本發(fā)明TCR(或其多價(jià)復(fù)合物)或者還可或額外還可與治療劑結(jié)合(例如，以共價(jià)或其它方式相連)，所述治療劑可以是，例如用于殺傷細(xì)胞的毒性部分，或免疫效應(yīng)分子，如白介素或細(xì)胞因子。與非多聚野生型或本發(fā)明的T細(xì)胞受體異源二聚體相比，本發(fā)明的多價(jià)TCR復(fù)合物對(duì)TCR配體的結(jié)合能力提高。因此，本發(fā)明的多價(jià)TCR復(fù)合物特別可用于在體外或體內(nèi)追蹤或靶向呈遞SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的細(xì)胞，也可用作中間體來(lái)產(chǎn)生具有這種用途的其它多價(jià)TCR復(fù)合物。因此，這些TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物可以在體內(nèi)應(yīng)用的藥學(xué)上可接受的制劑中提供。本發(fā)明也提供將治療劑遞送至靶細(xì)胞的方法，該方法包括在允許潛在的靶細(xì)胞與本發(fā)明TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物結(jié)合的條件下使二者接觸，所述TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物對(duì)SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物具有特異性并結(jié)合有治療劑。具體地說(shuō)，本發(fā)明的可溶性TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物可用于將治療劑遞送至呈遞具體抗原的細(xì)胞。這可用于許多情況，特別是針對(duì)HIV感染的細(xì)胞。治療劑的遞送應(yīng)可在局部起作用而非只對(duì)與其結(jié)合的細(xì)胞起作用。因此，一種具體方案設(shè)想可采用與SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物特異性的本發(fā)明TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物相連的細(xì)胞毒性或免疫刺激分子。為此應(yīng)用，可利用許多治療劑，例如放射性化合物，酶(例如，穿孔素)或化療藥物(例如，順鉑)。為保證在所需部位發(fā)揮毒性作用，可將毒素包裹在與鏈霉親和素相連的脂質(zhì)體內(nèi)從而使該化合物緩慢釋放。這防止了毒素在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)期間遭受破壞并且保證了TCR與相關(guān)的抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合后毒素具有最大作用。其它合適的治療劑包括小分子細(xì)胞毒性藥物，即分子量小于700道爾頓，能殺傷哺乳動(dòng)物細(xì)胞的化合物。這種化合物也可包含具有細(xì)胞毒性作用的毒性金屬。此外，應(yīng)該理解這些小分子細(xì)胞毒性藥物也包括藥物前體，即能在生理?xiàng)l件下分解或轉(zhuǎn)變從而釋放細(xì)胞毒性藥物的化合物。這種藥物的例子包括順鉑、美登素衍生物、拉奇霉素(rachelmycin)、刺胞霉素、多西他賽、鬼臼亞乙苷、吉西他濱、異環(huán)磷酰胺、依利替康、苯丙氨酸氮芥、米托蒽醌、sorfimer卟啉鈉II(sorfimersodiumphotofrin11)、替莫唑胺、拓?fù)涮婵?、葡萄糖醛酸曲美沙?trimetreateglucuronate)、奧利斯他汀E(auristatinE)、長(zhǎng)春新堿和阿霉素；肽細(xì)胞毒素，即能殺傷哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)或其片段。包括但不限于蓖麻毒素、白喉毒素、假單胞菌細(xì)菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，即一些元素的不穩(wěn)定同位素，其在衰減同時(shí)發(fā)射一種或多種oc或p粒子，或Y射線。包括但不限于碘131、錸186、銦111、銥90、鉍210和213、錒225和砹213;也可利用螯合劑來(lái)促進(jìn)這些放射性核素與高親和力TCR或其多聚體結(jié)合；前藥，包括但不限于抗體定向的酶前藥；免疫刺激劑，即能激活免疫應(yīng)答的部分。包括但不限于細(xì)胞因子，例如IL-2和IFN;超抗原和其變體；TCR-HLA融合物和趨化因子，例如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生長(zhǎng)刺激蛋白等抗體或其片段；補(bǔ)體激活劑；異種蛋白結(jié)構(gòu)域；同種蛋白結(jié)構(gòu)域；病毒/細(xì)菌蛋白結(jié)構(gòu)域；病毒/細(xì)菌肽和抗T細(xì)胞決定簇抗體(例如，抗-CD3或抗-CD28)或抗體類似物，例如Nanobodies和AffybodiesTM。本發(fā)明的可溶性TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物可與能將前藥轉(zhuǎn)化為藥物的酶相連接。這就使前藥僅在需要藥物的位點(diǎn)得以轉(zhuǎn)化為藥物(即通過(guò)sTCR靶向)期望本文所揭示的高親和力SLYNTVATL(SEQIDNO:16)-HLA-A*0201特異性TCR可用于診斷和治療AIDS的方法中。出于治療目的，使治療劑定位在HIV感染的(CD4+)細(xì)胞鄰近處將增強(qiáng)毒劑或免疫刺激劑的效果。出于疫苗遞送的目的，疫苗抗原可定位于抗原遞呈細(xì)胞的附近，從而增強(qiáng)抗原的效力。該方法還可用于成像目的。一個(gè)實(shí)施方式是包含本發(fā)明TCR的膜制劑?？捎眉?xì)胞制備所述膜制劑，或者所述膜制劑可包含合成的膜。另一實(shí)施方式是具有包含本發(fā)明TCR編碼核酸的表達(dá)載體的細(xì)胞。例如，所述細(xì)胞可為T細(xì)胞。本發(fā)明的其它實(shí)施方式是包含以下成分的藥物組合物本發(fā)明的TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物(任選地與治療劑結(jié)合)，或包含本發(fā)明TCR的膜制劑，或多個(gè)具有包含本發(fā)明TCR編碼核酸的表達(dá)載體的細(xì)胞，同時(shí)還含有藥學(xué)上可接受的載體。AIDS的方法，所述方法包括給予罹患AIDS的對(duì)象有效量的本發(fā)明的TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物，或包含本發(fā)明TCR的膜制劑，或多個(gè)具有包含本發(fā)明TCR編碼核酸的表達(dá)載體的細(xì)胞。在相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物、包含本發(fā)明TCR的膜制劑、或多個(gè)具有包含本發(fā)明TCR編碼核酸的表達(dá)載體的細(xì)胞在制備治療AIDS的組合物中的用途。本發(fā)明的這些用途和方法的其它具體實(shí)施方式是將本發(fā)明的TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物、或包含本發(fā)明TCR的膜制劑以與治療劑結(jié)合的方式給藥。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述具有包含本發(fā)明TCR編碼核酸的表達(dá)載體的細(xì)胞是CD8+T細(xì)胞.本發(fā)明的治療性或成像TCR將通常作為一般包含藥學(xué)上可接受的載體的無(wú)菌藥物組合物的一部分應(yīng)用。該藥物組合物可為任何適合的形式(取決于將其給予患者所需的方法)。可以單位劑型提供，(所述單位劑型)通常裝在密封容器中提供，并可作為試劑盒的一部分提供。