專利名稱：用于調(diào)控血管完整性的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及治療疾病和其它病理學(xué)狀況的領(lǐng)域。更具體的說， 本發(fā)明關(guān)注用于調(diào)控與血管發(fā)生(angiogenesis)有關(guān)的分子事件和結(jié)果的方 法和組合物。
背景技術(shù)：
血管系統(tǒng)在維持正常生理學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。例如，血管系統(tǒng)的內(nèi) 皮細(xì)胞在正常情況下形成細(xì)胞屏障，用來調(diào)控流體、電解質(zhì)和蛋白質(zhì)進(jìn)入組 織和器官的運(yùn)動(dòng)。雖然引起內(nèi)皮屏障功能喪失的事件是相當(dāng)復(fù)雜的，而且尚 未完全理解，但是血管系統(tǒng)完整性的形成和維持已有廣泛研究。參見例如 Kagsbmn & Moses, Chemistry & Biology (1999), 6:R217-R224; Ferrara, Endocrine Reviews (2004)， 25(4):581-611 。
不過，清楚的是，血管系統(tǒng)完整性的侵?jǐn)_(perturbation)與多種疾病和病 理學(xué)狀況的病因有關(guān)，范圍從癌癥到炎性疾病，諸如自身免疫性病癥。參見 例如美國專利申請公布號2004/0167198; Cines et al., Blood (1998), 91(10》3527-3561; Kumar et al., Curr. Opin. In Nephrology and Hypertension (2005), 14:33-37; Ca薩liet & Collen Am. J. Physiol. (1997), 273:H2091-H2104。另一方面，應(yīng)當(dāng)注意，在某些生理學(xué)背景下，形成和/或 維持受損狀態(tài)血管系統(tǒng)(vasculature)的能力是人們所希望的，而且在缺陷時(shí)其 自身可導(dǎo)致病理學(xué)問題或亞最佳治療結(jié)果。
與血管系統(tǒng)有關(guān)的炎癥已經(jīng)鑒定為常常與血管完整性侵?jǐn)_有關(guān)的胞外 血管發(fā)生性刺激的下游事件。Kirkpatrick et al., Int. J. Microcirc. (1997), 17:231-240。例如，越來越多的證據(jù)表明，炎癥過程可能在多種血管相關(guān)病 癥的病理生理學(xué)過程中發(fā)揮重大作用，諸如高血壓。參見例如Touyz, Cur. Opin. Nephrology and Hypertension (2005)， 14:125-131; Kobayashi & Lin, Frontiers in Bioscience (2005), 10:666-674; Bacon， Curr. Opin. Rheumatol. (2004), 17:49-55; Paleolog, J. Clin. Pathol.: mol. Pathol. (1997), 50-225-233; Mullenix et al., Ann. Vase. Surg. (2005), 19:130-138。正i口Touyz注意到的，在 血管系統(tǒng)中觀察到指示炎癥的事件，例如表面粘附分子及其配體的表達(dá)、炎 癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞因子生成、趨化因子釋放、氧化應(yīng)激和先天免疫激活升高。 內(nèi)皮細(xì)胞受到侵?jǐn)_還表現(xiàn)為馮維勒布蘭德(von Willebrand)因子和E-選擇蛋白 的釋放，后者只在內(nèi)皮細(xì)月包中表達(dá)。Kuenen et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. (2002)， 22:1500-1505。持續(xù)和/或不受調(diào)控的炎癥可導(dǎo)致組織/血管損傷。 炎癥應(yīng)答典型地涉及血管通透性、白細(xì)胞溢出(粘附、變移(transmigration) 和趨化性)和組織修復(fù)的改變。Touyz, supra。
不幸的是，迄今為止，仍然缺乏關(guān)于在胞外血管發(fā)生性刺激與相關(guān)下游 事件(諸如內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)炎癥)之間介導(dǎo)信號傳導(dǎo)的胞內(nèi)分子的信息。這妨 礙了開發(fā)能夠精密調(diào)節(jié)血管發(fā)生過程以將不希望有的炎癥引起的對血管完 整性的侵?jǐn)_降至最低或者在需要時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生對血管完整性的侵?jǐn)_的治療策 略的努力。因此，確實(shí)需要鑒定可作為新治療干預(yù)的焦點(diǎn)的"中間" (intermediate)分子靶物和途徑。本文中描述的發(fā)明滿足了這一需要并且還提 供了其它好處。
完整收入本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利申請和出版物，作為 本文的參考。
發(fā)明概述
本發(fā)明至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)唐氏(Down)綜合征關(guān)區(qū)域(critical region)蛋白質(zhì)家族的成員是血管發(fā)生因子的胞外信號傳導(dǎo)與調(diào)控血管完整 性的下游事件的胞內(nèi)調(diào)控之間的關(guān)鍵中間分子連接。具體而言，唐氏綜合征 關(guān)4建區(qū)域1 (下文中的"DSCRl，，)在本文中顯示為在活化的內(nèi)皮細(xì)胞中在受 到血管發(fā)生調(diào)控物諸如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的刺激后誘導(dǎo)的胞內(nèi)分子， 由此DSCRl的誘導(dǎo)繼而調(diào)控與血管/內(nèi)皮細(xì)胞炎癥有關(guān)的基因的表達(dá)。如上 所述，已經(jīng)將與血管系統(tǒng)(vasculature)有關(guān)的炎癥與眾多病癥聯(lián)系起來。值得
注意的是，DSCR1是治療性調(diào)控的特別有利的耙，因?yàn)樗诎庋馨l(fā)生信 號與胞內(nèi)血管炎癥調(diào)控之間的介導(dǎo)中經(jīng)由負(fù)調(diào)控反饋環(huán)起作用。不受理論束 縛，根據(jù)細(xì)胞/生理學(xué)環(huán)境，DSCR1，在其作為負(fù)調(diào)控反饋環(huán)的成分的能力 方面，預(yù)計(jì)對正調(diào)控或負(fù)調(diào)控都是敏感的，以改變在正常情況下與調(diào)控反饋 環(huán)有關(guān)的分子和信號傳導(dǎo)平衡。與此一致，如本文所示，內(nèi)皮細(xì)胞中DSCR1 活性的升高和降低都憑經(jīng)驗(yàn)證明導(dǎo)致對細(xì)胞存活結(jié)果的相似調(diào)控。如此，本 文中所公開的數(shù)據(jù)揭示了一種重要的分子靶物/途徑，其在受到干預(yù)時(shí)，導(dǎo)致 對血管發(fā)生信號傳導(dǎo)相關(guān)的關(guān)鍵下游事件之一，即血管系統(tǒng)相關(guān)炎癥的調(diào) 控。在某些情況下，諸如炎癥，如果置之不理，可造成不希望發(fā)生的病理學(xué) 后果。而在其它情況中，增強(qiáng)此類炎癥可能是希望的。本發(fā)明提供可用于調(diào) 控此類炎癥的方法、組合物、試劑盒和制品，其通過干預(yù)DSCRl功能/活性， 從而調(diào)控血管炎癥及由此調(diào)控血管完整性來實(shí)現(xiàn)。
一方面，本發(fā)明提供了調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞中的DSCR1活性的DSCR1調(diào)控物。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述DSCR1調(diào)控物調(diào)控經(jīng)由VEGF受體2 (VEGFR-2)的信 號傳導(dǎo)誘導(dǎo)的DSCR1活性。本發(fā)明的DSCRl調(diào)控物可調(diào)控DSCRl-鈣依賴磷 酸酶A (calcineurin A, CnA)途徑的一個(gè)或多個(gè)方面。例如，在一個(gè)實(shí)施方案 中，本發(fā)明的DSCR1調(diào)控物調(diào)控與NFAT活性有關(guān)的 一 個(gè)或多個(gè)細(xì)胞事件， 包括例如NFAT磷酸化、NFAT核易位或NFAT轉(zhuǎn)錄活性(例如NFAT介導(dǎo)CnA 對基因表達(dá)的調(diào)控的能力)。
本發(fā)明的DSCR1調(diào)控物可以以適于臨床使用的任何形式提供。例如，本 發(fā)明的調(diào)控物可以以核酸或多肽的形式提供和/或施用。相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施 方案中，本發(fā)明的DSCRl調(diào)控物包括編碼能夠拮抗CnA誘導(dǎo)的基因表達(dá)的多 肽的核酸。例如，所述多肽可包括至少包含DSCR1—部分的肽，其中所述肽 能夠與CnA相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含部分但非完整的成 熟DSCR1蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含全長成熟DSCR1蛋白質(zhì)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含人DSCR1的大約第96位到大約第125位或 者大約第108位到大約第122位氨基酸，其中氨基酸位置指SEQ ID NO: 1 (圖9 ) 所示序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含與人DSCR1大約第96位到大約 第125位或者人DSCR1大約第108位到大約第122位氨基酸的序列具有至少 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 98%序列同一性或相似性的序列,其 中氨基酸位置指SEQIDNO:l (圖9)所示序列，只要該多肽保留拮抗CnA誘
導(dǎo)的基因表達(dá)的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含人DSCR1的絲氨酸 -月甫氨酸(SP)序列的至少一部分及N和/或C-末端鈣依賴磷酸酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 至少一部分，其中所述多肽能夠結(jié)合CnA以抑制CnA調(diào)控的基因表達(dá)。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含(i)人DSCRl大約第96位到大約第125位或者人 DSCR1的大約第108位到大約第122位的序列，其中氨基酸位置指SEQ ID NO:l (圖9)所示序列;(ii)絲氨酸-脯氨酸(SP)序列的至少一部分；及(iii)人 DSCRl的N和/或C-末端釣依賴磷酸酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少一部分，其中所述多 肽能夠結(jié)合C n A以抑制Cn A調(diào)控的基因表達(dá)。
一方面，本發(fā)明提供了能夠拮抗DSCR1活性的DSCR1調(diào)控物。相應(yīng)地，
化的內(nèi)皮細(xì)胞)中時(shí)抑制細(xì)胞中的DSCR1活性(包括但不限于基因表達(dá))的 核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包括反義寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述核酸包括抑制性/干擾性RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抑制性/干 擾性RNA是抑制性/干擾性小RNA(siRNA)。例如，包含siRNA的DSCRl調(diào)控 物可包含選自下組的 一 種或多種序列GCUCAGACCUUACACAUAG 、 GGACAUCACCUUUCAGUAU、 GAAAGAAUGAGGAGACCUA 和 GACAUCACCUUUCAGUAUU。又例如，包含si脂A的DSCRl調(diào)控物可包 含選自下組的 一 種或多種序列AACGUAUGACAAGGACAUCAC 、 AAGGACAUCACCUUUCAGUAU 、 AAGUUAUAUUUUGCUCAGACC和 AAGAUGCGACCCCAGUCAUAA。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含siRNA的DSCRl 調(diào)控物包含選自下組的一種或多種序列GCUC AGACCUUAC AC AUAG、 GGACAUCACCUUUCAGUAU、 GAAAGAAUGAGGAGACCUA 、 GACAUCACCUUUCAGUAUU 、AACGUAUGACAAGGACAUCAC 、 AAGGACAUCACCUUUCAGUAU 、 AAGUUAUAUUUUGCUCAGACC和 AAGAUGCGACCCCAGUCAUAA。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包括適體(aptamer)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的DSCR1調(diào)控物包括抗體。在一個(gè)實(shí)施方案 中，施用抗體使得它進(jìn)入靶內(nèi)皮細(xì)胞以抑制該細(xì)胞中的DSCRl,即抗體得到 內(nèi)在化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體由導(dǎo)入(例如轉(zhuǎn)染)到靶內(nèi)皮細(xì)胞的核
酸編碼。
一方面，本發(fā)明提供了用于治療與內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)炎癥有關(guān)的多種病癥的
方法。例如， 一方面，本發(fā)明提供了治療與異常血管炎癥有關(guān)的病癥的方法，
所述方法包括對受試者施用有效量的本發(fā)明DSCR1調(diào)控物，由此治療該病
癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述調(diào)控物增強(qiáng)與血管系統(tǒng)有關(guān)的炎癥。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述調(diào)控物抑制與血管系統(tǒng)有關(guān)的炎癥。
一方面，本發(fā)明提供了治療與異常血管炎癥有關(guān)的免疫學(xué)病癥的方法，
所述方法包括對受試者施用有效量的本發(fā)明DSCR1調(diào)控物，由此治療該病 癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述調(diào)控物增強(qiáng)與血管系統(tǒng)有關(guān)的炎癥。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述調(diào)控物抑制與血管系統(tǒng)有關(guān)的炎癥。
又一方面，本發(fā)明提供了治療與血管完整性侵?jǐn)_有關(guān)的病癥的方法，所 述方法包括對受試者施用有效量的本發(fā)明DSCR1調(diào)控物，由此治療該病癥。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述血管完整性侵?jǐn)_與血管/內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)炎癥有關(guān)，例 如在存在不希望的較高或較低量的血管/內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)炎癥時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方 案中，所述調(diào)控物增強(qiáng)與血管系統(tǒng)有關(guān)的炎癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述調(diào) 控物抑制與血管系統(tǒng)有關(guān)的炎癥。
一方面，本發(fā)明提供了減輕與抗炎療法有關(guān)的副作用的方法，包括聯(lián)合 抗炎療法對受試者施用本發(fā)明的DSCR1調(diào)控物，由此減輕所述副作用。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述DSCR1調(diào)控物抑制內(nèi)皮細(xì)胞中的DSCR1活性。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述抗炎療法包括抑制炎癥的藥劑，例如所述藥劑可抑制免疫細(xì) 胞活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥劑是環(huán)孢霉素類炎癥抑制劑，諸如環(huán)孢 霉素A(CsA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述調(diào)控物增強(qiáng)與血管系統(tǒng)有關(guān)的炎癥。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述調(diào)控物抑制與血管系統(tǒng)有關(guān)的炎癥。
又一方面，本發(fā)明提供了治療與不希望的血管發(fā)生有關(guān)的病癥(諸如癌 癥)的方法，所述方法包括對患有該病癥的受試者施用抗血管發(fā)生劑和本發(fā) 明的DSCR1調(diào)控物。
另一方面，本發(fā)明提供了抑制腫瘤生長或癌細(xì)胞生長的方法，所述方法 包括對腫瘤或癌細(xì)胞施用有效量的抗癌劑和有效量的本發(fā)明DSCR1調(diào)控物， 其中所述組合有效量抑制腫瘤或癌細(xì)胞的生長。
在一個(gè)實(shí)施方案中，抗癌劑包括抗血管發(fā)生劑，例如VEGF拮抗劑。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述VEGF拮抗劑是抗VEGF抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所
個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合序列包含抗體A4.6.1或其親和力成熟變體的重
鏈的至少一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)高變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合序列
包含抗體A4.6.1或其親和力成熟變體的輕鏈的至少一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)高變區(qū)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合序列包含抗體A4.6.1或其親和力成熟變體 的重鏈可變域的人源化形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合序列包含抗 體A4.6.1或其親和力成熟變體的輕鏈可變域(variable domain)的人源化形式。 抗體A4.6.1是由保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心、保藏號為HB 10709 (ATCC, American Type Culture Collection, Manassas, VA)的雜交瘤細(xì)月包系生成的抗 VEGF抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗VEGF抗體是bevacizumab (貝伐單 抗)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗VEGF抗體是與bevacizumab結(jié)合人VEGF的 相同表位的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗VEGF抗體是與bevacizumab竟 爭結(jié)合人VEGF的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗VEGF抗體結(jié)合VEGF的 受體，例如VEGFR2。在這些方法的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的DSCR1調(diào)控 物聯(lián)合抗癌劑諸如化療劑施用于受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述DSCR1 調(diào)控物抑制與血管完整性侵?jǐn)_有關(guān)的副作用。例如，所述血管完整性侵?jǐn)_可 能與血栓溶解有關(guān)。
一方面，本發(fā)明提供了通過增強(qiáng)血管發(fā)生來治療病癥的方法，所述方法 包括對患有病癥的受試者施用有效量的誘導(dǎo)血管發(fā)生的藥劑和有效量的 DSCR1調(diào)控物，由此治療該病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)血管發(fā)生的 藥劑包括促血管發(fā)生物質(zhì)，例如本文中所公開的一種或多種血管發(fā)生因子。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述血管發(fā)生因子是VEGF。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 DSCR1調(diào)控物抑制血管完整性侵?jǐn)_?？赏ㄟ^此方法治療的病癥包括任何本文 中所公開的病癥，包括例如傷口、缺血、心血管病癥、動(dòng)脈粥樣硬化、血管炎等。
一方面，本發(fā)明提供了調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞存活的方法，包括使細(xì)胞接觸 DSCR1調(diào)控物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)皮細(xì)胞是活化的。在一個(gè)實(shí)施方
施方案中，所述內(nèi)皮細(xì)胞是用編碼DSCR1有義序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述DSCR1調(diào)控物包括抑制性/干擾性RNA,其在一個(gè)實(shí)施 方案中是小干擾RN A (s iRN A)。
在其中本發(fā)明的DSCR1調(diào)控物聯(lián)合另 一種治療劑施用的本發(fā)明方法中， 施用DSCR1調(diào)控物的時(shí)間安排相對于施用所述另 一種治療劑的時(shí)間安排將
是任何憑經(jīng)驗(yàn)和/或在臨床上認(rèn)為對治療有益的安排。例如，在一個(gè)實(shí)施方案
中，所述DSCR1調(diào)控物的施用在所述另一種治療劑的施用之前。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述DSCR1調(diào)控物的施用在所述另一種治療劑的施用之后。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，所述DSCR1調(diào)控物的施用與所述另一種治療劑的施用是同時(shí) 的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述另一種治療劑具有抗炎活性。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述兩種藥劑是作為分開的組合物施用的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩 種藥劑是作為單 一組合物施用的。
一方面，本發(fā)明提供了鑒定有風(fēng)險(xiǎn)形成與包括血管發(fā)生調(diào)控的病癥治療 有關(guān)的副作用的受試者的方法，所述方法包括測量組織或細(xì)胞中DSCR1表達(dá) 或活性的量，并將該量與正常的對應(yīng)組織或細(xì)胞的量進(jìn)行比較，其中量的差 異表明有風(fēng)險(xiǎn)形成所述副作用。 一般而言，所述副作用是由于與炎癥有關(guān)的 血管完整性受到侵?jǐn)_。所述鑒定方法可在臨床干預(yù)過程中任何方便和/或有益 的時(shí)間點(diǎn)實(shí)施。例如，它可以發(fā)生在施用治療劑以治療所討i侖病癥之前、期 間或之后。
一方面，本發(fā)明提供了鑒定DSCR1調(diào)控物(諸如可用于調(diào)控血管完整性 侵?jǐn)_/血管炎癥的分子)的方法，所述方法包括使候選物質(zhì)接觸DSCR1 (或 其功能性變體，如下文所定義的)，并測定存在和不存在所述候選物質(zhì)時(shí) DSCR1 (或其功能性變體)的量，其中存在和不存在所述候選物質(zhì)時(shí)DSCR1 (或其功能性變體)的量不同表明所述候選物質(zhì)是DSCR1的調(diào)控物。DSCR1 的量可通過本領(lǐng)域已知的任何合適的定性或定量測量法來測定。例如， DSCR1的量可通過RNA或蛋白質(zhì)的水平來指示。又例如，DSCR1的量可通 過DSCR1活性(例如CnA的抑制)來指示。本發(fā)明的方法可用于鑒定DSCR1 的拮抗劑或激動(dòng)劑。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，DSCR1的量在存在候選物質(zhì) 時(shí)較低。在另一個(gè)實(shí)施方案中，DSCR1的量在存在候選物質(zhì)時(shí)較高。通過本 發(fā)明的方法鑒定的調(diào)控物可具有用于本發(fā)明方法所要求的任何特征。例如， 可以選擇能夠調(diào)控血管完整性和/或與內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)的炎癥的候選物質(zhì)。或 者，候選物質(zhì)可進(jìn)行另外的評估以選擇缺乏某些不希望的特征的物質(zhì)。例如， 可以選擇基本上不調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖的候選物質(zhì)。
如上所述，本發(fā)明的DSCR1調(diào)控物和方法可用于治療懷疑或已知與不當(dāng) 血管完整性調(diào)控有關(guān)的多種病癥。例如，這些病癥包括但不限于血管(諸如 心血管)、內(nèi)皮、血管發(fā)生性(諸如腫瘤/癌癥)或免疫學(xué)(諸如自身免疫)
病癥范疇中的病癥。不過，在有些實(shí)施方案中，這些病癥不是心血管的或免 疫學(xué)的。在有些實(shí)施方案中，這些病癥不是內(nèi)皮的或血管發(fā)生性的。而在其 它實(shí)施方案中，所述病癥與組織炎癥(急性的或慢性的)，例如自身免疫性 病癥有關(guān)。還應(yīng)當(dāng)注意，有些疾病可能具有兩種或多種病癥范疇之間交疊的特征。
一般而言，本發(fā)明提供了可用于治療免疫介導(dǎo)的病癥的調(diào)控物分子和方 法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及自身免疫性病癥的治療，諸如本文中所 指明的。在一個(gè)實(shí)施方案中，病癥涉及移植物排斥或移植物抗宿主疾病。
在其中治療方法包括促進(jìn)血管發(fā)生(angiogenesis)/新血管形成以治療病 癥的本發(fā)明方法的有些實(shí)施方案中，所述病癥可以是但不限于例如血管創(chuàng) 傷、傷口、撕裂傷、切口、燒傷、潰瘍(例如糖尿病性潰瘍、壓迫性潰瘍、 血友病性潰瘍、靜脈曲張性潰瘍)、組織生長、體重增加、外周動(dòng)脈疾病、 引產(chǎn)、毛發(fā)生長、大皰性表皮松解癥、視網(wǎng)膜萎縮、骨折、骨脊柱融合(bone spinal fbsion)、半月板撕裂等。
在臨床上適當(dāng)或希望時(shí)，本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括另外的治療步驟。 例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括其中使靶細(xì)胞和/或組織 (例如癌細(xì)胞)暴露于放射治療或化療劑的步驟。
一方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種本發(fā)明DSCR1調(diào)控物和載體的組 合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是藥學(xué)可接受的。
一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明DSCR1調(diào)控物的核酸。在一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明的核酸編碼DSCR1調(diào)控物，其是或包含多肽(例如寡肽)。在 一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼DSCR1調(diào)控物，其是或包含抗體或其片 段。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼抑制DSCRl表達(dá)/活性(例如 DSCR1基因轉(zhuǎn)錄或DSCR1蛋白質(zhì)翻譯)的核酸序列。
一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸的載體。
一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸或載體的宿主細(xì)胞。載體可以是 任何類型的，例如重組載體，諸如表達(dá)載體。可以使用任何多種宿主細(xì)胞。 在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，例如大腸桿菌。在一個(gè)實(shí)施方案 中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì) 胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸或載體在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。
一方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的DSCR1調(diào)控物的方法。例如，本發(fā)
明提供了制備其是或包含抗體(或其片段)的DSCR1調(diào)控物的方法，所述方
體，并回收所述抗體(或其片段)。又例如，本發(fā)明提供了制備其是或包含 多肽(諸如寡肽)的DSCR1調(diào)控物的方法，所述方法包括在合適的宿主細(xì)胞 中表達(dá)編碼所述多肽(諸如寡肽)的本發(fā)明重組載體，并回收所述多肽(諸 如寡肽)。
一方面，本發(fā)明提供了制品，其包含容器；及裝在所述容器內(nèi)的組合物， 所述組合物包含一種或多種本發(fā)明的DSCR1調(diào)控物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述組合物包含本發(fā)明的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含DSCR1調(diào)控物的組合 物進(jìn)一步包含載體，其在有些實(shí)施方案中是藥學(xué)可接受的。在一個(gè)實(shí)施方案 中，本發(fā)明的制品進(jìn)一步包含關(guān)于施用所述組合物(例如DSCR1調(diào)控物)以 治療本文中所指明的病癥的"i兌明書。
一方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含第一容器，其中裝有包含一種或 多種本發(fā)明DSCR1調(diào)控物的組合物；及第二容器，其中裝有緩沖劑。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述緩沖劑是藥學(xué)可接受的。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含DSCR1 調(diào)控物的組合物進(jìn)一步包含載體，其在有些實(shí)施方案中是藥學(xué)可接受的。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含關(guān)于施用所述組合物(例如DSCR1 調(diào)控物)以治療本文中所指明的病癥的說明書。
