專利名稱：：弱分配層析的方法弱分配層析的方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及從包括一種或多種混雜物的負載流體中回收純化的產(chǎn)物的方法。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述方法包括使負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少1mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)，并在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收純化的產(chǎn)物。在本發(fā)明的其他實施方式中，所述方法包括使負載在由至少0.1的分配系數(shù)限定的操作條件下通過介質(zhì)。
背景技術(shù)：
：在生物技術(shù)工業(yè)中，商業(yè)規(guī)模的蛋白質(zhì)純化是開發(fā)用于治療和診斷目的的重組蛋白的重要挑戰(zhàn)。與收率、純度和處理量有關(guān)的問題困擾著制造部門。隨著重組蛋白技術(shù)的出現(xiàn)，目標(biāo)蛋白質(zhì)可以使用被工程化以表達編碼蛋白質(zhì)的基因的培養(yǎng)的真核或原核宿主細胞系來生產(chǎn)。然而，從宿主細胞培養(yǎng)過程產(chǎn)生的結(jié)果是期望的蛋白質(zhì)與混雜物的混合物，所述混雜物不是來自所述蛋白質(zhì)本身，例如蛋白質(zhì)變體，就是來自宿主細胞，例如宿主細胞蛋白質(zhì)。期望的重組蛋白質(zhì)用于藥物應(yīng)用的用途視能夠從這些混雜物可靠地回收足夠水平的蛋白質(zhì)而定。常規(guī)的蛋白質(zhì)純化方法被設(shè)計以根據(jù)大小、電荷、溶解度的差異和疏水性的程度從混雜物中分離目標(biāo)蛋白質(zhì)。這些方法包括層析方法，例如親和層析、離子交換層析、尺寸排阻層析、疏水性相互作用層析、固定的金屬親和層析和羥基磷灰石層析。這些方法常常采用分離介質(zhì)，其被設(shè)計以選擇性地吸附目標(biāo)蛋白或混雜物。在結(jié)合-洗脫模式中，期望的蛋白質(zhì)選擇性地結(jié)合分離介質(zhì)，通過不同的溶劑從介質(zhì)上差別地洗脫。在流通(flow-through)模式中，混雜物特異性地結(jié)合分離介質(zhì)，而目標(biāo)蛋白質(zhì)不結(jié)合，因而容許期望的蛋白質(zhì)在"流通"中回收。用于蛋白質(zhì)，例如抗體的純化的當(dāng)前方法包括兩個或多個層析步驟。例如，蛋白質(zhì)純化方案中的第一步常常涉及親和層析步驟，其利用目標(biāo)蛋白質(zhì)和固定的捕獲試劑之間的特異性相互作用。蛋白A吸附劑對于含有Fc區(qū)域的蛋白質(zhì)，例如抗體的親和性捕獲是特別有用的。然而，使用蛋白A層析用于蛋白質(zhì)純化的缺點包括蛋白A捕獲試劑的漏出，導(dǎo)致洗脫的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的污染。此外，親和性捕獲不能從目標(biāo)蛋白質(zhì)中分離出蛋白質(zhì)變體，例如蛋白質(zhì)的聚集形式。研究人員已經(jīng)使用了結(jié)合洗脫方法、流通方法和置換方法努力來回收沒有混雜物的蛋白質(zhì)，所述混雜物產(chǎn)自培養(yǎng)過程和產(chǎn)自純化步驟本身里可能的前期步驟。在親和性捕獲步驟之后使用結(jié)合-洗脫步驟作為典型的第二步驟來純化蛋白質(zhì)的類型的實例包括美國專利4,983，722，描述了從混合物還原蛋白A的結(jié)合-洗脫離子交換方法；美國專利5,429,746,描述了從包括蛋白A混雜物的混合物中純化IgG抗體的結(jié)合-洗脫疏水性相互作用層析方法；以及美國專利5,644,036，描述了獲得純化的IgG抗體制品的三步驟過程，包括蛋白A步驟、結(jié)合-洗脫離子交換步驟和尺寸排阻步驟。其他類型在親和層析步驟之后使用流通步驟。例如，PCT公開WO04/076485描述了從通過蛋白A層析步驟純化的抗體中除去漏出的蛋白A、隨后是流通離子交換步驟的方法。PCT公開WO03/059935描述了純化樣品中的蛋白質(zhì)的方法，包括使樣品經(jīng)歷親和層析步驟之后的流通羥基磷灰石層析步驟。其他類型使用了單精煉步驟純化方案來避免與先前的純化步驟相關(guān)的難題。例如，美國專利6,177,548描述了用于從生物樣品除去聚集物的單步驟流通離子交換方法，其中樣品的pH值被調(diào)節(jié)到低于生物樣品的等電點0,2對數(shù)值(log)。美國專利5,451,662描述了單步驟結(jié)合-洗脫離子交換法，其中粗蛋白混合物的pH值被調(diào)節(jié)到要分離的蛋白質(zhì)級分的等電點范圍之間的點值。PCT公開WO05/044856描述了使用羥基磷灰石層析用于從抗體制品除去高分子量聚集物的單步驟置換方法。然而，就通過量、收率和產(chǎn)品純度的所有要求來說，現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的從結(jié)合-洗脫或流通方法都不能滿足生物技術(shù)工業(yè)的需要。在其他的因素中，結(jié)合-洗脫方法和置換方法受到用于期望蛋白質(zhì)的分離介質(zhì)的容量極限的限制。另一方面，流通方法確實比結(jié)合-洗脫方法容許更高的負載挑戰(zhàn)，但受到用于混雜物的分離介質(zhì)的容量的限制。使用流通方法，不發(fā)生產(chǎn)物與柱的實質(zhì)上的結(jié)合；任何實質(zhì)上的產(chǎn)物結(jié)合被看作消極地影響產(chǎn)物回收率。仍然需要以高處理量回收純化的蛋白質(zhì)的方法，其滿足為治療和診斷應(yīng)用所需的純度和收率的要求。此外，商業(yè)性制造過程增加了可靠的、堅實的和成本有效的純化方案的需求。發(fā)明概述本發(fā)明涉及從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的產(chǎn)物的方法，通過使負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少lmg產(chǎn)物/mL介質(zhì)，并在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收純化的產(chǎn)物。在其他實施方式中，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少5mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)，在另一個實施方式中，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少10mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。在其他實施方式中，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少20、30、40、50或60mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。本發(fā)明還涉及從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的產(chǎn)物的方法，通過使負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件由至少0.1的分配系數(shù)限定，并在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收純化的產(chǎn)物。在一個實施方式中，所述分配系數(shù)在約0.2到約20.0的范圍內(nèi)。在另一個實施方式中，所述分配系數(shù)在約0.2到約10.0的范圍內(nèi)。在另一個實施方式中，所述分配系數(shù)在約1.0到約5.0的范圍內(nèi)。在另一個實施方式中，所述分配系數(shù)在約0.5到約5.0的范圍內(nèi)。在其他的實施方式中，所述分配系數(shù)在約0.5到約1.5的范圍內(nèi)。本發(fā)明還涉及從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的產(chǎn)物的方法，通過使負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少1到約70mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)并且由0.3到20的分配系數(shù)限定，并在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收純化的產(chǎn)物。本發(fā)明還提供了在篩選步驟中鑒定操作條件，所述操作條件引起介質(zhì)結(jié)合至少lmg產(chǎn)物/mL介質(zhì)，或作為選擇，由至少0.1的分配系數(shù)限定。所述篩選步驟可以采用分批結(jié)合研究或柱結(jié)合研究，例如梯度洗脫研究或等度洗脫研究。取決于媒介的選擇，操作條件包括pH水平、離子強度、鹽濃度、賦形劑濃度(例如，磷酸鹽濃度、鈣濃度、精氨酸濃度、甘氨酸濃度和HEPES濃度)，和反配體水平(例如，咪唑濃度)。所述介質(zhì)可以是任何類型的層析樹脂或分離介質(zhì)，包括帶電離子交換介質(zhì)，例如陰離子交換介質(zhì)或陽離子交換介質(zhì)，疏水性相互作用層析樹脂、羥基磷灰石樹脂或固定的金屬親和層析樹脂?？梢允褂帽景l(fā)明回收的純化的產(chǎn)物包括融合蛋白、含有Fc的蛋白質(zhì)、免疫綴合物、細胞因子、白細胞介素、激素和治療性酶?？梢允褂帽景l(fā)明除去的混雜物包括宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、產(chǎn)物變體、內(nèi)毒素、蛋白A和病毒。在一個實施方式中，所述介質(zhì)除去負載流體中至少99.9%的混雜物，所述負載流體包括宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、產(chǎn)物變體、內(nèi)毒素和蛋白A。在另一個實施方式中，在純化的產(chǎn)物中產(chǎn)物變體的濃度不超過約2%。在其他實施方式中，所述介質(zhì)上的負載可以是至少500mg或至少1000mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)的負載挑戰(zhàn)。在本發(fā)明的一個方面，純化的產(chǎn)物從包括一種或多種混雜物的負載流體中回收，通過使所述負載流體在包括pH值水平和離子強度的操作條件下通過帶電離子交換介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少lmg產(chǎn)物/mL介質(zhì)，或作為選擇，在由至少0.1的分配系數(shù)限定的操作條件下通過帶電離子交換介質(zhì)。在本發(fā)明的另一個方面，純化的產(chǎn)物從包括一種或多種混雜物的負載流體中回收，通過使所述負載流體在包括pH值水平、離子強度和鹽濃度的操作條件下通過疏水性相互作用層析樹脂，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少1mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)，或作為選擇，在由至少0.1的分配系數(shù)限定的操作條件下通過疏水性相互作用層析樹脂。在本發(fā)明的另一個方面，純化的產(chǎn)物從包括一種或多種混雜物的負載流體中回收，通過使所述負載流體在包括pH值水平、離子強度、磷酸鹽濃度、鈣濃度、精氨酸濃度、甘氨酸濃度、HEPES濃度和咪唑濃度的操作條件下通過羥基磷灰石層析樹脂，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少1mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)，或作為選擇，在由至少0.1的分配系數(shù)限定的操作條件下通過羥基磷灰石層析樹脂。在本發(fā)明的又一個方面，純化的產(chǎn)物從包括一種或多種混雜物的負載流體中回收，通過使所述負載流體在包括反配體水平和pH值水平的操作條件下通過固定的金屬親和層析樹脂，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少1mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)，或作為選擇，在由至少O.l的分配系數(shù)限定的操作條件下通過固定的金屬親和層析樹脂。本發(fā)明的方法可以任選的組合一種或多種純化步驟?？蛇x擇的步驟可以在進行本發(fā)明的方法之前或之后進行。例如，本發(fā)明的方法可以任選的與作為起始步驟的蛋白A層析步驟組合。在本發(fā)明的一個實施方式中，使用低離子強度的洗脫緩沖液從蛋白A柱上洗脫含產(chǎn)物流體；使用中和緩沖液調(diào)節(jié)含產(chǎn)物流體的pH值和導(dǎo)電率，所述中和緩沖液產(chǎn)生所述含產(chǎn)物流體的不超過20mM的離子強度，產(chǎn)生負載流體；以及所述負載流體在本發(fā)明的操作條件下通過陰離子交換介質(zhì)。在某些實施方式中，所述洗脫緩沖液包含具有6.5-10pKa的帶電陽離子基團的分子。在其他實施方式中，所述洗脫緩沖液進一步包含具有2-5pKa的帶電陰離子基團的分子。在某些實施方式中，所述洗脫緩沖液包含是pH在7和9之間的兩性離子的分子。本發(fā)明還提供了由本發(fā)明的方法制備的純化的產(chǎn)物，包括純化的蛋白質(zhì)和抗體。本發(fā)明的其他目的和益處將在隨后的說明書中部分地闡述，在某種程度上根據(jù)說明書將變得更為明顯，或可以從本發(fā)明的實踐中習(xí)得。通過特別在附隨的權(quán)利要求中指出的元素和組合的方式，將實現(xiàn)和達到本發(fā)明的目的和益處。需要理解的是，以上的一般性說明和隨后的詳細說明都僅是示范性的和說明性的，而不是對所要求權(quán)利的本發(fā)明的限制。附隨的圖畫，合并到本說明書中并作為本說明書的一部分，與說明書一同用來解釋本發(fā)明的原理。附圖的簡要說明附圖1顯示了(A)分配系數(shù)和產(chǎn)物吸附等溫線之間的關(guān)系；以及(B)與樹脂結(jié)合的產(chǎn)物的吸附等溫線，針對三種操作模式結(jié)合-洗脫模式，弱分配模式，和流通模式。