這種試劑盒通常(雖然并不是必須)裝有使用說(shuō)明書。其可裝有多種所述的單位劑型。不希望受限于理論，期望本發(fā)明的TCR可提供能遞送治療劑(例如免疫刺激劑和/或針對(duì)HIV感染的(CD4+)細(xì)胞的細(xì)胞毒劑)的有效靶向劑。具體而言，期望將本發(fā)明TCR與免疫刺激劑和/或細(xì)胞毒劑一起給藥，并聯(lián)用常規(guī)的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物療法和/或IL-2治療將能靶向HIV感染細(xì)胞。以下是在美國(guó)獲準(zhǔn)使用的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的列表Agenerase(安潑那韋)-蛋白酶抑制劑可比韋-疊氮胸苷(300mg)與拉米夫定(150mg)并用Crixivan(印地那韋(indinavir))-蛋白酶抑制劑拉米夫定(3-硫胞苷/lamivudine)—腺苷類似物，逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑Epzicom(聯(lián)用兩種核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(在同一藥丸中的NRTI;600mgZiagen(阿巴卡韋)和300mg拉米夫定(3TC))Emtriva[恩曲他濱(FTC)]沙奎那韋軟凝膠劑(沙奎那韋)-蛋白酶抑制劑Fuzeon(恩夫韋地(enfuvirtide))-融合抑制劑唑西他賓(ddc/扎西他賓)-核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑Invirase(沙奎那韋)-蛋白酶抑制劑Kaletra(洛匹那韋)-蛋白酶抑制劑Lexiva(福沙那韋)-蛋白酶抑制劑，批準(zhǔn)于10/20/03諾韋(利托那韋)-蛋白酶抑制劑Rescriptor(地拉夫定)-非核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑疊氮胸苷，AZT(齊多夫定)-核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑Reyataz(阿扎奈韋(atazanavir);BMS-232632)-蛋白酶抑制劑Sustiva(依法韋侖)-非核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑Trizivir(于同一片劑中的3種非核苷；阿巴卡韋+疊氮胸苷+疊氮胸苷Truvada(恩曲他濱+替諾福韋DF)惠妥滋(ddl/地達(dá)諾新)核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑惠妥滋EC;(ddl/地達(dá)諾新)核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑；奈非那韋(那非那韋)-蛋白酶抑制劑Viramune(奈韋拉平)-非核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑Viread(奈韋拉平；延胡索酸替諾福韋酯(tenofovirdisoproxilfomarate))核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(阿糖腺苷類)澤瑞特(d4t/司他夫定)-核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑Ziagen(司他夫定)-核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑所述藥物組合物可適于用任何合適的途徑給藥，例如胃腸道外、透皮或通過(guò)吸入給藥，優(yōu)選經(jīng)胃腸道外途徑(包括皮下、肌內(nèi)或最優(yōu)選靜脈內(nèi)給藥)。該組合物可用藥劑領(lǐng)域中己知的任何方法制備，例如在無(wú)菌條件下混合活性成分與載體或賦形劑。本發(fā)明物質(zhì)的劑量可根據(jù)待治療的疾病或病癥、待治療個(gè)體的年齡和狀況等而有較大不同，醫(yī)師最終可確定所使用的合適劑量。其它方面本發(fā)明的scTCR或dTCR(優(yōu)選由對(duì)應(yīng)于人序列的恒定區(qū)或可變區(qū)序列構(gòu)成)可以以基本純的形式、或作為純化或分離的制劑提供。例如，可以基本上不含其它蛋白質(zhì)的形式提供。也可改變本發(fā)明TCR的一種或多種編碼核酸的序列，從而使得在宿主細(xì)胞中獲得的表達(dá)水平最優(yōu)化。宿主細(xì)胞可為任何適宜的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。例如，所述宿主細(xì)胞可為大腸桿菌(五.co/()細(xì)胞或人T細(xì)胞。對(duì)這些遺傳序列所作出的改變是沉默的，即它們不會(huì)改變所編碼的氨基酸序列。有很多提供此類表達(dá)最優(yōu)化服務(wù)的公司，包括德國(guó)的GeneArt。本發(fā)明也提供與SLYNTVATL-HLA-A*0201具有結(jié)合特性的高親和力TCR的制備方法。所述TCR的特征在于(i)含有至少一個(gè)TCRcx鏈可變區(qū)和/或至少一個(gè)TCRp鏈可變區(qū)，和(ii)對(duì)所述SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的Kd小于或等于1pM和/或?qū)LYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的解離速率(k。ff)為1XlO—3S—1或更慢，該方法包括(a)制備含有親本HIVGagTCR的ot禾P卩鏈可變區(qū)的TCR，其中a和(3鏈可變區(qū)的一個(gè)或兩個(gè)在權(quán)利要求7和8所鑒定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸中含有突變；(b)在適合于TCR和SLYNTVATL-HLA-A*0201結(jié)合的條件下使所述突變的TCR與SLYNTVATL-HLA-A*0201接觸；和測(cè)定該相互作用的Kd和/或k。ff。本發(fā)明各方面的優(yōu)選特征與已作了必要修正的其它各方面的一樣。本文提及的現(xiàn)有技術(shù)文件按照法律所允許的最大程度納入。實(shí)施例以下實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下文參考了附圖，其中圖la和lb分別詳細(xì)描述了親本HIVGagTCR的a鏈可變區(qū)氨基酸序列和卩鏈可變區(qū)氨基酸序列。圖2a和2b分別顯示了可溶形式親本HIVGagTCRa鏈和|3鏈的DNA序列。圖3a和3b分別顯示了從圖2a和2b的DNA序列產(chǎn)生的HIVGagTCRoc和卩鏈胞外氨基酸序列。圖4a和4b分別顯示了可溶形式HIVGagTCRa和(3鏈的DNA序列經(jīng)突變而能編碼額外的半胱氨酸殘基從而形成非天然的二硫鍵。陰影表示突變的密碼子。下劃線表示限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。圖5a和5b分別顯示了從圖4a和4b的DNA序列產(chǎn)生的HIVGagTCRa和p鏈胞外氨基酸序列。陰影表示各鏈中引入的半胱氨酸。圖6詳細(xì)描述了高親和力HIVGagTCR變體的cc鏈可變區(qū)氨基酸序列。圖7詳細(xì)描述了高親和力HIVGagTCR變體的|3鏈可變區(qū)氨基酸序列。圖8a詳細(xì)描述了TRA可溶部分的氨基酸序列。圖8b詳細(xì)描述了TRBC1可溶部分的氨基酸序列。圖8c詳細(xì)描述了TRBC2可溶部分的氨基酸序列。圖9詳細(xì)描述了pEX954質(zhì)粒的DNA序列。圖IO詳細(xì)描述了pEX821質(zhì)粒的DNA序列。圖11詳細(xì)描述了通過(guò)肽接頭連接于野生型人IL-2的親本可溶性HIVGagTCR變體的P鏈氨基酸序列。