專利名稱：胰高血糖素樣肽-2(glp-2)類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)類似物及其醫(yī)藥用途，例如在預(yù)防或治療胃和腸相關(guān)病癥以及減輕化學(xué)療法和放射療法的副作用中的用途。

背景技術(shù)：
GLP-2是胰高血糖素原在腸的腸內(nèi)分泌L細(xì)胞以及腦干特定區(qū)域中翻譯后加工所釋放的33個氨基酸的肽。它與胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、胃泌酸調(diào)節(jié)素和腸高血糖素(glicentin)一起應(yīng)答于養(yǎng)分?jǐn)z食而共分泌。
GLP-2通過刺激隱窩中干細(xì)胞增殖和抑制絨毛凋亡來誘導(dǎo)小腸粘膜上皮的顯著生長(Drucker等Proc Natl Acad Sci U S A.1996，937911-6)。GLP-2還抑制胃排空和胃酸分泌(Wojdemann等J ClinEndocrinol Metab.1999，842513-7)、增強(qiáng)腸屏障功能(Benjamin等.Gut.2000，47112-9)、通過上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來刺激腸的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)(Cheeseman，.Am J Physiol.1997，R1965-71)以及提高腸的血流量(Guan等Gastroenterology.2003，125，136-47)。
GLP-2與屬于II類胰高血糖素分泌家族(1)的單G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合。GLP-2受體僅局限于小腸、結(jié)腸和胃中，這些部位是已知應(yīng)答于GLP-2的部位(Yusta等.Gastroenterology.2000，119744-55)。然而，胃腸道中GLP-2受體刺激的靶細(xì)胞仍不清楚，并且對與GLP-2偶聯(lián)的下游胞內(nèi)中介體的了解甚少。
GLP-2在小腸中已被證實(shí)的特異性并有益的效果已經(jīng)引起了人們在治療腸疾病或損傷中使用GLP-2的極大興趣(Sinclair和Drucker，Physiology 2005357-65)。而且，已顯示GLP-2在多種臨床前腸損傷模型中預(yù)防或降低粘膜上皮損傷，所述模型包括化學(xué)療法誘導(dǎo)的粘膜炎、缺血-再灌注損傷、硫酸葡聚糖誘導(dǎo)的結(jié)腸炎以及炎性腸病的遺傳模型(Sinclair and Drucker Physiology 2005357-65)。
GLP-2以具有以下序列的33個氨基酸的肽的形式分泌H-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH。其迅速地被酶DPP IV在NH2端的2位丙氨酸(A)處切割，以形成失活的人GLP-2(3-33)。除了腎清除之外，GLP-2(1-33)的這種快速酶降解導(dǎo)致該肽的半衰期為約7分鐘(Tavares等，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.278E134-E139，2000)。
US5,994,500(Drucker等)描述了GLP-2拮抗劑及其對胃腸組織生長的影響。其提出了將所述拮抗劑配制成藥物用于治療增生或誘導(dǎo)發(fā)育不全。美國5,994,500通過突變例如替換和缺失來改變哺乳動物GLP-2的結(jié)構(gòu)。
US6,184,208、US5,789,379和US6,184,201公開了GLP-2類似物及其醫(yī)藥用途。所述類似物全是通過人GLP-2的替換和/或缺失得到的。
DaCambra等(Biochemistry 2000，39，8888-8894)描述了GLP-2活性的結(jié)構(gòu)決定簇。這樣的決定簇的實(shí)例是Phe6和Thr5，所述Phe6和Thr5稱為對GLP-2受體結(jié)合和活化是至關(guān)重要的。
WO97/39031公開了GLP-2類似物[Gly2]GLP-2。其中2位的丙氨酸被甘氨酸取代，以使所述肽抵抗DPP IV切割。顯示丙氨酸的取代提高所述肽的穩(wěn)定性和效能(potency)。該專利申請描述了如何使用GLP-2類似物對抗腸上皮粘膜炎癥和破壞相關(guān)的疾病。它們包括大規(guī)模小腸切除、炎性腸病、化學(xué)療法誘發(fā)的粘膜炎以及缺血性損傷。
WO02/066511描述了體內(nèi)半衰期延長的GLP-2類似物及其作為治療胃腸病癥如炎性腸疾病的藥物的用途。
WO01/41779描述了h[Gly2]GLP-2用作抑制化學(xué)療法誘導(dǎo)的凋亡和促進(jìn)細(xì)胞存活的預(yù)處理的用途。
本文引用的所有參考文獻(xiàn)明確地以其整體通過參考并入本文。
許多科學(xué)家已經(jīng)提出使用GLP-2或GLP-2類似物治療多種疾病。然而，仍然存在對改善的、穩(wěn)定的GLP-2類似物的需要。


發(fā)明內(nèi)容
寬泛而言，本發(fā)明涉及GLP-2類似物，其與野生型GLP-2相比包含一種或多種替換，并且可能具有體內(nèi)生物活性改善和/或化學(xué)穩(wěn)定性(例如體外穩(wěn)定性測定中評估的穩(wěn)定性)改善的特點(diǎn)。更具體地，本發(fā)明優(yōu)選的GLP-2類似物包含野生型GLP-2序列8位、16位、24位和/或28位中一個或多個位置上的替換，其任選地與2位(如引言所述)以及3、5、7、10和11位中一個或多個位置的其他替換和/或野生型GLP-2序列31至33位中一個或多個氨基酸的缺失和/或N-端或C-端穩(wěn)定肽序列的添加組合。除了提供可能具有改善的化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物活性的GLP-2類似物之外，本發(fā)明還涉及提供這樣的化合物其在小腸中比在結(jié)腸中具有優(yōu)選的腸生長促進(jìn)活性，反之亦然，尤其是通過包含野生型GLP-2 Asp3和/或Ser8和/或Asn16和/或Asn24和/或Gln28位中一個或多個位置上的修飾而產(chǎn)生的化合物。
因此，在一個方面中，本發(fā)明提供通式I代表的GLP-2類似物或其可藥用鹽或衍生物 R1-Z1-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X20- X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2 其中 R1為氫、C1-4烷基(例如甲基)、乙?；?、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙?；? X2為Gly、Ala或Sar X3為Glu或Asp X5為Ser或Thr X6為Phe或Pro X7為Ser或Thr X8為Asp或Ser X9為Glu或Asp X10為Met、Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸 X11為Asn、Ala、Lys或Ser X12為Thr或Lys X13為Ile、Glu或Gln X14為Leu、Met或Nle X15為Asp或Glu X16為Asn或Ala X17為Leu或Glu X18為Ala或Aib X19為Ala或Thr X20為Arg或Lys X21為Asp或Ile X24為Asn、Ala或Glu X28為Gln、Ala或Asn X31為Pro、Ile或缺失 X32為Thr或缺失 X33為Asp、Asn或缺失 R2為NH2或OH； Z1和Z2獨(dú)立地為不存在或選自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn的3至20個氨基酸單位的肽序列；并且其中所述GLP-2類似物包含選自以下的一種或多種替換 X8為Ser和/或X16為Ala和/或X24為Ala和/或X28為Ala。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式II代表的GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物 R1-Z1-His-Gly-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-Arg- Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2 其中 R1為氫、C1-4烷基(例如甲基)、乙?；⒓柞；⒈郊柞；蛉阴；? X3為Glu或Asp X5為Ser或Thr X7為Ser或Thr X8為Asp或Ser X9為Glu或Asp X10為Met、Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸 X11為Asn、Ala、Lys或Ser X12為Thr或Lys X13為Ile、Glu或Gln X14為Leu、Met或Nle X15為Asp或Glu X16為Asn或Ala X17為Leu或Glu X19為Ala或Thr X24為Asn或Ala X28為Gln、Ala或Asn X31為Pro、Ile或缺失 X32為Thr或缺失 X33為Asp或缺失 R2為NH2或OH； Z1和Z2獨(dú)立地為不存在或選自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn的3至20個氨基酸單位的肽序列；并且其中所述GLP-2類似物包含選自以下的一種或多種替換X8為Ser和/或X16為Ala和/或X24為Ala和/或X28為Ala。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式III代表的GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物 R1-Z1-His-Gly-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-Glu-X10-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-X16-Leu-Ala-Ala-Arg- Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2 其中 R1為氫、C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲?；蛉阴；? X3為Glu或Asp X5為Ser或Thr X7為Ser或Thr X8為Asp或Ser X10為Met、Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸 X11為Asn、Ala、Lys或Ser X24為Asn或Ala X28為Gln或Ala X31為Pro或缺失 X32為Thr或缺失 X33為Asp或缺失 R2為NH2或OH； Z1和Z2獨(dú)立地為不存在或選自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn的3至20個氨基酸單位的肽序列；并且其中所述GLP-2類似物包含選自以下的一種或多種替換X8為Ser和/或X16為Ala和/或X24為Ala和/或X28為Ala。X16不是Ala時，它將是Asn。
在某些實(shí)施方案中，當(dāng)存在Z1時，R1可以是H，當(dāng)存在Z2時，R2可以是OH。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，GLP-2類似物與具有本申請引言中所公開序列的野生型GLP-2(1-33)具有至少60％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少63％的序列同一性，更優(yōu)選至少66％的序列同一性，并且還更優(yōu)選至少69％的序列同一性。
就GLP-2多肽序列而言，“氨基酸序列同一性百分比(％)”定義為候選序列中與野生型GLP-2序列中氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比，所述定義在以下步驟后得出比對序列和必要時引入缺口以實(shí)現(xiàn)最高序列同一性百分比，并且不將任何保守性替換認(rèn)為是序列同一性的一部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)例如使用公眾可用的軟件如BLAST、BLAST2或Align軟件進(jìn)行序列比對，比對程序參閱AItschul等(Methods in Enzymology，266460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html)或Pearson等(Genomics，46，24，36，1997)和http://molbiol.soton.ac.uk/compute/align.html。
使用這些程序及其默認(rèn)設(shè)置測定本文使用的以及根據(jù)本發(fā)明的序列同一性百分比。更一般地，技術(shù)人員能夠容易地確定用于測定比對的適當(dāng)參數(shù)，包括在所比較序列的全長上實(shí)現(xiàn)最佳比對所需的任何算法。
在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，式I、II或III代表的GLP-2肽類似物包含X8、X16、X24和/或X28位中一個以上位置上的替換和/或這些替換與其它替換的組合，優(yōu)選與X3、X5、X7、X10和/或X11位替換組合。
落入式I至III的X8位、X16位、X24和/或X28位替換組合的實(shí)例包括 Ser8，Ala16 Ser8，Ala24 Ser8，Ala28 Ala16，Ala24 Ala16，Ala28 Ala24，Ala28 Ser8，Ala16，Ala24 Ser8，Ala1 6，Ala28 Ser8，Ala24，Ala28 Ala16，Ala24，Ala28 Ser8，Ala1 6，Ala24，Ala28。
落入式I至III并且可與X8、X16、X24和/或X28位中一個或多個位置上的替換組合的X3、X5、X7、X10和/或X11位替換的實(shí)例包括 Glu3，Leu10，Ala11，24 Glu3，Thr5，Leu10，Ser11，Ala16，24，28 Glu3，Thr5，Leu10，Lys11，Ala16，24，28 Glu3，Thr5，Ser8，Leu10，Lys11，Ala16，24，28 Glu3，Thr5，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28 Glu3，Thr5，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28 Glu3，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28 Glu3，Leu10，Ser11，Ala16，24，28 Glu3，Leu10，Lys11，Ala16，24，28 Glu3，Thr5，Leu10，Ala11，16，24，28 Glu3，Thr5，Leu10，Ala11，16，24，26，Ile21 Glu3，Thr5，Ser8，Leu10，Ala11，16，24，28 Glu3，Ser8，Leu10，Ala11，16，24，28 Glu3，Leu10，Ala11，16，24，28 Thr7，Leu10，Ala11，24 Thr7，Leu10，Lys11，Ala24 Thr7，Leu10，Ser11，Ala24 Thr7，Leu10，Ser8，11，Ala24 Thr7，Ser8，Leu10，Ala11，24 Thr7，Ser8，Leu10，Lys11，Ala24 Ser8，Leu10，Ala11，24 Leu10，Ala24 Leu10，Ala11，Ala24 Leu10，Ala11，24，28 Leu10，Ala11，16，24，28 Leu10，Lys11，Ala24 Leu10，Ser11，Ala24 Leu10，Ser8，11，Ala24 或與上述8、16、24和/或28位變化組合的X31-X33位中一個或多個位置上的缺失。
下文的詳細(xì)描述中公開了本發(fā)明GLP-2化合物的具體實(shí)例。
除了提供可能改善了化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物活性的GLP-2類似物以外，本發(fā)明還涉及提供這樣的化合物其在小腸中具有比在結(jié)腸中優(yōu)選的生長促進(jìn)活性，反之亦然。具體而言，本文描述的實(shí)驗(yàn)顯示，在對測試動物施用時，與結(jié)腸質(zhì)量增加相比較，野生型GLP-2中Asp3和/或Ser8和/或Asn16和/或Asn24和/或Gln28位的替換提供優(yōu)選的小腸重量增加。這些發(fā)現(xiàn)意味著示例性化合物可用于治療這樣的病癥其中在小腸中具有提高的生長促進(jìn)效應(yīng)而在結(jié)腸中效應(yīng)較低是有利的，反之亦然。
因此，優(yōu)選用于引起小腸生長的化合物一般包含野生型GLP-2中3、8、16和/或28位中一個或多個位置上的替換。這樣的化合物可選擇性地引起小腸而不是結(jié)腸的生長。因此，它們可用于影響或涉及小腸的病癥。
優(yōu)選地，這樣的小腸選擇性化合物包含X3、X7、X16、X24、X28、X31、X32和/或X33位中一個以上位置上的替換。因此，小腸選擇性化合物可包含一個以上的下列替換X3為Glu、X7為Ser、X16為Ala、X24為Ala、X28為Ala、X31為Ile、X32為Thr和X33為Asp。可任選地缺失X31、X32和X33位的氨基酸殘基。
優(yōu)選刺激小腸中上皮生長的示例性化合物包括1809、1818、1819、1820、1826、1827、1844、1845、1846、1848、1849、1850、1851、1852、1853、1855、1857、1858、1859。
另一方面，不具有這些改動的本發(fā)明化合物，例如包含10、11和/或24位中一個或多個位置上的替換的本發(fā)明化合物可能優(yōu)選用于誘導(dǎo)結(jié)腸而不是小腸生長。因此，它們可用于治療影響或涉及結(jié)腸的病癥。
這樣的結(jié)腸選擇性化合物可包含X3、X8和/或X24位中一個以上位置上的替換。例如，它們可包含一個以上選自X3為Asp、X8為Asp和X24為Ala的替換?？梢匀芜x地缺失X31、X32和X33位的氨基酸殘基。
優(yōu)選地刺激結(jié)腸中上皮生長的示例性化合物包括1830、1831、1835、1836、1839、1840、1841和1843。
不引起小腸或結(jié)腸優(yōu)選生長的示例性化合物[Gly2]GLP-2(即參照分子)、1559、1821、1822、1823、1825、1828、1829、1832、1833、1834、1842、1854。
本發(fā)明的化合物還具有提高的化學(xué)穩(wěn)定性，例如針對酸水解、氧化和脫酰胺作用的穩(wěn)定性。相信X3和/或X33位的替換可提高對酸水解的穩(wěn)定性。X10位的替換可提高氧化穩(wěn)定性。X11、X16和/或X24位中一個或多個位置的替換可提高針對脫酰胺作用的穩(wěn)定性，因此，相對于Gly2-GLP-2，本發(fā)明的GLP-2類似物可顯示出針對酸性溶液中降解、針對脫酰胺作用和/或針對氧化降解的穩(wěn)定性的增強(qiáng)。
優(yōu)選地，所述GLP-2類似物維持下文實(shí)施例7所述至少一個降解測試中起始純度的至少70％的觀察純度。作為補(bǔ)充或替代，其在12天后可維持0.1M HCl溶液中起始純度的至少60％的觀察純度。作為補(bǔ)充或替代，其在6天后可維持0.1M NH4HCO3溶液中起始純度的至少70％的觀察純度。
在另一方面中，本發(fā)明提供包含與載體混合的本文定義的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物的組合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物為可藥用組合物，所述載體為可藥用載體。GLP-2肽類似物可以是GLP-2類似物的可藥用酸加成鹽。
在另一方面中，本發(fā)明提供用于治療的本文定義的GLP-2類似物或其鹽。
在另一方面中，本發(fā)明提供GLP-2類似物或者其鹽或衍生物用于制備治療和/或預(yù)防胃和腸相關(guān)病癥的藥物中的用途，比如治療患有腸功能受損、骨質(zhì)疏松和DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)的病癥的新生兒。例如，所述胃和腸相關(guān)病癥包括潰瘍、胃炎、消化病癥、吸收不良綜合征、短腸綜合征(short gut syndrome)、盲管綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉(例如由麩質(zhì)誘發(fā)的腸病或乳糜瀉病引起)、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、局限性腸炎(克羅恩病)、潰瘍性結(jié)腸炎、腹瀉相關(guān)的腸易激綜合征、小腸損傷或短腸綜合征(short bowel syndrome)。
可用本發(fā)明GLP-2類似物治療或可使用GLP-2類似物進(jìn)行預(yù)防或治療的其它病癥包括放射性腸炎、傳染性腸炎或感染后腸炎以及由于毒劑或其它化學(xué)治療劑引起的小腸損傷。這可能需要在化學(xué)療法或放射療法的療程之前、同時或之后施用GLP-2類似物，以降低化學(xué)療法的副作用例如腹瀉、腹部痛性痙攣和嘔吐，以及降低其后由化學(xué)療法或放射療法引起的腸上皮結(jié)構(gòu)和功能損傷。
因此，本發(fā)明還提供治療藥盒，其包含癌癥放射療法藥物和本發(fā)明的GLP-2類似物，其中每一種均任選地與可藥用載體組合。所述兩種治療劑可以分開包裝(例如在分開的瓶中)以分別施用，或可以在同一組合物中提供。因此本發(fā)明還提供包含與可藥用載體組合的癌癥化學(xué)療法藥物和本發(fā)明GLP-2類似物的藥物組合物。
