專利名稱：：疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及病毒載體，包括編碼HIV多肽的寡核普酸，更具體地，其中所迷病毒栽體是腺病毒。具體而言，此類腺病毒是非人靈長類動物腺病毒，諸如猿猴腺病毒(simianadenovirus),更具體地，是黑猩猩腺病毒。具體而言，本發(fā)明涉及包括HIV多核苷酸序列的腺病毒栽體，該序列編碼多種不同的HIV抗原，例如，兩種或三種或者更多種HIV抗原。本發(fā)明進一步涉及制備所述病毒栽體的方法，涉及通過本方法所制備的病毒栽體，并涉及所述載體在醫(yī)藥，尤其是在預(yù)防性或者治療性疫苗接種方面的用途。HIV-1是導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征(theacquiredimmunedeficiencysyndrome,AIDS)的主要原因，該病癥核j人為是世界上的主要健康問題之一。盡管在世界范圍內(nèi)已進行了廣泛的研究，但生產(chǎn)疫苗的努力至今尚未獲得成功。HIV-1是反轉(zhuǎn)錄病毒科的一種RNA病毒。HIV基因組編碼至少九種蛋白，其被劃分為三個種類主要的結(jié)構(gòu)蛋白Gag、Pol和Env,調(diào)控蛋白Tat和Rev，以及輔助蛋白(accessoryproteins)Vpu、Vpr、Vif和Nef。HIV基因組顯示了所有反轉(zhuǎn)錄病毒的5'LTR-gag-pol-env-LTR3'組織方式。腺病毒是一種雙鏈DNA病毒，基因組大小大約36kb，由于其具有在多種靶組織中獲得高效基因轉(zhuǎn)移的能力以及巨大的轉(zhuǎn)基因容量而被廣泛地用于基因轉(zhuǎn)移。按常規(guī)，腺病毒的El基因缺失，并用轉(zhuǎn)基因盒替換，該轉(zhuǎn)基因盒由所選的啟動子、感興趣基因的cDNA序列和polyA信號組成，從而產(chǎn)生復(fù)制缺陷型重組病毒。腺病毒具有典型的二十面體衣殼形態(tài)，其包括三種主要的蛋白，六鄰體(hexon)(II)、五鄰體基底(pentonbase)(III)和具圓柄的纖維(IV),以及大量的其它次要蛋白VI、VIII、IX、Ilia和IVa2(RussellW.C.2000，GenVirol,81:2573-2604)。該病毒的基因組是線性雙鏈DNA,5'末端與末端蛋白共價結(jié)合，所述5'末端具有反向末端重復(fù)序列(invertedterminalrepeats,ITRs)。病毒DNA與高堿性蛋白VII以及被命名為.mu小肽緊密結(jié)合。另一種蛋白，V,與此DNA-蛋白復(fù)合體包裝在一起，并通過蛋白VI提供了一種連接至衣殼的結(jié)構(gòu)鏈。此病毒同樣包含病毒編碼的蛋白酶，其對于加工一些結(jié)構(gòu)蛋白以產(chǎn)生出成熟的傳染性病毒而言是必要的。100種以上不同血清型的腺病毒已被分離出來，其感染不同種類的哺乳動物，其中51種是人類起源的。此類人類起源的腺病毒實例為Adl、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、Adll、Ad24、AcB4、Ad35。人類的血清型根據(jù)一些生物學(xué)、化學(xué)、免疫學(xué)和結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)已被劃分為六個亞類(A-F)[第一頁，WO04(H8627]。盡管基于Ad5的栽體已在大量的基因治療試驗中被廣泛地使用，但是由于自然感染而在總體人群中預(yù)先存在的免疫性，使得Ad5以及其它C組腺病毒栽體的使用可能受到限制。Ad5以及其它C組成員容易成為血清陽性率最高的血清型之一。對現(xiàn)有栽體的免疫性可能由于在治療期間暴露于該載體而得以發(fā)展。此類對血清陽性栽體的預(yù)先存在的或者發(fā)展的免疫性可能會限制基因治療或者接種疫苗努力的功效。因此，在尋找能夠規(guī)避宿主免疫反應(yīng)的基因遞送系統(tǒng)時，可選的腺病毒血清型構(gòu)成了非常重要的靶標(biāo)。可選血清的一種此類范圍是非人靈長類動物的腺病毒，尤其是黑猩猩腺病毒。參見美國專利6，083，716，其描述了兩種黑猩猩腺病毒的基因組。已表明黑猩猩("Pan"或"C")腺病毒栽體如同人腺病毒載體一樣有效地誘導(dǎo)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的強烈的免疫反應(yīng)(Fitzgeraldetal.J.Immunol.170:1416)。HIVTat和Nef蛋白是早期蛋白，即它們是在感染的早期，在缺乏結(jié)構(gòu)蛋白的情況下表達。Nef基因編碼一種早期的輔助性HIV蛋白，其已被表明具有若干種活性。例如，已知Nef蛋白能夠引起CD4，HIV受體，從細(xì)胞表面的清除，盡管此功能的生物學(xué)重要性還有爭議。此外，Nef與T細(xì)胞的信號通路相互作用并誘導(dǎo)了一種活化狀態(tài)，此狀態(tài)反過來可以促進更有效的基因表達。一些HIV分離物在此區(qū)域內(nèi)具有突變，其致使它們無法編碼功能蛋白并導(dǎo)致其在體內(nèi)復(fù)制和致病過程中嚴(yán)重受損。Gag基因是由全長RNA翻譯而來，以產(chǎn)生一種前體多聚蛋白，其隨后被剪切成3-5種衣殼蛋白；基質(zhì)蛋白、衣殼蛋白和核酸結(jié)合蛋白以及蛋白酶。(FundamentalVirology,FieldsBN,KnipeDMandHowleyM19962.FieldsVirologyvol21996)。Gag基因產(chǎn)生出55-千道爾頓(kD)的Gag前體蛋白，也被稱為p55，其由未經(jīng)剪接的病毒mRNA表達。在翻譯過程中，p55的N末端被豆蔻酰化，這引發(fā)了其與細(xì)胞膜胞質(zhì)面的結(jié)合。膜結(jié)合的Gag多聚蛋白募集了病毒基因組RNA的兩個拷貝，以及其它病毒蛋白和細(xì)胞蛋白，這引發(fā)了病毒顆粒從感染細(xì)胞的表面出芽。出芽后，在病毒成熟期間p55被病毒編碼的蛋白酶(Pol基因的產(chǎn)物)切割為四種更小的蛋白，被命名為MA(基質(zhì)matrix[pi7])、CA(衣殼capsid[p24])、NC(核殼體nucleocapsid[p9])和p6.(4)。除三種主要的Gag蛋白(pl7，p24andp9)之外，所有Gag前體都含有若千個其它區(qū)域，其被切割下來并作為各種大小的肽保留在病毒粒子中。這些蛋白具有不同的作用，例如p2蛋白被提出在調(diào)節(jié)蛋白酶活性方面具有作用，并且有助于對蛋白水解加工進行正確的時間選擇。MA多肽來源于p55的N-端，豆蔻?；┒恕４蠖鄶?shù)MA分子保持連接于病毒粒子脂雙層的內(nèi)表面，使該病毒顆粒穩(wěn)定。一套(subset)MA在病毒粒子更深層的內(nèi)部被募集，在其中它成為復(fù)合物的一部分，該復(fù)合物護送病毒DNA至細(xì)胞核。這些MA分子促進了病毒基因組的核轉(zhuǎn)運，因為MA上的親細(xì)胞核信號被細(xì)胞的核輸入機器所識別。此現(xiàn)象使HIV能夠感染不發(fā)生分裂的細(xì)胞，對反轉(zhuǎn)錄病毒而言是一種不尋常的特性。p24(CA)蛋白構(gòu)成病毒顆粒的圓錐形核心。親環(huán)蛋白A(CyclophilinA)已被證實與p55的p24區(qū)域相互作用，導(dǎo)致其整合入HIV顆粒中。Gag與親環(huán)蛋白A之間的相互作用是必不可少的，因為通過環(huán)孢菌素A破壞這種相互作用抑制了病毒的復(fù)制。Gag的NC區(qū)負(fù)責(zé)特異性地識別所謂HIV包裝信號。