接頭的氨基酸和IL-2用斜體表示。圖12提供了可溶性二硫鍵連接的親本HIVGagTCR與SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物相互作用的Biacore響應(yīng)曲線。圖13提供了pEX954質(zhì)粒的質(zhì)粒作圖。圖14提供了pEX821質(zhì)粒的質(zhì)粒作圖。圖15a提供了為在人T細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的親本HIVGagTCRa鏈的全長(zhǎng)DNA序列。圖15b提供了為在人T細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的親本HIVGagTCR0鏈的全長(zhǎng)DNA序列。圖16a提供了親本HIVGagTCRa鏈的全長(zhǎng)氨基酸序列。圖16b提供了為在人T細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的親本HIVGagTCRP鏈的全長(zhǎng)氨基酸序列。圖17a提供了未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對(duì)照CD8+T細(xì)胞的FACS分析數(shù)據(jù)。圖17b提供了說(shuō)明親本HIVGagTCR表達(dá)在轉(zhuǎn)導(dǎo)CD8+T細(xì)胞表面上的FACS分析數(shù)據(jù)。圖18a和18b分別提供了可溶性二硫鍵連接的高親和力cllc6HIVGagTCR的a和P鏈的氨基酸序列。圖19顯示了在受HIV感染的To細(xì)胞存在下，通過(guò)IFN-y和TNF-a的產(chǎn)量測(cè)定的可溶性二硫鍵連接的高親和力clIc6HIVGagTCR對(duì)SLYNTVATL-HLA-A*0201反應(yīng)性0X84單克隆T細(xì)胞株活化的抑制能力。圖20顯示了在SLYNTVATL肽脈沖的未受HIV感染的To細(xì)胞存在下，通過(guò)IFN-Y和TNF-a的產(chǎn)量測(cè)定的可溶性二硫鍵連接的高親和力clIc6HIVGagTCR對(duì)SLYNTVATL-HLA-A*0201反應(yīng)性0X84單克隆T細(xì)胞株活化的抑制能力。圖21顯示了可溶性二硫鍵連接的高親和力clIc6HIVGagTCR染色SLYNTVATL肽脈沖的T2細(xì)胞的能力。實(shí)iiW;-包診襲本/z/KGagrc;^資,游^麥性二疏經(jīng)遂麥游rc/游產(chǎn)主圖4a和4b提供了對(duì)SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物具有特異性的親本TCR的可溶性二硫鍵連接ap鏈的DNA序列?？捎啥鄠€(gè)承包研究公司(contractresearchcompany)從頭合成這些DNA序列，例如GeneArt(德國(guó))?？稍谶@些DNA序列中加入限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，從而使得這些DNA序列易于連接入基于pGMT7的表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有用于在大腸桿菌BL21-DE3(pLysS)中高水平表達(dá)的T7啟動(dòng)子(Pan等，腸^c/zm々廳(2000)29(6):1234-8)。該TCRa鏈序列包含導(dǎo)入的C/a/和&///限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，并且該序列被連接入用C/a/和Z/zo/切割的pEX954(參見(jiàn)圖9和13)。該TCR|3鏈序列包含導(dǎo)入的Ae/和^ge/限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，并且該序列被連接入用A^e/^ge/切割的pEX821(參見(jiàn)圖10和14)。導(dǎo)乂編^rcw舒游"A^游銜劍絲/^級(jí)發(fā)街激泣^C/a/-ATCGAT5*淑-GTCGAC-ATTAAT々e/-ACCGGT遂麥采用快速DNA連接試劑盒(rapidDNAligationkit，Roche)，根據(jù)廠商說(shuō)明書連接切割的TCRouJ3鏈DNA和切割的載體。將連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)的大腸桿菌菌株XLl-藍(lán)細(xì)胞，并將其接種于含有100mg/ml氨芐西林的LB/瓊脂平板上。于37'C孵育過(guò)夜后，挑選單菌落，使其在10ml含有100mg/ml氨芐西林的LB中于37'C搖動(dòng)生長(zhǎng)過(guò)夜。采用Miniprep試劑盒(Qiagen)純化克隆的質(zhì)粒，并采用自動(dòng)化DNA測(cè)序儀(LarkTechnologies)對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序。圖5a和5b分,處激2-^",絲二藏經(jīng)遂麥游///「(^^re//^旁浙力變,游產(chǎn)主可將如實(shí)施例1所述產(chǎn)生的可溶性二硫鍵連接的天然HIVGagTCR用作模板，由該模板可產(chǎn)生對(duì)SLYNTVATL(SEQIDNO:16)-HLA-A*0201復(fù)合物的親和力提高的本發(fā)明TCR。噬菌體展示是可為鑒別高親和力變體而制備HIVGagTCR變體庫(kù)的一種方法。例如，可對(duì)Li等(2005)A^ft^e23(3):349-354)描述的TCR噬菌體展示和篩選方法進(jìn)行調(diào)整并將其用于HIVGagTCR。圖6和7分別列出了與適當(dāng)?shù)腡CR鏈結(jié)合時(shí)對(duì)SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物顯示出高親和力的突變TCRa和!3鏈氨基序列(分別為SEQIDNo:11-13和14-15)。本領(lǐng)域技術(shù)人員己知可通過(guò)定點(diǎn)突變將產(chǎn)生這些突變鏈所需的必需密碼子變化導(dǎo)入編碼這些鏈的DNA中(QuickChangeTM，Stratagene的定點(diǎn)突變?cè)噭┖?。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)使用摻入所需的一個(gè)或多個(gè)密碼子變化的引物以及作為誘變模板的含相關(guān)TCR鏈DNA的質(zhì)粒來(lái)實(shí)現(xiàn)采用以下條件進(jìn)行誘變50ng質(zhì)粒模板、lpl的10mMdNTP、由廠商提供的5pi的10XPfuDNA聚合酶緩沖液、25pmo1的正向引物、25pmol的反向引物、1^1的pfuDNA聚合酶，總體積為50nl。在95。C進(jìn)行2分鐘的初始變性之后，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的如下反應(yīng)變性(95。C，10秒)、退火(55'C,10秒)和延伸(72。C，8分鐘)。用DpnI限制性內(nèi)切酶消化所得產(chǎn)物以去除模板質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株XU-藍(lán)。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證誘變。實(shí)嚴(yán)伊"-^#WTCA游表這、置叛#//7錄眾將實(shí)施例l或2中制備的分別含有突變a鏈和p鏈的表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株BL21pLysS，并于37"C下在TYP培養(yǎng)基(含100嗎/ml氨芐西林)中培養(yǎng)具有氨芐西林抗性的單菌落直至OD6。o為0.4，然后用0.5mMIPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。