附圖簡述


圖1 。使用基因召喚技術(shù)(GeneCall technology)和RT-PCR的基因表達(dá)分 析。(A)將原代HUVEC分別暴露于無血清培養(yǎng)基或補(bǔ)充有VEGF或5。/。 FCS 的無血清培養(yǎng)基達(dá)0、 6或24小時(shí)。將內(nèi)皮細(xì)胞溶胞并分離總RNA，通過基因 召喚分析基因表達(dá)。每欄代表一系列二元比較(已經(jīng)進(jìn)行了彼此比較)的輸 出結(jié)果。然而，證實(shí)了標(biāo)有"P" (P-中毒)或"I" (1=分離、克隆、測序和 中毒)的基因。發(fā)現(xiàn)所示選擇的基因在6和24小時(shí)時(shí)受到VEGF的誘導(dǎo)，但非 5% FCS的刺激；VEGF的倍數(shù)刺激表示為每個(gè)格中的數(shù)值?；疑癖砻髟? 和24小時(shí)有血清較之無血清的二元比較中沒有觀察到表達(dá)變化。放大的索引 圖中的垂直黑色條表明基因召喚的置信水平。(B)通過實(shí)時(shí)PCR的DSCR1表 達(dá)分析^。在所示時(shí)間階段將HUVEC保持在無血清條件下并用5。/。 FCS、 b-FGF (10ng/mL)、 VEGF (30 ng/mL) 、 P1GF (100ng/mL) 、 VEGFRl-sel
(100ng/mL)或VEGFR2-sel (30ng/mL)刺激。所有突變型蛋白質(zhì)是VEGFR2-sel (KDR選擇性):VEGF D63S/G65M/L66R和Fit選擇性VEGF 143A/I46A/Q79A/I83氣(C)通過實(shí)時(shí)PCR的DSCR1表達(dá)分析。將HPAEC、 HDMEC和HUAEC在存在0.5。/。 FCS (NA)時(shí)或在存在0.5% FCS和VEGF (30ng/mL)或與VEGFRl (VEGFRl-sd, 100ng/mL)或VEGFR2 (VEGFR2-sel， 30 ng/mL)結(jié)合的VEGF突變型時(shí)逃溫育4 (■)、 8 (C)和24 (口)小時(shí)。作為對照 細(xì)胞，使用不表達(dá)顯著水平VEGF受體的HUPASMC (數(shù)據(jù)未顯示)。所示數(shù) 據(jù)代表了代表性的總共3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的 一式三份樣品的平均值土SD。相對 RNA單位(RRU)如Gerber等人^斤述計(jì)算，使用cyclophylin作為參比基因。(D) 通過實(shí)時(shí)PCR的DSCR1表達(dá)分析。將HUVEC在存在CsA(l)iM)時(shí)溫育2小時(shí)， 然后用VEGF (3 Ong/mL) 、 VEGFR2-sel (3 Ong/mL) 、 VEGFR1 -sel (1 OOng/mL)、 PMA (200ng/mL)和IO (5pM)、毒胡蘿卜素(thapsigargin)(50nM)或TNF-a (10ng/mL)刺激5.5小時(shí)，如所示的。所示數(shù)據(jù)代表了 一式兩份平行進(jìn)行的代 表性的總共2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土 SD。 (E) HUVEC全細(xì)胞提取物的Western 印跡分析，HUVEC在0。/。血清、0.5% BSA和5。/。 FCS、 hVEGF (30ng/mL)、 b匿FGF (10 ng/mL)、 TNP-a (10ng/mL)和PMA或伊屋諾霉素(ionomycin, 10)中 培養(yǎng)5小時(shí)，如所示的。作為對照，包括100ng重組DSCRl蛋白質(zhì)。
圖2。 DSCRl和NFATcl磷酸化的細(xì)胞定位。(A)經(jīng)Ad-DSCRl-FLAG或 對照Ad-LacZ (MOI二100)轉(zhuǎn)導(dǎo)并暴露于VEGF (30ng/mL)的HUVEC的IHC分 析。經(jīng)VEGF刺激20分鐘后，將細(xì)胞固定并分析NFATcl的細(xì)胞定位。(B) NFATcl磷酸化的Western印跡分析。將HUVEC用所示腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo) (MOI爿OO)或只暴露于轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)基(NA)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后2天，向細(xì)胞中添加CsA (lpM), 2小時(shí)后將細(xì)胞用PMA(200ng/mL)/10 (5pM)刺激4小時(shí)。將總細(xì)胞提 取物進(jìn)行Western印跡分析，使用獨(dú)立于磷酸化狀態(tài)識別NPATc 1的抗NFATc 1 抗體。所示數(shù)據(jù)來自代表性的總共3次實(shí)驗(yàn)。
圖3。 DSCR1干擾活化的內(nèi)皮細(xì)胞中的NFAT轉(zhuǎn)錄活性。(A)包括編碼C-末端表位標(biāo)記形式的DSCR1 (DSCR1-FLAG)的CMV驅(qū)動(dòng)表達(dá)載體或等量空 載體的混合物轉(zhuǎn)染的HUVEC的熒光素酶報(bào)道基因分析。熒光素酶報(bào)道構(gòu)建 物包含3個(gè)NFAT結(jié)合位點(diǎn)(NPAT-Luc)或3個(gè)拷貝的APl (B)結(jié)合位點(diǎn)。轉(zhuǎn)染后 48小時(shí)，將細(xì)胞用PMA(200ng/mL)、毒胡蘿卜素(50nM)或I0 (5pM)刺激6小 時(shí)。將細(xì)胞溶胞并分析報(bào)道基因表達(dá)。所示數(shù)據(jù)代表了相對于SV40-RL活性
的熒光素酶活性。數(shù)據(jù)代表了代表性的4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一式三份樣品的平均 值土SD。
圖4。活化的內(nèi)皮細(xì)胞上DSCR1對炎癥標(biāo)志物基因表達(dá)的抑制。(A)用 編碼DSCR1 (Ad-DSCRl-FLAG)或?qū)φ誏acZ (Ad-LacZ)的腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo) (MOK00)的HUVEC的實(shí)時(shí)RT-PCR分析。轉(zhuǎn)導(dǎo)后2天，將細(xì)胞只與生長培養(yǎng) 基一起或與補(bǔ)充有PMA (200ng/mL)和I0 (5pM)、 VEGF (30ng/mL)、毒胡蘿 卜素(50nM)或其所示組合的生長培養(yǎng)基一起溫育5-6小時(shí)。分離總RNA并通 過實(shí)時(shí)RT-PCR分析來分析Cox-2(i)、 E-選4奪蛋白(ii)和TF (iii)的水平。所示數(shù) 據(jù)代表了代表性的總共3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一式三份樣品的平均值士SD。 RRU如 Gerber等人^斤述計(jì)算，使用GAPDH作為參比基因。(B)經(jīng)各種化合物刺激 的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞的FACS分析。向轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中添加CsA (ljiM)， 2小時(shí)后 用PBS(NA)、 PMA(200ng/mL)、 10 (5)iM)、 TNP-a (10ng/mL)或其組合刺激 細(xì)胞。刺激后24小時(shí)，通過在25mM EDTA (乙二胺四乙酸)/PBS中溫育IO分 鐘，從培養(yǎng)皿中取出細(xì)胞。對細(xì)胞分析E-選擇蛋白、VCAM-1、 TF和ICAM-1 的表達(dá)。層析圖下的白色區(qū)域代表用Ad-DSCRl轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞上的表達(dá)水平； 灰色區(qū)域代表LacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞上的表達(dá)水平。所示數(shù)據(jù)來自代表性的總共3次 獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。(C) HUVEC總細(xì)胞提取物分別對于Cox-2和TF的Westem印跡分 析。為了控制相等的荷載，使用識別2Y-銜接蛋白的抗體。所示數(shù)據(jù)來自代表 性的3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
圖5。內(nèi)皮細(xì)胞上VEGF對炎癥標(biāo)志物基因的瞬時(shí)調(diào)控。(A)所示時(shí)間階 段保持在無血清條件下并用VEGF (30ng/mL)刺激、或者只有無血清培養(yǎng)基的 HUVEC的實(shí)時(shí)RT-PCR分析。對表達(dá)水平進(jìn)行了 TaqMan分析。所示相對表達(dá) 水平是通過將存在VEGF時(shí)的基因表達(dá)RRU除以未刺激水平得到的'。(B)活 化的內(nèi)皮細(xì)胞中DSCR1的負(fù)反饋調(diào)控環(huán)的示意圖，導(dǎo)致VEGF或激活CnA信 號傳導(dǎo)的化合物刺激后對鈣依賴磷酸酶信號傳導(dǎo)的干擾。
圖6。 siRNA對內(nèi)源DSCR1的敲低(knock down)增強(qiáng)活化的內(nèi)皮細(xì)胞中的 NTFAT活性。(A)用siRNA和PRKN-DSCRl-Flag表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染的HUVEC的 Westem印跡分析。使用抗FLAG抗體分析了全細(xì)胞提取物。(B)對siDSCRl 轉(zhuǎn)染的HUVEC分析內(nèi)源DSCR1水平，通過使用多克隆抗血清檢測人DSCR1。 (C)來自NFAT熒光素酶報(bào)道構(gòu)建物和靶向DSCR1、 NFATcl或?qū)φ盏膕iRNA 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染并IO/PMA (6小時(shí))或VEGF ( D; 12小時(shí))分別刺激后的HUVEC
的細(xì)胞提取物中NFAT活性的熒光素酶報(bào)道基因測定法。所示數(shù)據(jù)來自代表 性的一式三份進(jìn)行的總共3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。誤差條=SD。 *P<.01, **P<.001， 使用方差分析(ANOVA),通過比較si對照(siControl)和siDSCRl組進(jìn)行分析。
圖7。內(nèi)源DSCR1的敲低誘導(dǎo)活化的內(nèi)皮細(xì)胞上炎癥標(biāo)志物的表達(dá)。(A) 用編碼GFP和siDSCRl 、 siNFATcl或si對照(siControl)siRNA的表達(dá)載體瞬時(shí) 共轉(zhuǎn)染的HIJVEC的FACS分析。對細(xì)胞分析PMA/IO刺激或?qū)φ仗幚?NA)后4 小時(shí)GFP+纟田月包上TF、 VCAM-l和E-選擇蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)。(B)用VEGF 刺激的HUVEC的FACS分析,分析了TF (4小時(shí))、VCAM-1 (20小時(shí))和E-選擇蛋白(20小時(shí))的表達(dá)。所示數(shù)據(jù)對應(yīng)于一組代表性的3次獨(dú)立,實(shí)驗(yàn)。
圖8。 DSCR1的調(diào)控影響內(nèi)皮細(xì)胞的存活。暴露于應(yīng)激條件，包括血清 饑餓、H202暴露和PMA/IO處理的內(nèi)皮細(xì)胞中Ad-DSCR1引起的DSCR1過表 達(dá)謗導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞死亡，正如DSCR1反義構(gòu)建物的表達(dá)P條低內(nèi)源DSCR1所為。 (A)包括編碼有義或反義DSCR1的腺病毒構(gòu)建物的DSCR1調(diào)控在血清饑餓 后24小時(shí)降低原代人內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的存活。(B)包括編碼有義或反義 DSCR1的腺病毒構(gòu)建物的DSCR1調(diào)控在存在胱天蛋白酶抑制劑ZVAD時(shí)在 血清饑餓后24小時(shí)降低原代人內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的存活。
圖9。人DSCRl氨基酸序列的一個(gè)例示性實(shí)施方案(SEQIDNO:l)。
實(shí)施本發(fā)明的方式
種病癥的方法、組
合物、試劑盒和制品。本文提供了這些方法、組合物、試劑盒和制品的詳情。
通用技術(shù)
除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微 生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些都在本領(lǐng)域的技 術(shù)范圍內(nèi)。文獻(xiàn)中充分闡述了這些技術(shù)，諸如"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis", (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture", (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology", (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology", (R M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al.， ed., 1994); "A Practica!
Guide to Molecular Cloning", (Perbal Bernard V" 1988)。 定義
在用于本文時(shí)，術(shù)語"脈管/血管"或"脈管/血管系統(tǒng)，，及其變化指遍 及哺乳動(dòng)物肉體運(yùn)輸血液(包括淋巴液)的脈管/血管系統(tǒng)。
"血管"指哺乳動(dòng)物脈管系統(tǒng)的任何脈管，包括動(dòng)脈、微動(dòng)脈(arteriole)、 毛細(xì)管、微靜脈(venule)、靜脈、竇和血管滋養(yǎng)管。在本發(fā)明的一個(gè)方面， 將DSCR1調(diào)控物直接導(dǎo)入為心肌供應(yīng)血液的脈管管道。此類脈管管道包括冠 狀動(dòng)脈以及諸如隱靜脈或乳內(nèi)動(dòng)脈移植物等脈管。在一個(gè)實(shí)施方案中，血管 包括活化的內(nèi)皮細(xì)胞。
"動(dòng)脈"指來自心臟的血液流過其中的血管。冠狀動(dòng)力永供應(yīng)心臟自身的 組織(特別是心肌)，而其它動(dòng)脈供應(yīng)身體剩余器官。動(dòng)脈的一般結(jié)構(gòu)由多 層動(dòng)脈壁圍繞內(nèi)腔組成。
術(shù)語"血管發(fā)生，，在用于本文時(shí)指導(dǎo)致新血管形成的細(xì)胞事件，其中血 管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、修剪(pmne)和重新組織(reorganize), 乂人而自先前存在的血 管網(wǎng)絡(luò)形成新的血管。血管發(fā)生是包括以下各項(xiàng)的連續(xù)過程(l)局部事發(fā)地 的胞外基質(zhì)在蛋白酶釋放后降解；(2)毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞增殖；及(3)毛細(xì)管向 血管發(fā)生性刺激遷移。參見例如Ferraraetal., Endocrine Rev. (1992), 13:18-32; Ferrara, Nature Reviews p002), 2:795-803。
在用于本文時(shí)，短語"血管完整性，，及其變化指血管系統(tǒng)未受損傷的狀 態(tài)，其中未受損傷的狀態(tài)包括血管系統(tǒng)中充當(dāng)分子在兩個(gè)隔室/兩側(cè)間自由運(yùn) 動(dòng)的屏障的正常生理學(xué)能力。更具體的說，所述兩個(gè)隔室/兩側(cè)一般涉及血管 系統(tǒng)的內(nèi)腔和腔外空間( 一般包括血管系統(tǒng)附近的組織和/或細(xì)胞)。
在用于本文時(shí)，短語"血管完整性侵?jǐn)_"及其變化指異常和/或不希望的 血管完整性變化，其導(dǎo)致血管系統(tǒng)不能充當(dāng)兩個(gè)隔室間運(yùn)動(dòng)的屏障。例如， 血管系統(tǒng)的炎癥是與血管完整性侵?jǐn)_有關(guān)的常見起因。血管完整性侵?jǐn)_可表 現(xiàn)為一種或多種組織和細(xì)胞狀況的形式，包括但不限于與內(nèi)皮細(xì)胞壞死、內(nèi) 皮細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮創(chuàng)傷、損傷、血管滲漏、高血壓和血管損傷有關(guān)的狀況。 進(jìn)一步的例子包括影響血管內(nèi)皮的創(chuàng)傷，例如對遭受創(chuàng)傷的動(dòng)物(一般是哺 乳動(dòng)物)或人的血管包括器官的血管網(wǎng)絡(luò)的創(chuàng)傷(諸如損傷)；此類創(chuàng)傷將 包括傷口 、切口 、和潰瘍(例如糖尿病性潰瘍)和血管/內(nèi)皮細(xì)胞的傷口或撕
裂。創(chuàng)傷包括由內(nèi)部事件引起的狀況以及由外部因子諸如病原體造成的狀況。
在用于本文時(shí)，"與血管完整性侵?jǐn)_有關(guān)的病癥"、"與異常血管炎癥有 關(guān)的病癥"及其變化一般指認(rèn)為或已知與血管完整性侵?jǐn)_和/或異常血管炎癥 有關(guān)的病理學(xué)疾患。這些病癥包括但不限于血管(諸如心血管)病癥、內(nèi)皮 細(xì)胞病癥、血管發(fā)生性病癥(例如癌癥)和免疫學(xué)病癥(例如炎性病癥，包 括自身免疫病)。例如，這些病癥包括與血管發(fā)生失調(diào)有關(guān)的病理學(xué)疾患。 可通過本發(fā)明的調(diào)控物分子和方法治療的病癥包括但不限于不希望的或異
常的肥大、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病、銀屑病斑塊、結(jié)節(jié)病、 動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、源自心"幾梗死的水腫、糖尿病性和其它 增殖性視網(wǎng)膜病包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織增生、新生血管性 青光眼、年齡相關(guān)黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管形成、角膜移 植片新血管形成、角膜移植片排斥、視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管形成、眼角的新血 管形成(發(fā)紅(rubeosis))、眼新血管疾病、血管再狹窄、動(dòng)靜脈畸形(AVM)、 腦脊膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、曱狀腺增生(包括格雷夫斯氏(Graves)病)、 角膜和其它組織移植、慢性炎癥、肺炎、急性肺損傷/ARDS、敗血癥(膿毒癥)、 高血壓(例如原發(fā)性月申動(dòng)脈高壓)、惡性肺積液(malignant pulmonary effUsion)、 腦水胂(例如與急性中風(fēng)(stroke)/閉合性頭部外傷/創(chuàng)傷有關(guān)的)、滑膜炎癥、 RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨關(guān)節(jié)炎(OA)、頑固性 腹水、多囊卵巢病、子宮內(nèi)膜異位癥、第三空間流體病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎、間隔綜合征、燒傷、腸病)、子宮纖維瘤(uterine fibroids)、 早產(chǎn)、慢性炎癥諸如IBD (克羅恩氏(Crohn)病和潰瘍性結(jié)腸炎)、腎同種異 體移植物排斥、炎性腸病、腎病綜合征、不希望的或異常的組織塊生長(非 癌性的)、肥胖癥、脂肪組織塊生長、血友病性關(guān)節(jié)、肥厚性瘢痕、毛發(fā)生 長的抑制、奧-韋二氏(Osler-Weber)綜合征、膿性肉芽腫晶狀體后纖維組織增 生、硬皮病、沙眼、血管粘連、滑膜炎、皮炎、先兆子癇、腹水、心包積液 (諸如與心包炎有關(guān)的)、胸腔積液、胃腸潰瘍、慢性氣道炎癥和血管炎。
血管發(fā)生失調(diào)可導(dǎo)致可通過本發(fā)明的組合物和方法來治療的許多病癥。 這些病癥包括非腫瘤性的和腫瘤性的疾患。腫瘤性病癥包括但不限于上文所 描述的那些。非腫瘤性病癥包括但不限于不希望的或異常的肥大、關(guān)節(jié)炎、 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病、銀屑病斑塊、結(jié)節(jié)病、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈
粥樣硬化斑塊、糖尿病性和其它增殖性視網(wǎng)膜病包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、晶狀
體后纖維組織增生、新血管性青光眼(neovascularglaucoma)(年齡相關(guān)黃斑變 性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移 植片排斥、視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管形成、眼角的新血管形成(發(fā)紅)、眼新血 管疾病、血管再狹窄、動(dòng)靜脈畸形(AVM)、腦脊膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、 曱狀腺增生(包括格雷夫斯氏(Graves)病)、角膜和其它組織移植、慢性炎癥、 肺炎、急性肺損傷/ARDS、敗血癥、原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、惡性肺積液(malignant pulmonary effusion)、腦水腫(例如與急性中風(fēng)/閉合性頭部外傷Z創(chuàng)傷有關(guān)的)、 滑液炎癥、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨關(guān)節(jié)炎(OA)、 頑固性腹水、多嚢卵巢病、子宮內(nèi)膜異位癥、第三空間流體病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎、間隔綜合征、燒傷、腸病)、子宮纖維瘤(uterine fibroids)、早產(chǎn)、慢性炎癥諸如IBD (克羅恩氏(Crohn)病和潰瘍性結(jié)腸炎)、 腎同種異體移植物排斥、炎性腸病、腎病綜合征、不希望的或異常的組織塊
生長(非癌性的)、血友病性關(guān)節(jié)、肥厚性瘢痕、毛發(fā)生長的抑制、奧-韋二 氏(Osler-Weber)綜合征、膿性肉芽肺晶狀體后纖維組織增生、硬皮病、沙眼、 血管粘連、滑膜炎、皮炎、先兆子癇、腹水、心包積液(諸如與心包炎有關(guān) 的)和胸腔積液
"病癥"指將受益于本發(fā)明DSCR1調(diào)控物和/或方法的治療的任何狀況。 這包括慢性和急性病癥或疾病，包括使哺乳動(dòng)物易患所討論病癥的病理狀 況。本文中待治療的病癥的非限制性例子包括惡性和良性腫瘤；非白血病和 淋巴惡性腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、星形膠質(zhì)細(xì)胞、下丘腦和其它腺體、巨 噬細(xì)胞、上皮、基質(zhì)和嚢胚腔的病癥；及炎性(例如自身免疫性炎癥)、血 管發(fā)生性和免疫學(xué)病癥。
"自身免疫病"在本文中指源于且針對個(gè)體自身組織的非惡性疾病或病 癥。自身免疫病在本文中明確排除惡性或癌性疾病或疾患，尤其排除B細(xì)胞 淋巴瘤、急性成淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、毛細(xì)胞 白血病和慢性成髓細(xì)胞白血病。自身免疫性疾病或病癥的例子包括但不限于 炎性應(yīng)答，諸如炎性皮膚病，包括銀屑病和皮炎(例如特應(yīng)性皮炎)；系統(tǒng) 性硬皮病和硬化；與炎性腸病有關(guān)的應(yīng)答(諸如克羅恩氏(Crohn)病和潰瘍性 結(jié)腸炎)；呼吸窘迫綜合征(包括成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS));皮炎；腦 膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結(jié)腸炎；腎小球腎炎；過敏狀況，諸如濕疹和哮喘
及涉及T細(xì)胞浸潤和慢性炎性應(yīng)答的其它狀況；動(dòng)脈粥樣硬化；白細(xì)胞粘著 缺陷；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；系統(tǒng)性紅斑狼齊(SLE);糖尿病(例如I型糖尿病或 胰島素依賴性糖尿病)；多發(fā)性硬化；雷諾氏(Reynaud)綜合征；自身免疫性 曱狀腺炎；變應(yīng)性腦脊髓炎；斯耶格倫氏(Sjogren)綜合征；幼發(fā)型糖尿?。?通常在結(jié)核病、結(jié)節(jié)病、多肌炎、肉芽腫病和血管炎中發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞因子和 T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏感性有關(guān)的免疫應(yīng)答；惡性貧血(阿狄 森氏(Addison)病)；涉及白細(xì)胞滲出的疾??；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性病癥； 多器官損傷綜合征；溶血性貧血(包括但不限于冷球蛋白血癥或庫姆斯氏 (Coombs)陽性貧血)；重癥肌無力；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病；抗腎小球 基膜??；抗磷脂綜合癥；過敏性神經(jīng)炎；格雷夫斯氏(Graves)??；朗-伊二氏 (Lambert-Eaton)肌無力綜合癥；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多種 內(nèi)分泌腺病；萊特氏(Rdter)病；僵人綜合癥(stiff-man syndrome);貝切特氏 (Behcet)??；巨細(xì)胞動(dòng)脈炎；免疫復(fù)合物腎炎；IgA腎病;IgM多神經(jīng)病;免 疫性血小板減少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板減少癥等。
"血管發(fā)生因子，，或"血管發(fā)生劑"在用于本文時(shí)指刺激血管發(fā)育，例 如促進(jìn)血管發(fā)生(angiogenesis)、內(nèi)皮細(xì)胞生長、血管穩(wěn)定性和/或血管生成 (vasculogenesis)等的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，血管發(fā)生因子在所要求的發(fā) 明中指VEGF和VEGF家族的成員(A、 B、 C、 D和E )。在一個(gè)實(shí)施方案中， 血管發(fā)生因子在所要求的發(fā)明中指P1GF和/或PDGF家族的成員。在一個(gè)實(shí)施 方案中，血管發(fā)生因子在所要求的發(fā)明中指TIE配體(血管生成素)。在一個(gè) 實(shí)施方案中，血管發(fā)生因子在所要求的發(fā)明中指肝配蛋白(ephrin)。在一個(gè) 實(shí)施方案中，血管發(fā)生因子在所要求的發(fā)明中指加速傷口愈合的因子，包括 但不限于一種或多種生長激素、胰島素樣生長因子-I(IGF-I)、 VIGF、表皮生 長因子(EGF)、 CTGF及其家族的成員、及TGF-a和TGF-(3。參見例如Kkgsbmn and D，Amore, Annu. Rev. Physiol" 53:217-39 (1"1); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999); Tonini et al.， Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(例如列 舉已知血管發(fā)生因子的表l); Sato Int. J. Clin, Oncol.， 8:200-206 (2003)。
短語"副作用，'或其變化在用于本文時(shí)指在接受病癥治療的受試者中可 測量的和/或可觀察的臨床的、醫(yī)學(xué)的、生理的、生理學(xué)的和/或生物化學(xué)的 作用，其中所述作用不是預(yù)定治療結(jié)果的一部分。一^&而言，所述作用在所
治療受試者的健康和/或舒適狀態(tài)、所治療受試者的健康風(fēng)險(xiǎn)、和/或所治療 受試者對治療的耐受性方面是不希望的。
如上所述，在治療本文所述炎性疾病(例如自身免疫病或自身免疫相關(guān)
疾患)時(shí)，受試者可用本發(fā)明的DSCR1調(diào)控物連同第二治療劑諸如免疫抑制 劑(即抗炎劑)諸如多種藥物方案來治療。DSCR1調(diào)控物可以與免疫抑制劑 同時(shí)、序貫或交替施用。免疫抑制劑可以以本領(lǐng)域所列相同或更低的劑量施 用。優(yōu)選的輔助性免疫抑制劑將取決于許多因素，包括所治療病癥的類型以 及患者的病史。
"免疫抑制劑"在用于本文時(shí)指作用于抑制或掩蓋患者的免疫系統(tǒng)和/ 或炎性應(yīng)答的物質(zhì)。此類藥劑將包括抑制細(xì)胞因子生成、下調(diào)或押制自身抗 原表達(dá)、或掩蓋MHC抗原的物質(zhì)。此類藥劑的例子包括類固醇，諸如糖皮質(zhì) 類固醇，例如潑尼+〉(prednisone)、 曱潑尼龍(methylprednisolone)和地塞米+^ (dexamethasone); 2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(參見美國專利第4,665,077號)； 硫唑。票呤(azathioprine)(或環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide),如果對硫唑。票呤有 不良反應(yīng)的話)；溴隱亭(bromocryptine);戊二醛(它掩蓋MHC抗原，如美 國專利第4,120,649號中所記載的)；針對MHC抗原和MHC片段的抗獨(dú)特型抗 體；環(huán)孢菌素A;細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑，包括抗干擾素-Y、 -P或-a 抗體；抗腫瘤壞死因子-a抗體；抗腫瘤壞死因子-p受體；抗白介素-2抗體和 抗IL-2受體抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細(xì)胞5求蛋白；泛(pan)T抗體，優(yōu) 選抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結(jié)合域的可溶性肽(WO 90/08187, 公布于90年7月26日)；鏈激酶；TGF-(3;鏈道酶；來自宿主的RNA或DNA; FK506; RS-61443;脫氧精胍菌素(deoxyspergualin);雷帕霉素(rapamycin); 丁細(xì)胞受體(美國專利第5,114，721號)；T細(xì)胞受體片段(Offner et al" Science 251:430-432 (1991); WO 90/11294; WO 91/01133);及T細(xì)胞受體抗體(EP 340,109),諸如T10B9。
術(shù)語"DSCR1"在用于本文時(shí)涵蓋能夠以與野生型DSCR1相似的方式調(diào) 控4丐依賴磷酸酶(及例如炎性標(biāo)志基因諸如組織因子、E-選擇蛋白和Cox-2 的表達(dá))的天然序列多肽、多肽變體、及天然序列多肽和多肽變體的片段(本 文中有進(jìn)一步定義)。本文中所描述的DSCR1多肽可以從多種來源分離，諸 如人組織類型或其它來源，或者通過重組或合成方法制備。術(shù)語"DSCR1"、 "DSCR1多肽"、"DSCR1蛋白質(zhì)"和"DSCR1分子"還包括本文中所公開
的DSCR1多肽的變體。本發(fā)明的"DSCR1調(diào)控物"指調(diào)控"DSCR1多肽，， 或"DSCR1蛋白質(zhì)"的正常生物學(xué)功能/活性的分子。 .