該包裝信號由定位于病毒RNA5'末端附近的四個莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成，并且足以介導(dǎo)將異源RNA整合進HIV-1病毒粒子中。NC通過由兩個鋅指基元介導(dǎo)的相互作用而結(jié)合于包裝信號。NC同樣有助于反轉(zhuǎn)錄過程。p6多肽區(qū)介導(dǎo)p55Gag和輔助蛋白Vpr之間的相互作用，導(dǎo)致Vpr被整合入裝配中的病毒粒子。p6區(qū)同樣含有所謂的晚期結(jié)構(gòu)域(latedomain)，其是出芽的病毒粒子從感染細(xì)胞中有效釋放所必需的。Pol基因編碼三種具有病毒早期感染所需活性的蛋白，反轉(zhuǎn)錄酶RT、蛋白酶以及使病毒DNA整合入細(xì)胞DNA所需的整合酶蛋白。Pol的初級產(chǎn)物被病毒粒子的蛋白酶切割以產(chǎn)生氨基末端的RT肽，其含有DNA合成所需的活性(RNA和DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，核糖核酸酶H)，以及羧基末端的整合酶蛋白。HIVRT是全長RT(p66)與剪切產(chǎn)物(p51)的異源二聚體，其缺少羧基末端核糖核酸酶整合酶結(jié)構(gòu)域。RT是反轉(zhuǎn)錄病毒基因組所編碼的最高度保守的蛋白之一。RT的兩種主要活性是DNAPol和核糖核酸酶H。RT的DNAPol活性可互換地(interchangeably)使用RNA和DNA作為模板，而且如同所有已知的DNA聚合酶一樣，無法從頭啟始DNA合成，而是需要預(yù)先存在的分子作為引物(RNA)。當(dāng)進行DNA合成時，所有RT蛋白所固有的核糖核酸酶H活性在復(fù)制早期去除RNA基因組的過程中發(fā)揮著基本的作用。它從所有RNA-DNA雜合體分子中選擇性地降解RNA。在結(jié)構(gòu)上，聚合酶和核糖核酸酶H占據(jù)了Pol中分開且不相重疊的結(jié)構(gòu)域，占Pol三分之二的氨基酸。p66的催化亞基被折疊成5個不同的亞結(jié)構(gòu)域。其氨基末端23是具有具RT活性的部分。其羧基末端是核糖核酸酶H的結(jié)構(gòu)域。在感染宿主細(xì)胞后，反轉(zhuǎn)錄病毒的RNA基因組被反轉(zhuǎn)錄酶拷貝成線性的dsDNA,所述反轉(zhuǎn)錄酶存在于傳染性顆粒中。整合酶(在SkalkaAM'99AdvinVirusRes52271-273中綜述)識別病毒DNA的末端，修整它們并陪伴病毒DNA至宿主染色體位點以催化整合。宿主DNA中的許多位點可以是整合的靶標(biāo)。盡管整合酶足以催化體外整合，但它并不是唯一與病毒DNA體內(nèi)結(jié)合的蛋白，從被感染的細(xì)胞中分離出來的大的蛋白-病毒DNA復(fù)合物被稱為整合前復(fù)合物(preintegrationcomplex)。這有助于通過子代病毒基因組來獲取宿主細(xì)胞的基因。整合酶由三個不同的結(jié)構(gòu)域組成，N末端結(jié)構(gòu)域、催化核心和C末端結(jié)構(gòu)域。催化核心結(jié)構(gòu)域包含了所有聚核苷酰基轉(zhuǎn)移化學(xué)所需的條件。病毒栽體，特別是含有多個外源基因的腺病毒栽體并非總是容易制備。可能存在栽體穩(wěn)定性方面的問題，以及獲得插入基因有效表達方面的困難。特別是，包含一種以上或者兩種以上HIV多核苷酸的腺病毒尚未被成功制備出來，所述多核苷酸可以被用于疫苗中。非人靈長類動物腺病毒可以從黑猩猩的腸系膜淋巴結(jié)中分離。黑猩猩腺病毒與人腺病毒亞型C十分相似，使得El缺失型病毒能夠在HEK293細(xì)胞中復(fù)制。但黑猩猩腺病毒與更常見的人類血清型(Ad2和Ad5)在系統(tǒng)發(fā)生上不同。Pan6與Pan's5、7和9相關(guān)度更低，且在血清學(xué)上不同。存在某些大小方面的限制，其與將異源DNA插入腺病毒相關(guān)。人類腺病毒具有包裝多達105%或者野生型基因組長度的能力。(Bettetal1993,JVirol67(10),5911-21)。對人類腺病毒更低的包裝限制已被表明為野生型基因組長度的75%(Parksetal1995,JVirol71(4),3293-8)。對于尋找對抗HIV的有效疫苗仍存在需求。本發(fā)明提供了缺失一個或多個區(qū)域的腺病毒載體，該栽體包括編碼至少三種HIV抗原或者其免疫原性衍生物或免疫原性片段的一條或多條多核苷酸，其中所述栽體能夠在哺乳動物宿主中表達所述抗原或者片段或衍生物，并且其中所述缺失的大小以及所迷一條或多條HIV多核苷酸的大小是這樣的，其使得所述載體基因組的全長是野生型病毒基因組長度的85至105%。在本發(fā)明的一種實施方式中，由所述一條或多條多核苷酸編碼的HIV抗原可以是Gag、Nef和Pol。在進一步的實施方式中，Pol可以只包括RT部分。在本發(fā)明的另一種實施方式中，編碼所述HIV抗原的一條或多條多核苷酸可以被安排為按Gag、RT、Nef的順序進行轉(zhuǎn)錄，即Gag部分位于所產(chǎn)生的融合蛋白的N-末端。整個栽體基因組的大小可以是例如野生型病毒基因組大小的90至100%，或者野生型病毒基因組大小的95至100%。在一種實施方式中，所述栽體的全部大小可以是野生型病毒基因組大小的大約96%。用于包含在根據(jù)本發(fā)明的腺病毒栽體中的特定HIV抗原是Pol、Nef和Gag或者它們的免疫原性衍生物或免疫原性片段。此類腺病毒栽體可以與藥學(xué)上可接受的賦形劑、栽體、稀釋劑或者佐劑一起配制以生產(chǎn)免疫原性組合物，包括適于治療和/或預(yù)防HIV感染和AIDS的藥物或疫苗組合物。(prevalentnaturallyoccurring)血清型，諸如Ad2和Ad5，的腺病毒。這就避免了誘發(fā)針對所迷栽體的強大的免疫反應(yīng)，其通過中和抗體以及影響毒性而阻斷了栽體的攝入，從而限制了以后施用相同血清型的功效。因此，該腺病毒載體可以是腺病毒，其并非是流行的天然存在的人類病毒血清型。從動物中分離的腺病毒含有免疫學(xué)上不同的衣殼、六鄰體、五鄰體和纖維組分，但它們在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上密切相關(guān)。特別地，所述病毒可以是非人類的腺病毒，諸如猿猴病毒，并且尤其是黑猩猩腺病毒，諸如Pan5、6、7或者9。此類品系的實例在WO03/000283中被描述，并可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection),10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209以及其他來源獲得。理想的黑猩獾腺病毒株系是Pan5[ATCCVR-591]、Pan6[ATCCVR-592]和Pan7[ATCCVR-593]。其它合適的腺病毒包括，但不限于，黑猩猩腺病毒CI和C68(Pan9)，其在美國專利No.6,083,716中被加以描述；以及猿猴腺病毒包括，但不限于SVl〖VR-195];SV25[SV畫201];SV35;SV15;SV-34;SV-36;SV-37和狒狒腺病毒[VR-27S]等。PanS(也被稱為C5)、Pan6(也被稱為C6)、Pan7(也被稱為C7)、SV1、SV25和SV39的序列已被加以描述[WO03/046124，2003年6月5日公布]。還參見國際專利公布號WO04/16614，其描述了雜種腺病毒栽體和由猿猴腺病毒SA18構(gòu)建的栽體。黑猩猩腺病毒由于缺少對目標(biāo)種群中的腺病毒預(yù)先存在的免疫性，尤其是缺少交叉中和抗體而被認(rèn)為是優(yōu)于人類腺病毒血清型。與某些候選的人類腺病毒栽體在目標(biāo)種群中35%的交叉反應(yīng)相比，黑猩猩腺病毒與預(yù)先存在的中和抗體反應(yīng)的交叉反應(yīng)在目標(biāo)種群中僅為2%。