誘導(dǎo)后3小時(shí)用BeckmanJ-6B以4000rpm離心30分鐘收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀物重懸在含有50mMTris-HCI、25%(w/v)蔗糖、lmMNaEDTA、0.1%(w/v)疊氮鈉、10mMDTTpH8.0的緩沖液中。在過(guò)夜的凍融步驟之后，在MilsonixXL2020超聲波儀中用標(biāo)準(zhǔn)的12mm直徑探頭對(duì)重懸的細(xì)胞進(jìn)行1分鐘的超聲破碎，總共超聲約IO分鐘。用BeckmanJ2-21離心機(jī)以13000rpm離心30分鐘回收包涵體沉淀物。然后用去污劑洗滌三次以去除細(xì)胞碎片和膜組分。每次將包涵體沉淀物在Triton緩沖液中均漿(50mMTris-HCl、0.5%Triton-X100、200mMNaCl、10mMNaEDTA、0.1%(w/v)疊氮鈉、2mMDTT，pH8.0)，然后用BeckmanJ2-21離心機(jī)以13000rpm離心15分鐘使其沉淀。然后在如下緩沖液中進(jìn)行類似洗滌去除去污劑和鹽50mMTris-HCl、lmMNaEDTA、0.1%(w/v)疊氮鈉、2mMDTT，pH8.0。最后，將包涵體分成30mg的等分，并于-70。C冷凍。用6M鹽酸胍溶解并通過(guò)Bradford染料結(jié)合測(cè)試(PerBio)定量測(cè)定包涵體蛋白產(chǎn)率。融化冷凍儲(chǔ)備物中溶有約30mg的TCR|3鏈和60mg的TCRa鏈的包涵體，然后混合樣品，用15ml胍溶液(6M鹽酸胍、10mM醋酸鈉、10mMEDTA)稀釋該混合物以確保鏈完全變性。然后將含有完全還原并變性的TCR鏈的胍溶液注入到1升如下的重折疊緩沖液中100mMTrispH8.5、400mML-精氨酸、2mMEDTA、5mM還原性谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽、5M尿素、0.2mMPMSF。加入氧化還原對(duì)(2-巰乙胺和六甲烯胺(其終濃度分別為6.6mM禾tl3.7mM)，約5分鐘后加入變性的TCR鏈。將溶液靜置5小時(shí)±15分鐘。5T士3r，在Spectr叩or1膜(Spectrum;產(chǎn)品編號(hào)132670)中用10L10mMTrispH8.1透析重折疊的TCR18-20個(gè)小時(shí)。然后將透析緩沖液換為新鮮的10mMTrispH8.1(10L)，繼續(xù)在5°?！?匸下再透析20-22小時(shí)。從降解產(chǎn)物中分離sTCR，將透析的重折疊蛋白加載到POROS50HQ陰離子交換柱上，然后采用Akta純化儀(Pharmacia)以50倍以上柱體積的0-500mMNaCl梯度溶液洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)來(lái)純化。將峰部分儲(chǔ)存于4t:，采用考馬斯染色的SDS-PAGE進(jìn)行分析，然后合并和濃縮。最后，采用在HBS-EP緩沖液(IOmMHEPESpH7.4、150mMNaCl、3.5mMEDTA、0.05%乙基苯基聚乙二醇p40(nonidetp40))預(yù)平衡的Superdex200HR凝膠過(guò)濾柱純化和表征sTCR。收集并濃縮在相對(duì)分子量約為50kDa洗脫的峰，然后用BIAcore表面等離子共振分析法表征。-表厥箏蓐f關(guān)嚴(yán)表C茲^f錄,絲pMi/C游JC/采用表面等離子共振生物傳感器(Biacore3000")來(lái)分析sTCR與其肽-MHC配體的結(jié)合。產(chǎn)生以半定向形式固定于抗生物素蛋白鏈菌素包被的結(jié)合表面的一種pMHC復(fù)合物(如下所述)有助于該分析并可同時(shí)有效測(cè)試可溶性T-細(xì)胞受體與多達(dá)4種不同pMHC(固定于不同流動(dòng)小室)的結(jié)合。手工注射HLA復(fù)合物易于操控固定的I類分子的精確水平。體外重新折疊含有組成性亞單位蛋白和合成肽的細(xì)菌表達(dá)的內(nèi)涵體的生物素化I類HLA-A*0201分子，然后純化并在體外進(jìn)行酶生物素化(O'Callaghan#"(1999)ja/.B/ocAe/w.266:9-15)。所表達(dá)的HLA-A+0201-重鏈具有C末端生物素化標(biāo)簽，其在適合的構(gòu)建物中替代了該蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。獲得的內(nèi)涵體表達(dá)水平約75mg/升細(xì)菌培養(yǎng)物。還從適合的構(gòu)建體在大腸桿菌中表達(dá)了MHC輕鏈或(52-微球蛋白，其水平約為500mg/升細(xì)菌培養(yǎng)物。裂解大腸桿菌細(xì)胞，將內(nèi)涵體純化到約80%的純度。在6M鹽酸胍、50mMTrispH8.1、100mMNaCl、10mMDTT、10mMEDTA中使內(nèi)涵體的蛋白質(zhì)變性，通過(guò)在低于5'C將變性蛋白一次脈沖加入重折疊緩沖液，以30mg/升重鏈、30mg/升(32m的濃度在0.4ML-精氨酸-HCl、100mMTrispH8.1、3.7mM六甲烯胺、6.6mM(3-巰乙胺，負(fù)載于HLA-A*0201分子所需的4mg/mlSLYNTVATL肽中重折疊。重折疊在4'C時(shí)進(jìn)行至少1小時(shí)方能完成。用IO倍體積的10mMTrispH8.1進(jìn)行透析來(lái)更換緩沖液。需更換緩沖液2次以充分降低溶液的離子強(qiáng)度。然后用1.5pm的醋酸纖維素濾膜過(guò)濾蛋白質(zhì)溶液，并加載到POROS50HQ陰離子交換柱上(8ml的床體積)。用線性0-500mMNaCl梯度洗脫蛋白質(zhì)。以約250mMNaCl洗脫HLA-A"201-肽復(fù)合物，收集峰組分，加入蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem)，然后在冰上冷藏該部分。采用以10mMTrispH8.1、5mMNaCl平衡的Pharmacia快速脫鹽柱，將生物素化標(biāo)記的pMHC分子的緩沖液更換為10mMTrispH8.1、5mMNaCl。洗脫后立即將含蛋白質(zhì)的組分置于冰上冷藏，加入蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem)。然后加入生物素試劑lmM生物素、5mMATP(緩沖至pH8)、7.5mMMgCb禾口5嗎/mlBirA酶(根據(jù)O，Callaghan#"(1999)勘a/.266:9-15進(jìn)行純化)。然后將該混合物在室溫下孵育過(guò)夜。采用凝膠過(guò)濾層析來(lái)純化生物素化的pHLA-AW201分子。用經(jīng)過(guò)濾的PBS預(yù)平衡PharmaciaSuperdex75HR10/30柱，然后加載1ml生物素化反應(yīng)混合物，用PBS以0.5ml/分鐘洗脫柱。生物素化的pHLA-A*0201分子在約15ml時(shí)以單峰洗脫。合并含蛋白質(zhì)的組分，在冰上冷藏，然后加入蛋白酶抑制劑混合物。采用考馬斯結(jié)合分析法(PerBio)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，將生物素化pHLA-A*0201分子的等份試樣冷凍于-20°C。采用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)法固定抗生物素蛋白鏈菌素。該固定化的復(fù)合物與T-細(xì)胞受體和共同受體CD8otoc均能結(jié)合，這些受體都可注入可溶相。即便是在低濃度下(至少40Mg/ml)也獲得了TCR的特異性結(jié)合，這就暗示了TCR相對(duì)穩(wěn)定。如果采用溶解的或固定相的sTCR，所觀察到的sTCR的pMHC結(jié)合特性在質(zhì)量和數(shù)量上類似。這是可溶性物質(zhì)的部分活性的一種重要控制方法，也提示生物素化的pMHC復(fù)合物與非生物素化復(fù)合物具有相同的生物學(xué)活性。