對于患有胃腸粘膜瘤形成或胃腸粘膜瘤形成風(fēng)險提高的患者，可能期望選擇化合物以降低或消除已降低副作用(例如刺激或加重胃腸粘膜瘤形成)的風(fēng)險。例如，選擇用于治療患有結(jié)腸瘤形成(良性或惡性)或有發(fā)生結(jié)腸瘤形成風(fēng)險的患者的化合物時，選擇對小腸的選擇性高于結(jié)腸的化合物比非選擇性化合物或?qū)Y(jié)腸的選擇性高于小腸的化合物可能更合適。
在其他方面中，本發(fā)明提供GLP-2類似物用于制備治療和/或預(yù)防營養(yǎng)不良(例如消耗綜合征惡病質(zhì)和厭食癥之類的病癥)的藥物的用途。
在其他方面中，本發(fā)明提供包含編碼本文定義GLP-2類似物的核酸序列的核酸分子。
在其他方面中，本發(fā)明提供包含任選地與指導(dǎo)其表達(dá)的序列組合的上述核酸序列的表達(dá)載體，以及用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞能夠表達(dá)并分泌GLP-2類似物。在另一方面中，本發(fā)明提供生產(chǎn)GLP-2類似物的方法，所述方法包括在適于表達(dá)所述GLP-2類似物的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞和純化這樣制備的GLP-2類似物。
本發(fā)明還提供用于治療的本發(fā)明核酸、本發(fā)明表達(dá)載體或者能夠表達(dá)并分泌本發(fā)明GLP-2類似物的宿主細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，所述核酸、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞可用于治療任何可用GLP-2類似物本身進(jìn)行治療的本文所述病癥。因此提到包含本發(fā)明GLP-2類似物的治療組合物或施用本發(fā)明的GLP-2類似物時，應(yīng)解釋為包括施用本發(fā)明的核酸、表達(dá)載體或宿主細(xì)胞，除非其上下文中另有說明。
在另一方面中，本發(fā)明提供通過施用有效量的本文定義的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物或者本發(fā)明的核酸、表達(dá)載體或宿主細(xì)胞來治療有此需要的患者中胃和腸相關(guān)病癥的方法。上文提供了胃和腸相關(guān)病癥的實(shí)例。
在另一方面中，本發(fā)明提供治療或預(yù)防有此需要的患者中化學(xué)療法或放射療法副作用的方法，所述方法包括施用有效量的本文定義的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物或者本發(fā)明的核酸、表達(dá)載體或宿主細(xì)胞。
在另一方面中，本發(fā)明提供治療和/或預(yù)防有此需要的患者中營養(yǎng)不良(例如消耗綜合征惡病質(zhì)和厭食癥之類的病癥)的方法，所述方法包括施用有效量的本文定義的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物或者本發(fā)明的核酸、表達(dá)載體或宿主細(xì)胞。
用于舉例而非限制地，現(xiàn)參照附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明的實(shí)施方案。



圖1四種小腸選擇性化合物(化合物編號1846、1855、1848和1858)在C57BL小鼠小腸(SI)質(zhì)量上的完全劑量-應(yīng)答數(shù)據(jù)的實(shí)施例。在三天中每日兩次皮下注射施用以下劑量的化合物0(載體)、5、15、45、135、405nmol/kg(n＝6/劑量組)。將每個劑量下水平的應(yīng)答與采用非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2治療的配對治療小鼠中相同劑量水平下得到的應(yīng)答進(jìn)行比較。為了校正體重(BW)變化，SI質(zhì)量表達(dá)為與BW的相對值(SI-BW比值)，并且用非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2觀察到的應(yīng)答將每個劑量水平下的生長應(yīng)答歸一化。結(jié)果證明，在5至405nmol/kg的劑量范圍內(nèi)，小腸選擇性化合物1846、1855、1848和1858的劑量-應(yīng)答關(guān)系與非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2存在顯著差異(p＜0.05，兩因素ANOVA)，所有四種化合物均以顯著高于[Gly2]GLP-2的最大應(yīng)答刺激小腸生長。值為平均值±SEM。*相對于等摩爾劑量[Gly2]GLP-2的p＜0.05。
圖2，四種小腸選擇性化合物(化合物編號1846、1855、1848、1858)在小腸(SI)-結(jié)腸敏感性指標(biāo)上相對于非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2的完全劑量-應(yīng)答數(shù)據(jù)的實(shí)施例。在三天中每日兩次對C57BL小鼠皮下注射施用以下劑量的化合物0(載體)、5、15、45、135、405nmol/kg(n＝6/劑量組)。將每個劑量下水平的應(yīng)答與采用非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2治療的配對治療小鼠中相同劑量水平下得到的應(yīng)答進(jìn)行比較。SI-結(jié)腸敏感性指標(biāo)計算為相對于結(jié)腸質(zhì)量的SI質(zhì)量，并且用非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2觀察到的應(yīng)答將每個劑量水平下的敏感性指標(biāo)歸一化。結(jié)果證明，在5至405nmol/kg劑量范圍內(nèi)，小腸選擇性化合物1857和1820的劑量-應(yīng)答關(guān)系與非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2存在顯著差異(p＜0.05，兩因素ANOVA)，相對于[Gly2]GLP-2，化合物1846、1855和1848均顯示最高小腸敏感性的提高。值為平均值±SEM。*相對于等摩爾劑量[Gly2]GLP-2的p＜0.05。
圖3兩種小腸選擇性化合物(化合物編號1857、1849和1820)在C57BL小鼠小腸(SI)質(zhì)量上的全部劑量-應(yīng)答數(shù)據(jù)的實(shí)施例。在三天中每日兩次皮下注射施用以下劑量的化合物0(載體)、5、15、45、135、405nmol/kg(n＝6/劑量組)。將每個劑量下水平的應(yīng)答與采用非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2治療的配對治療小鼠中相同劑量水平下得到的應(yīng)答進(jìn)行比較。為了校正體重(BW)變化，SI質(zhì)量表達(dá)為與BW的相對值(SI-BW比值)，并且用非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2觀察到的應(yīng)答將每個劑量水平下的生長應(yīng)答歸一化。結(jié)果證明，在5至405nmol/kg的劑量范圍內(nèi)，小腸選擇性化合物1857、1849和1820的劑量-應(yīng)答關(guān)系與非選擇性參照化合物[Gly2] GLP-2存在顯著差異(p＜0.05，兩因素ANOVA)，兩種化合物均以顯著高于[Gly2]GLP-2的最大應(yīng)答刺激小腸生長。值為平均值±SEM。*相對于等摩爾劑量[Gly2]GLP-2的p＜0.05。
圖4三種小腸選擇性化合物(化合物編號1857、1820、1849)在小腸(SI)-結(jié)腸敏感性指標(biāo)上相對于非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2的完全劑量-應(yīng)答數(shù)據(jù)的實(shí)施例。在三天中每日兩次對C57BL小鼠皮下注射施用以下劑量的化合物0(載體)、5、15、45、135、405nmol/kg(n＝6/劑量組)。將每個劑量下水平的應(yīng)答與采用非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2治療的配對治療小鼠中相同劑量水平下得到的應(yīng)答進(jìn)行比較。SI-結(jié)腸敏感性指標(biāo)計算為相對于結(jié)腸質(zhì)量的SI質(zhì)量，并且用非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2觀察到的應(yīng)答將每個劑量水平下的敏感性指標(biāo)歸一化。結(jié)果證明，在5至405nmol/kg劑量范圍內(nèi)，小腸選擇性化合物1857、1820和1849的劑量-應(yīng)答關(guān)系與非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2存在顯著差異(p＜0.05，兩因素ANOVA)，相對于[Gly2]GLP-2，全部三種化合物均顯示最高小腸敏感性的提高。值為平均值±SEM。*相對于等摩爾劑量[Gly2]GLP-2的p＜0.05。
圖5非選擇性化合物([Gly2]GLP-2)和小腸選擇性化合物(化合物1848)在小腸、結(jié)腸和胃質(zhì)量上的完全劑量-應(yīng)答數(shù)據(jù)的實(shí)施例。在三天中每日兩次對C57BL小鼠皮下注射施用以下劑量的化合物0(載體)、5、15、45、135、405nmol/kg(n＝6/劑量組)。結(jié)果證明，在5至405nmol/kg劑量范圍內(nèi)，[Gly2]GLP-2在小腸、結(jié)腸和胃中產(chǎn)生劑量依賴性生長刺激，而化合物1848僅在小腸中產(chǎn)生劑量依賴性生長刺激。值為平均值±SEM。*相對于載體的p＜0.05。
圖6顯示化合物1846(5、15、45、135、405和810nmol/kg，皮下，每日兩次，n＝6/劑量組)對采用細(xì)胞抑制藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)處理的小鼠中A)小腸-體重比(SI-BW)和B)小腸長度(SI長度)的影響的實(shí)施例?；衔?846在施用每日一次腹膜內(nèi)注射的50mg/kg5-FU之前施用3天，然后與5-FU一起施用4天。作為參照，對一組動物給予[Gly2]GLP-2(405nmol/kg)。還顯示了僅使用載體(PBS)或5-FU處理的對照動物的結(jié)果?；衔?846阻止了C57BL小鼠中5-FU誘導(dǎo)的小腸萎縮(器官質(zhì)量減少和縮短)。值為平均值±SEM。*相對于5-FU的p＜0.05。
圖7顯示化合物1848(5、15、45、135、405和810nmol/kg，皮下，每日兩次，n＝6/劑量組)對采用細(xì)胞抑制藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)處理的小鼠中A)小腸-體重比(SI-BW)和B)小腸長度(SI長度)的影響的實(shí)施例?；衔?848在施用每日一次腹膜內(nèi)注射的50mg/kg5-FU之前施用3天，然后與5-FU一起施用4天。作為參照，對一組動物給予[Gly2]GLP-2(405nmol/kg)。還顯示了僅使用載體(PBS)或5-FU處理的對照動物的結(jié)果?；衔?848阻止了C57BL小鼠中5-FU誘導(dǎo)的小腸萎縮(器官質(zhì)量減少和縮短)，并且高劑量的化合物1848比[Gly2]GLP-2更有效。值為平均值±SEM。*相對于[Gly2]GLP-2的p＜0.05。
圖8顯示化合物1855(5、15、45、135和405nmol/kg，皮下，每日兩次，n＝6/劑量組)對采用細(xì)胞抑制藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)處理的小鼠中A)小腸-體重比(SI-BW)和B)小腸長度(SI長度)的影響的實(shí)施例。化合物1855在施用每日一次腹膜內(nèi)注射的50mg/kg5-FU之前施用3天，然后與5-FU一起施用4天。作為參照，對一組動物給予[Gly2]GLP-2(405nmol/kg)。還顯示了僅使用載體(PBS)或5-FU處理的對照動物的結(jié)果。化合物1855阻止了C57BL小鼠中5-FU誘導(dǎo)的小腸萎縮(器官質(zhì)量減少和縮短)，并且最高劑量的化合物1855比等摩爾劑量的[Gly2]GLP-2更有效。值為平均值±SEM。*相對于[Gly2]GLP-2的p＜0.05。
圖9顯示化合物1857(5、15、45、135和405nmol/kg，皮下，每日兩次，n＝6/劑量組)對采用細(xì)胞抑制藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)處理的小鼠中A)小腸-體重比(SI-BW)和B)小腸長度(SI長度)的影響的實(shí)施例。化合物1857在施用每日一次腹膜內(nèi)注射的50mg/kg5-FU之前施用3天，然后與5-FU一起施用4天。作為參照，對一組動物給予[Gly2]GLP-2(405nmol/kg)。還顯示了僅使用載體(PBS)或5-FU處理的對照動物的結(jié)果。化合物1857阻止了C57BL小鼠中5-FU誘導(dǎo)的小腸萎縮(器官質(zhì)量減少和縮短)，并且最高劑量的化合物1857比等摩爾劑量的[Gly2]GLP-2更有效。值為平均值±SEM。*相對于[Gly2]GLP-2的p＜0.05。
圖10顯示化合物1846(16、80和400nmol/kg/天，皮下，n＝6/劑量組)在用細(xì)胞抑制藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)處理的雄性Spague-Dawley大鼠中的作用的實(shí)施例?；衔?846在施用每日一次腹膜內(nèi)注射的75mg/kg 5-FU之前施用3天，然后與5-FU一起施用4天。將結(jié)果與僅使用載體(鹽水)或5-FU處理對照動物中的應(yīng)答進(jìn)行比較。還顯示了鹽水和5-FU對照?；衔?846阻止了大鼠中5-FU誘導(dǎo)的小腸萎縮(小腸質(zhì)量減少和腸縮短)。值為平均值±SEM。*相對于僅有5-FU的p＜0.05，。
圖11該實(shí)施例展示化合物1846對由細(xì)胞抑制藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)處理誘發(fā)的腹瀉的影響。每日一次用5-FU 75mg/kg處理大鼠4天(第1至4天)；(n＝40只大鼠)。在5-FU處理之前最后3天(第-3至-1天)和5-FU處理的4天(第0至3天)中，半數(shù)動物接受化合物1846(400nmol/kg，皮下，每日一次)的其他處理。每日兩次(早晨和傍晚)觀察大鼠以確定動物是否發(fā)生腹瀉，并且根據(jù)以下尺度對腹瀉的嚴(yán)重程度進(jìn)行評分(0)無腹瀉；(1)輕度-肛門周圍糞便污染；(2)中度-后肢和尾巴糞便污染；和(3)重度-前肢和腹部糞便污染。第5天，約70％僅接受5-FU的Sprague Dawley大鼠發(fā)生腹瀉(圖11A)，而僅30％與化合物1846共處理的大鼠發(fā)生腹瀉(圖11B)。這些結(jié)果表明化合物1846有效地防止小腸損傷，從而在用5-FU進(jìn)行細(xì)胞抑制處理期間防止了腹瀉的發(fā)生。
圖12該實(shí)施例展示化合物1846對上皮隱窩-絨毛高度(圖12A)和空腸(即小腸中段)肌厚度(圖12B)的影響。用化合物1846(0.62、3.41或6.2mg/kg，每日一次)靜脈內(nèi)處理Sprague Dawley大鼠5天(n＝6/劑量組)。然后處死動物，在幽門括約肌遠(yuǎn)端25cm處收集小腸活檢(1cm)。固定所述活檢、石蠟包埋、切片并用蘇木精和伊紅染色。在顯微鏡下檢查染色的切片，測量隱窩深度、絨毛高度、隱窩-絨毛長度和肌厚度。根據(jù)圖示，化合物1846劑量依賴性地提高空腸腸上皮中的隱窩-絨毛長度，但是對空腸肌厚度沒有影響。這些結(jié)果提示化合物1846通過刺激小腸上皮生長而主要在小腸中發(fā)揮其增殖作用。值為平均值±SEM。*相對于載體對照(0mg/kg/天)的p＜0.05。
圖13該實(shí)施例展示化合物1848對吲哚美辛誘導(dǎo)的小腸潰瘍的影響。使用載體(鹽水；第1組)或吲哚美辛(7mg/kg皮下，每日一次，進(jìn)行2天；第2至7組)處理雄性Sprague Dawley大鼠。僅給予吲哚美辛(第2組)或與潑尼松龍組合(10mg/kg皮下，第3組)或與8、40或200nmol/kg化合物1848組合(皮下，每日一次，第4至6組)。最后，采用潑尼松龍(10mg/kg皮下)和化合物1848(200nmol/kg皮下，每日一次)的組合處理來處理一組大鼠(第7組)。吲哚美辛之前4天開始進(jìn)行化合物1848處理并且在吲哚美辛處理的2天期間繼續(xù)處理。第3天，處死大鼠，在尸檢時輕輕地用10％福爾馬林沖洗小腸并用福爾馬林填充小腸5分鐘，之后沿系膜小腸對向部邊緣將腸剪開并懸掛在聚丙烯盤上。小心地用鑷子除去任何剩余的腸內(nèi)容物。室溫下再固定24小時后，在Milli-Q水中清洗組織，并用制備為1％乙酸(Bie&Bernstsen)中0.5％溶液的Alcian Green3BX(Chroma)表面染色20分鐘。除去過量的染色液和Milli-Q水后，將所述組織制備物轉(zhuǎn)移到70％乙醇中并使用立體顯微鏡在低倍(×7)下進(jìn)行分析。從幽門開始仔細(xì)檢查小腸并利用標(biāo)準(zhǔn)尺(精度0.5mm)測量所有潰瘍的性狀(圓形和線形)和大小(圓形潰瘍直徑，線形潰瘍長×寬)。潰瘍定義為缺少上皮表面的部分。在正在愈合的潰瘍中，即使較大面積中仍然缺少絨毛結(jié)構(gòu)，也僅將仍然缺少上皮表面的部分認(rèn)為是潰瘍。以盲法進(jìn)行所有分析。如圖13所示，吲哚美辛強(qiáng)烈誘導(dǎo)小腸潰瘍(總小腸潰瘍＝333±21mm2)。潑尼松龍?zhí)幚硪饾兎秶@著下降約29％?；衔?848處理以劑量依賴性方式防止吲哚美辛誘導(dǎo)的潰瘍，在最高劑量下，總潰瘍降低約50％(178±17mm2)。這種對化合物1846的最大應(yīng)答高于潑尼松龍的作用，與高劑量化合物1848組合加入潑尼松龍未產(chǎn)生任何附加效應(yīng)。這些結(jié)果表明，化合物1848有效防止吲哚美辛誘導(dǎo)的小腸潰瘍。值為平均值±SEM。*與吲哚美辛(第2組)的p＜0.05。#與潑尼松龍(第3組)的p＜0.05。
圖14該實(shí)施例展示化合物1848對由吲哚美辛誘導(dǎo)小腸炎癥的大鼠中小腸TNF-α含量的影響。使用載體(鹽水；第1組)或吲哚美辛(7mg/kg皮下，每日一次，進(jìn)行2天；第2至7組)處理雄性Sprague Dawley大鼠。僅給予吲哚美辛(第2組)或與潑尼松龍組合(10mg/kg皮下，第3組)或與8、40或200nmol/kg化合物1848組合(皮下，每日一次，第4至6組)。最后，采用潑尼松龍(10mg/kg皮下)和化合物1848(200nmol/kg皮下，每日一次)的組合處理來處理一組大鼠(第7組)。吲哚美辛之前4天開始進(jìn)行化合物1848處理并且在吲哚美辛處理的2天期間繼續(xù)處理。第3天處死大鼠，在尸檢時將小腸分成長度相等的三個節(jié)段，分別對應(yīng)于1)十二指腸和近端空腸、2)中部空腸和遠(yuǎn)端空腸以及3)回腸。立即在液氮中快速冷凍樣品并保存在-80℃至分析。根據(jù)下述方案進(jìn)行小腸節(jié)段的勻漿和細(xì)胞蛋白的提取對組織節(jié)段稱重，加入每克組織1.5ml體積用冰預(yù)冷(4℃)的提取緩沖液(10mM Tris-HCI(Sigma)和1mM EDTA(J.T.Baker)，(pH7.6)，含0.05％疊氮化鈉(Fluka)、1％Tween-80(Fluka)、2mM苯甲基磺酰氟(PMSF，F(xiàn)luka)以及蛋白酶抑制劑抑肽酶、亮抑蛋白酶肽和胃蛋白酶抑制劑A各1μg/ml(RocheDiagnostics))。用剪刀將組織剪成小塊并以9500rpm 20秒勻漿3次(IKA UltraTurrax T25 homogenizer，Janke&Kunkel)，其間在冰上冷卻30秒。在4℃下以20.000×g離心組織勻漿30分鐘，收集上清液并保存在-20℃至分析TNF-α。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使用市售的ELISA試劑盒(Rat Tumor Necrosis Factor-α Ultrasensitive ELISAkit，Biosource International Inc.)分析小腸蛋白提取物的TNF-α。該測定的檢出限為0.7pg/ml。使用市售的測定(DC protein assay，Bio-Rad Laboratories Ltd.)分析蛋白提取物中的總蛋白含量。TNF-α的小腸組織水平表達(dá)為與總蛋白的相對值?；衔?848顯著降低促炎細(xì)胞因子TNF-α的小腸組織水平，并且這種效應(yīng)在近端節(jié)段(小腸的前1/3)最為顯著。在近端和中部節(jié)段(小腸第二個1/3)中，化合物1848比潑尼松龍更有效。有意思的是，化合物1848比潑尼松龍更有效地抑制小腸炎癥，并且當(dāng)與化合物1848組合施用時，潑尼松龍沒有附加效應(yīng)。這些結(jié)果提示化合物1848對影響小腸的疾病過程具有顯著的抗炎潛能。值為平均值±SEM。*與吲哚美辛(第2組)的p＜0.05。
本發(fā)明的詳細(xì)說明 定義 除非另外指出，為上述書面描述中使用的特定術(shù)語提供下述定義。
在說明書和權(quán)利要求書全篇中，使用天然氨基酸的常規(guī)單字母代碼和三字母代碼以及其它α-氨基酸例如肌氨酸(Sar)、正亮氨酸(Nle)和α-氨基異丁酸(Aib)的普遍公認(rèn)的三字母代碼。本發(fā)明的肽中所有氨基酸殘基優(yōu)選為L-構(gòu)型，然而，也可以存在D-構(gòu)型的氨基酸。