"天然序列DSCR1多肽"包括與衍生自自然界的相應(yīng)DSCR1多肽具有相 同氨基酸序列的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，天然序列DSCR1多肽包含SEQID NO:l (見圖9)的蛋白質(zhì)編碼氨基i^f列，其中第一個(gè)曱硫氨酸是第l位氨基 酸。此類天然序列DSCR1多肽可以從自然界分離，或者可通過重組或合成手 段生成。術(shù)語"DSCR1多肽"和"DSCR1蛋白質(zhì)"在用于本文時(shí)明確涵蓋天 然存在的截短或其它翻譯后修飾形式的特定DSCR1多肽、該多肽的天然存在 變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在等位變體。
"DSCR1多肽變體"或其變化意指與本文中所公開的天然序列DSCR1 多肽序列具有至少約80%氨基酸序列同 一性的DSCR1多肽， 一般是本文中所 定義的活性DSCR1多肽。此類DSCR1多肽變體包括例如在天然氨基酸序列的 N-或C-末端添加或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的DSCR1多肽。通常，DSCR1 多肽變體與本文中所公開的天然序列DSCR1多肽序列將具有至少約80%的 氨基酸序列同一性，或者至少約81%、 82。/。、 83%、 84%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97。/。、 98%或99% 的氨基酸序列同一性。通常，DSCR1變體多肽的長度為至少約10個(gè)氨基酸， 或者長度為至少約20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、
140、150、160、170、180、190、200、210、 220、 230、 240、250、 260、
270、280、290、300、310、320、330、340、 350、 360、 370、380、 390、
400、410、420、430、440、450、460、470、 480、 490、 500、510、 520、
530、540、550、560、570、580、590、600個(gè)氨基酸，或更多。任選的是.
DSCR1變體多肽與天然DSCR1多肽序列相比將具有不超過一處保守氨基酸 替代，或者與天然DSCR1多肽序列相比具有不超過2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或10處保守氨基酸替代。
關(guān)于肽或多肽序列的"百分比(。/。)氨基酸序列同一性"定義為對比序列 并在必要時(shí)引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代 視為序列同一性的一部分時(shí)，候選序列中與特定肽或多肽序列中的氨基酸殘 基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比 可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進(jìn)行，例如使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟 件，諸如BLAST、 BLAST-2、 ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域
技術(shù)人員可決定用于測量對比的適宜參數(shù)，包括對所比較序列全長獲得最大 對比所需的任何算法。然而，為了本發(fā)明的目的，。/。氨基酸序列同一性值是
使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2獲得的，如美國專利第6，828,146號中所記載的。
在用于本文時(shí)，術(shù)語"肽"和"多肽"可互換使用，只是術(shù)語"肽"一 般指包含少于200個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽。
術(shù)語"載體"在用于本文時(shí)意指能夠運(yùn)輸與其連接的其它核酸的核酸分 子。 一類載體是"質(zhì)粒"，指其中可連接另外的DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。 另一類載體是噬菌體載體。另一類載體是病毒載體，其中可將另外的DNA 區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在其所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制 (例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例 如非附加型哺乳動(dòng)物載體)可在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合到宿主細(xì)胞的基因組 中，由此隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作連 接的基因表達(dá)。此類載體在本文中稱為"重組表達(dá)載體"(或簡稱為"重組 載體")。通常，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體常常是質(zhì)粒形式。在本說 明書中，"質(zhì)粒"和"載體"可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的最常用形式。
"多核苷酸，，或"核酸"在本文中可互換使用，指任何長度的核苷酸聚 合物，包括DNA和RNA。核苦酸可以是脫氧核糖核苦酸、核糖核苷酸、經(jīng)過 修飾的核普酸或堿基、和/或其類似物，或者是可通過DNA或RNA聚合酶或 者通過合成反應(yīng)摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含經(jīng)過修飾的核苷 酸，諸如曱基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以 在裝配聚合物之前或之后進(jìn)行。核苷酸序列可以由非核苷酸組分中斷。多核 苷酸可以在合成后進(jìn)一步修飾，諸如通過與標(biāo)記物偶聯(lián)。其它類型的修飾包 括例如"帽"，將一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸用類似物替代，核苷酸間修 飾諸如例如具有不帶電荷連接(例如膦酸曱酯、磷酸三酯、磷酰胺酯 (phosphoamidate)、氨基曱酸酯等)和具有帶電荷連接(例如硫代磷酸酯、二 硫代磷酸酯等)的修飾，含有懸垂模塊(pendant moiety),諸如例如蛋白質(zhì)(例 如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等)的修飾、具有嵌入劑(例 如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、 氧化性金屬等)的修飾、含有烷化劑的修飾、具有經(jīng)修飾連接(例如a端基 異構(gòu)核酸(anomeric nucleic acid)等)的修飾、以及未修飾形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖類中的任何羥基可以用例如膦酸(phosphonate)基團(tuán)、磷 酸(phosphate)基團(tuán)替換，用標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，或活化以制備與另外的核苷 酸的另外的連接，或者可偶聯(lián)至固相或半固相支持物。5'和3'末端OH可磷酸 化或者用胺或1 -20個(gè)碳原子的有機(jī)加帽基團(tuán)模塊取代。其它羥基也可衍生成 標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)。多核苷酸還可含有本領(lǐng)域普遍知道的核糖或脫氧核糖糖類的 類似物形式，包括例如2'-氧-甲基、2'-氧-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮-核糖，碳 環(huán)糖類似物，ot-端基異構(gòu)糖，差向異構(gòu)糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡 喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，無環(huán)類似物及脫堿基核苷類似物諸如甲基核糖 核苷?？捎脗溥x連接基團(tuán)替換一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯連接。這些備選連接基團(tuán) 包括但不限于如下實(shí)施方案，其中磷酸酯用P(O)S ("硫代酸酯"(thioate))、 P(S)S ( "二硫代酸酯"(dithioate) )、 (0)NR2 ("酰胺酯"(amidate))、 P(O)R、 P(O)OR'、 CO或CH2 ("曱縮醛"(formacetal))替代，其中R或R'各自獨(dú)立為H 或者取代或未取代的烷基(l-20個(gè)C)，任選含有醚(-O-)連接、芳基、烯基、 環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相 同的。上述描述適用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
"寡核苷酸"在用于本文時(shí)通常指短多核苷酸，通常是單鏈，通常是合 成的，長度通常但不是必需小于約200個(gè)核苷酸。術(shù)語"寡核苷酸"和"多 核苷酸"并不互相排斥。上文關(guān)于多核苷酸的描述同樣且完全適用于寡核苷 酸。
術(shù)語"宿主細(xì)胞"(或"重組宿主細(xì)胞")在用于本文時(shí)意圖指通過導(dǎo)入 外源多核苦酸諸如重組質(zhì)?；蜉d體，遺傳上已經(jīng)改變或者能夠在遺傳上泉變 的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，此類術(shù)語意圖不僅指特定的受試細(xì)胞，還指此類細(xì)胞的 后代。因?yàn)樵诤蟠锌赡苡捎谕蛔兓颦h(huán)境影響而存在某些改變，所以此類后 代可能事實(shí)上與親本細(xì)胞不同，但是在用于本文時(shí)仍然包括在術(shù)語"宿主細(xì) 胞"的范圍內(nèi)。
"抗體"(Ab)和"免疫球蛋白"(Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。雖 然抗體展現(xiàn)出對特定抗原的結(jié)合特異性，但是免疫球蛋白包括抗體及通常缺 乏抗原特異性的其它抗體樣分子二者。后一類多肽例如由淋巴系統(tǒng)以低水平 生成而由骨髓瘤以升高的水平生成。
術(shù)語"抗體，，和"免疫球蛋白"以最廣義互換使用，包括單克隆抗體(例 如全長或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、單價(jià)、多價(jià)抗體、多特異性抗體
(例如雙特異性抗體，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性)，而且還可以包 括某些抗體片段(如本文中更為詳細(xì)描述的)?？贵w可以是嵌合的、人的、 人源化的和/或親和力成熟的。
"抗體片段"只包含完整抗體的一部分，其中所述部分優(yōu)選保留該部分 存在于完整抗體中時(shí)通常與之有關(guān)的至少一項(xiàng)、優(yōu)選大多數(shù)或所有功能。在 一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，如此保留結(jié)合抗
原的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段，例如包含F(xiàn)c區(qū)的抗體片段，保 留通常與Fc區(qū)存在于完整抗體中時(shí)通常與之有關(guān)的至少一項(xiàng)生物學(xué)功能，諸 如FcRn結(jié)合、抗體半衰期調(diào)控、ADCC功能和補(bǔ)體結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中， 抗體片段是體內(nèi)半衰期與完整抗體基本上相似的單價(jià)抗體。例如，此類抗體 片段可包含一個(gè)抗原結(jié)合臂且其與能夠賦予該片段以體內(nèi)穩(wěn)定性的Fc序列 相連。
抗體的"可變區(qū)"或"可變域"指抗體重鏈或輕鏈的氨基末端結(jié)構(gòu)域。 這些結(jié)構(gòu)域通常是抗體的最易變部分且包含抗原結(jié)合位點(diǎn)。
術(shù)語"高變區(qū)"、"HVR"或"HV"在用于本文時(shí)指抗體可變域中序列 上高度可變和/或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個(gè)高變區(qū) 三個(gè)在VH中(m、 H2、 H3)，三個(gè)在VL中(Ll、 L2、 L3 )。本文中使用且 涵蓋許多高變區(qū)的敘述。Kabat互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)是以序列變異性為基礎(chǔ)的， 而且是最常用的(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。 Chothia改為指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia and Lesk, J. MoL Biol. 196: 901-917 (1987))。 AbM高變區(qū)代表Kabat CDR和Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷， 而且得到Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件的使用。"接觸"高變區(qū)是以 對可獲得的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析為基礎(chǔ)的。下文記錄了這些高變區(qū)中每一 個(gè)的殘基。
環(huán)KabatAbMChothia接觸
L24-L34L24-L34L26-L32L30-L36
L50-L56L50-L56L50-L52L46-L55
L89-L97L89-L97L91-L96L89-L96
mH31-H35BH26-H35BH26-H32H30-H35B
(Kabat編號)
HI H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Chothia編號)
H2H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
"框架"或"FR"殘基指可變區(qū)中除本文中所定義的高變區(qū)殘基外的那 些可變域殘基。
術(shù)語"單克隆抗體"在用于本文時(shí)指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗 體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在 突變外。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原。此外，與典型的包含 針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，每種單克隆 抗體針對抗原上的單 一 決定簇。
單克隆抗體在本文中明確包括"嵌合"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部 分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同 或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗 體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望生 物學(xué)活性(美國專利第4,816,567號；Morrison " 。/.,胸/. ^cad 園 81: 6851-6855 (1984》。
非人(例如鼠)抗體的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫 球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受 體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供 體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。 在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。 此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基。進(jìn)行這 些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。 一般而言，人源化抗體將包含至少一 個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下可變區(qū)，其中整個(gè)或基本上整個(gè)高變環(huán)對應(yīng)于 非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且整個(gè)或基本上整個(gè)FR是人免疫球蛋白序列的 FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc),通常是人免 疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見Jones " a/.， A^wre 321: 522-525 (1986); Riechmann " a/., 7Va/^re 332: 323-329 (1988); Presta, Cwrr Op. Sfrwd. S/o/. 2: 593-596 (1992)。還可參見以下綜述及其引用的參考文獻(xiàn)Vaswani and
Hamilton, y4〃erg^ JwAwa & 7www"o/. 1:105-115 (1998); Harris, Bz'oc^e7 i. S"oc. Jharaacf/om1 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, CwrK Qp. 5/otec/ . 5:428-433 (1994)。
"人抗體"指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應(yīng)的氨基酸序列和
定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。
"親和力成熟的"抗體指在其一個(gè)或多個(gè)CDR/HVR中具有導(dǎo)致抗體對 抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進(jìn)的一處或多處改變 的抗體。優(yōu)選的親和力成熟的抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾水平的對靶抗 原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領(lǐng)域已知流程生成。Marks " a/., S/o/rec/mo/ogy 10: 779-783 (1992)記載了通過VH和VL結(jié)構(gòu)域改組的親和力 成熟。下列文獻(xiàn)記載了CDR/HVR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變Barbas ef a/., Prac. Ato. ^cac/. 91: 3809-3813 (1994); Schier ef a/., 169:
147-155 (1995); Yelton e"/.， J /wm冊o/. 155: 1994-2004 (1995); Jackson "a/., J /薩畫/. 154(7): 3310-9 (1995); Hawkins ef a/., / Mo/.腸/. 226: 889-896 (1992)。
術(shù)語"Fc區(qū)"用于定義免疫球蛋白重鏈的C-末端區(qū)，它可以通過用木瓜 蛋白酶消化完整抗體來產(chǎn)生。Fc區(qū)可以是天然序列Fc區(qū)或變異Fc區(qū)。盡管免 疫球蛋白重鏈Fc區(qū)的邊界可有所變化，然而人IgG重鏈Fc區(qū)通常定義為從 Cys226位置附近或Pro230位置附近的氨基酸殘基至Fc區(qū)的羧基末端的區(qū)段。 免疫球蛋白的Fc區(qū)通常包含兩個(gè)恒定域，CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，任選包 含CH4結(jié)構(gòu)域。"Fc區(qū)鏈"在本文中指Fc區(qū)的兩條多肽鏈之一。
短語"基本上相似"或"基本上相當(dāng)"在用于本文時(shí)表示兩個(gè)數(shù)值之間 足夠高的相似程度，以致本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為在用所述數(shù)值所測量的生物 學(xué)特性背景內(nèi)兩個(gè)數(shù)值之間的差異具有很小的或沒有生物學(xué)顯著性。所述兩 個(gè)數(shù)值之間的差異優(yōu)選小于約50。/。，優(yōu)選小于約40%,優(yōu)選小于約30%，優(yōu) 選小于約20%，優(yōu)選小于約10%。
術(shù)語"細(xì)胞毒劑"在用于本文時(shí)指抑制或阻止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞 破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素(例如At211、 I131、 I125、 Y90、 Re186、 Re)88、 Sm153、 Bi"2、 P"和Lu的放射性同位素)、化療劑、和毒素諸如小分子 毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體。
"化療劑"指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎?br> 類(alkylating agents)， 諸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN 環(huán)磷酰胺 (cyclophosphamide); ^黃酸烷基西旨類(alkyl sulfonates)， "i者如白消安(busulfan)、 英丙舒凡(improsulfan)禾口口底泊舒凡(piposulfan); 氮丙口定類(aziridines),諸i口苯 4左替》泉(benzodepa)、 卡;皮S昆(carboquone)、 美妥替;瓜(meturedepa)牙口烏5島替;泉 (uredepa); 乙撐亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamines), 包 括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐石舞酰胺 (triethylenephosphoramide)、 三乙撐石克代碌酰胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羥曱蜜胺(trimethylolomelamine);番篇枝內(nèi)酯類(acetogenins)(尤其是布 拉他辛(bullatacin)和布拉他辛S同(bullatacinone) ) ; 5-9-四氫大麻酚 (tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol) , MARINOL ); (3-拉帕醌 (lapachone);拉帕醇(lapachol);詳大水仙素類(colchicines); 白樺月旨酸(betulinic acid); 喜才對石威(camptothecin)(包4奮合成類似物4乇泊一#康(topotecan) (HYCAMTTN )、 CPT-11 (伊立替康(irinotecan), CAMPTOSAR )、乙酰喜 樹堿、東菱菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹堿)；苔蘚抑素(bryostatin); callystatin; CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和 比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin); 鬼臼酸 (podophyllinic add);護(hù)奪尼泊芬(teniposide); 隱藻素類(cryptophycins)(斗+另ll是 隱藻素1和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin); duocarmycin(包括合成類似物， KW-2189和CB1-TM1 );艾榴塞洛素(eleutherobin); pancratistatin; sarcodictyin; 〉每纟帛氺卩素(spongistatin); 氮芥類(nitrogen mustards) ， "i者濁口苯丁酉吏氮芥 (chlorambucil)、茶氮界(chlornaphazine)、月旦石粦醜胺(cholophosphamide)、肚,莫 司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、 鹽酸氧氮齊(mechlorethamine oxide hydrochloride)、 美法侖(melphalan)、新氮 芥(novembichin)、苯芥月旦甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、 曲 磷胺(加fosfamide)、尿嘧口定氮芥(uracil mustard); 亞硝脲類(nitrosoureas), 諸 i口卡莫司汀(carmustine)、 氯脲菌素(chlorozotocin)、 一畐莫司汀(fotemustine)、 洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素 類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(例如加利車霉素(calicheamicin)，尤其 是加利車霉素yll和加利車霉素coll (參見例如Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994));蒽環(huán)類抗生素(dynemidn)，包括dynemicinA;埃斯波霉
素(esperamicin); 以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔 類抗生素發(fā)色團(tuán))、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨 茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌 素C (cactinomycin) 、 carabicin 、 洋紅霉素(carminomycin)、 嗜癌霉素 (carzinophilin)、 色霉素(chromomycin)、放線菌素D (dactinomycin)、柔紅霉素 (daunombicin)、地托比星(detorubicin)、 6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星 (doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN⑧、嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比 星、2-吡咯代多柔比星、鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射劑(DOXIL⑧)和脫氧多柔 比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、 麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚 酸(mycophenolic acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、揪棍霉素(olivomycin)、培洛 霉素(peplomycin) 、 potfiromycin 、 嘌吟霉素(puromycin)、 三鐵阿霉素 (quelamycin)、 羅多比星(rodombicin)、 鏈黑菌素(streptonigrin)、 鏈佐星 (streptozocin)、 殺纟吉沖亥菌素(tubercidin)、 烏苯美司(ubenimex)、 凈司 <也丁 (zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代i射物類，；者如曱氨p巣呤(methotrexate)、 吉西他濱(gemcitabine) (GEMZAR )、替加氟(tegafiir) (UFTORAL )、卡培 他濱(capecitabine)(XELODA⑧)、埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧。定(5-FU); 葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、曱氨喋呤(methotrexate)、蝶酰三谷 氨酸(pteropterin)、三曱曲沙(trimetrexate); 噤呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱 (fludarabine)、 6-巰基。票呤(mercaptopurine)、硫咪。票呤(thiamiprine)、硫鳥噤呤 (thioguanine);嘧咬類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿4U包苦(azacitidine)、 6-氮尿芬(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、 阿4唐月包苦(cytarabine)、雙脫氧尿苦 (dideoxyuridine)、 去氧氟尿苦(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、 氟尿芬 (floxuridine);雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮 (dromostanolone propionate)、 表石克名食醇(epitiostano1)、 美方,》克(mepitiostane)、 睪內(nèi)西旨(testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托 坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補(bǔ)充劑，T者如亞葉酸(folinic acid); 醋葡醛內(nèi)酉旨(aceglatone); 醛石粦酰胺4唐香(aldophosphamide glycoside); 氨基乙 酰丙酸(aminolevulinic acid); 恩尿嘧咬(eniluracil); 安吖咬(amsacrine); bestrabucil;比生群(bisantrene);依達(dá)曲沙(edatraxate);地石舞酰胺(defosfamide); i4美可辛(demecolcine); i也p丫酉昆(diaziquone); elfornithine;依矛j醋4妄(elliptinium
