專利名稱：：P-鈣黏著蛋白抗體的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及結合P-鈣黏著蛋白的抗體及其抗原結合部分。本發(fā)明還涉及編碼這類抗體和抗原結合部分的核酸分子、制造P-鈣黏著蛋白抗體和抗原結合部分的方法、包含這些抗體和抗原結合部分的組合物以及使用這些抗體、抗原結合部分和組合物的方法。
背景技術：
：鈣黏著蛋白是在發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)中調節(jié)細胞-細胞黏附的跨膜糖蛋白超家族(Gumbiner乂0〃.所o/"148:399-404(2000);Yagi,etal.，Ge"^Dev,，14:1169-1180(2000))。鈣黏著蛋白的細胞內(nèi)結構域與細胞質蛋白質(如鏈蛋白和pl20)相互作用，這形成了鈣黏著蛋白附著在肌動蛋白細胞骨架上的基礎。鈣黏著蛋白具有五個細胞外C^+結合結構域和一個在經(jīng)典鈣黏著蛋白中高度保守的小細胞質結構域。經(jīng)典的鈣黏著蛋白家族成員包括P-鈣黏著蛋白、E-鈣黏著蛋白和N-鈣黏著蛋白。細胞黏附分子(如鈣黏著蛋白)被認為在癌細胞和轉移細胞的細胞聯(lián)絡中起重要作用(Furukawa,etal.，Af/mMco"i仏rec/mi，e38(4):343-352(1997))。正常成人組織中P-鈣黏著蛋白低表達，并基本上限于肌上皮細胞和復層上皮的基底層(Shimoyama,etal.C匿erL49:2128-33(1989))。在炎性腸疾病如Crohn's疾病和結腸炎中P-鈣黏著蛋白被上調(Hardy,etal.,50:513-519(2002))。目前大量證據(jù)表明異常的P-鈣黏著蛋白表達與細胞增殖和結腸、胸、肺、甲狀腺和子宮頸腫瘤相關(Gamallo,A/o^r"尸W/w/ogy,14:650-654,(2001);和Stefansson,etal.,C//".Owco/.22(7):1242-1252(2004))。人P-鈣黏著蛋白被報導為是能被NCC-CAD-299單克隆抗體識別的抗原，所述抗體是針對外陰表皮樣癌產(chǎn)生的(Shimoyama,etal.，C""cerie乂，49:2128-2133(1989))。對P-鈣黏著蛋白介導的粘附和細胞內(nèi)信號轉導的調節(jié)預期能導致體內(nèi)腫瘤細胞的增殖和存活降低。因此，考慮到P-鈣黏著蛋白看起來具有控制細胞增殖和實體瘤發(fā)展的關鍵作用，產(chǎn)生針對P-鈣黏著蛋白的、能夠給多種癌癥患者提供治療益處的抗體是人們需要的。
發(fā)明內(nèi)容在一個方面，本發(fā)明是P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結合部分，其中抗體或其抗原結合部分具有下文A)到K)中所述的若干功能特征的至少一種。A)例如在一個實施方案中，抗體或其抗原結合部分具有與E-鈣黏著蛋白(Kd(E))相比対P-鈣黏著蛋白(kd(P))更大的結合親和力。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗原結合部分具有大于或等于1.5的KD(E)/KD(P)。在另一實施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結合部分具有大于或等于2、大于或等于3、大于或等于5、大于或等于10、大于或等于20、大于或等于50、大于或等于100、大于或等于200、大于或等于500或大于或等于1000的KD(E)/KD(P)。典型地，Kd(E)/Kd(P)値不存在上限，因為K"E)值可以非常小，例如是0。然而對于實踐目的而言，Kd(E)/Kd(P)的上限可以是1x106。對P-鈣黏著蛋白和E-鈣黏著蛋白而言，這類Ko值可通過本領域技術人員已知的任何技術測量，例如通過ELISA、RIA、流式細胞儀或表面等離振子共振，例如BIACORETm。B)在另一實施方案中，通過表面等離振子共振測量，抗體或其部分以1000nM或更小的Kd與P-鈣黏著蛋白結合。在另一實施方案中，通過表面等離振子共振測量，抗體或其部分以小于500nM、小于100nM、小于50nM、小于20nM、小于10nM、小于1nM、小于500pM或小于100pM的Kd與P-鈣黏著蛋白結合。典型地，不存在Ko值的下限。然而對于實踐目的而言，下限可假定為約1pM。C)在另一實施方案中，如通過表面等離振子共振所測量的，抗體或其部分對P-鈣黏著蛋白具有小于或等于0.01S—4勺清除率(k。ff)。例如，在某些實施方案中抗體或其部分對P-鈣黏著蛋白具有小于0.005s—\小于0.004s—1、小于0.003s—1、小于0.002"或小于0.001"的k。ff。典型地，不存在k。ff值的下限。然而對于實踐的目的而言，下限可假定為約1x10—7s—]。D)在另一實施方案中，如通過P-鈣黏著蛋白依賴性細胞粘附測定法所測量的，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分具有100nM或更小的IC,在另一實施方案中，如通過P-鈣黏著蛋白依賴性細胞粘附測定法所測定的，所述ICso小于50nM、小于40nM、小于20nM、小于10nM、小于1nM、小于500pM、小于200pM、小于100pM或小于10pM。典型地，如通過P-鈣黏著蛋白依賴性細胞粘附測定法所測定的，不存在ICm)値的下限。然而對于實踐的目的而言，下限可假定為約1pM。E)在另一實施方案中，如通過P-鈣黏著蛋白依賴性細胞聚集測定法所測量的，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分具有100nM或更小的ICso。在另一實施方案中，如通過P-鈣黏著蛋白依賴性細胞聚集測定法所測定的，所述ICso小于50nM、小于40nM、小于20nM、小于10nM、小于1nM、小于500pM、小于200pM、小于100pM或小于1pM。典型地，如通過P-鈣黏著蛋白依賴性細胞聚集測定法所測定的，不存在IQo值的下限。然而對于實踐的目的而言，下限可假定為約1pM。F)在另一實施方案中，在P-鈣黏著蛋白依賴性球狀體破壞測定法中，與不存在IgG的對照樣品相比，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分以至少2的因數(shù)提高球狀體破壞。在另一實施方案中，在P-鈣黏著蛋白依賴性球狀體破壞測定法中，與不存在IgG的對照樣品相比，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分以至少3、至少4、至少6、至少10或至少15的因數(shù)提高球狀體破壞。G)在另一實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分與選自194-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196-h02;194-eOl;196-dl0;196-g03;196層e06;195-a09;198-a09;200-h06;g-194-b09;g-194-g09;g-196-g03;g-196-h02;g-194-e01;g-194-e06;129-lc4;和g-129-lc4的抗體競爭結合P4丐黏著蛋白。H)在另一實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分與選自194-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196陽h02;194-eOl;196-dl0;196-g03;196-e06;195-a09;198-a09;200-h06;g-194-b09;g-194-g09;g-196-g03;g-196-h02;g-194-e01;g-194-e06129-lc4;和g-129-lc4的抗體交叉競爭結合P-鈣黏著蛋白。I)在另一實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分與選自194-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196-h02;194-eOl;196-dl0;196-g03;196-e06;195-a09;198-a09;200-h06;g-194-b09;g-194-g09;g-196-g03;g-1%-h02;g-194-e01;g-194-e06;129-lc4;和g-129-lc4的抗體結合P-鈣黏著蛋白的相同表位。J)在另一實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分與選自194-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196-h02;194-eOl;196-dlO;196-g03;196-e06;195-a09;198-a09;200-h06;g-194-b09;g-194-g09;g-196-g03;g-196陽h02;g-194-e01;g-194-e06;129-lc4;和g-129-lc4的抗體以基本上相同的KD結合P-鈣黏著蛋白。K)在另一實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分與選自194-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196陽h02;194-eOl;196-dlO;196-g03;196-e06;195-a09;198-a09;200-h06;g-194-b09;g-194-g09;g-196-g03;g-196-h02;g-194-e01;g-194-e06;129-lc4;andg-129-lc4的抗體以基本上相同的k。ff結合P-鈣黏著蛋白。本發(fā)明的另一方面是至少具有先前在A)到K)中描述的功能特征之一的抗體或其抗原結合部分，其包含氨基酸序列與SEQIDNOs:1到13和320到325之任一至少90%同一的VH結構域。在一個實施方案中，所述VH結構域氨基酸序列與SEQIDNOs:1到12和320到325之任一至少91%、至少93%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一。在另一實施方案中，抗體或其部分至少具有先前在A)到K)中描述的功能特征之一，其包含一個VH結構域，所述VH結構域是SEQIDNOs:1到13和320到325之任一，或因具有至少一個保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:1至U13和320到325之任一不同。例如，VH結構域因1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:1到13和320到325之任一不同。在另一實施方案中，任何這些保守的氨基酸取代可發(fā)生在CDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)。本發(fā)明的另一方面是至少具有先前在A)到K)中描述的功能特征之一的抗體或其抗原結合部分，其包含一個氨基酸序列與SEQIDNOs:14到23和326到331之任一至少90%同一的V^結構域。在一個實施方案中，所述V^結構域氨基酸序列與SEQIDNOs:14到23和326到331之任一至少91%、至少93%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一。在另一實施方案中，抗體或其部分至少具有先前A)到K)中所述的功能特征之一，并包含一個VL結構域，所述V^結構域是SEQIDNOs:14到23和326到331之任一，或因具有至少一個保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:14到23和326到331之任一不同。例如Vj吉構域因1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守的氨基酸取代而與SEQIDN0s:14到23和326到331之任一不同。在另一實施方案中，任何這些保守的氨基酸取代可發(fā)生在CDR1、CDR2禾口/或CDR3區(qū)。本發(fā)明的另一方面是至少具有先前A)到K)中所述功能特征之一的抗體或其抗原結合部分，其中Vl和VH結構域分別與下述抗體的Vl和Vh結構域氨基酸序列至少90%同一，所述抗體選自194-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196-h02;194-eOl;196-dl0;196-g03;196-e06;195-a09;198-a09;200-h06;g-194陽b09;g-194-g09;g-196-g03;g-196-h02;g-194-e01;g-194-e06;129-lc4;和g-129-lc4任一。例如，Vl和VH結構域分別與下述抗體的Vl和VH結構域氨基酸序列至少91%、93%、95%、97%、99%或100%同一，所述抗體選自194-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196-h02;194-eOl;196-dl0;196-g03;196-e06;195-a09;198-a09;200-h06;g-194-b09;g-194-g09;g陽196-g03;g-196-h02;g-194-e01;g-194-e06;129-lc4;和g-129-lc4任一。本發(fā)明的另一方面是選自以下的抗體或其抗原結合部分a)包含如SEQIDNO:1所公開的VH結構域和如SEQIDNO:14所公開的VL結構域的抗體或其部分；b)包含如SEQIDNO:2所公開的VH結構域和如SEQIDNO:14所公開的VL^結構域的抗體或其部分；c)包含如SEQIDNO:2所公開的VH結構域和如SEQIDNO:15所公開的Vt結構域的抗體或其部分；d)包含如SEQIDNO:3所公開的VH結構域和如SEQIDNO:16所公開的V^結構域的抗體或其部分；e)包含如SEQIDNO:4所公開的VH結構域和如SEQIDNO:17所公開的VL結構域的抗體或其部分；f)包含如SEQIDNO:4所公開的VH結構域和如SEQIDNO:23所公開的V卜結構域的抗體或其部分；g)包含如SEQIDNO:5所公開的VH結構域和如SEQIDNO:18所公開的VL結構域的抗體或其部分；h)包含如SEQIDNO:6所公開的VH結構域和如SEQIDNO:23所公開的VL結構域的抗體或其部分；i)包含如SEQIDNO:7所公開的VH結構域和如SEQIDNO:23所公開的Vl結構域的抗體或其部分；j)包含如SEQIDNO:8所公開的VH結構域和如SEQIDNO:23所公開的VL結構域的抗體或其部分；k)包含如SEQIDNO:9所公開的VH結構域和如SEQIDNO:23所公開的Vj吉構域的抗體或其部分；1)包含如SEQIDNO:10所公開的VH結構域和如SEQIDNO:19所公開的VL結構域的抗體或其部分；m)包含如SEQIDNO:11所公開的VH結構域和如SEQIDNO:20所公開的Vj吉構域的抗體或其部分；n)包含如SEQIDNO:12所公開的VH結構域和如SEQIDNO:21所公開的Vl結構域的抗體或其部分；o)包含如SEQIDNO:13所公開的VH結構域和如SEQIDNO:22所公開的VL結構域的抗體或其部分；p)包含如SEQIDNO:320所公開的VH結構域和如SEQIDNO:326所公開的V^結構域的抗體或其部分；q)包含如SEQIDNO:321所公開的VH結構域和如SEQIDNO:327所公開的Vt結構域的抗體或其部分；r)包含如SEQIDNO:322所公開的VH結構域和如SEQIDNO:328所公開的結構域的抗體或其部分；s)包含如SEQIDNO:323所公開的VH結構域和如SEQIDNO:329所公開的VL結構域的抗體或其部分；t)包含如SEQIDNO:324所公開的VH結構域和如SEQIDNO:330所公開的VL結構域的抗體或其部分；和u)包含如SEQIDNO:325所公開的VH結構域和如SEQIDNO:331所公開的VL結構域的抗體或其部分。在另一實施方案中，對如上文在組a)到u)中所述的任何抗體或其部分而言，Vh和/或Vt結構域可與本文所述的特定SEQIDNOs因至少一個保守的氨基酸取代而不同。例如Vh和/或V^結構域可與所述的SEQIDNO因1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守的氨基酸取代而不同。在另一實施方案中，這些保守的氨基酸取代中任一可發(fā)生在CDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)。在另一實施方案中，本發(fā)明提供具有至少一種先前在A)到K)中所述功能特征的抗體或其抗原結合部分，其包含一個VH結構域和一個VL結構域，所述VH結構域獨立地選自SEQIDNOs:1到13和320到325之任一，或是與SEQIDNOs:1到13和320到325之任一因至少一個保守的氨基酸取代而不同的序列；所述V^結構域獨立地選自SEQIDNOs:14到23和326到331之任一，或是與SEQIDNOs:14到23和326到331之任一因至少一個保守的氨基酸取代而不同的序列。例如，Vh和VL結構域可各自獨立地與SEQIDNOs:1到13、320到325、14到23和326到331之任一因l、2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守的氨基酸取代而不同。在另一實施方案中，本發(fā)明提供具有至少一種先前在A)到K)中所述功能特征的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或部分包含選自SEQIDNOs:26到37禾q91到256之任一的VHCDR3，或與SEQIDNOs:26到37和91到256之任一因至少一個保守的氨基酸取代而不同的序列。例如，VHCDR3可與SEQIDNOs:26到37和91到256之任一因1、2、3或4個保守的氨基酸取代而不同。在另一實施方案中，本發(fā)明提供具有至少一種先前在A)到K)中所述功能特征的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或部分包含選自SEQIDNOs:40到47和257至U319之任一的VLCDR3，或與SEQIDNOs:40到47和257到319之任一因至少一個保守的氨基酸取代而不同的序列。例如，VLCDR3可與SEQIDNOs:40到47和257至U319之任-一因1、2、3或4個保守的氨基酸取代而不同。在另一實施方案中，本發(fā)明提供抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或抗原結合部分包含如SEQIDNO:24中公幵的VhCDR1，或與SEQIDNO:24因至少一個保守的氨基酸取代而不同的序列；如SEQIDNO:25中所公開的VHCDR2，或與SEQIDNO:25因至少一個保守的氨基酸取代而不同的序列；和獨立地選自SEQIDNOs:26到37和91到256之任一的VHCDR3，或與SEQIDNOs:26到37禾卩91到256之任一因至少一個保守的氨基酸取代而不同的序列。例如上文提到的每個VHCDR1、CDR2和CDR3序列可獨立地與各自所述的SEQIDNOs因1、2、3、4或5個保守的氨基酸取代而不同。在另一實施方案中，本發(fā)明提供抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或抗原結合部分包含如SEQIDN0:38中公開的V^CDR1，或與SEQIDNO:38因至少一個保守的氨基酸取代而不同的序列；如SEQIDNO:39中所公開的VlCDR2，或與SEQIDNO:39因至少一個保守的氨基酸取代而不同的序列；和獨立地選自SEQIDNOs:40到47和257到319之任一的VLCDR3，或與SEQIDNOs:40到47和257到319之任一因至少一個保守的氨基酸取代而不同的序列。例如上文提到的每個VLCDR1、CDR2和CDR3序列可獨立地與各自所述的SEQIDNOs因1、2、3、4或5個保守的氨基酸取代而不同。本發(fā)明還提供了抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分包含如SEQIDNO:24中公開的VHCDRl;如SEQIDNO:25中所公開的VHCDR2;選自SEQIDNOs:26到37和91至U256之任一的VHCDR3;如SEQIDNO:38中公開的VLCDRl;如SEQIDNO:39中公開的VLCDR2;和選自SEQIDNOs:40到47禾q257到319之任一的VLCDR3。在另一實施方案中，所述每個Vh和VLCDR1、CDR2禾卩CDR3序列也可獨立地與上文所述特定的SEQIDNOs因至少一個保守的氨基酸取代而不同。例如每個CDR1、CDR2禾卩CDR3序列可獨立地與上文所述的特定SEQIDNOs因1、2、3、4或5個保守的氨基酸取代而不同。本發(fā)明還提供抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或抗原結合部分包含如存在于l94-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196-h02;194-e01;196-dlO;196-g03;196-e06;195-a09;198陽a09;200畫h06;g-194-b09;g-194-g09;g-196-g03;g-196隱h02;g隱194-e01;g-194-e06;129-lc4;禾卩gl29畫lc4的任何抗體中的VH和VLCDRl、VH和VLCDR2和VH和VLCDR3。本發(fā)明還提供抗體或其抗原結合部分，其包含選自SEQIDNOs:1到3和20到325之任一或與SEQIDNOs:1到3和20到325之任一因1到10個保守的氨基酸取代而不同的VH結構域。本發(fā)明還提供抗體或其抗原結合部分，其包含選自SEQIDNOs:14到23和326到331之任一或與SEQIDNOs:14到23和326到331之任一因1到IO個保守的氨基酸取代而不同的Vl枸域。本發(fā)明還提供抗體或其抗原結合部分，其包含一個vh結構域和一個Vj吉構域，所述vh結構域獨立地選自SEQIDNOs:1到13和320到325之任一，或是與SEQIDNOs:1到13和320到325之任一因1到10個保守的氨基酸取代而不同的序列；所述V^結構域獨立地選自SEQIDNOs:14到23和326到331之任一，或是與SEQIDNOs:14到23和326到331之任一因至1到IO個保守的氨基酸取代而不同的序列。本發(fā)明還提供抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或抗原結合部分包含如SEQIDNO:24中公幵的VhCDR1，或與SEQIDNO:24因1到4個保守的氨基酸取代而不同的序列；如SEQIDNO:25中所公開的VHCDR2，或與SEQIDNO:25因1到4個保守的氨基酸取代而不同的序列；和選自SEQIDNOs:26到37和91到256之任一的VHCDR3，或與SEQIDNOs:26到37和91到256之任一因1到4個保守的氨基酸取代而不同的序列。本發(fā)明還提供抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或抗原結合部分包含如SEQIDNO:38中公開的VLCDR1，或與SEQIDNO:38因1到4個保守的氨基酸取代而不同的序列；如SEQIDNO:39中所公開的VLCDR2，或與SEQIDNO:39因1到4個保守的氨基酸取代而不同的序列；和選自SEQIDNOs:40到47和257到319之任一的VLCDR3，或與SEQIDNOs:40到47和257到319之任一因1到4個保守的氨基酸取代而不同的序列。本發(fā)明還提供至少具有先前在A)到K)中描述的功能特征之一的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或抗原結合部分包含如SEQIDNO:48中公開的VHFR1;如SEQIDNO:49中公開的VHFR2;選自SEQIDNOs:50到55之任一的VHFR3;選自SEQIDNOs:56和57之任一的VHFR4;選自SEQIDNOs:58和59之任一的VlFR1;選自SEQIDNOs:60到62之任一的VLFR2;選自SEQIDNOs:63到66之任一的VlFR3;和如SEQIDNO:67中公開的FR4。在另一實施方案中，每個所述Vh和VLFR1、FR2、FR3和FR4序列也可獨立地與上述特定的SEQIDNOs因至少一個保守的氨基酸取代而不同。例如，每個所述FRKFR2、FR3和FR4序列可獨立地與上述各自特定的SEQIDNOs因1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守的氨基酸取代而不同。還在另一實施方案中，每個FR1、FR2、FR3禾卩FR4序列之任一可獨立地被突變以匹配各自的種系框架序歹ll(germlineframeworksequence)。本發(fā)明的另一實施方案是本文所述的任何抗體，其中所述抗體為IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子，或來自其中。例如，抗體可以是IgGi或lgG2。例如在一個實施方案中，IgG是IgGp其中重鏈恒定區(qū)包含SEQIDNO:344，其中輕鏈恒定區(qū)包含SEQIDNO:345，并且SEQIDNO:344的C-端任選地被切割。另一實施方案提供上述任何抗體或抗原結合部分，其為Fab片段、F(ab，)2片段、Fv片段、單鏈Fv片段、單鏈VH片段、單鏈Vl片段、人源化抗體、嵌合抗體或雙特異性抗體。另一實施方案是衍生的抗體或抗原結合部分，其包含本文所述任何抗體或其部分和至少一個額外的分子實體。例如，所述至少一個額外的分子實體可以是另一抗體(例如雙特異性抗體或雙抗體)、檢測劑、標簽、細胞毒素劑、藥劑和/或能夠介導抗體或抗體部分與另一分子(例如鏈霉親和素核心區(qū)或多組氨酸標簽)聯(lián)合的蛋白質或肽。例如，有用的檢測劑(使用它可衍生本發(fā)明的抗體或抗原結合部分)包括熒光化合物，包括螢光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、5-二甲胺-l-萘磺酸、藻紅蛋白、鑭系磷光體等?？