在Biacore3000tm表面等離子共振(SPR)生物傳感器上分析含新的鏈間鍵的HIVGagsTCR與其配體/MHC復(fù)合物或無(wú)關(guān)HLA-肽組合物之間的相互作用(其產(chǎn)生如上所述)。在一流動(dòng)小室中，SPR檢測(cè)到傳感器表面附近以響應(yīng)單元(RU)表示的折光率發(fā)生變化，該原理可用于檢測(cè)受體配體相互作用和分析它們的親和力以及動(dòng)力學(xué)參數(shù)。所述探針流動(dòng)小室如下制備通過(guò)交聯(lián)到p2m上的生物素與已化學(xué)交聯(lián)到流動(dòng)小室的活性表面上的抗生物素蛋白鏈菌素之間的結(jié)合，將各HLA-肽復(fù)合物固定在不同的流動(dòng)小室中。然后使sTCR以恒定的流速通過(guò)不同流動(dòng)小室的表面，并測(cè)定該情況下的SPR響應(yīng)以進(jìn)行測(cè)試。情錄^煮',層定制備了親本或突變HIVGagsTCR的連續(xù)稀釋液，以5pl/分鐘的恒定流速注入兩個(gè)不同的流動(dòng)小室；一個(gè)流動(dòng)小室用約1000RU的特異性SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物包被，另一個(gè)用約1000RU的非特異性HLA-A2-肽復(fù)合物包被。采用對(duì)照小室的測(cè)定值對(duì)各濃度的響應(yīng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。以標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)響應(yīng)對(duì)TCR樣品的濃度作圖，擬合成雙曲線(hyperbola)以計(jì)算平衡結(jié)合常數(shù)，KD。(Price&Dwek，PrinciplesandProblemsinPhysicalChemistryforBiochemists(2ndEdition)，《生物化學(xué)的物理化學(xué)中的原理和問(wèn)題》第二版，1979，ClarendonPress,牛津)。動(dòng)力學(xué)參教層定通過(guò)試驗(yàn)測(cè)定解離速率常數(shù)Kd和結(jié)合速率常數(shù)Ka來(lái)確定高親和力TCR的KD。平衡常數(shù)KD計(jì)算為kd/ka。將TCR注射流過(guò)兩個(gè)不同小室，一個(gè)用約300RU的特異性HLA-A2-nyeso肽復(fù)合物包被，另一個(gè)用約300RU的非特異性HLA-A2-肽復(fù)合物包被。流速設(shè)置為50pl/分鐘。通常以約3pM的濃度注入250pi的TCR。然后使緩沖液流過(guò)直到響應(yīng)回復(fù)到基線。采用Biaevaluation軟件計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)。也將解離相擬合為單指數(shù)衰變方程式以計(jì)算半衰期。茲菜釆用上述方法分析可溶性二硫鍵連接的天然HIVGagTCR(由SEQIDNO:9禾B10分別詳述的a和(3TCR鏈組成)和SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物之間的相互作用，顯示I(D為85nM，解離速率(k。ff)為2.21Xl(T2S"。(Biacore響應(yīng)曲線可參見(jiàn)圖12)下表所述TCR具有的KD小于或等于1MM禾P/或k。ff為1X10—3S—1或更慢。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>貧^W5-/^霧絲葛凌浙力///FGagrCT-勞fMX^^歪/^游產(chǎn)主可利用大致上如實(shí)施例1-3中所述方法產(chǎn)生可溶性高親和力HIVGagTCR-野生型(WT)人IL-2融合蛋白。簡(jiǎn)言之，將編碼所需接頭和WT人IL-2的DNA加到可溶性二硫鍵連接的親本HIVGagTCR(3鏈3'端，即直接在TAA("終止")密碼子的前部。圖11提供了融合蛋白的氨基酸序列，該融合蛋白包含通過(guò)接頭序列融合到WT人IL-2的二硫鍵連接的親本HIVGagTCR卩鏈(SEQIDNO:24)。該融合蛋白的接頭和IL-2部分用斜體表示。然后可將編碼該構(gòu)建物的DNA連接入pEX821。然后可采用基本上如實(shí)施例3所述的方法，使該(3鏈融合蛋白與圖5a詳述的可溶性二硫鍵連接的親本HIVGaga鏈TCR鏈相結(jié)合，從而表達(dá)可溶性親本HIVGagTCR-IL-2融合蛋白。實(shí)督/6-#本鮮G"gra,T—鍾表,J:游重資表這合成了編碼親本HIVGagTCR鏈的信號(hào)序列、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的DNA構(gòu)建物(GeneArt，德國(guó))。這些TCRa鏈和TCR卩鏈DNA序列(分別示于圖15a和15b)與親本HIVGagTCRDNA序列不同，從而增強(qiáng)了所編碼的TCR鏈在人T細(xì)胞中的表達(dá)水平，并同時(shí)保留了天然氨基酸序列。圖16a和16b提供了分別由圖15a和15b所示DNA序列編碼的全長(zhǎng)氨基酸序列。然后將TCRa鏈和TCR(3鏈DNA序列一起插入慢病毒(Lentiviral)表達(dá)載體。該載體包含作為單個(gè)開(kāi)放讀框的編碼親本HIVGagTCRa鏈和卩鏈和隔開(kāi)TCR鏈的框內(nèi)口蹄疫病毒(FMDV)2A分裂因子(cleaviagefactor)氨基酸序列(LLNFDLLKLAGDVESNPG(SEQIDNO:31))的DNA序列。(deFelipe等，Ge"e,Facc/"^77zw(2004)2(1):13)。在mRNA翻譯時(shí)，產(chǎn)生了在C末端具有2A肽序列的TCRa鏈，而TCRp鏈則作為單獨(dú)的多肽產(chǎn)生。用上述慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，用抗CD3/抗CD28珠刺激原始(primary)T細(xì)胞24小時(shí)。然后將表達(dá)TCR基因的慢病毒濃縮上清液與經(jīng)刺激的T細(xì)胞一起孵育以進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。然后去除抗CD3/抗CD28珠，培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞直到它們達(dá)到200-300fL的"靜體積"(restingvolumn)。利用HLA-A*0201-SLYNTVALTPE三聚體和抗CD8單克隆抗體FITC共染色，通過(guò)FACS分析證實(shí)親本HIVGagTCR遞呈到轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞表面上。錄菜圖17b提供了FACS分析數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)顯示親本HIVGagTCR成功地表達(dá)在轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞表面。圖17a提供了利用對(duì)照的未轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生的FACS分析數(shù)據(jù)。7-^銀絲腐;黃^7力///rGagTOC7X/g眾游漸劍進(jìn)行了以下測(cè)試以證實(shí)可溶性高親和力cllc6HIVGagTCR能抑制SLYNTVATL-HLA-A*0201反應(yīng)性單克隆T細(xì)胞株的活化。///f感染潘應(yīng)存在7oxs4^sxKv:n^^反應(yīng)絲^^"虔r潘應(yīng)^/g歸漸劍鋪本試驗(yàn)中采用的可溶性cllc6高親和力HIVGagTCR包含分別如圖6c(SEQIDNO:13)和圖7b(SEQIDNO:15)所示的TCRa鏈可變區(qū)和TCR(5鏈可變區(qū)。