附圖2顯示了(A)離子交換層析中三種操作模式的分配區(qū)結(jié)合-洗脫模式、弱分配模式和流通模式；以及(B)在羥基磷灰石中三種操作模式的分配區(qū)。附圖3顯示了三種操作模式的示意性層析結(jié)合-洗脫模式、弱分配才莫式和流通才莫式。附圖4顯示了弱分配和流通層析之間的比較。附圖5顯示了(A)作為Kp的函數(shù)的典型的雜質(zhì)去除曲線；以及(B)作為負載挑戰(zhàn)和Kp的函數(shù)的回收率。附圖6顯示了弱分配層析步驟發(fā)展的典型進展，包括1)高處理量篩選來確定Kp,2)低負載挑戰(zhàn)運行，3)高挑戰(zhàn)容量運行，以及4)最佳的弱分配層析運行。附圖7顯示了Kpvs.pH和來自低濃度數(shù)據(jù)集的總氯化物濃度的等高線圖，如實施例l.l所描述。附圖8顯示了作為分配系數(shù)、Kp的函數(shù)的蛋白A去除，如實施例1.1所描述的。對數(shù)去除值隨Kp升高。流通模式由短劃線的方框"FT"標(biāo)出，弱分配模式由短劃線的方框"WP"標(biāo)出。附圖9顯示了logIQKpvs.pH和總氯化物濃度對數(shù)值的等高線圖，如實施例2.1所描述。附圖IO顯示了(A)對于Mab-AAB,在離子交換層析中作為Kp的函數(shù)的宿主細胞蛋白穿透曲線；以及(B)對于Mab-AAB，在離子交換層析中作為Kp的函數(shù)的蛋白A穿透。附圖ll顯示了，對于Mab-MYA，在羥基磷灰石中弱分配層析的最佳的操作范圍。這個實施例中的最佳Kp是1.5和20之間。附圖12顯示了，對于Mab-A5T4，在羥基磷灰石中弱分配層析的最佳的操作范圍。這個實施例中的最佳Kp是2和20之間。附圖13顯示了，對于Mab-MYO,在羥基磷灰石中弱分配層析的最佳的操作范圍。這個實施例中的最佳Kp是5和20之間。發(fā)明的詳細說明A.限定為了更容易地理解本發(fā)明，首先限定一些術(shù)語。其他的限定在整個詳細說明中闡述。術(shù)語"流通模式"是指一種產(chǎn)物制品分離技術(shù)，其中在制品中含有的至少一種產(chǎn)物預(yù)期流動通過層析樹脂或介質(zhì)，而至少一種可能的雜質(zhì)或混雜物與層析樹脂或介質(zhì)結(jié)合。一般地，流通模式的產(chǎn)物分配系數(shù)低于O.l，結(jié)合的產(chǎn)物濃度是<1mg/mL。"流通模式"是等度操作。術(shù)語"結(jié)合-洗脫模式"是指一種產(chǎn)物制品分離技術(shù)，其中制品中含有的至少一種產(chǎn)物與層析樹脂或介質(zhì)結(jié)合。一般地，結(jié)合-洗脫模式的產(chǎn)物分配系數(shù)大于20，結(jié)合的產(chǎn)物濃度在1-20mg/mL之間。在這種模式中結(jié)合的產(chǎn)物在洗脫階段期間被洗脫。術(shù)語"弱分配模式"是指一種產(chǎn)物制品分離技術(shù)，其中制品中含有的至少一種產(chǎn)物以及至少一種雜質(zhì)或混雜物，都與層析樹脂或介質(zhì)結(jié)合。在弱分配模式中產(chǎn)物的結(jié)合是至少1mg產(chǎn)物/mL層析樹脂或介質(zhì)。一般地，弱分配模式的產(chǎn)物分配系數(shù)是至少0.1。"弱分配模式"是等度操作。術(shù)語"分配系數(shù)"(Kp)是指在特定的pH值和溶液組成條件下吸附到樹脂上的產(chǎn)物濃度(Q)與溶液中的產(chǎn)物濃度(c)的平衡比。分配系數(shù)Kp還與如附圖1所示的產(chǎn)物吸附等溫線相關(guān)。分配系數(shù)Kp相應(yīng)于極低溶液濃度下產(chǎn)物吸附等溫線的斜率。它與最大容量相關(guān)，如下其中Qmax是用于產(chǎn)物的樹脂的最大容量，kd是"樹脂-產(chǎn)物"相互作用的離解常數(shù)。分配系數(shù)一般使用分批結(jié)合技術(shù)來測量，但是也可以使用其他技術(shù)，例如等度層析。術(shù)語"結(jié)合的產(chǎn)物"(Q)是指當(dāng)在料流中平衡時與樹脂結(jié)合的產(chǎn)物量。術(shù)語"抗體"是指任何免疫球蛋白或其片段，并且涵蓋任何包含抗原結(jié)合位點的多肽。這個術(shù)語包括，但不限于，多克隆的、單克隆的、單特異性的、多特異性的、非特異性的、人源化的、人類的、單鏈的、嵌合的、合成的、重組的、雜交的、突變的、移植的和體外產(chǎn)生的抗體。術(shù)語"抗體，，還包括抗體片段，例如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和保持了抗原結(jié)合功能的其他抗體片^a。一船:地，這種片段將包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述抗體是包含Ch2/Ch3區(qū)域并因而能由蛋白A層析純化的抗體。術(shù)語"CH2/CH3區(qū)域"是指在免疫球蛋白分子Fc區(qū)域中與蛋白A相互作用的那些氨基酸殘基。在某些實施方式中，(^2/(^3區(qū)域包括完整的CH2區(qū)域和隨后的完整Ch3區(qū)域，在其他實施方式中，包括免疫球蛋白的Fc區(qū)。含有Ch2/Ch區(qū)域的蛋白質(zhì)的實例包括抗體、免疫粘附素以及包含與CH2/CH3區(qū)域融合或綴合的目標(biāo)蛋白質(zhì)的融合蛋白。術(shù)語"負載"是指任何含有產(chǎn)物的負載材料，所述產(chǎn)物來源于澄清的細胞培養(yǎng)物或發(fā)酵條件培養(yǎng)基，或來自層析步驟的部分純化的中間物。術(shù)語"負載流體，，是指含有負載材料的流體，用于在本發(fā)明的操作條件下通過介質(zhì)。術(shù)語"混雜物"是指除了目標(biāo)蛋白質(zhì)以外、也存在于要純化目標(biāo)蛋白質(zhì)的樣品中的任何外源的或不需要的分子，包括生物學(xué)大分子，例如DNA、RNA或蛋白質(zhì)?；祀s物包括，例如，蛋白質(zhì)變體，如聚集的蛋白質(zhì)，高分子量種類、低分子量種類和片段，以及脫酰氨基的種類；來自分泌要純化的蛋白質(zhì)(宿主細胞蛋白質(zhì))的宿主細胞的其他蛋白質(zhì)；作為用于親和層析的吸附劑的部分、在先前的純化步驟期間可能漏出到樣品中的蛋白質(zhì)，例如蛋白A;內(nèi)毒素；以及病毒。術(shù)語"基本上等度的洗滌"是指就組成或pH值而言僅稍微不同于負載流體的溶液。術(shù)語"柱流出物"是指在負載循環(huán)期間、或在施加負載的期間流出介質(zhì)或柱的液體。術(shù)語"負載挑戰(zhàn)"是指按照每單位體積樹脂的產(chǎn)物的質(zhì)量單位來測量的、在層析步驟的負載循環(huán)中負載到柱上的、或在分批結(jié)合中施加到樹脂上的產(chǎn)物的總質(zhì)量。術(shù)語"對數(shù)去除值"(LRV)是指純化步驟中負載中的混雜物質(zhì)量與產(chǎn)物庫中混雜物質(zhì)量的比例的對數(shù)(底數(shù)io)。術(shù)語"等度層析"是指使用在目標(biāo)時期期間不改變強度(strength)的溶劑的層析柱的操作。B.方法的i兌明本發(fā)明提供了從含有一種或多種混雜物的負載流體中回收純化的產(chǎn)物的方法。本發(fā)明應(yīng)用于治療和診斷目的的蛋白質(zhì)的大規(guī)模制備。1.弱分配模式申請人:令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過按照處于常規(guī)的結(jié)合-洗脫和流通層析模式之間區(qū)域的一種層析模式操作，可以獲得高度的混雜物降低以及高產(chǎn)物負載挑戰(zhàn)和產(chǎn)物回收。申請人將這種中間的產(chǎn)物結(jié)合模式命名為"弱分配模式"。在弱分配模式中，含有目標(biāo)產(chǎn)物和一種或多種混雜物的負載流體通過層析介質(zhì)，產(chǎn)物和混雜物都與介質(zhì)結(jié)合。然而，與產(chǎn)物相比，混雜物與介質(zhì)更緊密地結(jié)合，隨著負載的繼續(xù)，未結(jié)合的產(chǎn)物通過介質(zhì)，并在柱流出物中被回收。任選的，介質(zhì)隨后在等度條件下洗滌來從介質(zhì)回收其他弱結(jié)合的產(chǎn)物，來自任何基本上等度洗滌的純化產(chǎn)物與在負載循環(huán)期間來自柱流出物的純化產(chǎn)物集中在一起。根據(jù)本發(fā)明，弱分配模式由操作條件限定，其使所述介質(zhì)結(jié)合至少lmg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。在一個實施方式中，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少5mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。在另一個實施方式中，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少10mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。在另一個實施方式中，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少20mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。在本發(fā)明的某些實施方式中，結(jié)合到介質(zhì)是的總產(chǎn)物質(zhì)量是負載到介質(zhì)上的總產(chǎn)物質(zhì)量的至少10%。在某些實施方式中，結(jié)合到介質(zhì)上的總產(chǎn)物質(zhì)量是負載到介質(zhì)上的總產(chǎn)物質(zhì)量的至少20%。在其他實施方式中，結(jié)合到介質(zhì)上的總產(chǎn)物質(zhì)量是負載到介質(zhì)上的總產(chǎn)物質(zhì)量的至少30%。根據(jù)本發(fā)明，弱分配模式還由至少0.1的分配系數(shù)限定。在某些實施方式中，在弱分配模式下操作包括在由約0.2到約20.0的范圍內(nèi)的分配系數(shù)限定的條件下操作。在某些實施方式中，在弱分配模式下操作包括在由約0.2到約10.0的范圍內(nèi)的分配系數(shù)限定的條件下操作。在其他實施方式中，在弱分配模式下操作包括在由約1.0到約5.0的范圍內(nèi)的分配系數(shù)限定的條件下操作。在其他實施方式中，在弱分配模式下操作包括在由約0.5到約5.0的范圍內(nèi)的分配系數(shù)限定的條件下操作。在又一個實施方式中，在弱分配模式下操作包括在由約0.5到約1.5的范圍內(nèi)的分配系數(shù)限定的條件下操作。在本發(fā)明的至少一個實施方式中，提供了弱分配模式操作條件，其使得所述介質(zhì)結(jié)合至少1到約70mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)，并且其由0.3到20的分配系數(shù)限定。附圖1顯示了結(jié)合-洗脫、流通和弱分配模式的產(chǎn)物吸附等溫線，與結(jié)合-洗脫和流通模式相比，弱分配模式的產(chǎn)物結(jié)合清楚地居于中間。由于產(chǎn)物分配系數(shù)(Kp)的值是吸附的產(chǎn)物濃度與溶液中的產(chǎn)物濃度的比值，弱分配模式的Kp值也處于結(jié)合-洗脫和流通模式的值之間。附圖2A描繪了作為離子強度的函數(shù)的結(jié)合-洗脫、弱分配和流通模式的分配區(qū)域，顯示了Kimp在弱分配模式中高于流通模式中。在弱分配模式的更嚴格的結(jié)合條件下，可以實現(xiàn)比流通模式更高的產(chǎn)物容量，而混雜物更強烈地結(jié)合，并且高于結(jié)合-洗脫模式，而與混雜物相比產(chǎn)物結(jié)合非常微弱，并且不占用大部分的樹脂容量。在更嚴格的結(jié)合條件下混雜物分配系數(shù)(Kimp)更高，與流通模式的產(chǎn)物庫相比，在弱分配模式的產(chǎn)物庫中產(chǎn)生更低濃度的殘余混雜物。作為磷酸鹽和NaCl濃度的函數(shù)的、羥基磷灰石中的流通、弱分配和結(jié)合-洗脫區(qū)域在附圖2B中示出。表A概況了三種結(jié)合模式結(jié)合-洗脫(B-E)、弱分配(WP)和流通(FT)之間的特征差異。表AFT/WP/B-E模式的特征<table>complextableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>弱分配模式也可以在它們的層析語上不同于結(jié)合-洗脫和流通模式，如附圖3所示。首先，流通和弱分配模式的層析語看起來相當(dāng)類似，產(chǎn)物在等度條件下在柱流出物和洗滌餾分中回收。然而，精細的、但重要的區(qū)別存在于層析鐠中，其可以用于區(qū)分這些模式，如附圖4所示。與流通模式相比，弱分配模式的起始穿透曲線中存在延遲(〉0.1柱體積或CV)。在弱分配模式中存在更慢的沖洗曲線。可以存在含有產(chǎn)物的小的列帶(strip)峰(其相應(yīng)于洗滌階段之后仍然結(jié)合10-50%負載產(chǎn)物濃度的樹脂)，其可以通過在負載循環(huán)期間回收柱流出物之后在等度條件下在負載之后施加1-5CV的洗滌來從樹脂中回收。附圖5A顯示了各種水平的產(chǎn)物分配系數(shù)值的雜質(zhì)LRV中的一般趨勢。雜質(zhì)LRV在相應(yīng)于流通操作的Kp條件下是相對低的。在提高Kp的條件下的操作在雜質(zhì)穿透之前顯著地提高柱流出物級分中的LRV。如實施例所示，與相應(yīng)于標(biāo)準的流通條件的那些相比，更高Kp值下的操作改善了雜質(zhì)LRV多達2對數(shù)值。提高Kp—般增加了與樹脂結(jié)合的產(chǎn)物以及雜質(zhì)。在較高Kp下雜質(zhì)的更強結(jié)合導(dǎo)致雜質(zhì)穿透之前柱流出物級分中更大的200680016391.X說明書第12/53頁LRV。然而，在雜質(zhì)穿透點處的負載挑戰(zhàn)隨著Kp提高而降低，因為產(chǎn)物開始與雜質(zhì)竟?fàn)帢渲系慕Y(jié)合位點，如附圖5A中高Kp曲線所示意性表示的。因而，弱分配區(qū)域相應(yīng)于操作范圍，其為給定的分離平衡了雜質(zhì)LRV的改善和柱容量需求。弱分配層析的Kp上限還取決于如附圖5B所示的柱負載挑戰(zhàn)。在流通條件的邊界值處，分配系數(shù)對于產(chǎn)物回收率沒有影響。在高Kp值處產(chǎn)物回收率開始降低，此時等度洗滌條件在以合理的洗滌體積數(shù)從柱上洗下結(jié)合的產(chǎn)物方面不是有效的。