贵w還可以用適用于檢測的酶標記，所述酶例如辣根過氧化物酶、/3-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶等。在另一實施方案中，本發(fā)明的抗體或其部分也可用生物素標記，或用被次級報告子識別的預先確定的多態(tài)表位(例如亮氨酸拉鏈對序列、次級抗體的結合位點、金屬結合結構域、表位標簽)來標記。還在本發(fā)明的另一實施方案中，任何抗體或其部分也可用化學基團來衍生，所述基團例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基，或碳水化合物基團。在一些實施方案中，本文公開的P-鈣黏著蛋白抗體或抗原結合部分附著在固體載體上。在一些實施方案中，任何本發(fā)明P-鈣黏著蛋白抗體的重鏈C-端賴氨酸被切割。在本發(fā)明的多個實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體的重鏈和輕鏈可任選地包括N-端信號序列。例如重鏈信號序列可以是SEQIDNO:346，輕鏈信號序列可以是SEQIDNO:347。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及本文所述任何抗體或其抗原結合部分，其中抗體或其抗原結合部分是人來源的。本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含上述任何抗體或其抗原結合部分和藥物可接受載體。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其包含編碼本文所述任何抗體或其抗原結合部分的核苷酸序列。一個具體的實施方案是分離的核酸分子，其包含如SEQIDNOs:68到90和332到343之任一所公開的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及包含本文所述的任何核酸分子的載體，其中所述載體任選地包含與所述核酸分子可操作連接的表達調控序列。另一實施方案提供宿主細胞，其包含本文所述任一載體，或包含本文所述任一核酸分子。本發(fā)明還提供分離的細胞系，其生產(chǎn)本文所述的任何抗體或抗原結合部分，或生產(chǎn)任何所述抗體或所述抗原結合部分的重鏈或輕鏈。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結合部分的方法，所述方法包含在合適條件下培養(yǎng)本文所述的任何宿主細胞或細胞系，并回收所述抗體或抗原結合部分。本發(fā)明還涉及包含本文所述任何核酸的非人轉基因動物或轉基因植物，其中所述非人轉基因動物或轉基因植物表達所述核酸。本發(fā)明還提供用于分離結合P-鈣黏著蛋白的抗體或其抗原結合部分的方法，所述方法包含從本文所述的非人轉基因動物或轉基因植物中分離所述抗體的步驟。本發(fā)明還提供用于在有需要的哺乳動物中治療異常細胞生長的方法，所述方法包含向所述哺乳動物施用本文所述的任何抗體或其抗原結合部分，或任何藥物組合物的步驟。本發(fā)明還提供使用結合P-鈣黏著蛋白的抗體或其抗原結合部分用于在有需要的哺乳動物中治療異常細胞生長的方法，所述方法包含在合適的條件下向所述哺乳動物施用有效數(shù)量的本文所述任何核酸分子的步驟，所述合適的條件允許所述核酸分子表達。在另一實施方案中，治療異常細胞生長的方法還包含施用一定用量的一種或多種選自抗腫瘤劑、抗血管生成劑、信號轉導抑制劑和抗增殖劑中的物質，所述用量一起能有效地治療所述異常細胞生長。在具體的實施方案中，所述異常細胞生長是癌性的。本發(fā)明還提供用于降低P-鈣黏著蛋白依賴性細胞聚集的方法，所述方法包含將細胞與本文所述任何抗體或其抗原結合部分或本文所述任何藥物組合物接觸。本發(fā)明的另一方面是抗體或其抗原結合部分，其包含利用人VH-3家族基因的重鏈可變區(qū)氨基酸序列。例如在一個實施方案中，人VH-3家族基因是Vh-3-23。本發(fā)明的另一方面提供本文所述的任何抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或抗原結合部分為人抗體。在另一方面，所述抗體或抗原結合部分是人重組抗體。本發(fā)明還提供用于生產(chǎn)p-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結合部分的方法，所述方法包含步驟在噬菌體上合成人抗體文庫、用P-鈣黏著蛋白或其抗原部分篩選所述文庫、分離與p-鈣黏著蛋白結合的噬菌體和從噬菌體獲得所述抗體。定義和一般技術除非本文另有定義，涉及本發(fā)明使用的科學和技術術語應當具有本領域常規(guī)技術人員所普遍理解的含義。另外，除非上下文另有要求，單數(shù)術語應當包括復數(shù)，復數(shù)術語應當包括單數(shù)。一般地，涉及本文所述的細胞和組織培養(yǎng)、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學和蛋白質與核酸化學和雜交而使用的術語或其技術是本領域所公知和普遍使用的。除非另有說明，本發(fā)明的方法和技術一般根據(jù)本領域公知的傳統(tǒng)方法進行，和如貫穿本說明書所列和所述的多種一般的和更特定的參考文獻所述來進行。參閱例如Sambrook,etal.MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded"ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2000);Ausubel，etal"ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002);HarlowandLaneUsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1998);禾口Coligan,etal.,ShortProtocolsinProteinScience,Wiley,John&Sons,Inc.(2003),其公開內(nèi)容通過引用并入本文。如本領域所所普遍完成的或如本文所述，酶反應和純化技術根據(jù)制造商的說明書進行。涉及本文所述分析化學、合成有機化學和醫(yī)學及制藥化學所使用的術語，或其實驗歩驟和技術是本領域所公知并普遍使用的。標準技術被用于化學合成，化學分析，藥物制備、配制、遞送和治療患者。已知基本的抗體結構單元包含四聚物。每個四聚物由兩個同樣的多態(tài)鏈對組成，每對具有一個"輕"鏈(約25kDa)和一個"重"鏈(約SOTOkDa)。每個鏈的氨基端部分包括約100到120或更多個氨基酸的可變區(qū)，其主要負責抗原識別。每個鏈的羧基端定義恒定區(qū)，所述恒定區(qū)主要負責效應子作用。人輕鏈被分類為K和入輕鏈。重鏈被分類為m、5、7、a或。并將抗體同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈中，可變區(qū)和恒定區(qū)通過約12或更多個氨基酸的"J"區(qū)而結合，重鏈還包括約3個或更多個氨基酸的"D"區(qū)。一般地參閱FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.，ed"2nded.RavenPress,N.Y.(1989))(就所有目的而言，以其整體通過引用并入本文)。每個重鏈/輕鏈對(Vh和Vl)形成抗體結合位點。因此，例如完整的IgG抗體具有兩個結合位點。除在雙功能或雙特異性抗體中之外，兩個結合位點是相同的。重鏈和輕鏈的可變區(qū)顯示相同的一般結構，所述結構為通過三個高度可變區(qū)結合的相對保守的框架區(qū)(FR)，也稱為互補性決定區(qū)或CDR。術語"可變的"是指下述情況抗體之中可變區(qū)的某些部分在序列上大為不同，并被用于每個具體的抗體與其具體的抗原的結合和特異性。然而，所述可變性并非均等地分布于抗體的整個可變結構域，而是集中在CDR中，所述CDR被更高度保守的FR隔開。來自每對兩條鏈的CDR通過FR排列，使得能夠與特定表位結合。從N-端到C-端，輕鏈和重鏈均包含F(xiàn)R1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3禾nFR4結構域。每個結構域的氨基酸分酉己是根據(jù)KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1987and1991))或Chothia&Lesk乂，Afo/.說o/"196:901-917(1987);Chothia,etal.,342:878-883(1989)的定義，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。除非另有說明，以下的術語應當理解為具有以下的含義除非另有特別說明，術語"P-鈣黏著蛋白"是指人P-鈣黏著蛋白，其是一種膜內(nèi)在蛋白和調節(jié)細胞-細胞粘附的跨膜糖蛋白的經(jīng)典鈣黏著蛋白家族成員。人P-鈣黏著蛋白的克隆和序列已被報導，例如Shimoyama,etal.，J.Ce〃說o/.109(4Pt1),1787-1794(1989)，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。術語P-鈣黏著蛋白旨在包括重組的人P-鈣黏著蛋白和P-鈣黏著蛋白的重組嵌合體形式，其可通過標準的重組表達方法制備或商業(yè)購得(R&DSystems861-PC-100)。除非另有特別說明，本文使用術語"E-鈣黏著蛋白"是指人E-鈣黏著蛋白，其是一種膜內(nèi)在蛋白和調節(jié)細胞-細胞粘附的跨膜糖蛋白的經(jīng)典鈣黏著蛋白家族成員。E-鈣黏著蛋白描述于例如Takeichi，5We"ce，251:1451-1455(1991)，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。術語E-鈣黏著蛋白旨在包括重組的人E-鈣黏著蛋白和E-鈣黏著蛋白的重組嵌合體形式，其可通過標準的重組表達方法制備或商業(yè)購得(R&DSystems861-EC-100)。術語"多肽"包括天然或人造的蛋白質、蛋白質片段和蛋白質序列的多肽類似物。多肽可以是單體的或多聚體的。術語"經(jīng)分離的蛋白質"、"經(jīng)分離的多肽"或"經(jīng)分離的抗體"是下述蛋白質、多肽或抗體，所述蛋白質、多肽或抗體由于其起源或衍生來源而(1)不帶有在其天然狀態(tài)下與之相隨的天然結合的成分，(2)不含有來自相同種類的其他蛋白質，(3)由來自不同種類的細胞表達，或(4)天然不存在。因此，經(jīng)化學合成的或在與下述多肽天然來源的細胞不同的細胞體系中合成的多肽應是從其天然結合的成分中"經(jīng)分離的"。也可以使用本領域公知的蛋白質純化技術通過分離使得蛋白質基本上不含天然結合的成分。經(jīng)分離的抗體實例包括已經(jīng)使用P-鈣黏著蛋白親和純化的P-鈣黏著蛋白抗體，和通過細胞系體外合成的P-鈣黏著蛋白抗體。當樣品的至少約60%到75%顯示為單一種類的多肽時，蛋白質或多肽是"基本上純凈的"、"基本上均相的"或"基本上經(jīng)純化的"。多肽或蛋白質可以是單體的或多聚體的?；旧霞儍舻亩嚯幕虻鞍踪|可典型地包含約50%、60%、70%、80%或90%w/w的蛋白質樣品，更經(jīng)常為約95%，優(yōu)選地可以大于99%的純凈。蛋白質純凈度可以通過大量本領域公知手段表明，如蛋白質樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳之后用本領域公知的染料將凝膠染色來顯影單一的多肽條帶。就某些目的而言，可通過使用HPLC或純化領域公知的其他手段提供更高的分辨率。術語本文使用術語"多肽片段"是指具有氨基端和/或羧基端刪除、但是剩余的氨基酸序列與天然存在序列中相應的位置相同的多肽。在一些實施方案中，片段為至少5、6、8或10個氨基酸長。在其他實施方案中，所述片段為至少14個、至少20個、至少50個或至少70、80、90、100、150或200個氨基酸長。本文使用術語"類似物"或"多肽類似物"是指包含下述片段的多肽，所述片段與一些參考氨基酸序列具有基本的同一性，并與參考氨基酸序列具有基本上相同的功能或活性。典型地，多肽類似物相對于參考序列包含保守的氨基酸取代(或插入或缺失)。類似物可以是至少20或25個氨基酸長，或可以是至少50、60、70、80、90、100、150或200個氨基酸長或更長，或經(jīng)常可以與全長多肽一樣長。本發(fā)明的一些實施方案包括與種系氨基酸序列相比帶有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個取代的多肽片段或多肽類似物抗體。抗體的片段或類似物或免疫球蛋白分子可以由本領域常規(guī)技術人員依照本說明書的教導容易地制備。在某些實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結合部分的氨基酸取代為(1)降低對蛋白酶解的敏感性，(2)降低對氧化的敏感性，(3)改變形成蛋白質絡合物的親合力，和(4)賦予或修飾這類類似物的其他物理化學特征或功能特征，但仍保留對P-鈣黏著蛋白的特異結合。類似物可包括對天然存在的肽序列的多種取代。例如，可以在天然存在的序列中(例如在形成分子間接觸的結構域之外的多肽部分中)制造單個或多個氨基酸取代(優(yōu)選地保守氨基酸取代)。氨基酸取代還可以在形成分子間接觸的結構域中制造，所述分子間接觸可以促進多肽活性。保守的氨基酸取代不應當顯著改變母體序列的結構性質；例如替換氨基酸不應改變母體序列中存在的組成免疫球蛋白結合結構域的反向平行的P-折疊，或破壞表征母體序列的其他類型二級結構。通常，甘氨酸或脯氨酸不應用于反向平行的P-折疊。本領域識別的多肽二級結構和三極結構的實例描述于Proteins,StructuresandMolecularPrinciples(Creighton,Ed"W.H.FreemanandCompany,NewYork(1984));IntroductiontoProteinStructure(C,BrandenandJ.Tooze,eds.，GarlandPublishing,NewYork,N.Y.(1991));和Thornton,etal.,A^wre,354:105(1991)，其通過引用并入本文。本文使用術語"抗體"與免疫球蛋白同義，應如本領域普遍已知地理解。具體地，術語抗體不受生產(chǎn)抗體的任何具體方法限制。例如術語抗體包括但不限于重組抗體、單克隆抗體和多克隆抗體。本文使用術語抗體的"抗原結合部分"(或簡單地"抗體部分")是指具有與抗原(例如P-鈣黏著蛋白)特異結合能力的一個或多個抗體片段。已顯示抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段完成。包括在術語抗體的"抗原結合部分"中的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、Cl和Ch1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含兩個Fab片段的二價片段，所述Fab片段在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接；(iii)由Vh和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由單臂抗體的VLandVH結構域組成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward,etal.,A^we,(1989)341:544-546)，其由VH結構域組成；和(vi)經(jīng)分離的互補性決定區(qū)(CDR)。另外，盡管Fv片段的兩個結構域V^和VH由獨立的基因編碼，但是它們可以使用重組方法通過合成的接頭連接，所述接頭允許它們作為單個蛋白質鏈產(chǎn)生，所述單鏈中V^和Vh區(qū)対形成単價分子(已知為單鏈Fv(scFv));參閱例如Birdetal.，Sc/ewce(1988)242:423-426禾口Huston,etal.,Prac.Wa〃.Jcad.Sc/.85:5879-5883(1988))。這類單鏈抗體也旨在被包括在術語抗體的"抗原結合部分"內(nèi)。其他形式的單鏈抗體如雙抗體也包括在內(nèi)。雙抗體是二價的、雙特異性的抗體，其中Vh和VL結構域在單個多肽鏈上表達，但是使用太短而不允許相同鏈上兩個結構域之間配對的接頭，從而強迫所述結構域與另一鏈的互補結構域配對并產(chǎn)生兩個抗原結合位點(參閱例如Holliger,etal"尸rac.vVa,/.t/&4，90:6444-6448(1993);Poljak，etal.5Vrw",'2:1121-1123(1994))。另外，抗體或其抗原結合部分可以是更大的免疫粘附分子的部分，其通過抗體或抗體部分與一個或多個其他蛋白質或肽的共價或非共價結合而形成。這類免疫粘附分子包括鏈霉親和素核心區(qū)制造四聚體scFv分子的用途(Kipriyanov,etal.,Jwft7oc^ej"awt/場&n'c/omo，6:93-101(1995))和半胱氨酸殘基、標記物肽和C-端多組氨酸標簽制造二價的和生物素化的scFv分子的用途(Kipriyanov,etal.,Mo/,/附"w"o/"31:1047-1058(1994))。其他實例包括來自抗體的一個或多個CDR被共價地或非共價地整合進分子中使其成為特異性結合目的抗原(如P-鈣黏著蛋白)的免疫粘合素。在這類實施方案中，CDR可以作為更大的多肽鏈的一部分被整合，可以與另一多肽鏈共價連接或可以非共價地整合?？贵w部分如Fab和F(ab')2片段可以使用傳統(tǒng)技術(分別為例如整個抗體的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化)從整個抗體中制備。另外，抗體、抗體部分和免疫粘附分子可使用如本文所述的標準重組DNA技術獲得。當關于本發(fā)明涉及"抗體"時，應當理解也可使用其抗原結合部分?？乖Y合部分與完整抗體競爭特異結合。一般地參閱FimdamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,2nded.RavenPress,N.Y.(1989))(以其整體通過引用并入，用于所有目的)?？乖Y合部分可通過重組DNA技術或通過完整抗體的酶切割或化學切割產(chǎn)生。在一些實施方案中，抗原結合部分包括Fab、Fab'、F(ab，)2,Fd、Fv、dAb和互補性決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙抗體和含有至少一個抗體部分的多肽，所述至少一個抗體部分足夠賦予所述多肽特異的抗原結合。在具有一個或多個結合位點的實施方案中，結合位點可以彼此相同或不同。本文使用術語"人抗體"是指其中可變結構域和恒定結構域的序列是人序列的任何抗體。該術語包括下述抗體，所述抗體帶有來自人基因的序列，但是已被改變以降低可能的免疫原性、提高親合力、消除可能引起不期望的折疊的半胱氨酸等。該術語還包括在非人細胞中重組產(chǎn)生的這類抗體，其可能賦予對人細胞非典型的糖基化。這些抗體可以以多種方式制備，如下所述。本文使用術語"嵌合抗體"是指下述抗體，所述抗體包含來自兩種或更多不同抗體(包括來自不同物種的抗體)的區(qū)域。例如，嵌合抗體的一個或多個CDR可以來自人P-鈣黏著蛋白抗體。在一個實例中，來自人抗體的CDR可以與來自非人抗體(如小鼠或大鼠)的CDR結合。在另一實例中，所有的CDR可來自人P-鈣黏著蛋白抗體。在另一實例中，來自多于一個人P-鈣黏著蛋白抗體的CDR可以組合在一個嵌合抗體中。例如，嵌合抗體可包含來自第一個人P-鈣黏著蛋白抗體輕鏈的CDR1、來自第二個人P-l丐黏著蛋白抗體輕鏈的CDR2和來自第三個人P-鈣黏著蛋白抗體輕鏈的CDR3，且重鏈的CDR可以來自一個或多個其他P-鈣黏著蛋白抗體。另外，框架區(qū)可來自一個P-鈣黏著蛋白抗體(一個或多個CDR來自其中)或來自一個或多個不同的人抗體。另外，術語"嵌合抗體"旨在包括任何上述組合，其中所述組合涉及人和非人抗體。本文使用術語"人源化抗體"是指非人來源的抗體，其中屬于非人物種抗體序列特征性的氨基酸殘基被替換為存在于人抗體相應位置的殘基。該"人源化"過程被認為降低所產(chǎn)生抗體在人中的免疫原性。應當知道非人來源的抗體可以使用本領域公知的技術被人源化。參閱例如Winter,etal.，/wmw"o/.7b&乂14:43-46(1993)。目的抗體可以通過重組DNA技術被加工為用相應的人序列取代CH1、CH2、CH3、鉸鏈結構域和/或框架結構域。參閱例如WO92/02190和U.S.專利Nos.5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,792、5,714,350禾口5,777,085。本文使用術語"人源化抗體"在其含義中包括嵌合的人抗體和CDR-嫁接的抗體。本發(fā)明的嵌合人抗體包括非人物種抗體的Vh和V^以及人抗體的Ch和CJ吉構域。本發(fā)明的CDR移植的抗體通過將人抗體Vh和Vl的CDR分別用非人動物抗體的Vh和Vd戈替而得到。本文使用術語"ELISA"是指酶聯(lián)免疫吸附測定法。該測定法為本領域技術人員公知。該測定法的實例可見于Vaughan,T丄，etal.，Wa,.^'ofcc/l,14:309-314(1996)以及本申請的實施例7。本文使用的術語"表面等離振子共振"是指例如使用BIACORE體系(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,SwedenandPiscataway,N丄)，通過檢測生物傳感器基質中蛋白質濃度改變允許分析實時生物特異性相互作用的光學現(xiàn)象。進一歩的描述參閱Jonssonetal.,J朋.5/o/.C//".,51:19-26(1993);Jonsson,etal"所ofec/m—es，11:620-627(1991);Jonsson，etal.,M/.TecogwY"8:125-131(1995);和Johnsson,etal"Jwa/.Sz'ocAem.,198:268-277(1991)。術語"KD"是指具體的抗體-抗原相互作用的親合力平衡常數(shù)。當KDSImM，優(yōu)選地S100nM和最優(yōu)選地^10nM時稱抗體與抗原特異結合。KD親合力常數(shù)可通過表面等離振子共振測量，例如使用實施例6中所述的BIACORE體系。術語"k。ff"是指具體的抗體-抗原相互作用的解離速率常數(shù)。k。ff解離速率常數(shù)可通過表面等離離子共振測量，例如使用實施例6中所述的BIACORE體系。本文使用術語"P-鈣黏著蛋白依賴性細胞粘附測定法"是指下述測定法，其用于測量P-鈣黏著蛋白抗體阻斷細胞與己固定在固體載體上的受體P-鈣黏著蛋白粘附的能力。該類型的測定法可通過例如將P-鈣黏著蛋白固定在固體載體(例如塑料)上來進行。然后允許過表達P-鈣黏著蛋白的細胞通過P-鈣黏著蛋白-P-鈣黏著蛋白相互作用粘附在固體載體上。可使用或不使用P-鈣黏著蛋白抗體來定量粘附水平。作為抗體濃度函數(shù)的粘附可隨后被用于測定ICso值。實施例3提供了用于測量P-鈣黏著蛋白抗體ICsJ直的P-鈣黏著蛋白依賴性的細胞粘附測定法的其他細節(jié)。本文使用術語"P-鈣黏著蛋白依賴性細胞聚集測定法"是指下述測定法，其用于測量P-鈣黏著蛋白抗體阻斷其表面上表達P4丐黏著蛋白的細胞聚集的能力。例如，這種類型的測定法可使用過表達P-鈣黏著蛋白的細胞系，其中所述細胞被置于懸浮液中，并允許其形成P-鈣黏著蛋白依賴性的聚集體。然后使用聚集測定法，通過測量使用和不使用抗體得到的細胞聚集體的尺寸來定量P-鈣黏著蛋白抗體阻止該聚集的能力。作為P-鈣黏著蛋白抗體濃度函數(shù)的細胞聚集體的尺寸可隨后被用于測定ICs。值。實施例4提供了用于測量若干P-鈣黏著蛋白抗體ICs。值的P-鈣黏著蛋白依賴性聚集測定法的其他細節(jié)。本文使用術語"p-鈣黏著蛋白依賴性球狀體破壞測定法"是指下述測定法，其用于測量p-鈣黏著蛋白抗體破壞預先形成的p-鈣黏著蛋白依賴性的細胞聚集體的能力。通過測量作為抗體濃度函數(shù)的聚集體尺寸減小，可測定ICs。值。實施例5提供了用于測量P-鈣黏著蛋白抗體IQ。值的P-鈣黏著蛋白依賴性球狀體破壞測定法的其他細節(jié)。本文使用術語"分子選擇性"是指抗體對特定抗原的親合力大于對相關抗原的親合力。例如，相對于E-鈣黏著蛋白，本發(fā)明的抗體是選擇P-鈣黏著蛋白的，即所述抗體對P-鈣黏著蛋白的親合力比對E-鈣黏著蛋白的親合力至少大2倍，例如4倍、或10倍、或50倍、或100倍或更多。這類親合力可使用本領域技術人員已知的標準技術來測量。術語"表位"包括能夠特異結合免疫球蛋白或T-細胞受體或以其他方式與分子相互作用的任何蛋白質決定簇。表位決定簇通常由分子的化學活性表面簇(例如氨基酸或碳水化合物或糖側鏈)組成，并通常具有特異的三維結構特性以及特異的電荷特性。表位可以是"線性的"或"構象的"。在線性表位中，蛋白質和相互作用的分子(例如抗體)之間所有的相互作用點沿著蛋白質的一級氨基酸序列線性地存在。在構象型表位中，相互作用點橫穿蛋白質上彼此分離的氨基酸殘基而存在。一旦抗原上的目的表位被確定，可能使用例如本發(fā)明所述的技術產(chǎn)生針對該表位的抗體?；蛘撸诎l(fā)現(xiàn)過程中，抗體的產(chǎn)生和表征可闡述關于目的表位的信息。根據(jù)該信息可能隨后競爭性地篩選抗體對相同表位的結合。達到該目的的一個途徑是構建交叉競爭研究以找出彼此競爭性結合的抗體，即所述抗體競爭結合抗原。以其交叉競爭為基礎的用于"binning"抗體的高通量方法描述于國際專利公開No.WO03/48731。本文關于抗體使用術語"競爭"是指第一種抗體或其抗原結合部分與第二種抗體或其抗原結合部分競爭結合，其中與不存在第二種抗體時第一種抗體的結合相比，當存在第二種抗體時第一種抗體與其相關表位的結合可檢測地降低。或者，情況可以是(但不必須是)第二種抗體與其表位的結合在存在第一種抗體時也可檢測地降低。即，第一種抗體能夠抑制第二種抗體與其表位的結合，而第二種抗體不能抑制第一種抗體與其各自表位的結合。然而，當每個抗體可檢測地抑制另一抗體與其表位或配體的結合時，無論程度相同、更大或更小，稱為抗體彼此"交叉競爭"地結合它們各自的表位。競爭和交叉競爭抗體均包括在本發(fā)明中。不考慮這類競爭或交叉競爭發(fā)生的機制(例如位阻、構象變化或與共同表位或其部分結合等)，熟練的技術人員應當知道，根據(jù)本文提供的教導，這類競爭和/或交叉競爭抗體包括在并適用于本文公開的方法中。