acetate);依托才各魯(etoglucid);硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea);香菇多糖(lent'inan); 氯尼達(dá)明(lonidamine); 美登木素生物堿類(maytansinoids)，諸如美登素 (maytansine)和安絲菌素(ansamitocin); 米胍月宗(mitoguazone); 米46蒽酉昆 (mitoxantrone); 莫。泉達(dá)醇(mopidamol); 二胺硝'吖。定(nitracrine); 噴司4也丁 (pentostatin); 蛋氨氮芥(phenamet); p比柔比星(pirarubicin); 洛索蒽酷 (losoxantrone); 2-乙基酰肼(ethylhydrazide); 丙卡巴肼(procarbazine); PSK 多糖復(fù)合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane);根霉素 (rhizoxin); 西佐喊(sizofir'an); 螺S走4者(spirogermanium); 纟田交4連孑包菌酉同酉吏 (tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone); 2，2',2"-三氯三乙胺；單端孑包菌素類 (trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疾孑包菌素(verrucarin) A、 一干孑包菌素(roridin) A和蛇行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine) (ELDISINE , FILDESIN );達(dá)卡巴漆(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine); 二溴甘 露醇(mitobronitol); 二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol); 艱泊溴烷(pipobroman); gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside) ("Ara-C");塞替派(thiotepa);類紫杉醇類 (taxoids),例如紫杉醇(paclitaxel) (TAXOL )、清蛋白改造的納米顆粒劑型紫 杉酉享(ABRAXANEtm)和多西他塞(doxetaxel) (TAXOTERE ));苯丁酸氮芥 (chlorambucil); 6-硫鳥噤呤(thioguanine);巰基噤呤(mercaptopurine);曱氨喋 口令(methotrexate); 4白類似4勿，i者^口"頃4白(cisplatin)牙口卡4白(carboplatin);長春石成 (vinblastine) (VELBAN );賴(platinum);依托泊苷(etoposide) (VP-16);異環(huán) 石岸酰胺(ifosfamide); 米4乇'藍(lán)、酉昆(mitoxantrone); 長春l斤石威(vincristine) (ONCOVIN );奧沙利鈾(oxaliplatin);亞葉酸(leucovorin); 長春瑞濱 (vinorelbine) (NAVELBINE ); 能滅瘤(novantrone);依達(dá)曲沙(edatrexate); 道i若霉素(daunomycin); 氨基蟲某p令(aminopterin); 4尹本膦酸鹽(ibandronate); 拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000; 二氟曱基鳥氨酸(DMFO);類^L黃酸類 (retinoids),諸如視黃酸(retinoic acid);任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受鹽、酸 或衍生物；以及兩種或多種上述物質(zhì)的組合，諸如CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔 比星、長春新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX (奧沙利鉑 (ELOXATINTM)聯(lián)合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。
該定義還包括作用為調(diào)節(jié)、降低、阻斷、或抑制可促進(jìn)癌生長的激素效 果的抗激素劑，且常常是系統(tǒng)或全身治療的形式。它們自身可以是激素。實(shí) 例包括抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑類(SERM)，包括例如他莫昔
芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX 他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene) (EVISTA )、屈洛昔芬(droloxifene)、 4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、 那洛昔芬(keoxifene)、LYl 17018、奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene) (FARESTON );抗孕酮類；雌激素受體下調(diào)劑類(ERD);雌激素受體拮抗劑， 諸如氟維司群(fUlvestrant) (FASLODEX );功能為抑制或關(guān)閉卵巢的藥劑， 例如促黃體生成激素釋放激素(LHRH)激動(dòng)劑，諸如醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate) ( LUPRON⑧和ELIGARD⑧)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸 布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin);其它抗雄激素類，諸 如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及抑 制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪 口坐、氨魯米特(aminoglutethimide)、 醋酸曱地孕酮(megestrol acetate) (MEGASE )、依西美坦(exemestane) (AROMASIN )、福美坦(formestane)、 法倔唑(fadrozole)、 伏氯唑(vorozole) (RIVISOR )、 來曲唑(letrozole) (FEMARA⑧)和阿那曲唑(anastrozole) (ARIMIDEX )。另夕卜，化療劑的這種 定義包括二膦酸鹽類(bisphosphonates),諸如氯膦酸鹽(clodronate)(例如 BONEFOS 或OSTAC )、依替膦酸鈉(etidronate) (DIDROCAL )、 NE-58095 、 唑來膦酸/唑來膦酸鹽(zoledronic acid/zoledronate) (ZOMETA )、阿倫膦酸鹽 (alendronate) (FOSAMAX )、帕米膦酸鹽(pamidronate) (AREDIA )、替魯膦 酸鹽(tiludronate) (SKELID⑧)或利塞膦酸鹽(risedronate) (ACTONEL );以及 曲沙他濱(troxacitabine) ( 1，3-二氧戊環(huán)核苦胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸， 特別是那些抑制涉及粘著細(xì)胞增殖的信號途經(jīng)中的基因表達(dá)的反義寡核苷 酸，諸如例如PKC-a、 Raf、 H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R);疫苗，諸 如THERATOPE 疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、 LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗；拓樸異構(gòu)酶1抑制劑(例如 LURTOTECAN ); rmRH (例如ABARELIX⑧)；lapatinib ditosylate ( ErbB-2 和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為GW572016); COX-2抑制劑， 諸如celecoxib (CELEBREX ; 4-(5-(4-曱基苯基)-3-(三氟曱基)-lH-吡唑-l-基)苯磺酰胺； 及任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受鹽、酸或衍生物。
"阻斷性"抗體或"拮抗性"抗體指抑制或降低其所結(jié)合的抗原的生物 學(xué)活性的抗體。此類阻斷可以任何手段發(fā)生，例如通過干擾蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì) 相互作用，諸如配體與受體的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，阻斷性抗體或拮抗
性抗體實(shí)質(zhì)或完全抑制抗原的生物學(xué)活性。
術(shù)語"癌癥"和"癌性"指向或描述哺乳動(dòng)物中特征通常為細(xì)胞生長/ 增殖不受調(diào)控的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤(例如何杰
金氏(Hodgkin)淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。此 類癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺 癌、肺的鱗癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸 癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、 結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、 曱狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及各種類型的頭和頸癌。
在用于本文時(shí),"治療"指試圖改變所治療個(gè)體或細(xì)胞的自然進(jìn)程的臨 床干預(yù)，可以是為了預(yù)防或在臨床病理學(xué)的進(jìn)程中進(jìn)行。治療的期望效果包 括預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、緩解癥狀、削弱疾病的任何直接或間接病理學(xué)后 果、預(yù)防轉(zhuǎn)移、減緩疾病進(jìn)展的速率、改善或減輕疾病狀態(tài)、及免除或改善 預(yù)后。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的調(diào)控物分子和方法用于延遲疾病或病癥 的發(fā)展。
"有效量"指在必需的劑量和時(shí)間上有效實(shí)現(xiàn)期望的治療或預(yù)防效果的 量。治療劑的"治療有效量"可根據(jù)諸如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體 重及該抗體在個(gè)體中引發(fā)期望應(yīng)答的能力等因素而變化。治療有效量還指該 治療劑的治療有益效果勝過任何有毒或有害后果的量。"預(yù)防有效量"指在 必需的劑量和時(shí)間上有效實(shí)現(xiàn)期望的預(yù)防效果的量。通常而非必然，由于預(yù) 防劑量是在疾病發(fā)作之前或在疾病的早期用于受試者的，因此預(yù)防有效量將 低于治療有效量。
本發(fā)明的組合物和方法
A. DSCR1調(diào)控物抗體
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可在本文中用作治療劑和/或診斷劑的 DSCR1調(diào)控物抗體。例示性的抗體包括多克隆的、單克隆的、人源化的、雙 特異性的、和異源偶聯(lián)的抗體?？贵w的生成、鑒定、表征、修飾和生產(chǎn)方面 是本領(lǐng)域已經(jīng)建立的技術(shù)，例如記載于美國專利申請公布號2005/0042216, 第522- 563段、第604-608段和第617-688段。
本文中所公開的DSCR1調(diào)控物抗體可配制成任何合適形式供投遞至靶
細(xì)胞/組織。例如，抗體可以配制成免疫脂質(zhì)體。"脂質(zhì)體"是由各種類型的 脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑構(gòu)成的、可用于將藥物^L遞至哺乳動(dòng)物的小嚢泡。 脂質(zhì)體的成分通常排列成雙層形式，與生物膜的脂質(zhì)排列相似。含有抗體的 脂質(zhì)體可通過本領(lǐng)域已知方法來制備，諸如Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); 美國專利第4,485,045號和第4,544,545號；W097Z38731,公布于1997年10月23 曰中所記載的。循環(huán)時(shí)間延長的脂質(zhì)體披露于美國專利第5,013，556號。
特別有用的脂質(zhì)體可以用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG書t生化磷脂酰 乙醇胺(PEG-PE)的脂類組合物通過反相蒸發(fā)法來生成。將脂質(zhì)體擠過具有限 定孔徑的濾器，產(chǎn)生具有期望直徑的脂質(zhì)體?？蓪⒈景l(fā)明抗體的Fab，片段經(jīng) 二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)，如Martin et al.， J. Biol. Chem, 257:286-288 (1982)中所記載的。任選在脂質(zhì)體中包含化療劑。參見Gabizon et al.， J. National Cancer Inst. 81(19): 1484 (1989)。
B. DSCRl調(diào)控物多肽
一方面，本發(fā)明的DSCR1調(diào)控物包括多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)控物 多肽拮抗內(nèi)皮細(xì)胞中的NFAT活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)控物多肽拮抗內(nèi) 皮細(xì)胞中的CnA活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合DSCRl 或與DSCRl或CnA相互作用的胞內(nèi)分子。多肽可以使用已知的肽合成方法學(xué) 化學(xué)合成，或者可以使用重組技術(shù)制備和純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，DSCR1 調(diào)控物多肽的長度是至少約5個(gè)氨基酸，或者長度為至少約6、 7、 8、 9、 10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、'40、41、42、43、44、
45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、
62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、
79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、
96、 97、 98、 99或100個(gè)氨基酸或更長，其中此類多肽能夠調(diào)控DSCR1活性。 這些多肽無需過多試驗(yàn)就可使用公知技術(shù)來鑒定。在這點(diǎn)上，注意到用于對 寡肽文庫篩選能夠特異性結(jié)合多肽靶物的寡肽的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(參見 例如美國專利號5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT^^布號WO 84/03506和WO 84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 3998-4002 (1984); Geysen et al,,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 178-182 (1985); Geysen et al,, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al.,丄Immunol. Meth. 102: 259-274 (1987); Schoofs et al" J. Immunol, 140: 611-616 (1988); Cwirla, S. E. et al., (1990) Proc. Natl, Acad. Sci. USA 87: 6378; Lowman, H.B. et al" (1991) Biochemistry 30: 10832; Clackson, T. et al" (1991) Nature 352: 624; Marks, J. D. et al., (1991), J. Mol. Biol. 222: 581; Kang， A.S. et al,, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8363; Smith, G. P., (1991) Current Opin. Biotechnol. 2: 668)。
在這點(diǎn)上，噬菌體展示是一種可以篩選大型寡肽文庫來鑒定那些文庫中 能夠特異性結(jié)合多肽靶物的成員的公知技術(shù)。噬菌體展示是將變體多肽作為 與外殼蛋白的融合蛋白展示在噬菌體顆粒表面的一種技術(shù)(Scott, J.K. and Smith, G P. (19卯)Science 249: 386)。噬菌體展示的效用在于，可以對選4奪性 隨機(jī)化蛋白質(zhì)變體(或隨機(jī)克隆cDNA)的大型文庫迅速且有效的分選那些 以高親和力結(jié)合靶分子的序列。在噬菌體上展示肽(Cwirla, S. E. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378)或蛋白質(zhì)(Lowman, H.B, et al" (1991) Biochemistry 30: 10832; Clackson, T. et al., (1991) Nature 352: 624; Marks, J. D. et al., (1991) J. Mol. Biol. 222: 581; Kang, A.S. et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: S363)文庫已經(jīng)用于對數(shù)百萬多肽或寡肽篩選具有特異結(jié)合特 性的那些(Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol. 2: 668)。分選隨才幾突變 體的噬菌體文庫需要構(gòu)建和擴(kuò)增大量變體的策略，使用靶受體進(jìn)行親和純化 的流程，及評估結(jié)合富集的結(jié)果的手段。參見美國專利5,223,409， 5,403,484, 5,571,689和5,663,143。
盡管大多數(shù)噬菌體展示方法已經(jīng)使用絲狀噬菌體，X類(lambdoid)噬菌體 展示系統(tǒng)(WO 95/34683; US 5,627,024)、 T4噬菌體展示系統(tǒng)(Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al.， Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al" Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci" 5: 1833 (1996); Efimov et al" Vims Genes, 10: 173 (1995))和T7噬菌體展示系統(tǒng)(Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); U.S. 5,766,905)也是已知的。
現(xiàn)在已經(jīng)對基礎(chǔ)噬菌體展示概念開發(fā)了很多其它改進(jìn)和變異。'這些改進(jìn) 增強(qiáng)了展示系統(tǒng)對肽文庫篩選與選定靶分子的結(jié)合及展示功能性蛋白質(zhì)的 能力，所述功能性蛋白質(zhì)具有對這些蛋白質(zhì)篩選期望特性的潛力。 已經(jīng)開發(fā)了用于噬菌體展示反應(yīng)的組合反應(yīng)裝置(WO 98/14277),而且 噬菌體展示文庫已經(jīng)用于分析和控制生物分子相互作用(WO 98/20169; WO 98/20159)和受約束螺旋肽的特性(WO 98/20036)。 WO 97/35196描述了分離親 和配體的方法，其中使噬菌體展示文庫接觸第一種溶液和第二種溶液以選擇 性分離結(jié)合的配體，在第一種溶液中配體將結(jié)合靶分子，而在第二種溶液中 親和配體將不會(huì)結(jié)合靶分子。WO 97/46251描述了這樣一種方法，即用親和 純化的抗體生物淘選隨機(jī)噬菌體展示庫，然后分離結(jié)合的噬菌體，隨后使用 微量板的孔進(jìn)行淘選過程以分離高親和力結(jié)合的噬菌體。已經(jīng)報(bào)道了金黃色 葡萄球菌(&a/ /^/ococcw awrew)蛋白A作為親和標(biāo)簽的使用(Li et al., (1998) Mol. Biotech. 9: 187)。 WO 97/47314描述了底物扣除文庫用于區(qū)別酶特異性 的用途，其中使用可以是噬菌體展示庫的組合文庫。WO 97/09446描述了使 用噬菌體展示選擇適用于洗滌劑的酶的方法。美國專利5,498，538， 5,432,018 和WO 98/15833中描述了選擇特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)的其它方法。
產(chǎn)生肽文庫和篩選這些文庫的方法還公開于美國專利5,723,286, 5,432,018, 5，580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018， 5，698，426, 5,763,192,和5,723，323。
用于生成、鑒定、表征、修飾和生產(chǎn)調(diào)控物多肽的方法是本領(lǐng)域已經(jīng)建 立的，例如記載于美國專利申請公布號2005/0042216第606-608段和第 614-688段。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于拮抗DSCRl依賴性CnA活性的多肽可在DSCR1 結(jié)構(gòu)i或結(jié)構(gòu)的基石出上i殳計(jì)，例i口j口Rothermel et al., Trends Cardiovascular Med. (2003), 13(1):15-21; Vega et al.， J. Biol. Chem, (2002), 277(33):30401-30407中 所記載的。例如，所述多肽可包含人DSCR1的大約第96位到大約第125位或 者大約第108位到大約第122位氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含 人DSCRl的絲氨酸-脯氨酸(SP)序列的至少一部分及N和/或C-末端鈣依賴磷 酸酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少一部分，其中所述多肽能夠結(jié)合CnA以抑制CnA調(diào)控 的基因表達(dá)。
C. DSCR1調(diào)控物小分子
在一個(gè)實(shí)施方案中，DSCR1調(diào)控物小分子指本文所定義的寡肽或抗體以 夕卜，調(diào)控DSCR1活性的有機(jī)分子。DSCR1調(diào)控物小分子可以使用已知方法學(xué) 來鑒定和化學(xué)合成(參見例如PCT公開號WO 00/00823和WO 00/39585)。
DSCR1調(diào)控物有機(jī)小分子的大小通常小于約2000道爾頓，或者其大小小于約 1500、 750、 500、 250或200道爾頓，其中此類有機(jī)小分子無需過多實(shí)驗(yàn)就可 使用公知技術(shù)來鑒定。在這點(diǎn)上，注意到用于對有機(jī)分子文庫篩選能夠結(jié)合 多肽靶物的分子的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(參見例如PCT公開號WO 00/00823 和WO00/395S5)。 DSCR1調(diào)控物有機(jī)小分子可以是例如醛、酮、坊、腙、縮 氨基脲(semicarbazone)、卡巴肼(carbazide)、伯胺、仲胺、^又胺、N-耳又代的肼、 酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基曱酸酯 (carbamate)、碳酸酯(carbonate)、縮酮、硫縮酮(thioketal)、縮醛、石克縮醛、 芳基鹵、芳基磺酸酯(aryl sulfonate)、烴基鹵、烴基磺酸酯(alkyl sulfonate)、 芳香族化合物、雜環(huán)化合物、苯胺、烯烴、炔烴、二醇、氨基醇、D惡唑烷、 D惡唑p林、漆唑烷、蓬唑啉、烯胺、磺酰胺(sulfonamide)、環(huán)氧化物、吖丙咬 (aziridine)、異氰酸酯(isocyanate)、石黃酰氯、重氮化合物、酰基氯(acid chloride)
D. 包含核酸的DSCR1調(diào)控物
一方面，本發(fā)明的DSCR1調(diào)控物包括核酸分子。例如，核酸分子可包括 有義/反義寡核苦酸、抑制性/干擾性RNA (例如抑制性/干擾性小RNA (siRNA))或適體。用于篩選、鑒定和生成這些核酸調(diào)控物的方法是本領(lǐng)域 已知的。
例如，siRNA已經(jīng)證明能夠調(diào)控其中傳統(tǒng)的拮抗劑諸如小分子或抗體已 經(jīng)失敗的基因表達(dá)(Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003))。長度小于30 個(gè)核苦酸(例如大約15-25、 17-20、 18-20、 19-20或21-23個(gè)核苷酸)的體外 合成的雙鏈RNA可充當(dāng)干擾性RNA (iRNA)且可特異性抑制基因表達(dá)(參見 例如Fire A., Trends in Genetics (1999), 391; 806-810;美國專利申請09/821832: 09/215257;美國專利6,506,559; PCT/US01/10188;歐洲申請流水號
由于它們的長度低于30個(gè)核苷酸，因此它們不會(huì)觸發(fā)細(xì)胞抗病毒防御機(jī)制。 此類機(jī)制包括干擾素生成及宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的全面停止。實(shí)踐中，siRNA 可人工合成，然后克隆到DNA載體中。此類載體可轉(zhuǎn)染，并使之以高水平表 達(dá)siRNA。高水平的siRNA表達(dá)用于"敲低，，(knockdown)或顯著降低細(xì)胞中 產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量，如此認(rèn)為它可用于蛋白質(zhì)的過表達(dá)與病理學(xué)病癥有關(guān)的 細(xì)胞背景。
適體是能夠結(jié)合靶分子諸如DSCR1蛋白質(zhì)的核酸分子。適體的生成和治 療用途是本領(lǐng)域已經(jīng)建立的。參見例如美國專利第5，475,096號，及Macugen⑧ (Eyetech, New York)用于治療年齡相關(guān)黃斑變性的治療功效。
反義技術(shù)是本領(lǐng)域已經(jīng)建立的。關(guān)于這種技術(shù)的進(jìn)一步詳情見下文。
E.藥用配制劑