由于無效沖洗的產(chǎn)物損失程度對于負載挑戰(zhàn)以及負載中雜質(zhì)的性質(zhì)和比例是敏感的。因而，WP區(qū)域的下限由雜質(zhì)去除的需求決定，而給定的負載挑戰(zhàn)的上限由產(chǎn)物回收率或容量的約束決定。在本發(fā)明的一個或多個實施方式中，最佳的弱分配條件可以使用以下的實驗系列來鑒定，如附圖6所示(i)進行HTS篩選(或標(biāo)準的分批結(jié)合實驗)來確定作為操作條件的函數(shù)的產(chǎn)物分配系數(shù)Kp。從這些實驗鑒定相應(yīng)于弱分配區(qū)域(0.1<Kp<20)的操作范圍。(ii)優(yōu)選的，在鑒定弱分配區(qū)域之后，可以以同用于標(biāo)準流通操作類似的負載挑戰(zhàn)(大約50mg/mL)在小規(guī)模柱上進行探測運行。根據(jù)來自這些實驗的雜質(zhì)去除和產(chǎn)物回收值可以進一步精調(diào)弱分配操作范圍。(iii)更優(yōu)選的，然后可以為弱分配區(qū)域內(nèi)的少數(shù)Kp條件產(chǎn)生雜質(zhì)穿透數(shù)據(jù)。根據(jù)這些結(jié)果，選擇弱分配區(qū)域中的最佳分配系數(shù)，其以可接受的負載挑戰(zhàn)提供了最高的雜質(zhì)去除。(iv)然后可以在最佳Kp條件下最優(yōu)選地進行弱分配層析運行，并進一步按需要來精調(diào)負載挑戰(zhàn)和洗滌體積以獲得最佳的回收和雜質(zhì)去除。確定弱分配層析^驟，其以相比;示準流通或結(jié)合/洗""脫模式的柱操作相當(dāng)?shù)幕蚋叩呢撦d挑戰(zhàn)提供了增強的雜質(zhì)去除。以上討論的一般性框架，如果有的話，具有細微的調(diào)整，可以用于開發(fā)離子交換、疏水性相互作用、羥基磷灰石或組合了這些相互作用中的任一或所有元素的多模式系統(tǒng)中的純化步驟。2.分離技術(shù)弱分配模式可以與任何用于從混雜物分離產(chǎn)物的層析樹脂或介質(zhì)組合使用。在一個實施方式中，所述介質(zhì)是帶電離子交換介質(zhì)。離子交換是一種根據(jù)凈電荷來分離的層析形式。作為目標(biāo)帶電產(chǎn)物和平衡離子之間對離子交換介質(zhì)上的帶相反電荷的配體基團竟?fàn)幍慕Y(jié)果，發(fā)生分子的分離。在產(chǎn)物和離子交換介質(zhì)之間的結(jié)合相互作用取決于產(chǎn)物的凈電荷。凈電荷取決于pH值和介質(zhì)的離子強度，其影響目標(biāo)產(chǎn)物分子的暴露表面上的氨基酸和其他成分的不同電荷性質(zhì)。可以用于本發(fā)明的離子交換樹脂包括陰離子交換樹脂和陽離子交換樹脂。陰離子交換樹脂可以采用取代基，例如二乙氨基乙基(DEAE)、三曱基氨基乙基(TMAE)、季氨乙基(QAE)和季胺(Q)基團。陽離子交換可以采用取代基，例如羧曱基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸根(P)和磺酸根(S)。纖維素離子交換樹脂，例如DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32和CM-52可以/人WhatmanLtd.Maidstone、Kent、U.K獲4尋?；赟ephadex的禾口交聯(lián)的離子交換劑也是已知的。例如，DEAE-、QAE-、CM-和SP-Sephadex，以及DEAE-、Q-、CM-和S-Sepharose，以及S印harose都可以從AmershamBiosciences,Piscataway,NJ獲得。進一步的,DEAE和CM衍生的乙二醇-異丁烯酸酯共聚物，例如TOYOPEARLDEAE-650S或M以及TOYOPEARLCM-650S或M可以從TosoHaasCo.,Philadelphia,PA獲得。在本發(fā)明的某些實施方式中，弱分配模式與疏水性相互作用層析(HIC)樹脂使用用于產(chǎn)物純化。HIC是根據(jù)疏水性來分離分子的技術(shù)。一般地，高鹽緩沖液中的樣品分子被負載到HIC樹脂上。緩沖液中的鹽與水分子相互作用來降低分子在溶液中的溶解，從而暴露樣品分子中的疏水性區(qū)域，其因而由HIC介質(zhì)吸附。分子的疏水性越高，需要越少的鹽來促進結(jié)合。在產(chǎn)物分子和HIC介質(zhì)之間的結(jié)合相互作用因而取決于一些條件，例如介質(zhì)的pH值、離子強度和鹽濃度?？梢杂糜诒景l(fā)明的各種商業(yè)上可獲得的HIC樹脂包括包含連結(jié)了疏水性配體(例如，烷基或芳基基團)的基礎(chǔ)基質(zhì)(例如，交聯(lián)的瓊脂糖或合成的共聚材料)的樹脂。實例包括PhenylSEPHAROSE6FASTFLOW(PharmaciaLKBBiotechnology,AB,Sweden);PhenylSEPHAROSEHighPerformance(PharmaciaLKBBiotechnology、AB，Sweden);OctylSEPHAROSEHighPerformance(PharmaciaLKBBiotechnology、AB，Sweden);FractogelEMDPropyl或FRACTOGELEMDPhenyl(E.Merck、Germany);MACRO-PREPTMMethyl或MACRO-PREPt-ButylSupports(Bio-Rad、CA);WPHI畫Propyl(C3)TM(J.T.Baker、NJ);以及TOYOPEARL醚、苯基或丁基(TosoHaas、PA)。在本發(fā)明的其他實施方式中，弱分配模式與羥基磷灰石層析使用用于產(chǎn)物純化。羥基磷灰石層析是一種技術(shù)，其利用了式[Ca,。(P04)6(OH)2]的不溶的羥基化的磷酸鈣作為基質(zhì)和配體。功能基團由帶正電的鈣離子對(C-位點)和帶負電的磷酸根基團的簇(P-位點)組成。產(chǎn)物和羥基磷灰石介質(zhì)之間的結(jié)合相互作用取決于一些條件，例如介質(zhì)的pH值、離子強度和賦形劑濃度，例如磷酸根濃度、鈣濃度、精氨酸濃度、甘氨酸濃度和HEPES濃度。各種羥基磷灰石層析樹脂是商業(yè)上可獲得的，可以用于本發(fā)明。在本發(fā)明的進一步的實施方式中，弱分配模式與固定的金屬親和層析(IMAC)樹脂使用用于產(chǎn)物純化。IMAC是基于固定在樹脂上的螯合的過渡金屬離子與標(biāo)靶的目標(biāo)產(chǎn)物上組氨酸殘基的咪唑側(cè)鏈之間的相互作用。作為標(biāo)靶的目標(biāo)產(chǎn)物和IMAC樹脂上金屬基團的反配體之間的竟?fàn)幍慕Y(jié)果，發(fā)生了分子的分離。在產(chǎn)物和帶有金屬的IMAC介質(zhì)之間結(jié)合相互作用取決于一些條件，例如介質(zhì)的反配體水平，例如咪唑濃度，以及離子強度。各種IMAC樹脂是商業(yè)上可獲得的，可以用于本發(fā)明。3.用于純化的產(chǎn)物本發(fā)明可以用于各種目標(biāo)產(chǎn)物的大規(guī)模純化，包括天然出現(xiàn)的蛋白質(zhì)、融合蛋白、含有Fc的蛋白質(zhì)、免疫綴合物、細胞因子、白細胞介素、激素和治療性酶。在一個實施方式中，經(jīng)歷純化的蛋白質(zhì)可以包括一個或多個恒定抗體免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中，蛋白質(zhì)還可以包含單或多可變抗體免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方式中，含有Fc的蛋白質(zhì)可以包含抗體。蛋白質(zhì)可以來自各種來源，包括培養(yǎng)的重組原核或真核宿主細胞系。本發(fā)明的抗體制品可以從許多來源分離，包括但不限于，免疫動物的血清、腹腔積液、雜交或骨髓瘤上清液、來自培養(yǎng)表達抗體分子的重組細胞的或來自抗體生產(chǎn)細胞的所有細胞提取物的條件培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個實施方式中，純化來自多種抗體生產(chǎn)重組細胞系的條件細胞培養(yǎng)基的抗體。雖然可以預(yù)期在各種的抗體產(chǎn)物之中存在細胞系與細胞系的一些偏差，根據(jù)在此公開的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)的是調(diào)整此處的發(fā)明來適合特定的抗體蛋白質(zhì)和生產(chǎn)細胞系組合。僅為了說明的目的，本發(fā)明被用于IgG同種型的幾種抗體的純化。更具體地，本發(fā)明被用于人源化的抗A(3單克隆抗體、抗GDF8抗體和人源化的抗-IL-13單克隆抗體的純化。4.負載條件和容量在將含有產(chǎn)物和混雜物的流體負載到介質(zhì)上之前，可能必需的是通過找到引起介質(zhì)結(jié)合至少1mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)的操作條件來鑒定弱分配的區(qū)域。在一個實施方式中，發(fā)現(xiàn)的所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少5mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。在另一個實施方式中，發(fā)現(xiàn)的所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少10mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。在其他實施方式中，發(fā)現(xiàn)的所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少20mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。做為選擇，通過找到由至少O，l的分配系數(shù)限定的操作條件來鑒定弱分配區(qū)域。在某些實施方式中，發(fā)現(xiàn)的操作條件是由約0.2到約20.0的范圍內(nèi)的分配系數(shù)限定的。在其他實施方式中，發(fā)現(xiàn)的操作條件是由約0.2到約IO.O的范圍內(nèi)的分配系數(shù)限定的。在又一個實施方式中，發(fā)現(xiàn)的操作條件是由約1.0到約5.0的范圍內(nèi)、約0.5到約5.0的范圍內(nèi)或約0.5到約1.5的范圍內(nèi)的分配系數(shù)限定的。在其他實施方式中，所述弱分配區(qū)域是通過找到使得所述介質(zhì)結(jié)合至少l到約70mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)、并且由0.3到20的分配系數(shù)所限定的操作條件來鑒定的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，合適的操作條件將取決于為純化產(chǎn)品所選擇的介質(zhì)的選擇。在某些實施方式中，操作條件包括pH值水平和離子強度。在其他實施方式中，操作條件進一步包括鹽濃度。在又一個實施方式中，操作條件進一步包括賦形劑水平，例如磷酸鹽濃度和鈣濃度。在某些實施方式中，所述操作條件包括反配體水平，例如咪唑濃度，以及pH值水平。篩選步驟可以用來鑒定弱分配模式的操作條件。這種篩選步驟可以包括分批結(jié)合研究或柱結(jié)合研究。柱結(jié)合研究可以包括梯度洗脫研究或等度洗脫研究。例如，本領(lǐng)域:汰術(shù)人員可以確定哪種緩沖液或鹽適合于要純化的特定蛋白質(zhì)以及要鑒定的操作條件。然后，所選擇的援沖液或鹽的最佳濃度可以通過，例如，使選擇的緩沖液或鹽的梯度運動通過已經(jīng)施加了包含要純化的產(chǎn)物和混雜物的負載流體的柱來確定。可以收集和分析柱的流出物的級分，來確定緩沖液或鹽的濃度，在該濃度下產(chǎn)物結(jié)合是至少1mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)，或作為選擇，在該濃度下產(chǎn)物的分配系數(shù)是至少0.1。在本發(fā)明的某些實施方式中，在分批結(jié)合實驗中使用三到六的相比例(液體的體積比樹脂的體積)，測量1和10mg/mL負載挑戰(zhàn)之間的分配系數(shù)?！┐_定了操作條件，可以相應(yīng)地調(diào)節(jié)負載流體和/或介質(zhì)的條件。例如，可以通過用溶液洗滌介質(zhì)來將介質(zhì)平衡，所述溶液將使得所述介質(zhì)達到弱分配模式的必要操作條件。在弱分配模式的準備中，負載流體也可以是被交換成合適的緩沖液或負載緩沖液的緩沖液。負載緩沖液可以是與平衡緩沖液相同或不同的緩沖液。在一個實施方式中，負載流體的離子強度不超過100mM。在另一個實施方式中，負載流體的離子強度不超過50mM。在其他實施方式中，負載流體的離子強度不超過25mM。在又一個實施方式中，負載流體的離子強度不超過10mM。負載流體可以通過分離介質(zhì)，所述分離介質(zhì)被填充在床柱中、填充在含有固相基質(zhì)的流化/膨脹床柱中，和/或以分批形式，其中固相基質(zhì)與負載流體混合一定時間。在負載流體通過所述介質(zhì)之后，任選的用一定體積的基本上等度的洗液來沖洗介質(zhì)。純化的產(chǎn)物可以從任何基本上等度的洗液獲得，并與負載循環(huán)期間來自柱流出物的純化的產(chǎn)物集中。在任選的洗滌步驟之后，介質(zhì)可以任選的被脫除'并再生。這個步驟一般有規(guī)律地進行，用以最小化混雜物在固相的表面上的積累，和/或用以滅菌介質(zhì)來避免微生物對產(chǎn)物的污染。使用弱分配模式，高負載濃度和負載體積是可能的。在一個實施方式中，負載流體中產(chǎn)物的濃度是至少1mg產(chǎn)物/mL負載流體，在另一個實施方式中，負載流體中的產(chǎn)物濃度是至少5mg個產(chǎn)物/mL負載流體，在另一個實施方式中，至少50mg產(chǎn)物/mL負載流體，在另一個實施方式中，至少100mg產(chǎn)物/mL負載流體。純化的產(chǎn)物可以從至多50CV的通過介質(zhì)的負載流體中回收。使用弱分配模式，高負載挑戰(zhàn)也是可能的。在一個實施方式中，介質(zhì)上的負載可以是至少10mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)的負載挑戰(zhàn)。在其他實施方式中，介質(zhì)上的產(chǎn)物負載可以是至少50mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。