本文關于具體的基因使用術語"利用"是指抗體中具體區(qū)域的氨基酸序列在B-細胞成熟時根本地來源于該基因。例如，短語"利用人VH-3家族基因的重鏈可變區(qū)氨基酸序列"是指下述取代B-細胞成熟時抗體的Vh區(qū)域來自VH-3家族的基因片段。在人B細胞中存在多于30種不同的功能性重鏈可變基因，這些基因被用于產(chǎn)生抗體。因此，就結合抗原和功能活性的組合特征而言，具體的重鏈可變基因的使用指示優(yōu)選的抗體-抗原相互作用的結合基序。應當知道，基因利用分析僅提供了有限的抗體結構概況。因為人B-細胞隨機地產(chǎn)生V-D-J重鏈或V-jk輕鏈轉錄物，所以存在大量次級過程，所述次級過程包括但不限于體細胞高度突變、n-添加和CDR3擴展。參閱例如Mendezetal.A^weGewe"cs15:146-156(1997)。本文依照常規(guī)用法使用二十個常規(guī)氨基酸及其縮寫。參閱Immunology-ASynthesis(2ndEdition,E.S.GolubandD.R.Gren,Eds"SinauerAssociates,Sunderland,Mass.(1991))，其通過引用并入本文。本文所涉及的術語"多核苷酸"是指至少10個堿基長度的多聚體形式核苷酸，其為核糖核苷酸或脫氧核苷酸或兩種類型核苷酸的經(jīng)修飾的形式。該術語包括單鏈和雙鏈形式。本文使用術語"經(jīng)分離的多核苷酸"是指基因組、cDNA或合成來源的多核苷酸或其一些組合，因為所述"經(jīng)分離的多核苷酸"的來源，其(1)不伴隨有所述"經(jīng)分離的多核苷酸"天然被發(fā)現(xiàn)時的所有或部分多核苷酸，(2)與多核苷酸可操作地連接，所述多核苷酸天然不與其連接，或(3)天然不作為更大序列的部分而存在。本文使用的術語"天然存在的核苷酸"包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文使用的術語"經(jīng)修飾的核苷酸"包括帶有經(jīng)修飾的或經(jīng)取代的糖基等的核苷酸。本文涉及的術語"寡核苷酸連接"包括例如硫代磷酸、二硫代磷酸、硒代磷酸、二硒代磷酸、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯月安石粦酸酉旨(phoshoraniladate)、石粦酉先j]安酸(phosphoroamidate)等的寡核苷酸鍵。參閱例如LaPlanche,etal.，M/c/.y4c/&Tes.，14:9081(1986);Stec，etal.,爿m.Oem.&c.，106:6077(1984);Stein,etal.，M/c/.Jc油ias"16:3209(1988);Zon,etal"^""-GawcerZ>wgZ)as7'gw,6:539(1991);Zon,etal.,OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach,pp.87-108(F.Eckstein,Ed.,OxfordUniversityPress,OxfordEngland(1991));U.S.專禾UNo.5,151,510;UhlmannandPeyman,C/em/ca/T^v纟em，90:543(1990)，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。需要時寡核苷酸可包括用于檢測的標簽。"可操作地連接的"序列包括與目的基因相鄰的表達調控序列和反向作用或在遠處作用以調控目的基因的表達調控序列。本文使用術語"表達調控序列"是指影響它們所連接的編碼序列表達和加工所必須的多核苷酸序列。表達調控序列包括適當?shù)霓D錄起始、終止、啟動子和增強子序列；有效的RNA加工信號，例如剪接和多腺苷酸化信號；穩(wěn)定細胞質mRNA的序列；增強翻譯效率的序列(例如Kozak共有序列)；增強蛋白質穩(wěn)定性的序列；和需要時增強蛋白質分泌的序列。這類調控序列的本質取決于宿主生物而不同；在原核生物中，這類調控序列通常包括啟動子、核糖體結合位點和轉錄終止序列；在真核生物中這類調控序列通常包括啟動子和轉錄終止序列。術語"調控序列"旨在至少包括其存在對于表達和加工是必需的的所有成分，并也可包括其存在是有利的的額外成分，例如前導序列和融合配偶體序列。本文使用術語"載體"是指能夠將轉移其所連接的另一核酸的核酸分子。在一些實施方案中，載體是質粒，即額外的DNA片段可連接在其中的環(huán)狀雙鏈DNA部分。在一些實施方案中，載體是病毒載體，其中額外的DNA片段可被連接進病毒基因組中。在一些實施方案中，載體能夠在其被引入的宿主細胞中自主復制(例如具有細菌復制起點的細菌載體和附加體哺乳動物載體)。在其他實施方案中，載體(例如非附加體哺乳動物載體)可以通過引入宿主細胞被整合進宿主細胞基因組中，從而與宿主基因組一起被復制。此外，某些載體能夠指導與它們可操作地連接的基因的表達。這類載體在本文中稱為"重組表達載體"(或簡單地"表達載體")。本文使用的術語"重組宿主細胞"(或簡單地"宿主細胞")是指重組表達載體已被引入其中的細胞。應當理解"重組宿主細胞"和"宿主細胞"不但指具體的受試者細胞(subjectcell)，也指該細胞的后代。因為某些修飾可由于突變或環(huán)境影響而在后繼的世代中發(fā)生，因此這類后代事實上可與母細胞不相同，但是其仍然包括在本文所使用的術語"宿主細胞"的范圍內(nèi)。本文使用術語"種系"是指抗體基因和基因片段的核苷酸序列，因為它們通過生殖細胞從親代傳遞給后代。該種系序列與編碼成熟B細胞中抗體的核苷酸不同，所述抗體在B細胞成熟的過程中己被重組和高突變事件改變。在核酸序列語境中的術語"序列同一性百分比"是指針對最大對應進行比對時，兩個序列中相同的殘基。序列同一性比較的長度可以在至少約九個核苷酸，通常至少約18個核苷酸，更通常至少約24個核苷酸，典型地至少約28個核苷酸，更典型地至少約32個核苷酸和優(yōu)選地至少約36、48或更多核苷酸的一段上。本領域存在可用于測量核苷酸序列同一性的大量不同的算法。例如，可使用FASTA、G叩或Bestfit(其為WisconsinPackageVersion10.0，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison,Wisconsin中的程序)比較多核苷酸序列。包括例如程序FASTA2禾PFASTA3的FASTA提供查詢序列和搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對和序列同一性百*、比(Pearson,7k^AoA五"z;;mo/.，183:63-98(1990);Pearson,^feAo^Afo/.脂.'132:185-219(2000);Pearson,她/力油266:227-258(1996);Pearson,J.M/.276:71-84(1998);通過引用并入本文)。除非另有說明，使用針對具體程序或算法的默認參數(shù)。例如，核酸序列間的序列同一性百分比可使用FASTA用其默認參數(shù)(字碼尺寸為6，NOPAM因子用于積分矩陣)測定，或使用Gap用GCGVersion6.1中提供的默認參數(shù)測定，通過引用并入本文。除非另有說明，提到核苷酸序列時包括其補體。因此，具有具體序列的核酸的含義應當被理解為包括其互補鏈及其互補序列。當涉及核酸或其片段時，術語"顯著相似性"或"顯著序列相似性"是指與另一核酸(或其互補鏈)就適當?shù)暮塑账岵迦牖騽h除進行最佳比對時，通過任何公知的序列同一性算法(例如如上所述的FASTA、BLAST或Gap)測量得到至少約85%，優(yōu)選地至少約90%，和更優(yōu)選地至少約95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸堿基中存在核苷酸序列同一性。在氨基酸語境中的術語"序列同一性百分比"是指針對最大對應進行比對時，兩個序列中相同的殘基。序列同一性比較的長度可以在至少約五個氨基酸，通常至少約20個氨基酸，更通常至少約30個氨基酸，典型地至少約50個氮基酸，更典型地至少約100個氨基酸和進一步更典型地約150、200或更多個氨基酸的一段上。存在大量不同的可用于測量氨基酸序列同一性的本領域已知算法。例如，可使用FASTA、Gap或Bestfit(其為WisconsinPackageVersion10.0,GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,Wisconsin中的程序)比較氨基酸序列。應用于多肽時，術語"顯著同一性"或"顯著相似性"是指例如通過程序GAP或BESTFIT使用程序提供的默認缺口權重進行最佳比對時，兩個氨基酸序列共享至少70%、75%或80%的序列同一性，優(yōu)選地至少90%或95%的序列同一性，更優(yōu)選地至少97%、98%或99%的序列同一性。在某些實施方案中，不同的殘基位置區(qū)別在于保守的氨基酸取代。本文使用"保守的氨基酸取代"是指下述氨基酸取代其中一個氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基所取代，所述另一個氨基酸殘基帶有有相似化學特征(例如電荷或疏水性)的側鏈R基團的。一般地，保守的氨基酸殘基不會顯著改變蛋白質的功能特征。當兩個或更多的氨基酸序列彼此因保守取代而不同時，可上調序列同一性百分比以糾正取代的的保守本質。進行該調節(jié)的手段為本領域技術人員所公知。參閱例如Pearson，Me^oAMo/.所o/.,243:307-31(1994)。具有有相似化學特征側鏈的氨基酸基團的實例包括1)脂肪族側鏈甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂肪族-羥基側鏈絲氨酸和蘇氨酸；3)含酰胺的側鏈天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族側鏈；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)堿性側鏈賴氨酸、精氨酸和組氨酸；6)酸性側鏈天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫的側鏈半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，保守的氨基酸取代基團可以是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺?；蛘?，保守的替換是在Gonnetetal，，5We"ce256:1443-45(1992)(通過引用并入本文)中公開的PAM250log-相似性矩陣中具有正值的任何改變。"適度保守的"替換是在PAM250log-相似性矩陣中具有非負值的任何改變。多肽的序列同一性典型地使用序列分析軟件來測量。蛋白質分析軟件使用對多種取代、缺失和其他修飾(包括保守的氨基酸取代)賦值的相似性手段來匹配序列。例如，GCG含有例如"Gap"和"Bestfit"的軟件，其可使用程序指明的默認參數(shù)來測定密切相關的多肽(例如來自不同種類生物的同源多肽)之間或野生型蛋白質和其類似物之間的序列同源性或序列同一性。參閱例如GCGVersion6.1(UniversityofWisconsin,WI)。多肽序列還可使用FASTA用默認的或推薦的參數(shù)進行比較，參閱GCGVersion6丄FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查詢和搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對和序列同一性百分比(Pearson,M&Ao心五"矽mo/.，183:63-98(1990);Pearson,MelodyMo/.肌o/"132:185-219(2000))。將本發(fā)明的序列與包含來自不同生物的大量序列的數(shù)據(jù)庫進行比較時，另一優(yōu)選地算法是計算機程序BLAST,特別是blastp或tblastn，使用隨程序提供的默認參數(shù)。參閱例如Altschul，etal.，編.5/。/"215:403-410(1990);Altschul,etal"M/c/e/cA;/^i^&，25:3389-402(1997)。一般地，進行同源性比較的多肽序列的長度應為至少約16個氨基酸殘基，通常至少約20個殘基，更通常至少約24個殘基，典型地至少約28個殘基和優(yōu)選地多于約35個殘基。當在包含來自不同生物的大量序列的數(shù)據(jù)庫中搜索時，優(yōu)選比較氨基酸序列。本文使用術語"標簽"或"經(jīng)標記的"是指抗體中整合了另一分子。在一個實施方案中，標簽是可檢測的標記，例如整合經(jīng)放射性標記的氨基酸，或生物素基部分附著在多肽上，所述生物素基部分可由經(jīng)標記的抗生物素蛋白(例如含有熒光標記物的鏈霉親和素，或可通過光學或比色法檢測的酶活性)檢測。在另一實施方案中，標簽或標記物可以是治療性的，例如藥物綴合物或毒素。標記多肽和糖蛋白的多種方法是本領域己知的并可被使用。用于多肽的標簽包括但不限于以下的放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、"Tc、mIn、125I、131I)、熒光標簽(例如FITC、羅丹明、鑭系磷光體)、酶標簽(例如辣根過氧化物酶、/3-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶)、化學發(fā)光標記物、生物素基、被次級報告子識別的、預先確定的多肽表位(例如亮氨酸拉鏈對序列、次級抗體的結合位點、金屬結合結構域、表位標簽)、磁性劑如軋螯合物、毒素如百日咳毒素、紫杉醇、細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁(emetine)、絲裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷(etoposide)、鬼臼噻吩武(tenoposide)、長春新堿(vincristine)、長春堿、秋水仙素、阿霉素、柔紅霉素、二羥炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)、鹽酸米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝霉素、放線菌素D、1-去氫睪甾酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素及其類似物或同系物。在一些實施方案中，標簽通過多種長度的間隔臂連接以降低可能的位阻。"治療有效量"是指所施用的治療劑的用量會在一定程度上減輕被治療的疾病的一種或多種癥狀。就癌癥治療而言，治療有效量是指具有至少一種以下效果的量減小腫瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上減緩，優(yōu)選地停止)腫瘤轉移；在一定程度上抑制(即在一定程度上減緩，優(yōu)選地停止)腫瘤生長和在一定程度上減輕(或優(yōu)選地消除)癌癥相關的--種或多禾中;/S4犬。"治療"是指減輕或消除生物學疾病和/或附帶的癥狀。就癌癥而言，這些術語簡單地表示受癌癥影響的個體的預期壽命會被延長，或疾病的一種或多種癥狀會被減輕。"接觸"是指以抗體能夠影響p-鈣黏著蛋白生物活性的方式，將本發(fā)明的抗體或其抗原結合部分和靶p-鈣黏著蛋白或其表位集合在一起。這類"接觸"可"體外"完成，即在試管、培養(yǎng)皿等中完成。在試管中，接觸可僅涉及抗體或其抗原結合部分和p-鈣黏著蛋白或其表位，或其可涉及整個細胞。細胞可維持或培養(yǎng)在細胞培養(yǎng)皿中，并在該環(huán)境中與抗體或其抗原結合部分接觸。在該語境中，可在用更復雜的活體體內(nèi)嘗試抗體的用途之前測定具體抗體或其抗原結合部分影響p-鈣黏著蛋白相關疾病的能力(即抗體的IC50)。對生物外的細胞而言，將p-鈣黏著蛋白與抗體或其抗原結合部分接觸的多種方法存在并是本領域技術人員公知的。除非另有說明，本文使用"異常細胞生長"是指不依賴于正常調節(jié)機制的細胞生長(例如缺失接觸抑制)，包括正常細胞的異常生長和異常細胞的生長。這包括但不限于以下的異常生長通過表達經(jīng)突變的酪氨酸激酶或過表達受體酪氨酸激酶而增殖的腫瘤細胞(腫瘤)；其他增殖性疾病的良性或惡性細胞，其中發(fā)生異常的酪氨酸激酶激活；通過受體酪氨酸激酶增殖的任何腫瘤；通過異常的絲氨酸/蘇氨酸激酶激活而增殖的任何腫瘤；其他增殖性疾病的良性和惡性細胞，其中發(fā)生異常的絲氨酸/蘇氨酸激酶激活；表達經(jīng)激活的Ras癌基因的良性和惡性腫瘤；良性或惡性的腫瘤細胞，其中Ras蛋白質作為另一基因中致癌突變的結果而被激活；其他增殖性疾病的良性或惡性細胞，其中發(fā)生異常的Ras激活。這類良性增殖疾病的實例是銀屑病、良性前列腺肥大、人乳頭狀瘤病毒(HPV)和restinosis。"異常細胞生長"還涉及并包括由法呢基蛋白轉移酶的酶活性導致的良性和惡性細胞的異常生長。術語"異常細胞生長"和"高增殖性疾病"在本申請中可交換使用。"體外"是指在人造環(huán)境中(例如但不限于試管或培養(yǎng)基中)進行的步驟。"體內(nèi)"是指在活體中(例如但不限于小鼠、大鼠或兔)中進行的歩驟。附圖概述圖1顯示SEQIDNOs:1-347的氨基酸和核酸序列。發(fā)明詳述人P-鈣黏著蛋白抗體本發(fā)明涉及與人P-鈣黏著蛋白結合的、經(jīng)分離的人抗體或其抗原結合部分。優(yōu)選地，人抗體是重組的人P-鈣黏著蛋白抗體，其對P-鈣黏著蛋白具有比對E-鈣黏著蛋白更大的親和力。本發(fā)明的多個方面涉及這類抗體和抗原結合部分及其藥物組合物，以及用于制造這類抗體和抗原結合部分的核酸、重組表達載體和宿主細胞。使用本發(fā)明抗體和抗原結合部分以體內(nèi)或體外地檢測人P-鈣黏著蛋白或抑制人P-鈣黏著蛋白活性的方法也包括在本發(fā)明中。已知來自若干物種(包括人)的P-鈣黏著蛋白氨基酸和核苷酸序列(參閱例如登錄號No.NM—001793.3)。人P-鈣黏著蛋白或其抗原部分可根據(jù)本領域技術人員公知的方法來制備，或可從商業(yè)賣主處購得(例如R&DSystems861-PC-100)。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體是如194-e06;194-a02;194-b09;195畫ell;194陽g09;196-h02;194-eOl;196-dlO;196-g03;196陽e06;195-a09;198-a09;200-h06;g-194-b09;g-194-g09;g-196-g03;g-196-h02;g-194-e01;g-194-e06;129-lc4;和g-129-lc4所指的.IgG。如實施例1中更詳細討論的，使用scFv噬菌體展示文庫的高通量f審選來鑒定129-lc4scFv，其隨后被轉化為IgG。129-lc4代表了初期噬菌體展示篩選中鑒定的前導抗體，并且是一個譜系的親本抗體，從其中派生出本發(fā)明的若干個其他抗體。若干個這類經(jīng)派生的抗體被指定為194-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196-h02;194-eOl;196-dlO;196-g03;196-e06;195-a09;198-a09;和200-h06，并代表了129-lc4親本譜系中經(jīng)最優(yōu)化的抗體。所述g-129-lc4抗體是129-lc4親本抗體的種系版，其中Vh和V^結構域的骨架區(qū)中某些氨基酸被突變以匹配種系骨架區(qū)中的氨基酸。上述任何抗體也可被種系化，使得骨架區(qū)序列與g-129-lc4中的種系骨架序列相同。例如在本發(fā)明的一個實施方案中，抗體g-194-b09、g-194-g09、g-196-g03、g-196-h02、g-194-e01、g-195-ell、g-200-h06和g-194-e06分別是194-b09、194-g09、196-g03、196-h02、194-e01、195-ell、200-h06和194-e06經(jīng)種系化的版本。被突變以達到經(jīng)種系化版本的特定氨基酸對本領域技術人員是顯而易見的，可通過將經(jīng)種系化的抗體與未種系化的抗體比較得到。如下所討論的，本發(fā)明抗體的特定氨基酸序列描述于表1-3和圖1中。強烈傾向于利用重鏈可變區(qū)的VH3基因家族生產(chǎn)本發(fā)明的抗體。具體地，129-lc4親本抗體衍生自Vh3-23可変基因片段。在人B細胞中，存在多于30種不同的功能性重鏈可變基因，其被用于生產(chǎn)抗體。然而就結合抗原和功能活性的組合特征而言，傾向預示著抗體-抗原相互作用的優(yōu)選的結合基序。應當知道，基因利用分析僅提供有限的抗體結構概況。因為人B-細胞隨機地產(chǎn)生V-D-J重鏈或V-jk輕鏈轉錄物，所以存在大量次級過程，所述次級過程包括但不限于體細胞高度突變、n-添加和CDR3擴展。參閱例如Mendezetal.7Va似"15:146-156(1997)和在2002年二月19日提交的U.S.公開專利申請2003-0070185。因此，為了進一步檢查本發(fā)明的抗體結構，從得自克隆的cDNA產(chǎn)生預知氨基酸序列的抗體。另外，N-端氨基酸序列通過蛋白質測序獲得。圖1提供若干個本發(fā)明抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列。如表1和2中所示，上述每個特定的抗體可通過它們重鏈(Vh)和輕鏈(Vl)的可變結構域序列來描述。這些SEQIDNOs.所涉及的特定序列顯示在圖1中。如表1和表2所示，上述抗體相應的Vh和VJ勺氨基酸和DNA序列由SEQIDNOs:1-23、68-90和320-343描述。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>本發(fā)明的額外抗體和抗原結合部分也可被描述為包含CDR和FR序列，所述CDR禾QFR序列構成表1和2中所示抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)。因此，對應于本發(fā)明抗體多種CDR禾卩FR序列的SEQIDNOs在表3中顯示。另外，也在129-lc4親本抗體的重鏈和輕鏈CDR3區(qū)中進行了大量隨機的突變，其產(chǎn)生經(jīng)改進的P-鈣黏著蛋白親和力，所述親和力通過表位競爭測定法測量改進10-到417-倍范圍內(nèi)(見實施例8)。這些經(jīng)突變的VH和CDR3序列的SEQIDNOs.(SEQIDNOs:91-256和257-319)也包括在以下表3中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>生產(chǎn)抗體的方法噬菌體展示文庫本發(fā)明的抗體或抗原結合部分可根據(jù)本領域已知的若干方法來制備。例如，可使用噬菌體展示技術提供含有一系列抗體的文庫，所述抗體具有不同的對p-鈣黏著蛋白的親和力。然后可篩選這些文庫以鑒定并分離對p-鈣黏著蛋白具有所需親和力的分離抗體。例如，本發(fā)明的重組人p-鈣黏著蛋白抗體可通過篩選重組的組合抗體文庫來分離。優(yōu)選地，所述文庫為使用人VL和VHcDNA生產(chǎn)的scFv噬菌體展示文庫，所述cDNA從分離自人B細胞的mRNA制備。用于制備和篩選這類文庫的方法為本領域已知。用于生產(chǎn)噬菌體真實文庫的試劑盒可商業(yè)購得(例如PharmaciaRecombinantPhageAntibodySystem,產(chǎn)品目錄號no.27-9400-01;和theStratageneSurfZAP噬菌體展示試劑盒，產(chǎn)品目錄號no.240612)。還存在其他方法和試劑可用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫(參閱例如U.S.專禾UNo.5,223,409;PCT公開Nos.WO92/18619、WO91/17271、WO92/20791、WO92/15679、WO93/01288、WO92/01047和WO92/09690;Fuchsetal.，說o/Tec/mo/ogy9:1370-1372(1991);Hay，etal.,ii/w/w.y4w幼od場^廠油mo51,3:81-85(1992);Huse,etal"5Wewce,246:1275-1281(1989);McCaffertyetal.，A^w",348:552-554(1990);Griffiths:etal.,EMSO人12:725-734(1993);Hawkins,etal.，Mo/.AW"226:889-896(1992);Clackson,etal.,淑騰352:624-628(1991);Gram,etal.,尸rac.腐.Jcac/.5W.t/&4，89:3576-3580(1992);Garrad,etal.,5w/rec/mo/ogy，9:1373-1377(1991);Hoogenboom，etal.,Wwc.y4c^ie&,19:4133-4137(1991);Barbas,etal.,尸rac.TVa".Jcadi7&4，88:7978-7982(1991);和Griffiths,etal.，^MSO/.,13:3245-3260(1994);其均通過引用并入本文)。用于制備用于噬菌體展示技術的抗體文庫的另一方法包含步驟用P-鈣黏著蛋白或其抗原部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人動物，以產(chǎn)生免疫應答，從被免疫的動物中抽提產(chǎn)生抗體的細胞；從經(jīng)抽提的細胞中分離編碼本發(fā)明抗體重鏈和輕鏈的RNA;反轉錄該RNA產(chǎn)生cDNA，使用引物擴增該cDNA并將該cDNA插入噬菌體展示載體中，使得抗體在噬菌體上被表達。為了生產(chǎn)這類系列，不必須將來自被免疫動物的B細胞無限增殖化。另外，原始B細胞可直接用作DNA的來源。得自B細胞(例如來自脾)的cDNA混合物被用于制備表達文庫，例如轉染進五."http://的噬菌體展示文庫。根本地，鑒定對抗原產(chǎn)生所需強度親和力的來自文庫的克隆，并將編碼負責這類結合的產(chǎn)物的DNA回收并處理用于標準重組表達。噬菌體展示文庫還可使用先前經(jīng)處理的核苷酸序列構建并以相似方式篩選。一般地，編碼重鏈和輕鏈的cDNA被獨立地提供或被連接以形成Fv類似物，用于在噬菌體文庫中生產(chǎn)。