可如下制備依照本發(fā)明使用的DSCR1調(diào)控物的治療用配制劑，即以凍干 劑型或水溶液的形式，將具有期望純度的DSCR1調(diào)控物與任選的藥學(xué)可接受 的載體、J武形劑或穩(wěn)、定劑混合(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition，Osol,A. Ed, 1980)?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量 和濃度對接受者是無毒的，包括緩沖劑，諸如醋酸鹽、Tris、磷酸鹽、檸檬 酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和曱石克氨酸；防腐劑(諸如氯 化十八烷基二曱基千基銨；氯化己烷雙胺；笨扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇 或苯曱醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯曱酸曱酯或丙酯；鄰苯二酚； 間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約IO個(gè)殘基)多 肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚 乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨 酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精； 螯合劑，諸如EDTA;張力調(diào)節(jié)劑(tonicifier),諸如海藻糖和氯化鈉；糖類， 諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；表面活性劑，諸如聚山梨醇酯；成鹽 反荷離子，諸如鈉；金屬復(fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面 活性劑，諸如TWEENTM 、 PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。
本文中的配制劑還可含有超過一種所治療具體適應(yīng)癥所必需的活性化 合物，優(yōu)選活性互補(bǔ)且彼此沒有不利影響的。例如，在DSCR1調(diào)控物之外， 可能還期望在 一種配制劑中含有另外的調(diào)控物，例如結(jié)合DSCR 1蛋白質(zhì)上不 同表位的第二種抗體，或針對一些其它靶物的抗體?；蛘?另外，所述組合物 還可包含化療劑、細(xì)胞毒劑、細(xì)胞因子、生長抑制劑、抗激素劑和/或心臟保 護(hù)劑。合適的是，此類分子以對于預(yù)定目的有效的量組合存在。
活性成分還可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠嚢 中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢)、 在膠狀藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和 納米月交嚢)、或在粗滴乳狀液中。此類才支術(shù)4皮露于例如Remington'sPharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol,A. Ed" 1980。
可制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏 水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是定型產(chǎn)品的形式，例如薄膜或微膠嚢。持 續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酉旨)或聚 (乙烯醇))、聚交酯(美國專利3,773,919)、 L-谷氨酸和L-谷氨酸Y-乙酯的共聚 物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微^t體)及
聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無菌的。這可容易的通過使用無菌濾膜過 濾來實(shí)現(xiàn)。
F.使用本發(fā)明DSCR1調(diào)控物的治療
本發(fā)明的DSCR1調(diào)控物具有多種非治療應(yīng)用。所述調(diào)控物可用于表達(dá) DSCR1的疾病的分期或檢測(例如在放射成像中)?？贵w、寡肽和有機(jī)小分 子也可用于自細(xì)胞純化或免疫沉淀DSCR1，供體外DSCR1檢測和定量，例如 在ELISA或Westem印跡中，以調(diào)控細(xì)胞群中的細(xì)胞事件。
現(xiàn)在，根據(jù)癌癥的分級，癌癥的治療涉及下列療法中的一種或它們的組 合手術(shù)去除癌性組織，放療和化療。包含DSCR1調(diào)控物的療法對于不能很 好承受化療的毒性和副作用的老年患者和放療具有有限效用的轉(zhuǎn)移性疾病 可能是尤其想要的。對于治療性應(yīng)用，可單獨(dú)使用DSCR1調(diào)控物，或者用于 與例如激素、抗血管發(fā)生劑(antiangiogen)或放射標(biāo)記的化合物，或者與手術(shù)、 冷凍療法和/或放療的聯(lián)合療法。DSCR1調(diào)控物可與其它形式的常規(guī)療法聯(lián) 合施用，與常規(guī)療法連續(xù)、在之前或之后施用?；熕幬镏T如TAXOTERE⑧ 多西他塞(doxetaxel)、 TAXOL⑧紫杉醇(paclitaxel)、雌莫司汀(estramustine)和 米托蒽醌(mitoxantrone)用于治療癌癥，特別是無風(fēng)險(xiǎn)(good risk)的患者。通 常將DSCR1調(diào)控物與治療有效劑量的化療劑一起施用。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，聯(lián)合化療施用DSCR1調(diào)控物以降低源自化療劑例如紫杉醇的副作用。 Physicians' Desk Reference (PDR)公開了已經(jīng)在多種癌癥的治療中使用的這 些藥劑的劑量。這些前述化療藥物在治療上有效的劑量給藥方案和劑量將取 決于所治療的具體癌癥、疾病的程度、及有本領(lǐng)域技術(shù)的內(nèi)科醫(yī)師所熟悉的 其它因素、且可以由內(nèi)科醫(yī)師確定。
將DSCR1調(diào)控物依照已知方法施用給人類患者，諸如靜脈內(nèi)施用，例如
作為推注(bolus)或一段時(shí)間的連續(xù)輸注，通過肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、
皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入路徑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí) 施方案中，優(yōu)選靜脈內(nèi)或皮下施用抗體、寡肽或有機(jī)小分子。
DSCR1調(diào)控物的施用可聯(lián)合其它治療方案。聯(lián)合施用包括使用分開的配 制劑或單一的藥用配制劑的共施用，及任意順序的連續(xù)施用，其中優(yōu)選有一 段時(shí)間所有兩種(或多種)活性劑同時(shí)發(fā)揮其生物學(xué)活性。優(yōu)選的是，此類 聯(lián)合療法導(dǎo)致協(xié)同治療效果和/或降低不希望的副作用。
可能還期望將DSCR1調(diào)控物的施用與針對與特定病理學(xué)疾患有關(guān)的另 一種抗原的治療劑的施用聯(lián)合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療性處理方法涉及DSCR1調(diào)控物與一 種或多種化療劑或生長抑制劑的聯(lián)合施用，包括不同化療劑的混合物 (cocktail)的共施用?；焺┌╚奔酸必,莫司汀(estramustine phosphate)、潑尼 莫司汀(prednimustine)、順鉑、5-氟尿嘧咬、美法侖(melphalan)、環(huán)磷酰胺、 羥基脲和羥基脲紫杉烷(hydroxyureataxane)(諸如紫杉醇和多西他塞 (doxetaxel))和/或蒽環(huán)類(anthracycline)抗生素。此類化療劑的制備和劑量給 藥方案可依照制造商的說明書使用或由熟練從業(yè)人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。此類化 療的制備和劑量給藥方案還可參閱Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)。
DSCR1調(diào)控物可與抗激素化合物以此類分子的已知?jiǎng)┝柯?lián)合，例如抗雌 激素化合物，諸如他莫昔芬(tamoxifen);抗孕酮化合物，諸如奧那司酮 (onapristone)(見EP616, 812);或抗雄激素化合物，諸如氟他米特(flutamide)。 當(dāng)待治療癌癥是雄激素非依賴性癌癥時(shí)，患者可能先前已經(jīng)接受過抗雄激素 療法，并在癌癥變成雄激素非依賴性時(shí)，可以給患者施用DSCRl調(diào)控物。
有時(shí)，還給患者共施用心臟保護(hù)劑(以預(yù)防或降低與療法有關(guān)的心肌功 能障礙)或一種或多種細(xì)胞因子可能也是有益的。除了上述治療方案，在 DSCR1調(diào)控物療法之前、同時(shí)、或之后，可給患者進(jìn)行手術(shù)去除癌細(xì)胞和/ 或放療。任何上述共施用藥劑的合適劑量就是那些目前所使用的劑量，而且 可由于該藥劑與DSCR1調(diào)控物的聯(lián)合作用(協(xié)同作用)而降低。
為了預(yù)防或治療疾病，施用的劑量和模式可以由內(nèi)科醫(yī)師依照已知標(biāo)準(zhǔn) 來選擇。DSCR1調(diào)控物的適宜劑量將取決于如上定義的待治療疾病的類型、 疾病的嚴(yán)重程度和進(jìn)程、施用DSCR1調(diào)控物是為了預(yù)防還是治療目的、先前
的療法、患者的臨床史及對DSCR1調(diào)控物的響應(yīng)、及主治醫(yī)師的判斷。恰當(dāng) 的將DSCR1調(diào)控物一次性或在一系列治療中施用給患者。在一個(gè)實(shí)施方案 中，將DSCR1調(diào)控物通過靜脈內(nèi)輸注或通過皮下注射來施用。才艮據(jù)疾病的類 型和嚴(yán)重程度，約liig/kg至約50mg/kg體重(例如約0.1-15mg/kg/劑)的抗體 可作為初始侯選劑量施用給患者，無論是例如通過一次或多次分開的施用， 或是通過連續(xù)輸注。劑量給藥方案可包括施用約4mg/kg的初始加載劑量，后 續(xù)約2mg/kg DSCR1調(diào)控物抗體的每周維持劑量。然而，其它劑量方案也可 使用。根據(jù)上述因素，典型的每日劑量可在約l嗎/kg到100mg/kg或更大的范 圍內(nèi)。對于持續(xù)幾天或更長時(shí)間的重復(fù)施用，根據(jù)狀況，維持治療直到發(fā)生 對疾病癥狀的期望遏制。這種療法的進(jìn)展可容易地通過常規(guī)方法和測定法， 并基于內(nèi)科醫(yī)師或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的標(biāo)準(zhǔn)來監(jiān)測。
在將多肽調(diào)控物(例如多肽、抗體等)施用給患者之外，本發(fā)明設(shè)想通 過基因療法來施用調(diào)控物。包含/編碼DSCRl調(diào)控物的核酸的此類施用涵蓋 在表述"施用治療有效量的DSCR1調(diào)控物"中。關(guān)于使用基因療法來產(chǎn)生胞 內(nèi)抗體的用途參見例如1996年3月14日公開的WO 96/07321。
有兩種主要方法使核酸(任選包含在載體中)進(jìn)入患者的細(xì)胞，即體內(nèi) 和回體(ex Wvo)。對于體內(nèi)投遞，通常在需要DSCR1調(diào)控物的部位將核酸直 接注射到患者體內(nèi)。對于回體治療，采集患者的細(xì)胞，將核酸導(dǎo)入這些分離 的細(xì)胞，并將經(jīng)過修飾的細(xì)胞或是直接施用于患者，或是例如裝入多孔膜內(nèi) 并植入患者體內(nèi)(參見例如美國專利4，892,538和5，283,187 )。有多種技術(shù)可 用于將核酸導(dǎo)入活細(xì)胞。這些技術(shù)根據(jù)是將核酸轉(zhuǎn)移至預(yù)期宿主的體外培養(yǎng) 細(xì)胞還是體內(nèi)細(xì)胞而有所變化。適于在體外將核酸轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的 技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷 酸4丐沉淀法等。常用于回體投遞基因的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
在一個(gè)實(shí)施方案中，體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(諸如腺病毒、 I型單純皰滲病毒或腺伴隨病毒)和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(可用于脂質(zhì)介導(dǎo)的基 因轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)有例如DOTMA、 DOPE和DC-Chol)進(jìn)行的轉(zhuǎn)染。關(guān)于目前已 知的基因標(biāo)記和基因治療方案的綜述參見Anderson et al., Science 256: 808-813 (1992)。還可參見WO 93/25673及其引用的參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明的DSCR1調(diào)控物抗體可以是本文中"抗體"定義所涵蓋的不同形 式。因此，抗體包括全長或完整抗體，抗體片段，天然序列抗體或氨基酸變
體，人源化的、嵌合的或融合抗體，及其功能性片段。
本發(fā)明提供了包含DSCR1調(diào)控物及載體的組合物。在又一個(gè)實(shí)施方案 中，組合物可包含DSCR1調(diào)控物并聯(lián)合其它治療劑諸如細(xì)胞毒劑或生長抑制 劑，包括化療劑。本發(fā)明還提供了包含DSCR1調(diào)控物及載體的配制劑。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述配制劑是包含藥劑學(xué)可接受載體的治療用配制劑。
G. 制品和試劑盒
本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含可用于治療病癥的物質(zhì)的制品，其中使用 DSCR1調(diào)控物。制品包括容器和所述容器上或與其相關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽或包裝插 頁。合適的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用各種材料制成， 諸如玻璃或塑料。容器中裝有有效治療疾患的組合物，而且可具有無菌存取 口 (例如容器可以是具有皮下注射針頭可刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小 管)。組合物中的至少一種活性劑是本發(fā)明的DSCR1調(diào)控物。標(biāo)簽或包裝插 頁指示該組合物用于治療特定病癥。標(biāo)簽或包裝插頁進(jìn)一步包含給患者施用 組合物的說明書。另外，制品還可包括第二容器，其中裝有藥學(xué)可接受的緩 沖劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏(Ringer)溶液和 右旋糖溶液。它還可包括商業(yè)和用戶立場上所需的其它物質(zhì)，包括其它緩沖 劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。
還提供了可用于多種目的的試劑盒?？梢蕴峁┌景l(fā)明DSCR1調(diào)控物 的試劑盒，用于DSCR1的體外檢測和定量，例如在ELISA或Western印跡中。 與制品相同，試劑盒包括容器和所述容器上或與其相關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽或包裝插 頁。容器中裝有包含至少一種本發(fā)明DSCR1調(diào)控物的組合物?？砂硗獾?容器，其中裝有例如稀釋劑和緩沖劑、對照抗體。標(biāo)簽或包裝插頁可提供對 組合物的描述以及用于預(yù)期體外或檢測用途的說明書。
H. 包含多肽或核酸的DSCR1調(diào)控物-具體的形式和應(yīng)用 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸包括反義或有義寡核苷酸/多核苷酸，
包括能夠結(jié)合內(nèi)源DSCR1核酸或編碼DSCR1多肽的單鏈核酸序列(或是 RNA或是DNA)。依照本發(fā)明，反義或有義寡核苷酸包含DSCR1 DNA編碼 區(qū)的至少一個(gè)片段。此類片段通常包含至少約14個(gè)核苷酸，優(yōu)選約14至30個(gè) 核苷酸。根據(jù)編碼給定蛋白質(zhì)的cDNA序列來衍生反義或有義寡核苷酸的能 力描述于例如Stein and Cohen, Cancer Res. 48: 2659, 1988和van der Krol et al., BioTechniques 6: 958, 1988。
反義或有義寡核苷酸與靶核酸序列的結(jié)合導(dǎo)致雙鏈體的形成，其通過多 種手段之一阻斷靶序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯，所述手段包括雙鏈體的降解增強(qiáng)、轉(zhuǎn) 錄或翻譯的過早終止、或其它手段。此類方法涵蓋在本發(fā)明中。反義寡核普
酸因此可用于阻斷內(nèi)皮細(xì)胞中DSCR1蛋白質(zhì)的表達(dá)。反義或有義寡核苦酸還 包括具有經(jīng)過修飾的糖-磷酸二酯骨架(或其它糖鍵(linkage),諸如WO 91/06629中所述)的寡核香酸，且其中此類糖鍵對內(nèi)源核酸酶有抗性。具有 抗性糖鍵的此類寡核苷酸在體內(nèi)是穩(wěn)定的(即能夠抵抗酶促降解)，但保留 了能夠結(jié)合靶核苷酸序列的序列特異性。
用于反義結(jié)合的優(yōu)選基因內(nèi)位點(diǎn)包括摻入基因開放閱讀框(ORF)的翻譯 起始密碼子(5'-AUG/5'-ATG )或終止密碼子(5'-UAA 、 5'-UAG和 5-UGA/5'-TAA、 5'-TAG和5'-TGA )的區(qū)域。這些區(qū)域指mRNA或基因中涵蓋 從翻譯起始或終止密碼子起任一方向(即5'或3')的約25個(gè)至約50個(gè)毗連核 苦酸的部分。用于反義結(jié)合的其它例示性區(qū)域包括內(nèi)含子；外顯子；內(nèi)含 子-外顯子連接處；開放閱讀框(ORF)或"編碼區(qū)"，即翻譯起始密碼子和翻 譯終止密碼子之間的區(qū)域；mRNA的5'帽，其包含經(jīng)由5'-5'三磷酸酯^:與 mRNA的最5'端殘基連接的N7-甲基化鳥苷殘基，包括5'帽結(jié)構(gòu)自身以及與帽 相鄰的前50個(gè)核苷酸；5'非翻譯區(qū)(5'UTR)，即mRNA中從翻譯起始密碼子起 5'方向的部分，因此包括mRNA中5'帽位點(diǎn)和翻譯起始密碼子之間的核普酸或 基因上的相應(yīng)核苷酸；和3'非翻譯區(qū)(3'UTR),即mRNA中從翻譯終止密碼子 起3'方向的部分，因此包括mRNA中翻譯終止密碼子和的3'末端之間的核苷酸 或基因上的相應(yīng)核苦酸。
骨架或非天然核苦間鍵的寡核苦酸。具有經(jīng)修飾骨架的寡核苷酸包括那些在 骨架中保留磷原子的以及那些在骨架中沒有磷原子的寡核苷酸。為了本說明 書的目的，而且有時(shí)候在本領(lǐng)域內(nèi)參考，在其核香間骨架中沒有磷原子的經(jīng) 修飾寡核苷酸也可認(rèn)為是寡核苦酸。例示性的經(jīng)修飾寡核苷酸骨架包括例如 具有正常3'-5'鍵的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、 氨烷基磷酸三酯(aminoalkylphosphotriester)、曱基和其它烴基膦酸酯包括3'-亞烷基膦酸酯(3'-alkylene phosphonate) 、 5'-亞烷基膦酸酯(5'-alkylene phosphonate)和手性膦酸酯、亞磷酸酯、氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯 (3'-amino phosphoramidate)和氨烴基氨 基 磷酸 酉旨(aminoall(ylphosphoramidate)、石克l炭氨基石壽酉羑酉旨(thionophosphoramidate)、石克,炎 烴基膦酸酯(thionoalkylphosphonate)、 硫羰烴基磷酸三酯 (ttiionoalkylphosphotriester)、 石西4戈石舞酉殳酉旨(selenophosphate)禾口 ；臭4戈石岸酉吏酉旨 (borano-phosphate),它們的2'-5'連接類似物，及那些具有反向極性的類似物， 其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸間鍵是3'到3'、 5'到5'、或2'到2'鍵。具有反向極性的例 示性寡核苷酸在最3'端核苷酸間鍵包含單一3'到3'鍵，即可以是無堿基(核堿 基缺失或以羥基取代)的單一反向核苦殘基。多種鹽、混合鹽和游離酸的形 式也包括在內(nèi)。教導(dǎo)含磷鍵的制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利
3,687,808; 4,469,863
5,276,019; 5,278,302
5,455,233; 5,466,677
5，563,253; 5,571,799
4,476,301; 5,023,243;'5,177,196; 5,188,897; 5,264,423 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218 5,672,697;和5,625,050,在此收入每一項(xiàng)作為參考。
其中不含磷原子的經(jīng)修飾寡核苷酸骨架的例子具有由短鏈烴基或環(huán)烴 基核苷間鍵、混合雜原子和烴基或環(huán)烴基核苷間鍵、或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原 子或雜環(huán)核苷間鍵形成的骨架。這些包括那些具有嗎啉代鍵(部分由核苷的 糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；曱?；?formacetyl)和 硫代曱?；?thioformacetyl)骨架；亞曱基曱酰基(formacetyl)和硫代曱?；?(thioformacetyl)骨架；核糖乙?；羌?；含烯(alkene)骨架；氨基磺酸酯 (sulfamate)骨架；亞曱基亞氨基和亞曱基肼基(methylenehydrazino)骨架；磺 酸酯和磺酰胺(sulfonamide)骨架；酰胺骨架；及其它具有混合N、 O、 S和CH2 組成部分的骨架。教導(dǎo)此類寡核苦酸的制備的代表性美國專利包括但不限于 美國專利5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046 5，610，289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608 5,646,269;和5,677,439,在此收入每一項(xiàng)作為參考。
在反義寡核苷酸的其它例子中，核苷酸單元的糖和核苷間鍵，即骨架， 用新基團(tuán)取代。保持堿基單元以與適宜的核酸靶化合物雜交。已顯示出具有 卓越雜交特性的這樣一種寡聚化合物，即寡核苷酸模擬物，稱為肽核酸 (PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架以含酰胺骨架取代，特別是氨 乙基甘氨酸骨架。核堿基得到保留并直接或間接結(jié)合骨架酰胺部分的氮雜氮
原子。教導(dǎo)PNA化合物的制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利 5,539,082; 5,714,331;和5，719'262,在此收入每一項(xiàng)作為參考。PNA化合物 的更多教導(dǎo)可參見Nielsenetal., 1991, Science 254: 1497-1500。
反義寡核苷酸的例子摻入了硫代磷酸酯骨架和/或雜原子骨架，特別是 -CH2-NH-0-CH2-、 -CH2-N(CH3)-0-CH2-(稱為亞曱基(曱基亞氨基)或MMI骨 架)、-CH2-0-N(CH3)-CH2-、 上述美國專利5,489,677中描述的 -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH24。-0-N(CH3)-CH2-CH2-(其中天然磷酸二酯骨架表 示為-0-P-0-CH2-)、及上述美國專利5,602,240的酰胺骨架。上述美國專利 5,034,506的具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的反義寡核苷酸也是另外的例子。
經(jīng)修飾的寡核香酸還可以包含一種或多種取代糖模塊。例示性的寡核苷 酸在2'位置包含如下之一OH; F; O-烷基，S-烷基，或N-烷基；O-烯基，S-烯基, 或N-烯基；O-炔基，S-炔基，或N-炔基；或O-烴基-O-烴基，其中烷基、烯基和 炔基可以是取代的或未取代的C,到C,。烷基或C2到C, o烯基和炔基。特別優(yōu)選 的是0[(CH2)nO]mCH3 、 0(CH2)nOCH3 、 0(CH2)nNH2 、 0(CH2)nCH3 、 0(CH2)nONH2、和0(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2,其中n和m是l到約10。其它例示 性的反義寡核苷酸在2'位置包含如下之一C,到C,。低級烴基，取代的低級烴 基，烯基，炔基，烴芳基(alkaryl)，芳烴基(aralkyl)， O-烴芳基或O-芳烴基, SH, SCH3， OCN, Cl， Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, S02CH3, ON02， N02, N3， NH2,雜環(huán)烴基，雜環(huán)烴芳基，氨烴基氨基(aminoalkylamino),聚 烴基氨基(polyalkylamino),取代的曱硅烷基，RNA切割基團(tuán)(cleaving group), 報(bào)道基團(tuán)(reporter group),嵌入劑，用于提高寡核苷酸的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)， 或用于提高核苷酸的藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)，及具有相似性質(zhì)的其它取代基。一 種可能的修飾包括2'-曱氧基乙氧基(2'-0-CH2CH2OCH3,也稱作2'-0-(2-曱氧 基乙基)或2'-MOE )(Martin et al., 1995， Helv. Chim. Acta 78: 486-504)即烴氧基 烴氧基(alkoxyalkoxy)。進(jìn)一步優(yōu)選的修飾包括2'-二曱氨基氧基乙氧基，即 0(CH2)20N(CH3)2基團(tuán)，也稱作2'-DMAOE，和2'-二甲氨基乙氧基乙氧基(本 領(lǐng)域也稱作2'-〇-二曱氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE ), 即 2'-0-(CH2)rO-(CH2)2-N(CH3)2。
進(jìn)一步的修飾包括鎖定核酸(Locked Nucleic Acid, LNA),其中2'-羥基與 糖環(huán)的3'或4'碳原子相連，由此形成雙環(huán)糖模塊。鍵可以是橋接2'氧原子和4'
碳原子的亞曱基(methelyne)(-CH2-)n基團(tuán)，其中n是l或2。 LNA及其制備參見 WO 98/39352和WO 99/14226。
其它的修飾包括2'-甲氧基(2'-0-CH3), 2'-氨丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-烯丙基(2'-CH2-CH-CH2) ， 2'-0-烯丙基(2'-0-CH2-CHNCH2)和2'-氟(2'-F) 。 2'-修飾可以在阿拉伯糖(arabino)(上)位或核糖(ribo)(下)位。 一種2'-阿拉伯糖修飾 是2'-F。也可在寡核苷酸上的其它位置進(jìn)行類似的修飾，特別是3'末端核苷酸 的糖的3'位置或在2'-5'連接的寡核苷酸中和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸 還可具有糖模擬物，諸如用環(huán)丁基模塊取代呋喃戊糖基(pentoforanosyl)糖。 教導(dǎo)此類經(jīng)過修飾的糖結(jié)構(gòu)的制備的代表性美國專利包括但不限于美國專 利4，981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597，909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5，646，265; 5，658，873; 5,670,633; 5,792,747; 和 5,700,920，在此完整收入每一項(xiàng)作為參考。