該可溶性TCR的TCRa和卩鏈全長(zhǎng)序列分別示于圖18a(SEQIDNO:29)和圖18b(SEQIDNO:30)中。將IFN-y和TNF-a的產(chǎn)生用作CTL活化的顯示。微RIO分析培養(yǎng)基10%FCS(經(jīng)熱滅活，Gibco，目錄號(hào)10108-165)、88%RPMI1640(Gibco，目錄號(hào)42401-018)、1%谷胺酰胺(Gibco，目錄號(hào)25030-024)和"/。青霉素/鏈霉素(Gibco，目錄號(hào)15070-063)。肽(獲自各種來(lái)源)最初溶于DMSO(Sigma，目錄號(hào)D2650),濃度為4mg/ml，凍存。BDTM細(xì)胞計(jì)數(shù)珠芯片試劑盒(BDTMCytometricBeadArrayKit)，人Thl/Th2細(xì)胞因子試劑盒II(HumanThl/Th2cytokineKitII，BDBiosciences,圣迭戈，美國(guó))包含了該測(cè)試所需的所有試劑。r鄰應(yīng)^眾/，試洗漆慢性HIV感染的To靶細(xì)胞(HXB2和HIV3BHIV試驗(yàn)株)，并重懸于RIO培養(yǎng)基中。作為對(duì)照，加入未感染的To靶細(xì)胞和lnM的SLYNTVATL肽，于37匸、5%。02中(培育)30分鐘。96孔U型底培養(yǎng)板中每孔含有RIO培養(yǎng)基配制的25,000個(gè)HIV感染的To耙細(xì)胞。每孔中含有RIO培養(yǎng)基配制的2X10—7M高親和力cllc6HIVGagTCR或親本HIVGagTCR。每孔中含有RIO培養(yǎng)基配制的50000X84單克隆效應(yīng)T細(xì)胞株。上述替代的無(wú)關(guān)可溶性TCR(HLA-A*0201-Tax特異性和HLA-A*0201-NY-ESO特異性TCR)或高親和力HIVGagTCR。然后將板在37。C、5%(302中孵育4小時(shí)。去除培養(yǎng)上清液，采用如下方法測(cè)定IFN-y和TNF-a存在的水平。/FjV7浙7WF-cc,/試根據(jù)廠商說(shuō)明書制備(a)IFNY捕獲抗體和(b)抗TNFa捕獲抗體包被的bdtm細(xì)胞計(jì)數(shù)珠。然后制備含有以下添加物的多個(gè)分析管50p舊D測(cè)試稀釋液配制的混合抗IFNy和抗TNFabdtm細(xì)胞計(jì)數(shù)珠50plPE檢測(cè)試劑方法如下從T細(xì)胞活化測(cè)試孔中取出50pl培養(yǎng)上清液(試樣)或通過(guò)連續(xù)稀釋儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)液制備各濃度范圍的50pl混合IFNY和TNFa標(biāo)準(zhǔn)液(定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物)然后避光孵育試管3小時(shí)，再用lmlBD洗滌緩沖液洗滌，離心。最后，將這些珠重懸于300pl洗滌緩沖液中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)根據(jù)廠商的說(shuō)明書測(cè)定IFNy和TNFa存在的水平。以s丄]wnM7xi(fi^^游未^"糴ro潘應(yīng)存,7^s丄iwr^4r丄-特弄絲多jT虔r潘應(yīng)系游,虔y采用上述CTL活化測(cè)試所用的相同試劑和方法，除了在各T細(xì)胞活化測(cè)試中使用20000X84多克隆效應(yīng)T細(xì)胞。用1(T1G-l(T8MSLYNTVATL肽脈沖的未感染To類淋巴母細(xì)胞用作靶T細(xì)胞。錄菜通過(guò)IFN-y禾卩TNF-a產(chǎn)量測(cè)得，在HIV感染的To細(xì)胞存在下，可溶性高親和力cllc6HIVGagTCR強(qiáng)烈抑制了SLYNTVATL-HLA-A*0201反應(yīng)性0X84多克隆T細(xì)胞株活化(參見(jiàn)圖19)。通過(guò)IFN-y和TNF-a產(chǎn)量測(cè)得，在SLYNTVATL脈沖的未感染To細(xì)胞存在下，可溶性高親和力cllc6HIVGagTCR強(qiáng)烈抑制了SLYNTVATL-HLA-A*0201反應(yīng)性0X84多克隆T細(xì)胞株的活化(參見(jiàn)圖20)。實(shí)^Ws-邀過(guò)貴i^微籍^募襲^7力"/c(5///kc^gre/定著粼定if嚴(yán);^游77紛應(yīng)J:游潘應(yīng)表鷹SLlW7T^r丄HJ"廁貧嚴(yán)通過(guò)單分子熒光顯微鏡用可溶性高親和力cllc6HIVGagTCR測(cè)定肽脈沖的T2類淋巴母細(xì)胞上SLYNTVATL-HLA-A*0201抗原的數(shù)量(基于假設(shè)一個(gè)熒光信號(hào)與一個(gè)標(biāo)記TCR結(jié)合其位于靶細(xì)胞表面的同源pMHC配體有關(guān))。采用生物素化TCR靶向表達(dá)抗原的癌細(xì)胞，然后用抗生物素蛋白鏈菌素R-藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)物來(lái)標(biāo)記與細(xì)胞結(jié)合的TCR有助于該項(xiàng)測(cè)定。然后用三維熒光顯微鏡使單個(gè)PE分子成像。37。C用一定濃度范圍(10—5-1CT"M)的HIVGag-衍生的SLYNTVATL肽或無(wú)關(guān)肽(SLLMWITQC)脈沖T2類淋巴母細(xì)胞90分鐘。脈沖后，用50(^1PBS洗滌細(xì)胞2次。室溫下，將細(xì)胞孵育于200pl的TCR溶液中(100nM高親和力cllc6HIVGagTCR，用含0.5%BSA白蛋白的PBS配制)30分鐘。去除TCR溶液，用500plPBS洗滌細(xì)胞3次。室溫下，在200pl抗生物素蛋白鏈菌素-PE溶液中(5嗎ml"含0.5%BSA的PBS配制的抗生物素蛋白鏈菌素-PE中)避光孵育細(xì)胞20分鐘。去除抗生物素蛋白鏈菌素-PE溶液，用500plPBS洗滌細(xì)胞3次。去除洗滌介質(zhì)，將細(xì)胞保存在400plRlO中，在用熒光顯微鏡成像前不加入酚紅。資光^微法采用Axiovert200M(Zeiss)顯微鏡以63X油鏡(Zeiss)進(jìn)行熒光顯微法。用將裝有300W氤弧燈(Sutter)的XLS光源照明，通過(guò)在光路中放入0.3和0.6中密度濾片將光強(qiáng)減低到優(yōu)化水平。采用TRITC/Dil濾波器組(Chroma)來(lái)分離激發(fā)和發(fā)射光譜。通過(guò)z-疊層(z-stack)采集(21個(gè)平面，1pm間隔)使細(xì)胞三維成像。采用如(Irvine等，淑匿419:p845-9禾口Purbhoo等，NatureImmunology5:p524-30)所述的Metamorph軟件(UniversalImaging)進(jìn)行圖像采集和分析。茲菜如圖21所示，上述方法成功地使與肽脈沖的T2細(xì)胞表面上的SLYNTVATL-HLA-A*0201抗原結(jié)合的高親和力cllc6HIVGagTCR成像。這些結(jié)果顯示采用高親和力c6cllHIVGagTCR對(duì)SLYNTVATL肽脈沖的細(xì)胞上表位進(jìn)行計(jì)數(shù)的閾值約為10力M肽。權(quán)利要求1.一種T細(xì)胞受體(TCR)，其對(duì)于SLYNTVATL-HLA-A*0201具有結(jié)合特性，且包含至少一個(gè)TCRα鏈可變區(qū)和/或至少一個(gè)TCRβ鏈可變區(qū)，其特征在于，所述TCR對(duì)所述SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的KD小于或等于1μM和/或?qū)LYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的解離速率(koff)為1×10-3S-1或更慢，前提是當(dāng)所述TCR由細(xì)胞遞呈并包含SEQIDNO1和2時(shí)，該細(xì)胞不是天然T細(xì)胞。