所述黑猩猩腺病毒不同于更常見的人類亞型Ad2和Ad5,但與人類亞組E的Ad4更密切的相關(guān)，Ad4并非流行的亞型。Pan6與Pan5、7和9相關(guān)度更低。本發(fā)明的腺病毒可以是復(fù)制缺陷型。這意味著其與野生型病毒相比，在非互補細(xì)胞中具有減弱的復(fù)制能力，這可以通過使病毒突變，例如通過使涉及復(fù)制的基因缺失，例如使Ela、Elb、E3或E4基因缺失而產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明所述的腺病毒栽體可以是包括功能性El缺失的復(fù)制缺陷型腺病毒。因此，根據(jù)本發(fā)明所述的腺病毒栽體可以由于缺乏表達腺病毒Ela和Elb的能力，即在Ela和Elb中被功能性缺失而是復(fù)制缺陷型的。重組的腺病毒也可以在其它基因中包含功能性缺失[參見WO03/000283],例如在E3或E4基因中的缺失。腺病毒延遲早期基因(delayedearlygene)E3可以從構(gòu)成重組病毒一部分的猿猴腺病毒序列中被去除。E3的功能不是生產(chǎn)重組腺病毒顆粒所必需的。因此，替換此基因產(chǎn)物的功能以包裝在本發(fā)明中有用的重組猿猴腺病毒并不是必需的。在一項特殊的實施方式中，該重組(猿猴)腺病毒含有功能性缺失的El和E3基因。此類載體的構(gòu)建過程在Royetal.,HumanGeneTherapy15:519-530,2004中被加以描述。重組腺病毒同樣可以被構(gòu)建為含有功能性缺失的E4基因，盡管保留E4ORF6的功能可能是理想的。根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體也可以含有延遲早期基因E2a的缺失。缺失同樣可以在猿猴腺病毒基因組的晚期基因Ll至L5的任何一個中進行。同樣地，中期基因(intermediategenes)IX和Iva中的缺失可能是有用的。缺失可以被單;使用，、即用于本i明的腺病毒序列4以只含有El的缺失。作為另一種選擇，能夠有效破壞整個基因或者其一部分的生物學(xué)活性的缺失可以以任何組合方式使用。例如在一種示例性的載體中，腺病毒序列可以含有El基因和E4基因的缺失，或者E1、E2a和E3基因的缺失，或者E1和E3基因的缺失(諸如Ela和Elb的功能性缺失，以及E3的至少一部分的缺失)，或者E1、E2a和E4基因的缺失，帶有或不帶有E3的缺失等等。此類缺失可以是這些基因的部分缺失或全部缺失，并可以與其它突變方式，諸如溫度敏感型突變組合使用以取得所期望的結(jié)果。所述腺病毒栽體可以在任何合適的細(xì)胞系中制備，在該細(xì)胞系中所述病毒能夠復(fù)制。特別地，可以使用互補細(xì)胞系(complementingcelllines),該細(xì)胞系提供了病毒載體中失去的因子，該失去的因子導(dǎo)致了受損的復(fù)制特征。例如，互補細(xì)胞系可以表達E1、或者E1和E3、或者El、E3和E4。沒有限制地，此類細(xì)胞系可以是HeLa[ATCCAccessionNo.CCL2]、A549[ATCCAccessionNo.CCL185]、HEK293、KB[CCL17〗、Detroit[e.g.,Detroit510，CCL72]和WI-38[CCL75]細(xì)胞等。這些細(xì)胞系均可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection),10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209獲得。其它合適的親代細(xì)胞系可以從其它來源荻得，諸如PER.C60細(xì)胞，如通過以ECACCno.96022940保藏于應(yīng)用微生物學(xué)與研究中心(theCentreforAppliedMicrobiologyandResearch,CAMR,UK)的歐洲動物纟田胞培養(yǎng)物保藏中心(theEuropeanCollectionofAnimalCellCultures,ECACC)的細(xì)胞所代表的。本發(fā)明在另一方面提供了一種腺病毒載體，包含以Gag、RT、Nef順序編碼至少HIV抗原RT、Nef和Gag或者它們的免疫原性衍生物或免疫原性片段的一條或多條多核苷酸，換言之，腺病毒栽體包含編碼至少HIV抗原RT、Nef和Gag或者它們的免疫原性衍生物或免疫原性片段的一條或多條多核苷酸，其被如此排布以使得它們按Gag、RT、Nef的順序被轉(zhuǎn)錄。例如，根據(jù)本發(fā)明所述的腺病毒載體可以包括編碼Gag或者其免疫原性衍生物或免疫原性片段的多核苷酸，其被融合于編碼RT或者其免疫原性衍生物或免疫原性片段的多核苷酸序列，其被融合于Nef或者其免疫原性衍生物或免疫原性片段，并在單個異源啟動子的控制下，其中該基因的Gag部分存在于所述多核苷酸的5'末端。在本發(fā)明的另一種備選的實施方式中，所述三種抗原中的每一種均通過其自身的啟動子進行表達，每一種所述的啟動子可以是相同的或不同的。在本發(fā)明的另一種實施方式中，三種抗原中的兩種形成融合物，連接于單個啟動子，而第三種抗原被連接于第二個啟動子上，該第二個啟動子可以與第一個啟動子相同或不同。例如，Gag和RT可以被連接于第一啟動子，而Nef可以被連接于第二啟動子。編碼至少三種HIV抗原或者它們的免疫原性衍生物或免疫原性片段的一條或多條多核苷酸可以被插入任何腺(Adeno)缺失區(qū)，例如插入El缺失區(qū)。盡管編碼抗原的兩條或多條多核苷酸可以連接為融合形式，但所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以表達為融合蛋白，或者可以表達為分離的蛋白產(chǎn)物，或者可以表達為融合蛋白，然后被分解為更小的亞基。在一方面，本發(fā)明提供了一種由根據(jù)本發(fā)明的栽體所表達的融合蛋白，例如，人體內(nèi)產(chǎn)生的融合蛋白。被包括在根據(jù)本發(fā)明的栽體中的編碼例如Nef、Gag或RT的一條或多條HIV序列可以針對哺乳動物細(xì)胞進行了密碼子優(yōu)化，例如使它/它們在其密碼子使用方面與高表達的人類基因相類似。這些HIV序列的密碼子優(yōu)化在W003/025003中被進一步加以描迷。例如，在根據(jù)本發(fā)明的腺病毒栽體中，編碼Gag和/或RT的多核苦酸可以如上面所討論的進行了密碼子優(yōu)化。根據(jù)本發(fā)明的腺病毒栽體中的Gag序列可以不包括Gagp6多肽編碼序列。用于本發(fā)明的Gag序列的具體實例包括p17和/或p24編碼序列。RT序列可以編碼突變以使任何反轉(zhuǎn)錄酶活性基本失活。一種具體的失活突變包括將W色氨酸229置換為K(賴氨酸)，參見WO03膨003。如上所述，RT基因是HIV基因組中更大的Pol基因的組分。應(yīng)當(dāng)理解，包括在根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體中的RT編碼序列可以存在于Pol的范圍(context)中，或者是至少編碼RT的Pol片段。Pol的此類片段保留了Pol的主要CTL表位。在一個具體的實例中，RT僅以RT的p51或者p66片段而被包括在內(nèi)。任選地，用于本發(fā)明的Nef序列被截短以去除編碼N末端區(qū)的序列，即去除30至85個氨基酸，例如60至85個氨基酸，尤其是N末端的65個氨基酸(后一種截短方式在此被稱為trNef)。備逸地或額外地，Nef可以被修飾以去除一個或多個肉豆蔻酰化位點(myristylationsites)。例如，Gly2肉豆蔻?；稽c可以通過缺失或置換而被去除。備選地或額外地，Nef可以通過缺失或置換Leu174和Leu175中的一個或兩個而被修飾以改變此雙亮氨酸基序(dileucinemotif)。