本發(fā)明的優(yōu)選化合物具有至少一種GLP-2生物活性，尤其是引起腸生長。這可以如實(shí)施例中所述在體內(nèi)測定中進(jìn)行評估，其中在用GLP-2類似物處理或接觸測試動物之后測定腸或其部分的質(zhì)量。
與天然GLP-2和上述定義的GLP-2相比較，本發(fā)明的GLP-2類似物具有一個或多個氨基酸替換、缺失、倒位或添加。這一定義還包括同義術(shù)語GLP-2模擬物和/或GLP-2激動劑。此外，本發(fā)明的類似物還可具有一個或多個其氨基酸側(cè)基、α-碳原子、末端氨基、或末端羧酸基的化學(xué)修飾?；瘜W(xué)修飾包括但不限于添加化學(xué)部分、形成新鍵以及去除化學(xué)部分。氨基酸側(cè)基修飾包括但不限于賴氨酸ε-氨基的?；?、精氨酸、組氨酸或賴氨酸的N-烷基化、谷氨酸或天冬氨酸羧酸基的烷基化以及谷氨酸或天冬氨酸的脫酰胺作用。末端氨基修飾包括但不限于去氨基(des-amino)、N-低級烷基、N-二低級烷基以及N-酰基修飾。末端羧基修飾包括但不限于酰胺、低級烷基酰胺、二烷基酰胺以及低級烷基酯修飾。本文優(yōu)選的低級烷基為C1-C4烷基。此外，可通過肽化學(xué)普通技術(shù)人員公知的保護(hù)基保護(hù)一個或多個側(cè)基或端基。氨基酸的α-碳可被單甲基化或二甲基化。
在其存在時，氧化穩(wěn)定的Met-取代氨基酸指選自以下的氨基酸Met(O)(甲硫氨酸亞砜)、Met(O)2(甲硫氨酸砜)、Val、Ile、Asn、Glx(Glu或Gln)、Tyr、Phe、Trp，優(yōu)選為Leu、Nle、Ala、Ser和Gly。
應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的肽還可以以鹽或其它衍生物的形式提供。鹽包括可藥用鹽例如酸加成鹽和堿鹽。酸加成鹽的實(shí)例包括鹽酸鹽、檸檬酸鹽和乙酸鹽。堿鹽的實(shí)例包括陽離子選自以下的鹽堿金屬例如鈉和鉀、堿土金屬例如鈣以及銨離子+N(R3)3(R4)(其中R3和R4獨(dú)立地表示任意取代的C1-6烷基、任意取代的C2-6烯基、任意取代的芳基或任意取代的雜芳基)?？伤幱名}的其它實(shí)例描述于“Remington′sPharmaceutical Sciences”第17版Ed.Alfonso R.Gennaro(Ed.)，Mark Publishing Company，Easton，PA，U.S.A.，1985和更新的版本以及the Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology中。
本發(fā)明GLP-2類似物的其它衍生物包括與金屬離子如Mn2+和Zn2+的配位絡(luò)合物、酯如體內(nèi)可水解的酯、游離酸或堿、水合物、前藥或脂質(zhì)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的技術(shù)在化合物中存在的羥基或羧酸基之間以及適當(dāng)?shù)聂人峄虼挤磻?yīng)配偶體之間形成酯。作為前藥的化合物衍生物可在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)化成母體化合物之一。一般地，化合物的至少一種生物活性將在化合物前藥形式中降低，并且可通過前藥轉(zhuǎn)化被活化，以釋放該化合物或其代謝物。前藥的實(shí)例包括使用保護(hù)基，所述保護(hù)基可原位除去以釋放活性化合物，或者可在體內(nèi)抑制藥物的清除。
在其存在時，Z1和Z2各自獨(dú)立地代表3至20個或4至20個氨基酸殘基的肽序列，例如在4至15個氨基酸殘基范圍內(nèi)、更優(yōu)選在4至10個氨基酸殘基范圍內(nèi)，尤其是在4至7個氨基酸殘基范圍內(nèi)，例如4、5、6或7個氨基酸殘基，比如6個氨基酸殘基。肽序列Z中每個氨基酸殘基可獨(dú)立地選自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met、Orn。優(yōu)選地，所述氨基酸殘基選自Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Orn和Met以及落入WO01/04156中所定義的式I的氨基酸，例如Dbu(2，4-二氨基丁酸)或Dpr(2，3-二氨基丙酸)，更優(yōu)選選自Glu、Lys和Met，尤其是Lys。上述氨基酸可為D-或L-構(gòu)型，但優(yōu)選上述氨基酸為L-構(gòu)型。特別優(yōu)選的序列Z是4個、5個或6個連續(xù)賴氨酸殘基、特別是6個連續(xù)賴氨酸殘基的序列。示例性序列Z示于WO01/04156。
在某些實(shí)施方案中不存在Z1。在這種情況下，可以存在或不存在Z2。
本發(fā)明包含下文實(shí)驗(yàn)章節(jié)中進(jìn)一步描述的下述肽。
參照GLP-2類似物 1559 H-[Gly2]hGLP-2-OH H-HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD-OH 本發(fā)明GLP-2類似物的實(shí)例 1809[Gly2，Glu3，Thr5，Leu10，Ala11，16，24，28]hGLP-2-(Lys)6-NH2 HGEGTFSDELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1810[Gly2，Glu3，Thr5，Leu10，Ala11，16，24，28，Ile21]hGLP-2(1-30)-(Lys)6-NH2 HGEGTFSDELATILDALAARIFIAWLIATK6-NH2 1811[Gly2，Pro6，Leu10，Ala11，16，24，28]hGLP-2-NH2 HGDGSPSDELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1812[Gly2，Glu3，Leu10，Ala11，24]hGLP-2-NH2 HGEGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITD-NH2 1813[Gly2，Leu10，Ala11，16，24，28]hGLP-2-NH2 H-HGDGSFSDELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1814[Gly2，Leu10，Ala11，24，28]hGLP-2-NH2 H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIATKITD-NH2 1815[Gly2，Glu3，Leu10，Ala11，16，24，28]hGLP-2-NH2 H-HGEGSFSDELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1818[Gly2，Ser8，Leu10，Ala11，24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFSSELATILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2 1819[Gly2，Leu10，Ser11，Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFSDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2 1820[Gly2，Thr7，Ser8，Leu10，Ala11，24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAW LIQTK6-NH2 1821[Gly2，Leu10，Lys11，Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFSD ELKTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2 1822[Gly2，Thr7，Leu10，Lys11，Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFTDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2 1823[GIy2，Thr7，Ser8，Leu10，Lys11，Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFTSELKTILDNL-AARDFIAWLIQTK6-NH2 1824[Gly2，Thr7，Leu10，Ala11，24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFTDELATILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2 1825[Gly2，Ser8，Leu10，Ala11，24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFSSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1826[Gly2，Leu10，Ala24]hGLP-2-K6-NH2 H-HGDGSFSDELNTILDNLAARDFIAWLIQTKITDK6-NH2 1827[Gly2，Thr7，Leu10，Ser11，Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFTDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2 1828[Gly2，Thr7，Leu10，Ser8，11，Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFTSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2 1829[Gly2，Leu10，Ser8，11，Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFSSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2 1830[Gly2，Leu10，Ser11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFSDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1831[Gly2，Thr7，Leu10，Ser11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFTDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1832[Gly2，Thr7，Leu10，Ser8，11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFTSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1833[Gly2，Leu10，Ser8，11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFSSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1834[Gly2，Thr7，Ser8，Leu10，Ala11，24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1835[Gly2，Leu10，Lys11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFSDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1836[Gly2，Thr7，Leu10，Lys11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFTDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1839[Leu10，Ala11，Ala24]hGLP-2(1-33)-K6-NH2 H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITDK8-NH2 1840[Leu10，Ala11，Ala24]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITD-NH2 1841[Leu10，Ala11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1842[Thr7，Ser8，Leu10，Lys11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFTSELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1843[Thr7，Leu10，Ala11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFTDELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1844[Gly2，Glu3，Thr5，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2 H-HGEGTFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1845[Gly2，Glu3，Thr5，Leu10，Ser11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2 H-HGEGTFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1846[Gly2，Glu3，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6NH2 1847[Gly2，Glu3，Leu10，Ser11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2 H-HGEGSFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1848[Gly2，Glu3，Thr5，Ser8，Leu10，Ala11，16，24，28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1849[Gly2，Glu3，Ser8，Leu10，Ala11，16，24，28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1850[Gly2，Glu3，Leu10，Lys11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2 H-HGEGSFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1851[Gly2，Glu3，Thr5，Leu10，Lys11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2 H-HGEGTFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1852[Gly2，Glu3，Thr5，Ser8，Leu10，Lys11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGTFSSELKTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1853[Gly2，Glu3，Thr5，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGTFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1854[Gly2，Glu3，Thr5，Leu10，Ser11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGTFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1855[Gly2，Glu3，Thr5，Ser8，Leu10，Ala11，16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1856[Gly2，Glu3，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGSFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1857[Gly2，Glu3，Leu10，Ser11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1858[Gly2，Glu3，Ser8，Leu10，Ala11，16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1859[Gly2，Glu3，Leu10，Lys11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGSFSDELKTILDAL-AARDFIAWLIATKITD-NH2 1860[Gly2，Glu3，Thr5，Leu10，Lys11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGTFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1861[Gly2，Glu3，Thr5，Ser8，Leu10，Lys11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 HGEGTFSSELKTILDALAARDFIAWLIATKITD 本發(fā)明特別優(yōu)選的化合物包括化合物1834、1846、1847、1848、1849、1855、1857和1858。
1834 H-HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1846 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6NH2 1847 H-HGEGSFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1848 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1849 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1855 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1857 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1858 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 穩(wěn)定性研究 技術(shù)人員能設(shè)計適當(dāng)方法(例如定量法)用于檢測GLP-2類似物的降解產(chǎn)物，例如基于下面描述的方法。降解可以以氧化、水解和脫酰胺作用的形式發(fā)生，取決于任何給定的GLP-2類似物中氨基酸的特性和位置以及條件例如pH、溶液和溫度。當(dāng)在應(yīng)激條件(即可能引起降解的條件)下孵育化合物并且隨后分析化合物中剩余完整肽的含量時，可根據(jù)化學(xué)穩(wěn)定性對化合物進(jìn)行分級。此外，得到的對應(yīng)激條件下所得主要降解產(chǎn)物的了解對于任何后來分析方法的開發(fā)都是很重要的。
檢測GLP類似物的定量測定 技術(shù)人員還能夠設(shè)計方法(例如定量法)用于檢測復(fù)雜環(huán)境或溶液(例如血漿、尿、組織勻漿、細(xì)胞勻漿、唾液等)中的GLP-2類似物，以研究施用于哺乳動物之后GLP-2類似物的吸收、分布、代謝和排泄，或者作為體外細(xì)胞體系功能研究的一部分。
在一個實(shí)施方案中，定量測定可基于針對GLP類似物或其片段的抗體。從經(jīng)免疫的動物中得到的抗體可用于定量分析。在一個實(shí)施例中，可利用固定在多孔板中的與所述分子中一部分具有親和力的第一抗體制備直接夾層ELISA。然后對孔應(yīng)用樣品，GLP類似物被第一抗體捕獲。然后所捕獲的GLP類似物被與GLP類似物另一部分具有親和力的第二抗體識別?？捎妹?辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或β-半乳糖苷酶)或放射性同位素標(biāo)記所述第二抗體。然后可通過加入比色底物或直接計數(shù)輻射或通過閃爍來檢測所捕獲的GLP類似物的量?；蛘?，通過加入與第二抗體具有親和力的標(biāo)記抗體來間接檢測所捕獲的GLP類似物的量。可由含有已知量GLP類似物的外標(biāo)曲線得到的應(yīng)答來估計樣品中的濃度?；蛘?，所述抗體可用于制備直接競爭性免疫測定，其中將對GLP類似物具有特異性的抗體固定在多孔板上，并將樣品與預(yù)定固定濃度的標(biāo)記GLP類似物一起在孔中孵育。所述標(biāo)記可以是酶、熒光團(tuán)、放射性同位素或生物素，并使用以下方法檢測，例如對所述酶具有特異性的底物(例如比色、熒光或化學(xué)發(fā)光)、閃爍或者與酶連接的抗生物素蛋白，隨后進(jìn)行上述檢測?？赏ㄟ^適當(dāng)?shù)姆椒z測已結(jié)合的標(biāo)記GLP類似物的量，并可由得自上述外標(biāo)曲線的應(yīng)答來得出樣品中GLP類似物的濃度。