2.如權(quán)利要求1所述的TCR，其包含a鏈可變區(qū)和TCR(3鏈可變區(qū)。3.如權(quán)利要求1所述的TCR，其為aa或即同二聚體。4.如前述任一權(quán)利要求所述的T細(xì)胞受體(TCR)，其特征在于，所述KD和/或k。ff用表面等離子共振法測(cè)定。5.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其相對(duì)于親本HIVGagTCRa鏈可變區(qū)(SEQIDNo:1)和/或卩鏈可變區(qū)(SEQIDNO:2)在至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)中存在突變。6.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其相對(duì)于親本HIVGagTCRoc鏈可變區(qū)(SEQIDNo:1)和/或(3鏈可變區(qū)(SEQIDN0:2)在其至少一個(gè)可變區(qū)框架區(qū)中存在突變。7.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其特征在于，采用SEQIDNO:l所示編號(hào)，a鏈可變區(qū)氨基酸95T5、96N、97S、98G和IOOA中的一個(gè)或多個(gè)發(fā)生突變。8.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其特征在于，采用SEQIDNO:2所示編號(hào)，(3鏈可變區(qū)氨基酸51Y、52E、53E和54E中的一個(gè)或多個(gè)發(fā)生突變。9.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的TCR，采用SEQIDNO:l所示編號(hào)，其包含a鏈可變區(qū)氨基酸95S、95G、96A、97H、98D或100S中的一個(gè)或多個(gè)。10.如權(quán)利要求l-6或9中任一項(xiàng)所述的TCR，采用SEQIDNO:2所示編號(hào)，其包含(3鏈可變區(qū)氨基酸51V、51A、52R、52L、53G或54V中的一個(gè)或多個(gè)。11.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的TCR，其包含SEQIDNO:ll-13所示a鏈可變區(qū)氨基酸序列之一，任選包含一個(gè)或多個(gè)表型沉默取代。12.如權(quán)利要求1-6或11中任一項(xiàng)所述的TCR，其包含SEQIDNO:14-15所示P鏈可變區(qū)氨基酸序列之一，任選包含一個(gè)或多個(gè)表型沉默取代。13.如權(quán)利要求2所述的TCR，其包含下表所示的a和P鏈可變區(qū)對(duì)，任選地包含一個(gè)或多個(gè)表型沉默取代<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>14.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其還包括SEQIDNO:19所示的a鏈恒定區(qū)氨基酸序列和/或SEQIDNO:20和21所示的e鏈氨基酸恒定區(qū)序列之一，任選地包含一個(gè)或多個(gè)表型沉默取代。15.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其為二聚T細(xì)胞受體(dTCR)或單鏈T細(xì)胞受體(scTCR)。16.如權(quán)利要求4-15中任一項(xiàng)所述的TCR，其為包含如下區(qū)段的scTCR:第一區(qū)段，其由對(duì)應(yīng)于TCRa鏈可變區(qū)的氨基酸序列構(gòu)成；第二區(qū)段，其由對(duì)應(yīng)于TCR(5鏈可變區(qū)序列并融合于對(duì)應(yīng)于TCR(3鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列N末端的氨基酸序列構(gòu)成；和接頭序列，該序列連接第一區(qū)段的C末端和第二區(qū)段的N末端。17.如權(quán)利要求4-15中任一項(xiàng)所述的TCR，其為包含如下區(qū)段的scTCR:第一區(qū)段，其由對(duì)應(yīng)于TCRe鏈可變區(qū)的氨基酸序列構(gòu)成；第二區(qū)段，其由對(duì)應(yīng)于TCRoc鏈可變區(qū)序列并融合于對(duì)應(yīng)于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列N末端的氨基酸序列構(gòu)成；和接頭序列，該序列連接第一區(qū)段的C末端和第二區(qū)段的N末端。18.如權(quán)利要求16或17所述的TCR，其還包含位于第一和第二鏈之間的二硫鍵，所述二硫鍵在天然a(3T細(xì)胞受體中沒(méi)有等價(jià)物，且其中所述接頭序列的長(zhǎng)度和所述二硫鍵的位置使得第一和第二區(qū)段的可變區(qū)序列相互取向基本上與天然a(3T細(xì)胞受體相同。19.如權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)所述的scTCR，其特征在于，在結(jié)合部分中，所示接頭序列連接第一區(qū)段的C末端和第二區(qū)段的N末端。20.如權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)所述的scTCR，其特征在于，在結(jié)合部分中，所述接頭序列具有結(jié)構(gòu)式-000-(80000)5--(SEQIDNO:17)或-PGGG-(SGGGG)6-P-(SEQIDNO:18)，其中P為脯氨酸，G為甘氨酸，S為絲氨酸。21.如權(quán)利要求l、2或4-15中任一項(xiàng)所述的TCR，其是包含如下區(qū)段的dTCR:第一多肽，其中對(duì)應(yīng)于TCRoc鏈可變區(qū)序列的序列融合于對(duì)應(yīng)于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端；和第二多肽，其中對(duì)應(yīng)于TCRP鏈可變區(qū)序列的序列融合于對(duì)應(yīng)于TCR(3鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端，所述第一和第二多肽通過(guò)二硫鍵連接，該二硫鍵在天然aPT細(xì)胞受體中沒(méi)有等價(jià)物。22.如權(quán)利要求21所述的TCR，其特征在于，所述二硫鍵連接所述恒定區(qū)序列的氨基酸殘基，該二硫鍵在天然TCR中沒(méi)有等價(jià)物。23.如權(quán)利要求22所述的TCR，其特征在于，所述二硫鍵位于半胱氨酸殘基之間，所述半胱氨酸對(duì)應(yīng)于天然TCR中P碳原子距離小于0.6nm的氨基酸殘基。24.如權(quán)利要求22所述的TCR，其特征在于，所述二硫鍵位于半胱氨酸殘基之間，所述半胱氨酸殘基取代TRAC*01外顯子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01或其非人等價(jià)物的外顯子1的Ser57。25.如權(quán)利要求15-24中任一項(xiàng)所述的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR結(jié)合部分包括二硫鍵，所述二硫鍵位于對(duì)應(yīng)于在天然TCR中由二硫鍵連接的那些殘基的殘基之間。26.如權(quán)利要求14-23中任一項(xiàng)所述的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR結(jié)合部分不含對(duì)應(yīng)于天然TCR跨膜或胞質(zhì)序列的序列。27.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其特征在于，所述TCR與至少一條聚亞垸基二醇鏈相連。