在CD4的下調(diào)過程中，此雙亮氨酸基序的重要性在例如BresnahanP.A.etal(1998)CurrentBiology,8(22):1235-8中被加以描述。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建物可以包括Gag、Pol和Nef，其中存在這些天然抗原的至少75%,或至少90%或至少95%,例如96%的CTL表位。在根據(jù)本發(fā)明的包括pl7/p24Gag、p66RT和如上所定義的截短的Nef的構(gòu)建物中，存在天然Gag、Pol和Nef抗原的96%的CTL表位。本發(fā)明的一種實施方式提供了一種腺病毒栽體，包括按Gag、RT、Nef順序編碼p17、p24(優(yōu)化的)Gag、p66RT(優(yōu)化的)、截短的Nef(缺少編碼末端氨基酸l-85-"trNef'的核苷酸)的一條或多條多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建物包括1.pl7，p24(密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag-p66RT(密碼子經(jīng)優(yōu)化)-截短的Nef;2.截短的Nef-p66RT(密碼子經(jīng)優(yōu)化)-pl7，p24(密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag;3.截短的Nef-pI7，p24(密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag-p66RT(密碼子經(jīng)優(yōu)化)；4.p66RT(密碼子經(jīng)優(yōu)化)-pl7，p24(密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag-截短的Nef;5.p66RT(密碼子經(jīng)優(yōu)化)-截短的Nef-pl7,p24(密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag;6.pl7,p24(密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag-截短的Nef-p66RT(密碼子經(jīng)優(yōu)化)。本發(fā)明的一種或多種多核苷酸可以含有接頭序列，其存在于編碼Gag、RT和Nef的序列之間。此類接頭序列可以是，例如，長度達20個氨基酸。在一個具體實例中，它們可以是1至IO個氨基酸，或者1至6個氨基酸，例如2至4個氨基酸。本發(fā)明的多核苷酸可以包含進一步的HIV序列。特別是，它們可以包括HIVenv蛋白或者它們的免疫原性衍生物或免疫原性片段。env的適當(dāng)形式是gpl20、gpl40和gpl60。其它適當(dāng)?shù)腍IV序列包括但不限于Tat、Rev、Vpu、Vpr和Vif。因此，本發(fā)明進一步提供了一種腺病毒栽體，包括按Gag、RT、Nef的順序編碼HIV抗原RT、Nef和Gag或者它們的免疫原性衍生物或免疫原性片段以及HIVenv蛋白或者它們免疫原性衍生物或免疫原性片段的一個或多個多核苷酸。此外，本發(fā)明包括一種免疫原性組合物，其包括根據(jù)本發(fā)明的腺病毒栽體與第二種腺病毒栽體的組合，所迷第二種腺病毒栽體包括編碼一種或多種HIV抗原的一個或多個多核苷酸。應(yīng)當(dāng)理解，對于包括在本發(fā)明中的所有HIV序列而言，它們并非必須代表編碼全長蛋白或天然蛋白的序列。免疫原性衍生物，諸如截短的或以其它方式改變的，例如突變的蛋白也可以被考慮，編碼至少一種HIV表位，例如CTL表位(一般是至少8個氨基酸的肽)的片段，也可以被考慮。只要所編碼的寡肽或多肽表現(xiàn)出HIV抗原性，也就是說主要的CTL表位由該寡肽或多肽保留下來，那么編碼至少8個，例如8-10個氨基酸或者長度達20、50、60、70、100、150或200個氨基酸的片段的多核苷酸被認(rèn)為是屬于本發(fā)明的范疇。主要的CTL表位在此被定義為能夠引起體內(nèi)免疫反應(yīng)的那些表位。由根據(jù)本發(fā)明所述的多核苷酸序列編碼的HIV多肽分子可以代表至少50%天然蛋白長度的片段，該片段可以包含突變，但其保留了至少一種HIV表位并表現(xiàn)出HIV抗原性。此類HIV抗原性可以通過例如測量抗體或者細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)而被加以測量。類似地，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性衍生物必須表現(xiàn)出HIV抗原性。免疫原性衍生物可以提供一些超過天然蛋白的潛在優(yōu)勢，諸如減少或去除天然蛋白的功能，該功能在疫苗抗原中是不想要的，諸如酶活性(RT)、或者CD4下調(diào)作用(Nef)。所述多核苷酸序列可以是針對哺乳動物細(xì)胞而進行了密碼子優(yōu)化的，根據(jù)本文所述的本發(fā)明密碼子優(yōu)化的方面進行。本發(fā)明進一步提供了一種制備根據(jù)本發(fā)明所述的載體的方法，包括步驟a)提供腺病毒栽體；b)提供質(zhì)粒，其攜帶可操作地連接于適當(dāng)啟動子的所述HIV抗原序列；c)用所述質(zhì)粒和所迷栽體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；d)經(jīng)過足夠的時間使重組能夠發(fā)生；并e)回收攜帶所述HIV抗原序列的重組病毒栽體。在另一方面，本發(fā)明提供了一種在哺乳動物中引發(fā)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括向哺乳動物施用適當(dāng)量的根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物。本發(fā)明可以特別涉及HIV-1。此處所述的構(gòu)建物可以來源于任何HIV分化枝(clade),例如分化枝B或分化枝C，尤其是分化枝B。用于根據(jù)本發(fā)明的腺病毒栽體的啟動子可以是來自HCMVIE基因的啟動子，例如其中，包含外顯子1的所述HCMVIE基因的5'非翻譯區(qū)被包括在內(nèi)，如WO02/36792中所述。所述藥物組合物可以按足夠的量施用，以轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞并提供足夠水平的基因轉(zhuǎn)移與表達，從而提供治療益處，其無不適副作用或者具有醫(yī)學(xué)上可接受的生理效應(yīng)，其可以由醫(yī)藥領(lǐng)域的技術(shù)人員來確定。常規(guī)的藥學(xué)上可接受的給藥途徑包括，但不限于，直接遞送至視網(wǎng)膜以及其它眼內(nèi)遞送方法，直接遞送至肝臟，吸入，鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、直腸、經(jīng)口的以及其它腸胃外的給藥途徑。如需要，給藥途徑可以進行組合，或者根據(jù)基因產(chǎn)物或病癥來加以調(diào)整。給藥途徑主要決定于所治療病癥的性質(zhì)。所述病毒栽體的劑量將主要決定于這些因素，諸如所治療的病癥、患者的年齡、體重和健康狀況，因此，可以在患者之間有所變化。例如所述病毒栽體的成人或獸醫(yī)的治療有效劑量一般范圍是大約100^L至大約100mL的栽體，其含有濃度大約lxl()G至大約lxl0"個病毒顆粒、大約lxlO'，至大約lxlO"個病毒顆粒、或者大約lxl(^至大約lxlO"個病毒顆粒。劑量范圍將決定于動物的大小和給藥途徑。例如，對于單個部位，合適的人用或獸用肌內(nèi)注射劑量(對于大約80kg的動物)是在每毫升大約lxl(^至大約5xl(^個顆粒。