寡核苷酸還可包括核堿基(本領(lǐng)域內(nèi)通常簡稱為"堿基")修飾或替代。 在用于本文時(shí)，"未修飾的"或"天然的"核堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和 鳥嘌呤(G),及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧咬(U)。經(jīng)過修飾的 核堿基包括其它合成的和天然的核堿基，諸如5-曱基胞嘧啶(5-me-C), 5-羥 曱基胞嘧啶，黃噤呤，次黃。票呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-曱基 和其它烴基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烴基衍生物，2-硫尿嘧 咬，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卣代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基 (-CeC-CH3或-CH2-OCH)尿嘧啶和胞嘧啶及嘧啶堿基的其它炔基衍生物，6-偶氮(azo)尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧。定， 8-卣代、8-氨基、8-巰基(thio1)、 8-硫烴基(thioalkyl)、 8-羥基和其它8-取代的 腺噤呤和鳥噤呤，5-卣代特別是5-溴、5-三氟曱基和其它5-取代的尿嘧啶和 胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-曱基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基-腺嘌呤，8-氮 雜鳥。票呤和8-氮雜腺噪呤，7-脫氮鳥噪呤和7-脫氮腺。票呤和3-脫氮鳥嘌呤和 3-脫氮腺。票呤。進(jìn)一步修飾的核堿基包括三環(huán)嘧啶，諸如吩D惡嗪胞苷(lH-嘧 啶[5,4-b][l,4]苯丙D惡嗪-2(3H)-酮)，吩噻嗪胞苷(lH-嘧啶[5,4-b][W]苯丙噻嗪 -2(3H)-酮)，G-夾環(huán)(G-clamps)諸如取代的吩D惡嗪胞苷(例如9-(2-氨乙氧基)-H-嘧啶[5,4-b][l,4]苯并D惡嗪-2(3H)-酮)， 咔唑胞苷(2H-嘧啶[4,5-b]吲哚-2-酮)，吡 啶并吲哚胞苷(H-吡啶[3',2':4,5]吡咯[2,3-d]嘧啶-2-酮)。經(jīng)修飾的核堿基還可 包括那些其中。票呤或嘧啶堿基用其它雜環(huán)，例如7-脫氮-腺噤呤、7-脫氮鳥。票 呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮取代的核堿基。更多核堿基包括美國專利3,687,S08 中公開的那些；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990中乂丄開的那些；和 Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613中公開 的那些。這些核堿基中的某些特別可用于提高本發(fā)明寡聚化合物的結(jié)合親和 力。這些包括5-取代的嘧啶，6-氮雜嘧，定和N-2、 N-6和0-6取代的嘌呤，包 括2-氨丙基腺噤呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-曱基胞嘧啶取代 已顯示出將核酸雙鏈體的穩(wěn)定性提高0.6-1.2。C (Sanghvi et al.， Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993， pp. 276-278)而且是 例示性的堿基取代，例如在與2'-0-曱氧基乙基糖修飾結(jié)合時(shí)。教導(dǎo)經(jīng)修飾核 堿基的制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利3,687，808，以及美國專 利4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 5,681,941; 和5,750,692,在此收入每一項(xiàng)作為參考。
反義寡核苷酸的另 一種修飾包括與寡核苷酸化學(xué)連接提高寡核苷酸的 活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取的一種或多種模塊或共軛物(conjugate)。本發(fā)明 的化合物可包含與功能基團(tuán)諸如伯鞋基或仲羥基共價(jià)連接的共軛基團(tuán) (conjugate group)。本發(fā)明的共軛基團(tuán)包括嵌入劑、報(bào)道分子、多胺、聚酰胺、 聚乙二醇、聚醚、提高寡聚體藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)、和提高寡聚體藥動(dòng)學(xué)性質(zhì) 的基團(tuán)。典型的共軛基團(tuán)包括膽固醇、脂質(zhì)、陽離子脂質(zhì)、磷脂、陽離子磷 脂、生物素、吩嗪、葉酸(folate)、菲啶、蒽醌、吖啶、熒光素、羅丹明、香 豆素、和染料。在本發(fā)明的內(nèi)容中，提高藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)包括提高寡聚體 攝取、提高寡聚體對降解的抗性、和/或增強(qiáng)與RNA的序列特異性雜交的基 團(tuán)。在本發(fā)明的內(nèi)容中，提高藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)包括提高寡聚體攝取、分布、 代謝或排泄的基團(tuán)。共軛物模塊包括但不限于脂質(zhì)模塊，諸如膽固醇模塊 (Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556),膽酸 (Manoharan et al., 1994, Bioorg. Med. Chem. Let 4: 1053-1060),硫醚例如己基 -S-三苯曱基硫醇(tritylthiol)(Manoharan et al., 1992, Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 306-309; Manoharan et al., 1993, Bioorg. Med. Chem. Let, 3: 2765-2770),碌b代
膽固醇(Oberhauser et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20: 533-538)，月旨肪族鏈例如 十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al., 1991， EMBO J. 10: 1111-1118; Kabanov et al., 1990， FEBS Lett. 259: 327-330; Svinarchuk et al., 1993, Biochimie 75: 49-54)，磷脂例如二-十六烷基-夕卜消旋-甘油或三乙基-銨 1,2-二-0-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan et al., 1995， Tetrahedron Lett. 36: 3651-3654; Shea et al" 1990, Nucl. Acids Res. 18: 3777-3783)，多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al., 1995, Nucleosides & Nucleotides 14: 969-973)，或醋酸金剛烷(Manoharan et al., 1995, Tetrahedron Lett. 36: 3651-3654)，棕櫚基模塊(Mishra et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta 1264:229-237),或十八烷胺或己氨基-羰基-羥膽固醇模塊。本發(fā)明的寡核苷 酸還可與活性藥物物質(zhì)偶聯(lián)，例如阿司匹林(aspirin)、華法林(warfarin)、苯 基丁氮酮(phenylbutazone)、 布洛芬(ibuprofen)、 舒洛芬(suprofen)、 芬布芬 (fenbufen)、酮洛芬(ketoprofen)、 (S)-(+)-普拉洛芬(pranoprofen)、卡洛芬 (carprofen)、丹磺酰肌氨酸(dansylsarcosine)、 2,3,5-三橫苯曱酸、氟芬那酸 (flufenamic acid)、亞葉酸(folinic acid)、苯并p塞二口秦(benzothiadiazide)、氯p塞 。秦(chlorothiazide)、 二氮草雜萆(diazepine)、。引咮美辛(indomethacin)、巴比妥 酸鹽(barbiturate)、頭孢菌素(cephalosporin)、磺胺藥(sulfa drug)、抗糖尿病藥 (antidiabetic)、抗菌藥(antibacterial)或抗生素。寡核苷酸-藥物偶聯(lián)物及其制備 參見美國系列申請09/334,130 (1999年6月15日提交)和美國專利4,828，979, 4,948,882; 5，218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5，214，136; 5,245,022 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5，371,241 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923 5,599,928;和5，688,9化在此收入每一項(xiàng)作為參考。
不必對給定化合物中的所有位置作均一的修飾，事實(shí)上可以在單一化合 物中甚至在寡核苷酸內(nèi)的單一核苷處摻入超過一種上述修飾。本發(fā)明還包括 作為嵌合化合物的反義化合物。在本發(fā)明的內(nèi)容中，"嵌合的"反義化合物
或"嵌合物"指包含兩個(gè)或多個(gè)在化學(xué)上不同的區(qū)的反義化合物，特別是寡 核苷酸，每個(gè)區(qū)由至少一個(gè)單體單元構(gòu)成，在寡核苷酸化合物的情況中即為 核苦酸。這些寡核香酸通常包含至少一個(gè)區(qū)，其中寡核苷酸經(jīng)過修飾而賦予 該寡核芬酸以提高的對核酸酶降解的抗性、提高的細(xì)胞攝取、和/或提高的對
靶核酸的結(jié)合親和力。寡核苷酸的額外區(qū)可充當(dāng)能夠切割RNA:DNA或 RNA:RNA雜合物的酶的底物。舉例而言，RNA酶H是切割RNA:DNA雙鏈體 的RNA鏈的細(xì)胞內(nèi)切核酸酶。因此，RNA酶H的活化導(dǎo)致對RNA耙物的切割， 由此大大提高寡核苷酸抑制基因表達(dá)的效率。因此，在使用嵌合寡核苷酸時(shí)， 與雜交于相同靶區(qū)的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸相比，用較短的寡核苷酸通常 獲得可比的結(jié)果。本發(fā)明的嵌合反義化合物可形成為如上所述的兩種或多種 寡核苷酸、經(jīng)修飾的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模擬物的復(fù)合結(jié)構(gòu)。例 示性的嵌合反義寡核芬酸在3'-末端摻入至少一個(gè)2'修飾的糖(優(yōu)選 2'-0-(CH2)2-0-CH3)以賦予核酸酶抗性，及具有至少4個(gè)相連2'-H糖的區(qū)域以 賦予RNA酶H活性。此類化合物在本領(lǐng)域也稱為雜合物(hybrid)或接合物 (gapmer)。例示性的接合物(gapmer)在由具有至少4個(gè)相連2'-H糖的至少 一個(gè) 區(qū)分隔的3'-末端和5'末端具有2'修飾的糖(優(yōu)選2'-0-(CH2)2-0-CH3)的區(qū)，且 可以摻入硫代磷酸酯骨架鍵。教導(dǎo)此類雜合物結(jié)構(gòu)的制備的代表性美國專利 包括但不限于美國專利5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; 和 5,700,922,在此完整收入每一項(xiàng)作為參考。
依照本發(fā)明使用的反義化合物可方便且常規(guī)的通過眾所周知的固相合 成技術(shù)來制備。有多家銷售商銷售用于此類合成的設(shè)備，包括例如Applied Biosystems (Foster City, Calif.)。另外/或者，可采用本領(lǐng)域已知的用于此類合 成的任何其它手段。眾所周知使用類似技術(shù)來制備寡核苷酸，諸如硫代磷酸 酯和烴基化衍生物。本發(fā)明的化合物還可與其它分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的 混合物混合、膠嚢化、偶聯(lián)或以其它方式關(guān)聯(lián)成例如脂質(zhì)體，受體靶向分子， 口服的、直腸的、局部的或其它劑型以幫助攝取、分布和/或吸收。教導(dǎo)此類 攝取、分布和/或吸收輔助劑型的制備的代表性美國專利包括但不限于美國專 利5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395，619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854;5,469,854; 5,512,295; 5,527，528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575;和 5,595,756,在此收入每一項(xiàng)作為參考。
有義或反義寡核苷酸的其它例子包括那些與有機(jī)模塊，諸如WO 90/10048中描述的那些，及提高寡核芬酸對靶核酸序列的親和力的其它模塊， 諸如聚-(L-賴氨酸)共價(jià)連接的寡核苷酸。而且，嵌入劑，諸如玫瑰樹堿 (ellipticine)和烷化劑或金屬絡(luò)合物可附著于有義或反義寡核苷酸以調(diào)整反義 或有義寡核苷酸對靶核苷酸序列的結(jié)合特異性。
可通過任何基因轉(zhuǎn)移方法將反義或有義寡核苷酸導(dǎo)入包含靶核酸序列 的細(xì)胞，包括例如CaP04介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染、電穿孔、或通過使用基因轉(zhuǎn)移載 體諸如埃巴二氏病毒(Epstein-Barr vims)。.在一種例示性的流程中，將反義或 有義寡核苷酸插入合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。使包含靶核S吏序列的細(xì)胞在體內(nèi) 或回體接觸重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括但不限于那些 衍生自鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒M-MuLV的那些，N2 (衍生自M-MuLV的逆轉(zhuǎn)錄病毒)， 或命名為DCT5A、 DCT5B和DCT5C的雙拷貝載體(見WO 90/13641)。
還可通過與配體結(jié)合分子形成偶聯(lián)物將有義或反義寡核苷酸導(dǎo)入包含 靶核苷酸序列的細(xì)胞，如WO 91/04753中所述。合適的配體結(jié)合分子包括但 不限于細(xì)胞表面受體、生長因子、其它細(xì)胞因子、或結(jié)合細(xì)胞表面受體的其 它配體。 一般而言，與配體結(jié)合分子的偶聯(lián)優(yōu)選基本不干擾所述配體結(jié)合分 子結(jié)合其相應(yīng)分子或受體的能力或者阻斷有義或反義寡核苷酸或其偶聯(lián)物 型式進(jìn)入細(xì)月包。
或者，可通過形成寡核苷酸-脂質(zhì)復(fù)合物將有義或反義寡核苷酸導(dǎo)入包 含靶核酸序列的細(xì)胞，如WO 90/10448中所述。有義或反義寡核苷酸-脂質(zhì)復(fù) 合物優(yōu)選在細(xì)胞內(nèi)由內(nèi)源脂肪酶解離。
為至少約6, 7， 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18， 19, 20， 21， 22， 23, 24, 25, 26， 27， 28, 29, 30, 35, 40， 45， 50， 55, 60, 65， 70, 75, 80， 85，卯，95, 100, 105， 110， 115, 120, 125， 130, 135, 140, 145， 150, 155, 160， 165， 170， 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260， 270, 280, 290， 300, 310, 320, 330, 340, 350， 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630， 640, 650, 660， 670, 680， 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810， 820,
830, 840， 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990,或1000個(gè)核苦酸，其中在此內(nèi)容中術(shù)語"約"指所述核苷酸序列長度加 或減該長度的10%。
編碼DSCR1調(diào)控物多肽的核酸還可用于基因療法。在基因療法應(yīng)用中， 將基因?qū)爰?xì)胞以實(shí)現(xiàn)治療上有效的基因產(chǎn)物的體內(nèi)合成，例如用于替代缺 陷基因。"基因療法"包括常規(guī)基因療法和施用基因治療劑兩種，前者通過 一次處理獲得持續(xù)的效果，后者涉及一次或反復(fù)施用治療上有效的DNA或 mRNA。反義RNA和DNA可作為治療劑用于在體內(nèi)阻斷某些基因的表達(dá)。已 經(jīng)顯示可以將短反義寡核苦酸輸入它們在其中起抑制劑作用的細(xì)胞，盡管由 于細(xì)胞膜對它們的攝取有限，因而它們的胞內(nèi)濃度低(Zamecnik et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146)?？梢孕揎椆押似账嵋蕴岣咚鼈兊臄z 取，例如通過用不帶電荷的基團(tuán)取代它們帶負(fù)電荷的磷酸二酯基團(tuán)。
有多種技術(shù)可用于將核酸導(dǎo)入活細(xì)胞。這些技術(shù)根據(jù)是將核酸轉(zhuǎn)移到體 外的培養(yǎng)細(xì)胞中，還是體內(nèi)的預(yù)期宿主的細(xì)胞中而有所變化。適于在體外將 核酸轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、細(xì) 胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸鈣沉淀法等。目前優(yōu)選的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 包括使用病毒(通常是逆轉(zhuǎn)錄病毒)載體的轉(zhuǎn)染和病毒外殼蛋白-脂質(zhì)體介 導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Dzau et al., 1993, Trends in Biotechnology 11: 205-210)。在有些情況 中，期望與靶向靶細(xì)胞的試劑一起提供核酸來源，諸如對細(xì)胞表面膜蛋白或 耙細(xì)胞特異的抗體、靶細(xì)胞上受體的配體等。在采用脂質(zhì)體時(shí)，結(jié)合與胞吞 有關(guān)的細(xì)胞表面膜蛋白的蛋白質(zhì)可用于靶向和/或促進(jìn)攝耳又，例如對特定細(xì)胞 類型有向性的衣殼蛋白或其片段、在循環(huán)中經(jīng)歷內(nèi)在化的蛋白質(zhì)的抗體、靶 向胞內(nèi)定位并增強(qiáng)胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)。受體介導(dǎo)的胞吞的技術(shù)參見例如 Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432;和Wagner et al" 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414。關(guān)于基因標(biāo)記和基因療法方案的綜述見 Anderson et al., 1992, Science 256: 808-813。
本發(fā)明的DSCR1調(diào)控物多肽及核酸分子可在診斷上用于組織分型，其中 DSCR1多肽可能在一種組織中與另 一種組織相比，優(yōu)選在患病組織中與相同 組織類型的正常組織相比差異表達(dá)。
本發(fā)明涵蓋篩選化合物以鑒定那些調(diào)控DSCR1的化合物的方法。用于拮 抗劑藥物候選物的篩選測定法設(shè)計(jì)成鑒定與DSCR1多肽結(jié)合或復(fù)合，或者以
其它方式千擾DSCR1多肽與其它細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用的化合物，包括例如抑 制細(xì)胞表達(dá)DSCR1多肽。此類篩選測定法包括適應(yīng)高通量篩選化學(xué)文庫的測 定法，使得它們特別適用于鑒定小分子藥物候選物。
可以多種形式進(jìn)行測定法，包括本領(lǐng)域已經(jīng)很好表征的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì) 結(jié)合測定法、生物化學(xué)篩選測定法、免疫測定法和基于細(xì)胞的測定法。
用于拮抗劑的所有測定法的共同之處在于它們需要使藥物候選物接觸 DSCR1多肽，其條件和時(shí)間足以使這兩種組分相互作用。
在結(jié)合測定法中，相互作用指結(jié)合，所形成的復(fù)合物可在反應(yīng)混合物中 分離或檢測。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，將DSCR1多肽或藥物候選物通過共 價(jià)或非共價(jià)附著固定在固相上，例如微量滴定板。非共價(jià)附著通常通過用
DSCR1多肽溶液包被固相表面并干燥來實(shí)現(xiàn)?；蛘?，對待固定的DSCR1多肽 特異的固定化抗體例如單克隆抗體可用于將它錨定到固相表面上。測定法如 下進(jìn)行，將可以用可^^測標(biāo)記物標(biāo)記的非固定化組分加到固定化組分例如包 含錨定組分的包被表面上。在反應(yīng)完成時(shí)，例如通過清洗除去未反應(yīng)的組分， 并檢測錨定到固相表面上的復(fù)合物。若最初的非固定化組分?jǐn)y帶可檢測標(biāo)記 物，檢測出固定到表面上的標(biāo)記物表明發(fā)生了復(fù)合作用。若最初的非固定化 組分不攜帶標(biāo)記物，可例如通過使用特異性結(jié)合已固定復(fù)合物的標(biāo)記抗體來 ;險(xiǎn)測復(fù)合作用。
如果候選化合物與DSCR1多肽相互作用但不結(jié)合，那么它與DSCR1的相 互作用可通過用于檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的公知方法來測定。此類測 定法包括傳統(tǒng)方法，諸如例如交聯(lián)、免疫共沉淀、和通過梯度或?qū)游鲋墓?純化。另外，可以如Chevray and Nathans, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5789-5793所公開的,使用Fields及其同事(Fields and Song, 1989， Nature (London) 340:245-246; Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9578-9582)描述的基于酵母的遺傳系統(tǒng)來監(jiān)測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。許多 轉(zhuǎn)錄激活物，諸如酵母GAL4，由兩個(gè)空間上離散的模塊結(jié)構(gòu)域組成， 一個(gè) 起DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的作用，另一個(gè)起轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的功能。上述出版物中 描述的酵母表達(dá)系統(tǒng)(通稱為"雙雜交系統(tǒng)")利用了此特性，采用兩種雜 合蛋白質(zhì)，在一個(gè)中將靶蛋白質(zhì)與GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，而在另一 個(gè)中將候選激活蛋白質(zhì)與激活結(jié)構(gòu)域融合。GAL 1 - tocZ報(bào)道基因在GAL4激活 的啟動(dòng)子控制下的表達(dá)依賴于GAL4活性經(jīng)由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的重
建。用(3-半乳糖香酶的顯色底物檢測包含相互作用多肽的菌落。使用雙雜交 技術(shù)鑒定兩種特定蛋白質(zhì)之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的完整試劑盒
(MATCHMAKERTM)可從Clontech購買。此系統(tǒng)還可延伸到對參與特定蛋白 質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的作圖以及指出對這些相互作用至關(guān)重要的氨 基酸殘基。
在足以使兩種產(chǎn)物相互作用和結(jié)合的條件和時(shí)間下制備包含DSCR1及胞內(nèi) 或胞外組分的反應(yīng)混合物。為了測試候選化合物抑制結(jié)合的能力，在缺乏和 存在測試化合物時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。另外，可以向第三份反應(yīng)混合物中加入安慰劑， 作為陽性對照。如上所述監(jiān)測混合物中存在的DSCR1和胞內(nèi)或胞外組分之間 的結(jié)合(復(fù)合物形成)。對照反應(yīng)物中形成復(fù)合物但含有測試化合物的反應(yīng) 混合物中沒有形成復(fù)合物表明，測試化合物干擾DSCR1與其反應(yīng)配偶體的相 互作用。
為了測定拮抗劑，可將DSCR1多肽與要篩選特定活性的化合物一起加到 細(xì)胞中，在存在DSCR1多肽時(shí)該化合物抑制目的活性的能力表明，該化合物 是DSCR1多肽的拮抗劑。DSCR1多肽可進(jìn)行標(biāo)記，諸如通過放射性，使得與 受體分子結(jié)合的DSCR1多肽分子的數(shù)目可用于確定潛在拮抗劑的效力。
其中例如反義RNA或DNA分子通過與靶mRNA雜交并防止蛋白質(zhì)翻i奪來起 直接阻斷mRNA翻譯的作用。反義技術(shù)可用于通過三股螺旋形成或反義DNA 或RNA來控制基因.表達(dá)，二者都基于多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。例如， 可將編碼成熟DSCR1蛋白質(zhì)的多核苷酸序列的5'編碼部分用于設(shè)計(jì)長度為約 10-40個(gè)堿基對的反義RNA寡核苦酸。將DNA寡核苷酸設(shè)計(jì)成與基因中參與 轉(zhuǎn)錄的區(qū)互補(bǔ)(三股螺旋-參見Lee et al., 1979， Nucl. Acids Res. 6: 3073; Cooney et al., 1988, Science 241: 456; Dervan et al" 1991, Science 251:1360)， 由此防止轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生DSCR1多肽。反義RNA寡核苷酸與mRNA在體內(nèi)雜交并 阻斷mRNA分子翻譯成為DSCRl多肽(反義-Okano， 1991, Neurochem. 56: 560; Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press: Boca Raton, FL， 1988)。上述寡核苷酸還可投遞至細(xì)胞，使得反義RNA 或DNA可在體內(nèi)表達(dá)以抑制DSCR1多肽的生成。在使用反義DNA時(shí)，優(yōu)選 衍生自草巴基因核芬酸序列的翻譯起始位點(diǎn)(例如約-10到+10位置之間)的寡
脫氧核糖核苦酸。
潛在的拮抗劑包括結(jié)合DSCR1多肽的活性位點(diǎn)、蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)、 或其它相關(guān)結(jié)合位點(diǎn)，由此阻斷DSCR1多肽的正常生物學(xué)活性的小分子。小 分子的例子包括但不限于小肽或肽樣分子，優(yōu)選可溶性肽，和合成的非肽基 有機(jī)或無機(jī)化合物。
核酶是能夠催化對RNA的特異性切割的酶性RNA分子。核酶通過與互補(bǔ) 靶RNA發(fā)生序列特異性雜交，隨后進(jìn)行內(nèi)切核酸水解(endonudeolytic)切割來 起作用。可通過已知技術(shù)來鑒定潛在RNA靶物內(nèi)的特定核酶切割位點(diǎn)。更多 細(xì)節(jié)參見例如Rossi, 1994, Current Biology 4: 469-471和PCT公開號WO 97/33551 (1997年9月18日/>開)。
用于抑制轉(zhuǎn)錄的三股螺旋結(jié)構(gòu)中的核酸分子應(yīng)當(dāng)是單鏈的且由脫氧核 苷酸組成。設(shè)計(jì)這些寡核苷酸的堿基組成，使得它通過Hoogsteen堿基配對原 則促進(jìn)三股螺旋形成，這通常需要在雙鏈體的一條鏈上有大段嘌呤或嘧啶。 更多細(xì)節(jié)參見例如PCT公開號WO 97/33551，見上文。
這些小分子可通過上文討論的一種或多種篩選測定法和/或通過本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知的任何其它篩選技術(shù)來鑒定。
在一個(gè)實(shí)施方案中，內(nèi)在化抗體是優(yōu)選的?？贵w可具有某些特征，或者 經(jīng)過修飾后具有此類特征，以致于增強(qiáng)抗體進(jìn)入細(xì)胞的投遞。用于實(shí)現(xiàn)這一 效果的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。在又一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以在靶細(xì)胞中表 達(dá)，通過將能夠表達(dá)該抗體的核酸導(dǎo)入靶細(xì)胞。參見例如美國專利號 6,703,019; 6,329,173; PCT發(fā)表號2003/077945。還可以用脂轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體將抗 體投遞到細(xì)胞中。在使用抗體片段時(shí)，特異性結(jié)合靶蛋白質(zhì)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 最小抑制性片段一般是有益的。例如，根據(jù)抗體的可變區(qū)序列，可以設(shè)計(jì)保 留與靶蛋白質(zhì)序列結(jié)合能力的肽分子。此類肽可以化學(xué)合成和/或通過重組 DNA4支術(shù)生成。參見例如Marasco et al., 1993， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893。