在另一個實(shí)施方案中，定量測定可基于液相層析-串聯(lián)質(zhì)譜法。在這樣的設(shè)置中，根據(jù)與惰性氣體(He或Ar)碰撞引起的母體化合物斷裂來監(jiān)測對待研究GLP類似物具有特異性的片段的應(yīng)答。斷裂之前通過反相層析分離樣品組分，或直接將樣品注入質(zhì)譜儀中。適當(dāng)時可對樣品進(jìn)行預(yù)處理(即加入蛋白酶抑制劑、蛋白質(zhì)沉淀、固相萃取、免疫-親和萃取等)。由上述外標(biāo)曲線所得應(yīng)答得出樣品中存在的GLP類似物濃度，這可以是在使用與待研究的GLP類似物相似的內(nèi)標(biāo)校正應(yīng)答之后。
產(chǎn)生特異性抗體 可在哺乳動物中誘導(dǎo)并從血清中純化針對GLP類似物或其片段的特異性抗體。GLP類似物或片段可直接與佐劑一起用于免疫兔、小鼠或其它哺乳動物，或者GLP類似物或其片段可與載體分子(即匙孔槭血藍(lán)蛋白、卵白蛋白、白蛋白等)化學(xué)連接，并與佐劑一起注射。可在延長的時間中以2至4周的間隔重復(fù)所述注射，以提高抗體的親和力和選擇性?？芍苯訌难瀚@得多克隆抗體。為了得到單克隆抗體，應(yīng)將分離自免疫動物(優(yōu)選小鼠)的B細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合，以形成產(chǎn)生抗體的雜交瘤。利用固定的GLP類似物或其肽隨后用標(biāo)記的抗-抗體檢測來篩選和選擇適當(dāng)?shù)目寺『涂贵w。或者，所述篩選和選擇可基于固定抗體隨后用標(biāo)記的GLP類似物或其片段檢測。在所有情況下，所述標(biāo)記均可以是放射性同位素、酶、熒光團(tuán)或生物素，并使用以下方法檢測，例如對所述酶具有特異性的底物(例如比色、熒光或化學(xué)發(fā)光)、閃爍或者抗生物素蛋白與酶連接，隨后進(jìn)行上述檢測。
合成GLP類似物 優(yōu)選通過固相或液相肽合成手段合成本發(fā)明的類似物。在該上下文中，參照WO98/11125和Fields，GB等，2002，“Principles and practice ofsolid-phase peptide synthesis”.InSynthetic Peptides(2nd Edition)以及本文的實(shí)施例。
因此，可用多種方式合成GLP類似物，例如包括以下步驟的方法(a)通過固相或液相肽合成手段合成肽并回收這樣得到的合成肽；或(b)當(dāng)所述肽由天然存在的氨基酸組成時，在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述肽的核酸構(gòu)建體，并從所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收表達(dá)產(chǎn)物；或(c)當(dāng)所述肽由天然存在的氨基酸組成時，實(shí)現(xiàn)編碼所述肽的核酸構(gòu)建體的無細(xì)胞體外表達(dá)，并回收所述表達(dá)產(chǎn)物；或(a)、(b)和(c)方法的組合以得到所述肽的片段，隨后連接所述片段以得到所述肽，并回收所述肽。
因此，對于本發(fā)明的一些類似物，使用基因工程技術(shù)可能是有利的。這可能是當(dāng)肽足夠大(或作為融合構(gòu)建體產(chǎn)生)和當(dāng)肽僅包含可由活生物RNA翻譯的天然存在氨基酸的情況。
就重組基因技術(shù)而言，編碼本發(fā)明肽的核酸片段是重要的化學(xué)產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的另一方面提供包含編碼本發(fā)明GLP-2類似物的核酸序列的核酸分子，其中所述肽優(yōu)選包含于天然存在氨基酸中。本發(fā)明的核酸片段為DNA或RNA片段。
本發(fā)明的核酸片段通常插入適當(dāng)?shù)妮d體中，以形成攜帶本發(fā)明核酸片段的克隆載體或表達(dá)載體；這種新載體也是本發(fā)明的一部分。涉及構(gòu)建本發(fā)明這些載體的細(xì)節(jié)將在下文轉(zhuǎn)化細(xì)胞和微生物的上下文中討論。取決于應(yīng)用的目的和類型，所述載體可以是質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、微染色體或病毒的形式，但僅在某些細(xì)胞中瞬時表達(dá)的裸DNA也是重要的載體。本發(fā)明優(yōu)選的克隆載體和表達(dá)載體(質(zhì)粒載體)能自主復(fù)制，從而能夠?yàn)榱擞糜陔S后克隆的高水平表達(dá)或高水平復(fù)制而實(shí)現(xiàn)高拷貝數(shù)。
本發(fā)明載體的一般概況包括在5’→3’方向有效連接的下述特征用于驅(qū)動本發(fā)明核酸片段表達(dá)的啟動子，任選的編碼允許分泌(分泌至胞外相或適當(dāng)時分泌至周質(zhì)體中)的前導(dǎo)肽或多種目的(如組合分泌、純化標(biāo)記和酶修飾以校正肽或?qū)⒍嚯钠握系侥ぶ?的前導(dǎo)肽的核酸序列、編碼本發(fā)明肽的核酸片段以及任選的編碼終止子的核酸序列。當(dāng)用表達(dá)載體在生產(chǎn)株或細(xì)胞系中操作時，為了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因穩(wěn)定，優(yōu)選所述載體在引入宿主細(xì)胞時整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中。
使用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以產(chǎn)生經(jīng)修飾的本發(fā)明肽。這樣的轉(zhuǎn)化細(xì)胞也是本發(fā)明的一部分，可以是用于增殖本發(fā)明核酸片段和載體或用于重組產(chǎn)生本發(fā)明肽的培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系。
本發(fā)明優(yōu)選的轉(zhuǎn)化細(xì)胞是微生物例如細(xì)菌(如埃希菌(Escherichia)(如大腸桿菌)、芽孢桿菌(Bacillus)(如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、沙門氏菌(Salmonella)或分枝桿菌(Mycobacterium)(優(yōu)選非致病性的，如牛分枝桿菌(M.bovis)BCG)的物種)、酵母(如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和原生動物?；蛘撸鲛D(zhuǎn)化細(xì)胞來自多細(xì)胞生物，即可以是真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。來自人的細(xì)胞也是有意義的，參照下文對細(xì)胞系和載體的討論。為了克隆和/或最優(yōu)化表達(dá)的目的，優(yōu)選所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞能復(fù)制本發(fā)明核酸片段。本發(fā)明的實(shí)施方案優(yōu)選使用表達(dá)所述核酸片段的細(xì)胞；它們可用于小規(guī)?；虼笠?guī)模制備本發(fā)明的肽。
通過轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn)本發(fā)明的肽時，雖然遠(yuǎn)非必要，但將表達(dá)產(chǎn)物運(yùn)出至培養(yǎng)基或攜帶到轉(zhuǎn)化細(xì)胞表面是便利的。
已經(jīng)鑒定了有效的生產(chǎn)細(xì)胞時，優(yōu)選基于所述生產(chǎn)細(xì)胞建立攜帶本發(fā)明載體和表達(dá)編碼所述肽的核酸片段的穩(wěn)定細(xì)胞系。優(yōu)選地，這種穩(wěn)定細(xì)胞系分泌或攜帶本發(fā)明的肽，從而便于純化。
一般而言，將含有復(fù)制子和控制序列的質(zhì)粒載體(來源于與宿主細(xì)胞相容的物種)與宿主一起使用。所述載體通常帶有復(fù)制位點(diǎn)以及能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)記序列。例如，一般使用來源于大腸桿菌物種的質(zhì)粒pBR322(但是存在許多其它可用的質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化大腸桿菌(參閱如Bolivar等，1977)。pBR322質(zhì)粒含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因，因而提供鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的簡單手段。pBR質(zhì)?；蚱渌⑸镔|(zhì)粒或噬菌體必須還包含啟動子或經(jīng)修飾以包含啟動子，其可被原核微生物用于表達(dá)。
在原核重組DNA構(gòu)建中最普遍使用的啟動子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動子系統(tǒng)(Chang等，1978；ltakura等，1977；Goeddel等，1979)以及色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel等，1979；EP 0 036 776 A)。盡管這些是最常用的，但也已發(fā)現(xiàn)并使用了其它微生物啟動子，其核苷酸序列的細(xì)節(jié)已公開，使得技術(shù)人員能將其與質(zhì)粒載體功能性連接(Siebwenlist等，1980)。除了原核生物、真核微生物以外，還可使用例如酵母培養(yǎng)物，而且這時所述啟動子也應(yīng)能夠啟動表達(dá)。在真核微生物中，釀酒酵母或普通面包酵母是最常用的，盡管許多其它株也是普遍可得的。例如，對于酵母屬中的表達(dá)，質(zhì)粒YRp7是常用的(Stinchcomb等，1979；Kingsman等，1979；Tschemper等，1980)。該質(zhì)粒已含有為不能生長在色氨酸中的酵母突變株(如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，1977))提供選擇標(biāo)記的trp1基因。然后，作為酵母宿主細(xì)胞基因組特征的trp1損傷的存在提供了用于通過在無色氨酸情況下培養(yǎng)檢測轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。
酵母載體中適當(dāng)?shù)膯有蛄邪?-磷酸甘油酸激酶(Hitzman等，1980)或其它糖酵解酶(Hess等，1968；Holland等，1978)的啟動子，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶以及葡糖激酶的啟動子。在構(gòu)建適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)質(zhì)粒時，還將與這些基因相關(guān)的終止序列還被連接到表達(dá)載體中待表達(dá)序列的3’，以提供mRNA多聚腺苷酸化和終止。
具有轉(zhuǎn)錄由生長條件控制的額外優(yōu)點(diǎn)的其它啟動子為乙醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶和上述甘油醛-3-磷酸脫氫酶以及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。含有酵母兼容性啟動子、復(fù)制起點(diǎn)和終止序列的任何質(zhì)粒載體都是適用的。
除了微生物以外，來源于多細(xì)胞生物的細(xì)胞培養(yǎng)物也可用作宿主。原則上任何這樣的細(xì)胞培養(yǎng)物都是可使用的，不管來自脊椎動物或無脊椎動物培養(yǎng)物。然而，脊椎動物細(xì)胞是最有意義的，近年來，脊椎動物在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)方案(TissueCulture，1973)。這種可用的宿主細(xì)胞系的實(shí)例為VERO和HeLa細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系以及W138、BHK、COS-7 293、草地貪夜蛾(spodoptera frugiperda，SF)細(xì)胞(完整的表達(dá)系統(tǒng)可購自i.a.Protein Sciences，1000 Research Parkway，Meriden，CT06450，U.S.A.和Invitrogen)、Invitrogen(PO Box 2312，9704 CHGroningen，The Netherlands)提供的黑腹果蠅(D.melanogaster)細(xì)胞系S2以及MDCK細(xì)胞系。
這些細(xì)胞的表達(dá)載體通常包括(如果需要)復(fù)制起點(diǎn)、位于待表達(dá)基因之前的啟動子以及任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄終止子序列。
對于哺乳動物中的應(yīng)用，表達(dá)載體的控制功能通常由病毒物質(zhì)提供。例如，常用的啟動子來源于多瘤病毒、腺病毒2，最常用的是猿猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期啟動子是特別有用的，因?yàn)樗鼈兌既菀滓酝瑫r包括SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)的片段的形式從病毒中得到(Fiers等，1978)。還可以使用更小或更大的SV40片段，只要其包括從Hind III位點(diǎn)至病毒復(fù)制起點(diǎn)中Bg II位點(diǎn)的約250bp序列。此外，還可能(并且通常希望)利用正常情況下與目的基因序列相關(guān)的啟動子或控制序列，只要這樣的控制序列與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。
復(fù)制起點(diǎn)可通過構(gòu)建載體提供以包含外源起點(diǎn)來提供，例如可來自SV40或其它病毒(例如多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)，或者可以由宿主細(xì)胞染色體復(fù)制機(jī)制提供。如果所述載體整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體中，后者通常是足夠的。
為了在重組生產(chǎn)方法中得到滿意的產(chǎn)量，通過將肽與可用作親和標(biāo)記(為了易于純化)的融合配偶體和/或通過具有多個肽重復(fù)來將所述類似物制備為融合蛋白可能是有利的。這些方法需要存在適當(dāng)?shù)碾拿盖懈钗稽c(diǎn)，但是技術(shù)人員會知道如何加工其背后的基因構(gòu)建體。
重組制備后，可通過本領(lǐng)域普遍公知的方法純化本發(fā)明的肽，包括多步層析(離子交換、大小排阻以及親和層析技術(shù))。
或者，可在無細(xì)胞體系中體外制備由天然存在的氨基酸組成的肽。這在肽可能對推定的宿主細(xì)胞有毒性的情況下特別有利。因此，本發(fā)明還考慮使用無細(xì)胞體外翻譯/表達(dá)以制備本發(fā)明的肽。在這種情況下，參照來自例如Ambion Inc.，2130 Woodward，Austin，TX78744-1832，USA的市售體外翻譯試劑盒、材料和技術(shù)文件。
最后，當(dāng)然可以組合可用方法，從而制備如半合成類似物。在這樣的設(shè)置中，使用至少2個分開的步驟或方法制備肽片段，隨后連接所述片段以得到最終的肽產(chǎn)物。
藥物組合物和施用 本發(fā)明的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物可配制成用于保存或施用的藥物組合物，并且其在可藥用載體中包含治療有效量的本發(fā)明GLP-2肽或者其鹽或衍生物。
本發(fā)明化合物的治療有效量取決于給藥途徑、受治哺乳動物的類型以及所考慮的具體哺乳動物的身體特征。這些因素及其與確定該量之間的關(guān)系是醫(yī)藥領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的?？烧{(diào)整該量和施用方法以達(dá)到最佳效力，從而將肽遞送到大腸，但是將取決于醫(yī)藥領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的因素例如體重、飲食、同時用藥(concurrent medication)和其它因素。
本發(fā)明中提供藥物組合物，其中所述GLP-2類似物或其鹽以有效治療或預(yù)防胃和腸相關(guān)病癥的量存在。
利用有機(jī)和無機(jī)堿可形成具有酸性部分的本發(fā)明化合物的可藥用鹽。與堿形成的適當(dāng)鹽包括金屬鹽比如堿金屬或堿土金屬鹽，例如鈉、鉀或鎂鹽；銨鹽和有機(jī)胺鹽，比如與嗎啉、硫代嗎啉、哌啶、吡咯烷、單-、二-或三羥基低級烷基胺(例如單-、二-或三乙醇胺)形成的鹽。還可以形成內(nèi)鹽。相似地，當(dāng)本發(fā)明的化合物包含堿性部分時，可利用有機(jī)和無機(jī)酸形成鹽。例如，可由下述酸形成鹽醋酸、丙酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、延胡索酸、馬來酸、丙二酸、苦杏仁酸、蘋果酸、鄰苯二甲酸、鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲基磺酸、萘磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸和樟腦磺酸以及其它公知的可藥用酸。還可利用氨基酸例如賴氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸形成氨基酸加成鹽。
對醫(yī)藥領(lǐng)域中技術(shù)人員顯而易見地，本發(fā)明的肽或藥物組合物的“治療有效量”將根據(jù)年齡、體重和受治哺乳動物的物種、使用的具體化合物、具體的給藥方式以及所需效果和治療適應(yīng)證進(jìn)行變化。由于這些因素與確定該量的關(guān)系是醫(yī)藥領(lǐng)域熟知的，因此確定治療有效的劑量水平、實(shí)現(xiàn)預(yù)防和/或治療本文描述的腸和胃相關(guān)疾病的理想結(jié)果所需的量以及本文公開的其它醫(yī)學(xué)適應(yīng)證將在技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
本文使用的“治療有效量”是降低給定病癥或病理的癥狀、優(yōu)選使患有所述病癥或病理的個體的生理反應(yīng)正?；牧??？梢允褂帽绢I(lǐng)域的常規(guī)方法確定癥狀的降低或生理反應(yīng)的正?；⑶铱筛鶕?jù)給定的病癥或病理而改變。在一個方面中，一種或多種GLP-2類似物或含有一種或多種GLP-2類似物的藥物組合物的治療有效量是這樣的量其將可檢測的生理參數(shù)恢復(fù)到與未患所述病癥或病狀的個體中所述參數(shù)基本相同的值(優(yōu)選在所述值的+30％以內(nèi)，更優(yōu)選在+20％以內(nèi)，并且還更優(yōu)選在+10％以內(nèi))。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，開始以較低的劑量水平施用本發(fā)明的化合物或藥物組合物，提高劑量水平直至實(shí)現(xiàn)預(yù)防/治療相關(guān)醫(yī)療適應(yīng)證例如腸和胃相關(guān)疾病的理想效果。這將定義為治療有效量。對于單獨(dú)的或作為藥物組合物一部分的本發(fā)明的肽，這樣的劑量可以在約0.01mg/kg體重至100mg/kg體重之間，比如在約0.01mg/kg體重至10mg/kg體重之間，例如在10至100μg/kg體重之間。
對于治療用途，將選定的GLP-2類似物與可藥用并且適于通過選定的給藥途徑遞送肽的載體配制在一起。就本發(fā)明目的而言，外周腸胃外途徑包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下以及腹膜內(nèi)給藥途徑。用于本發(fā)明的某些化合物還可能適于通過口服、直腸、鼻腔或下呼吸道途徑給藥。這些是所謂的非胃腸外(non-parenteral)途徑。本發(fā)明的藥物組合物包含本發(fā)明的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物以及可藥用載體。適當(dāng)?shù)目伤幱幂d體是常規(guī)地與基于肽的藥物一起使用的載體，比如稀釋劑、賦形劑等。用于治療用途的可藥用載體是藥學(xué)領(lǐng)域熟知的，并且描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)。例如，可以使用弱酸性或生理pH的無菌鹽水和磷酸緩沖鹽水。PH緩沖劑可以是磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、碳酸氫銨、二乙醇胺、組氨酸(是優(yōu)選的緩沖劑)、精氨酸、賴氨酸、或乙酸鹽或其混合物。優(yōu)選的緩沖范圍是pH4至8、pH6.5至8，更優(yōu)選pH7至7.5。所述藥物組合物中可包含防腐劑，例如對甲酚、間甲酚和鄰甲酚、對羥苯甲酸甲酯和對羥苯甲酸丙酯、酚、苯甲醇、苯甲酸鈉、苯甲酸、苯甲酸芐酯、山梨酸、丙酸、對羥基苯甲酸酯。所述藥物組合物中可包含防止氧化、脫酰胺、異構(gòu)化、消旋化、環(huán)化、肽水解的穩(wěn)定劑，例如抗壞血酸、甲硫氨酸、色氨酸、EDTA、天冬酰胺、賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸。所述藥物組合物中可包含防止聚集、纖維化和沉淀的穩(wěn)定劑，比如十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇、羧甲基纖維素、環(huán)糊精。所述藥物組合物中可包含增溶或防止聚集的有機(jī)改性劑，比如乙醇、乙酸或乙酸酯及其鹽。所述藥物組合物中可包含等滲劑比如鹽例如氯化鈉或最優(yōu)選的碳水化合物例如葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖或其混合物。