在某些實施方式中，介質(zhì)上的產(chǎn)物負載可以是至少100mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。在其他實施方式中，介質(zhì)上的負載可以是至少500mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)的負載挑戰(zhàn)。在又一個實施方式中，介質(zhì)上的負載可以是至少1000mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)的負載挑戰(zhàn)。5.混雜物的去除弱分配模式已經(jīng)顯示了對于從產(chǎn)物制品除去所有種類的混雜物是有用的，包括宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、產(chǎn)物變體，包括聚集的產(chǎn)品和高分子量種類，內(nèi)毒素、病毒、和來自先前的純化步驟的蛋白A雜質(zhì)。在本發(fā)明的一個實施方式中，在純化的產(chǎn)物的存在的宿主細胞蛋白質(zhì)的濃度是不超過約500ng宿主細胞蛋白質(zhì)/mg產(chǎn)物。在其他實施方式中，宿主細胞蛋白質(zhì)的濃度可以被降低到不超過250ng/mg產(chǎn)物，在其他實施方式中，降低到不超過IOOng/mg產(chǎn)物。在某些實施方式中，宿主細胞蛋白質(zhì)的對數(shù)去除值是至少1.0,在其他實施方式中，宿主細胞蛋白質(zhì)的對數(shù)去除值是至少2.0，在其他實施方式中，宿主細胞蛋白質(zhì)的對數(shù)去除值是至少3.0。在本發(fā)明的一個實施方式中，在純化的產(chǎn)物的蛋白A的濃度是不超過約100ng蛋白A/mg產(chǎn)物。在某些實施方式中，蛋白A的濃度可以被降低到不超過50ng/mg產(chǎn)物，在其他實施方式中，降低到不超過10ng/mg產(chǎn)物。在某些實施方式中，蛋白A的對數(shù)去除值是至少1.0,在其他實施方式中，蛋白A的對數(shù)去除值是至少2.0，在其他實施方式中，蛋白A的對數(shù)去除值是至少3.0。在本發(fā)明另一個實施方式中，從純化的產(chǎn)物中除去病毒混雜物。在某些實施方式中，病毒的對數(shù)去除值是大于1.0,在其他實施方式中，大于2.0，在其他實施方式中，大于3.0。在本發(fā)明的某些實施方式中，從純化的產(chǎn)物除去核酸混雜物。在某些實施方式中，在純化的產(chǎn)物中存在的核酸的數(shù)量可以被降低到不超過1ng核酸/mg產(chǎn)物。在其他實施方式中，在純化的產(chǎn)物中蛋白質(zhì)變體的濃度是不超過約10%。在某些實施方式中，蛋白質(zhì)變體的濃度被降低到不超過約5%,在某些實施方式中，降低到不超過2%,在某些實施方式中，降低到不超過0.5%。在弱分配模式的嚴格結(jié)合條件下，分離介質(zhì)除去至少90%的宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)變體、內(nèi)毒素和蛋白A混雜物。在某些實施方式中，所述介質(zhì)除去至少99%的混雜物，在其他實施方式中，所述介質(zhì)除去至少99.9%的混雜物。6.其他的可選4奪的步驟本發(fā)明的純化方法可以與其他蛋白質(zhì)純化步驟組合使用。在本發(fā)明的一個實施方式中，在弱分配步驟之前的一個或多個步驟可能是期望的，以降低負載挑戰(zhàn)。在本發(fā)明的其他實施方式中，在弱分配步驟之后的一個或多個純化步驟可能是期望的，以除去其他的雜質(zhì)或混雜物。所描述的弱分配純化步驟可以任選的與其他純化步驟組合，包括但不限于，蛋白A層析、親和層析、疏水性相互作用層析、固定的金屬親和層析、尺寸排阻層析、滲濾、超濾、病毒去除過濾和/或離子交換層析。在弱分配步驟之前和/或之后的可選擇的純化步驟也可以以弱分配模式，或以其他模式，例如結(jié)合-洗脫模式或流通模式來操作。在一個實施方式中，在弱分配純化步驟之前，收獲物介質(zhì)可以任選的通過蛋白A層析步驟初步純化。例如，可以采用PROSEP-A(Millipore、U.K.),其由與受控有孔玻璃共價連結(jié)的蛋白A組成。其他有用的蛋白A制劑包括蛋白ASepharoseFASTFLOW(AmershamBiosciences,Piscataway、NI)、TOYOPEARL650M蛋白A(TosoHaasCo.、Philadelphia,PA)和MABSELECTtm柱(AmershamBiosciences、Piscataway、NJ)。7.在串聯(lián)的蛋白A層析和離子交換層析中使用的兩性離子緩沖液在某些實施方式中，使用低離子強度的洗脫緩沖液從蛋白A柱上洗脫含產(chǎn)物流體。然后使用中和緩沖液調(diào)節(jié)含產(chǎn)物流體的pH值和導(dǎo)電率，所述中和緩沖液產(chǎn)生不超過20mM的離子強度的所述含產(chǎn)物流體。產(chǎn)生的負載流體然后通過在弱分配模式的條件下操作的陰離子交換介質(zhì)或羥基磷灰石介質(zhì)。在某些實施方式中，所述負載流體通過陰離子交換介質(zhì)而不需要滲濾。在某些實施方式中，使用中和緩沖液來調(diào)節(jié)含產(chǎn)物流體的pH值和導(dǎo)電率，所述中和緩沖液產(chǎn)生不超過40mM的離子強度的所述含產(chǎn)物流體。在其他實施方式中，使用中和緩沖液來調(diào)節(jié)含產(chǎn)物流體的pH值和導(dǎo)電率，所述中和緩沖液產(chǎn)生不超過60mM的離子強度的所述含產(chǎn)物流體。在又一個實施方式中，使用中和緩沖液來調(diào)節(jié)含產(chǎn)物流體的pH值和導(dǎo)電率，所述中和緩沖液產(chǎn)生不超過80mM的離子強度的所述含產(chǎn)物流體?？捎糜趶牡鞍譇柱上的洗脫的緩沖液包括一些緩沖液，其包含具有pKa2-5的帶電陰離子基團的分子。這種洗脫緩沖液可以進一步包含具有6.5-10的pKa的帶電陽離子基團的分子。在一個實施方式中，所述洗脫緩沖液包含pH值在4和9之間的兩性離子的分子，例如甘氨酸；1，4-哌溱二-(乙烷磺酸)；雙甘氨肽；環(huán)戊烷四-1,2,3,4-羧酸；N，N-二(2-羥乙基)-2-氨基乙烷磺酸；2-(N-嗎啉代)丙烷-磺酸；N-三(羥曱基)甲基-2-氨基乙烷磺酸；N-2-羥基乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸；4-(2-羥乙基)-I-哌溱丙烷磺酸；N-三(羥曱基)曱基甘氨酸；甘氨酰胺；N,N-二(2-羥乙基)甘氨酸；N-三(羥曱基)甲基-2-氨基丙烷磺酸；或N-甘氨酰-甘氨酸。使用兩性離子緩沖液洗脫蛋白A柱提供了在一定程度的中和時的低離子強度益處。緩沖液的低離子強度不會不利地影響隨后的離子交換柱，包括羥基磷灰石柱的操作。高水平的離子強度將降低混雜物與離子交換柱的結(jié)合，其可能降低純化的總效率。更低離子強度的溶液對于在離子交換柱上的負載是優(yōu)選的，因為離子強度可以通過添加濃縮的鹽溶液來容易地提高；降低溶液的離子強度是不容易的。令人驚訝地，存在著一些緩沖液，所述緩沖液具有低pKa，其容許使用在蛋白A洗脫步驟中有用的低pH值水平，但也具有第二pKa，其容許使用在離子交換層析中有用的更高的pH值水平；如果在適合的第二pH值下使用，這些緩沖液在蛋白A步驟之后的離子交換步驟的操作期間具有極少的有效電荷。具有與優(yōu)選用于蛋白A的洗脫pH值相近的pKa的兩性離子緩沖液(在pH2和5之間，優(yōu)選的在2.5和4.0之間)容許該緩沖液被使用來維持pH值接近緩沖液的pl并且用來洗脫柱。還具有接近隨后的離子交換柱的操作的(pH5.5到11)的pKa的兩性離子緩沖液將容許緩沖液將pH值控制在這個pH范圍內(nèi)，以及控制在蛋白A洗脫pH值范圍內(nèi)。使用單個化合物用于在低pH值洗脫蛋白A柱以及用于維持在離子交換層析中有用的較高pH值，簡化了兩個步驟的操作，并且也簡化了中和之后產(chǎn)物庫的組成。在本發(fā)明的進一步的實施方式中，具有pKal和pKa2的兩性離子緩沖液可以在pKal的一個pH單位內(nèi)的pH值水平下洗脫蛋白A柱。進一步的，如果蛋白A庫使用兩性離子緩沖液的堿性溶液中和到pKa2的一個pH單位內(nèi)的第二pH值，兩性離子緩沖液將能夠維持該溶液的pH值。如果第二pH值低于pKa2的，緩沖液保持了兩性離子性，并且為溶液的總離子強度做出極少貢獻。例如，濃度x的兩性離子緩沖液在pH等于pKa2將僅貢獻總離子強度x/2。濃度x的兩性離子緩沖液在該緩沖液pKa2以下一個pH單位將具有x的十分之一的離子強度。這種離子強度的降低對于離子交換層析的操作是非常有用的。具有對于蛋白A柱的洗脫有用的pKal以及對于離子交換層析的操作有用的pKa2的緩沖液的存在不是顯而易見的，因為通常沒有報道這些緩沖液的pKal。緩沖液通常在靠近pKa2的pH值水平下使用，層析領(lǐng)域的技術(shù)人員不知道對于蛋白A柱的洗脫是有用的。進一步的，雖然這些緩沖液用于蛋白A層析柱洗脫的實用性沒有被普遍認識到，但是同樣沒有認識到的是，這些兩性離子緩沖液將具有作為用于蛋白A柱之后的離子交換柱緩沖液的其他實用性，因為它們?yōu)橹泻偷牡鞍譇庫貢獻了較少的離子強度。C.實施例以下實施例僅為了說明性的目的來提供。實施例提供了使用三種不同單克隆抗體的三種層析模式(陰離子交換、疏水性相互作用和羥基磷灰石)。描述了四個獨立的實驗系列，各自代表了不同的層析模式和要純化的單克隆抗體的配對。首先呈現(xiàn)了初步篩選研究，其確定了在各種溶液條件下的分配系數(shù)和/或與樹脂結(jié)合的產(chǎn)物濃度，因而確定了弱分配(WP)和流通(FT)模式的操作區(qū)域。然后使用關(guān)于產(chǎn)物回收率和混雜物去除的數(shù)據(jù)概述了幾項柱研究。產(chǎn)物回收率對于WP柱運行是非常好的，與相應(yīng)的FT研究中的相比混雜物水平更低。與FT研究相比，對樹脂使用了更高的負載挑戰(zhàn)來進行WP運行。使用蛋白A酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來測量測試樣品中的蛋白A殘留物的水平。使用分析性尺寸排阻層析(SEC)分析來測量高分子量聚集物的數(shù)量。使用HCPELISA來測量宿主細胞蛋白質(zhì)(HCP)的水平。所有的篩選和柱研究在室溫下進行。系列1-使用TMAE-HiCap(M)的陰離子交換和Mab-AAB實施例1.1高處理量篩選來確定WP和FT條件進行高處理量篩選(HTS)來鑒定使用TMAE-HiCap(M)介質(zhì)對于Mab-AAB的弱分配和流通條件。這種篩選改變氯化鈉的濃度和pH值來確定它們對MAB-AAB的結(jié)合程度的影響以及步驟相關(guān)的混雜物(蛋白A和HCP)對TMAE介質(zhì)的影響。50jaL的TMAEHiCap介質(zhì)添加到96孔濾板的每個孔中。在由50mM甘氨酸和變動數(shù)量的Tris緩沖液(取決于中和到表1.1.1中指定的pH值所需的數(shù)量)和氯化鈉(在表l丄2中指定)制成的溶液中平衡每個孔。pH值范圍從7.6到9.0，氯化鈉范圍從OmM到80mM。用于每一排的緩沖溶液在自動化的移液系統(tǒng)(Tecan100RST)上稀釋。緩沖液的])&備溶液由用HC1酸化到pH值3.0的500mM甘氨酸制成，隨后用2MTris堿中和到表1.1.1中指定的pH值水平這種滴定產(chǎn)生了取決于緩沖液的pH值的Tris水平。在貯備緩沖液濃度的1到10倍稀釋度下測量緩沖液pH值，其相應(yīng)于由自動化移液系統(tǒng)產(chǎn)生的稀釋度。作為甘氨酸酸化到pH3.0的結(jié)果，緩沖液為最終溶液貢獻了約10mM的離子強度。將兩個負載挑戰(zhàn)做到樹脂上5mg/mL來測量分配系數(shù)，K,122mg/mL來測量樹脂除去混雜物和結(jié)合的產(chǎn)物的容量，Q，使用與柱負載濃度近似相等的濃度的蛋白質(zhì)溶液平衡。表1.1.1:每個孔中的緩沖液類型和pH值目標(biāo)<table>complextableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>強度與TMAE介質(zhì)結(jié)合的區(qū)域。這些區(qū)域在附圖7中更清楚地示出。MAB-AAB與TMAE介質(zhì)結(jié)合的強度可以通過改變進入到流通(K<0.1)、弱分配(0.1<K<20)和結(jié)合區(qū)(K>20)的pH值和氯化物濃度條件來操縱。將來自每個區(qū)域的所有孔的負載階段的上清液進行采樣并進行蛋白A分析。這些樣品的分析結(jié)果在表1.1.4中概述。存在著一個pH值和導(dǎo)電率區(qū)域，在此TMAE層析步驟提供了非常顯著的蛋白A去除以及對于樹脂的有限蛋白質(zhì)損失。發(fā)現(xiàn)這個區(qū)域與分配系數(shù)值Kp緊密相關(guān)，而不是任何特定的pH值或氯化物濃度(參見附圖8)。表1.1.4來自HTS篩選的MAB-AAB結(jié)合數(shù)據(jù)的蛋白A對數(shù)去除值(LRV)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>實驗1.2流通條件下的柱運行以流通(FT)模式進行以下實驗，其中Mab-AAB僅非常微弱地與柱相互作用。使用110mg/ml和200mg/ml樹月旨的負載挑戰(zhàn)進行兩個運行。對于在系列1實驗中描述的所有TMAE(HiCapM)陰離子交換層析運行，使用以下條件(除了在單獨的實驗說明中注明的之外)。操作流速-150-300cm/hr平衡液l-50mMTris、2.0MNaCl、pH7,5(5倍柱體積)平衡液2-如指定的，大約等于負載pH值和氯化物含量負載后洗滌液-如指定的，大約相當(dāng)于負載pH值和氯化物含量脫除緩沖液-50mMTris、2.0MNaCl、pH7.5(5倍柱體積)Mabselect蛋白A層析使用連接到MilliporeK畫prime400層析系統(tǒng)的MabSelect柱(2,389mL)在中試規(guī)模純化含有單克隆抗體的培養(yǎng)物。用5倍柱體積的50mMTris/150mMNaCl，pH7.5以300cm/hr的流速平衡Mabselect蛋白A柱。然后以大約40mg產(chǎn)物/ml樹脂的負載來負載柱。之后是1MNaCl、50mMTris，pH7.5中的5CV洗液，以及含有10mMTris、75mMNaClpH7.5的洗液的洗滌。然后使用50mM甘氨酸、75mMNaCl，pH3.0來洗脫柱。使用2MTrispH8=5將產(chǎn)物庫中和到pH7.6。中和的峰具有大約90mM的氯化物濃度。TMAEHiCap(M)層析中和的蛋白A庫進一步在具有平tf、負載和pH7.5、50mMTris和75mM氯化鈉的洗滌溶液的TMAE步驟上純化。