任選地，可以采用多部位的給藥方式。在另一實例中，對于經(jīng)口的制劑，合適的人用或獸用劑量可以是范圍大約lxlO"至大約lxlO"個顆粒。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)給藥途徑以及重組載體所應(yīng)用的治療或免疫應(yīng)用來調(diào)整這些劑量。所述治療產(chǎn)物的表達水平，或者對于免疫原而言，循環(huán)抗體的水平，可以被監(jiān)測以確定劑量給藥頻率。確定給藥頻率的時間安排的其它方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是顯而易見的。所述藥物組合物的施用可以采用一次單劑量或一次以上單劑量的形式，例如作為相同的含多核苷酸腺病毒的重復(fù)劑量，或者按異源"激發(fā)-強化(prime-boost)"的疫苗接種制度。異源激發(fā)-強化制度在激發(fā)和強化過程中采用了不同形式疫苗的給藥，其每一種可以包括兩次或多次給藥。激發(fā)組合物和強化組合物通常將含有至少一種共同的抗原，盡管沒有必要是同一形式的抗原，但可以是不同形式的同一抗原。使用本發(fā)明所述載體的激發(fā)強化制度可以采用異源DNA和腺病毒栽體的激發(fā)強化形式，例如棵DNA激發(fā)給藥，隨后以腺病毒栽體強化，或者例如，腺病毒載體激發(fā)，隨之以一種或多種棵DNA強化。此類DNA強化可以通過肌內(nèi)或皮內(nèi)DNA給藥的方式，或者粒子加速技術(shù)來進行遞送。備選地，此類激發(fā)強化制度可包括例如根據(jù)本發(fā)明的蛋白和腺病毒栽體，其中激發(fā)劑量包括該蛋白，強化劑量包括該腺病毒栽體，或者例如，其中激發(fā)劑量包括腺病毒栽體，而強化劑量包括蛋白。實施例實施例1El/E3缺失的Pan6和Pan7腺病毒的構(gòu)建1.重組型El-缺失SV-25栽體的形成構(gòu)建一質(zhì)粒，其含有除工程化的El缺失以外的完整的SV-25基因組。在El缺失的部位，限制性內(nèi)切酶I-Ceul和PI-SceI的識別位點被插入，其使得來自穿梭質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因能夠被插入，其中，這兩個酶識別位點位于轉(zhuǎn)基因表達盒側(cè)翼。含有限制性位點SwaI-SnaBI-SpeI-AfIII-EcoRV-SwaI的合成接頭被克隆進用EcoRI和Ndel切開的pBR322中。通過使兩種合成寡聚物SV25T(5'-AATTTAAATACQTAGCGCACTAGTCGCGCTAAGCGCGGATATCATTTAM-3')和SV25B(5'.TATTTAMTGATATCCGCGCTTAAGCGCGACTAGTGCGCTACGTATTTA-3')一起退火并將其插入用EcoRI和Ndel消化的pBR322來完成此過程。AdSV25的左端(bpl至1057)被克隆進SnaBI和Spel位點間的上述接頭中。AdSV25的右端(bp28059至31042)被克隆進AflII和EcoRV位點間的接頭中。然后將腺病毒E1如下所述從被克隆的左端的EcoRI位點(bp547)至XhoI(bp2031)切下。將來自pShuttle(Clontech)的由PCR生成的I-Ceul-PI-Scel盒在EcoRI和Spel位點間插入。然后，將AdSV-25(bp2031至12185)的10154bpXhol片段插入Spel位點。所產(chǎn)生的質(zhì)粒用HindIII消化，并通過插入18344bpAdSV-25HindIII片段(bpl1984至30328)來完成此構(gòu)建物(Psv25)，從而生成El缺失的腺病毒SV25的完整分子克隆，其適合于生成重組型腺病毒。任選地，所需轉(zhuǎn)基因被插入新創(chuàng)的pSV25載體質(zhì)粒的I-Ceul和PI-SceI位點。為生成攜帶標(biāo)記基因的AdSV25,先前被克隆進質(zhì)粒pShuttle(Clontech)的GFP(綠色焚光蛋白)表達盒用限制性酶I-Ceul和PI-SceI切開，并連接進用相同的酶消化的pSV25(或者此處所述的另一種Ad黑猩猩質(zhì)粒)中。將所產(chǎn)生的質(zhì)粒(pSV25GFP)用Swal消化以分離細(xì)菌質(zhì)粒骨架，并轉(zhuǎn)染進E1互補細(xì)胞系HEK293。大約10天后，觀察到細(xì)胞病理效應(yīng)，表明復(fù)制型病毒的存在。表達GFP的基于AdSV25的腺病毒栽體的成功生成是通過將來自轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物的上清應(yīng)用于新鮮細(xì)胞培養(yǎng)物而被證實的。第二次被感染的細(xì)胞的存在是通過觀察細(xì)胞群體中的綠色熒光來確定的。2.E3缺失的Pan-6和Pan-7載體的構(gòu)建為增強所述腺病毒栽體的克隆容量，可以使E3缺失，因為此區(qū)域編碼了對于培養(yǎng)中的病毒的繁殖所不需要的基因。為此，E3-缺失版本的Pan-5、Pan-6、Pan-7和C68已被制成。(含E31-9的3.5kbNru-AvrII片段被缺失)。Pan6基栽體中的E3缺失El-缺失的pPan6-pkGFP分子克隆用SbfI和NotI消化以分離19.3kb的片段并在SbfI位點上連接回去。所產(chǎn)生的構(gòu)建物pPan6-SbfI-E3用Eco47III和Swal處理，生成pPan6-E3。最后，來自pPan6-pkGFP的SbfI消化的21kbSbfI片段被亞克隆進pPan6-E3以生成帶有E3的4kb缺失的pPan6-E3-pkGFP。E3缺失的Pan7栽體相同的策略被用于獲得Pan7中的E3缺失。首先，將跨越E3區(qū)的5.8kbAvrII片段亞克隆入pSL-1180中，隨后通過NruI消化使E3缺失。將產(chǎn)生的質(zhì)粒用SpeI和Avr1I處理以獲得4.4kb的片段并將其在AvrII位點克隆進pPan7-pkGFP以分別替換出原來的含E3的AvrII片段。最終的pPan7-E3-pkGFP構(gòu)建物含有3.5kb的E3-缺失。對于這些以及其它Pan腺病毒血清型中El、E3和E4缺失的構(gòu)建過程的完整描述在WO03/0046124中給出。進一步的信息也可以在HumanGeneTherapy15:519-530(WO03/046124)中獲得。實施例2Gag、RT、Nef序列的構(gòu)建在WO03/025003中全文描述。質(zhì)粒p73i-Tgrn1.質(zhì)粒p73i-GRN2克隆#19(pl7/p24(opt)/RT(opt)trNef)-修復(fù)型感興趣的基因來自HIV-1分化枝B林系HXB2的密碼子優(yōu)化的Gag的pl7/p24部分、密碼子優(yōu)化的RT和截短的Nef基因，位于Iowa長HCMV啟動子(IowalengthHCMVpromoter)+外顯子1的下游，并位于兔(3-珠蛋白多聚腺苷酸化信號的上游。含有來源于質(zhì)粒pl7/24trNefl的trNef基因的質(zhì)粒包含PCR錯誤，其使得Nef末端的19個氨基酸發(fā)生R到H的氨基酸變化。這是由PCR誘變加以糾正的，糾正后的NefPCR被粘合至來自p7077-RT3的密碼子優(yōu)化的RT，該粘合片段用Apal和BamHI切開，并被克隆入Apal/BamHI切開的p73i-GRN。引物PCRcoRT來自p7077-RT3，使用引物(聚合酶-PWO(Roche)始終。正義UlGAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGATAScoRT-NefGGTGTGACTGGAAAACCCACCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC循環(huán)95。