調(diào)控物多肽進(jìn)入靶細(xì)胞可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)來增強(qiáng)。例如，某些序 列，i者如那些f;亍生自HIV Tat或觸角(Antennapedia)同源i或蛋白(homeodomain protein)的序列，能夠指導(dǎo)異源蛋白質(zhì)穿過細(xì)胞膜的高效攝取。參見例如Chen et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329。
本文中的配制劑還可含有所治療具體適應(yīng)癥所必需的超過一種的活性
化合物，優(yōu)選那些活性互補(bǔ)且彼此沒有不利影響的?；蛘?另外，組合物可包 含增強(qiáng)其功能的藥劑，諸如例如細(xì)胞毒劑、細(xì)胞因子、化療劑、或生長抑制 劑。合適的是，此類分子以對于預(yù)定目的有效的量組合存在。
下面是本發(fā)明方法和組合物的實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)上文提供的一般 描述，可實(shí)施各種其它實(shí)施方案。提供實(shí)施例僅僅為了例示目的，而非意圖 以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
我們對內(nèi)皮細(xì)胞中受到血管發(fā)生因子調(diào)控的基因進(jìn)行了基因組范圍的
分析，鑒定出DSCR1是最顯著誘導(dǎo)的基因之一。與拮抗鈣依賴磷酸酶(CnA)
導(dǎo)的 一種轉(zhuǎn)錄因子，活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cell, NFAT) 的脫磷酸化、核易位和活性。DSCR1不僅受到VEGF的誘導(dǎo)，而且還受到激 活CnA信號傳導(dǎo)的其它化合物的誘導(dǎo)，說明DSCRl在活化的內(nèi)皮細(xì)胞中有更 普遍的作用。如本文所示，DSCR1的瞬時(shí)表達(dá)削弱多種炎性標(biāo)志物基因，鑒 定了先前不知道的DSCR1在活化的內(nèi)皮細(xì)胞中的調(diào)控作用。內(nèi)源DSCR1的敲 低對活化的內(nèi)皮細(xì)胞提高NTFAT活性并刺激炎性基因表達(dá)。如此，所鑒定的 內(nèi)皮細(xì)胞中DSCRl與CnA信號傳導(dǎo)之間的負(fù)調(diào)控反饋環(huán)代表了炎性基因在 內(nèi)皮細(xì)胞活化(例如由VEGF通過VEGFR2而活化)后表達(dá)的潛在分子機(jī)制。 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)結(jié)合2種跨膜酪氨酸激酶受體，稱為VEGFR-1 和-2,它們調(diào)控多種多樣的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括磷脂酶C-丫、磷脂酰肌醇3 (PI-3) 激酶/AKT、Ras鳥苷三磷酸酶活化蛋白和Src家族，由此控制多種血管功能(綜 述見Ferrara and Gerber1)。 VE.GF代表了與多種疾病有關(guān)的生理性和病理性血 管發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控物，包括腫瘤生長、慢性炎癥和糖尿病性視網(wǎng)膜病。 一般 而言，與病理性血管發(fā)生有關(guān)的惡性腫瘤中VEGF活性的干預(yù)常常減緩疾病 進(jìn)展，得到較好耐受，而且不顯著影響健康的、成熟的血管系統(tǒng)(綜述見Ferrara etal2)。 VEGF還稱為血管通透性因子(VPF),這是基于其侵?jǐn)_血管完整性和
胞促分裂原和通透性增強(qiáng)劑，而VEGFR-1選擇性VEGF突變體表現(xiàn)為不具有 這些活性。VEGF經(jīng)由VEGFR-2的信號傳導(dǎo)和血管侵?jǐn)_表現(xiàn)為血管滲漏增加 的主要途徑，認(rèn)為這與VEGF在治療性血管發(fā)生背景中的有些用途有關(guān)。內(nèi)
皮細(xì)胞中受到VEGF特異性調(diào)控的新基因的鑒定導(dǎo)致了在病理性較之正常血 管系統(tǒng)中差異表達(dá)的基因的鑒定。
我們采用了已建立的體外內(nèi)皮細(xì)胞存活測定法，其中添加VEGF有力抑 制了由血清饑餓誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。這種測定法在鑒定內(nèi)皮細(xì)胞中的信號 傳導(dǎo)途徑的分子成分中特別有用。例如，這種測定系統(tǒng)有助于鑒定PI-3激酶 /Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵作用及Bcl2對內(nèi)皮細(xì)胞存活的重要性14。當(dāng)前的研 究選擇了相似的條件，因?yàn)樗鼈兡M內(nèi)皮細(xì)胞在新血管發(fā)生過程中對VEGF 的顯著依賴性，正如在臨床前體內(nèi)研究中所觀察到的。使用GeneCalIing技術(shù) (CuraGen, Branford, CT),我們試圖檢測整個(gè)人內(nèi)皮轉(zhuǎn)錄組中的VEGF靶基因
在這里，我們描述了內(nèi)皮細(xì)胞中DSCR1作為新VEGF靶基因的鑒定，及 DSCR1作為抗炎信號傳導(dǎo)分子的功能特征。人的基因(DSCR1)是位于人染色 體21 (HC21)最小區(qū)域內(nèi)的50-100種基因之一，它在以超過2個(gè)拷貝存在時(shí)引 起智力發(fā)育遲緩，統(tǒng)稱為唐氏綜合征(DS)、 DSCR1屬于一個(gè)保守的蛋白質(zhì) 家族，也稱為calcipressins^^或調(diào)控性鈣依賴磷酸酶相互作用蛋白(MCIP), 在人類中包含3個(gè)成員，即DSCR1/MCIP1 、 ZAKI-4/DSCR1L1/MCIP2和 DSCR1L2/MCIP3，共享結(jié)合鈣依賴磷酸酶的能力。DSCR1發(fā)揮胞質(zhì)信號傳 導(dǎo)小分子的功能，受到Ca2十/鉤調(diào)蛋白依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶2B (PP2B)或釣依賴磷酸酶A (CnA)的調(diào)控。與負(fù)調(diào)控反饋環(huán)一致，CnA活性受 到DSCR1結(jié)合的抑制。DSCR1在發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟中高度表達(dá)， 而在成人中，在眾多組織和細(xì)胞類型中檢測到中度表達(dá)，包括橫紋肌細(xì)胞和 心肌細(xì)胞6。其中，DSCRl在體內(nèi)動(dòng)物模型中顯示出干擾橫紋肌細(xì)胞中的CnA 信號傳導(dǎo)2及抑 制心臟肥大、Minami et al. (J. Biol. Chem. (2004)， 279(48): 50537-50554)也報(bào)道了DSCRl可以受凝血酶誘導(dǎo)。DSCR1的長期過表達(dá)也已 與疾病諸如阿爾茨海默氏病聯(lián)系起來，而且血管炎癥和血管侵?jǐn)_參與阿爾茨 海默氏病、血管性癡呆、混合型癡呆等。E腿k et al., J. Biol. Chem. (2001), 276(42):38787-38794壁。Townsend et al,， Ann. N.Y. Acad. Sci. (2002), 977: 65-76; Iadecola et al" Stroke, (2003)， 34:335-337。
CnA在對多種胞外信號和環(huán)境應(yīng)激的細(xì)胞應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且對 于凋亡、記憶過程、及骨骼肌和心肌生長和分化的調(diào)控是重要的(綜述見 Rothermd et al.2和Crabtree and Olson,。 CnA對活化T細(xì)胞核因子轉(zhuǎn)錄因子
(nuclear factor of activated T-cell transcription factor, NFATcl)的脫石奔酉菱4l^足進(jìn) 其易位至核，在那里它與其它轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，包括AP1、 cMAF、 GATA 或MEF2家族的成員u。這個(gè)基因家族的4個(gè)成員(NFATcl-c4)在許多組織中表 達(dá)，而且在神經(jīng)元導(dǎo)向、骨骼肌和心肌肥大、及賁門瓣發(fā)育期間發(fā)揮關(guān)鍵作 用(綜述見Hill-Eubanksetal.,。在它們在炎癥細(xì)胞中的調(diào)控作用之外，最近 在小鼠中進(jìn)行的基因消融實(shí)驗(yàn)說明NFAT轉(zhuǎn)錄因子家族的有些成員有獨(dú)立血 管功能。這些發(fā)現(xiàn)說明NFAT轉(zhuǎn)錄因子可能不是內(nèi)皮細(xì)胞存活所必需的，但 是對血管成熟過程中的正確血管裝配發(fā)揮重要作用皿。
先前的研究證明了暴露于刺激CnA信號傳導(dǎo)的藥劑諸如佛波醇 (phorbol)12-肉豆蔻酸鹽/酯(myristate)11-醋酸鹽/酯(PMA)和伊屋諾霉素 (ionomycine, IO)皿的內(nèi)皮細(xì)胞中NFAT發(fā)生磷酸化和核易位。環(huán)孢菌素A (cyclosporin,CsA)是CnA的有力抑制劑，而且基于CsA對基因表達(dá)的抑制作 用，在活化的內(nèi)皮細(xì)胞中描述了多種潛在CnA靶基因，包括粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞 集落剌激因子(GM-CSF)"、 Cox-2，白介素8 (IL-8嚴(yán)和組織因子(TF)氣如 此，盡管在內(nèi)皮細(xì)胞中鑒定了數(shù)種潛在CnA靶基因并在淋巴細(xì)胞和心肌細(xì)胞 中描述了DSCRl對CnA信號傳導(dǎo)的拮抗活性，但是尚不知道DSCR1在內(nèi)皮細(xì) 胞中在CnA信號傳導(dǎo)中的作用。
本發(fā)明鑒定了 DSCR1是活化的內(nèi)皮細(xì)胞中CnA的新內(nèi)源抑制物并描述 了在內(nèi)皮細(xì)胞中調(diào)控DSCR1水平對炎癥標(biāo)志物基因表達(dá)的生物學(xué)后果。例 如，如本文所示，對內(nèi)源DSCRl的干預(yù)提高了NFAT活性并刺激了數(shù)種炎癥 標(biāo)志物的表達(dá)，證明對DSCRl內(nèi)源水平的調(diào)控足以影響血管炎癥。
材料和方法
人DSCRl的克隆
通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)克隆DSCR1,其中使用商品化表達(dá)序列標(biāo)簽 (EST)克隆(Incyte, Palo Alto, CA)，使用設(shè)計(jì)成在5'端引入Clal位點(diǎn) (DSCRl-5'Clal)及在3'端引入EcoR位點(diǎn)(DSCRl-3'EcoRl)的引物。將PCR片 段克隆入經(jīng)過ClaI和EcoRI切割的巨細(xì)胞病毒(CMV)馬區(qū)動(dòng)的表達(dá)載體PRKN (Genentech, South San Francisco, CA)，并通過測序驗(yàn)證插入片段，然后進(jìn)行 進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。在C-末端另外引入了 FLAG表位(DSCRl-Flag)。
試劑。除非另有說明，所有一抗來自BD Pharmingen (San Diego, CA),
重組人VEGF (rhVEGF)得自Genentech,而堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF) 將腫瘤壞死因子a (TNF-a)購自R&D Systems (Minneapolis, MN)。
細(xì)胞和細(xì)胞測定法。原代人內(nèi)皮細(xì)胞購自Clonetics (Santa Rosa, CA)并依 照制造商的說明書培養(yǎng)。為了進(jìn)行基因召喚實(shí)驗(yàn)(gene calling experiments), 從Clonetics (BioWhittaker, Walkersville, MD)購得人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC) 并遵循制造商的說明書在補(bǔ)充有5。/。胎牛血清(FCS)的內(nèi)皮生長培養(yǎng)基 (EBM-2)中維持。將細(xì)胞(1 x 107)以19,000個(gè)細(xì)胞/cn^的細(xì)胞密度分配并一式三 份對每種條件進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。分配細(xì)胞后24小時(shí)，將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)和含0.1。/o牛血清清蛋白(BSA)或0.10/0 BSA+VEGF (30ng/mL)或50/。 FCS 的培養(yǎng)基(Clonetics)清洗3次。如文獻(xiàn)所述進(jìn)4亍RNA分子和逆轉(zhuǎn)錄-PCR (RT-PCR)分析11。對于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，使用以下條件人(h) VEGF， 30ng/mL; hTNF-a, 10ng/mL; PMA, 200ng/mL (Calbiochem, La Jolla, CA); CsA, l^M (Calbiochem); 10, 5pM (Sigma, St Louis, MO);毒胡蘿卜素(thapsigargin), 5 OnM (Sigma)。在一種情況中，由Dharmacon (Lafayette, CO)基于各基因的全 長cDNA并使用"Smart-pool"裝置(Dharmacon, Lafayette, CO)生成抑制性(si) RNA。為了進(jìn)行腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)存活實(shí)驗(yàn)，遵循制造商的說明書在補(bǔ)充有5。/。FCS 的內(nèi)皮生長培養(yǎng)基(EBM-2)中維持人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。給6孔板 (Primaria， BD Biosciences, Bedford, MA)的每各孔分S己3xl()5個(gè)細(xì)胞并一式兩 份對每種條件進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞在立式搖床上于室溫在不含血清、含 10mM CaCl2和10nM MgCl2的培養(yǎng)基中用編碼gD肽(Ad-對照)、DSCR1 (Ad-DSCR1)或具有倒置編碼序列的反義構(gòu)建物(Ad-DSCRl-AS)的腺病毒感 染(MOI-100)2小時(shí)。然后，加入5倍體積的含5。/。FCS的常規(guī)生長培養(yǎng)基并將 細(xì)胞在C02培養(yǎng)箱中放置1天。然后，將細(xì)胞用PBS清洗3次，并加入含0.1% BSA的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Clonetics, Santa Rosa, CA), PMAZIO、 H202和ZVAD如所 示的。血清々幾^"我和劑量給藥后24小時(shí)，在Coulter牌style細(xì)胞計(jì)凄"義上對細(xì) 胞計(jì)數(shù)。對于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，使用以下條件PMA, 200ng/ml (Calbiochem, La Jolla, CA);伊屋諾霉素，5|iM (Sigma, St. Louis, MO);將3% &02溶液在基礎(chǔ) 培養(yǎng)基，0.1% BSA中1:300稀釋以得到0.01% 11202溶液；ZVAD 5pM。
靡病善戎傳的i^和力發(fā)勿^敏^脊?fàn)?br> 基本上如制造商所述，通過將NotI-NotI cDNA插入片段克隆入Ad-easy 載體構(gòu)建試劑盒(Stratagene, La Jolla, CA)的多接頭位點(diǎn)來構(gòu)建
Ad-DSCR1陽Flag和Ad-LacZ。
為了鑒定差異表達(dá)的新基因，使用了 "開放式"(open)技術(shù)諸如基因表 達(dá)系歹'J分片斤(serial analysis of gene expression, SAGE)和基因召喚 (GeneCalling)?；蛘賳驹谖墨I(xiàn)中有記載^22。
將來自各個(gè)處理組的樣品逆轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行定量表達(dá)分析(QEA)5。分析聚 焦于調(diào)控至少2倍的基因的鑒定。探索條件依賴性基因表達(dá)概況的初步分析 通過QEA或基因召喚來進(jìn)行，如先前所述5。
將在10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞用Tris (三(幾曱基)氨基曱烷)緩沖鹽水清 洗2次，并加入0.6mLRIPA緩沖液(10mMPBS， 1% Nonidet P-40, 0.5%脫氧膽 酸鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉[SDS], 100mg/mL苯曱基磺酰氯，30嗎/mL抑肽 酶，ImM原4凡酸鈉)及蛋白酶抑制劑(Roche Pharmaceuticals, Gaithersburg， MD)。針對人NFATc 1 、 c2和c3的小鼠單克隆抗體(mAb)購自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)。親和純化的針對人E-選擇蛋白、血管細(xì)胞粘 附分子-1 (VCAM-1)、胞間粘附分子-1 (ICAM-l)和Cox-2的山羊多克隆抗體來 自BD Pharmingen。內(nèi)皮細(xì)胞總提取物、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、印跡 和免疫檢測依照Santa Cruz Biotechnology的方案進(jìn)行。將總共60mg全細(xì)胞提 取物加載至4% - 16%聚丙烯酰胺凝膠的每條泳道。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng) i式劑盒購自Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), 4吏用來自Vector Laboratories (Burlingame, CA)的辣根過氧化物酶-鏈霉親合素。對于NFATcl 實(shí)驗(yàn)，加載等量的細(xì)胞提取物以顯現(xiàn)NFATcl (mAb 7A6; 1:500; Santa Cmz Biotechnology),加載對照是a-微管蛋白(單抗來自ICN, Santa Ana, CA; l:5000)。對于Cox-2和TF免疫印跡分析，將等量的細(xì)胞溶胞物加載至6。/。 - 12% 梯度SDS-PAGE。用抗Cox2 mAb (RDI, 1:500)分析Cox-2,用1:500稀釋的 Genentech的抗hTF單抗(克隆7Gll)分析TF。將樣品加載至凝膠前，對蛋白質(zhì) 的量定量，并作相應(yīng)調(diào)整。作為加載對照，在4%-20%聚丙烯酰胺凝膠上使 用抗y-銜接蛋白單抗(adaptin)(l: 1000)。
力^:勿應(yīng)源亡的為V^1
對于熒光激活細(xì)胞分揀(FACS)分析，將細(xì)胞通過異硫氰酸熒光素偶聯(lián)的 膜聯(lián)蛋白V和通過熒光染料碘化丙啶(PI)染色，基本上如Gerber et al. J Biol
Chem. 1998; 273: 30336-30343所記載的。
#/七乂力發(fā)紐應(yīng)的錄秒脊染和處龍,爽源;t法
對于HUVEC和人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVEC)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，將3mL生長培養(yǎng) 基(Primaria; BD Biosciences, Bedford, MA)中的細(xì)胞(7.5乂104)分配至6孔板的 每個(gè)孔。為總共3個(gè)孔的轉(zhuǎn)染計(jì)算脂轉(zhuǎn)染混合物中所使用的質(zhì)粒DNA的量。 然后，將1.25pg表達(dá)載體、3.75嗎熒光素酶報(bào)道物和2.0)ig SV-Renilla參照報(bào) 道物混合，并加入14iuLFl月旨轉(zhuǎn)染試劑(Targeting Systems, Santee, CA)。然后， 向混合液中加入4.5mL高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)。如制造 商所推薦的進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。對于報(bào)道基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)，遵循制造商的推薦通過 在300^iL lx被動(dòng)溶胞緩沖液(passive lysis buffer)中使用雙重?zé)晒馑孛笀?bào)道物 i式劑盒(Dual Luciferase Reporter Kit, Promega, San Luis Obispo, CA;H夸細(xì)月包;容 胞。
對于包括siRNA的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，如關(guān)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)所述將HUVEC 分配入6孔板。對于一式6份樣，將600pmo1 siRNA (Dharmacon, Lafayette, CO)、 7.5jiig焚光素酶和4嗎Renilla報(bào)道構(gòu)建物在6mL高葡萄糖DMEM中混合。對于 FACS和免疫組織化學(xué)(IHC)實(shí)驗(yàn)，加入11.5嗎增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)質(zhì)粒 替代熒光素酶質(zhì)粒。在于37。C溫育25-30分鐘前，向混合物中加入30^L Targefect溶液A和60nL Targefect溶液B (Targeting Systems);將lmL該溶液用 于所述的脂轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞用PBS清洗2次，然后加入不含血清的培養(yǎng)基并按指 定時(shí)間給藥。
DSCR1和NFATC 1的siRNA拮抗物 基因名稱作為基礎(chǔ)的編號有義鏈的序列5'->3， 在血管發(fā)生因子(例如VEGF)活化研究中作為混合物使用
DSCR1 DSCR1 DSCR1 DSCR1
畫一004414 雨—004414 恵一004414 NM 004414
在PMA/IO活化研究中使用 DSCR1 NM 004414
GCUCAGACCUACACAUAG GGACAUCACCUUUCAGUAU GAAAGAAUGAGGAGACCUA GACAUCACCUUUCAGUAUU
AACGUAUGACAAGGACAUCAC
基因名稱作為基礎(chǔ)的編號有義鏈的序列5，->3， NFATC1固一l 72390 CGUAUGAGCUUCGGAUUGA NTFATC1固一 172390 GCAGAGCACGGACAGCUA NPATC1NM一172390 UCAGAAACUCCGACAUUGA NFATC1而一 172390 GCCGGAAUCCUGAAACUCA
注意列出的所有siRNA在每一條鏈上具有UU作為3，-突出，而只有反義鏈
上有5'-磷酸根。
^瘦《^^凝裙^^;
在染色前24小時(shí)將原代人內(nèi)皮細(xì)胞(7xl03個(gè)細(xì)胞/cm、接種入8腔顯微鏡 載波片(Nalgene Nunc, Naperville, IL)的每個(gè)孔。將細(xì)胞在立式搖床上于室溫 在不含血清、含10mM CaCl2和10nM MgCl2的培養(yǎng)基中用編碼LacZ或DSCRl 的腺病毒(感染復(fù)數(shù)[MOI]-100)感染2小時(shí)。然后，加入5倍體積的常規(guī)生 長培養(yǎng)基并將細(xì)胞在C02培養(yǎng)箱中放置2天。更換培養(yǎng)基后，將細(xì)胞用濃度為 30ng/mL的hVEGF處理20分鐘。在與各種抗體一起溫育前，將細(xì)胞于-20。C 用曱醇固定4分鐘并于室溫用PBS清洗。將細(xì)胞在含小鼠抗人NFATcl—抗 (sc7294, Santa Cmz Biotechnology)的PBS中于室溫溫育1小時(shí)。然后將細(xì)胞用 PBS清洗3次，并在含Alexa Fiuor 488抗小鼠IgG (Molecular Probes, Eugene, OR)的PBS中溫育。最后將細(xì)胞用PBS清洗3次，并在Vectashield培養(yǎng)基(Vector Laboratories)中封固在蓋玻片下。使用配有AxioCam MR單色照相機(jī)(Zeiss, Thornwood， NY)的Zeiss Axiovert 200熒光顯微鏡進(jìn)行顯微鏡檢查和照相，其 中使用x63油鏡。
名吵乂ASCi / W/^謦在舉的^:成和『&yter"伊遊為V^f 使用DSCR1 cDNA作為模板用引物DSCRl-EcoRI-Pro 5'(添加額外的脯 氨酸)和DSCRl-Stop-XhoI3'PCR擴(kuò)增DSCRl，并克隆入pGEX-KG。表達(dá)并 純化GST-DSCR1，基本上如先前所述21。通過用重組GST-DSCR1進(jìn)行免疫來 制備多克隆兔抗GST-DSCR1。將過濾后的粗制血清用于Western印跡(l:400)。 寡聚物和TaqMan探針引物組如表1所示。
表l:寡聚物和TaqMan探針引物組
引物組
HSDSCR1.1113FP 5' (FAM) -AGG TTG TGA AAA CAG CAG CAA
TGC AAT GT- (TAMRA) P3'
HSDSCR1.1088.F HSDSCR1.1171.R HSGMCSF-571T
HSGMCSF-515F HSGMCSF-610R HSTF-1911T
HSTF-1880F HSTF-2025R HSCOX-2-3152T
HSCOX-2-3130F HSCOX-2-3207R HSCD34-2497T
HSCD34-2447F HSCD34-2519R HSVCAM-1-2686T
HSVCAM-1-2665F HSVCAM-1-273 OR DSCR1-EcoRI-Pro 5'
DSCRl-Stop-XhoI3'
CCA CAG GAA GCC GCC TAG T
TGA GGG AAG AAA GGA AAC GCT
5' (FAM) -AGG TCC AGG CCA CTC CCA CC GT-
(TAMRA) P3'
GTC ATC TTG GAG GGA CCA A
TTC TGC CAT GCC TGT ATC A
5' (FAM)陽TTA ACT GAC TTA AGT GGC ATT AAA
CAT TTG AGA GCT AA GT- (TAMRA) P3'
CAG CTT CCT AAT ATG CTT TAC AAT CT
CAA TGT CAA CCA TAG AAG CTT TAA GTA
5' (FAM) -CCT GGC TAC CTG CAT GCT GTT CC
GT- (TAMRA) P3'
CAG TAG GTG CAT TGG AAT CAA
TCT TAG CAA AAT GGC TAA AAG AAG
5' (FAM) -ATC CCT GCT CAA CCC CTC TGG A
GT- (TAMRA) P3'
CCC AGG TCC TTG TTT GCT
TCC AAC CGT CAT TGA AAC C
5' (FAM)陽CGA AGT TTG TTC ATC AGA CTC CTG
TGC GT- (TAMRA) P3'
GCA TGG TAC GGA GAT GTT TC
GGC CAC ATT GGG AAA GTT
CCGAATTCCCATGCATTTTAGAAACTTTAACTA
CAG
GGGCTCGAGCTAGCTGAGGTGGATCGGCGTG TACTCC
結(jié)果
新VEGF輩巴基因的鑒定
通過衍生自經(jīng)VEGF (30ng/mL)或5。/。 FCS刺激的HUVEC的基因表達(dá)概 況相對于基礎(chǔ)條件(未添加[NA])的差異電扣除，分別鑒定了在缺乏血清時(shí)
受到VEGF的特異性調(diào)控的基因。所述分析的直觀顯示見圖1A，證明了在刺 激6小時(shí)和24小時(shí)后HUVEC中VEGF誘導(dǎo)的DSCR1 mRNA表達(dá)分別是4.8倍 和2.9倍。存在5% FCS不顯著改變DSCR1的表達(dá)水平?？傊?，我們在FCS刺 激的細(xì)胞中在6和24d、時(shí)后分別檢測到1.8%和4.4%的痕跡有變化，代表基因 表達(dá)的改變。對于VEGF剌激的細(xì)胞，我們觀察到6和24小時(shí)后分別有1.7%和 3.4%的基因發(fā)生變化。受到VEGF但非FCS特異性誘導(dǎo)的46種cDNA片段的身 份如先前所述確定5。 28種cDNA對應(yīng)于已知基因或EST，其中DSCR1是受到 最強(qiáng)烈誘導(dǎo)的。剩余18種cDNA片段與公開數(shù)據(jù)庫內(nèi)的任何已知序列都不匹 配。28種已知基因中有13種(46%)屬于分泌因子類，它們進(jìn)一步強(qiáng)化了內(nèi)皮 作為分泌組織的重要作用24?？偣?種基因(21。/。)屬于胞質(zhì)蛋白質(zhì)類，可能涉 及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括DSCR1。剩余9種基因(37%),包括3種核糖體的、2種線粒 體的、2種轉(zhuǎn)錄因子、l種細(xì)胞周期調(diào)控基因和l種涉及翻譯調(diào)控的基因，代 表了涉及代謝和細(xì)胞周期調(diào)控的基因類別。
導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活化的條件誘導(dǎo)DSCR1表達(dá)