所述藥物組合物中可包含去污劑比如Tween 20、Tween 80、SDS、泊洛沙姆例如Pluronic F-68、Pluronic F-127。所述藥物組合物中可包含染料甚至是芳香劑。在另一個實(shí)施方案中，包含GLP-2肽類似物的可藥用酸加成鹽。可以使用助懸劑。
所述藥物組合物中可包含有機(jī)調(diào)節(jié)劑比如乙醇、叔丁醇、2-丙醇、乙醇、甘油、聚乙二醇，用于冷凍凍干的產(chǎn)物。所述藥物組合物中可包含填充劑和等滲劑比如鹽例如氯化鈉或最優(yōu)選的碳水化合物例如葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖或其混合物、氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸或賦形劑半胱氨酸、卵磷脂或人血清白蛋白或其混合物用于冷凍。
本發(fā)明的藥物組合物可以配制成以下形式并使用用于口腔給藥的片劑、膠囊劑或酏劑；用于直腸給藥的栓劑；用于注射給藥的優(yōu)選的無菌溶液或無菌粉劑或懸液等等?？烧{(diào)整給藥劑量和方法以實(shí)現(xiàn)最佳效力，但是將取決于這樣的因素比如體重、飲食、并行的藥物處理和其它因素，這是醫(yī)藥領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到的。
當(dāng)進(jìn)行胃腸外給藥時，比如靜脈內(nèi)和皮下，例如以每日為基礎(chǔ)，注射用藥物組合物可制備成水溶液或懸液的常規(guī)形式；適用在臨用前重建或在注射前懸于液體中的凍干固體形式，或作為乳劑。
用于重建凍干產(chǎn)品的稀釋劑可以是上述列表中的適當(dāng)緩沖劑、水、鹽水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸鈉、鹽酸半胱氨酸；或添加洗滌劑比如Tween 20、Tween 80、SDS、泊洛沙姆例如Pluronic F-68或Pluronic F-127、聚乙二醇和或添加防腐劑比如對甲酚、間甲酚和鄰甲酚、對羥苯甲酸甲酯和對羥苯甲酸丙酯、酚、苯甲醇、苯甲酸鈉、苯甲酸、苯甲酸芐酯、山梨酸、丙酸、對羥基苯甲酸酯和或添加有機(jī)改性劑比如乙醇、乙酸、檸檬酸、乳酸或其鹽的注射用水。
此外，如果需要，所述注射用藥物組合物可包含少量非毒性輔助物質(zhì)，比如濕潤劑或pH緩沖劑?？墒褂迷鰪?qiáng)吸收的制劑(例如脂質(zhì)體、洗滌劑和有機(jī)酸)。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，將化合物配制成用于輸注給藥，例如在用作全胃腸外營養(yǎng)治療的患者(例如新生兒，或患有惡病質(zhì)或厭食癥的患者)的液體營養(yǎng)補(bǔ)充劑時，或用于注射給藥，例如皮下、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)，并且相應(yīng)地以無菌和無熱原形式的水溶液使用，并優(yōu)選地緩沖至生理上可接受的pH，例如弱酸性或生理pH。用于肌內(nèi)給藥的制劑可基于植物油溶液或懸液，例如蕓苔油、玉米油或大豆油。這些基于油的制劑可利用抗氧化劑進(jìn)行穩(wěn)定，例如BHA(丁化羥基苯甲醚)和BHT(丁化羥基甲苯)。
因此，本發(fā)明的肽化合物可在載體如蒸餾水或鹽水、磷酸緩沖鹽水、5％葡萄糖溶液或油中施用。如果需要，可通過摻入增溶劑例如洗滌劑和乳化劑提高GLP-2類似物的溶解度。
為了用作注射劑，可向水性載體或載體中補(bǔ)充明膠，所述明膠的量是在注射部位處或附近駐留GLP-2類似物使得GLP-2類似物向理想的作用部位緩慢釋放的量。替代的凝膠劑比如透明質(zhì)酸也可用作駐留劑(depot agents)。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述制劑包含 a.溶解在水中的L-組氨酸，終濃度為0.5mM至300mM，優(yōu)選3至200mM，最優(yōu)選20至100mM； b.甘露醇，最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選100mM至230mM；和 c.乙酸，溶液中最高為200mM，優(yōu)選0.05至100mM，最優(yōu)選0.5至50mM。
添加適當(dāng)量的治療化合物以達(dá)到濃度為1至100mg/mL，優(yōu)選5至50mg/mL，最優(yōu)選10至30mg/mL。將pH調(diào)整為終pH為4至8，優(yōu)選6.5至7.5，最優(yōu)選6.7至7.3。將所得的溶液調(diào)整成目標(biāo)重量，無菌過濾并以適當(dāng)?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體產(chǎn)物或凍干產(chǎn)物進(jìn)一步處理所述制劑。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述制劑包含 a.溶解在水中的L-組氨酸，終濃度為0.5mM至300mM，優(yōu)選3至200mM，最優(yōu)選20至100mM； b.L-精氨酸，最高為200mM，優(yōu)選0.5至100mM，最優(yōu)選5至50mM； c.甘露醇，最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選100至230mM；和 d.醋酸，溶液中最高為200mM，優(yōu)選0.05至100mM，最優(yōu)選0.5至50mM。
添加適當(dāng)量的治療化合物以達(dá)到濃度為1至100mg/mL，優(yōu)選5至50mg/mL，最優(yōu)選10至30mg/mL。將pH調(diào)整為終pH為4至8，優(yōu)選6.5至7.5，最優(yōu)選6.7至7.3。將所得的溶液調(diào)整成目標(biāo)重量，無菌過濾并以適當(dāng)?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體產(chǎn)物或凍干產(chǎn)物進(jìn)一步處理所述制劑。
在本發(fā)明的又一個實(shí)施方案中，所述制劑包含 a.溶解在水中的L-組氨酸，終濃度最高為200mM，優(yōu)選3至100mM，最優(yōu)選5至50mM L-組氨酸； b.L-精氨酸，最高為200mM，優(yōu)選0.5至100mM，最優(yōu)選5至50mM； c.甘露醇，最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選100至230mM；和 d.醋酸，溶液中最高為200mM，優(yōu)選0.05至100mM，最優(yōu)選0.5至50mM。
添加適當(dāng)量的治療化合物以達(dá)到濃度為1至100mg/mL，優(yōu)選5至50mg/mL，最優(yōu)選10至30mg/mL。將pH調(diào)整為終pH為4至8， 優(yōu)選6.5至7.5，最優(yōu)選6.7至7.3。將所得的溶液調(diào)整成目標(biāo)重量，無菌過濾并以適當(dāng)?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體產(chǎn)物或凍干產(chǎn)物進(jìn)一步處理所述制劑。
在本發(fā)明的又一個實(shí)施方案中，所述制劑包含 a.溶解在水中的L-組氨酸，終濃度為0.5mM至300mM，優(yōu)選3至200mM，最優(yōu)選20至100mM； b.L-精氨酸，最高為200mM，優(yōu)選0.5至100mM，最優(yōu)選5至50mM； c.甘露醇，最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選100至230mM；和 d.醋酸，使得溶液中最高為200mM，優(yōu)選0.05至100mM，最優(yōu)選0.5至50mM。
添加適當(dāng)量的治療化合物以達(dá)到濃度為1至100mg/mL，優(yōu)選5至50mg/mL，最優(yōu)選10至30mg/mL。將pH調(diào)整為終pH為4至8，優(yōu)選6.5至7.5，最優(yōu)選6.7至7.3。將所得的溶液調(diào)整成目標(biāo)重量，無菌過濾并以適當(dāng)?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體產(chǎn)物或凍干產(chǎn)物進(jìn)一步處理所述制劑。
在本發(fā)明的又一個實(shí)施方案中，所述制劑包含 a.溶解在水中的L-組氨酸，終濃度最高為200mM，優(yōu)選3至100mM，最優(yōu)選5至50mM L-組氨酸； b.L-精氨酸，最高為200mM，優(yōu)選0.5至100mM，最優(yōu)選5至50mM； c.甘露醇，最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選100至230mM；和 d.醋酸，使得溶液中最高為200mM，優(yōu)選0.05至100mM，最優(yōu)選0.5至50mM。
添加適當(dāng)量的治療化合物以達(dá)到濃度為1至100mg/mL，優(yōu)選5至50mg/mL，最優(yōu)選10至30mg/mL。將pH調(diào)整為終pH為4至8，優(yōu)選6.5至7.5，最優(yōu)選6.7至7.3。將所得的溶液調(diào)整成目標(biāo)重量，無菌過濾并以適當(dāng)?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體產(chǎn)物或凍干產(chǎn)物進(jìn)一步處理所述制劑。
在本發(fā)明的又一個實(shí)施方案中，所述制劑包含 a.溶解在水中的N-乙酸鹽，終濃度最高為200mM，優(yōu)選3至100mM，最優(yōu)選5至50mM L-組氨酸； b甘露醇，最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選100至230mM；和 添加適當(dāng)量的治療化合物以達(dá)到濃度為1至100mg/mL，優(yōu)選5至50mg/mL，最優(yōu)選10至30mg/mL。將pH調(diào)整為終pH為4至8，優(yōu)選6.5至7.5，最優(yōu)選6.7至7.3。將所得的溶液調(diào)整成目標(biāo)重量，無菌過濾并以適當(dāng)?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體產(chǎn)物或凍干產(chǎn)物進(jìn)一步處理所述制劑。
還可將本發(fā)明的GLP-2類似物配制成緩慢釋放的植入裝置，用于延長和持續(xù)施用GLP-2肽類似物。這樣的持續(xù)釋放制劑可以是位于身體表面的貼片形式。持續(xù)釋放制劑的實(shí)例包括生物相容性聚合物的復(fù)合材料，比如聚(乳酸)、乳酸-羥基乙酸共聚物、甲基纖維素、透明質(zhì)酸、唾液酸、硅酸鹽、膠原、脂質(zhì)體等。當(dāng)希望提供本發(fā)明GLP-2類似物的高局部濃度時，所述持續(xù)釋放制劑是特別有意義的。
可以以含有腸營養(yǎng)(intestinotrophic)量的肽的無菌-填充小瓶或安瓿形式、以單位劑量或多劑量的量應(yīng)用GLP-2類似物。所述小瓶或安瓿可含有GLP-2類似物和理想的載體，作為可施用的制劑?；蛘撸鲂∑炕虬碴晨珊羞m于在適當(dāng)載體(如無菌水或磷酸緩沖鹽水)中重建的形式(如冷凍形式)的GLP-2肽。
作為注射制劑的替代方案，GLP-2類似物可配制成用于通過其它途徑給藥?？筛鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)藥物實(shí)踐配制口服劑型比如片劑、膠囊劑等。根據(jù)本發(fā)明，施用GLP-2類似物以治療將受益于小腸組織生長的個體。
可通過加入增強(qiáng)劑例如殼聚糖或洗滌劑例如Tween 20、Tween80、泊洛沙姆例如Pluronic F-68、Pluronic F-127、Brij 35、Brij 72、cremophor EL來配制鼻腔劑型。
本發(fā)明的肽化合物可單獨(dú)使用，或者與具有抗炎效應(yīng)的化合物組合使用。不限于理論地，設(shè)想這樣的組合治療可增強(qiáng)本發(fā)明肽類似物的有益治療效果。
當(dāng)然，最適于患者治療的治療劑量和方案將根據(jù)待治療的疾病或病癥以及患者的體重和其它參數(shù)而變化。不希望限于任何特定理論地，預(yù)計μg/kg范圍內(nèi)的劑量以及更短或更長的治療時間或頻率可產(chǎn)生治療上有用的結(jié)果，比如尤其是小腸質(zhì)量的統(tǒng)計學(xué)顯著性增加。在一些情況下，治療方案可包括施用維持劑量，所述劑量適于預(yù)防初始治療停止后出現(xiàn)的組織退化?？筛鶕?jù)本發(fā)明得到的結(jié)果指導(dǎo)最適于人類應(yīng)用的劑量大小和給藥方案，并可在正確設(shè)計的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行證實(shí)。
可通過常規(guī)手段確定有效劑量和治療方案，從實(shí)驗(yàn)動物中的低劑量開始，然后提高劑量同時監(jiān)測效果，并系統(tǒng)性地變化給藥方案。在對給定的對象確定最佳劑量時，臨床醫(yī)生可考慮許多因素。這樣的考慮因素是技術(shù)人員公知的。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明GLP-2肽的人類劑量可以從約10μg/kg體重/天至約10mg/kg/天，優(yōu)選約50μg/kg/天至約5mg/kg/天，并且最優(yōu)選約100μg/kg/天至約1mg/kg/天。
醫(yī)療條件 通過施用有效量的本文所述的GLP-2類似物或其鹽，本發(fā)明的肽可用作預(yù)防或治療患有胃腸(包括食管上消化道)病癥的個體的藥劑。所述胃和腸相關(guān)病癥包括任何病因的潰瘍(例如消化性潰瘍、藥物誘發(fā)的潰瘍、與感染或其它病原體有關(guān)的潰瘍)、消化病癥、吸收不良綜合征、短腸綜合征、盲管綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉(例如由麩質(zhì)誘發(fā)的腸病或乳糜瀉病引起)、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、小腸損傷和化學(xué)療法誘發(fā)的腹瀉/粘膜炎(CID)。
如上文一般所述，將受益于小腸質(zhì)量提高以及隨后發(fā)生和/或維持正常小腸粘膜結(jié)構(gòu)和功能的個體是采用本發(fā)明GLP-2類似物治療的候選者?？捎肎LP-2類似物治療的具體病癥包括多種形式的斯?jié)姳R腹瀉，包括腹型斯?jié)姳R腹瀉，其由熱α-麥醇溶蛋白的毒性反應(yīng)引起，并且可能是麩質(zhì)誘發(fā)的腸病或乳糜瀉病的結(jié)果，以小腸絨毛的顯著喪失為特征；熱帶型斯?jié)姳R腹瀉，由感染引起，以絨毛的部分扁平為特征；丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉，通常在患有普通變異型免疫球蛋白缺乏癥或低丙種球蛋白血癥的患者中觀察到，以絨毛高度顯著降低為特征。GLP-2類似物治療的治療效力可通過檢查絨毛形態(tài)的腸活檢、營養(yǎng)吸收的生物化學(xué)評估、患者的體重增加、或這些病癥相關(guān)癥狀的改善來監(jiān)測。
除上述以外，可用本發(fā)明GLP-2類似物治療或可用GLP-2類似物預(yù)防的其它病癥還包括上述放射性腸炎、傳染性腸炎或感染后腸炎以及由于癌癥化學(xué)治療劑或毒劑引起的小腸損傷。
GLP-2類似物還可用于治療營養(yǎng)不良，例如惡病質(zhì)和厭食癥。
本發(fā)明的具體實(shí)施方案涉及使用本發(fā)明的肽預(yù)防和/或治療腸損傷和功能障礙。這樣的損傷和功能障礙是癌癥化學(xué)療法治療熟知的副作用?；瘜W(xué)療法的施用經(jīng)常伴隨著涉及胃腸系統(tǒng)的不需要的副作用，比如粘膜炎、腹瀉、細(xì)菌易位、吸收不良、腹部痛性痙攣、胃腸出血和嘔吐。這些副作用是腸上皮結(jié)構(gòu)和功能損傷的臨床結(jié)果，經(jīng)常使得必須降低化學(xué)療法的劑量和頻率。施用本發(fā)明的GLP-2肽激動劑可增強(qiáng)腸隱窩的營養(yǎng)效應(yīng)并且迅速提供新細(xì)胞以取代化學(xué)療法后損傷的腸上皮。施用本發(fā)明肽實(shí)現(xiàn)的最終目標(biāo)是降低進(jìn)行化學(xué)療法治療患者中相關(guān)胃腸損傷的發(fā)病率，同時產(chǎn)生癌癥治療的最佳化學(xué)療法方案。根據(jù)本發(fā)明，可向正在進(jìn)行或準(zhǔn)備進(jìn)行放射療法的患者提供伴隨的預(yù)防性或治療性治療。
由于增殖迅速，小腸粘膜干細(xì)胞對化學(xué)療法的細(xì)胞毒效應(yīng)特別敏感(Keefe等，Gut 2000；47632-7)。臨床上，化學(xué)療法引起的小腸粘膜損傷通常稱為胃腸粘膜炎，特征為小腸吸收和屏障受損。例如，已經(jīng)顯示廣泛應(yīng)用的化學(xué)治療劑5-FU、伊立替康和氨甲蝶呤提高凋亡，引起嚙齒動物小腸絨毛萎縮和隱窩發(fā)育不全(Keefe等，Gut 47632-7，2000；Gibson等，J Gastroenterol Hepatol.Sep；18(9)1095-1100，2003；Tamaki等，J lnt Med Res.31(1)6-16，2003)。在人中，已經(jīng)顯示化學(xué)治療劑在施用后24小時提高腸隱窩中的凋亡，并且其后在化學(xué)治療后3天降低絨毛面積、隱窩長度、每個隱窩的有絲分裂數(shù)和腸細(xì)胞高度(Keefe等，Gut 2000；47632-7)。因此，小腸內(nèi)的結(jié)構(gòu)變化直接導(dǎo)致腸功能障礙，并在一些情況下導(dǎo)致腹瀉。
癌癥化學(xué)療法后的胃腸粘膜炎是一旦出現(xiàn)就基本上不能治療的日益嚴(yán)重的問題，盡管能逐漸緩和。利用常用的細(xì)胞抑制癌癥藥物5-FU和伊立替康進(jìn)行的研究證明，使用這些藥物的有效化學(xué)療法主要影響小腸的結(jié)構(gòu)完整性和功能，而結(jié)腸的敏感性較低，并且主要應(yīng)答為粘液形成的提高(Gibson等，J Gastroenterol Hepatol.Sep；18(9)1095-1100，2003；Tamaki等，J Int Med Res.31(1)6-16，2003)。
本發(fā)明的新GLP-2類似物可用于預(yù)防和/或治療化學(xué)治療劑的胃腸損傷和副作用。這種可能很重要的治療應(yīng)用可適用于目前使用的化學(xué)治療劑，例如但不限于5-FU、六甲蜜胺、博來霉素、白消安、卡培他濱、卡鉑、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、Crisantaspase、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、放線菌素D、柔紅霉素、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、脂質(zhì)體多柔比星、亞葉酸、洛莫司汀、美法侖、巰嘌呤、美司鈉、氨甲蝶呤、絲裂霉素、米托蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇、Pemetrexed、噴司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、鏈脲菌素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、塞替派、硫鳥嘌呤/硫代鳥嘌呤、托泊替康、曲奧舒凡、長春堿、長春新堿、長春地辛、長春瑞濱、博來霉素、白消安、卡培他濱、卡鉑、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、Crisantaspase、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、放線菌素D、柔紅霉素、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、脂質(zhì)體多柔比星、亞葉酸、洛莫司汀、美法侖、巰嘌呤、氨甲蝶呤、絲裂霉素、米托蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇、Pemetrexed、噴司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、鏈脲菌素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、塞替派、硫鳥嘌呤/硫代鳥嘌呤、托泊替康、曲奧舒凡、長春堿、長春新堿、長春地辛和長春瑞濱。
設(shè)想可通過施用有效量的GLP-2類似物或其鹽將本發(fā)明的肽用于治療新生兒的方法中。通過利用本發(fā)明的肽激動劑可克服由于缺少腸發(fā)育造成的喂養(yǎng)新生兒的相關(guān)并發(fā)癥。
在本發(fā)明的另外一個實(shí)施方案中，描述了通過向有此需要的患者施用有效量的GLP-2類似物或其鹽來治療DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)的病癥的方法。這樣的疾病包括DPP-IV酶過表達(dá)的病癥。
在一個實(shí)施方案中，可將藥物組合物配制成引起上述GLP-2類似物或其鹽或衍生物的緩慢釋放。