C(30秒)，然后20個循環(huán)95。C(30秒)、55。C(30秒)、72。C(180秒)，然后72°C(120秒)并保持在4。C。1.7kbPCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠純化。PCR5'Nef來自pl7/24trNefl，使用引物正義S-NefATGGTGGGTTTTCCAGTCACACC反義ASNef-G:GATGAAATGCTAGGGGGCTGTCAAACCTC循環(huán)95。C(30秒)，然后15個循環(huán)95。C(30秒)、55。C(30秒)、72。C(60秒)，然后72。C(120秒)并保持在4'C。PCR3'Nef來自pl7/24trNefl，使用引物正義SNEF-GGAGGTTTGACAGCCSCC下AGCATTTCATC反義AStrNef(反義)CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAA(3TACTCC循環(huán)95。C(30秒)，然后15個循環(huán)95。C(30秒)、55。C(30秒)、72°C(60秒)，然后72°C(120秒)并保持在4'C。該PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠純化。最初用5'(S-Nef)和3'(AstrNef)引物將兩條Nef產(chǎn)物粘合。循環(huán)95。C(30秒)，然后15個循環(huán)95'C(30秒)、55。C(30秒)、72。C(60秒)，然后72。C(180秒)并保持在4X:。該PCR產(chǎn)物被PCR清潔，并使用Ul和AstrNef引物將其粘合至所述RT產(chǎn)物循環(huán)95。C(30秒)，然后20個循環(huán)95。C(30秒)、55。C(30秒)、72。C(180秒)，然后72。C(180秒)并保持在4。C。2.1kb產(chǎn)物經(jīng)過凝膠純化，并用ApaI和BamHI切開。質(zhì)粒p73I-GRN同樣用Apal和BamHI切開，凝膠純化，并與Apal-BamRT3trNef連接以重新生成pl7/p24(叩t)/RT(opt)trNef基因。2.質(zhì)粒p73I-RTw229k(失活的RT)感興趣的基因生成失活的RT基因，位于1owa長HCMV啟動子+外顯子1的下游，并位于兔P-珠蛋白多聚腺苷酸化信號的上游。由于對活性HIVRT種類在治療性疫苗方面的使用的顧慮，該基因的失活是令人期望的。這是通過該RT(來源于P73I-GRN2)氨基酸位置229由Trp至Lys(R7271pl-28)的PCR誘變而獲得的。引物PCR5'RT+突變，使用引物(聚合酶-PWO(Roche)始終)正義RT3-u:lGMTTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAA(3CTGAAACCCGGGAT反義AScoRT-Trp229LysGGAGCTCGTAGCCCATCTTCAGGMTGGCGGCTCCTTCT循環(huán)lx[94。C(30秒)]15x[94。C(30秒)/55。C(30秒)/72。C(60秒)]lx[72。C(180秒)]PCR凝膠純化PCR3'RT+突變，使用引物反義RT3-I:1GAATTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAGCTTGTCGACCTGCTCGTTGCCGC反義ScoRT畫Trp229LysCCTGAAGATGGGCTACGAGCTCCATG循環(huán)lx[94。C(30秒)]15x[94。C(30秒)/55。C(30秒)/72。C(60秒)]lx[72。C(180秒)]PCR凝膠純化將該PCR產(chǎn)物凝膠純化，并用5'(RT3-U1)和3'(RT3-L1)引物粘合RT的5'和3'末端。循環(huán)lx[94。C(30秒)]15x[94。C(30秒)/55。C(30秒)/72。C(120秒)]lx[72。C(180秒)]將此PCR產(chǎn)物凝膠純化，并使用Notl和BamHI限制性位點將其克隆進p7313ie中，以生成p73I-RTw229k。(參見圖13)3.質(zhì)粒p73i-Tgrn感興趣的基因來自HIV-1分化枝B抹系HXB2的密碼子優(yōu)化的Gag的pl7/p24部分、密碼子優(yōu)化的RT和截短的Nef基因，位于Iowa長HCMV啟動子+外顯子1的下游，并位于兔P-珠蛋白多聚腺苷酸化信號的上游。含有活性形式RT的三重融合構(gòu)建物可能無法被管理當(dāng)局所接受用于人類用途，因此RT的失活是通過將來自p73i-RTw229k的Nhel和Apal切割片段插入Nhel/Apal切割的p73i-GRN2弁19(圖14)而獲得的。這導(dǎo)致在RT的位置229上的W—K的改變。Tgrn質(zhì)粒插入片段的全序列在圖7中表示。這包含了pl7p24(opt)Gag、p66RT(opt并失活)以及截短的Nef。可選的Gag、RT和Nef構(gòu)建物如下trNef-p66RT(opt)-pl7，p24(opt)Gag,trNef-p17，p24(opt)Gag-p66RT(opt),p66RT(opt)-p17，p24(opt)Gag-trNef,p66RT(opt)-trNef-p17，p24(opt)Gagpl7，p24(opt)Gag-trNef-p66RT(opt)。這些構(gòu)建物的全序列分別在圖8至12中提供。實施例3Gag、RT、Nef序列插入腺病毒'將GRN表達盒亞克隆入pShuttle質(zhì)粒.通過SphI和EcoRI雙重消化，將由啟動子、cDNA和多聚腺苷酸化信號構(gòu)成的完整的表達盒從pT-GRN構(gòu)建物分離出來。SphI/EcoRI片段的SphI末端用Klenow填平，并被克隆進pShuttle質(zhì)粒的EcoRI21和MluI位點，其中MluI末端是平端。在克隆過程中，一個額外的側(cè)翼序列變得與HIV表達盒相關(guān)聯(lián)。此序列已知為Cer序列，并且不具有已知的功能。將GRN表達盒轉(zhuǎn)移入Pan6和Pan7栽體的El/E3-缺失的分子克隆。通過I-CeuI和PI-SceI消化，從pShuttle回收該表達盒，并將其克隆進Pan6和Pan7載體分子克隆的相同位點。重組克隆經(jīng)綠/白篩選鑒定并通過大量限制性酶分析加以證實。重組病毒的營救與繁殖。C6和C7栽體的分子克隆用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶(分別為Pmel和Pacl)處理以釋放出完整的線性載體基因組，并用磷酸鉀法轉(zhuǎn)染進293細(xì)胞。當(dāng)觀察到轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的全部細(xì)胞病理效應(yīng)時，收荻粗制病毒裂解液并逐漸擴大至293細(xì)胞的大規(guī)模感染(lxl0e9個細(xì)胞)。通過標(biāo)準(zhǔn)的CsCl沉淀法純化來自大規(guī)模感染物的病毒。此夕卜，pShuttle質(zhì)?？梢酝ㄟ^用EcoRI和Xmnl切割而被進一步修剪以去除3'接頭序列并減少該質(zhì)粒大小以制成pShuttleGRNc。使用上述方法，此修飾的質(zhì)?？梢员挥糜谏深~外的Pan7病毒(C7-GRNc)。其它構(gòu)建物類似地插入Pan6和Pan7腺病毒。不過帶有p66RT(opt)-trNef-pn,p24(opt)Gag插入片段的Pan6未被成功制備。實施例4小鼠免疫原性模型一系列含有重排的HIV抗原RT、Nef和Gag(RGN、NRG、NGR、GRN和GNR)插入片段的Pan6和Pan7載體被檢測了其體內(nèi)初級免疫反應(yīng)。