為了驗(yàn)證通過基因召喚技術(shù)得到的結(jié)果，我們通過實(shí)時(shí)RT-PCR分析 (TaqMan)分析了經(jīng)VEGF或其它內(nèi)皮細(xì)胞促分裂原刺激的多種人內(nèi)皮細(xì)胞中 的RNA水平。這證實(shí)了我們先前的結(jié)果(圖1A)，將FCS或b-FGF添加至血清 饑餓的HUVEC不顯著改變DSCR1水平，而添加VEGF在HUVEC中誘導(dǎo) D.SCRl表達(dá)延長，達(dá)到36小時(shí)(圖1B)。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了來自基因召喚實(shí)驗(yàn) 的數(shù)據(jù)，說明DSCR1不是有絲分裂內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的普遍標(biāo)志物。
為了評估2種VEGFR介導(dǎo)DSCR1誘導(dǎo)的程度，我們測試了突變型VEGF, 它們以排他方式活化每一種VEGFR，如先前所述^。 VEGFR-2選擇性突變 型(VEGFR2-sel)與VEGF在誘導(dǎo)DSCR1表達(dá)方面具有同等效力。相反， VEGFR-l選擇性配體(VEGFRl-sel和PlGF)未能誘導(dǎo)DSCRl表達(dá)的改變，表明 VEGFR-2足以誘導(dǎo)DSCR1表達(dá)(圖1B-C )。
分離自不同組織的內(nèi)皮細(xì)胞可能在其VEGFR表達(dá)水平中或在其信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)途徑中有所不同，這可能影響其VEGF靶基因表達(dá)概況。為了測試所述潛 在細(xì)胞類型特異性差異，我們用VEGF或受體選擇性突變型刺激人肺主動(dòng)脈 內(nèi)皮細(xì)胞(HPAEC)、人真皮孩i血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVEC)和人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUAEC)并通過實(shí)時(shí)RT-PCR分析DSCR1表達(dá)。作為陰性對照，我們測試了 人肺主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HPASMC)，它們不表達(dá)顯著水平的VEGF受體(數(shù)據(jù)
未顯示)。測試的所有內(nèi)皮細(xì)月包展示出DSCR1表達(dá)水平應(yīng)答VEGF和 VEGFR2-sel但非VEGFRl-sel的升高，表明VEGFR-2是在各種內(nèi)皮細(xì)胞中誘 導(dǎo)DSCR1的必要且充分條件(圖1C和未顯示的數(shù)據(jù))。 一般而言，大多數(shù)細(xì) 胞類型在用VEGF延長刺激后展示出不如HUVEC突出的DSCR1表達(dá)升高(圖 1B)。
為了評估一般導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活化的條件是否誘導(dǎo)DSCRl表達(dá)及CnA是 否涉及DSCR1調(diào)控，我們用TNF-a或活化CnA信號傳導(dǎo)的化合物諸如釣離子 載體A23187 「GenBankl (10)，單獨(dú)或聯(lián)合PMA和CnA信號傳導(dǎo)的另 一種激活 物毒胡蘿卜素刺激HUVEC。所有化合物在5.5小時(shí)(圖1D)和18小時(shí)(數(shù)據(jù) 未顯示)后顯著升高DSCR1 mRNA水平，而且這種誘導(dǎo)在存在CnA信號傳導(dǎo) 的抑制物CsA時(shí)受到有力抑制。有趣的是，TNF-a誘導(dǎo)DSCRl至與對VEGF 觀察到的相似的水平。自HUVEC制備的全細(xì)胞提取物的Westem印跡分析證 實(shí)了用VEGF、 PMA/IO和毒胡蘿卜素刺激6小時(shí)后DSCR1的誘導(dǎo)(圖1E)。 與關(guān)于mRNA水平的發(fā)現(xiàn)相似，在用b-FGF或5。/。FCS刺激后沒有發(fā)現(xiàn)DSCRl 蛋白質(zhì)水平的顯著升高。與關(guān)于mRNA水平的發(fā)現(xiàn)相反，我們未能在用TNF-a 刺激的細(xì)胞中檢測到DSCR1蛋白質(zhì)水平的升高，說明VEGF和TNF-a對 DSCR1表達(dá)的調(diào)控有不同機(jī)制?；贑sA對活化的內(nèi)皮細(xì)胞上DSCR1水平的 抑制性效果，我們得出結(jié)論，這種誘導(dǎo)主要是由CnA介導(dǎo)的。然而，用TNF-a
控機(jī)制。
DSCR1防止NFAT的核易位
VEGF在添加至人肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HPVEC)時(shí)早在刺激后20分鐘就誘導(dǎo) NFATcl核易位22。如此，我們希望分析HUVEC中NFATcl核易位的動(dòng)力學(xué)及 DSCR1對此過程的干預(yù)達(dá)到什么程度。內(nèi)皮細(xì)胞的IHC分析揭示了經(jīng)VEGF 刺激的細(xì)胞中NFATc 1的顯著核易位，這在表達(dá)DSCR1的細(xì)胞中在刺激后20 分鐘(圖2A)及延長溫育60和120分鐘后(數(shù)據(jù)未顯示)都不存在。據(jù)我們 所知，這是首次證明活化的原代人內(nèi)皮細(xì)胞中DSCR1與NFATcl之間的功能 性干擾，防止NTFATcl的核易位。另夕卜，我們通過IHC法研究了在用編碼表位 標(biāo)記的DSCRl的載體(Ad-DSCRl-FLAG)或?qū)φ蛰d體(Ad-LacZ)經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo) 的內(nèi)皮細(xì)胞中DSCR1的亞細(xì)胞定位。與先前的報(bào)道一致2^11，我們檢測了在 用Ad-DSCR1 -FLAG轉(zhuǎn)導(dǎo)后DSCR1的胞質(zhì)和核定位，這在存在VEGF或
10/PMA時(shí)沒有改變(數(shù)據(jù)未顯示)。
絲氨酸蘇氨酸磷酸酶CnA對NFATcl的脫磷酸化生成這種轉(zhuǎn)錄因子的活 化形式，它能夠進(jìn)入細(xì)胞核并刺激轉(zhuǎn)錄氣如此，我們希望將DSCR1對內(nèi)皮 細(xì)胞中NFATc 1的磷酸化狀態(tài)的效果與CsA誘導(dǎo)的效果進(jìn)行比較。與Johnson
DSCRl的NFATcl的脫磷酸化形式向磷酸化形式(在圖2B中標(biāo)以"P'，)的轉(zhuǎn) 變。這些變化與CsA誘導(dǎo)的效果相當(dāng)，說明CnA的磷酸酶活性得到阻斷。另 外，DSCR1提高了總的NFATcl蛋白質(zhì)水平，表明DSCR1表達(dá)可能影響 NFATcl蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。相反，CsA不顯著改變NFATcl蛋白質(zhì)水平，說明 CsA與DSCRl之間可能以不I^的作用機(jī)制來調(diào)控CnA活性和NFATcl磷酸化。 DSCR1削弱MFAT的轉(zhuǎn)錄活性
使用轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)證明了暴露于刺激CnA的化合物諸如IO和 PMA的細(xì)胞中DSCR1和NFAT轉(zhuǎn)錄活性之間的功能性干擾，為了測試這樣 一種機(jī)制是否存在于內(nèi)皮細(xì)胞中，我們瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染DSCR1的表達(dá)載體，并通 過分析內(nèi)皮細(xì)胞中的熒光素酶報(bào)道基因表達(dá)來對NFAT活性水平定量。與CsA 誘導(dǎo)的效果相似，DSCR1的表達(dá)強(qiáng)烈抑制經(jīng)PMA、毒胡蘿卜素、TNF-a或鈣 離子載體(calcium ionophore)A23187 「GenBankl刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中NPAT驅(qū)動(dòng) 的轉(zhuǎn)錄(圖3A)。 DSCR1不顯著干擾AP1活性(圖3B),證明該效果是對NFAT 特異的。
DSCR1抑制活化的內(nèi)皮細(xì)胞上炎癥標(biāo)志物基因的表達(dá) 為了研究DSCRl表達(dá)升高對CnA靶基因表達(dá)的影響，我們用表達(dá)DSCR1 的腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞并在活化后分析CnA靶基因表達(dá)水平。測試的條 件包括與VEGF、 PMA/IO或毒胡蘿卜素及其組合一起溫育4小時(shí)。通過實(shí)時(shí) RT-PCR進(jìn)行的mRNA水平分析揭示了活化的內(nèi)皮細(xì)胞中COX2、 E-選擇蛋白 和TF的顯著誘導(dǎo)(圖4A)。與先前的報(bào)道一致，應(yīng)答VEGF刺激升高的2倍到 3倍顯著低于IO/PMA誘導(dǎo)的基因表達(dá)升高的10倍到20倍，這些差異可能反 映了胞內(nèi)作用的PMA是相對于結(jié)合胞外表達(dá)的VEGFR2的VEGF而言CnA信 號傳導(dǎo)的更有力誘導(dǎo)物。正如本文第一次證明的，DSCR1的表達(dá)在經(jīng)VEGF 或IO/PMA刺激的內(nèi)皮細(xì)月包中抑制炎癥標(biāo)志物基因表達(dá)。
為了驗(yàn)證RNA水平的這些變化是否與蛋白質(zhì)水平的改變有關(guān)，我們進(jìn)行 了 一系列FACS和Western印跡實(shí)驗(yàn)。圖4B-C所示數(shù)據(jù)證明了DSCRl對E-選擇 蛋白、VCAM-1、 TF和Cox-2的下調(diào)。TF和Cox-2蛋白質(zhì)水平應(yīng)答DSCR1表達(dá) 的降低在與單獨(dú)使用CsA時(shí)誘導(dǎo)的效果相比時(shí)更突出(圖4C，分別比較第4 和7道與第4和5道及第6和9道與第6和5道)。這些發(fā)現(xiàn)證明了 DSCR1在活化的 人內(nèi)皮細(xì)胞中比CsA更有效的降低數(shù)種炎癥標(biāo)志物基因的表達(dá)。
接著，我們監(jiān)測了VEGF靶基因包括DSCR1應(yīng)答VEGF刺激的表達(dá)動(dòng)力 學(xué)。正如預(yù)期的，GM-CSF、 TF、 COX-2、 VCAM-1和E-選擇蛋白RNA水平 在VEGF施用后0和2小時(shí)之間升高(圖5A)。然而，所述誘導(dǎo)是瞬時(shí)的，而 且與對照未處理細(xì)胞相比，在刺激后6和36小時(shí)之間逆轉(zhuǎn)成抑制。作為對照， 我們分析了Bcl-2應(yīng)答VEGF刺激的表達(dá)，它在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中表達(dá)一致(圖 5A和Gerber et al;)?？傊?，VEGF耙基因表達(dá)降低與DSCR1表達(dá)水平應(yīng)答 VEGF刺激的升高同時(shí)發(fā)生。組合的數(shù)據(jù)支持我們的模型，其中DSCR1可能 在活化的內(nèi)皮細(xì)胞中干擾CnA信號傳導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)控環(huán)中起作用(圖5B)。
使用腺病毒DSCR1的侵?jǐn)_調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的存活
細(xì)胞死亡，正如DSCR1反義構(gòu)建物的表達(dá)降低內(nèi)源DSCR1 。這是在血清饑餓、 H202暴露和PMA/IO處理及在存在胱天蛋白酶抑制劑諸如具體如ZVAD的條 件下看到的。
敲低DSCR1誘導(dǎo)NFAT活性和活化的內(nèi)皮細(xì)胞上炎癥標(biāo)志物基因表達(dá) 為了測試用siRNA轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞的效果，我們使用抗Flag抗體進(jìn)行了用 編碼表位標(biāo)記形式DSCRl (DSCRl-FLAG)的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的 Western印跡分析?；蛘?，我們使用兔多克隆抗血清評估了 DSCR1的內(nèi)源水 平。我們發(fā)現(xiàn)在用編碼FLAG標(biāo)記形式(PRKN-DSCR1-FLAG)的表達(dá)載體共 轉(zhuǎn)染后DSCR1蛋白質(zhì)表達(dá)完全缺失(圖6A),表明靶向DSCRl的siRNA有力 降低DSCR1表達(dá)。正如預(yù)期的，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)源DSCRl水平降低了50。/。至700/。， 與通過共轉(zhuǎn)染GFP表達(dá)載體的細(xì)胞的熒光顯微鏡檢術(shù)評估的相似轉(zhuǎn)染效率 一致(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)說明用siDSCRl瞬時(shí)轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞有效降低內(nèi) 皮細(xì)胞中的蛋白質(zhì)水平。
接著，我們應(yīng)用這些條件來調(diào)查內(nèi)源DSCR1水平降低對CnA下游信號傳 導(dǎo)事件的影響。我們將siRNA與含NFAT結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)道基因構(gòu)建物 瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染，并用VEGF或PMA/IO活化轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞。用siDSCRl轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞的NFAT活性相對于對照轉(zhuǎn)染細(xì)胞(si對照(siControl))在存在IO/PMA和
VEGF、 IO/PMA(圖6C)或VEGF (圖6D)時(shí)都有2倍和3倍提高。與siDSCRl 轉(zhuǎn)染細(xì)胞相反，siNFATcl轉(zhuǎn)染細(xì)胞的NFAT活性有降低，證實(shí)了siRNA共轉(zhuǎn)染 方法對原代人內(nèi)皮細(xì)胞的有效性(圖6C-D)。
因表達(dá)的影響。為了選擇經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，我們將GFP表達(dá)載體添加到 轉(zhuǎn)染混合物中。GFP+細(xì)胞的FACS分析揭示了數(shù)種炎癥標(biāo)志物基因的表達(dá)在 存在siDSCRl的條件下有升高，所述炎癥標(biāo)志物基因包括TF、 E-選擇蛋白和 VCAM-1 (圖7A)，而ICAM-1表達(dá)未受顯著影響(數(shù)據(jù)未顯示)。相反，用 siNFATcl共轉(zhuǎn)染細(xì)胞阻斷基因表達(dá)，說明這種轉(zhuǎn)錄因子在活化的內(nèi)皮細(xì)胞中 的E-選擇蛋白、VCAM-1和TF表達(dá)中起關(guān)鍵作用。有趣的是，VCAM-1的基 礎(chǔ)水平和活化水平都受到siNFATcl的抑制，證明NFATcl在VCAM-l的基礎(chǔ)表 達(dá)中起作用。經(jīng)VEGF刺激的細(xì)胞中siDSCRl誘導(dǎo)炎癥基因表達(dá)的程度明顯 低于對PMA/IO刺激細(xì)胞觀察到的水平(圖7A-B)。與其它報(bào)告相似氣這些 發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明VEGF誘導(dǎo)鈣依賴磷酸酶信號傳導(dǎo)的潛力相對于藥學(xué)化合物 諸如PMA/IO降低?？傊覀兊陌l(fā)現(xiàn)證明DSCR1的內(nèi)源水平足以抑制經(jīng) VEGF或其它CnA信號傳導(dǎo)激活物刺激的內(nèi)皮細(xì)胞上的炎癥基因表達(dá)。
討論
CsA與DSCR1間作用機(jī)制的差異
盡管DSCRl和CsA都干擾CnA活性，然而它們在干擾的機(jī)制和分子靶物 方面有所不同。CsA和其它免疫抑制性藥物像FK506通過與特定細(xì)胞抑免蛋 白(immun叩hilin)(分別是FKBU和親環(huán)蛋白(cyclophilin) A)形成復(fù)合物來 抑制鈣依賴磷酸酶，而且此復(fù)合物結(jié)合鈣依賴磷酸酶上的多個(gè)位點(diǎn)。相反， DSCR1經(jīng)在NFAT蛋白質(zhì)中首先鑒定的類似鈣依賴磷酸酶相互作用結(jié)構(gòu)域的 結(jié)構(gòu)基序直接結(jié)合CnA。 DSCR1內(nèi)的這些保守基序表現(xiàn)出具有功能重要性， 因?yàn)槿狈@些區(qū)的截短形式DSCRl在結(jié)合CnA方面是缺陷的、綜述見 Rothermeleta12)。因此，認(rèn)為DSCR1直接接觸鈣依賴磷酸酶的活性位點(diǎn)，可 能是通過抑制NFAT和其它磷蛋白底物的接近。
我們分析了它們的作用機(jī)制差異是否會(huì)轉(zhuǎn)化為不同藥理學(xué)效果。如圖4 所示，DSCR1和PMA/IO在經(jīng)VEGF 、毒胡蘿卜素或PMA/IO刺激的內(nèi)皮細(xì)胞 中顯著降低數(shù)種NFAT靶基因的表達(dá)，包括E-選擇蛋白、TF和Cox-2。然而，
由DSCR1誘導(dǎo)的NFATc 1基因表達(dá)和超磷酸化的降低在與CsA誘導(dǎo)的效果相 比時(shí)通常更加突出(圖4C)。總之，DSCR1對炎癥基因表達(dá)的抑制效果相對 于CsA的增加表現(xiàn)為是由DSCRl干擾內(nèi)皮細(xì)胞中調(diào)控炎癥事件的其它信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起的。或者，差異應(yīng)答可能是由添加到培養(yǎng)基中的CsA的藥理學(xué) 特性相對于在細(xì)胞中表達(dá)DSCR1的腺病毒載體的差異引起。 活化的內(nèi)皮細(xì)胞上的DSCR1和炎癥基因的調(diào)控
CnA和下游轉(zhuǎn)錄因子NFAT很可能在發(fā)育的血管發(fā)生過程中發(fā)揮作用。 兩個(gè)NPATcl等位基因都缺陷的小鼠展示出缺陷的主動(dòng)脈瓣和肺動(dòng)脈瓣發(fā)育 及后續(xù)胚胎第14.5天左右的死亡，其是充血性心力衰竭的后果皿。缺乏 NFATc3和NFATc4的小鼠中的雙重敲除實(shí)驗(yàn)不削弱瓣發(fā)育，但導(dǎo)致胚胎第11 天作用的胚胎致死，這是由于血管裝配中的泛發(fā)缺陷11。在兩個(gè)CnA等位基 因都缺陷的胚胎中觀察到相似血管表型。這些發(fā)現(xiàn)說明CnA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不 直接調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞存活，但對于血管成熟是重要的22。支持此想法的是，我 們沒有檢測到內(nèi)皮細(xì)胞存活應(yīng)答DSCR1水平改變的任何顯著變化(數(shù)據(jù)未顯 示)。
內(nèi)皮細(xì)胞中DSCR1的負(fù)反饋環(huán)
在內(nèi)皮細(xì)胞中，受到CsA抑制的許多基因^^有獨(dú)立記載說受到VEGF 的調(diào)控16，18.20.30—33。這些觀察結(jié)果暗示VEGF可能經(jīng)由CnA調(diào)控這類基因。支 持此理論的是，向經(jīng)VEGF刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中添加CsA削弱IL-8、 GM-CSF和 Cox-2的表達(dá)水平^2^。所有這些基因以瞬時(shí)方式受到VEGF的上調(diào)，而且 延長與VEGF的溫育導(dǎo)致它們的下調(diào)。我們在內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)行的工作指向介 導(dǎo)CnA信號傳導(dǎo)的 一種轉(zhuǎn)錄因子NFATc 1和抑制性蛋白質(zhì)DSCR1的伴隨上 調(diào)，其中DSCR1在內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生負(fù)反饋環(huán)(圖5B)。支持此信號傳導(dǎo)途徑 的是，我們在VEGF刺激后2小時(shí)發(fā)現(xiàn)最高水平的E-選擇蛋白、TF、 COX-2 和VCAM-1表達(dá)。相反，處理后6小時(shí)，這些基因的表達(dá)水平等于或低于未 處理對照細(xì)胞的水平。在該實(shí)驗(yàn)的時(shí)程中，DSCR1水平在刺激后的前6小時(shí) 升高，此后達(dá)到平臺(plateau)(圖5A)。與負(fù)反饋一致，VEGF靶基因的表達(dá) 與DSCR1表達(dá)反向相關(guān)。
負(fù)反饋環(huán)的模型進(jìn)一步預(yù)測敲低抑制性成分將導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞上的炎癥 標(biāo)志物基因的水平升高(圖5B)。與此預(yù)期一致，靶向內(nèi)源DSCRl的siRNA 實(shí)驗(yàn)揭示了活化的內(nèi)皮細(xì)胞上升高的NFAT轉(zhuǎn)錄活性(圖6C)和CnA靶基因
表達(dá)，包括TF、 VCAM-l和E-選擇蛋白(圖7A)。在分析用VEGF處理的內(nèi)皮 細(xì)胞時(shí)，通過siRNA敲低內(nèi)源DSCRl導(dǎo)致升高的NFAT活性(圖6D)和升高 的TF、 E-選擇蛋白和VE-鈣粘著蛋白表達(dá)水平(圖7B)。總之，VEGF刺激的 細(xì)胞中誘導(dǎo)的程度不如PMA/IO處理突出，這可能可以用后面的化合物刺激 CnA活性的卓越效力來解釋。
在其它生物學(xué)系統(tǒng)中已經(jīng)記載了刺激性和抑制劑信號傳導(dǎo)事件應(yīng)答細(xì) 胞因子刺激的相伴誘導(dǎo)。在淋巴細(xì)胞中記載了負(fù)反饋環(huán)來限制TNF-a或IL-l 的延長的刺激的作用。這兩種細(xì)胞因子都誘導(dǎo)在多種細(xì)胞類型中負(fù)干擾 TNF-a信號傳導(dǎo)的胞內(nèi)銜接分子A20氣如此，與A20在TNF-a信號傳導(dǎo)中的 保護(hù)作用相似，我們認(rèn)為DSCR1能在血管發(fā)生因子(例如VEGF)或其它刺 激活化內(nèi)皮細(xì)胞延長期間預(yù)防血管損傷。
總之，我們在本文中提供了DSCR1在用促炎化合物刺激的內(nèi)皮細(xì)胞上對 炎癥基因的抑制中的作用的第一手直接證據(jù)?？紤]到這些基因中的一些(包 括Cox-2和TF)作為治療靶的突出作用，我們的發(fā)現(xiàn)指向DSCR1作為新治療 靶來調(diào)控血管系統(tǒng)上炎癥事件的表達(dá)并影響血管完整性的侵?jǐn)_。
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權(quán)利要求
1.調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞中的DSCR1活性的DSCR1調(diào)控物。
2. 權(quán)利要求1的DSCR1調(diào)控物，其中所述調(diào)控物調(diào)控經(jīng)由VEGF受體2 (VEGFR-2)的信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)的DSCR1活性。
3. 任何前述權(quán)利要求的DSCR1調(diào)控物，其中所述調(diào)控物調(diào)控DSCRl-4丐依 賴磷酸酶A (CnA)途徑。
4. 任何前述權(quán)利要求的DSCR1調(diào)控物，其中所述調(diào)控物調(diào)控與NPAT活性 有關(guān)的細(xì)胞事件。
5. 權(quán)利要求4的DSCR1調(diào)控物，其中所述細(xì)胞事件是NFAT磷酸化、NFAT 核易位或NFAT轉(zhuǎn)錄活性。
6. 任何前述權(quán)利要求的DSCR1調(diào)控物，其中所述調(diào)控物包括編碼能夠拮抗 CnA誘導(dǎo)的基因表達(dá)的多肽的核酸。
7. 權(quán)利要求6的DSCR1調(diào)控物，其中所述多肽包括至少包含DSCR1—部分 的肽，其中所述肽能夠與CnA相互作用。
8. 權(quán)利要求6或7的DSCR1調(diào)控物，其中所述多肽包含人DSCR1的大約第96 位到大約第125位或者大約第108位到第122位氨基酸。
9. 權(quán)利要求1或2的DSCR1調(diào)控物，其中所述調(diào)控物能夠拮抗DSCR1功能。
10. 權(quán)利要求9的DSCR1調(diào)控物，其中所述調(diào)控物包括在存在于內(nèi)皮細(xì)胞中 時(shí)抑制細(xì)胞中的D S CR1活性的核酸。
11. 權(quán)利要求10的DSCR1調(diào)控物，其中所述核酸包括反義寡核香酸。
12. 權(quán)利要求10的DSCR1調(diào)控物，其中所述核酸包括抑制性/干擾性RNA。
13. 權(quán)利要求12的DSCR1調(diào)控物，其中所述抑制性/干擾性RNA是抑制性/干 護(hù)b性小RNA (siRNA)。
14. 權(quán)利要求12或13的DSCR1調(diào)控物，其中所述核酸包含選自下組的一種或 多 種 序 歹'J :GCUCAGACCUUACACAUAG 、 GGACAUCACCUUUCAGUAU 、 GAAAGAAUGAGGAGACCUA 、 GACAUCACCUUUCAGUAUU 、 AACGUAUGACAAGGACAUCAC 、 AAGGACAUCACCUUUCAGUAU 、 AAGUUAUAUUUUGCUCAGACC 和AAGAUGCGACCCCAGUCAUAA。
15. 權(quán)利要求10的DSCR1調(diào)控物，其中所述核酸包括適體。
16. 治療與異常血管炎癥有關(guān)的病癥的方法，所述方法包括對受試者施用有 效量的4又利要求1 -15任一項(xiàng)的DSCR1調(diào)控物，由此治療該病癥。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述調(diào)控物增強(qiáng)與血管系統(tǒng)有關(guān)的炎癥。
18. 權(quán)利要求16的方法，其中所述調(diào)控物抑制與血管系統(tǒng)有關(guān)的炎癥。
19. 治療與異常血管炎癥有關(guān)的免疫學(xué)病癥的方法，所述方法包括對受試者 施用有效量的權(quán)利要求1 -15任一項(xiàng)的DSCR1調(diào)控物，由此治療該病癥。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述調(diào)控物增強(qiáng)與血管系統(tǒng)有關(guān)的炎癥。
21. 權(quán)利要求19的方法，其中所述調(diào)控物抑制與血管系統(tǒng)有關(guān)的炎癥。
22. 治療與血管完整性侵?jǐn)_有關(guān)的病癥的方法，所述方法包括對受試者施用 有效量的權(quán)利要求1 -15任一項(xiàng)的DSCR1調(diào)控物，由此治療該病癥。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述血管完整性侵?jǐn)_與血管/內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)炎癥 有關(guān)。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述調(diào)控物增強(qiáng)與血管系統(tǒng)有關(guān)的炎癥。
25. 權(quán)利要求23的方法，其中所述調(diào)控物抑制與血管系統(tǒng)有關(guān)的炎癥。
26. 減輕與抗炎療法有關(guān)的副作用的方法，包括連同抗炎療法對受試者施用 權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的DSCR1調(diào)控物，由此減輕所述副作用。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述DSCR1調(diào)控物抑制內(nèi)皮細(xì)胞中的DSCR1 活性。
28. 權(quán)利要求26或27的方法，其中所述抗炎療法包括抑制炎癥的藥劑。
29. 權(quán)利要求26的方法，其中所述調(diào)控物增強(qiáng)與血管系統(tǒng)有關(guān)的炎癥。
30. 權(quán)利要求26的方法，其中所述調(diào)控物抑制與血管系統(tǒng)有關(guān)的炎癥。
31. 治療與不希望的血管發(fā)生有關(guān)的病癥的方法，所述方法包括對患有該病 癥的受試者施用抗血管發(fā)生劑和權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的DSCR1調(diào)控物。
32. 抑制紳瘤生長或癌細(xì)胞生長的方法，所述方法包括對肝瘤或癌細(xì)胞施用 有效量的抗癌劑和有效量的4又利要求1 -15任一項(xiàng)的DSCR1調(diào)控物，其中 所述組合有效量抑制腫瘤或癌細(xì)胞的生長。
33. 權(quán)利要求32的方法，其中所述抗癌劑包括抗血管發(fā)生劑。
34. 權(quán)利要求33的方法，其中所述抗血管發(fā)生劑包括VEGF拮抗劑。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中所述VEGF拮抗劑是抗VEGF抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了可用于調(diào)控血管完整性的方法和組合物。
文檔編號C07K14/47GK101175769SQ200680016324
公開日2008年5月7日 申請日期2006年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月10日
發(fā)明者漢斯-彼得·格伯, 鮑里斯·A·赫瑟 申請人:健泰科生物技術(shù)公司