28.如權(quán)利要求27所述的TCR，其特征在于，所述一條或多條聚亞烷基二醇鏈與TCR共價(jià)連接。29.如權(quán)利要求27或28所述的TCR，其特征在于，所述一條或多條聚亞垸基二醇鏈包含至少兩個(gè)聚乙二醇重復(fù)單元。30.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其還包括位于其a或(3鏈C末端或N末端的反應(yīng)活性半胱氨酸。31.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其與治療劑或可檢測(cè)部分連接。32.如權(quán)利要求31所述的TCR，其特征在于，所述TCR與所述治療劑或可檢測(cè)部分共價(jià)連接。33.如權(quán)利要求31所述的TCR，其特征在于，所述治療劑或可檢測(cè)部分與一條或兩條TCR鏈的C末端共價(jià)連接。34.如權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)所述的TCR，其與治療劑連接，所述治療劑為免疫效應(yīng)分子。35.如權(quán)利要求34所述的TCR，其特征在于，所述免疫效應(yīng)分子是細(xì)胞因子。36.如權(quán)利要求34所述的TCR，其特征在于，所述免疫效應(yīng)分子是IL-2或其功能性變體或片段。37.如權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)所述的TCR，其特征在于，所述治療劑是細(xì)胞毒劑。38.如權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)所述的TCR，其特征在于，所述治療劑是放射性核素。39.—種多價(jià)TCR復(fù)合物，其包含前述任一權(quán)利要求中所述的至少兩個(gè)TCR。40.—種多價(jià)TCR復(fù)合物，其包含通過(guò)非肽聚合物鏈或肽接頭序列連接的前述任一權(quán)利要求中所述的至少兩個(gè)TCR。41.如權(quán)利要求40所述的TCR復(fù)合物，其特征在于，所述聚合物鏈或肽接頭序列在各TCR的氨基酸殘基之間延伸，所述氨基酸殘基不位于TCR可變區(qū)序列中。42.如權(quán)利要求40或41所述的TCR復(fù)合物，其特征在于，所述TCR通過(guò)聚亞垸基二醇鏈或衍生自人多聚化結(jié)構(gòu)域的肽接頭連接。43.如權(quán)利要求42所述的TCR復(fù)合物，其特征在于，二價(jià)亞垸基間隔基團(tuán)位于所述聚亞烷基二醇鏈和其與所述復(fù)合物的TCR的連接點(diǎn)之間。44.如權(quán)利要求40或41所述的TCR復(fù)合物，其特征在于，所述聚亞垸基二醇鏈包括至少兩個(gè)聚乙二醇重復(fù)單元。45.—種多價(jià)TCR復(fù)合物，其包含如權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)所述的TCR中的至少兩個(gè)TCR，其中(i)所述TCR中的至少一個(gè)與權(quán)利要求31-38中任一項(xiàng)所述的治療劑連接。46.—種膜制劑，其包含權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述的TCR。47.—種包含表達(dá)載體的細(xì)胞，該表達(dá)載體包含權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述的TCR的編碼核酸。48.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-45中任一項(xiàng)所述的TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物、或權(quán)利要求46所述的膜制劑、或多個(gè)權(quán)利要求47中所述的細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體。49.一種治療AIDS的方法，所述方法包括給予罹患AIDS的對(duì)象有效量的權(quán)利要求1-45中任一項(xiàng)所述的TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物、或權(quán)利要求46所述的膜制劑、或多個(gè)遞呈權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)所述的TCR中的多個(gè)TCR的T細(xì)胞。50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，以與治療劑結(jié)合的形式給予TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物、或包含TCR的膜制劑。51.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，給予多個(gè)遞呈多個(gè)TCR的T細(xì)胞，且所述T細(xì)胞是CD8+T細(xì)胞。52.權(quán)利要求1-45中任一項(xiàng)所述的TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物、或權(quán)利要求46所述的膜制劑、或多個(gè)權(quán)利要求47中所述的細(xì)胞在制備治療AIDS的組合物中的用途。53.如權(quán)利要求52所述的用途，其特征在于，以與治療劑結(jié)合的方式給予TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物、或含有TCR的膜制劑。54.如權(quán)利要求52所述的用途，其特征在于，給予多個(gè)遞呈多個(gè)TCR的T細(xì)胞，且所述T細(xì)胞是CD8+T細(xì)胞。55.—種產(chǎn)生對(duì)SLYNTVATL-HLA-A*0201具有結(jié)合特性的高親和力TCR的方法，其特征在于，所述TCR(i)包含至少一個(gè)TCRa鏈可變區(qū)和/或至少一個(gè)TCR卩鏈可變區(qū)，和(ii)其對(duì)所述SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的KD小于l|iM和/或?qū)λ鯯LYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的解離速率(k。ff)小于1X10—3，所述方法包括(a)產(chǎn)生包含HIVGagTCR的a禾B|3鏈可變區(qū)的TCR，其中a禾Q卩鏈可變區(qū)中的一條或兩條在權(quán)利要求7和8中所限定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸中含有突變；(b)在適于使所述突變的TCR與SLYNTVATL-HLA-A*0201結(jié)合的條件下，使所述TCR與SLYNTVATL-HLA-A*0201接觸；禾口測(cè)定該相互作用的Kd和/或k。ff。全文摘要本發(fā)明提供了對(duì)SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的親和力(K_D)小于或等于1μM和/或解離速率(k_off)為1×10^-3S^-1或更慢的TCR，前提是當(dāng)所述TCR由細(xì)胞遞呈并包含SEQIDNO1和2時(shí)，所述細(xì)胞不是天然T細(xì)胞。此類TCR可單獨(dú)使用或與治療劑聯(lián)用，以靶向于遞呈該復(fù)合物的HIV感染細(xì)胞。文檔編號(hào)C07K14/725GK101155829SQ200680011470公開(kāi)日2008年4月2日申請(qǐng)日期2006年3月29日優(yōu)先權(quán)日2005年4月1日發(fā)明者B·K·雅各布森,P·E·莫洛伊,S·M·鄧恩,懿李申請(qǐng)人:阿維德克斯有限公司