進行了三組實驗以檢測Pan6病毒，進行了兩組實驗以檢測Pan7病毒。每種腺病毒按50pl體積lx108個粒子的劑量，肌內(nèi)施用于Balb/c(K2d)小鼠的單個后肢。由于此劑量先前已被表明能誘導(dǎo)優(yōu)良水平的細(xì)胞免疫反應(yīng)(未7〉開)而被選用。表1概括了在這些實驗中比較的腺病毒。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>用針對Gag、Nef和RT中特定表位的肽或蛋白進行體外刺激之后，通過ELIspot試驗在激發(fā)后的14和28天對CD8和CD4反應(yīng)的發(fā)生進行測量。該結(jié)果提供了強有力的證據(jù)，如通過IFNy和IL-2的產(chǎn)生所測量的，與空栽體對照相比，所有的變體都能夠產(chǎn)生強大的初次免疫反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。對來自這些研究的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析(使用SAS(version9丄3ServicePack2)中ProcMixed的方差混合模型分析(ANOVA)以確定各時點Pan6和Pan7中RNG變體的排名。針對IFNy生成對CD8肽的反應(yīng)之和用Gag和RT加以定量，而IL-2的ELIspot數(shù)椐則按照對Gag、Nef和RT的CD4肽的反應(yīng)之和來加以評價。使用貝葉斯模型計算各變體小組(thepanelofvariants)的排名(使用ProcMixed的PriorStatement來完成，其中的flatprior產(chǎn)生100,000posteriorsamples;參見Tierney,L.(1994),"MarkovChainsforExploringPosteriorDistributions"(帶有i寸論)，和AnnalsofStatistics,22,1701-1762.Gelfand,A.E.，Hills,S.E.,Racine-Poon,A.，andSmith,A,F.M.(1990),"IllustrationofBayesianInferenceinNormalDataModelsUsingGibbsSampling,"JournaloftheAmericanStatisticalAssociation,85，972-985)以預(yù)測每種變體是"最佳，，的概率，這是基于由所研究的實驗條件所提供的數(shù)據(jù)而進行的。圖1顯示在第14天和第28天，采用每種肽對于ifny和il-2的Pan6CD4和CD8反應(yīng)之和，如貝葉斯法所預(yù)測的。圖2顯示在第14天和第28天，采用每種肽對于IFNy和IL-2的Pan7CD4和CD8反應(yīng)之和，如貝葉斯法所預(yù)測的。與空栽體對照相比，所有的插入片段均表現(xiàn)出免疫反應(yīng)的顯著增加。統(tǒng)計分析表明不同的病毒之間沒有顯著的差異。實施例5豬免疫原性模型來自若干項研究的結(jié)果已表明，豬是檢測候選疫苗的免疫原性的良好模型。建立一項研究以調(diào)查所述四個候選NHP腺病毒在小型豬(minipigs)中的免疫原性。各組5只小型豬，用PAN6GRN、PAN6NGR、PAN7GRN或PAN7NGR進行激發(fā)(所用批次的詳細(xì)情況參見表2)。每只動物通過肌內(nèi)途徑接受總共3xl(T腺病毒的病毒粒子(使用1.0ml體積，在每一內(nèi)側(cè)大腿肌肉間等分)。表2.用于小型豬實驗的各批次NHP腺病毒<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>在免疫接種前以及免疫接種后一定時間間隔，從每只動物采集血液樣本。分離外周血單核細(xì)胞，并用RT、Nef和Gag肽文庫集合(peptidelibrarypools)和蛋白體外重新刺激。所述肽文庫集合由重疊11個氨基酸的15-mer肽組成，其橫跨整個RT、Nef和Gag序列，所述肽文庫集合與小鼠體內(nèi)實驗所用的那些相同。這些豬細(xì)胞產(chǎn)生的伽馬干擾素已用ELIspot試驗加以測量。圖3顯示了在4個采樣時點對RT、Nef和Gag肽文庫集合的反應(yīng)。免疫接種后的七天，對針對全部四種病毒的反應(yīng)進行檢測。對全部四種NHP病毒的細(xì)胞反應(yīng)被保持至激發(fā)后至少5周。通過IFN-gammaELIspot，PAN6-GRN在激發(fā)后7天產(chǎn)生最強烈的反應(yīng)。實施例6靈長類動物免疫原性模型來自靈長類動物初步研究的結(jié)果表明肌內(nèi)注射表達RT、Nef和Gag的NHP腺病毒引起了恒河猴(cynomolgusmonkey)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。建立一項研究以調(diào)查所述四個候選NHP腺病毒在恒河猴中的免疫原性。各組動物用PAN6-GRN、PAN6-NGR、PAN7-GRN或PAN7-NGR進行激發(fā)(所用病毒批次的詳細(xì)情況參見表3)。每只動物通過肌內(nèi)途徑接受總共10"腺病毒的病毒粒子(使用1.0ml體積，在每一內(nèi)側(cè)大腿肌肉(medialthighmuscle)間等分)。表3.用于靈長類動物實驗的各批次NHP腺病毒<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>在免疫接種前以及隨后每周的時間間隔采集血液樣本。分離外周血單核細(xì)胞，并用RT、Nef和Gag肽文庫集合體外重新刺激。用ELIspot試驗對這些靈長類動物細(xì)胞產(chǎn)生的伽馬干擾素進行測量。圖4顯示在3個采樣時點每一組的反應(yīng)。結(jié)果表明所有組在初次免疫接種后的一周都發(fā)生強烈反應(yīng)，且反應(yīng)持續(xù)至免疫接種后至少7周。此結(jié)果表明當(dāng)在靈長類動物中使用此劑量(即1011粒子)時，各栽體之間幾乎沒有差異。實施例7對肌內(nèi)遞送的(i.m.)的一定劑量范圍的編碼HIVGRN抗原的NHP腺病毒的初次免疫后的反應(yīng)。為評價初次免疫接種時腺病毒的劑量效應(yīng)，小鼠組(n-5)用不斷增加劑量的NHP腺病毒(從107至101。個粒子)進行肌內(nèi)(i.m.)免疫。作為陽性對照，一組動物使用粒子介導(dǎo)的表皮遞送(ND5)通過DNA(2pg)進行免疫。在免疫接種后的第6天和第19天，動物被排定時間(scheduleone)并移去脾臟。通過IFN-yELISPOT試驗，使用針對每一抗原(GAG和RT)的肽文庫集合過夜刺激脾細(xì)胞，從而對免疫反應(yīng)進行監(jiān)測。圖5顯示每組在兩個采樣時點的反應(yīng)。實施例8對皮內(nèi)遞送(i.d.)的一定劑量范圍的編碼HIVGRN抗原的NHP腺病毒的初次免疫后的反應(yīng)。為評價初次免疫接種時腺病毒的劑量效應(yīng)，小鼠組(11=5)用不斷增加劑量的NHP腺病毒(從107至101G個粒子)進行皮內(nèi)(i.d.)免疫。作為陽性對照，一組動物使用粒子介導(dǎo)的表皮遞送(PMED)通過DNA(lpg)進行免疫。在免疫接種后的第7天和第14天，動物被排定時間并移去脾臟。通過IFN-丫ELISPOT試驗監(jiān)測免疫反應(yīng)。使用每種抗原(GAG和RT)的良好定義的肽過夜刺激脾細(xì)胞，其特異性地刺激CD4或CD8T-細(xì)胞。圖6顯示每組在兩個采樣時點的反應(yīng)。這些結(jié)果表明i-m和i-d都是本發(fā)明組合物有效的給藥途徑。圖1.Pan6HIV腺病毒的排名。這代表了第14天和第28天對IFN丫和IL-2用每種肽的Pan6CD4和CD8反應(yīng)之和，如貝葉斯法所預(yù)測的。