設(shè)想可通過施用有效量的GLP-2類似物或其鹽將本發(fā)明的肽用于治療新生兒的方法中。通過利用本發(fā)明的肽激動劑可克服由于缺少腸發(fā)育造成的喂養(yǎng)新生兒的相關(guān)并發(fā)癥。
在本發(fā)明的另外一個實(shí)施方案中，描述了通過向有此需要的患者施用有效量的GLP-2類似物或其鹽來治療DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)的病癥的方法。這樣的疾病包括DPP-IV酶過表達(dá)的病癥。
實(shí)施例 提供下述實(shí)施例用于說明本發(fā)明的優(yōu)選方面，而不意在限制本發(fā)明的范圍。
一般肽合成 儀器和合成策略 在裝有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中分批合成肽，使用9-芴甲氧羰基(Fmoc)作為N-α-氨基保護(hù)基和適當(dāng)?shù)耐ㄓ脗?cè)鏈功能性保護(hù)基。
溶劑 將溶劑DMF(N，N-二甲基甲酰胺，Riedel de-Haen，Germany)通過填充強(qiáng)陽離子交換樹脂(Lewatit S 100 MB/H strong acid，BayerAG Leverkusen，Germany)的柱進(jìn)行純化，并在使用前加入3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt-OH)分析其中的游離胺，如果存在游離胺，則產(chǎn)生黃色(Dhbt-O-陰離子)。不經(jīng)純化直接使用溶劑DCM(二氯甲烷，分析級，Riedel de-Haen，Germany)。不經(jīng)純化直接使用乙腈(HPLC-級，Lab-Scan，Dublin Ireland)。
氨基酸 以適當(dāng)?shù)膫?cè)鏈保護(hù)形式從Advanced ChemTech(ACT)購得Fmoc保護(hù)的氨基酸。
偶聯(lián)試劑 偶聯(lián)試劑二異丙基碳二亞胺(DIC)購自Riedel de-Haen，Germany。
固體支持物 在TentaGel S樹脂0.22-0.31mmol/g上合成肽，在優(yōu)選C端酰胺化肽的情況下使用TentaGel S-Ram、TentaGel SRAM-Lys(Boc)Fmoc(Rapp polymere，Germany)，而當(dāng)優(yōu)選C端游離羧酸時使用TentaGel S PHB，TentaGel S PHB Lys(Boc)Fmoc。
催化劑和其它試劑 二異丙基乙胺(DIEA)購自Aldrich，Germany，哌啶和吡啶來自Riedel-de Haen，F(xiàn)rankfurt，Germany。ethandithiol購自Riedel-de Haen，F(xiàn)rankfurt，Germany。3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt-OH)、1-羥基苯并三唑(HOBt)(HOAt)得自Fluka，Switzerland。乙酸酐得自Fluka。
偶聯(lián)方案 在DMF中通過DIC法由適當(dāng)?shù)腘-a-保護(hù)的氨基酸和HObt或HOAt將氨基酸偶聯(lián)為原位合成的HObt或HOAt酯。在80℃進(jìn)行茚三酮測試檢查酰化作用，以防止測試期間Fmoc去保護(hù)(Larsen，B.D.and Holm，A.，Int.J.Peptide Protein Res.43，1994，1-9)。
N-α-氨基保護(hù)基(Fmoc)的去保護(hù) 按以下進(jìn)行Fmoc基的去保護(hù)利用DMF中的20％哌啶進(jìn)行處理(1×5和1×10分鐘)，隨后用DMF沖洗(5×15ml，每次5分鐘)直到向排出的DMF中加入Dhbt-OH后不能檢測到黃色為止。HOBt-酯的偶聯(lián) 將3份N-α-氨基保護(hù)的氨基酸與3份HObt和3份DIC一起溶解在DMF中，然后加入樹脂中。
用酸從樹脂中切割肽 利用95％三氟乙酸(TFA，Riedel-de Haen，F(xiàn)rankfurt，Germany)-水(體積/體積)或95％TFA和5％乙二硫醇(體積/體積)在室溫下處理2小時從樹脂中切割肽。用95％TFA-水洗滌過濾的樹脂，減壓蒸發(fā)濾液和洗液。用醚沖洗殘留物并在醋酸-水中凍干。通過高效液相層析(HPLC)分析粗冷凍產(chǎn)物并通過質(zhì)譜(MS)進(jìn)行鑒定。
在TentaGel樹脂(PEG-PS)上進(jìn)行分批肽合成 將TentaGel樹脂(1g，0.23-0.24mmol/g)置于裝有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。所述樹脂在DMF(15ml)中膨脹，并用DMF中的20％哌啶處理，以除去接頭TentaGel S RAM上或樹脂TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc的第一個氨基酸上的初始Fmoc基團(tuán)。排干樹脂并用DMF洗滌直到向排出的DMF中加入Dhbt-OH后不能檢測到黃色為止。如上述將根據(jù)序列的氨基酸偶聯(lián)為預(yù)制的Fmoc-保護(hù)的HObt酯(3份)。除非另外指出，繼續(xù)偶聯(lián)2小時。排干樹脂并用DMF(5×15ml，每次5分鐘)洗滌以除去過量的試劑。通過上述茚三酮測試檢查所有的?；饔?。完成合成后，用DMF(3×15ml，每次5分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)以及最后用二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)洗滌肽-樹脂，并真空干燥。如上所述從樹脂中切割肽并如下所述分析和純化粗肽產(chǎn)物。
HPLC條件 用HP1100四元泵、HP1100自動進(jìn)樣器、HP1100柱恒溫器和HP1100多波長檢測器組成的Hewlett Packard HP 1100 HPLC系統(tǒng)進(jìn)行梯度HPLC分析。使用Hewlett Packard Chemstation for LC軟件(A.06.01版)進(jìn)行儀器控制和數(shù)據(jù)采集。使用以下的柱和HPLC緩沖系統(tǒng) 柱VYDAC 238TP5415，C-18，5mm，300150×4.6mm。
緩沖液AMQV中0.1％的TFA；B0.085％TFA、10％MQV、90％MeCN。
梯度0-1.5分鐘.0％B 1.5-25分鐘50％B 25-30分鐘100％B 30-35分鐘100％B 35-40分鐘0％B 流速1ml/分鐘，箱溫度40℃，UV檢測I＝215nm。
粗肽的HPLC純化 通過PerSeptive Biosystems VISION工作站純化粗肽產(chǎn)物，VISION 3.0軟件用于儀器控制和數(shù)據(jù)采集。使用下述柱和HPLC緩沖系統(tǒng) 柱Kromasil KR 100，10mm C-8，250×50.8mm。
緩沖體系緩沖液AMQV中0.1％的TFA；B0.085％TFA、10％MQV、90％MeCN。
梯度0-37分鐘.0-40％B 流速35ml/分鐘，UV檢測I＝215nm和280nm。
質(zhì)譜 將肽溶解在超梯度甲醇(Labscan，Dublin，Ireland)、milli-Q水(Millipore，Bedford，MA)和甲酸(Merck，Damstadt，Germany)(50∶50∶0.1 v/v/v)中得到1至10mg/ml的濃度。利用準(zhǔn)確度為+/-0.1m/z的LCT質(zhì)譜儀(Micromass，Manchester，UK)通過ESI-TOF-MS以正極性方式分析肽溶液(20ml)。
一般合成方案 在所有合成中，將干燥的TentaGel-S-Ram樹脂(1g，0.22-0.31mmol/g)置于裝有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。所述樹脂在DMF(15ml)中膨脹，并用含有20％哌啶的DMF處理以保證樹脂上非質(zhì)子化氨基的存在。排干樹脂并用DMF洗滌，直到向排出的DMF中加入Dhbt-OH后不能檢測到黃色為止。如上述將根據(jù)序列的氨基酸偶聯(lián)為預(yù)制的Fmoc-保護(hù)的HObt酯(3份)。除非另外指出，繼續(xù)偶聯(lián)2小時。排干樹脂并用DMF(5×15ml，每次5分鐘)洗滌以除去過量的試劑。在80℃進(jìn)行茚三酮測試檢查所有的?；饔谩Ｍ瓿珊铣珊?，用DMF(3×15ml，每次5分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)以及最后用二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)洗滌肽-樹脂，并真空干燥。如上所述從樹脂中切割肽并凍干。利用上述制備性HPLC純化后，收集肽產(chǎn)物并通過ES-MS確定肽的身份。該方案用于合成下文進(jìn)一步示例的所有肽。
合成的化合物 利用上述技術(shù)，使用上述方法合成化合物1809至1861以及參照化合物1559(H-[Gly2]hGLP-2-OH)(表1)。
表1合成的化合物 *)產(chǎn)量；產(chǎn)量/g樹脂 實(shí)施例1.化合物1846的合成 TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc上的H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2。
將干燥的TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24mmol/g，1g)置于裝有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并如“ TentaGel樹脂上分批式肽合成”所述進(jìn)行處理直到完成N端組氨酸的偶聯(lián)。所有偶聯(lián)均持續(xù)過夜。如上所述檢查?；饔?。完成合成和N端Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后，如上所述從樹脂中切割肽。如上所述利用制備性HPLC純化后，收集了28.8mg純度高于90％的肽產(chǎn)物，并通過MS確定肽的身份(實(shí)測M4315.38，計算M4315.41)。
實(shí)施例2.化合物1848的合成 TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc上的H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2。
將干燥的TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24mmol/g，1g)置于裝有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并如“TentaGel樹脂上分批式肽合成”所述進(jìn)行處理直到完成N端組氨酸的偶聯(lián)。所有偶聯(lián)均持續(xù)過夜。如上所述檢查?；饔?。完成合成和N端Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后，如上所述從樹脂中切割肽。如上所述利用制備性HPLC純化后，收集了230mg純度高于90％的肽產(chǎn)物，并通過MS確定肽的身份(實(shí)測M4313.63，計算M4313.43)。
實(shí)施例3.化合物1855的合成 TentaGel S RAM-Asp(OtBu)Fmoc上的H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2。
將干燥的TentaGel S RAM-Asp(OtBu)Fmoc(0.2mmol/g，1g)置于裝有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并如“TentaGel樹脂上分批式肽合成”所述進(jìn)行處理直到完成N端組氨酸的偶聯(lián)。所有偶聯(lián)均持續(xù)過夜。如上所述檢查?；饔?。完成合成和N端Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后，如上所述從樹脂中切割肽。如上所述利用制備性HPLC純化后，收集了27.3mg純度高于90％的肽產(chǎn)物，并通過MS確定肽的身份(實(shí)測M3547，計算M3546.84)。
實(shí)施例4.化合物1857的合成 TentaGel S RAM-Asp(OtBu)Fmoc上的H-His-Gly-Glu-GIy-Thr-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2。
將干燥的TentaGel S RAM-Asp(OtBu)Fmoc(0.2mmol/g，1g)置于裝有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中，并如“TentaGel樹脂上分批式肽合成”所述進(jìn)行處理直到完成N端組氨酸的偶聯(lián)。所有偶聯(lián)均持續(xù)過夜。如上所述檢查?；饔谩Ｍ瓿珊铣珊蚇端Fmoc基團(tuán)去保護(hù)后，如上所述從樹脂中切割肽。如上所述利用制備性HPLC純化后，收集了39.3mg純度高于90％的肽產(chǎn)物，并通過MS確定肽的身份(實(shí)測M3544.88，計算M3544.86)。
實(shí)施例5.化合物1846A(乙酸鹽)的合成 由三氟乙酸反離子交換為化合物1846的乙酸鹽。
由于用于純化粗合成肽產(chǎn)物的HPLC緩沖液中存在三氟乙酸(0.1％體積/體積)，因此以三氟乙酸鹽分離經(jīng)純化的化合物1846合成肽產(chǎn)物。
為了與乙酸交換反離子三氟乙酸，使肽溶液通過在乙酸上填充強(qiáng)堿離子交換樹脂的柱(Dowe×1×8)。將365mg化合物1溶解在40ml水中。使所述溶液通過在乙酸上含有40ml強(qiáng)堿離子交換樹脂的柱(Dowe×1×8；容量1.33meq/ml樹脂)。然后用4×30ml水洗滌樹脂，收集洗脫液并凍干得到312mg乙酸鹽，根據(jù)HPLC分析的純度為97％。
實(shí)施例6.化合物1848C(鹽酸鹽)的合成 由三氟乙酸(Tfa)反離子交換為化合物1846的氯化物(Cl-)。
將100mg化合物溶解在50ml 0.1M鹽酸中并凍干所得的溶液。將剩余物溶解在50ml水中并再次凍干得到80mg鹽酸鹽，根據(jù)HPLC的純度為93％。
實(shí)施例7-化學(xué)穩(wěn)定性測試 將GLP-2類似物溶解在純凈水中并隨后稀釋在含有HCl、NaOH、H2O2或NH4HCO3的溶液中。在40℃孵育所述溶液以產(chǎn)生水解、脫酰胺和氧化產(chǎn)物。通過RP-HPLC分析樣品并測定剩余的完整化合物的百分率作為相對穩(wěn)定性的度量。通過LC-MS試驗(yàn)性地確定主要的降解產(chǎn)物。表3中列舉了所用的肽。
表2.測試并比較化學(xué)穩(wěn)定性的GLP-2類似物 化合物ZP1559、Gly2-GLP-2用作被測試的其它GLP-2類似物的參照。在GLP-2類似物中，以粗體顯示序列中不同于參照化合物ZP1559的位置。表3中列舉了所述序列。
根據(jù)其序列以及含有和不含有C端-K6延伸以配對形式列舉化合物。
表3.Gly2-GLP-2和GLP-2類似物的序列 表4列舉了實(shí)驗(yàn)中所用的化學(xué)品。
表4.用于分析方案的化學(xué)品和試劑 首先去除水中的礦物質(zhì)使得電阻＞18MΩcm，然后將其通過Milli-Q系統(tǒng)(Millipore，Bedford，USA)。最后使Milli-Q純化水(MQW)通過0.22-μm無菌濾器(Millipak 40 Gamma Gold，Millipore)。
將測試的GLP-2類似物和參照Gly2-GLP-2、ZP1559溶解在水中，隨后稀釋到含有HCl、NaOH、H2O2或NH4HCO3的溶液中。在40℃孵育所述溶液以分別產(chǎn)生水解、脫酰胺和氧化產(chǎn)物。通過RP-HPLC分析化合物中原始主峰的純度并通過LC-MS由主峰和主要降解產(chǎn)物的質(zhì)量確定特征。
脅迫溶液的制備 0.2M HCl 4mL MQW和1mL 1M HCl。
0.02M NaOH4mL MQW和1mL 0.1M NaOH。
0.2M NH4HCO3，pH80.79g NH4HCO3溶解在50mL MQW中。
1％H2O25.8mL MQW和0.2mL 30％H2O2。
樣品落液； 首先將GLP-2類似物溶解在MQW中，濃度為4mg/mL，然后以1∶1比例(例如125μL加125μL)進(jìn)一步稀釋在所述脅迫溶液中。對于分別為0.1M HCl、0.01M NaOH、0.1M NH4HCO3和0.5％H2O2的脅迫條件，GLP-2類似物的終濃度為2mg/mL。
在通過RP-HPLC和LC-MS分析之前，在40℃下在黑暗中孵育所述溶液，然后稀釋在洗脫液A中，濃度為0.5mg/mL(加入750μL)。
表5.脅迫測試的條件 RP-HPLC 在Agilent Technologies，Inc.的ChemStation(A.08.03[847]版)軟件的Agilent Series 1100 HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行RP-HPLC分析。利用Agilent Technologies Revision B01.03軟件將原始數(shù)據(jù)和峰整合結(jié)果存放到ChemStore C/S服務(wù)器上。
表6.RP-HPLC法 LC-MS 在由在線脫氣設(shè)備、四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱恒溫器、UV檢測器組成的Agilent Technologies 1100 HPLC儀器上進(jìn)行分析性LC-MS分析。所述HPLC儀器與受控于來自MicroMass，UK的Masslynx 3.5軟件的Micromass LCT(ESI-TOF)質(zhì)譜儀相連。
表7.LC-MS法 表8.根據(jù)SOP22-3003的MS設(shè)置 表9中顯示在脅迫條件下孵育后通過RP-HPLC測量的化合物純度結(jié)果?，F(xiàn)對于T＝0測量的純度，該純度是在脅迫溶液中孵育后剩余完整化合物的度量。這些結(jié)果不考慮通過該分析性RP-HPLC法未觀察到的可能隱藏的降解產(chǎn)物。
通過LC-MS法試驗(yàn)性地確定脅迫試驗(yàn)樣品中的主要降解產(chǎn)物。通過該LC-MS法未觀察到母體化合物的任何異構(gòu)體以及次要的降解產(chǎn)物。表11至15列舉試驗(yàn)性的鑒定。
根據(jù)其序列以及含有和不含有C端-K6延伸以配對形式列舉GLP-2類似物。
表9.在脅迫條件下孵育后觀察到的測試化合物純度 未列舉在NaOH中孵育的化合物的結(jié)果，因?yàn)槲茨苡^察到穩(wěn)定性的差異。通過LC-MS分析，降解產(chǎn)物和主峰都具有相同的質(zhì)量；這些化合物可能隨時間發(fā)生外消旋化。表9中的結(jié)果顯示，被測試的GLP-2類似物一般比Gly2-GLP-2參照、ZP1559具有更好的化學(xué)穩(wěn)定性。
酸水解中，除了ZP1820和ZP1834以外，測試的GLP-2類似物比Gly2-GLP-2參照、ZP1559更穩(wěn)定。這主要是由于3位的氨基酸Asp。Glu而不是Asp可能將氨基酸3和4Asp-Gly之間的切割最小化。被測試的其它ZP GLP-2類似物確實(shí)具有大致相同的穩(wěn)定性，并且不含有C端-K6的化合物、ZP1855、ZP1857和ZP1858的穩(wěn)定性稍高。這種差異由33位氨基酸Asp來進(jìn)行解釋。在不含有C端-K6的化合物中，該氨基酸是C-末端，氨基酸32和33Tyr-Asp之間的切割比氨基酸33和33Asp-Lys之間的切割更慢。穩(wěn)定性的差異是由于Asp而不是C端-K6。
在加速氧化(H2O2，還見表10和13)條件下，測試的GLP-2類似物比Gly2-GLP-2參照、ZP1559穩(wěn)定得多。這可能是由于ZP1559中10位Met的氧化。ZP1855是一個例外，其顯示無法解釋的低穩(wěn)定性。這可能是ZP1855批次特有的，需要進(jìn)一步研究來解釋。
促進(jìn)脫酰胺(NH4HCO3)條件下的穩(wěn)定性，測試的GLP-2類似物比Gly2-GLP-2參照、ZP1559更穩(wěn)定。這可能是由于ZP1559中11位、16位和24位Asn這幾個脫氨基位點(diǎn)在測試的GLP-2類似物序列中是不存在的。
通過LC-MS試驗(yàn)性地確定主要降解產(chǎn)物 表10.ZP GLP-2類似物和參照ZP1559中的主要切割位點(diǎn) ZP1559HGD↓GS FSDEM N↓TILD NLAAR DFINW LIQTK ITD-OH ZP1820HGD↓GS FTSEL ATILDNLAAR DFIAW LIQTK K6-NH2 ZP1834HGD↓GS FTSEL ATILDNLAAR DFIAW LIQTK -NH2 ZP1846HGEGSFSSEL STILDALAAR DFIAW LIATK ITD↓K6-NH2 ZP1855HGEGSFSSEL STILDALAAR DFIAW LIATK IT↓D-NH2 ZP1848HGEGTFSSEL ATILDALAAR DFIAW LIATK ITD↓K6-NH2 ZP1857HGEGTFSSEL ATILDALAAR DFIAW LIATK IT↓D-NH2 ZP1849HGEGSFSSEL ATILDALAAR DFIAW LIATK ITD↓K6-NH2 ZP1858HGEGSFSSEL ATILDALAAR DFIAW LIATK IT↓D-NH2 用HCl脅迫的溶液 表11.在40℃和0.1MHCl中孵育12天的GLP-2類似物 na＝不可得，未計算或提示理論MW *質(zhì)量差異是主峰或所提示化合物的測量MW與理論MW的差異 表12的結(jié)果顯示被測試的GLP-2類似物和Gly2-GLP-2參照、ZP1559的測量分子量，對應(yīng)于理論分子量。