然后從噬菌體文庫中篩選對P-鈣黏著蛋白具有最高親和力的抗體，并從適當?shù)目寺≈谢厥者z傳材料。更多輪的篩選可提高所分離的原始抗體的親和力。在一個實施方案中，為了分離和生產(chǎn)具有所需特性的人P-鈣黏著蛋白抗體，本文所述的人P-鈣黏著蛋白抗體首先被用于使用PCT公開No.WO93/06213中所述的表位印記方法選擇對P-鈣黏著蛋白具有相似結合活性的人重鏈和輕鏈序列，所述資料通過引用并入本文。優(yōu)選地，該方法中使用的抗體文庫是如PCT公開No.WO92/01047，McCafferty，etal.,7Va^"，348:552-554(1990);和Griffiths,etal.，fMSO12:725-734(1993),所述制備并篩選的scFv文庫，所述資料均通過引用并入本文。所述scFv抗體文庫可使用人P-鈣黏著蛋白作為抗原來篩選。從噬菌體文庫中篩選對P-鈣黏著蛋白具有最高親和力的抗體，并從適當?shù)目寺≈谢厥者z傳材料。更多輪的篩選可提高所分離的原始抗體的親和力。一旦選擇了初始的人Vl和VH結構域，可然后進行"混合并匹配"實驗，其中篩選初始選擇的不同對V^和VH片段對P-鈣黏著蛋白的結合，以選擇優(yōu)選的Vl/Vh対組合。這些混合并匹配實驗也可在隨機突變V^和VH片段后進行，用于下文所述的最佳化結合。另外，為了進一步提高抗體品質，優(yōu)選的Vl/Vh対的Vl和Vh片段可以在下述方法中被隨機突変(優(yōu)選地在Vh和/或Vl的CDR3區(qū)中)，所述方法與天然免疫應答中負責抗體親和力成熟的體內(nèi)體細胞突變方法類似。該體外親和力成熟可以例如通過使用分別與VHCDR3或VlCDR3互補的PCR引物擴增Vh或Vl結枸域而完成，所述引物已用四種核苷酸堿基的隨機混合物在某些位置上被"穿刺(spiked)"，使得產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物編碼下述Vh和Vl片段，所述Vh和VL片段中隨機突變被引入Vh和/或CDR3區(qū)中?？稍谶@些隨機突變的Vh和Vl片段中再蹄逸対P-鈣黏著蛋白的結合，對P-鈣黏著蛋白顯示高親和力和低解離率(offrate)的序列可被選擇。如先前所述，SEQIDNOs:91-256和257-319指出被隨機突變并顯示經(jīng)改進的親和力的、本發(fā)明的若干Vh禾卩VlCDR3序歹j。從重組的免疫球蛋白展示文庫中篩選并分離本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白抗體之后，可從展示包(例如從噬菌體基因組中)中回收編碼所選擇抗體的核酸，并通過標準重組DNA技術亞克隆進其他表達載體中。需要時，核酸可被進一步加工以產(chǎn)生本發(fā)明的其他抗體形式，如下文所述。為了表達通過篩選組合文庫而分離的重組人抗體，將編碼所述抗體的DNA克隆進重組表達載體中并引入宿主細胞中，如下文所述。免疫在另一實施方案中，人P-鈣黏著蛋白抗體可以通過免疫非人的、轉基因的動物來產(chǎn)生，所述動物的基因組中包含帶有P-鈣黏著蛋白抗原的一些或所有的人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座。例如，非人動物可以是XENOMOUSETM動物。(Abgenix，Inc.,Fremont,CA)。XENOMOUSETM小鼠被操作為包含大片段人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座的、小鼠抗體生產(chǎn)不足的小鼠株系。參閱例如Green,etal.,Ato,e7:13-21(1994)和U.S.專利Nos.5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598、6,130,364、6,162,963禾卩6,150,584。還參閱WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735、WO98/16654、WO98/24893、WO98/50433、WO99/45031、WO99/53049、WO00/09560和WO00/037504。這些文件中公開的方法可如U.S.專利No.5,994,619中所述被修飾，其通過引用并入本文。U.S.專利No.5,994,619描述用于制造新培養(yǎng)的內(nèi)細胞團(CICM)細胞和細胞系(來自豬和牛)，以及其中被插入異源DNA的轉基因CICM細胞。CICM轉基因細胞可以用于制造克隆的轉基因胚、胎和后代。所述'619專利還描述了制造轉基因動物的方法，所述轉基因動物能夠將異源DNA傳遞給其后代?？捎糜谶@些方法的非人動物實例包括大鼠、綿羊、豬、山羊、牛、雞和馬。XENOMOUSETM小鼠生產(chǎn)成人樣人系列的全人抗體并產(chǎn)生抗原特異性的人抗體。在一些實施方案中，XENOMOUSETM小鼠通過引入經(jīng)測量的巨堿基(megabasesized)、人重鏈基因座的種系構型片段和酵母人工染色體(YAC)中k輕鏈基因座而含有約80%的人抗體V基因系列。在另一實施方案中，XENOMOUSETM小鼠還含有約所有人入輕鏈基因座。參閱Mendez,etal.,AtoweGewe/to'15:146-156(1997),GreenandJakobovits,五平她d，188:483-495(1998)和WO98/24893，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。在一些實施方案中，包含人免疫球蛋白基因的非人動物是具有人免疫球蛋白"小基因座(minilocus)"的動物。在小基因座途徑中，外源Ig基因座通過包括來自Ig基因座的個體基因而被模擬。因此，一個或多個VH基因、一個或多個Dh基因、一個或多個Jh基因、U恒定結構域和另一恒定結構域(優(yōu)選地，Y恒定結構域)形成一個構建體用于插入動物中。該途徑描述于U.S.專禾UNos.5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5，770,429、5,789,650、5,814,318、5,591,669、5,612,205、5,721,367、5,789,215和5,643,763中，通過引用并入本文。上述非人動物可隨后用如下所述的P-鈣黏著蛋白抗原在允許抗體產(chǎn)生的條件下被免疫。從動物中分離產(chǎn)生抗體的細胞，從經(jīng)分離的產(chǎn)生抗體的細胞中或從這類細胞所產(chǎn)生的無限增殖細胞系中分離編碼目的P-鈣黏著蛋白抗體的重鏈和輕鏈的核酸。這些核酸隨后使用本領域技術人員已知的和如下文進一步描述的技術被加工，以降低非人序列的量，即人源化所述抗體以降低在人中的免疫應答。在一些實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗原可被分離和/或是經(jīng)純化的P-鈣黏著蛋白。在一些實施方案中，P-鈣黏著蛋白是人P-鈣黏著蛋白。在其他實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗原可以是表達或過表達P-鈣黏著蛋白的細胞。在其他實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗原是由酵母、昆蟲細胞、細菌如Eco//或其他來源通過重組技術所表達的重組蛋白質。動物免疫可以通過本領i或己知的任何方法進行。參閱例如HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,NewYork:ColdSpringHarborPress(1990)。用于免疫非人動物如小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬、牛和馬的方法為本領域公知。參閱例如HarlowandLane,上文，和U.S.專利No.5,994,619。例如，P-鈣黏著蛋白抗原可以與佐劑一起被施用以刺激免疫應答。示范性的佐劑包括完全或不完全Freund，s佐劑、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激復合物)。這類佐劑可通過將多肽隔離在局部沉積物中而保護其免于快速分散，或它們可包含刺激宿主分泌下述因子的物質，所述因子對巨噬細胞和免疫系統(tǒng)中的其他成分是趨化性的(chemotactic)。優(yōu)選地，如果多肽被施用，則免疫程序表會涉及多肽的兩次或更多施用(遍布若干周中)。例如，如上所述用P-鈣黏著蛋白免疫轉基因動物后，可從經(jīng)免疫的轉基因動物中分離原始細胞(例如脾或外周血B細胞)，并可鑒定產(chǎn)生下述抗體的個體細胞，所述抗體對目的抗原特異。然后分離來自每個個體細胞的經(jīng)多腺苷酸化的mRNA，使用與可變區(qū)序列退火的有義引物(例如識別大部分或所有人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因FR1區(qū)的簡并引物，和與恒定區(qū)或連接區(qū)序列退火的反義引物)進行反轉錄多聚酶鏈式反應(RT-PCR)。然后克隆重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA并在任何合適的宿主細胞(例如骨髓瘤細胞)中表達為嵌合抗體，所述嵌合抗體帶有各自的免疫球蛋白恒定區(qū)，例如重鏈和/c或入恒定結構域。參閱Babcook，etal.,iVoc.2V^/.JcW.93:7843-48，(1996)，通過引用并入本文。然后可如本文所述鑒定并分離P-鈣黏著蛋白。生產(chǎn)抗體的重組方法
技術領域：
：本發(fā)明的抗體或抗體部分可以通過免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因在宿主細胞中的重組表達來制備。例如，為了重組地表達抗體，用帶有編碼抗體免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA片段的一個或多個重組表達載體來轉染宿主細胞，使得所述輕鏈和重鏈在宿主細胞中被表達，優(yōu)選地被分泌進入培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基中，從該培養(yǎng)基中可回收抗體。使用標準的重組DNA方法獲得抗體重鏈和輕鏈基因，將這些基因整合進重組表達載體并將所述載體引入宿主細胞，所述方法例如Sambrook,FritschandManiatis(eds):MolecularCloning;ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarbor,N.Y.,(1989),Ausubel,F.M.，etal.(eds.)CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates,(1989)和U.S.專利No.4,816,397中所述的方法，這些資料的公開內(nèi)容通過引用并入本文。突變和修飾為了表達本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白抗體，可使用如上所述的任何方法首先獲得編碼Vh和Vl區(qū)的DNA片段。也可使用本領域技術人員已知的標準方法向DNA序列中引入多種突變、缺失和/或添加。例如，可使用標準方法(例如PCR-介導的誘變)進行誘變，其中經(jīng)突變的核苷酸被整合進PCR引物中，使得PCR產(chǎn)物含有所需的突變或定點誘變。例如，可以制造的一種類型的取代是改變抗體中一個或多個半胱氨酸，所述半胱氨酸對另一殘基(例如但不限于丙氨酸或絲氨酸)可以是化學反應性的。例如，可以存在不規(guī)范半胱氨酸的取代。該取代可以在抗體的CDR中或可變結構域框架區(qū)中或恒定結構域中產(chǎn)生。在一些實施方案中，半胱氨酸是規(guī)范的。抗體也可以在重鏈和/或輕鏈可變結構域中發(fā)生突變，例如以改變抗體的結合特征。例如，突變可以在一個或多個CDR區(qū)中發(fā)生以提高或降低抗體對P-鈣黏著蛋白的KD、提高或降低k。ff或改變抗體的結合特異性。定點誘變技術為本領域公知。參閱例如Sambrook，etal.andAusubel,etal.，上文，其通過引用并入本文。例如，如在實施例8中更詳細描述的，根據(jù)上文所述步驟制造129-lc4親本的大量可變的Vh和CDR3序列，并在圖1中被顯示為SEQIDNOs:91到256(VHCDR3變體)和SEQIDNOs:257至U319(VlCDR3變體)。也可在框架區(qū)或恒定結構域中制造突變以提高P-鈣黏著蛋白抗體的半衰期。參閱例如PCT公開No.WO00/09560，通過引用并入本文?？蚣軈^(qū)或恒定結構域中的突變也可被制造以改變抗體的免疫原性、提供與另一分子共價或非共價結合的位點或改變?nèi)缪a體結合、FcR結合和抗體依賴性細胞介導的細胞毒性之類的特征。根據(jù)本發(fā)明，單個抗休可在任何一個或多個CDR或可變結構域框架區(qū)或恒定區(qū)中具有突變。在稱作"種系化"的方法中，Vh和V^序列中某些氨基酸可以被突變以匹配在種系Vh和Vl序列中天然存在的氣基酸。具體地，Vh和Vl序列中框架區(qū)的氨基酸序列可以被突變來匹配種系序列，以降低抗體被施用時的免疫原性風險。人Vh和V^基因的種系DNA序列為本領域己知(參閱例如the"Vbase"humangermlinesequencedatabase;還參閱Kabat，E.A.,etal.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242;Tomlinson,etal.(1992),Mo/,說o/.227:776-798;和Cox,etal.五跌J./mmw"o/,24:827-836(1994);每個資料的內(nèi)容通過引用明確并入本文)?？梢灾圃斓牧硪活愋偷陌被崛〈侨コ贵w中可能的蛋白水解位點。這類位點可存在于CDR中或可變結構域的框架區(qū)中或抗體的恒定結構域中。半胱氨酸殘基的取代和蛋白水解位點的去除可降低抗體產(chǎn)物中的異質性風險從而提高其同質性。另一類型的氨基酸取代是通過改變天冬酰胺-甘氨酸對的一個或兩個殘基將其消除，所述天冬酰胺-甘氨酸對形成可能的脫酰胺位點。在另一實例中，本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白抗體重鏈的C-端賴氨酸可以被切割。在本發(fā)明的多種實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體的重鏈和輕鏈可任選地包括N-端信號序列，如SEQIDNOs:346和347所指的序列。一旦獲得編碼本發(fā)明Vh和V^片段的DNA片段，這些DNA片段可通過標準重組DNA技術被進一步地處理，以例如將可變區(qū)基因轉化為全長抗體鏈基因、轉化為Fab片段基因或轉化為scFv基因。在這些處理中，Vl-或V『編碼DNA片段被可操作地與編碼另一蛋白質的另一DNA片段連接，所述另一蛋白質為例如抗體恒定區(qū)或柔性接頭(flexiblelinker)。該語境中使用術語"可操作地連接"旨在表示兩個DNA片段被連接，使得由兩個DNA片段編碼的氨基酸序列保持在讀碼框內(nèi)(in-frame)。經(jīng)分離的編碼Vh區(qū)的DNA可通過將V『編碼DNA與編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子可操作地連接而被轉化為全長重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列為本領域已知(參閱例如Kabat，E.A.，etal.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEd"U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)，包含這些區(qū)的DNA片段可通過標準的PCR擴增獲得。重鏈恒定區(qū)可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但是最優(yōu)選地是IgGl或IgG2恒定區(qū)。IgGl恒定區(qū)序列可以是任何已知在不同個體間存在的等位基因或同種異型，例如Gm(l)、Gm(2)、Gm(3)和Gm(17)。這些同種異型代表了IgGl恒定區(qū)中天然存在的氨基酸取代。例如，重鏈IgGl恒定區(qū)可以是SEQIDNO:344。就Fab片段重鏈基因而言，V『編碼DNA可以與僅編碼重鏈CHI恒定區(qū)的另一DNA分子可操作地連接。CHI重鏈恒定區(qū)可以來自任何重鏈基因。經(jīng)分離的編碼Vl區(qū)的DNA可以通過將VL-編碼DNA與編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另一DNA分子可操作地連接而被轉化為全長輕鏈基因(例如Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列為本領域已知(參閱例如Kabat,E.A.，etal.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEd"U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)，包含這些區(qū)的DNA片段可通過標準PCR擴增獲得。輕鏈恒定區(qū)可以是k或A恒定區(qū)。k恒定區(qū)可以是任何已知發(fā)生在不同個體間的多種等位基因，例如Inv(l)、Inv(2)和Inv(3)。入恒定區(qū)可以來自三個人基因之任一。例如，輕鏈IgGl恒定區(qū)可以是SEQIDNO:347。為了產(chǎn)生scFv基因，將Vh-和Vl-編礙DNA片段與編碼柔性接頭(例如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一片段可操作地連接，使得Vh和VL序列可以被表達為緊鄰的單鏈蛋白質，其中Vh和VL區(qū)通過柔性接頭相連(參閱例如Birdetal.5We"ce242:423-426(1988);Hustonetal.尸rac.A^/.爿cad.園85:5879-5883(1988);McCafferty,etal"淑mm，348:552-554(1990))。單鏈抗體可以是單價的(如果僅使用單個Vh和Vl)、雙價的(如果使用兩個Vh和Vl)或多價的(如果使用多于兩個Vh和Vl)。可產(chǎn)生與P-鈣黏著蛋白和另一分子特異結合的雙特異性抗體或多價抗休。在另一實施方案中，可以制造融合抗體或免疫粘附素，其包含與另一多肽連接的本發(fā)明P-鈣黏著蛋白抗體的全部或部分。在另一實施方案中，僅P-鈣黏著蛋白抗體的可變區(qū)與多肽連接。在另一實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體的VH結構域與第一個多肽連接，而P-鈣黏著蛋白抗體的VL結構域與第二個多肽連接，所述第二個多肽以下述方式與第一個多肽相連VH和V^結構域能夠彼此相互作用，形成抗原結合位點。在另一優(yōu)選的實施方案中，Vh結枸域與VL結構域通過接頭分離，使得Vh和VJ吉構域可以彼此相互作用。然后將VH-接頭-V^抗體與目的多肽連接。另外可產(chǎn)生融合蛋白質，其中兩個(或更多)單鏈抗體被彼此連接。這適用于想要在單一多肽鏈上產(chǎn)生二價或多價抗體，或想要產(chǎn)生雙特異性抗體時。在其他實施方案中，可使用編碼P-鈣黏著蛋白抗體的核酸分子制備其他的經(jīng)修飾的抗體。例如可使用標準分子生物學技術依照本說明書的教導制各"k抗體(Kappabodies)"(111,etal"尸驗/"10:949-57(1997)),"小抗體(Minibodies)"(Martin,etal"五細O13:5303-9(1994))，"雙抗體，，(Holliger,etal"尸rac.淑/.Jed>SW.園'90:6444-6448(1993))或"Janusins，，(Traunecker,etal.，EMSO,,10:3655-3659(1991)禾卩Tra薦cker,etal"乂(Suppl.)7:51-52(1992))。可通過大量方法(包括融合雜交瘤或連接Fab'片段)生產(chǎn)雙特異性抗體或抗原結合片段。參閱例如Songsivilai&Lachmann，五xp./m肌廳o/.，79:315-321(1990),Kostelny,etal.,/mm歸/"148:1547-1553(1992)。另外，雙特異性抗體可以形成為"雙抗體"或"Janusins"。在一些實施方案中，雙特異性抗體與P-鈣黏著蛋白兩個不同的表位結合。在一些實施方案中，使用來自本文提供的人P-鈣黏著蛋白抗體的一個或多個可變結構域或CDR區(qū)制備如上所述的經(jīng)修飾的抗體。載體和宿主細胞為了表達本發(fā)明的抗體和抗原結合部分，將如上所述獲得的、編碼部分或全長的輕鏈和重鏈的DNA插入表達載體中，使得基因與轉錄和翻譯調控序列可操作地連接。在該語境中，術語"可操作地連接"旨在表示抗體基因被連接進載體，使得載體內(nèi)的轉錄和翻譯調控序列提供它們預期的調節(jié)抗體基因轉錄和翻譯的功能。選擇與所使用的表達宿主細胞相容的表達載體和表達調控序列。表達載體包括質粒，反轉錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒(AAV)，植物病毒如花椰菜花葉病毒、煙草花葉病毒，粘粒，YAC，EBV衍生的附加體等?？贵w基因被連接進載體，使得載體內(nèi)的轉錄和翻譯調控序列提供它們預期的調節(jié)抗體基因轉錄和翻譯的功能。選擇與所使用的表達宿主細胞相容的表達載體和表達調控序列?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因可以被插入分離的載體中。在優(yōu)選的實施方案中，兩個基因被插入同一表達載體中?？贵w基因通過標準方法(例如連接抗體基因片段和載體上互補的限制性位點，或不存在限制性位點時連接平末端)被插入表達載體中。便利的載體是下述載體，其編碼功能完整的人Ch或Cl免疫球蛋白序列，帶有被設計的適當?shù)南拗菩晕稽c，使得任何Vh或Vl序列可以被容易地插入和表達，如上所述。在這類載體中，剪接通常發(fā)生在被插入的J區(qū)中剪接供體位點和人C結構域之前的剪接受體位點之間，還發(fā)生在存在于人CH外顯子中的剪接區(qū)中。多腺苷酸化和轉錄終止存在于編碼區(qū)下游的天然染色體位點中。重組表達載體還可編碼信號肽，所述信號肽有助于抗體鏈從宿主細胞中分泌?？贵w鏈基因可以被克隆進載體中，使得信號肽與免疫球蛋白鏈氨基端按照讀碼框連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即來自非免疫球蛋白蛋白質的信號肽)。除抗體鏈基因外，本發(fā)明的重組表達載體帶有調控抗體鏈基因在宿主細胞中表達的調節(jié)序列。本領域技術人員應當知道表達載體的設計，包括調節(jié)序列的選擇可取決于下述因子用于被轉化的宿主細胞的選擇、所需的蛋白質表達水平等等。用于哺乳動物宿主細胞表達的優(yōu)選的調節(jié)序列包括指導哺乳動物細胞中蛋白質高水平表達的病毒元件，例如來自逆轉錄病毒LTR的啟動子和/或增強子、來自巨細胞病毒(CMV)的啟動子和/或增強子(例如CMV啟動子/增強子)、來自猿猴病毒40(SV40)的啟動子禾口/或增強子(例如SV40啟動子/增強子)、來自腺病毒的啟動子和/或增強子(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))、多瘤啟動子和強哺乳動物啟動子如天然免疫球蛋白啟動子和肌動蛋白啟動子。病毒調節(jié)元件的進一步描述及其序列參閱例如U.S,專利No.5，168，062、U.S.專利No.4,510,245和U.S.專利No.4,968,615。用于在植物中表達抗體的方法(包括啟動子和載體的描述)以及植物轉化的方法為本領域已知。參閱例如U.S.專利No.6,517,529，通過引用并入本文。在細菌細胞或真菌細胞(例如酵母細胞)中表達多肽的方法也是本領域公知的。除抗體鏈基因和調節(jié)序列外，本發(fā)明的重組表達載體可帶有額外的序列，例如調節(jié)載體在宿主細胞中復制的序列(如復制起點)和可選擇的標記基因?？蛇x擇的標記基因有助于選擇其中已被引入載體的宿主細胞(參閱例如U.S.專利Nos.4，399，216、4,634,665和5,179,017，通過引用并入本文)。例如典型地，可選擇的標記基因給其中己被引入載體的宿主細胞賦予了對藥物(如G418、潮霉素或甲氨喋呤)的抗性。優(yōu)選的可選擇的標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于用甲氨喋呤選擇/擴增的dhfr-宿主細胞)、新霉素磷酸轉移酶基因(用于G418選擇)和谷氨酸合成酶基因。編碼P-鈣黏著蛋白抗體的核酸分子和包含這些核酸分子的載體可以用于轉染合適的哺乳動物、植物、細菌或酵母宿主細胞。轉化可以通過用于將多核苷酸引入宿主細胞的任何己知方法進行。用于將異源多核苷酸引入哺乳動物細胞的方法為本領域公知，其包括葡聚糖介導的轉染、磷酸f丐沉淀、polybrene(1,5-二甲基-l,5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物)介導的轉染、原生質體融合、電穿孔、脂質體包裹多核苷酸和將DNA直接顯微注射進細胞核中。另外，可通過病毒載體將核酸分子引入哺乳動物細胞中。轉化細胞的方法為本領域公知。參閱例如U.S.專利Nos.4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455，通過引用并入本文。轉化植物細胞的方法為本領域公知，包括例如土壤桿菌(Agrobacterium)介導的轉化、生物射彈轉化(biolistictransformation)、直接注射、電穿孔和病毒轉化。轉化細菌和酵母細胞的方法也是本領域公知的?？色@得的作為宿主用于表達的哺乳動物細胞系是本領域公知的，其包括可得自AmericanTypeCultureCollection(ATCC).的許多無限增殖細胞系。