y軸代表每百萬脾細(xì)胞中的斑點形成細(xì)胞。圖2.Pan7HIV腺病毒的排名。這代表了第14天和第28天對IFN丫和IL-2用每種肽的Pan7CD4和CD8反應(yīng)之和，如貝葉斯法所預(yù)測的。y軸代表每百萬脾細(xì)胞中的斑點形成細(xì)胞。圖3.小型豬在初次免疫后的第0、1、3和5周對RT、Nef和Gag肽文庫集合的反應(yīng)。結(jié)果是每只動物對每一肽文庫集合的反應(yīng)之和的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)椐從賓夕法尼亞大學(xué)獲得。圖4.靈長類動物在初次免疫后的第0、1和2周對RT、Nef和Gag肽文庫集合的反應(yīng)。結(jié)果是每只動物對每一肽文庫集合的反應(yīng)之和的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖5:初次免疫后對肌內(nèi)遞送(i.m.)的一定劑量范圍的編碼HIVGRN抗原的NHP腺病毒的反應(yīng)。小鼠組(n-5)已用不同劑量的NHP腺病毒(從107至101Q個粒子)進行免疫，并使用IFN-yELISPOT試驗對針對每一抗原的肽文庫集合的細(xì)胞免疫反應(yīng)進行監(jiān)測(第6天和第19天)。圖6:初次免疫后對皮內(nèi)遞送(i.d.)的一定劑量范圍的編碼HIVGRN抗原的NHP腺病毒的反應(yīng)。小鼠組(11=3)已用不同劑量的NHP腺病毒(從107至101Q個粒子)進行免疫，并使用IFN-yELISPOT試驗對針對特定肽的細(xì)胞免疫反應(yīng)進行監(jiān)測(第7天和第14天)。圖7至12:實施例2中所述構(gòu)建物的多核苷酸序列、氨基酸序列和限制性圖譜。所述序列的詳細(xì)情況列于表4中表4:。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>權(quán)利要求1.一種腺病毒載體，包括編碼至少HIV抗原RT、Nef和Gag或者它們的免疫原性衍生物或免疫原性片段的一種或多種多核苷酸，所述多核苷酸被如此安排以便使它們按照Gag、RT、Nef的順序被轉(zhuǎn)錄。2.根椐權(quán)利要求1所述的腺病毒載體，其中所述RT是被截短的。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腺病毒載體，其中所述Nef是被截短的。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的腺病毒栽體，其中所述Gag只是pl7和p24。5.根椐前述權(quán)利要求中任一項所述的腺病毒栽體，其中所述的一種或多種HIV多核苷酸的大小使得所述栽體的總體大小為所述病毒大小的90至100%。6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的腺病毒栽體，其中所述病毒是非人靈長類動物腺病毒。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的腺病毒栽體，其中所述病毒是黑猩猩腺病毒。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的腺病毒栽體，其中所述的腺病毒選自pan5、6、7和9。9.根據(jù)權(quán)利要求8所迷的腺病毒載體，其中所述的腺病毒是pan6。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的腺病毒載體，其中所述的腺病毒是pan7。11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的腺病毒載體，其中所述病毒是復(fù)制缺陷型的。12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的腺病毒栽體，其中所述病毒的El和E3區(qū)是缺失的。13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的腺病毒栽體，其中編碼所述HIV抗原的多核苷酸序列被安排為融合形式。14.一種黑猩猩腺病毒載體，包括下列多核苷酸構(gòu)建物之一pl7，p24(密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag-p66RT(密碼子經(jīng)優(yōu)化)-截短的Nef;截短的Nef-p66RT(密碼子經(jīng)優(yōu)化)-pl7，p24(密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag;截短的Nef-pl7，p24(密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag-p66RT(密碼子經(jīng)優(yōu)化)；p66RT(密碼子經(jīng)優(yōu)化)-pl7,p24(密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag-截短的Nef;p66RT(密碼子經(jīng)優(yōu)化)-截短的Nef-pl7,p24(密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag;pl7，p24(密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag-截短的Nef-p66RT(密碼子經(jīng)優(yōu)化)。15.根據(jù)權(quán)利要求14的腺病毒栽體，其中所述腺病毒是Pan6或Pan7，條件是當(dāng)所述腺病毒是Pan6時，所述構(gòu)建物不是p66RT(優(yōu)化)-trNef-p17,p24(優(yōu)化)Gag。16.—種免疫原性組合物，包括前述權(quán)利要求中任一項所迷的病毒栽體和藥學(xué)上可接受的栽體或佐劑。17.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項所述的腺病毒栽體的用途，其被用于制備治療或預(yù)防HIV感染的藥物。18.制備權(quán)利要求1至5任一項所述的栽體的方法，包括步驟a)提供腺病毒栽體；b)提供攜帶所述HIV抗原序列的質(zhì)粒，所述序列可操作地連接于合適的啟動子；c)用所述質(zhì)粒和所述栽體一起轉(zhuǎn)染細(xì)胞；d)給予充足的時間使重組發(fā)生；以及e)回收攜帶所述HIV抗原序列的重組病毒栽體。19.一種在哺乳動物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用適當(dāng)量的根據(jù)權(quán)利要求16的免疫原性組合物。20.由權(quán)利要求1至15任一項所述的載體表達的融合蛋白。21.根據(jù)權(quán)利要求20的融合蛋白，其在人體內(nèi)產(chǎn)生。全文摘要本發(fā)明涉及病毒載體，其包括編碼HIV多肽的寡核苷酸，更具體地，其中所述病毒是腺病毒。具體而言，此類腺病毒是非人類的靈長類動物腺病毒，諸如猿猴腺病毒，更具體地，黑猩猩腺病毒。具體而言，本發(fā)明涉及腺病毒載體，其包括編碼多種不同HIV抗原的HIV多核苷酸序列，例如兩種或三種或者更多種的HIV抗原。本發(fā)明進一步涉及制備所述病毒載體的方法，涉及由此方法制備的病毒載體，并涉及所述載體在醫(yī)藥，尤其是在預(yù)防性或治療性疫苗接種方面的用途。文檔編號C07K14/005GK101384722SQ200680016279公開日2009年3月11日申請日期2006年5月10日優(yōu)先權(quán)日2005年5月12日發(fā)明者C·A·范維利,J·P·蒂特,P·F·埃爾特爾申請人:葛蘭素集團有限公司