使用5倍柱體積的洗液。用于這兩項研究的柱尺寸和負載挑戰(zhàn)是運行l(wèi):7.0cm直徑x20.6cm床高度(體積-793mL),負載濃度11.9mg/mL，運行2:7.0cm直徑x13cm床高度(體積-500mL),負載濃度17.6mg/mL。這些負載條件處于流通(FT)區(qū)域中(表1.2.1)。分批結(jié)合研究被用于測量分配系數(shù)(Kp)，通過使用UV吸光度通過柱列帶中的蛋白質(zhì)測定結(jié)合的產(chǎn)物。由于在洗滌期間產(chǎn)物的等度洗脫，測定結(jié)合的產(chǎn)物的這種方法一般低估了在負載期間結(jié)合的產(chǎn)物數(shù)量。測量負載和產(chǎn)物庫中蛋白A、HCP和HMW的水平，計算去除的程度。結(jié)果在表1.2.1中示出。存在著不良的蛋白A和HMW去除，和HCP水平的中度降低。表1.2.1流通條4:i二下HCP、蛋白A和HMW的去除<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>*混雜物水平是38.5ppmProA和51,943ppmHCP(運行1)8.8ppmProA和25,398ppmHCP(運行2)。實施例1.3在弱分配條件下的柱運行(高產(chǎn)物挑戰(zhàn))TMAE(HiCapM)陰離子交換層析基本上如實施例1.2中描述的進行幾個MabselectProteinA運行來產(chǎn)生用于這些運行的負載材料。來自蛋白A步驟的部分純化的抗體庫進一步在TMAE柱上純化。TMAE柱上的負載是處于50mMTris，pH8.2中。柱直徑是0.5cm，床高度是10cm床高度(體積-2.0mL)。以27.7mg/mL的負載濃度將柱挑戰(zhàn)到500mg/mL樹脂的負載。用含有50mMTris、2MNaCl、pH7.5的5倍柱體積的溶液平衡柱，隨后是包含50mMTris、pH8.2溶液的另一個平衡步驟。然后用來自上述步驟的中和的蛋白A峰將柱負載到500mg產(chǎn)物/mL樹脂，從負載循環(huán)期間的柱流出物以及一定柱體積的洗滌級分中回收產(chǎn)物。這些負載條件處于弱分配區(qū)域內(nèi)。分批結(jié)合研究被用于測量分配系數(shù)(Kp)，產(chǎn)物在高蛋白濃度下結(jié)合。在pH8.2處，12mM的近似的氯化物含量，分配系數(shù)Kp估計是1.9(根據(jù)對來自HTS篩選的數(shù)據(jù)集的內(nèi)插值)。在代表大約250、375和500mg/ml樹脂的負載挑戰(zhàn)的負載階段期間，在三個級分中測量HCP和蛋白A水平。實驗1.3的結(jié)果在表1.3.1中示出。這些結(jié)果表明，在弱分配模式中可以實現(xiàn)非常高的產(chǎn)物挑戰(zhàn)，而沒有混雜物的穿透。實現(xiàn)了HCP和蛋白A的極好的降低，以及HMW含量的50%降低。與表1.2.1中的流通模式的操作結(jié)果相比，在弱分配模式中混雜物的去除好得多。表1.3.1:500mg/mLTMAE負載挑戰(zhàn)的HCP、ProteinA和HMW的去除<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>*負載中的混雜物是25,398ppm的HCP、99.5ppm的蛋白A和2.3%HMW。實施例1.4在弱分配條件下的柱運行(健全性(robustness)研究)為了進一步確認在弱分配區(qū)域內(nèi)TMAE柱的性能，設(shè)計了改變負載中的pH值和NaCl濃度來測試過程健全性的幾個運行試驗。在250mg/mL樹脂的負載挑戰(zhàn)下進行所有運行試驗。基本上如實施例1.2中描述的進行幾個Mabselect蛋白A運行試一驗來產(chǎn)生用于這些運行試驗的負載材料。在這些運行試驗中改變的唯一因素是蛋白A洗脫中的氯化鈉濃度，其被改變來匹配特定實驗的TMAE負載中的NaCl濃度。用平衡液2緩沖液平衡柱，并用具有與負載大致相同的pH值和氯化鈉含量的洗滌緩沖液洗滌。這些負載條件處于弱分配區(qū)域內(nèi)。分批結(jié)合研究被用于測量分配系數(shù)(Kp)。通過表1.4.1所列的分配系數(shù)來對運行試驗分級。通過使用UV吸光度測量柱列帶中的蛋白質(zhì)來測定結(jié)合的產(chǎn)物，范圍7.8-25.3mg/mL。這些實驗的蛋白A、HCP和HMW結(jié)果也在表1.4.1中呈現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)在覆蓋13.5-38.8mM總氯化物和pH值7.8-8.4的操作范圍中，所有混雜物的去除是健全的。表1.4.1:對于弱分配模式中HCP、ProteinA和HMW去除的過程健全性研究<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>*混雜物水平是38.5ppmProA和51,943ppmHCP(運行1),8.8ppmProA和25,398ppmHCP(運行2)。+包括來自NaCl、緩沖液和滴定劑的Cl離子貢獻總結(jié)根據(jù)這項研究，可以看出蛋白A去除(LRV)隨著Kp強烈地變化，而HCPLRV在0，26或以上的所有Kp值下是極好的，但在Kp=0.17時大大降低(在流通條件下)。甚至在降低的負載挑戰(zhàn)之下，與弱分配條件相比，流通條件的宿主細胞蛋白質(zhì)去除要低超過一個對數(shù)。對于樹脂和單克隆抗體的這種組合，這些弱分配條件的結(jié)合的產(chǎn)物范圍從7.8-25mg/mL。分配系數(shù)在0.41<Kp<5.4之間似乎是最佳的?？雌饋韺嵤├?.2的條件Kp=0.17和1.4-3.3mg/mL的結(jié)合產(chǎn)物處不是最佳的。系列2-使用TMAE-HiCapM的陰離子交換和Mab-IMA實施例2.1高處理量篩選來確定WP和FT條件進行高處理量篩選(HTS)來鑒定使用TMAE-HiCap(M)介質(zhì)對于Mab-IMA的弱分配和流通條件。這種篩選改變氯化鈉的濃度和pH值來確定它們對Mab-IMA的結(jié)合程度的影響以及步驟相關(guān)的混雜物(蛋白A和HCP)對TMAE介質(zhì)的影響。將100"L的TMAEHiCap介質(zhì)添加到96孔濾板的每個孔中。在由不遠離緩沖液pKa超過1個pH值單位的25mM緩沖液(表2.1.1)和合適水平的氯化鈉(表2丄2)組成的溶液中平衡每個孔。pH值濃度范圍從7.00到8.75，氯化鈉濃度范圍從lmM到190mM。使用12MHCl將所有緩沖液滴定到目標(biāo)pH值。作為不同的緩沖液種類需要不同水平的滴定劑的結(jié)果，取決于對孔使用的緩沖液，氯化物濃度在孔與孔之間是不同的。滴定緩沖液到目標(biāo)pH值所需的Cl-的數(shù)量使用Henderson-Hasselbach方程式來計算，并增加到由NaCl和負載材料中的數(shù)量所貢獻的總C1-中。在該實驗中為每個孔計算的Cl-水平在表2丄3中列出。表2,1.1:每個孔中的緩H<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>溶液100|aL樹脂)在表2.1.1和2.1.2描述的NaCI和pH值條件下平衡每個孔。將平板搖動20分鐘，容許達到平衡。然后通過離心所述濾板來除去溶液。這個平衡循環(huán)重復(fù)三次。在第二階段，每個孔中的樹脂在合適的NaCl濃度和pH值下以3:1的體積比(300juL溶液100nL樹脂)用濃縮的MAb-IMA溶液挑戰(zhàn)到3mg/mL樹脂。具有300ppm蛋白A的、在lmMMes、15mMNaCl、pH6.5中30mg/mL的Mab-IMA溶液被用作貝i備溶液。負載的板搖動20分鐘，容許樹脂和溶液平衡。通過離心從濾板除去上清液，并收集到收集板中。每個孔中的上清液中的蛋白質(zhì)濃度通過A280nm處的吸光度來測定。蛋白A和/或HCP水平中的任何下降表明有助于純化的條件。在第三階段，通過添加在表2.1.2中列出的指定的NaCl和pH值條件的溶液來洗滌樹脂。在搖動20分鐘后除去上清液。在第四階段，添加2MNaCl來除去結(jié)合到樹脂上的剩余蛋白質(zhì)。使用從階段3&4洗脫的質(zhì)量以及階段2的產(chǎn)物濃度，為每個孔計算分配系數(shù)，在表2丄4中示出。作為pH值和氯化物的函數(shù)的分配系數(shù)的對數(shù)的等高線圖在附圖9中示出。表2.1.4MAB-IMA的96孑LHTS篩選的分配系數(shù)(Kp)<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>如表2丄4中所示，Kp值可以用于描述MAB-IMA以不同強度與TMAE介質(zhì)結(jié)合的區(qū)域。這些區(qū)域在附圖9中更清楚地示出。MAB-IMA與TMAE介質(zhì)結(jié)合的強度可以通過改變進入流通(Kp<0.1)、弱分配(0,l<Kp<20)和結(jié)合區(qū)(Kp>20)的pH值和氯化物濃度條件來操縱。來自每個區(qū)域的幾個孔的負載階段的上清液進行采樣并進行蛋白A分析。負載具有300ppm的蛋白A。這些樣品的分析結(jié)果在表2.1.5中概述。存在著一個pH值和導(dǎo)電率區(qū)域，在此TMAE層析步驟提供了非常顯著的蛋白A去除以及對于樹脂的有限蛋白質(zhì)損失。發(fā)現(xiàn)這個區(qū)域與分配系數(shù)值Kp緊密相關(guān)，而不是任何特定的pH值或氯化物濃度。表2.1.5來自HTS篩選的蛋白A殘留水平和MAB-IMA結(jié)合數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>預(yù)測的Kp值來自與HTS篩選的響應(yīng)表面擬合，和基于此回歸模型的Kp的隨后預(yù)測。實施例2.2使用TMAE-HiCapM和Mab-IMA在FT條件下的柱運行以流通(FT)模式進行以下實驗，其中Mab-IMA僅非常微弱地與柱相互作用。進行四個運行，產(chǎn)物挑戰(zhàn)109-275mg/ml樹脂。TMAE(HiCapM)陰離子交換層析對于在實驗2系列中描述的所有TMAE(HiCapM)陰離子交換層析步驟，使用以下條件(除了在單獨的實驗說明中注明的之外)。操作流速-150-300cm/hr平衡液1-50mMTris、2.0MNaCl、pH7.5或8.0(5倍柱體積)平衡液2-75mMNaCl、50mMTris、pH7.5(運行3和4含有50mM甘氨酸)負載后洗滌液-75mMNaCl、50mMTris、pH7.5(運行3和4含有50mM甘氨酸)脫除緩沖液-50mMTris、2.0MNaCl、pH7.5或8.0(5倍柱體積)基本上如實施例1.2中描述的進行幾個MabselectProteinA運行來產(chǎn)生用于這些運行的負載材料。來自先前描述的蛋白A步驟的部分純化的抗體庫以流通(FT)模式在陰離子交換步驟中進一步純化。柱直徑范圍1.0-3.2cm，柱高度是7.2-8.5cm。用含有50mMTris、2MNaCl、pH7.5的5倍柱體積的溶液平衡柱，隨后是包含50mMTris、pH7.5溶液的另一個平衡步驟。然后用所述部分純化的蛋白A峰將柱負載到109mg/mL和275mg/mL之間，從負載循環(huán)期間的柱流出物以及洗滌級分的一定柱體積中回收產(chǎn)物。這些負載條件處于流通(FT)區(qū)域中。實施例2.1中描述的高處理量篩選估計了在這些pH值和氯化物濃度條件下分配系數(shù)(Kp)的值。通過表2.2.1所列的分配系數(shù)對運行試驗分級。通過使用UV吸光度測量柱列帶中的蛋白質(zhì)來測定結(jié)合的產(chǎn)物。由于在洗滌期間產(chǎn)物的等度洗脫，測定結(jié)合的產(chǎn)物的這種方法一般低估了結(jié)合產(chǎn)物總量。這些實驗的蛋白A、HCP,HMW去除結(jié)果也在表2.2.1中呈現(xiàn)。存在著相對不良和可變的HCP去除，沒有蛋白A和產(chǎn)物變體(HMW和LMW種類)的去除。表2.2.1:在FT模式中HCP、蛋白A和HMW和LMW的去除<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>ND=沒有測定實驗2.3-對于Mab-IMA在弱分配條件下的柱運行以下柱實驗在由HTS篩選(實驗2.1)鑒定的條件下在弱分配模式中進行。對來自部分地純化的蛋白A庫的TMAE柱進行七個運行。TMAEHiCap(M)層析譜來自基本上與先前描述的相同的蛋白A步驟運行的部分純化的抗體在如下所述的pH值和氯化物含量的弱分配(WP)條件下在TMAE步驟上被進一步純化。柱直徑范圍0.5到3.2cm，柱高度是9.4-9.5cm。用含有50mMTris、2MNaCl、pH7.5或8.0的5倍柱體積的溶液平衡柱，隨后是包含50mM甘氨酸、50mMTris、pH7.5或8.0溶液的另一個平衡步驟。然后用所述部分純化的蛋白A峰將柱負載到124mg/mL和303mg/mL之間，從負載循環(huán)期間的柱流出物以及洗滌級分的一定柱體積中回收產(chǎn)物。這個實驗的結(jié)果在表2.3.1中示出。這些負載條件處于弱分配(WP)區(qū)域中。實施例2.1中描述的高處理量篩選提供了對分配系數(shù)(Kp)的值的估計。通過表2.3.1所列的分配系數(shù)來對運行試驗分級。通過使用UV吸光度測量柱列帶中的蛋白質(zhì)來測定結(jié)合的產(chǎn)物。由于在洗滌期間產(chǎn)物的等度洗脫，測定結(jié)合的產(chǎn)物的這種方法一般低估了結(jié)合的產(chǎn)物總量。這些實驗的蛋白A、HCP、HMW和LMW去除結(jié)果也在表2.2.1中呈現(xiàn)。存在著一致的和很高的HCP去除，極好的蛋白A去除，以及產(chǎn)物變體的有價值的降低(HMW和LMW種類)。表2.2.1和2.3.1中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)的比較證實了，在流通模式(《0.3的Kp值)的條件下HCP、蛋白A、HMW和LMW的去除與在弱分配條件(X).3的Kp值)實現(xiàn)的相比要低得多，即使在負載挑戰(zhàn)超過300mg/mL時。表2.3.1:弱分配條件下HCP、蛋白A、HMW和LMW的去除ND=沒有測定<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>NO:沒有測定表2.4.2:在弱分配條件下生產(chǎn)規(guī)模運行的性能<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>承TMAE峰庫中的HCP和蛋白A水平低于定量的極限?？偨Y(jié)HTS鑒定了WP和FT操作的條件。FT模式僅提供了HCP和LMW種類中的中度的降低，在蛋白A殘余或HMW種類中沒有降低。