ZP1559、ZP1820和ZP1834中最豐富的降解產(chǎn)物是氨基酸3和4；Asp和Gly之間的切割。對于具有C端-K6的化合物ZP1846、ZP1848和ZP1849，檢測到了對應(yīng)于在33至39位失去C端-K6(LyS6)的降解產(chǎn)物。對于不具有C端-K6的化合物ZP1855和ZP1857，檢測到了對應(yīng)于在33位失去C端Asp的降解產(chǎn)物。
檢測到的次要降解產(chǎn)物是氨基酸15和16(Asp和Asn或Asp和Ala)、氨基酸4和5(Gly和Ser)、氨基酸21和22(Asp和Phe)之間的切割。
用H2O2脅迫的溶液 表12.在40℃和0.5％H2O2中孵育3天的GLP-2類似物 na＝不可得，未計算或提示理論MW *質(zhì)量差異是主峰的測量MW與理論MW的差異 表13的結(jié)果顯示測試的GLP-2類似物和Gly2-GLP-2參照、ZP1559的測量分子量對應(yīng)于于理論分子量。對于ZP1559，觀察到MW+16Da的主要降解產(chǎn)物，這可能是10位Met的氧化產(chǎn)物。對于ZP1820和ZP1834，觀察到MW+18Da的主要降解產(chǎn)物。這可能歸因于脫酰胺前體時的失水。此外，觀察到MW-2Da的次要產(chǎn)物，可能在兩個位點(diǎn)脫酰胺。在所有化合物中觀察到MW+16Da的次要降解產(chǎn)物，可能是Trp的氧化。對于不具有C端-K6的化合物ZP1855、ZP1857和ZP1858，檢測到MW-137Da和-65Da的次要降解產(chǎn)物，分別相應(yīng)于在1位失去His和未鑒定的降解產(chǎn)物。
用NaOH脅迫的溶液 表13.在40℃和0.01MNaOH中孵育3天的GLP-2類似物 na＝不可得，未計算或提示理論MW *質(zhì)量差異是主峰的測量MW與理論MW的差異 LC-MS分析顯示每個化合物的所有峰都具有相同的分子量。這意味著最豐富的降解產(chǎn)物可能是序列中一個或多個氨基酸從L-到D-形的外消旋。主峰可隱藏一個或幾個外消旋產(chǎn)物，因此未能確定殘留的完整肽純度。沒有檢測到來自切割的主要降解產(chǎn)物。
用NH4HCO3脅迫的溶液 表14.在40℃和pH8的0.1M NH4HCO3中孵育6天的GLP-2類似物 na＝不可得，未計算或提示理論MW *質(zhì)量差異是主峰的測量MW與理論MW的差異 表14的結(jié)果顯示測試的GLP-2類似物和Gly2-GLP-2參照、ZP1559的測量分子量，對應(yīng)于理論分子量。對于ZP1559，觀察到MW+1Da的次要降解產(chǎn)物，這可能是脫酰胺產(chǎn)物。對于ZP1820、ZP1834和ZP1846，觀察到與主化合物MW相同的次要降解產(chǎn)物。它們可能是外消旋產(chǎn)物或脫酰胺作用。然而，本發(fā)明儀器的MS分辨率不足以確認(rèn)或否決這一點(diǎn)。此外，這些化合物可能存在于其它化合物中，但是由于它們可能隱藏在主峰之下而未被檢測到。
在水解、氧化和脫酰胺的脅迫條件下，所有測試的本發(fā)明GLP-2類似物具有比參照化合物Gly2-GLP-2、1559更好的化學(xué)穩(wěn)定性。由于酸水解，化合物1820和1834的穩(wěn)定性低于其余的6個候選化合物。當(dāng)氨基酸A3是Glu而不是Asp時可見最高的化學(xué)穩(wěn)定性。
除了不具有-K6的候選物具有稍好的穩(wěn)定性以外，未觀察到剩余的6個候選物的化學(xué)穩(wěn)定性的顯著差異，這主要?dú)w因于Asp之后的易變位點(diǎn)以及具有C端-K6的候選化合物中-K6的失去。
實(shí)施例8.在C57BL小鼠中篩選化合物的腸生長效應(yīng) 在雄性C57BL小鼠中檢測本發(fā)明化合物刺激腸生長的能力。在連續(xù)10天中每日兩次對每組(n＝6)小鼠皮下給予30nmol/kg每種化合物。為了對比的目的，在相同的劑量方案中對其它組的動物給予等摩爾劑量的[Gly2]GLP-2或載體(磷酸緩沖鹽水，pH7.4)?；衔镒詈笠淮谓o藥后24小時處死小鼠，清空小腸(從幽門到盲腸)和結(jié)腸(腸遠(yuǎn)端至盲腸)并稱重。為了校正體重(BW)的輕微差異，小腸(SI)和結(jié)腸的器官質(zhì)量表達(dá)為相對于BW的值。已經(jīng)報導(dǎo)非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2在食道、胃、小腸和結(jié)腸中刺激胃腸生長并且評價了化合物引起的生長模式的差異，以下述公式計算化合物X的小腸-結(jié)腸敏感性指標(biāo) (SI/結(jié)腸)x/(SI/結(jié)腸)[Gly2]GLP-2％ 小腸-結(jié)腸敏感性指標(biāo)大于或等于1.05的化合物認(rèn)為對小腸具有相對選擇性(表15)。
小腸-結(jié)腸敏感性指標(biāo)小于或等于0.95的化合物認(rèn)為對結(jié)腸具有相對選擇性(表15)。
表15.選擇性GLP-2類似物化合物列表 結(jié)果 基于所述肽劑量依賴性地提高SI質(zhì)量，相對于等摩爾劑量非選擇性參照化合物[Gly2] GLP-2的效應(yīng)測定本發(fā)明化合物的腸生長效應(yīng)。
該研究的結(jié)果證明，與[Gly2]GLP-2相比，在野生型GLP-2序列的8、16、24和/或28位具有氨基酸替換的GLP-2變體提高了C57BL小鼠中的生物活性。
實(shí)施例9.選定的化合物對C57BL小鼠腸生長的劑量-應(yīng)答效應(yīng) 選擇1820、1855、1846、1858、1849、1848和1857為先導(dǎo)化合物，因?yàn)檫@些化合物相對于[Gly2]GLP-2(實(shí)施例8)都能提高小腸質(zhì)量，并且在脅迫條件(實(shí)施例7)下相對于[Gly2]GLP-2提高化學(xué)穩(wěn)定性。在雄性C57BL小鼠中檢測了1820、1855、ZP1846、1858、1849、1848和1857對小腸質(zhì)量的劑量-應(yīng)答效應(yīng)。在連續(xù)3天中每日兩次對每組(n＝6)小鼠皮下給予5、15、45、135或405nmol/kg每種化合物。為了對比的目的，在相同的劑量方案中對其它組的動物給予等摩爾劑量的[Gly2]GLP-2或載體(磷酸緩沖鹽水，pH7.4)?；衔镒詈笠淮谓o藥后24小時處死小鼠，清空小腸(從幽門到盲腸)并稱重以檢測對小腸質(zhì)量的影響。
結(jié)果 圖1至5顯示相對于參照化合物[Gly2]GLP-2的效應(yīng)的1820、1855、1846、1858、1849、1848和1857對小腸質(zhì)量的效應(yīng)。在每個測試劑量下，將[Gly2]GLP-2對小腸質(zhì)量的效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化為100％。基于所述肽能相對于等摩爾劑量的[Gly2]GLP-2的效應(yīng)而劑量依賴性地提高SI質(zhì)量來測定本發(fā)明的化合物1820、1855、1846、1858、1849、1848和1857對小腸生長的影響?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們可推斷與用[Gly2]GLP-2處理的小鼠相比，含有8個替換(GLP-21809的G2、E3、T5、L10、A11、A16、A24、A28)的GLP-2類似物能顯著提高小腸重量。
具體地，與結(jié)腸相比，將Asp3替換為Glu、將Asn16替換為Ala和將Gln28替換為Ala以選擇性方式使小腸重量提高(1839或1840與1809相比較)。因此，相對于結(jié)腸質(zhì)量，三個氨基酸Asp3、Asn16以及Gln28的替換引起小腸重量的選擇性提高。
此外，Asp8替換為絲氨酸導(dǎo)致選擇性的額外提高，因此導(dǎo)致小腸重量的額外提高而不顯著性影響結(jié)腸的重量(1818、1820、1844、1846、1848、 1849、1852、1853、1855、1858)。
圖1至4顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中相對于參照化合物[Gly2]GLP-2地顯示示例性化合物1846、1855、1848、1857、1849在SI-BW結(jié)腸-BW比的劑量應(yīng)答上的效應(yīng)。在每個測試劑量下，將[Gly2]GLP-2對在小腸質(zhì)量上的效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化為100％。所有示例性化合物均共有8、16和/或28位的修飾，并且顯示引起小場相對于結(jié)腸生長的選擇性提高。
實(shí)施例10-1846、1848、1855和1857對施用5-FU小鼠中小腸萎縮的劑量-應(yīng)答效應(yīng) 小腸干細(xì)胞迅速的增殖率使得它們成為抗癌治療中所使用治療劑的細(xì)胞毒效應(yīng)的敏感性靶標(biāo)。因此，化學(xué)治療劑5-氟尿嘧啶(5-FU)的臨床應(yīng)用經(jīng)常與癌癥患者中的小腸損傷(萎縮和腹瀉)有關(guān)。之前我們已經(jīng)顯示，在連續(xù)4天中每日一次腹膜內(nèi)(i.p)施用50mg/kg 5-FU誘發(fā)了C57BL小鼠中小腸的顯著萎縮。在小鼠中研究了先導(dǎo)化合物1846、1848、1855和1857在5-FU誘發(fā)的小腸萎縮上的效應(yīng)。之前我們已經(jīng)顯示，在連續(xù)4天中每日一次腹膜內(nèi)(i.p)施用50mg/kg 5-FU誘發(fā)了C57BL小鼠中小腸的顯著萎縮。5-FU之前施用1846、1848、1855或1857(每日兩次，連續(xù)三天)并與5-FU一起施用四天。在之前顯示有效刺激健康小鼠小腸生長的五個不同劑量(5、15、45、135和405nmol/kg)(實(shí)施例9)下施用每種先導(dǎo)化合物。為了對比目的，用405nmol/kg[Gly2]GLP-2處理一組動物。為了測定5-FU對小腸的影響，一組動物僅給予5-FU并維持不處理(5-FU對照)，另外一組動物僅給予載體(PBS對照)。
結(jié)果 相對于PBS對照，5-FU引起C57BL小鼠SI-BW和SI長度的顯著降低。圖6至9顯示1846、1848、1855或1857對施用5-FU的小鼠SI-BW和SI長度的劑量-應(yīng)答效應(yīng)。還顯示了405nmol/kg[Gly2]GLP-2的效應(yīng)。1846、1848、1855或1857劑量依賴性地預(yù)防5-FU誘發(fā)的SI萎縮，并將SI-BW維持在與PBS對照相似的水平。等摩爾劑量的ZP1848、ZP1855和ZP1857對SI-BW顯著地比405nmol/kg[Gly2]GLP-2更有效。1848和1857對SI-長度顯著地比405nmol/kg[Gly2]GLP-2更有效。
實(shí)施例11.1846對施用5-FU的SD大鼠中小腸萎縮和腹瀉的劑量應(yīng)答效應(yīng) 在SD大鼠中研究了臨床候選化合物1846在5-FU誘導(dǎo)的小腸萎縮和腹瀉上的效應(yīng)。之前我們已經(jīng)顯示，腹膜內(nèi)(i.p)施用75mg/kg5-FU(每日一次，四天)引起SD大鼠的顯著小腸萎縮和腹瀉。5-FU之前施用1846(16、80和400nmol/kg/天；n＝20只大鼠/劑量組)(每日兩次，三天)并與5-FU一起施用四天。研究中包括5-FU對照和PBS對照。1846最后一次給藥后24小時處死一個亞組的動物，以測定1846在小腸萎縮上的效應(yīng)。為了測定1846在腹瀉上的效應(yīng)，在給藥期間和額外6天中每日兩次(早晨和傍晚)觀察所有動物。每次觀察期間，給每只動物打分(0，無腹瀉，1(輕度)，肛門周圍糞便污染，2(中度)，后肢和尾巴上有糞便污染，以及3(重度)，前肢和腹部上有糞便污染)，所述分?jǐn)?shù)顯示動物是否有腹瀉以及腹瀉的嚴(yán)重程度。
結(jié)果 相對于PBS對照，5-FU引起SD大鼠SI-BW和SI-長度的顯著降低并引起腹瀉。圖10和11顯示1846在5-FU誘導(dǎo)的小腸萎縮和腹瀉上的劑量-應(yīng)答效應(yīng)。1846劑量依賴性地防止5-FU誘導(dǎo)的SI萎縮并將SI-BW和SI-長度維持在與對照相似的水平。在施用的最高劑量(400nmol/kg)下，1846降低施用5-FU大鼠的腹瀉發(fā)生率和嚴(yán)重程度。
實(shí)施例12.1846對SD大鼠小腸的隱窩-絨毛長度和肌厚度的劑量應(yīng)答效應(yīng) 研究了臨床候選化合物1846在SD大鼠小腸的隱窩-絨毛長度和肌厚度上的效應(yīng)。靜脈內(nèi)推注施用1846(0.62、3.41或6.2mg/kg/天，n＝6只大鼠/劑量組)，每日一次，連續(xù)五天。施用最后劑量后24小時處死大鼠，并從空腸(胃十二指腸連接處遠(yuǎn)端30cm)和回腸(回盲連接處近端30cm)剪下1cm活檢用于組織學(xué)處理。
結(jié)果 圖12顯示1846對空腸和回腸隱窩-絨毛長度和肌厚度的劑量-應(yīng)答效應(yīng)。1846劑量依賴性地提高空腸平均隱窩-絨毛長度以及回腸的回腸肌厚度。
實(shí)施例13.1848對吲哚美辛誘導(dǎo)的克羅恩病模型小腸類癥標(biāo)記物的作用 克羅恩病是引起小腸短暫性間斷性炎癥的慢性疾病。研究了GLP-2類似物1848在吲哚美辛誘導(dǎo)的克羅恩病模型中小腸炎癥上的效應(yīng)。之前我們顯示施用吲哚美辛(皮下，每日一次，兩天)誘發(fā)以潰瘍?yōu)樘卣鞯男∧c炎癥以及促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)的增加。為了測定ZP1848對潰瘍的作用，在吲哚美辛首次給藥之前給予1848(8、40和200nmol/kg，皮下，每日兩次(9:00和16:00))，并且與吲哚美辛一起再施用兩天。皮質(zhì)類固醇潑尼松龍(10mg/kg，口服)用作陽性對照，因?yàn)槠べ|(zhì)類固醇普遍用于治療克羅恩病中的活躍炎癥。此外，對一組動物給予1848(200nmol/kg)和潑尼松龍以測定組合治療的效果。1848最后一次給藥后24小時處死動物，輕輕地將小腸沖洗干凈并固定。為了測定潰瘍程度，沿系膜小腸對向部邊緣剪開腸，懸掛在聚丙烯盤中并用Alcian Green 3BX進(jìn)行表面染色。從幽門開始仔細(xì)檢查小腸并使用標(biāo)準(zhǔn)尺(精密度0.5mm)測量所有潰瘍的形狀(圓形和線形)和大小(圓形潰瘍直徑，線形潰瘍長×寬)。潰瘍定義為缺少上皮表面的面積。最后，通過所有單個潰瘍的面積總和來計算每只動物的總損傷面積。
為了測定1848對小腸中TNF-α濃度的影響，如上所述給予1848和吲哚美辛。然而在處死時將小腸分成相同長度的三段(近端、中部和遠(yuǎn)端)。使用市售的ELISA試劑盒檢測每個單獨(dú)段的TNF-α濃度。
結(jié)果 與對照組相比，吲哚美辛強(qiáng)烈誘導(dǎo)小腸潰瘍(估計的潰瘍程度為333±21mm2比10mm2)。圖13顯示1846對估計的潰瘍程度(mm2)的影響。1848(8nmol/kg、40nmol/kg和200nmol/kg)處理顯著降低潰瘍程度(分別為230+12mm2、216±17mm2和178+17mm2，與吲哚美辛的p＜0.001)。在所用的最高劑量(200nmol/kg)下，ZP1848比陽性對照潑尼松龍更有效(p＜0.05)。
與對照動物(34±7pg/mg蛋白質(zhì)，與吲哚美辛的p＜0.05)相比，吲哚美辛使得遠(yuǎn)端節(jié)段中TNF-α的組織水平提高約2.9倍(97±14pg/mg蛋白質(zhì))。圖14顯示1846對小腸TNF-α濃度的影響。1848(8、40或200nmol/kg)處理顯著降低TNF-α的組織水平(分別為45±14pg/mg蛋白質(zhì)、44±9pg/mg蛋白質(zhì)和45±7pg/mg蛋白質(zhì))，3種劑量之間沒有顯著差異。
與對照動物(34±6pg/mg蛋白質(zhì)，與吲哚美辛的p＜0.05)相比，吲哚美辛使得中部節(jié)段的TNF-α的組織水平提高約3.2倍(108±9pg/mg蛋白質(zhì))。1848(40或200nmol/kg)分別顯著降低TNF-α的組織水平(與吲哚美辛的p＜0.05)。
與對照動物(45±3pg/mg蛋白質(zhì)，與吲哚美辛的p＜0.05)相比，吲哚美辛使得遠(yuǎn)端節(jié)段的TNF-α組織水平提高約1.7倍(75±5pg/mg蛋白質(zhì))。1848對遠(yuǎn)端節(jié)段的TNF-α水平具有抑制效應(yīng)，但是與其它節(jié)段相比，該效應(yīng)較不顯著。在全部三個節(jié)段中僅使用潑尼松龍均不顯著影響TNF-α的組織水平，但是潑尼松龍的施用提高了1848(200nmol/kg)對TNF-α水平的抑制效應(yīng)(僅在遠(yuǎn)端節(jié)段中)。
實(shí)施例14 在組氨酸、甘露醇和乙酸鹽制劑中配制10mg/mL ZP1846 1.在1L燒杯中裝入800mL(WFI) 2.在燒杯中稱出13.964g L-組氨酸并加入所述1L燒杯中 3.在燒杯中稱出32.200g甘露醇并加入所述1L燒杯中 4.直接將629μL 100％乙酸加入所述1L燒杯中，或稱出12.58g 5％(重量/體積)乙酸溶液并加入所述燒杯中 6.補(bǔ)充至約950mL 7.測量pH，必要時用10％乙酸或0.25M組氨酸調(diào)整至pH6.9至7.0 8.稱出11.312g藥物物質(zhì)(肽含量88.4％)并加入所述燒杯中 9.補(bǔ)充至1.015kg(＝約1000mL)并測量pH、摩爾滲透壓濃度和密度 10.通過串聯(lián)連接的兩個無菌濾器使所述制劑過濾除菌 11.在LAF工作臺中以0.5mL的等分試樣將所述制劑分裝到2mL已批準(zhǔn)藥用的瓶中 12.不完全密封地裝上凍干的塞子，然后裝入已滅菌并預(yù)冷卻至4℃的冷凍干燥器中 13.冷凍干燥周期進(jìn)行40.5小時，由冷凍、退火、初級干燥和次級干燥階段組成。在冷凍干燥器的室中在氮中塞住所述瓶。
14.對所述瓶進(jìn)行分選，應(yīng)用密封物(overseal)和彎折封口(crimp)。
實(shí)施例15 在組氨酸、精氨酸、甘露醇和海藻糖中配制10mg/mL ZP1846 1.將800mL(WFI)水裝入1L燒杯中 2.在燒杯中稱出6.206g L-組氨酸并加入所述1L燒杯中 3.在燒杯中稱出3.484g L-精氨酸并加入所述1L燒杯中 4.在燒杯中稱出33.46g甘露醇并加入所述1L燒杯中 5.在燒杯中稱出11.16g海藻糖并加入所述1L燒杯中 6.補(bǔ)充至約950mL 7.測量pH，必要時用10％乙酸或0.25M組氨酸調(diào)節(jié)至pH6.9至7.0 8.稱出11.312g藥物物質(zhì)(肽含量88.4％)并加入所述燒杯中 9.補(bǔ)充至1.015kg(＝約1000mL)并測量pH、摩爾滲透壓濃度和密度 10.通過串聯(lián)連接的兩個無菌濾器將所述制劑過濾除菌 11.在LAF工作臺中以0.5mL的等分試樣將所述制劑分裝到2mL已批準(zhǔn)藥用的瓶中 12.不完全密封地裝上凍干的塞子，然后裝入已滅菌并預(yù)冷卻至4℃的冷凍干燥器中 13.冷凍干燥周期進(jìn)行40.5小時，由冷凍、退火、初級干燥和次級干燥階段組成。在冷凍干燥器的室中在氮中塞住所述瓶。
14.對所述瓶進(jìn)行分選，應(yīng)用密封物(overseal)和彎折封口(crimp)。
盡管已經(jīng)結(jié)合上述示例性實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是在給出這一公開內(nèi)容后，許多等價的改良和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此，認(rèn)為所提出的本發(fā)明示例性實(shí)施方案是用于說明而非限制?？蓪λ鰧?shí)施方案進(jìn)行多種變化而不背離本發(fā)明的精神和范圍。將本文引用的所有文獻(xiàn)均明確地以參考方式并入本文。
權(quán)利要求
1.通式I代表的胰高血糖素樣肽2(GLP-2)類似物或者其可藥用鹽或衍生物
R1-Z1-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X20-
X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2
其中
R1為氫、C1-4烷基(例如甲基)、乙?；?、甲酰基、苯甲?；蛉阴；?br> X2為Gly、Ala或Sar
X3為Glu或Asp
X5為Ser或Thr
X6為Phe或Pro
X7為Ser或Thr
X8為Asp或Ser
X9為Glu或Asp
X10為Met、Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸
X11為Asn、Ala、Lys或Ser
X12為Thr或Lys
X13為Ile、Glu或Gln
X14為Leu、Met或Nle
X15為Asp或GIu
X16為Asn或Ala
X17為Leu或Glu
X18為Ala或Aib
X19為AIa或Thr
X20為Arg或Lys
X21為Asp或Ile
X24為Asn、Ala或Glu
X28為Gln、Ala或Asn
X31為Pro、Ile或缺失
X32為Thr或缺失
X33為Asp、Asn或缺失
R2為NH2或OH；
Z1和Z2獨(dú)立地為不存在或選自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn的3至20個氨基酸單位的肽序列；并且其中所述GLP-2類似物包含選自以下的一種或多種替換X8為Ser和/或X16為Ala和/或X24為Ala和/或X28為Ala。
2.通式II代表的權(quán)利要求1所述GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物
R1-Z1-His-Gly-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-Arg-
Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2
其中
R1為氫、C1-4烷基(例如甲基)、乙?；?、甲酰基、苯甲?；蛉阴；?br> X3為Glu或Asp
X5為Ser或Thr
X7為Ser或Thr
X8為Asp或Ser