這些包括例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO細胞、SP2細胞、HEK-293T細胞、NIH-3T3細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、非洲綠猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如H印G2)、A549細胞和大量其他細胞系。具體優(yōu)選的細胞系通過確定具有高表達水平的細胞系來選擇?？墒褂玫钠渌毎凳抢ハx細胞系，如Sf9或Sf21細胞。當編碼抗體基因的重組表達載體被引入哺乳動物宿主細胞中時，通過將宿主細胞培養(yǎng)下述時間段來生產(chǎn)抗體，所述時間段足夠允許抗體在宿主細胞中表達，或更優(yōu)選地，允許抗體被分泌進培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基中?？墒褂脴藴实牡鞍踪|純化方法從培養(yǎng)基中回收抗體。植物宿主細胞包括例如煙草、擬南芥、浮萍、玉米、小麥、馬鈴薯等等。細菌宿主細胞包括五.o//和&Mptom;;c"禾中。酵母宿主細胞包括5"c/n'zosacc/mra附j^cespo附6e、Sacc/zaram少ces1cerev^/ae禾口朽c/n.a戸加"^。另外，生產(chǎn)細胞系對本發(fā)明抗體的表達可使用大量已知技術來增強。例如，谷氨酰胺合成酶(GS體系)和DHFR基因表達體系是用于在某些條件下增強表達的普遍途徑。高表達細胞克隆可以使用常規(guī)技術(例如有限稀釋克隆法和微滴技術)來鑒定。GS體系描述于歐洲專利Nos.0216846、0256055、0323997和0338841。很可能由不同細胞系或轉基因動物表達的抗體會具有彼此不同的糖基化作用。然而，由本文提供的核酸分子編碼的所有抗體，或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗體都屬于本發(fā)明，無論抗體是否糖基化。轉基因動物和植物本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白抗體也可通過產(chǎn)生下述哺乳動物或植物而轉基因地生產(chǎn)，所述哺乳動物或植物被轉入目的免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列的基因并生產(chǎn)可回收形式的抗體。就哺乳動物中的轉基因生產(chǎn)而言，P-鈣黏著蛋白抗體可以在山羊、牛或其他哺乳動物的乳中產(chǎn)生，并從其中回收。參閱例如U.S.專利Nos.5,827，6卯、5，756，687、5,750,172禾n5,741,957，通過引用并入本文。在一些實施方案中，包含人免疫球蛋白基因座的非人轉基因動物使用P-鈣黏著蛋白或其免疫原性部分被免疫，如上所述。用于在植物中制造抗體的方法描述于例如U.S.專利6,046,037和5,959,177中，通過引用并入本文。在一些實施方案中，非人轉基因動物或植物通過將一個或多個本發(fā)明的核酸分子(其編碼P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結合部分)通過標準的轉基因技術引入動物或植物中來生產(chǎn)。參閱Hogan和UnitedStates專利6,417,429，如上文。用于制造轉基因動物的轉基因細胞可以是胚胎干細胞或體細胞或受精卵。轉基因非人生物可以是嵌合體的、非嵌合體的雜合子禾口非嵌合體的纟屯合子。參閱例如Hoganetal.,ManimilatingtheMouseEmbryo:ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborPress(1999);Jackson,etal"MouseGeneticsandTransgenics:APracticalApproach,OxfordUniversityPress(2000);禾口Pinkert,TransgenicAnimalTechnology:ALaboratoryHandbook,AcademicPress(1999)，其均通過引用并入本文。在一些實施方案中，轉基因非人動物具有靶向構建體的定向破壞和替換，所述靶向構建體編碼目的重鏈和/或輕鏈。P-鈣黏著蛋白可在任何轉基因動物中產(chǎn)生。在優(yōu)選的實施方案中，非人動物是小鼠、大鼠、綿羊、豬、山羊、?；蝰R。非人轉基因動物在血、乳、尿、唾液、淚水、粘液和其他體液中表達所述被編碼的多肽。種類轉換P-鈣黏著蛋白的種類(例如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD)和亞類(IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)可以通過本領域已知的任何方法確定。一般地，抗體的種類和亞類可以使用對具體的抗體種類和亞類特異的抗體來確定。這類抗體是可商業(yè)購得的。可通過ELISA或Western印跡以及其他技術確定種類和亞類?；蛘撸扇缦麓_定種類和亞類通過測序抗體重鏈和/或輕鏈的全部或部分恒定區(qū)，將它們的氨基酸序列與多種免疫球蛋白種類和亞類的己知氨基酸序列比較，并確定抗體的種類和亞類。本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白抗體可以是IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。例如，P-鈣黏著蛋白抗體可以是IgG，所述IgG是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞類。在一個實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體可具有SEQIDNO:344所示的重鏈恒定區(qū)和SEQIDNO:345所示的輕鏈恒定區(qū)。本發(fā)明的一方面提供用于將P-鈣黏著蛋白抗體的種類或亞類轉化為另--種類或亞類的方法。在一些實施方案中，使用本領域公知的方法分離編碼vl或vh的核酸分子，其不包括編碼C^或Ch的序列。然后將所述核酸分子與來自目的免疫球蛋白種類或亞類的、編碼Cl或Ch的核酸序列可操作地連接。這可使用載體或包含0_或CH鏈的核酸分子完成，如上所述。例如，最初是IgM的P-鈣黏著蛋白抗體可以被種類轉換為IgG。另外，可使用種類轉換將一個IgG亞類轉換為另一個，例如從IgGl轉換為IgG2。生產(chǎn)包含目的同種型的本發(fā)明抗體的另一種方法包括以下步驟分離編碼P-鈣黏著蛋白抗體重鏈的核酸和編碼P-鈣黏著蛋白抗體輕鏈的核酸，分離編碼Vh區(qū)的序列，將VH序列與編碼目的同種型重鏈恒定結構域的序列連接，在細胞中表達輕鏈基因和重鏈構建體，和收集帶有目的同種型的P-鈣黏著蛋白抗體。脫免疫化的抗體在本發(fā)明的另一方面，可使用例如PCT公開Nos.W098/52976和WOOO/34317(通過引用并入本文)中描述的技術脫免疫化抗體或其抗原結合部分以降低其免疫原性。經(jīng)衍生的和經(jīng)標記的抗體本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白或其抗原結合部分可以被衍生或連接至另一分子(例如另一肽或蛋白質)。一般地，抗體或其部分被衍生使得P-f丐黏著蛋白結合不受衍生或標記的不利影響。因此，本發(fā)明的抗體和抗體部分旨在包括本文所述的完整的和經(jīng)修飾形式的人P-鈣黏著蛋白。例如，本發(fā)明的抗體或抗體部分可以被功能性地連接(通過化學偶聯(lián)、遺傳融合、非共價結合或以其他方式)至一個或多個其他分子部分，例如另一抗體(例如雙特異性抗體或雙抗體)、檢測劑、標簽、細胞毒素劑、藥劑和/或蛋白質或肽，所述一個或多個其他分子部分能夠介導抗體或抗體部分與另一分子(例如鏈霉親和素核區(qū)或多組氨酸標簽)的結合。一種類型的衍生抗體是通過將兩個或更多個抗體(相同或不同類型的，例如產(chǎn)生雙特異性抗體)交聯(lián)而生產(chǎn)的。合適的交聯(lián)劑包括異雙功能劑(例如m-maleimidobenzoyl-N-羥基琥珀酰亞胺酯)或同雙功能劑(例如disuccinimidylsuberate)，所述異雙功能劑具有被適當隔離區(qū)分隔開的兩個不同的反應基團。這類接頭可得自PierceChemicalCompany,Rockford，IL。另一種類型的衍生抗體是經(jīng)標記的抗體。可以用來衍生本發(fā)明抗體或抗原結合部分的檢測劑包括熒光化合物(包括熒光黃、異硫氰酸熒光素、羅丹明、5-二甲胺-l-萘磺酰氯、藻紅蛋白、鑭系磷光體等)。抗體還可用適用于檢測的酶標記，例如辣根過氧化物酶、P-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。抗體使用可檢測的酶標記時，其可通過添加額外的試劑檢測，酶使用所述額外的試劑產(chǎn)生可以辨別的反應產(chǎn)物。例如黨存在辣根過氧化物酶時，添加過氧化氫酶和二氨基聯(lián)苯導致有色的反應產(chǎn)物，其是可檢測的?？贵w還可用生物素標記，并通過間接測量抗生物素蛋白或鏈霉親和素結合來檢測?？贵w還可用預先確定的、被二級報告基因(例如亮氨酸拉鏈對序列、用于二級抗體的結合位點、金屬結合結構域、表位標簽)識別的多肽表位來標記。在一些實施方案種，標簽通過多種長度的間隔臂結合以降低可能的位阻。P-鈣黏著蛋白還可以用化學基團衍生，所述化學基團例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或碳水化合物基團。這些基團適用于促進抗體的生物學特性，例如提高血清的半衰期。P-鈣黏著蛋白抗體對P-鈣黏著蛋白的親合力P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結合部分對P-鈣黏著蛋白的親合力(KD)和離解速率(k。ff)可通過本領域已知方法測量?？赏ㄟ^ELISA、RIA、流式細胞儀或表面等離振子共振，例如BIACORETM來測量親合力。離解速率可以通過表面等離振子共振來測量。優(yōu)選地，通過表面等離振子共振測量親合力和離解速率。更優(yōu)選地，使用BIACORETM測量親合力和離解速率?？墒褂帽绢I域已知方法測定抗體是否與P-鈣黏著蛋白抗體具有基本相同的KD。這類測定KD和k。ff的方法可用于初始的篩選階段，以及隨后的優(yōu)化階段。鑒定被P-鈣黏著蛋白識別的P-鈣黏著蛋白表位本發(fā)明提供下述人P-鈣黏著蛋白抗體，所述人P-鈣黏著蛋白抗休與P-鈣黏著蛋白結合，并與表1或2中所述的任何抗體競爭或交叉競爭和/或結合相同表位?？墒褂帽绢I域已知方法測定抗體是否與本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白抗體結合相同的表位，或針對結合而交叉競爭。在一個實施方案中，允許本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白抗體在飽和條件下與P-鈣黏著蛋白結合，然后測量測試抗體與P-鈣黏著蛋白結合的能力。如果測試抗體能夠和P-鈣黏著蛋白抗體同時與P-鈣黏著蛋白結合，則測試抗體和P-鈣黏著蛋白抗體結合不同的表位。然而，如果測試抗體不能同時結合P-鈣黏著蛋白，則測試抗體結合相同的表位或重疊表位，或與人P-鈣黏著蛋白抗體所結合的表位密切近似的表位結合。該實驗可使用ELISA、RIA、BIACORETM或流式細胞儀進行。在優(yōu)選的實施方案中，實驗使用ELISA進行。通過P-鈣黏著蛋白抗體抑制P-鈣黏著蛋白活性可使用大量測定法鑒定抑制P-鈣黏著蛋白活性的P-鈣黏著蛋白抗體。例如，細胞聚集測定法提供了測量P-鈣黏著蛋白-依賴性的細胞聚集的方法。該類型的測定法使用過表達P-鈣黏著蛋白的細胞系，其中細胞被置于懸浮液中并被允許形成P-鈣黏著蛋白-依賴性聚集體。然后使用聚集測試，通過測量使用和不使用抗體導致的細胞聚集體的尺寸來定量P-鈣黏著蛋白抗體阻止該聚集的能力。作為P-鈣黏著蛋白抗體濃度的函數(shù)，細胞聚集體的尺寸可隨后被用于測定ICs。值。實施例3提供了用于測量若干P-鈣黏著蛋白抗體ICso值的P-鈣黏著蛋白-依賴性聚集體測定法的其他細節(jié)。細胞粘附測定法還可用于測量P-鈣黏著蛋白阻斷細胞與受體P-鈣黏著蛋白粘附的能力，所述受體P-鈣黏著蛋白已被固定在固體載體上。該類型的測定法可通過例如將P-鈣黏著蛋白固定在固體載體如塑料上來進行。然后允許過表達P-鈣黏著蛋白的細胞通過P-鈣黏著蛋白-P-鈣黏著蛋白相互作用附著在固體載體上。然后可以使用或不使用P-鈣黏著蛋白抗體定量附著的水平。作為抗體濃度的函數(shù)，附著可隨后用于測定IC5。值。實施例3提供用于測量P-鈣黏著蛋白抗體ICso值的P-鈣黏著蛋白-依賴性細胞附著測定法的其他細節(jié)。p-鈣黏著蛋白活性的抑制也可使用p-鈣黏著蛋白依賴性球狀體破壞測定法來測量。該類型的測定法測量p-鈣黏著蛋白抗體破壞預先形成的p-鈣黏著蛋白-依賴性細胞聚集的能力。通過測量聚集體的尺寸減小(作為抗體濃度的函數(shù))，可測定ICso值。實施例5提供用于測量P-鈣黏著蛋白抗體ICso值的P-鈣黏著蛋白-依賴性球狀體破壞測定法的其他細節(jié)。上述通過多種抗體或其抗原結合部分用于測定p-鈣黏著蛋白活性抑制的方法和測定法，可在初始的篩選階段以及隨后的優(yōu)化階段使用。分子選擇性本發(fā)明P-鈣黏著蛋白抗體對其他鈣黏著蛋白(例如E-鈣黏著蛋白)的選擇性可使用本領域公知方法測定。例如，可使用Western印跡、流式細胞儀、ELISA、免疫沉淀或RIA測定選擇性。實施例7提供ELISA測定法的其他細節(jié)，所述ELISA測定法用于測量特定抗體對P-鈣黏著蛋白超出E-鈣黏著蛋白的選擇性。上述用于測定多種抗體或其抗原結合部分對P-鈣黏著蛋白選擇性的方法和測定法，可在初始的篩選階段以及隨后的優(yōu)化階段使用。藥物組合物和施用本發(fā)明還涉及用于在哺乳動物(包括人)中治療異常細胞生長的藥物組合物，所述藥物組合物包含一定量的本文所述P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結合部分以及藥物可接受載體，所述量有效治療異常細胞生長。本發(fā)明的抗體和抗原結合部分可被整合進適用于施用給受試者的藥物組合物中。典型地，藥物組合物包含本發(fā)明的抗體或抗原結合部分和藥物可接受載體。本文使用"藥物可接受載體"是指生理學適用的任何和所有的溶劑、分散介質、涂層、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。藥物可接受載體的一些實例是水、鹽水、磷酸鹽緩沖的鹽水、葡萄糖、tt油、乙醇等及其組合。在許多情況下，組合物屮優(yōu)選包括等滲劑例如糖，多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。藥物可接受物質的其他實例是濕潤劑或少量輔助物質，例如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液，其延長抗體的儲藏壽命或提高其效力。本發(fā)明的組合物可以是多種形式，例如液體、半固體和固體劑型，例如液體溶液(例如可注射的和可輸注的溶液)、分散液或懸浮液、藥片、丸劑、粉末、脂質體和栓劑。優(yōu)選的形式取決于將采用的施用和治療應用模式。典型的優(yōu)選的組合物是可注射或可輸注的溶液，例如與用于被動免疫人的組合物類似的組合物。優(yōu)選的施用模式是腸胃外的(例如靜脈、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi))。在優(yōu)選的實施方案中，通過靜脈輸注或注射施用抗體。在另一優(yōu)選的實施方案中，通過肌內(nèi)或皮下注射施用抗體。用于注射的配方可以以單位劑型存在于例如安瓿或多劑容器中，添加或不添加防腐劑。組合物可在油性或水性運載體中帶有如懸浮液、溶液或乳劑之類的形式，并可含有配制劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，活性成分可以是用于在使用前與合適運載體(例如滅菌的無熱原水)組合的粉末形式。典型地，治療組合物在制造和儲存的條件下必須是無菌和穩(wěn)定的。組合物可被配制為溶液、微乳劑、分散劑、脂質體或適用于高藥物濃度的其他有序結構?？赏ㄟ^將所需用量的P-鈣黏著蛋白抗體整合進帶有所需的上文所列成分之一或其組合的適當溶劑中，然后過濾滅菌來制備無菌的可注射溶液。一般地，通過將活性化合物整合進無菌運載體中制備分散劑，所述無菌運載體含有基礎分散介質和來自上文所列的需要的其他成分。在用于配制無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的配制方法是真空干燥和冷凍干燥，其從先前經(jīng)無菌過濾的溶液中得到活性成分加上任何額外所需成分的粉末?？衫缤ㄟ^使用涂層如卵磷脂，通過維持所需的顆粒尺寸(在分散劑的情況下)和通過使用表面活性劑來維持溶液的適當流動性?？勺⑸浣M合物的延長吸收可通過在組合物中包括延遲吸收的劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)來實現(xiàn)。本發(fā)明的抗體或抗體部分可通過本領域已知的多種方法施用，盡管對于許多治療應用而言，優(yōu)選的施用途徑/方式是皮下、肌內(nèi)或靜脈輸注。本領域技術人員應當知道，施用途徑和/或方式會取決于所需結果而變化。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體組合物可以用下述載體制備，所述載體會保護抗體免于快速釋放，例如受控釋放成分，包括埋植劑、透皮貼劑和微囊包埋遞送體系。可使用生物可降解的、生物相容的多聚體，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚正酯和聚乳酸。用于制備這類配方的許多方法是本領域技術人員普遍已知的。參閱例如SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J,R.Robinson,ed.,MarcelDekker,Inc.，NewYork,1978，其通過引用并入本文。額外的活性化合物也可被整合進組合物中。在某些實施方案中，本發(fā)明的異質性P-鈣黏著蛋白抗體與一種或多種額外的治療劑共同配制和/或共同施用。這些劑包括但不限于結合其他靶標的抗體、抗腫瘤劑、抗血管生成劑、信號轉導抑制劑、抗增殖劑、化學治療劑或抑制P-鈣黏著蛋白的肽類似物。這類組合治療可需要低劑量的抑制性P-鈣黏著蛋白以及共同施用的劑，從而避免伴隨著多種單一治療的可能的毒性或并發(fā)癥。本發(fā)明的組合物可包括"治療上有效量"或"預防上有效量"的本發(fā)明抗體或抗原結合部分。"治療上有效量"是指按劑量或對必需的時間段而言，有效達到所需治療結果的量?？贵w或抗原結合部分的治療上有效量可根據(jù)例如疾病階段、年齡、性別和個體體重的因子以及抗體或抗體部分在個體中因其所需應答的能力而變化。治療上有效量也是下述量，其中治療上有益的效應勝過抗體或抗原結合部分的任何有毒效應或有害效應。"預防上有效量"是指按劑量或對必需的時間段而言，有效達到所需預防結果的量。典型地，因為預防劑量被用于患疾病之前的或處于疾病早期階段的受試者中，所以預防上有效量可少于治療上有效量。可調節(jié)給藥方案以提供最佳的期望應答(例如治療的或預防的應答)。例如，可以施用單次大丸劑(bolus)，可以隨時間進展施用若干被分開的劑量或所述劑量可根據(jù)治療情況所要求的按比例降低或提高。特別有利的是以單位劑型配制腸胃外組合物，以簡化施用和劑量均一性。本文使用單位劑型是指物理上分離的單位，其適合作為單一劑量用于被治療的哺乳動物受試者；每個單位含有與所需藥物載體結合的、經(jīng)計算以產(chǎn)生所需治療效果的預定數(shù)量的活性成分。本發(fā)明單位劑型的規(guī)格由以下規(guī)定并直接取決于(a)P-鈣黏著蛋白抗體或其部分的獨特特性和所要達到的具體治療或預防效應；和(b)調劑領域中這類抗體用于治療個體中敏感性的固有限制。本發(fā)明抗體或抗體部分的治療上或預防上有效量的示范性的、非限制的范圍是0.025到50mg/kg，更優(yōu)選地0.1到50mg/kg，更優(yōu)選地0.1-25、0.1到10或0.1到3mg/kg。在一些實施方案中，配方在20mM檸檬酸鈉(pH5.5)、140mMNaCl和0.2mg/mL聚山梨酯80的緩沖液中含有5mg/mL的抗體。應當注意劑量值可隨著待減輕的病癥類型和嚴重性而變化。還應當理解對任何具體的受試者，應當根據(jù)個體需要和施用組合物或管理組合物施用的人的專業(yè)判斷，隨著時間調整特定的給藥方案，本文公開的劑量范圍僅是示范性的，并不旨在限制所要求的組合物的范圍或實踐。本發(fā)明的另一方面提供包含本發(fā)明P-鈣黏著蛋白抗體或抗原結合部分的試劑盒，或包含這類抗體或部分的組合物。除抗體或組合物外，試劑盒可包括診斷劑或治療劑。試劑盒可包括針對診斷方法或治療方法使用的說明書。在優(yōu)選的實施方案中，試劑盒包括抗體或包含抗體的組合物，以及可用于下述方法中的診斷劑。在另一優(yōu)選的實施方案中，試劑盒包括抗體或包含抗體的組合物，以及可用于下述方法中的一種或多種治療劑。使用的診斷方法P-鈣黏著蛋白或其抗體結合部分可用于診斷方法以檢測體外或體內(nèi)生物樣品中的P-鈣黏著蛋白。例如，P-鈣黏著蛋白可用于常規(guī)免疫測定法，包括但不限于ELISA、RIA、流式細胞儀、組織免疫組織化學、Western印跡或免疫沉淀。本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白可用于檢測來自人的P-鈣黏著蛋白。P-鈣黏著蛋白也可用于檢測來自小鼠、大鼠和短尾猴的P-鈣黏著蛋白。本發(fā)明提供用于檢測生物樣品中P-鈣黏著蛋白的方法，包含將生物樣品與本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白接觸并檢測結合的抗休。在一個實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體用可檢測的標簽直接標記。在另一實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體(第一抗體)未被標記，能夠結合P-鈣黏著蛋白抗體的第二抗體或其他分子被標記。如本領域技術人員所公知的，選擇能夠與具體種類和類別的第一抗體特異結合的第二抗體。例如，如果P-鈣黏著蛋白抗體是人IgG，則第二抗體可以是抗-人-IgG。能夠結合抗體的其他分子包括但不限于A蛋白和G蛋白，其均可從例如PierceChemicalCo.商業(yè)獲得。用于抗體或二級抗體的合適標簽先前已討論，其包括多種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料和放射性材料。合適的酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、3-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基絡合物實例包括鏈霉親和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光材料實例包括傘形酮、熒光黃、異硫氰酸熒光素、羅丹明、dichlorotriazinylamine熒光黃、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實例包括魯米諾；合適的放射性材料的實例包括1251、1311、35S或3h。在其他實施方案中，可使用經(jīng)可檢測物質標記的P-鈣黏著蛋白標準和未標記的P-鈣黏著蛋白抗體，通過競爭免疫測定法在生物樣品中測定P-鈣黏著蛋白。在該測定法中，將生物樣品、經(jīng)標記的P-鈣黏著蛋白標準和P-鈣黏著蛋白抗體組合，并測定與未標記抗體結合的經(jīng)標記的P-鈣黏著蛋白標準的量。生物樣品中P-鈣黏著蛋白的量和結合了P-鈣黏著蛋白抗體的經(jīng)標記的P-鈣黏著蛋白標準的量成反比。上述免疫測定法可被用于大量目的。例如，P-鈣黏著蛋白抗體可被用于在經(jīng)培養(yǎng)的細胞中檢測P-鈣黏著蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，P-l丐黏著蛋白抗體被用于檢測細胞產(chǎn)生的P-鈣黏著蛋白的量，所述細胞已用多種化合物處理。該方法可用于鑒定調節(jié)P-鈣黏著蛋白水平的化合物。根據(jù)該方法，用一種測試化合物處理一種細胞一段時間，同時另一樣品不被處理。如果要測量總P-鈣黏著蛋白水平，則將細胞裂解并使用上述免疫測定法之一測量總P-鈣黏著蛋白水平。比較處理細胞與未處理細胞相對的總P-鈣黏著蛋白水平以測定測試化合物的效應。用于測量總P-鈣黏著蛋白水平的優(yōu)選免疫測定法是流式細胞儀或免疫組織化學。例如ELISA、RIA、流式細胞儀、Western印跡、免疫組織化學、細胞表面標記膜內(nèi)在蛋白質和免疫沉淀為本領域公知。參閱例如HarlowandLane，上文。另外，免疫測定法可以提高為高通量篩選，從而檢測大量化合物的活性或對P-鈣黏著蛋白的抑制。本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白抗體也可用于檢測組織中或來自該組織的細胞中P-鈣黏著蛋白水平。在一些實施方案中，該組織是患病組織。在該方法的一些實施方案中，組織或其組織活檢從患者切離。然后將組織或組織活檢用于免疫測定法，以通過上文所述方法測定例如總P-鈣黏著蛋白水平或定位P-鈣黏著蛋白。本發(fā)明的抗體還可體內(nèi)用于鑒定表達P-鈣黏著蛋白的組織和器官。使用本發(fā)明的人P-鈣黏著蛋白抗體的一個優(yōu)點在于與非人來源的抗體或人源化抗體或嵌合抗體不同，它們可被安全地體內(nèi)使用而不因為施用引起對抗體的顯著免疫應答。該方法包含步驟向需要這類診斷測試的患者施用經(jīng)可檢測地標記的P-鈣黏著蛋白抗體或包含它們的組合物，對患者進行圖像分析以確定表達P-鈣黏著蛋白的組織定位。圖像分析為醫(yī)學領域所公知，包括但不限于X射線分析、磁共振成像(MRI)或計算機斷層攝影術(CT)。抗體可用適用于體內(nèi)成像的任何劑標記，例如造影劑如鋇(其可被用于X射線分析)，或磁造影劑如釓螯合物(其可用于MRI或CT)。其他標記劑包括但不限于放射性同位素，例如"Tc。在另一實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體可以是未標記的，并可通過施用可檢測并能結合P-鈣黏著蛋白抗體的第二抗體或其它分子而被成像。在一個實施方案中，從患者獲得組織活檢以確定目的組織是否表達P-鈣黏著蛋白。