WP模式的操作改進了所有混雜物的去除而沒有犧牲產(chǎn)物收率。加工步驟被擴大到中試工廠，三個運行一致性地操作，對于HCP和蛋白A具有非常高的LRV,以及在HMW和LMW種類中良好的降低。系列3-使用TMAE-HiCapM的陰離子交換和Mab-AAB實施例3.1-高處理量篩選來確定WP和FT條件使用如實驗l.l中描述的步驟來進行實驗3.1。實驗3.2-在相應(yīng)于變動的分配系數(shù)的條件下的柱容量運行在相應(yīng)于由HTS篩選(實驗3.1)鑒定的一系列分配系數(shù)的條件下進行五個層析實驗。TMAE柱被負載到非常高的負載挑戰(zhàn)(>1000g/L)來特別地強調(diào)在弱分配條件下AEX步驟的優(yōu)越性能。使用以下條件用于在系列3中進行的AEX運行(除了在單獨的實驗描述中注明的)。捧作流速-l50-300cm/hr平衡液1-50mMTris、2.0MNaCl、pH7.5(5倍柱體積)平衡液2-如指定的，大約相當(dāng)于負載pH值和氯化物含量負載后洗滌液-如指定的，大約相當(dāng)于負載pH值和氯化物含量脫除緩沖液50mMTris、2.0MNaCl、pH7.5(5倍柱體積)使用5倍柱體積的平衡緩沖液1和隨后5倍柱體積的平衡液2步驟來平衡柱。然后用調(diào)節(jié)到適合的平衡液2緩沖液的蛋白A峰庫(是指系列1，實驗1.1)將柱負載到940和2144mg產(chǎn)物/ml樹脂之間。收集柱流出物級分，隨后分析HCP和殘余的蛋白A水平。這些實驗中使用的負載條件相應(yīng)于逐漸地提高的分配系數(shù)，其跨越了流通和弱分配(WP)區(qū)域。實施例3.1中描述的高處理量篩選提供了對分配系數(shù)(Kp)的值的估計。這個實施例中結(jié)合的產(chǎn)物的值根據(jù)在列帶中洗脫的產(chǎn)物來計算。這些實驗的結(jié)果在表3.2.1和附圖IOA和10B中示出。表3.2.1-在WP模式下非常高的負載挑戰(zhàn)試驗結(jié)果的概述<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>*基于質(zhì)量平衡計算。相應(yīng)于KpO.l的運行的結(jié)合的產(chǎn)物的值接近零，如典型的流通操作所預(yù)期的。在弱分配區(qū)域中進行的實驗的結(jié)合的產(chǎn)物值在所有情況下>12.0mg/ml。實際上，相應(yīng)于Kp7的運行的結(jié)合的產(chǎn)物結(jié)合高達71mg/ml。然而，在所有情況下，在組合的負載洗脫液和洗滌級分中的產(chǎn)物回收率是>93%。作為負載挑戰(zhàn)的函數(shù)的HCP和蛋白A去除在附圖IOA和IOB中示出。如較早討論的，HCP去除隨著條件從流通移動到弱分配而顯著提高。流通條件下的操作提供了大約1.5對數(shù)值的HCP清除，而當(dāng)在弱分配區(qū)域中在Kp7下操作時在負載挑戰(zhàn)<450mg/ml樹脂時HCP對數(shù)去除值高達3.8對數(shù)值。在弱分配區(qū)域中的Kp0.8時，高達1000mg/ml樹脂的負載挑戰(zhàn)獲得了2.8對數(shù)值的HCP清除，在弱分配區(qū)域中在Kp2.7時，高達800mg/ml樹脂的負載挑戰(zhàn)獲得了〉3對數(shù)值的HCP清除。與HCP中的情況一樣，當(dāng)我們從流通條件移動到弱分配條件時，蛋白A去除顯著地提高。附圖IOA和10B中示出的結(jié)果也強調(diào)了該事實，將操作的Kp從流通提高到弱分配區(qū)域時，在雜質(zhì)的穿透之前提高了所獲得的HCP和蛋白A對數(shù)清除值，并提高了相應(yīng)于穿透點的負載挑戰(zhàn)。在雜質(zhì)的穿透之前，Kp的進一步增加提高了HCP和蛋白ALRV。然而，由于結(jié)合的產(chǎn)物現(xiàn)在與雜質(zhì)竟?fàn)幗Y(jié)合位點，穿透點在相對較低的負載挑戰(zhàn)時出現(xiàn)。盡管如此，在此呈現(xiàn)的運行的柱容量即使對于高Kp運行也是非常高的?？偨Y(jié)在這個實施例中，顯示的是，通過在弱分配條件下和在超過1000mg/ml樹脂的負載挑戰(zhàn)下操作AEX步驟，可以顯著地改善蛋白A和HCP去除。這個實施例突出了弱分配層析和在結(jié)合條件下的標(biāo)準操作之間的一個根本差異。弱分配條件僅將產(chǎn)物結(jié)合的極限推高到雜質(zhì)清除或被顯著改善的點，而產(chǎn)物回收率和負載挑戰(zhàn)保持很高。相應(yīng)于結(jié)合條件的Kp值在AEX中是〉20;在這些條件下，產(chǎn)物和雜質(zhì)之間的竟?fàn)幮?yīng)非常強，導(dǎo)致與弱分配層析相比降低的容量。系歹'J4-使用PhenylToyopearl的疏水性相互作用和Mab-AAB實驗4.1-確定WP和FT條件的分批結(jié)合研究進行分批結(jié)合研究來鑒定使用來自TosohBiosciences的PhenylToy叩earl介質(zhì)對于Mab-AAB的弱分配和流通條件。調(diào)節(jié)產(chǎn)物與樹脂的相互作用的強度的鹽是Na2S04，其從0.20變動到0.90M。溶液被緩沖控制在pH7.5。使用45um過濾板來孵育樹脂和液體，并通過離心傾析出上清液。使用不同濃度的Na2S04(0.2M到0.9M)來制作八個Tris/Na2S04緩沖液。通過蛋白A層析部分純化的Mab-AAB稀釋到Tris/Na2S04溶液中到0.87mg/ml的終濃度。使用300juL的緩沖液平衡50Ml的樹脂，然后對于每個Tris/Na2S04條件傾析出上清液；重復(fù)這個平衡三次。在平衡之后，在相同的鹽濃度和pH值下將傾析的樹脂與產(chǎn)物混合，并柔和搖動地孵育30分鐘。所有條件的負載挑戰(zhàn)是5.2mg產(chǎn)物/ml樹脂。然后將UV平板堆疊在濾板的底部來在離心時收集上清液。隨后，將300lal50mMTris、pH7.5緩沖液施加到樹脂上來脫除結(jié)合的產(chǎn)物。在20分鐘的孵育之后，通過離心在獨立的UV平板中收集列帶。每個級分中的產(chǎn)物濃度通過UV吸光度和這種MAB的消光系數(shù)來測量。調(diào)節(jié)計算用于29lal(在通過獨立的實驗集確定)體積的階段-階段繼續(xù)試驗(carryover)。在每種鹽條件下重復(fù)實驗四次，報告平均的分配系數(shù)。表4.2.1概述了這個實驗的分配系數(shù)。Na2S04的最高濃度引起了強的產(chǎn)物結(jié)合，而在0.40-0.55M的范圍內(nèi)的鹽濃度代表了弱分配條件。實驗4.2-在弱分配、流通和結(jié)合條件下的柱運行(高產(chǎn)物挑戰(zhàn)研究)在流通、弱分配和強結(jié)合條件下進行柱運行。對于在系列4實驗中描述的所有PhenylToyopearl疏水性相互作用層析運行，使用以下條件(除了在單獨的實驗說明中注明的之外)。柱尺寸直徑0.5cm,床高度9.5-10.5cm平衡液-50mMTris、pH7.5，[Na2S04]大約等于負載負載-如以下指定的[Na2S04]洗滌-[Na2S04]等于負載(除以下注明的之外)脫除-50mMTris、pH7.5使用兩種不同的負載i)來自與之前描述的那些基本上相同蛋白A步驟運行的部分純化的抗體庫，或ii)來自FT模式操作的更純的TMAEQSepharoseFF產(chǎn)物庫。實驗4.2.1使用蛋白A峰庫作為負載的柱運行進行在此討論的實驗來強調(diào)弱分配條件下HIC的優(yōu)越性能。在變動的鹽濃度下進行柱運行來覆蓋相應(yīng)于流通、弱分配和強結(jié)合條件的一系列分配系數(shù)。實驗4.1中描述的分批結(jié)合篩選提供了對分配系數(shù)(Kp)的值的估計。用5倍體積的含有50mMTris、pH7.5和指定濃度的適合的[Na2S04]的溶液來平衡柱子。蛋白A峰首先濃縮10倍，隨后在合適的鹽濃度中稀釋到14.77mg/ml。在負載材料的宿主細胞蛋白質(zhì)(HCP)和殘余的蛋白A水平分別是30911ppm和17.1ppm。所有的柱運行在100mg/ml樹脂的負載挑戰(zhàn)下進行。在負載循環(huán)級分期間在柱流出物中收集產(chǎn)物。在產(chǎn)物流通之后，將與負載相同鹽濃度的十倍柱體積的洗滌緩沖液施加到柱上，隨后是含有50mMTris、pH7.5的五倍體積的脫除緩沖液。負載洗脫液和洗滌樣品中的HCP和蛋白A含量隨后通過ELISA來分析。在負載洗脫液和洗滌級分中的組合的混雜物水平在表4.2.1中報告。運行通過分配系數(shù)來分級。通過使用UV吸光度測量柱列帶中的蛋白質(zhì)來測定結(jié)合的產(chǎn)物。由于在洗滌期間產(chǎn)物的逐漸脫附，測定結(jié)合的產(chǎn)物的這種方法一般低估了在負載期間結(jié)合的產(chǎn)物數(shù)量。表4.2.1:在流通、弱分配和強結(jié)合條件下的混雜物去除<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>(分配系數(shù)Kp說明來自50微升樹脂和300微升溶液的相體積比6。)根據(jù)表4.2.1中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)明顯的是，當(dāng)我們從流通條件移動到弱分配條件時，對于雜質(zhì)降低，HIC步驟的性能顯著地改善了，而產(chǎn)物回收率是相當(dāng)?shù)摹Ｔ诓僮鼷}濃度中的進一步提高產(chǎn)生了相應(yīng)于強結(jié)合條件的分配系數(shù)。根據(jù)表4.2.1中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)再一次清楚的是，當(dāng)我們從弱分配移動到強結(jié)合條件時，對于雜質(zhì)降低以及產(chǎn)物回收率，HIC步驟性能都惡化了。因而這種分離的最佳的操作范圍相應(yīng)于弱分配層析的。在弱分配條件下，HIC步驟提供了HCP的1個對數(shù)的降低和蛋白A的3.4倍的降低。在這個實施例中，在弱分配條件下的結(jié)合的產(chǎn)物水平在2.8-5mg/ml樹脂之間。實驗4，2.2-使用Q-Sepharose峰庫作為負載的柱運行在這些實驗集里使用QSepharoseFF峰庫來突出以下事實，在最佳的弱分配層析條件下的HIC步驟的性能可以用更清潔的進料來進一步改善。在這種情況下的負載材料含有2880ppm的HCP，通過在Q-SepharoseFF柱上純化蛋白A峰庫來產(chǎn)生。進行兩個實驗來比較對于混雜物去除的柱性能，一個在弱分配條件下，另一個在典型的流通條件下。Q-Sepharose峰在550mMNa2S04中稀釋到3.27mg/ml,并負載到柱上到100mg/ml樹脂的負載挑戰(zhàn)用于在弱分配條件下操作。隨后用含有與負載相同鹽濃度的IOCV的緩沖液洗滌柱，用6CV的50mMTris緩沖液、pH7.5來脫除。在流通條件下進行第二實一瞼。將負載在200Na2SO4中調(diào)節(jié)到3.03mg/ml，并負載到柱上到90mg/ml樹脂的負載挑戰(zhàn)。然后用含有與負載相同鹽濃度的6CV的緩沖液洗滌柱，隨后用6CV的50mMTrislC沖液、pH7.5來脫除。在兩個運4亍中，收集流通和洗滌級分用于回收率和混雜物分析。這些運行的結(jié)果在表4.2.2中報告。表4.2.2:HIC弱分配結(jié)果與流通結(jié)果的比較<table>complextableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>在弱分配條件下的產(chǎn)物回收率數(shù)值與流通操作是相當(dāng)?shù)模勃毩⒂谶@些實驗中使用的進料。與流通操作相比，該步驟對于HCP去除的性能在弱分配條件下顯著更高。兩種進料的HIC步驟的HCPLRV在流通條件下是相當(dāng)?shù)?約0.4-0,5LRV)。然而，在弱分配條件下進行的實驗的HCPLRV值從使用蛋白A負載材料的1LRV提高到使用通過蛋白A和QSepharosePF柱純化的負載材料的大于2LRV?？偨Y(jié)層析的另一種模式(HIC)顯示了在弱分配模式中成功地運作。對于產(chǎn)物回收率和HCP/蛋白A去除，顯示了在弱分配條件下的HIC步驟的性能優(yōu)于流通條件以及更緊密的結(jié)合條件下的操作。100mg/ml樹脂的高負載挑戰(zhàn)容量在弱分配條件成功地進行，其中〉3mg/mL的產(chǎn)物結(jié)合到樹脂(即使負載濃度是3.27mg/mL)。相應(yīng)于最佳弱分配條件的分配系數(shù)似乎稍微高于陰離子交換層析的分配系數(shù)。系列5-使用陶瓷的I型羥基磷灰石的羥基磷灰石和Mab-MYA實施例5.1-高處理量篩選來確定WP和FT條件進行高處理量篩選(HTS)來鑒定使用陶瓷羥基磷灰石介質(zhì)對于Mab-MYA的弱分配和流通條件。這個篩選改變氯化鈉和磷酸鈉的濃度來確定它們對MAB-MYA與羥基磷灰石介質(zhì)的結(jié)合程度的影響。將50juL陶瓷羥基磷灰石介質(zhì)添加到96孔濾板的30個孔中。在由含100mM精氨酸、pH7.2的100mMHEPES緩沖液中適合的氯化鈉和磷酸鈉濃度組成的溶液中平衡每個孔。溶液中兩種鹽的濃度在表5丄1和5.1.2中示出。每種條件進行兩次。這些孔的每一個中的MAB-MYA負載挑戰(zhàn)是5.0mg/mL樹脂。表5.1.1:每個孔中的氯化鈉水平(mM)<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>表5.1.2:每個孔中的磷酸鈉水平(mM)<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>在HTS實驗的第一個階段，以6:1的相體積比(300ML溶液50jaL樹脂)在表5.1.1和5.1.2中描述的氯化鈉和磷酸鈉條件下平衡每個孔。將平板搖動20分鐘，容許達到平衡。然后通過離心所述濾板來除去溶液。這個平衡循環(huán)重復(fù)三次。在第二階段，每個孔中的樹脂在合適的氯化鈉和磷酸鈉濃度下以6:1的體積比(300juL溶液50juL樹脂)用濃縮的MAb-MYA溶液挑戰(zhàn)到適合的蛋白質(zhì)負載挑戰(zhàn)。使用50mMNaCl、100mMHEPES、100mM精氨酸、pH7.2中的7.0mg/mLMAB-MYA溶液作為貝i備溶液。負載的板搖動20分鐘，容許樹脂和溶液平衡。通過離心從濾板除去上清液，并收集到收集板中。每個孔中的上清液中的蛋白質(zhì)濃度通過A280nm處的吸光度來測定。在第三階段，通過添加在表5.1.1和5.1.2中列出的指定的氯化鈉和磷酸鈉條件的溶液來洗滌樹脂。在搖動20分鐘后除去上清液。在第四階段，添加由100mM磷酸鈉、1MNaCl組成pH7.2的緩沖液來除去與樹脂結(jié)合的殘留蛋白質(zhì)。