X9為Glu或Asp
X10為Met、Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸
X11為Asn、Ala、Lys或Ser
X12為Thr或Lys
X13為Ile、Glu或Gln
X14為Leu、Met或Nle
X15為Asp或Glu
X16為Asn或Ala
X17為Leu或Glu
X19為Ala或Thr
X24為Asn或Ala
X28為Gln、Ala或Asn
X31為Pro、Ile或缺失
X32為Thr或缺失
X33為Asp或缺失
R2為NH2或OH；
Z1和Z2獨(dú)立地為不存在或選自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn的3至20個氨基酸單位的肽序列；并且其中所述GLP-2類似物包含選自以下的一種或多種替換X8為Ser和/或X16為Ala和/或X24為Ala和/或X28為Ala。
3.通式III代表的權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物
R1-Z1-His-Gly-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-Glu-X10-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-X16-Leu-Ala-Ala-Arg-
Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2
其中
R1為氫、C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲?；⒈郊柞；蛉阴；?br> X3為Glu或Asp
X5為Ser或Thr
X7為Ser或Thr
X8為Asp或Ser
X10為Met、Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸
X11為Asn、Ala、Lys或Ser
X24為Asn或Ala
X28為Gln或Ala
X31為Pro或缺失
X32為Thr或缺失
X33為Asp或缺失
R2為NH2或OH；
Z1和Z2獨(dú)立地為不存在或選自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn的3至20個氨基酸單位的肽序列；并且其中所述GLP-2類似物包含選自以下的一種或多種替換X8為Ser和/或X16為Ala和/或X24為Ala和/或X28為Ala。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的GLP-2類似物，其中所述GLP-2類似物與野生型GLP-2(1-33)具有至少60％的氨基酸序列同一性，并且在體內(nèi)具有引起小腸質(zhì)量增加的生物活性。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的GLP-2類似物，其中所述GLP-2類似物包含X8、X16、X24和/或X28中一個以上位置的替換和/或一個或多個所述替換與X3、X5、X7、X10和/或X11中一個或多個位置上的替換組合。
6.權(quán)利要求5的GLP-2類似物，其中所述X10位上的替換為Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸，例如Met(O)或Met(O)2。
7.權(quán)利要求5的GLP-2類似物，其中所述X11位上的替換為Ala、Ser或Lys。
8.權(quán)利要求4的GLP-2類似物，其中所述GLP-2類似物包含一種或多種以下替換
Ser8，Ala16
Ser8，Ala24
Ser8，Ala28
Ala16，Ala24
Ala16，Ala28
Ala24，Ala28
Ser8，Ala16，Ala24
Ser8，Ala16，Ala28
Ser8，Ala24，Ala28
Ala16，Ala24，Ala28
Ser8，Ala16，Ala24，Ala28。
9.權(quán)利要求5的GLP-2類似物，其中所述GLP-2類似物包含一種或多種下述替換
Glu3，Leu10，Ala11，24
Glu3，Thr5，Leu10，Ser11，Ala16，24，28
Glu3，Thr5，Leu10，Lys11，Ala16，24，28
Glu3，Thr5，Ser8，Leu10，Lys11，Ala16，24，28
Glu3，Thr5，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28
Glu3，Thr5，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28
Glu3，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28
Glu3，Leu10，Ser11，Ala16，24，28
Glu3，Leu10，Lys11，Ala16，24，28
Glu3，Thr5，Leu10，Ala11，16，24，28
Glu3，Thr5，Leu10，Ala11，16，24，28，Ile21
Glu3，Thr5，Ser8，Leu10，Ala11，16，24，28
Glu3，Ser8，Leu10，Ala11，16，24，28
Glu3，Leu10，Ala11，16，24，28
Thr7，Leu10，Ala11，24
Thr7，Leu10，Lys11，Ala24
Thr7，Leu10，Ser11，Ala24
Thr7，Leu10，Ser8，11，Ala24
Thr7，Ser8，Leu10，Ala11，24
Thr7，Ser8，Leu10，Lys11，Ala24
Ser8，Leu10，Ala11，24
Leu10，Ala24
Leu10，Ala11，Ala24
Leu10，Ala11，24，28
Leu10，Ala11，16，24，28
Leu10，Lys11，Ala24
Leu10，Ser11，Ala24
Leu10，Ser8，11，Ala24；或X31-X33中一個或多個位置上的缺失。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物，所述GLP-2類似物如本文表1所公開。
11.權(quán)利要求10的GLP-2類似物，所述GLP-2類似物為
1834 H-HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1846 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6NH2
1847 H-HGEGSFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1848 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1849 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1855 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1857 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1858 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2。
12.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的GLP-2類似物，其中所述GLP-2類似物包含X3、X7、X16、X24、X28、X31、X32和/或X33中一個以上位置上的替換。
13.權(quán)利要求12的GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物，其中所述GLP-2類似物包含一種或多種選自以下的替換X3為Glu、X7為Ser、X16為Ala、X24為Ala、X28為Ala、X31為Ile、X32為Thr和X33為Asp，并任選地缺失了X31、X32和X33位置上的氨基酸殘基。
14.權(quán)利要求12或權(quán)利要求13的GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物，所述GLP-2類似物為
1827 H-HGDGSFTDELSTILDNLAARDFIAWLIQTKKKKKKK-NH2
1844 H-HGEGTFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2
1845 H-HGEGTFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2
1846 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2
1848 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2
1849 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2
1850 H-HGEGSFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2
1851 H-HGEGSFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2
1852 H-HGEGTFSSELKTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2
1855 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1857 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1858 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1859 H-HGEGSFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2。
15.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的GLP-2類似物，其中所述GLP-2類似物包含X3、X8和/或X24中一個以上位置上的替換。
16.權(quán)利要求15的GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物，其中所述GLP-2類似物包含一種或多種選自以下的替換X3為Asp、X8為Asp和X24為Ala，并任選地缺失了X31、X32和X33位置上的氨基酸殘基。
17.權(quán)利要求15或權(quán)利要求16的GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物，所述GLP-2類似物為
1830 H-HGDGSFSDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1831 H-HGDGSFTDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1835 H-HGDGSFSDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1836 H-HGDGSFTDELKTILDNLAARD FIAWLIQTK-NH2
1839 H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITDKKKKKK-NH2
1840 H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITD-NH2
1841 H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1843 H-HGDGSFTDELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2。
18.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的GLP-2類似物，其具有X3、X33、X10、X11、X16和/或X24中一個或多個位置上的替換。
19.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的GLP-2類似物，用于治療。
20.藥物組合物，其包含與載體混合的前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物。
21.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中所述GLP-2類似物為可藥用酸加成鹽。
22.權(quán)利要求20或權(quán)利要求21的藥物組合物，其被配制成適于注射或輸注的液體，或被配制成使所述GLP-2類似物緩慢釋放。
23.權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的GLP-2類似物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防胃和腸相關(guān)病癥。
24.權(quán)利要求23的用途，其中所述胃和腸相關(guān)病癥為潰瘍、消化病癥、吸收不良綜合征、短腸綜合征(short gut syndrome)、盲管綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉(例如由麩質(zhì)誘發(fā)的腸病或乳糜瀉病引起)、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、局限性腸炎(克羅恩病)、潰瘍性結(jié)腸炎、小腸損傷或短腸綜合征(short bowel syndrome)。
25.權(quán)利要求23的用途，其中所述胃和腸相關(guān)病癥為放射性腸炎、傳染性腸炎或感染后腸炎，或者由于毒劑或者其它化學(xué)治療劑引起的小腸損傷。
26.權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的GLP-2類似物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防化學(xué)療法或放射治療的副作用。
27.權(quán)利要求26的用途，其中所述化學(xué)療法的副作用是腹瀉、腹部痛性痙攣、嘔吐或化學(xué)療法治療引起的腸上皮結(jié)構(gòu)和功能損傷。
28.權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的GLP-2類似物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療新生兒、骨質(zhì)疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)的病癥。
29.權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的GLP-2類似物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防與營養(yǎng)不良相關(guān)的病癥。
30.權(quán)利要求29的用途，其中所述與營養(yǎng)不良相關(guān)的病癥為惡病質(zhì)或厭食癥。
31.核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的GLP-2類似物的核酸序列。
32.表達(dá)載體，其包含與指導(dǎo)其表達(dá)的控制序列組合的權(quán)利要求31所述核酸序列。
33.已轉(zhuǎn)化權(quán)利要求32所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
34.生產(chǎn)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的GLP-2類似物的方法，所述方法包括在適于表達(dá)GLP-2類似物的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求22的宿主細(xì)胞以及純化這樣生產(chǎn)的GLP-2類似物。
35.根據(jù)權(quán)利要求31的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求32的表達(dá)載體或根據(jù)權(quán)利要求33的宿主細(xì)胞，用于治療。
36.根據(jù)權(quán)利要求31的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求32的表達(dá)載體或根據(jù)權(quán)利要求33的宿主細(xì)胞在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防胃和腸相關(guān)病癥，或者用于治療和/或預(yù)防化學(xué)療法或放射治療的副作用，或者用于治療新生兒、骨質(zhì)疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)的病癥。
37.治療有此需要的患者中胃和腸相關(guān)病癥的方法，所述方法通過施用有效量的權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的GLP-2類似物、根據(jù)權(quán)利要求31的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求32的表達(dá)載體或根據(jù)權(quán)利要求33的宿主細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述胃和腸相關(guān)病癥為潰瘍、消化病癥、吸收不良綜合征、短腸綜合征(short gut syndrome)、盲管綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉(例如由麩質(zhì)誘發(fā)的腸病或乳糜瀉病引起)、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、小腸炎、局限性腸炎(克羅恩病)、潰瘍性結(jié)腸炎、小腸損傷或短腸綜合征(short bowel syndrome)。
39.權(quán)利要求37的方法，其中所述胃和腸相關(guān)病癥為放射性腸炎、傳染性腸炎或感染后腸炎，或者由于毒劑或者其它化學(xué)治療劑引起的小腸損傷。
40.在有此需要的患者中治療或預(yù)防化學(xué)療法或放射療法副作用的方法，所述方法包括施用有效量的權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的GLP-2類似物、根據(jù)權(quán)利要求31的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求32的表達(dá)載體或根據(jù)權(quán)利要求33的宿主細(xì)胞。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述化學(xué)療法副作用為腹瀉、腹部痛性痙攣、嘔吐或由化學(xué)療法治療引起的腸上皮結(jié)構(gòu)或功能損傷。
42.在需要其治療的患者中治療新生兒病癥、肥胖、骨質(zhì)疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)的病癥的方法，所述方法包括施用有效量的權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的GLP-2類似物、根據(jù)權(quán)利要求31的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求32的表達(dá)載體或根據(jù)權(quán)利要求33的宿主細(xì)胞。
43.治療藥盒，其包含癌癥化學(xué)療法藥物以及根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的GLP-2類似物、根據(jù)權(quán)利要求31的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求32的表達(dá)載體或根據(jù)權(quán)利要求33的宿主細(xì)胞，其中每一種均任選地與可藥用載體組合。
44.藥物組合物，其包含與可藥用載體組合的癌癥化學(xué)療法藥物以及根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的GLP-2類似物、根據(jù)權(quán)利要求31的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求32的表達(dá)載體或根據(jù)權(quán)利要求33的宿主細(xì)胞。
全文摘要
本文公開了GLP-2類似物，與[hGly2]GLP-2相比，所述GLP-2類似物包含一個或多個替換并且提高了體內(nèi)生物活性和/或提高了化學(xué)穩(wěn)定性，例如通過體外穩(wěn)定性測定評估的化學(xué)穩(wěn)定性。更具體地，本文公開的優(yōu)選GLP-2類似物包含野生型GLP-2序列8、16、24和/或28位中一個或多個位置上的替換和/或31至33位氨基酸中一個或多個缺失和/或N端或C端穩(wěn)定肽序列的添加，其中所述替換任選地與2位(如說明書中所述)和3、5、7、10以及11位中的一個或多個位置上的其他替換組合。所述類似物尤其可用于預(yù)防或治療胃和腸相關(guān)病癥以及用于減輕化學(xué)療法的副作用。
文檔編號C07K14/605GK101171262SQ200680015213
公開日2008年4月30日 申請日期2006年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月4日
發(fā)明者比亞內(nèi)·杜·拉森, 伊薇特·米亞塔·彼得森, 基爾斯滕·埃貝霍伊 申請人:西蘭制藥公司