使用的治療方法在另一實施方案中，本發(fā)明提供通過向需要的患者施用P-鈣黏著蛋白抗體而用于抑制P-鈣黏著蛋白活性的方法。本文所述任何抗體或其抗原結合部分可治療性地使用。在優(yōu)選的實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體是人抗體、嵌合抗體或人源化的抗體。在另一優(yōu)選的實施方案中，P-鈣黏著蛋白是人的，患者是人患者?；蛘?，患者可以是表達與所述P-鈣黏著蛋白抗體交叉反應的P-鈣黏著蛋白的哺乳動物?？梢韵虮磉_(與所述抗體交叉反應的)P-鈣黏著蛋白的非人哺乳動物(例如大鼠、小鼠或短尾猴)施用抗體，用于獸醫(yī)的目的或用作人疾病的動物模型。這類動物模型可適用于評價本發(fā)明抗體的治療效力。在另一實施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體或其抗體部分可被施用給表達異常高水平P-鈣黏著蛋白的患者。該抗體可被施用一次，但更優(yōu)選被施用多次。抗體可被施用為一天三次到每六個月或更久一次。施用可以按照如下的日程表一天三次、一天兩次、一天一次、兩天一次、三天一次、一周一次、兩周一次、一個月一次、兩個月一次、三個月一次和六個月一次?？贵w還可通過微泵被連續(xù)地施用?？贵w可以通過粘膜、頰、鼻內(nèi)、吸入、靜脈、皮下、肌內(nèi)、腸胃外或瘤內(nèi)途徑被施用。抗體可被施用一次、至少兩次或至少施用一段之間直到病癥被治療、減輕或治愈。一般地，只要病癥存在，抗體就被施用。一般地，抗體會作為上文所述藥物組合物的一部分被施用。一般地，抗體劑量會在0.1到100mg/kg，更優(yōu)選地0.5到50mg/kg，更優(yōu)選地1到20mg/kg和進一步更優(yōu)選地1到10mg/kg的范圍內(nèi)。血清抗體濃度可通過本領域已知的任何方法測量。本發(fā)明還涉及用于治療哺乳動物(包括人)中異常細胞生長的方法，包含向所述哺乳動物施用治療上有效量的P-鈣黏著蛋白或其抗原結合部分，如上所述，其有效治療異常細胞生長。在該方法的一個實施方案中，異常細胞生長是癌癥，包括但不限于間皮瘤、肝膽管(肝和膽管)的癌癥、原發(fā)性或繼發(fā)性的CNS腫瘤、原發(fā)性或繼發(fā)性的腦腫瘤、肺癌(NSCLC和SCLC)、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭與頸癌、表皮或眼內(nèi)黑色素瘤、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌、腸胃(胃的、結腸直腸的和十二指腸的)的癌癥、乳腺癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、陰門癌、Hodgkin's疾病、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、睪丸癌、慢性或急性白血病、慢性髓細胞樣白血病、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)新生物、原發(fā)性CNS淋巴瘤、非hodgkins，s淋巴瘤、脊髓性樞椎腫瘤(spinalaxistumors)、腦干神經(jīng)膠質瘤、垂體腺瘤、腎上腺皮質癌、單囊癌、多發(fā)性骨髓瘤、膽管癌、纖維肉瘤、神經(jīng)母細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤，或一種或多種上述癌癥的組合。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，癌癥選自肺癌(NSCLC禾BSCLC)、頭與頸癌、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌、乳腺癌、腎或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)新生物、原發(fā)性CNS淋巴瘤、非hodgkins，s淋巴瘤、脊髓樞椎腫瘤或一種或多種上述癌癥的組合。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，癌癥選自肺癌(NSCLC和SCLC)、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、肛區(qū)癌或一種或多種上述癌癥的組合。在所述方法的另一實施方案中，所述異常細胞生長是良性的增生疾病，包括但不限于銀屑病、良性前列腺肥大或組織增生(restinosis)。本發(fā)明還涉及用于治療哺乳動物中異常細胞生長的方法，其包含向所述哺乳動物施用一定量的P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結合部分(如本文所述，所述量有效治療異常細胞生長)以及選自以下的抗腫瘤劑核分裂抑制劑、烷化劑、抗代謝物、嵌入抗生素、生長因子抑制劑、細胞周期抑制劑、酶、拓撲異構酶抑制劑、生物應答修飾劑、抗體、細胞毒素、抗激素和抗雄激素。本發(fā)明還涉及用于治療哺乳動物(包括人)中異常細胞生長的藥物組合物，其包含一定量(如本文所述，所述量有效治療異常細胞生長)的P-鈣黏著蛋白或其抗原結合部分與藥物可接受載體和選自以下的抗腫瘤劑核分裂抑制劑、烷化劑、抗代謝物、嵌入抗生素、生長因子抑制劑、細胞周期抑制劑、酶、拓撲異構酶抑制劑、生物應答修飾劑、抗激素和抗雄激素。本發(fā)明還涉及用于治療哺乳動物中高增生性疾病的方法，其包含向所述哺乳動物施用治療上有效量的P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結合部分(如本文所述)以及選自以下的抗腫瘤劑抗增殖劑、激酶抑制劑、血管生成抑制劑、生長因子抑制劑、COX-I抑制劑、COX-II抑制劑、核分裂抑制劑、垸化劑、抗代謝物、嵌入抗生素、生長因子抑制劑、輻射、細胞周期抑制劑、酶、拓撲異構酶抑制劑、生物應答修飾劑、抗體、細胞毒素、抗激素、statins和抗雄激素。在本發(fā)明的一個實施方案中，與本文所述P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結合部分和藥物組合物組合使用的抗腫瘤劑是抗血管生成劑、激酶抑制劑、pan激酶抑制劑或生長因子抑制劑。優(yōu)選的pan激酶抑制劑包括U.S.專利No.6,573,293(Pfizer，Inc，NY,USA)中描述的SU-11248。抗血管生成劑，包括但不限于以下劑，例如EGF抑制劑、EGFR抑制劑、VEGF抑制劑、VEGFR抑制劑、TIE2抑制劑、IGFIR抑制劑、COX-II(環(huán)氧合酶II)抑制劑、MMP-2(基質-金屬蛋白酶2)抑制劑和MMP-9(基質-金屬蛋白酶9)抑制劑。優(yōu)選的VEGF抑制劑包括例如Avastin(貝4戈單抗bevacizumab)禾卩Genentech,Inc.ofSouthSanFrancisco,California的抗VEGF單克隆抗體。其它的VEGF抑制劑包括CP-547,632(PfizerInc.,NY,USA)、AG13736(PfizerInc.)、ZD-6474(AstraZeneca)、AEE788(Novartis)、AZD-2171)、VEGFTrap(Regeneron，/Aventis)、Vatalanib(也稱為PTK-787、ZK隱222584:Novartis&ScheringAG)、Macugen(pegaptaniboctasodium,NX-1838,EYE-001,PfizerInc./Gilead/Eyetech)、IM862(CytranInc.ofKirkland，Washington,USA);禾口angiozyme~—來自Ribozyme(Boulder,Colorado)和Chiron(Emeryville,Califomia)的合成性合酶，及其組合。在本發(fā)明實踐中有用的VEGF抑制劑公開于US專利No.6,534,524禾n6，235，764中，所述資料的整體內(nèi)容均并入本文用于所有目的。具體優(yōu)選的VEGF抑制劑包括CP-547,632、AG13736、Vatalanib、Macugen及其組合。其它的VEGF抑制劑描述于例如WO99/24440(1999年五月20日公開)、PCT國際申請PCT/IB99/00797(1999年五月3日提交)、WO95/21613(1995年八月17日公開)、WO99/61422(1999年十二月2日公開)、美國專利6,534,524(公開AG13736)、美國專利5,834,504(1998年H^—月10日出版)、WO98/50356(1998年i-一月12日公開)、美國專利5,883,113(1999年三月16日出版)、美國專利5,886,020(1999年三月23日出版)、美國專利5,792,783(1998年八月11日出版)、U.S.專利No.US6,653,308(2003年H^—月25日出版)、WO99/10349(1999年三月4日公開)、WO97/32856(1997年十二月12日公開)、WO97/22596(1997年六月26日公開)、WO98/54093(1998年十二月3日公開)、WO98/02438(1998年一月22日公開)、WO99/16755(1999年四月8日公開)和WO98/02437(1998年一月22日公開)，其整體內(nèi)容均通過引用并入本文。可以與本發(fā)明抗體或其抗原結合部分使用的其它抗增殖劑包括法呢基蛋白質轉移酶的酶抑制劑和受體酪氨酸激酶PDGFr的抑制劑，包括以下美國專利申請中所公開并要求的化合物09/221946(1998年十二月28日提交)；09/454058(1999年十二月2日提交)；09/501163(2000年二月9日提交)；09/539930(2000年三月31日提交)；09/202796(1997年五月22日提交);09/384339(1999年八月26日提交)和09/383755(1999年八月26日提交)；和以下的美國臨時專利申請中公開并要求的化合物60/168207(1999年^^一月30日提交);60/170119(1999年十二月10日提交)；60/177718(2000年一月21日提交)；60/168217(1999年H"^—月30日提交)和60/200834(2000年五月1日提交)。每個上述專利申請和臨時專利申請的整體內(nèi)容被引入本文。PDGRr抑制劑包括但不限于公開于以下的那些2001年七月7日公開的WO01/40217和2004年三月11日公開的WO2004/020431，就一切目的而言其內(nèi)容整體并入本文。優(yōu)選的PDGFr抑制劑包括Pfizer'sCP-673，451和CP-868,596及其可藥用鹽。優(yōu)選的GARF抑制劑包括Pfizer'sAG-2037(pelitrexol及其可藥用鹽)。適用于本發(fā)明實踐的GARF抑制劑公開于U.S.專利No.5,608,082，就一切目的而言其被整體引入。可與本文所述P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結合部分和本文所述藥物組合物組合使用的、有用的COX-II抑制劑的實例包括CELEBREX(塞來考昔)、帕瑞考昔、地拉考昔、ABT-963、MK-663(艾托考昔)、COX-189(L畫iracoxib)、BMS347070、RS57067、NS陽398、Bextra(伐地考昔)、paracoxib、Vioxx(羅非考昔)、SD-8381、4-甲基-2-(3，4-二甲基苯基)-1-(4-氨磺?；?苯基)-1H-口比咯、2-(4-乙氧苯基)-4-甲基-1-(4-氨磺?；交?-lH-吡咯、T-614、JTE-522、S-2474、SVT-2016、CT-3、SC-58125和Arcoxia(艾托考昔)。另夕卜，COX-II抑制劑公開于U.S.專利申請Nos.10/801,446和10/801,429，就一切目的而言其內(nèi)容被整體并入。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗腫瘤劑是如U.S.專利No.5,466,823中公開的塞來考昔，就一切目的而言其內(nèi)容通過引用被整體并入。塞來考昔的結構如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage63</formula>在一個優(yōu)選的實施方案中，抗腫瘤劑是如U.S.專利No.5,633,272中所公開的法利考昔(valecoxib)，就一切目的而言其內(nèi)容通過引用被整體并入。法利考昔的結構如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula>在一個優(yōu)選的實施方案中，抗腫瘤劑是如U.S.專利No.5，932,598中,公開的帕瑞考昔，就一切目的而言其內(nèi)容通過引用被整體并入。帕瑞考二的結構如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula>parecoxibCASNo.198470-84-5,932,598C-2931在-'昔-個實施方案中，抗腫瘤劑是如U.S.專利No.5,521,207所述的地拉:一切目的而言其內(nèi)容通過引用被整體并入。地拉考昔的結構如下所:CHF.deracoxibCASNo.169590-5,521,207C-2779在一個優(yōu)選的實施方案中，抗腫瘤劑是如U.S.專利No.6,034,256中公開的SD-8381,就一切目的而言其內(nèi)容通過引用被整體并入。SD-8381的結構如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula>在一個優(yōu)選的實施方案中，抗腫瘤劑是如國際公開號WO2002/24719中公開的ABT-963，就一切目的而言其內(nèi)容通過引用被整體并入。ABT-963的結構如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>在優(yōu)選的實施方案中，抗腫瘤劑是如下所示的羅非考昔:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>在一個優(yōu)選的實施方案中，抗腫瘤劑是如國際公開號WO1998/03484中所公開的MK-663(艾托考昔)，就一切目的而言其內(nèi)容通過引用被整體并入。艾托考昔的結構如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>在一個優(yōu)選的實施方案中，抗腫瘤劑是如國際公開號WO1999/11605中所述的COX-189(Lumiracoxib)，就一切目的而言其內(nèi)容通過引用被整體并入。Lumiracoxib的結構如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>在一個優(yōu)選的實施方案中，抗腫瘤劑是如美國專利No.6,180,651中所公開的BMS-347070，就一切目的而言其內(nèi)容通過引用被整體并入。BMS-347070的結構如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>在一個優(yōu)選的實施方案中，抗腫瘤劑是NS-398(CAS123653-11-2)。NS-398(CAS123653-1l-2)的結構如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>在一個優(yōu)選的實施方案中，抗腫瘤劑是RS57067(CAS17932-91-3)。RS57067(CAS17932-91-3)的結構如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>在一個優(yōu)選的實施方案中，抗腫瘤劑是4-甲基-2-(3,4-二甲基苯基)-1-(4-氨磺?；?苯基)-lH-吡咯。4-甲基-2-(3,4-二甲基苯基)-l-(4-氨磺?；?苯基)-lH-吡咯的結構如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>在一個優(yōu)選的實施方案中，抗腫瘤劑是2-(4-乙氧苯基)-4-甲基-l-(4-氨磺酰基苯基)-lH-吡咯。2-(4-乙氧苯基)-4-甲基-l-(4-氨磺?；交?-lH-吡咯的結構如下所示在一個優(yōu)選的實施方案中，抗腫瘤劑是美洛昔康(mdoxicam)。美洛昔康的結構如下所示與本發(fā)明抗體和本文所述的藥物組合物一起用作抗腫瘤劑的其它有用抑制劑包括阿司匹林和非載體抗炎藥(NSAID)，它們抑制制造前列腺素的酶(環(huán)氧合酶I和II)，導致更低的前列腺素水平，其包括但不限于以下的雙水楊酸酯(Salsalate)(Amigesic)、氟苯水楊酸(Diflunisal)(Dolobid)、布洛芬(Ibuprofen)(Motrin)、酮洛芬(Ket叩rofen)(Orudis)、萘丁美酮(Nabumetone)(Relafen)、皮洛西康(Piroxicam)(Feldene)、萘普生(Naproxen)(Aleve，Naprosyn)、雙氯芬酸(Diclofenac)(Voltaren)、卩引口朵美辛(Indomethacin)(Indocin)、舒林酸(Sulindac)(Clinoril)、痛滅定(Tolmetin)(Tolectin)、依托度酸(Etodolac)(Lodine)、酮咯酸(Ketorolac)(Tomdol)、惡丙嗪(Oxaprozin)(Daypro)及其組合。優(yōu)選的COX-I抑制劑包括布洛芬(Motrin)、磺胺二甲噁唑、萘普生(Aleve)、吲哚美辛(Indocin)、萘丁美酮(Relafen)及其組合。與本文所述P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結合部分以及本文所述藥物組合物組合使用的定向劑包括EGFr抑制劑，例如易瑞沙(Iressa)(吉非替尼(gefitinib)、阿斯利康(AstraZeneca))、得舒緩(Tarceva)(埃羅替尼(erlotinib)或OSI-774,OSIPharmaceuticalsInc.)、而必得舒(Erbitux)(西妥昔單抗，ImclonePharmaceuticals,Inc.)、EMD-7200(MerckAG)、ABX隱EGF(AmgenInc.禾口AbgenixInc.)、HR3(CubanGovernment)、IgA抗體(UniversityofErlangen-Nuremberg)、TP-38(IVAX)、EGFR融合蛋白、EGF-疫苗、抗-EGFr免疫脂質體(HermesBiosciencesInc.)及其組合。優(yōu)選的EGFr抑制劑包括易瑞沙、而必得舒、得舒緩及其組合。本發(fā)明還涉及選自panerb受體抑制劑或ErbB2受體抑制劑的抗腫瘤劑，例如CP-724,714(Pfizer,Inc.)、CI-1033(坎呢替尼(canertinib),Pfizer,Inc.)、賀癌平(Herceptin)(曲妥單抗，GenentechInc.)、奧米他(Omitarg)(2C4，派特資哌(pertuzumab),GenentechInc.)、TAK-165(Takeda)、GW-572016(龍呢法尼(lonafarnib),GlaxoSmkhKline)、GW-282974(GlaxoSmithKline)、EKB-569(Wyeth)、PKI-166(Novartis)、dHER2(HER2Vaccine,CorixaandGlaxoSmithKline)、APC8024(HER2Vaccine,Dendreon)、抗HER2/神經(jīng)鞘雙特異性抗體(DecofCancerCenter)、B7.her2.IgG3(Agensys)、ASHER2(ResearchInstituteforRadBiology&Medicine)、三功能雙特異性抗體(UniversityofMunich)禾BmABAR-209(AronexPharmaceuticalsInc)和mAB2B-1(Chiron)及其組合。優(yōu)選的erb選擇性抗腫瘤劑包括Herceptin、TAK-165、CP-724,714、ABX-EGF、HER3及其組合。優(yōu)選的panerbb受體抑制劑包括GW572016、CI-1033、EKB-569和奧米他及其組合。其它的erbB2抑制劑包括描述于以下的那些WO98/02434(1998年一月22日公開)、WO99/35146(1999年七月15日公開)、WO99/35132(1999年七月15日公開)、WO98/02437(1998年一月22日公開)、WO97/13760(1997年四月17日公開)、WO95/19970(1995年七月27日公開)、美國專利5,587,458(1996年十二月24日出版)和美國專利5，877,305(1999年三月2日出版)，每個資料通過引用被整體并入本文。適用于本發(fā)明的ErbB2受體抑制劑也描述于美國專利Nos.6,465,449和6,284,764和國際申請No.WO2001/98277中，每個資料通過引用被整體并入本文。另外，其它的抗腫瘤劑可選自以下劑BAY-43-9006(OnyxPharmaceuticalsInc.)、根纟內(nèi)三思(Genasense)(奧格莫森(augmerosen),Genta)、盤尼圖姆(Panitumumab)(Abgenix/Amgen)、澤娃靈(Zevalin)(Schering)、托西莫(Bexxar)(Corixa/GlaxoSmithKline)、阿巴瑞克(Abarelix)、力比泰(Alimta)、EPO906(Novartis)、迪斯德莫來(discodermolide)(XAA-296)、ABT-510(Abbott)、癌立消(Neovastat)(Aetema)、恩澤特林(enzastaurin)(EliLilly)、風車子阻生素(Combrestatin)A4P(Oxigene)、ZD-6126(AstraZeneca)、氟拉皮雷多(flavopiridol)(Aventis)、CYC-202(Cyclacel)、AVE-8062(Aventis)、DMXAA(Roche/Antisoma)、諾拉曲特(Thymitaq)(Eximias)、石肖卡芥(Temodar)(替莫唑胺，ScheringPlough)和雷維里德(Revilimd)(Celegene)及其組合。其它抗腫瘤劑可選自以下劑西皮特(CyPat)(醋酸環(huán)丙孕酮)、組胺瑞林(Histerelin，醋酸組氨瑞林)、皮雷恩思(Plenaixis)(abarelixdepot)、阿曲生坦(Atrasentan)(ABT-627)、薩特鉑(Satraplatin)(JM-216)、沙利度胺(thalomid)、塞拉特(Theratope)、替米利芬(Temilifene)(DPPE)、ABI-007(紫杉醇)、易維特(Evista)(雷洛昔芬)、阿他美坦(Atamestane)(Biomed-777)、聚殼氨酸紫杉醇(Xyotax，polyglutamatepaclitaxel)、他格停(Targetin)(bexarotine)及其組合。另外，其它抗腫瘤劑可選自以下劑特塞酮(Trizaone)(替拉扎明)、依昔舒林(Aposyn，exisulind)、萘瓦特(Nevastat)(AE-941)、色譜林(Ceplene)(二鹽酸組胺)、盧比替康(Orathecin，rubitecan)、維如利金(Virulizin)、胰腺癌疫苗(Gastrimmune)(G17DT)、DX-8951f(依喜替康甲磺酸鹽(exatecanmesylate))、Onconase(豹蛙酶)、BEC2(米妥莫單抗)、莫特沙芬軋(Xcytrin，motexafmgadolinium)及其組合。其它的抗腫瘤劑可選自以下劑昔瓦(CeaVac)(CEA)、新特瑞辛(NeuTrexin)(三切葡糖醛酸酯(trimetresateglucuronate))及其組合。額外的抗腫瘤劑可選自以下劑奧雷瑞(OvaRex)(oregovomab)、奧昔地(Osidem)(IDM-1)及其組合。額外的抗腫瘤劑可選自以下劑阿德維辛(Advexin)(ING201)、替拉茲明(Tirazone)(tirapazamine)及其組合。額外的抗腫瘤劑可以選自以下劑RSR13(乙丙昔羅(efaproxiral))、克他拉(Cotara)(1311chTNTl/b)、NBI-3001(IL-4)及其組合。額外的抗腫瘤劑可選自以下劑Canvaxin、GMK疫苗、PEGInteronA、泰克派新(Taxoprexin)(DHA/派昔泰克(paciltaxel))及其組合。其它優(yōu)選的抗腫瘤劑包括Pfizer的MEK1/2抑制劑PD325901、ArrayBiopharm的MEK抑制劑ARRY-142886、BristolMyers的CDK2抑制劑BMS-387,032、Pfizer的CDK抑制劑PD0332991和AstraZeneca的AXD-5438及其組合。額外地，mTOR抑制劑也可利用，例如CCI-779(Wyeth)和雷怕霉素衍生物RAD001(Novartis)和AP-23573(Ariad)、HDAC抑制齊USAHA(MerckInc./AtonPharmaceuticals)及其組合。額外的抗腫瘤劑包括aurora2抑制劑VX-680(Vertex)、Chkl/2抑制劑XL844(Exilixis)。以下的細胞毒素劑，例如選自表柔比星(Ellence)、多西紫杉醇(Taxotere)、紫杉醇、右雷佐生(Zinecard，dexrazoxane)、美羅華(Rituxan)、甲磺酸伊馬替尼(imatinibmesylate)(Gleevec)的-一種或多種及其組合可與本文所述的P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結合部分和本文所述的藥物組合物組合使用。本發(fā)明還關注本發(fā)明抗體及其抗原結合部分與激素療法一起的用途，所述激素療法包括但不限于依西美坦(Aromasin,PfizerInc.)、亮丙瑞林(Lupron或Leuplin，TAP/Abbott/Takeda)、阿那曲唑(Arimidex,Astrazeneca)、gosrelin(Zoladex,AstraZeneca)、度骨化醇、法倔唑、福美坦、檸檬酸他莫昔芬(他莫昔芬，Nolvadex,AstraZeneca)、康士得(Casodex)(AstraZeneca)、阿巴瑞克(Abarelix)(Praecis)、普托雷林(Trelstar)及其組合。