使用從階段4洗脫的質(zhì)量以及階段2的產(chǎn)物濃度，為每個孔計算分配系數(shù)，在表5.1.3中示出。表5,1.3:MAB-MYO的96孑LHTS篩選的分配系數(shù)(Kp)<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>如表5丄3中所示，Kp值可以用于描述MAB-MYA以不同強度與羥基磷灰石介質(zhì)結(jié)合的區(qū)域。MAB-MYA與陶瓷羥基磷灰石介質(zhì)結(jié)合的強度可以通過改變進入流通(K《0.1)、弱分配(0,KK〈20)和結(jié)合區(qū)(K>20)的氯化物和磷酸鹽濃度的條件來操縱。實驗5.2-在WP條件下的柱運行具體地進行在此討論的實驗來強調(diào)弱分配條件下cHA步驟的優(yōu)越性能。因而在相應(yīng)于由HTS篩選(實驗5.1)鑒定的一系列分配系數(shù)的條件下進行實驗。進行十二個運行，產(chǎn)物負載挑戰(zhàn)為100mg/ml樹月旨。Mabselect蛋白A層析使用MabSelect柱純化含有單克隆抗體的培養(yǎng)物。用5倍柱體積的50mMTris/150mMNaCl,pH7.5以300cm/hr的流速平4軒Mabselect蛋白A柱。然后以大約40mg產(chǎn)物/ml樹脂的負載來負載該柱。之后是1M精氨酸、50mMTris，pH7.5中的10CV洗液，以及含有10mMTris、75mMNaClpH7.5的洗液的5CV洗液。然后使用100mM精氨酸、50mMNaCl，pH3.0來洗脫柱。使用2MHEPESpH8.0將產(chǎn)物庫中和到pH7.2。陶瓷羥基磷灰石層析來自蛋白A步驟的部分純化的抗體庫進一步在羥基磷灰石上純化。柱直徑是0,5cm,柱高度是10cm。對于在實驗5系列中描述的所有羥基磷灰石層析步驟，使用以下條件(除了在單獨的實驗說明中注明的之外)。操作流速-150-240cm/hr平衡液1300mM磷酸鈉、l.OMNaCl、pH6.8(3倍柱體積)平衡液25-30mM磷酸鈉、50-760mMNaCl、100mMArg、100mMHEPESpH7.2(5倍柱體積)洗滌5-30mM磷酸鈉50-760mMNaCl、100mMArg、100mMHEPESpH7.2(5-10倍柱體積)使用5倍柱體積的平衡緩沖液1和隨后另一個平衡液2步驟來平衡柱。然后用來自上述步驟的蛋白A峰(調(diào)節(jié)到合適的平衡液2緩沖液)將柱負載到100mg產(chǎn)物/mL樹脂，從負載循環(huán)期間的柱流出物以及一定柱體積的洗滌級分中回收產(chǎn)物。這些實驗的結(jié)果在表5.2.1和附圖11中示出。這些負載條件處于流通、弱分配(WP)和結(jié)合區(qū)域中。實施例5.1中描述的高處理量篩選估計了在這些氯化物和磷酸鹽濃度條件下分配系數(shù)(Kp)和結(jié)合的產(chǎn)物(mg/mL樹脂)的值。結(jié)合的產(chǎn)物根據(jù)柱運行的產(chǎn)物穿透體積來測定。這些實驗的HCP和蛋白A結(jié)果在表5.2.1和附圖11中示出。表5.2.1:在流通、弱分配和結(jié)合條件下的HCP和蛋白A去除<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>根據(jù)表5.2.1和附圖11中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)明顯的是，當(dāng)我們從流通條件移動到弱分配條件時，對于雜質(zhì)降低，cHA步驟的性能顯著地改善了，而產(chǎn)物回收率是相當(dāng)?shù)摹Ｔ谙鄳?yīng)于分配系數(shù)進一步提高的條件下的操作(即，在結(jié)合區(qū)域操作)對于雜質(zhì)去除沒有提供額外的益處。然而，在強結(jié)合條件下在該步驟上產(chǎn)物回收率開始降低。因而這種分離的最佳的操作范圍相應(yīng)于弱分配層析的操作范圍。在這些條件下，在100mg產(chǎn)物/ml樹脂的負載挑戰(zhàn)下獲得了〉2對數(shù)的蛋白A降低和〉1.2對數(shù)的宿主細胞蛋白質(zhì)降低。在這個實施例中，在弱分配條件下的結(jié)合的產(chǎn)物水平在3.0-10.2mg/ml樹脂之間?？偨Y(jié)層析的第三種模式(羥基磷灰石)顯示了在弱分配模式中成功地運作。蛋白A和HCP比產(chǎn)物抗體更緊密地結(jié)合陶資的樹脂，在WP條件下強烈地保留。在WP區(qū)域中更高的Kp值有時在10和20之間，其仍然提供了良好的產(chǎn)物回收率(>90%)。更低的Kp水平得到了相應(yīng)更高的回收率。在這個實施例中，顯示的是，柱步驟的性能可以主要通過選擇用于運行柱的分配系數(shù)來優(yōu)化。羥基磷灰石中的分配系數(shù)是pH值、鹽(類型和濃度)、磷酸鹽和緩沖液成分的復(fù)雜的函數(shù)。一般地所有這些變量對于柱步驟的性能有影響。在此呈現(xiàn)的方法提供了改變?nèi)我环N這些變量對柱性能的影響的關(guān)聯(lián)的簡單方法。與以前所做的相比，在這個實施例中呈現(xiàn)的統(tǒng)一的"分配系數(shù)"方法打開了在這種層析模式中以更廣的操作空間來操作的可能性。最佳性能的弱分配條件可以使用如上所述的HTS方法容易地鑒定。系列6-使用陶瓷的I型羥基磷灰石的羥基磷灰石和Mab-A5T實施例6.1-高處理量篩選來確定WP和FT條件進行高處理量篩選(HTS)來鑒定使用陶f:羥基磷灰石介質(zhì)對于Mab-A5T的弱分配和流通條件。這個篩選改變pH值、氯化鈉和磷酸鈉的濃度來確定它們對MAB-A5T與羥基磷灰石介質(zhì)的結(jié)合程度的影響。將50iuL陶資羥基磷灰石介質(zhì)添加到96孔濾板的30個孔中。在由含50mM精氨酸、pH7.0或pH8.0的50mMHEPES緩沖液中適合的氯化鈉和磷酸鈉濃度組成的溶液中平tf每個孔。溶液中兩種鹽的濃度在表6.1.1和6.1.2中示出。1-3欄中所示的條件在pH7.0下進行，4-6欄在pH8.0下進行。這些孔的每一個中的MAB-A5T負載挑戰(zhàn)是5.0mg/mL樹月旨。表6.1.1:每個孔中的氯化鈉水平(mM)<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>表6.1.2:每個孔中的磷酸鈉水平(mM)<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>在HTS實驗的第一個階段，以6:1的相體積比(300|uL溶液50laL樹月旨)在表6.1.1和6.1.2中描述的氯化鈉、磷酸鈉和pH值條件下平衡每個孔。將平板搖動20分鐘，容許達到平衡。然后通過離心所述濾板來除去溶液。這個平衡循環(huán)重復(fù)三次。在第二階段，每個孔中的樹脂在合適的pH值和氯化鈉和磷酸鈉濃度下以6:1的體積比(300mL溶液50jaL樹脂)用濃縮的MAb-A5T溶液挑戰(zhàn)到適合的蛋白質(zhì)負載挑戰(zhàn)。lmMHEPES、100mMNaCl、pH7.0中的6.9mg/mlMab-A5T溶液用作貝i備溶液。負載的板搖動20分鐘，容許樹脂和溶液平衡。通過離心從濾板除去上清液，并收集到收集板中。每個孔中的上清液中的蛋白質(zhì)濃度通過A280nm處的吸光度來測定。在第三階段，通過添加在表6.1.1和6.1.2中列出的指定的氯化鈉、磷酸鈉和pH值條件的溶液來洗滌樹脂。在搖動20分鐘后除去上清液。在第四階段，添加包含100mM磷酸鈉、1MNaCl的pH7.2的緩沖液來除去與樹脂結(jié)合的殘留蛋白質(zhì)。使用從階段4洗脫的質(zhì)量以及階段2的產(chǎn)物濃度，為每個孔計算分配系數(shù)，在表6.1.3中示出。表6丄3:MAB-A5T的HTS篩選的分配系數(shù)(Kp)<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>如表6丄3中所示，Kp值可以用于鑒定MAB-A5T以不同強度與羥基磷灰石介質(zhì)結(jié)合的區(qū)域。MAB-A5T與陶瓷羥基磷灰石介質(zhì)結(jié)合的強度可以通過改變進入到流通、弱分配和結(jié)合區(qū)的NaCl、磷酸鹽和pH值的條件來操縱。實驗6.2-在WP條件下的柱運行進行實驗來強調(diào)弱分配條件下cHA步驟的優(yōu)越性能。因而在相應(yīng)于由HTS篩選(實驗6.1)鑒定的一系列分配系數(shù)的條件下進行實驗。進行八個運行，產(chǎn)物負載挑戰(zhàn)110mg/ml樹脂。Mabselect蛋白A層析使用MabSelect柱純化含有單克隆抗體的培養(yǎng)物。用5倍柱體積的50mMTris/150mMNaCl，pH7.5以300cm/hr的流速平衡-Mabselect蛋白A柱。然后以大約40mg產(chǎn)物/ml樹脂的負載挑戰(zhàn)負載柱。之后是lMNaCl、50mMTris,pH7.5中的5CV洗滌，以及含有10mMTris、75mMNaClpH7.5的洗液的5CV洗滌。然后4吏用100mM精氨酸、50mMNaCl，pH3.0來洗脫柱。使用2MHEPESpH8.0將產(chǎn)物庫中和到pH7.2。陶瓷羥基磷灰石層析來自蛋白A步驟的部分純化的抗體庫進一步在羥基磷灰石上純化。柱直徑是0.5cm,柱高度是10cm。對于在實驗6系列中描述的所有羥基磷灰石層析步驟，使用以下條件(除了在單獨的實驗說明中注明的之外)。操作流速-150-240cm/hr平衡液1300mM磷酸鈉、l.OMNaCl、pH6.8(3倍柱體積)平衡液22-32mM磷酸鈉、50-400mMNaCl、5mM咪哇、50mM甘氨酸、10mMHEPES、pH7.0(5倍柱體積)洗液與平tf液2相同使用5倍柱體積的平衡緩沖液1和隨后另一個平衡液2步驟來平衡柱。然后用來自上述步驟的蛋白A峰(調(diào)節(jié)到合適的平衡液2緩沖液)將柱負載到110mg產(chǎn)物/mL樹脂，從負載循環(huán)期間的柱流出物以及一定柱體積的洗滌級分中回收產(chǎn)物。這些實驗的結(jié)果在表6.2.1和附圖12中示出。表6.2.1:在cHA樹脂上MAB-A5T的分配系數(shù)和相應(yīng)的操作范<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>這些實驗中操作條件相應(yīng)于流通、弱分配(WP)區(qū)域和結(jié)合區(qū)域。試驗6.1中描述的HTS實驗估計了在這些pH值、氯化物和磷酸鹽濃度條件下分配系數(shù)(Kp)的值。表6.2.1中的運行通過分配系數(shù)來分級。通過使用UV吸光度測量柱列帶中的蛋白質(zhì)來測定結(jié)合的產(chǎn)物。由于在洗滌期間產(chǎn)物的逐漸脫附，測定結(jié)合的產(chǎn)物的這種方法一般低估了在負載期間結(jié)合的產(chǎn)物量。這些實驗產(chǎn)生的HCP和產(chǎn)物相關(guān)的HMW去除以及產(chǎn)物回收率在附圖12中示出。根據(jù)附圖12中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)明顯的是，當(dāng)我們從流通條件移動到弱分配條件時，對于HCP和HMW降低，cHA步驟的性能顯著地改善了，而產(chǎn)物回收率維持在〉80%。在相應(yīng)于分配系數(shù)進一步提高的條件下的操作(即，在結(jié)合區(qū)域操作)對于雜質(zhì)去除沒有提供額外的益處。然而，在強結(jié)合條件下在該步驟上產(chǎn)物回收率開始降低。因而這種分離的最佳的操作范圍相應(yīng)于弱分配層析的范圍。在這些條件下，在110mg產(chǎn)物/ml樹脂的負載挑戰(zhàn)下獲得了產(chǎn)物相關(guān)的HMW物質(zhì)的4倍降低和HCP的〉1.4的對數(shù)降低。在這個實施例中，在弱分配條件下的結(jié)合的產(chǎn)物水平在1.6-6.7mg/ml樹脂之間。總結(jié)在弱分配層析下操作的羥基磷灰石中呈現(xiàn)的第二實施例顯示了，提供了對于HCP和HMW降低以及產(chǎn)物回收率(〉80%)的改善的性能。在早先的實施例中，步驟的性能可以主要通過選擇用于運行柱的分配系數(shù)來優(yōu)化。在此呈現(xiàn)的方法提供了將改變幾種變量(pH值、鹽、磷酸鹽、咪唑、甘氨酸、HEPES,等等)中的任一種對柱性能的影響相關(guān)聯(lián)的簡單方法。最佳性能的弱分配條件可以使用在這個實施例中描述的HTS方法鑒定。與以前所估文的相比，在此呈現(xiàn)的方法打開了在這種層析模式中以更廣的操作空間來操作的可能性。這個實施例中最佳的WP區(qū)域相應(yīng)于2和20之間的分配系數(shù)。系列7-使用I型陶瓷羥基磷灰石的羥基磷灰石和Mab-MYO實施例7.1-高處理量篩選來確定FT、WP和強結(jié)合條件進行高處理量篩選(HTS)來鑒定使用陶瓷羥基磷灰石介質(zhì)對于Mab-MYO的流通、弱分配和結(jié)合條件。這個篩選改變pH、精氨酸/甘氨酸、HEPES、磷酸鈉和氯化鈉的濃度來確定它們對MAB-MYO與羥基磷灰石介質(zhì)的結(jié)合程度的影響。這個實施例中使用的HTS步驟與在系列5和系列6中描述的那些類似，在此不再討論。來自與HTS數(shù)據(jù)擬合的響應(yīng)曲面的預(yù)測的Kp值被用于挑選柱實驗的具體條件。實驗7.2-在WP條件下的柱運行在相應(yīng)于由HTS試驗鑒定的一系列分配系數(shù)的條件下進步驟對于HCP和產(chǎn)物相關(guān)的HMW種類的去除的優(yōu)越性能。使用55mg/ml樹脂的產(chǎn)物負載挑戰(zhàn)來進行四個運行。這些實驗中使用的負載挑戰(zhàn)對于弱分配層析是低的，但對于流通操作是典型的。在這些實驗中不進行嘗試來優(yōu)化弱分配層析的負載挑戰(zhàn)。來自蛋白A步驟的部分純化的抗體庫被用于這些實驗中。柱直徑是0.5cm，柱高度是10cm。對于在實驗7系列中描述的所有羥基磷灰石層析步驟，使用以下條件(除了在單獨的實驗說明中注明的之外)。操作流速-150-240cm/hr平衡液1300mM磷酸鈉、l.OMNaCl、pH6.8(2-5倍柱體積)平衡液2l-8mM磷酸鈉、50-1750mMNaCl、12-50mMArg、20-50mMHEPESpH7.0(5倍柱體積)洗滌與平4軒液2相同使用2-5倍柱體積的平衡緩沖液1和隨后5倍柱體積的平衡液2來平衡柱。然后用蛋白A峰(調(diào)節(jié)到合適的平衡液2緩沖液)將柱負載到55mg產(chǎn)物/mL樹脂，從負載循環(huán)期間的柱流出物以及一定柱體積的洗滌級分中回收產(chǎn)物。這些實驗的結(jié)果在表7.2.1和附圖13中示出。