本發(fā)明還涉及激素治療劑例如抗抗雌激素，包括但不限于氟維司群、托瑞米芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、來曲唑(Femara,Novartis);抗雄激素，例如比卡魯胺、氟他胺、米非司酮、尼魯米特、Casodex(4'-氰基-3-(4-氟苯基磺酰)-2-羥基-2-甲基-3'-(三氟甲基)丙酰苯胺，比卡魯胺)及其組合。另外，本發(fā)明提供單獨的或與一種或多種支持性醫(yī)護產(chǎn)品組合的本發(fā)明的抗體，所述支持性醫(yī)護產(chǎn)品例如選自沙格莫丁(Filgrastim)(Neupogen)、昂丹司瓊(Zofran)、法瑪西亞(Fragmin)、促紅細胞生長素(Procrit)、阿樂喜(Aloxi)、止敏吐(Emend)的產(chǎn)品或其組合。具體地優(yōu)選的細胞毒素劑包括伊立替康(Camptosar)、而必得舒、易瑞沙、格列衛(wèi)(Gleevec)、泰素帝(Taxotere)及其組合。以下的拓撲異構酶I抑制劑可以作為抗腫瘤劑使用喜樹堿、鹽酸伊立替康(irinotecanHC1，伊立替康(Camptosar))、艾替卡辛(edotecarin)、盧比替康(orathecin)(Supergen)、依沙替康(exatecan，Daiichi)、BN-80915(Roche)及其組合。具體地優(yōu)選的拓撲異構酶II包括表柔比星(Ellence)。本發(fā)明的抗體可以與抗腫瘤劑、烷化劑、抗代謝物、抗生素、來自植物的抗腫瘤劑、喜樹堿衍生物、酪氨酸激酶抑制劑、其它抗體、干擾素和/或生物應答修飾劑一起使用。烷化劑包括但不限于氮芥N-氧化物、環(huán)磷酰胺、異磷酰胺、美法侖、白消安、二溴甘露醇、卡波醌、塞替派、雷莫司汀、尼莫司汀、替莫唑胺、AMD-473、六甲蜜胺、AP-5280、阿帕茲酮(apaziquone)、布羅他辛(brostallicin)、苯達莫司汀、卡莫司汀、雌莫司汀、福莫司汀、葡磷酰胺、異磷酰胺、KW-2170、馬磷酰胺和二溴衛(wèi)矛醇；鉑配合的垸化化合物包括但不限于順鉑、必治妥(Paraplatin)(卡鉑)、依它鉑、洛鉑、奈達鉑、奧沙利鉑(Eloxatin，oxaliplatin，Sanofi)或塞特鉑(satrplatin)及其組合。具體地優(yōu)選的垸化劑包括奧沙利鉑(Eloxatin)?？勾x物包括但不限于甲氨喋呤、6-巰嘌呤苷、巰嘌呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)單獨或與亞葉酸(leucovorin)、替加氟、UFT、去氧氟尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷(cytarabineocfosfate)、依諾他濱、S-l，力比泰(Alimta，premetrexed二鈉，LY231514,MTA)、健澤(Gemzar)(吉西他濱，EliLilly)、氟達拉濱、5-阿扎胞苷、卡培他濱、克拉屈濱、氯法拉濱(clofarabine)、地西他濱、依氟鳥氨酸、乙炔基胞核(ethynylcytidine)、阿糖胞苷(cytosinearabinoside)、羥基脲、TS-1、美法侖、奈拉濱、諾拉曲塞、奧佛思特(ocfosfate)、力比泰(disodiumpremetrexed)、噴司他丁、派利特克(pelitrexol)、雷替曲塞、特阿平(triapine)、曲美沙特、阿糖腺苷、長春新堿、長春瑞濱組合；或例如優(yōu)選的抗代謝物之一公開于歐洲專利申請No.239362，例如N-(5-[N-(3，4-二氫-2-甲基-4-氧喹唑啉-6-基甲基)-N-甲氨基]-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸及其組合。抗生素包括嵌入抗生素但不限于阿柔比星(aclarubidn)、放線菌素D(actinomycinD)、安柔比星(amrubicin)、月旨質體蒽環(huán)霉素(amiamycin)、阿霉素(adriamycin)、博來霉素(bleomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、依沙盧星(elsamitrucin)、表柔比星(epirubicin)、力口柔比星(galarubicin)、伊達比星(idarubicin)、絲裂霉素C、奈莫柔比星(nemorubicin)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、培》各毒素(peplomycin)、卩比柔比星(pirarubicin)、蝴蝶霉素(rebeccamycin)、司丁拉米(stimalamer)、鏈佐星.(streptozocin)、〖戈柔比星(valrubicin)、7爭司亍也丁(zinostatin)及來自植物的抗腫瘤物質包括例如選自核分裂抑制劑的物質，例如長春堿(vinblastine)、多西紫杉醇(Taxotere)、紫杉醇(paclitaxel)及其組合。細胞毒拓撲異構酶抑制劑包括一種或多種選自以下的劑阿拉柔比星(aclarubicn)、氨萘非特(amonafide)、白龍?zhí)婵?belotecan)、喜樹石咸(camptothecin)、10-竽圣基喜豐對石咸(10-hydroxycamptothecin)、9-氨基喜樹堿(9-aminocamptothecin)、達佛莫替康(diflomotecan)、鹽酸伊立替康(Camptosar)、edotecarin、表柔比星(Ellence)、表鬼臼毒吡喃葡糖苷(etoposide)、依沙替康(exatecan)、基哌替康(gimatecan)、勒托替康(lurtotecan)、米托蒽酉昆(mitoxantrone)、卩比柔比星(pirarubicin)、皮可特酮(pixantrone)、盧比替康(rubitecan)、索布佐生其組合。(sobuzoxane)、SN-38、泰魯潑昔(tafluposide)、托泊替康(topotecan)及其組合。優(yōu)選的細胞毒拓撲異構酶抑制劑包括選自以下的一種或多種劑喜樹堿、10-羥基喜樹堿、9-氨基喜樹堿、鹽酸伊立替康(Camptosar)、艾替卡辛(edotecarin)、表柔比星(Ellence)、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、SN-38、托泊替康及其組合。免疫劑包括干擾素和大量其它免疫增強劑。干擾素包括干擾素a、干擾素a-2a、干擾素a-2b、干擾素P、干擾素Y-la、干擾素y-lb(Actimmime)或干擾素Y-nl及其組合。其它劑包括非格司亭(filgrastim)、香范多糖(lentinan)、裂裥多糖(sizofilan)、TheraCys、烏苯美司(ubenimex)、WF-IO、阿地白介素(aldesleukin)、阿侖單抗(alemtuzumab)、BAM-002、達卡巴嗪(dacarbazine)、達珠單抗(daclizumab)、地尼白介素(denileukin)、吉姆單抗(gemtuz腿ab)奧佐米星(ozogamicin)、伊莫單抗(ibritumomab)、咪喹莫特(imiquimod)、來格司亭(lenograstim)、香燕多糖(lentinan)、黑瘤疫苗(melanomavaccine)(Corixa)、莫拉司亭(molgramostim)、OncoVAX-CL、沙格司亭(sargramostim)、他索納明(tasonermin)、泰克白介素(tecleukin)、司卩屑拉辛(thymalasin)、托西莫單f亢(tositumomab)、維如利金(Virulizin)、Z-IOO、依帕珠單抗(epratuzumab)、米妥莫單抗(mi.tumomab)、奧雷瑞(oregovomab)、派圖莫(pemtumomab)(Y-muHMFGl)、普拉維格(Provenge)(Dendreon)及其組合。生物應答修飾劑是修飾活體防御機制或生物應答(例如存活、生長或組織細胞分化)使得它們具有抗腫瘤活性的劑。這類劑包括云芝多糖(krestin)、香燕多糖(lentinan)、西佐喃(sizofiran)、溶鏈菌(picibanil)、烏苯美司(ubenimex)及其組合。其它抗癌劑包括阿利維A酸(alitretinoin)、聚肌胞(ampligen)、阿曲生坦(atrasentan)貝沙羅汀(bexarotene)、硼替佐米(bortezomib)、伯森坦(Bosentan)、骨化三醇(calcitriol)、依昔舒林(exisulind)、非那雄胺(finasteride)、福莫司汀(fot飄stine)、伊班膦酸(ibandronicacid)、米替福新(miltefosine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、1-門冬酰胺酶、丙卡巴阱(procarbazine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、羥基脲(hydroxycarbamide)、培門冬酉每(pegaspargase)、噴司他丁(pentostatin)、泰紫羅尼(tazarotne)、泰司特(Telcyta)(TLK-286,TelikInc.)、萬5可(Velcade)(bortemazib，Millenium)、纟隹甲酸(tretinoin)及其組合。其它抗血管生成化合物包括阿西曲丁(acitretin)、芬維A胺(fenretinide)、沙禾ll度胺(thalidomide)、唑來月粦酸(zoledronicacid)、制管張素(angiostatin)、脫氫膜海鞘素B(aplidine)、昔冷特(cilengtide)、考布他汀A-4(combretastatinA-4)、內(nèi)皮抑制素(endostatin)、齒夫酉同(halofoginone)、雷必瑪特(rebimastat)、雷莫氟(removab)、來那度胺(Revlimid)、角鯊胺(squalamine)、烏克蘭(ukrain)、單抗LM609(Vitaxin)及其組合。與鉬配合的化合物包括但不限于順鉑、卡鉑、奈達鉑、奧沙利鉑及其組合。喜樹堿衍生物包括但不限于喜樹堿、10-羥基喜樹堿、9-氨基喜樹堿、伊立替康、SN-38、艾替卡辛(edotecarin)、托泊替康及其組合。其它抗腫瘤劑包括米托蒽醌、1-門冬酰胺酶、丙卡巴阱、達卡巴嗪、羥基脲、噴司他丁、維甲酸及其組合。能夠增強抗腫瘤免疫應答的抗腫瘤劑如CTLA4(細胞毒性淋巴細胞抗原4)和能夠阻斷CTLA4的其它劑也可被利用，例如MDX-010(Medarex)和美國專利No.6,682,736中公幵的CTLA4化合物；和抗增殖劑如其它法呢基蛋白轉移酶抑制劑，例如法呢基蛋白轉移酶抑制劑。另外，可用于本發(fā)明的特定CTLA4抗體包括描述于美國臨時申請60/113，647(1998年十二月23日提交)、美國專利No.6,682，736中的那些，所述兩個資料均通過引用整體并入本文?？捎糜诒景l(fā)明的特定IGF1R抗體包括描述于國際專利申請No.WO2002/053596中的那些，其通過引用整體并入本文?？捎糜诒景l(fā)明的特定CD40抗體包括描述于國際專利申請No.WO2003/040170中的那些，其通過引用整體并入本文?；蛑委焺┮部捎米骺鼓[瘤劑，例如TNFerade(GeneVec)，其響應放射性治療而表達TNFa。在本發(fā)明的一個實施方案中，他汀類(statins)可與本文所述的P-鈣黏著蛋白抗體或其抗體結合部分及其藥物組合物組合使用。他汀類(HMG-CoA還原酶抑制劑)可以選自阿托伐他汀(Atorvastatin，Lipitor,PfizerInc.)、普》去4也？丁(Pravastatin,Pravachol,Bristol-MyersSquibb)、？各"f戈f也丁(Lovastatin，Mevacor，MerckInc.)、辛j戈"f也丁(Simvastatin,Zocor，MerckInc.)、氟伐他汀(Fluvastatin，Lescol,Novartis)、薛利伐史達汀(Cerivastatin，Baycol,Bayer)、瑞舎予伐他汀(Rosuvastatin，Crestor,AstraZeneca)、洛伐他汀(Lovostatin)禾卩煙堿酸(Niacin,Advicor,KosPharmaceuticals)其衍生物或其組合。在優(yōu)選的實施方案中，他汀類選自阿托伐他汀和洛伐他汀、其衍生物或其組合。適用于抗腫瘤劑的其它劑包括苯磺酸氨氯地平/阿伐他汀鈣(Caduet)。就治療本文所述的高增生性疾病或異常細胞生長的任何方法而言(所述方法使用P-鈣黏著蛋白抗體或抗原結合部分與至少-一種額外的治療劑的組合)，P-鈣黏著蛋白抗體可以與額外的治療劑綴合，或衍生化。所述至少一種額外的治療劑也可以單獨地施用，或以非衍生化的或非綴合的方式施用。當所述至少一種額外的治療劑不是經(jīng)衍生化的或與抗體綴合，其可以在與抗體相同的藥物配方中施用，或其可以在單獨的配方中施用?；虔煼ň幋a本發(fā)明抗體和抗體部分的核酸分子可以通過基因療法施用給需要的患者。該療法可以是體內(nèi)的或離體的。在優(yōu)選的實施方案中，編碼重鏈和輕鏈二者的核酸分子被施用給患者。在更優(yōu)選的實施方案中，核酸分子被施用，使得它們被穩(wěn)定的整合進B細胞的染色體中，因為這些細胞是專門用于生產(chǎn)抗體的。在優(yōu)選的實施方案中，轉染或離體感染前體B細胞，并再移植進需要的患者中。在另一實施方案中，使用已知感染目的細胞類型的病毒體內(nèi)感染前體B細胞或其它細胞。用于基因療法的典型載體包括脂質體、質粒和病毒載體。示范性的病毒載體是逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。體內(nèi)或離體感染后，通過從被治療的患者中采樣并使用本領域已知的或本文所述的任何免疫測定法監(jiān)控抗體表達水平。在優(yōu)選的實施方案中，基因治療方法包含步驟施用編碼P-鈣黏著蛋白抗體重鏈或其抗原結合部分的、經(jīng)分離的核酸分子，和表達所述核酸分子。在另一實施方案中，基因治療方法包含步驟施用編碼P-鈣黏著蛋白抗體輕鏈或其抗原結合部分的、經(jīng)分離的核酸分子，和表達所述核酸分子。在更優(yōu)選的實施方案中，基因治療方法包含步驟施用編碼P-鈣黏著蛋白抗體重鏈或其抗原結合部分的、經(jīng)分離的核酸分子和編碼P-鈣黏著蛋白抗體輕鏈或其抗原結合部分的、經(jīng)分離的核酸分子，和表達所述核酸分子?；蛑委煼椒ㄟ€可包含施用另一治療劑(例如先前所述的與組合療法相關的任何劑)的步驟。為了使本發(fā)明更好地被理解，公開以下實施例。這些實施例僅用于闡述的目的而不應理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例在以下的實施例和制劑中，"BSA"是指牛血清白蛋白；"EDTA"是指乙二胺四乙酸；"DMSO"是指二甲基亞砜；"MOPS"是指3-(N-嗎琳代)丙磺酸；"MES"是指2-(N-嗎啉代)甲磺酸；"PBS"是指磷酸鹽緩沖的鹽水；"dPBS"是指Dulbecco，s磷酸鹽緩沖的鹽水；"HEMA"是指2-羥基-乙基異丁烯酸；"DMEM"是指Dulbecco's改良的小鷹培養(yǎng)基(eagle'smedium);"FBS"是指胎牛血清；"NEAA"是指非必需的氨基酸；"HEPES"是指N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸；"DMF"是指二甲基甲酰胺。實施例1:篩選scFv噬菌體展示文庫重組的人P-鈣黏著蛋白(R&DSystems861-PC-100)被用作抗原以篩選scFv噬菌體展示文庫?？寺∵M噬菌粒載體中的大scFv人抗體文庫被用于選擇(Vaughan，T丄etal.,Nat.Biotech.14:309-314(1996))。識別P4丐黏著蛋白的scFv在對重組人P-鈣黏著蛋白和表達P-鈣黏著蛋白的HCT116細胞融合單細胞層所采取的一系列重復選擇循環(huán)中從噬菌體展示文庫中被分離。簡言之，與文庫孵育之后，從P-鈣黏著蛋白回收結合的噬菌體，未結合的噬菌體被洗掉。然后如Vaughan,T丄etal.,Nat.Biotech.14:309-314(1996)中所述復蘇結合的噬菌體，并重復選擇過程。來自選擇周期輸出的代表性比例的克隆進行噬菌體酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)以檢測對P-鈣黏著蛋白的結合，基本上如Vaughan,T丄etal.，Nat.Biotech.14:309-314(1996)中所述。ELISA中使用兩個不同的抗原重組的人P-鈣黏著蛋白(R&DSystems)和表達P-鈣黏著蛋白的A431細胞的融合單細胞層。對ELISA-陽性克隆進行如Vaughan,TJ.etal.，Nat.Biotech.14:309-314(1996)和Osboum，J.K.etal.,Immunotechnology3:293-302(1998)中所述的DNA測序。獨特的ELISA-陽性克隆被轉化為完整IgG分子并檢測它們在實施例4中描述的P-鈣黏著蛋白依賴性粘附測定法中中和P-鈣黏著蛋白的能力。根據(jù)該篩選的結果，抗體129-lc4(在A431粘附測定法中IC50為1-3pM)被選擇為先導親本譜系用于進一歩的優(yōu)化。實施例2:先導物優(yōu)化通過寡核苷酸指導誘變抗體可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VJCD3區(qū)構建來自129-lc4的噬菌體展示文庫。使用如ClacksonandLowman,PhageDisplay-APracticalApproach(OxfordUniversityPress2004)中所述的標準分子生物學技術構建該文庫。由此進行基于親和力的選擇；與文庫孵育后，重組人P-鈣黏著蛋白(R&DSystems)被G蛋白包被的順磁珠(Dynal100.03)捕獲，結合的噬菌體通過磁分離被回收，同時未結合的復合物被洗掉。重復選擇過程，選擇時存在的重組人P-鈣黏著蛋白濃度遞減(4輪中25nM到10pM)。另外，來自VHCDR3和VLCDR3文庫的選擇輸出被重組進另一噬菌體展示文庫，并在另外兩輪基于親和力的選擇中被選擇。來自選擇周期輸出的代表性比例的克隆進行篩選，如實施例8中所述129-lc4表位競爭測定法中的scFv。實施例3:P-鈣黏著蛋白依賴性的粘附測定法使用以下的方案在P-鈣黏著蛋白依賴性的粘附測定法中使用若干個經(jīng)最佳化的scFv測定ICs。值，所述經(jīng)最佳化的scFv在如實施例2中上述的抗體回收最佳化階段中被轉化為IgG。這些抗體的平均測量ICs。值顯示在下表4中。使用前24小時時，用2mMCaCl2的MilliQ水溶液將重組人P-鈣黏著蛋白Fc(R&DCat.861-PC)重建為1mg/mL的濃度并儲存于4°C。如下培養(yǎng)并制備A431細胞。常規(guī)地，將A431細胞(ECACCNo.85090402)在最小必需培養(yǎng)基(MEM)(InvitrogenCat31095)中培養(yǎng)于Nunc三元燒瓶(3x175cm2面積)中，所述最小必需培養(yǎng)基含有10X胎牛血清(InvitrogenCat.10100-147)和lX的非必需氨基酸(InvitrogenCat.11140-035)。在收集用于測定時，經(jīng)培養(yǎng)的細胞約80%融合。為了防止可能的傳代相關小鷹，常規(guī)地使用第4代和第8代之間、在培養(yǎng)48或72小時后收集的細胞。用0.25%胰蛋白酶/1mMEDTA(GibcoCat25200-056)經(jīng)恰好足夠細胞分離的時間(7-10分鐘)收集A431細胞，然后立刻在組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中稀釋為約2x1(f細胞/mL的密度。然后將A431細胞離心(1200rpm)、重懸進測定緩沖液中(Hanks平衡鹽溶液(不含Mg"禾卩Ca2+，不含酚磺酞)(InvitrogenCat.14175-053)，補充為1mM的終CaCl2終濃度)、再離心并再次以2x1(^細胞/mL的終濃度再重懸進測定緩沖液中。如下進行IgG系列稀釋液的制備和與A431細胞的預孵育。180/xL的每種檢測IgG或其部分被補充以20/iL含10%BSA(SigmaCat.A-9576)的測定緩沖液，將BSA濃度標準化為1。％。最初將抗鼠/人P-鈣黏著蛋白參考多克隆抗體(R&DCat.AF-761)重懸進MilliQ水中得到1mg/mL的儲液。然后將40AtL該儲存液進一步稀釋進140^L測定緩沖液中。然后加入20/xL含10%BSA的測定緩沖液，得到200溶液(0.2mg/mL抗體和0.1%BSA)。通過首先向Greiner96孔聚丙烯稀釋板(GrdnerCat.780271)的第一列添加2x90/xL的AF-761多克隆抗體或檢測IgG來制備雙份系列稀釋。然后向第2-ll列加入60/xL測定緩沖液。然后在平板上從左到右從第1-11列制備30mL到60AtL(l:3)的稀釋。然后向孔12A-d中單獨加入60/iL測定緩沖液以定義最大粘附。通過向孔12E-H中添加60pL的25mMEDTA(測定緩沖液中)來定義最小粘附。然后向所有孔中加入60的A431細胞懸浮液(測定緩沖液中2x1(^細胞/mL——如上文下劃線的制備)，攪動后將平板在37"C預孵育1小時。制備測試IgG系列稀釋和與A431細胞預孵育的同時，如下制備P-鈣黏著蛋白包被的測定平板。將重組人P-鈣黏著蛋白Fc在包被緩沖液(不含Mg"和Ca"的PBS-InvitrogenCat.14190-094)中稀釋至10/xg/mL的濃度并分散在Fluoronunc96(NuncCat.437958)孔測定平板(100//L/孔)上。然后將平板在室溫下孵育1到30分鐘。然后使用Tecan96平板洗滌器用PBS洗漆平板3次。然后加入200/xL/孔的測定緩沖液用于封閉，并將平板在室溫下孵育額外的1小時。然后如前所述將平板用PBS洗滌3次。然后將100^L/孔經(jīng)預孵育的IgG/A431材料從Greiner96孔稀釋平板轉移至P-鈣黏著蛋白包被的測定平板中。轉移時通過吸打混合IgG/A431材料，以保證細胞是均相的。然后通過將測定板在37。C孵育30-45分鐘允許粘附過程發(fā)生。孵育結束時，通過將培養(yǎng)基從平板中輕柔抽吸去除未粘附的細胞，并用細胞洗滌緩沖液(補充至1mMCaCl2終濃度的Hanks平衡鹽溶液(不含Mg"+和Ca"并且不含酚磺酞-InvitrogenCat.14175-053)再充填孔。然后將平板倒置于細胞洗滌緩沖液浴中15分鐘以去除殘留的未粘附細胞。該孵育結束時，輕柔抽吸孔的內(nèi)含物。如下進行粘附細胞的定量。通過添加100ml/孔的組合溶解/堿性磷酸酶檢測試劑(用水1:5稀釋的二乙醇胺底物緩沖液5X濃縮物(PierceCat.34064)，之后每25mL的1X溶液中溶解一個15mg的PNPP藥片(SigmaCat.N-2640))然后再37。C孵育30-60分鐘來檢測粘附細胞。然后通過添加1MNaOH(50/xL/孔)終止反應，以得到不存在抑制時約0.8的最大OD值。然后使用標準平板讀數(shù)器測量405nm處的吸光度。然后如下分析結果。第12列、孔A-D作為100%粘附，第12列、孔E-H作為0%粘附，如下將原始數(shù)據(jù)首先轉化為％粘附值%粘附={(粘附值一最小粘附值)/(最大粘附_最小粘附)}*100然后使用Prism軟件計算。X粘附比IgG抑制劑濃度，測定ICs。值。當觀察到部分抑制時，IC5。引用為與曲線中點相比產(chǎn)生真實的50%抑制的IgG濃度。ICM)值報告于表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>進行兩個獨立的A431粘附測定，與其未種系化的等價物相比，研究若干個來自129-lc4譜系的經(jīng)種系化、最優(yōu)化的IgG。就這些實驗而言，必須改變?yōu)橐慌碌腜-鈣黏著蛋白(CFR-134041)，其顯示和比其它數(shù)據(jù)輕微提高的ICso值相關。來自這兩個實驗的針對若干個經(jīng)種系化的IgG的平均數(shù)據(jù)顯示于表5中。如前所述，g-194-b09是指194-b09的經(jīng)種系化版本，等等。<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>實施例4:P-鈣黏著蛋白依賴性的細胞聚集測定法使用以下方案用于在P-鈣黏著蛋白依賴性的聚集測定法中測定ic50值，所述方法使用若干在如上文實施例2所述的抗體回收最佳化階段中被轉化為IgG的經(jīng)最佳化的scFv。因為置于懸液生長中時，過表達P-鈣黏著蛋白的細胞系形成緊密的多細胞聚集體，因此細胞聚集可以在影響細胞聚集的P-鈣黏著蛋白抗體存在時被測量。若干抗體的平均測量IC50顯示于下表6中。如下制備平板。每個96孔測定板用50uL多聚HEMA(12mg/mL溶于90%乙醇、10%甲醇中)包被，然后蒸發(fā)6小時過夜，之后在使用前用3x100uL無菌H20洗滌。然后如下培養(yǎng)細胞。來自人細胞系SW480(穩(wěn)定表達P-鈣黏著蛋白G418D的細胞在完全生長培養(yǎng)基(qsDMEM(inVitrogen11995-065)、10%FBS(OmegaScientificFB-02)、1:100NEAA(InVitrogen11140-050)、1:100丙酮酸鈉(InVitrogen11360-070)、1:100谷氨酰胺(InVitrogen25030-051)、1:100青霉素/鏈球菌溶血素(InVitrogen15070-063)、1:100、遺傳霉素50mg/mL(Invitrogen10131-035))+G418(500ug/mL)中傳代，然后1:3-4每周分傳兩次。然后將培養(yǎng)物冷凍于生長培養(yǎng)基+10%DMSO中。第1天以5x106細胞/100mm平皿、不大于1:3的稀釋度接種SW480:pCAD細胞和對照SW480:pCLNX(穩(wěn)定的對照載體)。細胞然后在培養(yǎng)基中生長48小時。每個100mm平皿提供約10x106的或足夠2x96孔板的細胞。第3天，去除培養(yǎng)基后用dPBS(Dulbecco，sPBS(InVitrogen14040-133))洗漆，之后在3mL/100mm平皿中使細胞受胰蛋白酶作用。用兩體積(6mL)完全生長培養(yǎng)基釋放后進行中和。然后使用10mL的吸量管將平板洗滌三次以破壞聚簇。然后計數(shù)細胞并使用Beckman離心機在1000rpm5分鐘獲得沉淀。吸去培養(yǎng)基，通過手指渦旋隨后p1000吸量管吸打將沉淀首先重懸于<1mL的完全生長培養(yǎng)基中，然后將細胞濃度標準化至1.3M/mL。通過顯微鏡確保單個細胞分散。然后通過用dPBS和5%PBS封閉96孔板30分鐘來制備試劑平板。然后用1x100PLdPBS洗滌平板，隨后抽吸并輕彈至干燥。使用4x[IgG]濃度，用dPBS制備測試IgG的稀釋系列，其足夠96孔中一個孔中處理板的3個孔。30^L/孔中的40000個細胞被等分至96孔的、經(jīng)洗滌的、多聚HEMA包被的Costar3590非組織培養(yǎng)平板(Coming3590)中。然后向96孔板的每個孔轉移10iiL試劑。使用8通道吸量管進行每處理三份樣品。然后在250rpm搖動下在潮濕的37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜(16-18小時)。第4天，將40UL經(jīng)搖動的細胞轉移至聚賴氨酸包被的96孔板(BioCoat聚賴氨酸包被的96孔板BD356516)。然后用60uL完全生長培養(yǎng)基沖洗孔，通過敲打搖動平板，并轉移至涂布有聚賴氨酸的平板。需要時進行額外的50wL洗滌。隨后在潮濕的37°C,5%C02培養(yǎng)箱中孵育60分鐘。在該步驟小心地在數(shù)量上轉移所有的細胞，盡可能輕柔，不要過度吸打。然后通過在通風櫥中添加100yL固定液(7.4%甲醛(37%wt/vol,SigmaF15587))，之后在室溫下孵育>30分鐘來固定細胞。為了洗滌細胞，隨后將液體傾析進收集杯中或碟中并輕彈以去除殘余液體，輕柔地倒在紙巾上。然后添加100uL每孔的dPBS以洗滌，隨后孵育15分鐘。然后通過如上傾析并使用100^LHoescht(dPBS中1g/mLHoescht-Hoescht10mg/mLMolecularProbes33342)，隨后孵育30分鐘將細胞染色。然后洗滌細胞兩次，孔中剩余100uLdPBS用于顯微鏡檢査。然后測量每孔中聚集的物體數(shù)量(Cellomics)，將平均物體計數(shù)(測試IgG)與IgG(例如Gt-抗-P-鈣黏著蛋白R&DSystemsAF761)的或只有培養(yǎng)基的對照相比。然后計算物體計數(shù)比IgG抑制劑的濃度，并測定IC5()值。本發(fā)明若干抗體的ICs。值報告于表6中。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>實施例5:P-鈣黏著蛋白依賴性的球形體破壞測定法以下的球形體破壞測定法是聚集測定法(描述于實施例4)的變體，其中在添加P-鈣黏著蛋白和對照抗體之前過夜形成細胞聚集體。然后在分析前額外的24小時加入測試試劑。如下制備平板。每個96孔測定板用50uL多聚HEMA(90%乙醇、10%甲醇中12mg/mL)包被，然后蒸發(fā)6小時過夜，之后在使用前用3x100uL無菌H20洗滌。然后如下培養(yǎng)細胞。來自人細胞系SW480(穩(wěn)定表達P-鈣黏著蛋白G4iy)的細胞在完全生長培養(yǎng)基(qSDMEM(inVitrogen11995-065)、10%FBS(OmegaScientificFB-02)、1:100NEAA(InVitrogen11140-050)、1:100丙酮酸鈉(InVitrogen11360-070)、1:100谷氨酰胺(InVitrogen25030-051)、1:100青霉素/鏈球菌溶血素(InVitrogen15070-063)、1:100、遺傳霉素50mg/mL(Invitrogen10131-035))+G418(500ug/mL)中傳代，然后1:3-4每周分傳兩次。然后將培養(yǎng)物冷凍于生長培養(yǎng)基+10%DMSO中。第1天以5x106細胞/100mm平皿、不大于1:3的稀釋度接種SW480:pCAD細胞和對照SW480:pCLNX(穩(wěn)定的對照載體)。細胞然后在培養(yǎng)基中生長48小時。每個100mm平皿提供約10x106的或足夠2x96孔板的細胞。第3天，去除培養(yǎng)基后用dPBS(Dulbecco，sPBS(InVitrogen14040-133))洗滌，之后在3mL/100mm平皿中使細胞受胰蛋白酶作用。用兩體積(6mL)完全生長培養(yǎng)基釋放后進行中和。然后使用10mL的吸量管將平板洗滌三次以破壞聚簇。然后計數(shù)細胞并使用Beckman離心機在1000rpm5分鐘獲得沉淀。吸去培養(yǎng)基，通過手指渦旋隨后p1000吸量管吸打將沉淀首先重懸于<1mL的完全生長培養(yǎng)基中，然后將細胞濃度標準化至1.0xl06/mL。通過顯微鏡確保單個細胞分散。40uL/孔中的40000個細胞被等分至96孔的、經(jīng)洗滌的、多聚HEMA包被的Costar3590非組織培養(yǎng)平板(Corning3590)中。然后在250rpm搖動下在潮濕的37°C、5%002培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜(16-18小時)。第4天，通過用dPBS和5%PBS封閉96孔板30分鐘來制備試劑平板。然后用1x100uLdPBS洗滌平板，隨后抽吸并輕彈至干燥。使用5x[IgG]濃度，用dPBS制備測試IgG的稀釋系列，其足夠96孔中一個孔中處理板的3個孔。使用8通道吸量管進行每處理三份樣品。然后在250rpm搖動下在潮濕的37°C、5%(302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(20-24小時)。第5天，將50tlL經(jīng)搖動的細胞轉移至聚賴氨酸包被的96孔板(BioCoat聚賴氨酸包被的96孔板BD356516)。然后用50yL完全生長培養(yǎng)基沖洗孔，通過敲打搖動平板，并轉移至涂布有聚賴氨酸的平板。需要時進行額外的50UL洗滌。隨后在潮濕的37。C,5%C02培養(yǎng)箱中孵育60分鐘。在該步驟小心地在數(shù)量上轉移所有的細胞，盡可能輕柔，不要過度吸打。然后通過在通風櫥中添加100tiL固定液(7.4%甲醛(37%wt/vol,SigmaF15587))，之后在室溫下孵育〉30分鐘來固定細胞。為了洗滌細胞，隨后將液體傾析進收集杯中或碟中并輕彈以去除殘余液體，輕柔地倒在紙巾上。然后添加100uL每孔的dPBS以洗滌，隨后孵育15分鐘。然后通過如上傾析并使用100txLHoescht(dPBS中1g/mLHoescht—Hoescht10mg/mLMolecularProbes33342)，隨后孵育30分鐘將細胞染色。然后洗滌細胞兩次，孔中剩余100wLdPBS用于顯微鏡檢查。然后測量每孔中聚集的物體數(shù)量(Cellomics)，將平均物體計數(shù)(測試IgG)與IgG(例如Gt-抗-P-鈣黏著蛋白R&DSystemsAF761)的或只有培養(yǎng)基的對照相比。然后計算物體計數(shù)比IgG抑制劑的濃度以測定ICso值?；蛘撸矬w計數(shù)被表達為在表7所示的一個確定的濃度下與對照相比的破壞倍數(shù)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>實施例6:測量P-鈣黏著蛋白抗體的K^和如下使用制造商的方案，使用BIACORE3000設備通過表面等離振子共振進行P-鈣黏著蛋白scFv單鏈抗體的親和力測量(Ko和k。ff)。為了進行動力學分析，使用常規(guī)的胺偶合將重組的人P-鈣黏著蛋白/Fc融合蛋白(hCad/Fc)和小鼠P-鈣黏著蛋白/Fc融合蛋白(mCad/Fc)固定在CM5BIACORE傳感器芯片的分離流動單元上。使用含有2.0mMCaCl2的10mM乙酸鹽緩沖液pH4.5作為固定緩沖液制備表面，并達到hCad/FC和mCad/Fc融合蛋白分別為5800和1600RU的蛋白質密度。使用1M鹽酸乙醇胺，pH8.5進行未反應N-羥基琥珀酰亞胺酯的失活。使用激活的/滅活的空白表面作為對照表面。在電泳緩沖液中制備濃度從200nM到0.78nM(包括作為零參考的、只包含電泳緩沖液的OnM溶液)的scFv抗體樣品。將樣品隨機化，并使用HBS-P(10mMHEPESpH7.4，150mMNaCl,0.005%SurfactantP20)—式三份穿過流動單元注射1分鐘，使用2.0mMCaCl2作為電泳緩沖液。使用25uL/分鐘的流速測定親和常數(shù)?？贵w離解被檢測5分鐘，表面通過12秒注射10mM甘氨酸-HClpH1.5(25wL/min)來再生。原始數(shù)據(jù)使用Scrubber(BioLogicSoftware)軟件包加工，使用CLAMP(BioLogicSoftware)軟件包分析。數(shù)據(jù)整體上符合1:1的Langmuir結合模型。表8列出本發(fā)明單鏈抗P-鈣黏著蛋白抗體的親和常數(shù)表8<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>實施例7:測定P-鈣黏著蛋白抗體的選擇性使用以下方案測定多種抗體對P-鈣黏著蛋白超出E-鈣黏著蛋白的選擇性。將重組人P-鈣黏著蛋白(R&DSystems861-PC-100)和重組人E-鈣黏著蛋白(R&DSystems648-EC-100)以1pg/mL在PBS+0.5mMCaCl2中涂布于Exiqon蛋白質固定平板(VWRInternational)的孔上。在從50nM(7.5昭/mL)滴定至0.64nM(0.096)ig/mL)前將樣品IgG在3%Marvel/PBS+0.5mMCaCl2中封閉1小時，雙份加入用兩種不同抗原包被的孔中。在4。C過夜平衡后，將平板用lxPBS/0.1%Tween+0.5mMCaCl2洗滌三次，隨后用1xPBS+0.5mMCaCl2洗滌三次。然后向每個孔中加入501:5000稀釋于3%Marvel/PBS+0.5mMCaCl2中的抗人Fab過氧化物酶綴合物，使其在室溫下平衡1小時。將平板用1xPBS/0.1%Tween+0.5mMCaCl2洗滌三次，用1xPBS+0.5mMCaCl2洗滌三次。向每個孔中加入50pl3，3，，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB;Sigma)，允許反應進行20分鐘，之后通過加入25fiL/well0.5M112804終止反應。在450nm處讀吸光度數(shù)值后，使用GraphpadPrism軟件分析數(shù)據(jù)以計算每個抗體結合P-鈣黏著蛋白和E-鈣黏著蛋白的相對Kd但。得到的數(shù)據(jù)概括在表9中。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>實施例8:表位競爭測定法使用以下的方案在表位競爭測定法中測量IC5Q值以測量親本譜系中變體scFv用親本IgG代替A431細胞表面上天然P-鈣黏著蛋白的能力。用銪鏈霉親和素(europiumstreptavidin)禾nDELFIA定量來檢測存在抑制性scFv時結合的、經(jīng)生物素化的親本IgG的數(shù)量。若干scFv的經(jīng)測量的IC50值顯示在表IO中。使用前一天，將根據(jù)標準方法培養(yǎng)的、隨后在約80%融合時收集的A431細胞(ECACCNo.85090402)以2.5乂104細胞每孔接種在96孔BecktonDickenson(BDCat.6407)膠原包被的平板上。然后通過浸入PBS緩沖液(GibcoCat.14190-094，不含f丐、鎂和碳酸氫鈉)容器中，之后添加200uL每孔的封閉緩沖液(PBSGibcoCat.14190-094，加3%Marvel(PremierInternationalFoodsLtd.))并在室溫下孵育2小時。然后將平板用如上的PBS洗滌3次。對高通量篩選和ICso繪圖而言，首先在Greiner稀釋平板(Greiner96孔聚丙烯平板(GreinerCat.780271))中60yL總體積的測定緩沖液中制備scFv/IgG材料。然后將50uL從被控的Greiner平板直接轉移至測定平板，允許結合反應在室溫下進行2小時30分鐘。結合反應結束時，將平板在PBS中洗滌三次，之后添加銪標記的鏈霉親和素(PerkinElmerCat.1244-360，1:1000稀釋于DELFIA測定緩沖液(PerkinElmerCat.4002-0010)中)，在室溫下再孵育l小時。然后通過重復地將平板浸入緩沖液容器中，用DELFIA洗滌緩沖液(PerkinElmerCat.4010-0010)洗滌平板7次。最后，添加DELFIA增強因子(PerkinElmerCat.4001-0010—100uL/孑L)后，使用標準DELFIA方案在適合的讀數(shù)器(例如Wallac或Envision)上讀數(shù)平板。Greiner稀釋平板裝配-HTS高通量篩選(HTS)條件根據(jù)最佳化的階段而不同地設置。對來自個體Vh和VL鏈最佳化的輸出HTS而言，最終[peri-prep]被設定為12.5%,使得親本scFv給出部分抑制。對來自VH:V^重組文庫輸出的后期HTS而言，最終peri-prep濃度降至1.7%，在這些條件下經(jīng)Vh恍化的基準scFv(TOP-108-C01)給出部分抑制。最優(yōu)化peri-prep濃度使得相關的基準scFv產(chǎn)生部分抑制，這建立了一個鑒定經(jīng)改良克隆的窗口。為了達到這些最終scFvperi-prep濃度，采取以下步驟i)使用Cybiwell設備，將所需體積(見下文)的peri-prep樣品材料從深孔樣品平板中轉移至Greiner稀釋平板的第1-11列。轉移體積[12.5%]=7.5uL=lO.OuL(的1:10稀釋的peri-prep)(通過將10yL純peri-prep從樣品平板轉移進含90^L測定緩沖液的Greiner稀釋平板(使用Cybiwell)來制備1:10預稀釋的peri-prep)ii)然后通過添加合適體積的測定緩沖液將第1-11列的體積補足30UE。iii)然后向第12列(A-D)(完全結合孔)中添加30測定緩沖液。iv)向第12歹ij(E-H)添加30pL測定緩沖液中過量的未標記的親本IgG(129-lc4)以定義非特異性的結合。以1000nM的濃度添加以得到500nM的終濃度。v)使用水溶性試劑EZ-link-NHS-LC-Biotin(Perbio/Pierceproductno.21336)生物素化129-lc4IgG。通過添加1/10體積的1MNaHC。3和1/10體積的二甲基酰胺補充IgG溶液。將EZ-link-NHS-LC-Biotin試劑溶解在DMF中，然后以超出IgG五倍的摩爾數(shù)添加，允許反應在室溫下進行20分鐘。然后通過添加BSA(0.1%)來穩(wěn)定經(jīng)生物素化的IgG。然后向所有孔中添加30/xL的、測定緩沖液中的、經(jīng)生物素化的親本129-lc4IgG，得到最終60AtL體積中1.5nM的終濃度(即以2x終濃度添加銪標記的IgG)。vi)通過攪動混合Greiner平板內(nèi)含物后，將50^L直接轉移至測定平板，允許結合反應在室溫下進行2小時30分鐘(如前文所述)。Greiner稀釋平板裝配一ICso繪圖i)將30iwL/孔測定緩沖液添加至標準Greiner稀釋平板的第2-11列和孔12A到12D。ii)將30ML的、測定緩沖液中的、過量的未標記的129-lc4親本IgG添加至第12列(E-H)中以定義非特異性結合。這應當以1000nM濃度添加以得到500nM的終濃度。iii)向第1列中加入2x45^L每種未稀釋的scFvHis-prep，使得每個96孔測定平板能夠進行4個雙份11點IQo滴定。然后通過從第1列取出15/xL與第2列混合、之后從第2列取出15ML混合進第3列等等，進行1:3的雙份系列稀釋?；旌线M第11列后，去除15/xL(即剩余30//L的終體積)。iv)然后向所有孔中加入30/IL的、測定緩沖液中的、經(jīng)生物素化的129-lc4親本IgG，得到最終60體積中1.5nM的終濃度(即以2x終濃度添加銪標記的IgG)。v)通過攪動混合Greiner平板內(nèi)含物后，將50直接轉移至測定平板，如前文所述允許結合反應在室溫下進行2小時30分鐘。對HTS而言，scFv在96孔板中被表達為來自含MOPS/EDTA/SorbitolpH7.4(MESpH7.4)的基礎緩沖液中的細菌周質膜(scFvperi-prep)的粗提物。就IC50繪圖而言，使用基礎緩沖液中用于親和純化的scFvffis-tag(scFvHis-prep)PBS將scFv表達較低通量的經(jīng)純化的形式。對HTS和IC5。分析二者而言，原始數(shù)據(jù)首先根據(jù)以下等式轉化為％結合數(shù)據(jù)%結合={(結合值一非特異結合)/(總結合一非特異結合)}*100然后使用標準Excel模板進一步分析HTS數(shù)據(jù)，以鑒定與相關基準scFv相比給出更大抑制(更低％結合)的提示。對ICso分析而言，使用Prism4.0版曲線擬合軟件分析％結合數(shù)據(jù)。ScFv是129-lc4親本IgG的變體，其中Vh和VLCDR3區(qū)被隨機突變，如實施例2中所述。VhCDR3変體序列在圖1中顯示為SEQIDNOs:91到256。VLCDR3變體序列在圖1中顯示為SEQIDNOs:257到319。顯示超出親本129-lc4IgG的經(jīng)改進的結合的若干scFv的IQo值顯示在表10中。129-lc4親本的每種scFv變體通過兩個序列SEQIDNOs:VHCDR3和VLCDR3鑒定。作為參考，親本129-lc4IgG的ICso是108.3nM。表IO<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>本說明書所列的所有出版物、專利和專利申請通過引用并入本文，好像每個單獨的出版物或專利申請被明確地、單獨地指出是通過引用并入本文一樣。盡管己經(jīng)就明確理解的目的通過闡述和舉例比較詳細地描述了前述發(fā)明，但是根據(jù)本發(fā)明的教導，本領域常規(guī)技術人員應當容易地明白可以對其進行某些改變和變更，而不偏離所附帶的權利要求書的思想或范圍。權利要求1.具有至少一個選自以下組的特征的抗體或其抗原結合部分，所述組由a)具有大于或等于1.5的KD(E)/KD(P)；b)通過表面等離振子共振測量以50nM或更小的KD與P-鈣黏著蛋白結合；c)對P-鈣黏著蛋白而言，通過表面等離振子共振測量的koff小于或等于0.01s-1；d)通過P-鈣黏著蛋白依賴性細胞黏著測定法測量的IC50為50nM或更??；e)通過P-鈣黏著蛋白依賴性細胞聚集測定法測量的IC50為50nM或更?。籪)在P-鈣黏著蛋白依賴性球狀體破壞測定法中，與無IgG的對照樣品相比球狀體破壞增加因數(shù)為2或更多；g)與選自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4的抗體競爭結合P-鈣黏著蛋白；h)與選自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06129-1c4；和g-129-1c4的抗體交叉競爭結合P-鈣黏著蛋白；i)與選自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4的抗體結合在P-鈣黏著蛋白上相同的表位；j)與選自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4的抗體以基本上相同的KD結合P-鈣黏著蛋白；和k)與選自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4的抗體以基本上相同的koff結合P-鈣黏著蛋白構成。2.如權利要求1所述的抗體或其抗原結合部分，其包含氨基酸序列與SEQIDNOs:13、320、321和322中任一至少90%同一的vh結構域。3.如權利要求1所述的抗體或其抗原結合部分，其包含氨基酸序列與SEQIDNOs:22、326、327和328中任一至少90%同一的V^結構域。4.選自以下組的如權利要求1所述的抗體或抗原結合部分，所述組由a)抗體或其抗原結合部分，其包含如SEQIDNO:13中公開的Vh結構域或因1到10個保守氨基酸取代而與SEQIDNO:13不同的Vh結枸域，和如SEQIDNO:22中公開的Vj吉構域或因1到IO個保守氨基酸取代而與SEQIDNO:22不同的Vi結構域；b)抗體或其抗原結合部分，其包含如SEQIDNO:320中公開的Vh結構域或因1到10個保守氨基酸取代而與SEQIDNO:320不同的Vh結枸域，和如SEQIDNO:326中公開的V^結構域或因1到10個保守氨基酸取代而與SEQIDNO:326不同的V^結構域；c)抗體或其抗原結合部分，其包含如SEQIDNO:321中公開的Vh結構域或因1到10個保守氨基酸取代而與SEQIDNO:321不同的Vh結枸域，和如SEQIDNO:327中公開的vl結構域或因1到IO個保守氨基酸取代而與SEQIDNO:327不同的vl結構域；禾口d)抗體或其抗原結合部分，其包含如SEQIDNO:322中公開的Vh結構域或因1到10個保守氨基酸取代而與SEQIDNO:322不同的Vh結枸域，和如SEQIDNO:328中公開的Vj吉構域或因1到10個保守氨基酸取代而與SEQIDNO:328不同的V^結構域構成。5.如權利要求1所述的抗體或其抗原結合部分，其包含獨立地選自SEQIDNOs:1到13和320到325之任一的VH結構域或因1到10個保守氨基酸取代而與SEQIDNOs:1到13和320到325之任一不同的序列；并還包含獨立地選自SEQIDNOs:14到23和326到331之任一的VL結構域或因1到10個保守氨基酸取代而與SEQIDNOs:14到23和326到331之任一不同的序列。6.如權利要求1所述的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或抗原結合部分包含選自SEQIDNOs:26到37禾D91到256之任一的VHCDR3，或因1個或2個保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:26到37和91到256之任一不同的序列。7.如權利要求1所述的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或抗原結合部分包含選自SEQIDNOs:40到47和257至(J319之任一的VLCDR3，或因1個或2個保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:40到47和257到319之任一不同的序列。8.如權利要求1所述的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或抗原結合部分包含a)如SEQIDNO:24所公開的VHCDR1，或因1個或2個保守的氨基酸取代而與SEQIDNO:24不同的序列；b)如SEQIDNO:25所公開的VHCDR2，或因1個或2個保守的氨基酸取代而與SEQIDNO:25不同的序列；禾口c)選自SEQIDNOs:26到37和91到256之任一的VHCDR3，或因1個或2個保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:26到37和91到256之任一不同的序列。9.如權利要求1所述的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或抗原結合部分包含a)如SEQIDNO:38所公開的VLCDR1，或因l個或2個保守的氨基酸取代而與SEQIDNO:38不同的序列；b)如SEQIDNO:39所公開的VLCDR2，或因1個或2個保守的氨基酸取代而與SEQIDNO:39不同的序列；和c)選自SEQIDNOs:40到47和257至(J319之任一的VLCDR3，或因1個或2個保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:40到47和257到319之任一不同的序列。10.抗體或其抗原結合部分，其中VH結構域包含SEQIDNOs:13、320、321禾n322之任一，或因1至(J10個保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:13、320、321和322之任一不同的序列；禾卩VL結構域包含SEQIDNOs:22、326、327和328之任一，或因l到10個保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:22、326、327和328之任一不同的序列。11.如權利要求1妾U10任一項所述的抗體，其為IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子，或由這些獲得。12.如權利要求ll所述的抗體，其中IgG為IgG,，其中重鏈恒定區(qū)包含SEQIDNO:344，其中輕鏈恒定區(qū)包含SEQIDNO:345，并且SEQIDNO:344的C-端賴氨酸殘基任選地被切割。13.藥物組合物，其包含如權利要求1到12任一項所述的抗體或抗原結合部分和藥物可接受載體。14.經(jīng)分離的核酸分子，其包含如SEQIDNOs:80、89、332、333、334、338、339和340中任一所公開的核苷酸序列。15.如權利要求1所述的抗體或其抗原結合部分，其包含利用人VH-3家族基因的重鏈可變區(qū)氨基酸序列。全文摘要本發(fā)明涉及抗體，其包括人抗體及其抗原結合部分，其結合P-鈣黏著蛋白，并且發(fā)揮抑制P-鈣黏著蛋白的作用。本發(fā)明還涉及來自人P-鈣黏著蛋白抗體的重鏈和輕鏈免疫球蛋白，以及編碼這類免疫球蛋白的核酸分子。本發(fā)明還涉及制造人P-鈣黏著蛋白抗體的方法、包含這些抗體的組合物和使用所述抗體和組合物的方法。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸分子的轉基因動物或植物。文檔編號C07K16/28GK101184778SQ200680014282公開日2008年5月21日申請日期2006年4月13日優(yōu)先權日2005年4月26日發(fā)明者克里斯托弗·托德·保爾,大衛(wèi)·威廉·格里格斯,威廉·迪恩·卓恩,孟拉尼·波耶勒,巴雷特·理查德·思伊拉,托德·李·瓦納斯達勒,拉爾夫·雷蒙德·米特爾,杰拉爾德·菲爾斯·加斯波森,理查德·大衛(wèi)·漢德,理查德·艾倫·瑪扎艾勒,莫琳·杰瑞·鮑內(nèi),馬克·艾倫·莫法特申請人:輝瑞有限公司