表7.2.1:在cHA樹脂上MAB-MYO的分配系數(shù)和相應(yīng)的操作模式<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>*最佳的Kp條件，參見附圖13這些實驗中的操作條件相應(yīng)于流通、弱分配(WP)區(qū)域和結(jié)合區(qū)域。實施例7.1中描述的HTS實驗估計了在這些pH值、氯化物，磷酸鹽、甘氨酸/精氨酸和HEPES濃度下分配系數(shù)(Kp)的值。表7.2.1中的運行通過分配系數(shù)來分級。通過使用UV吸光度測量柱列帶中的蛋白質(zhì)來測定結(jié)合的產(chǎn)物。由于在洗滌期間產(chǎn)物的逐漸脫附，測定結(jié)合的產(chǎn)物的這種方法一般低估了在負載期間結(jié)合的產(chǎn)物量。這些實驗產(chǎn)生的產(chǎn)物相關(guān)的高分子量(HMW)去除和產(chǎn)物回收率也在附圖13中示出。根據(jù)附圖13中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)明顯的是，當(dāng)我們從流通條件移動到弱分配條件時，對于HMW降低，cHA步驟的性能顯著地改善了，而產(chǎn)物回收率>80%。在相應(yīng)于分配系數(shù)進一步提高的條件下的操作(即，在結(jié)合區(qū)域操作)對于雜質(zhì)去除沒有提供額外的益處。然而，在強結(jié)合條件下在該步驟上產(chǎn)物回收率開始降低。因而這種分離的最佳的操作范圍相應(yīng)于弱分配層析的范圍。在這些條件下，獲得了20倍的產(chǎn)物相關(guān)的HMW種類的降低。在這個實施例中，在弱分配條件下的結(jié)合的產(chǎn)物水平在5.1-9.5mg/ml樹脂之間?？偨Y(jié)在弱分配層析下操作的羥基磷灰石中呈現(xiàn)的第二實施例顯示提供了關(guān)于HMW降低方面的改善性能，具有良好的產(chǎn)物回收率(>80%)。產(chǎn)物相關(guān)的HMW種類和HMW種類與產(chǎn)物抗體相比更緊密地結(jié)合陶瓷樹脂，在WP條件下強烈地保留。這個實施例中的WP區(qū)域相應(yīng)于8和20之間的分配系數(shù)。在這個實施例中，再一次顯示的是，柱步驟的性能可以主要通過選擇用于運行柱的分配系數(shù)來優(yōu)化。在此呈現(xiàn)的方法提供了改變幾種變量(pH值、鹽、磷酸鹽、精氨酸、HEPES,等等)中的任一種對柱性能產(chǎn)生的影響相關(guān)聯(lián)的簡單方法。最佳性能的弱分配條件可以使用在這個實施例中描述的HTS方法鑒定。與以前所做的相比，在此呈現(xiàn)的方法打開了在這種層析模式中以更廣的操作空間來操作的可能性。在此還值得注意的是，弱分配層析的原理在不由電荷相互作用單獨驅(qū)動的系統(tǒng)中也能工作。在本申請中描述的一般方法可以成功地應(yīng)用于復(fù)雜的系統(tǒng)，例如HIC以及羥基磷灰石。例如，除了操作pH值以外，其他幾種變量例如NaCl、磷酸鹽、精氨酸/甘氨酸、緩沖液種類以及樹脂的類型都可以影響羥基磷灰石中的步驟性能。盡管如此，人們可以通過進行使用單獨的目標(biāo)產(chǎn)物的簡單分批結(jié)合實驗來容易地鑒定WP窗口。系列8-用于蛋白A洗脫的兩性離子緩沖液和隨后的離子交換步驟使用MabSelect樹脂純化含有單克隆抗體的培養(yǎng)物。用5倍柱體積的50mMTris/150mMNaCl,pH7.5平衡Mabselect蛋白A柱。然后以大約40mg產(chǎn)物/ml樹脂的負載負載柱。之后是lMNaCl、50mMTris,pH7.5中的5CV洗滌，以及含有10mMTris、75mMNaClpH7.5洗液的5CV洗滌。然后使用30mMHEPES、pH3.1洗脫柱。產(chǎn)物庫使用1MHEPESpH8.0中和到pH7.2，產(chǎn)生55mM的總HEPES濃度。在pH7.2，HEPES對緩沖液貢獻了17mM的離子強度。在此引用的所有參考文獻在此為了所有目的通過將它們完全引用來合并在此，其程度與具體的或單獨的指示為了所有目的通過引用合并在此的出版物和專利或?qū)＠暾埮c在說明書中含有的公開內(nèi)容抵觸時，本說明書意圖是優(yōu)于和/或高于任何這樣的對立材料。在說明書和權(quán)利要求書中使用的所有表示成分數(shù)量、反應(yīng)條件等的數(shù)字，都被理解為是在所有情況下用術(shù)語"約"所修飾的。因此，除非另有相反的陳述，在說明書和附隨的權(quán)利要求中列出的數(shù)字參數(shù)是近似值，可以依據(jù)試圖通過本發(fā)明獲得的期望的性質(zhì)而改變。至少，而不是作為將等效原則的應(yīng)用限定到權(quán)利要求的范圍的嘗,[^212]S:進^t對本發(fā)明:許多修't^口變化而不背離它的精神和范圍，這對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。在此描述的具體實施方式僅通過舉例來提供，無論如何不意味著是限制性的。意圖是，說明書和實施例被認為僅是示范性的，本發(fā)明的真實范圍和精神由以下的權(quán)利要求指明。權(quán)利要求1.一種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的產(chǎn)物的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少1mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的產(chǎn)物。2.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的產(chǎn)物的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件由至少0.1的分配系數(shù)限定；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的產(chǎn)物。3.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的產(chǎn)物的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少1到約70mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)并且由0.3到20的分配系數(shù)限定；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的產(chǎn)物。4.權(quán)利要求1-3的任一項的方法，其中所述操作條件在篩選步驟中鑒定。5.權(quán)利要求1-3的任一項的方法，其中所述操作條件包括pH值水平和離子強度。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述操作條件進一步包括鹽濃度。7.權(quán)利要求5的方法，其中所述操作條件進一步包括賦形劑濃度。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述操作條件進一步包括磷酸鹽濃度、鈣濃度、精氨酸濃度、甘氨酸濃度和HEPES濃度。9.權(quán)利要求1-3的任一項的方法，其中所述操作條件包括反配體水平和pH值水平。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述操作條件進一步包括咪唑濃度。11.權(quán)利要求4的方法，其中所述篩選步驟使用分批結(jié)合研究。12.權(quán)利要求4的方法，其中所述篩選步驟使用柱結(jié)合研究。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述柱結(jié)合研究是梯度洗脫研究。14.權(quán)利要求12的方法，其中所述柱結(jié)合研究是等度洗脫研究。15.權(quán)利要求l的方法，其中所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少5mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。16.權(quán)利要求l的方法，其中所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少10mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。17.權(quán)利要求l的方法，其中所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少20mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。18.權(quán)利要求l的方法，其中所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少30mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。19.權(quán)利要求l的方法，其中所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少40mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。20.權(quán)利要求l的方法，其中所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少50mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。21.權(quán)利要求l的方法，其中所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少60mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。22.權(quán)利要求2的方法，其中所述分配系數(shù)的值在約0.2到約20.0的范圍內(nèi)。23.權(quán)利要求2的方法，其中所述分配系數(shù)的值在約0.2到約10.0的范圍內(nèi)。24.權(quán)利要求2的方法，其中所述分配系數(shù)的值在約1.0到約5.0的范圍內(nèi)。25.權(quán)利要求2的方法，其中所述分配系數(shù)的值在約0.5到約5.0的范圍內(nèi)。26.權(quán)利要求2的方法，其中所述分配系數(shù)的值在約0.5到約1.5的范圍內(nèi)。27.權(quán)利要求1-3的任一項的方法，其中所述產(chǎn)物是選自由融合蛋白、含F(xiàn)c的蛋白、免疫綴合物、細胞因子、白細胞介素、激素和治療性酶構(gòu)成的組的蛋白質(zhì)。28.權(quán)利要求23的方法，其中所述含F(xiàn)c的蛋白是抗體。29.權(quán)利要求1-3的任一項的方法，其中所述介質(zhì)是帶電的離子交換介質(zhì)。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述帶電的離子交換介質(zhì)是陰離子交換樹脂。31.權(quán)利要求29的方法，其中所述帶電的離子交換介質(zhì)是陽離子交換樹脂。32.權(quán)利要求1-3的任一項的方法，其中所述介質(zhì)是疏水性相互作用層析樹脂。33.權(quán)利要求1-3的任一項的方法，其中所述介質(zhì)是羥基磷灰石樹脂。34.權(quán)利要求1-3的任一項的方法，其中所述介質(zhì)是固定的金屬親和層析樹脂。35.權(quán)利要求1-3的任一項的方法，其中所述一種或多種混雜物選自由宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、產(chǎn)物變體、內(nèi)毒素和蛋白A構(gòu)成的組。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述混雜物進一步包括病毒。37.權(quán)利要求35的方法，其中所述混雜物包括具有在純化的產(chǎn)物中濃度不超過約100ng宿主細胞蛋白質(zhì)/mg產(chǎn)物的宿主細胞蛋白38.權(quán)利要求35的方法，其中所述混雜物包括具有在純化的產(chǎn)物中濃度不超過約250ng宿主細胞蛋白質(zhì)/mg產(chǎn)物的宿主細胞蛋白39.權(quán)利要求35的方法，其中所述混雜物包括具有在純化的產(chǎn)物中濃度不超過約500ng宿主細胞蛋白質(zhì)/mg產(chǎn)物的宿主細胞蛋白質(zhì)。40.權(quán)利要求35的方法，其中所述混雜物包括具有在純化的產(chǎn)物中濃度不超過約100ng蛋白A/mg產(chǎn)物的蛋白A。41.權(quán)利要求35的方法，其中所述混雜物包括具有在純化的產(chǎn)物中濃度不超過約50ng蛋白A/mg產(chǎn)物的蛋白A。42.權(quán)利要求35的方法，其中所述混雜物包括具有在純化的產(chǎn)物中濃度不超過約10ng蛋白A/mg產(chǎn)物的蛋白A。43.權(quán)利要求35的方法，其中所述混雜物包括具有在純化的產(chǎn)物中濃度不超過約1ng核酸/mg產(chǎn)物的核酸。44.權(quán)利要求35的方法，其中在純化的產(chǎn)物中產(chǎn)物變體的濃度是不超過約0.5%。45.權(quán)利要求35的方法，其中在純化的產(chǎn)物中產(chǎn)物變體的濃度是不超過約2%。46.權(quán)利要求35的方法，其中在純化的產(chǎn)物中產(chǎn)物變體的濃度是不超過約5%。47.權(quán)利要求35的方法，其中在純化的產(chǎn)物中產(chǎn)物變體的濃度是不超過約10%。48.權(quán)利要求36的方法，其中所述病毒的對數(shù)去除值是大于1.0。49.權(quán)利要求36的方法，其中所述病毒的對數(shù)去除值是大于2.0。50.權(quán)利要求36的方法，其中所述病毒的對數(shù)去除值是大于3.0。51.權(quán)利要求35的方法，其中所述宿主細胞蛋白質(zhì)的對數(shù)去除值是至少1.0。52.權(quán)利要求35的方法，其中所述宿主細胞蛋白質(zhì)的對數(shù)去除值是至少2.0。53.權(quán)利要求35的方法，其中所述宿主細胞蛋白質(zhì)的對數(shù)去除值是至少3.0。54.權(quán)利要求35的方法，其中所述蛋白A的對數(shù)去除值是至少1.0。55.權(quán)利要求35的方法，其中所述蛋白A的對數(shù)去除值是至少2.0。56.權(quán)利要求35的方法，其中所述蛋白A的對數(shù)去除值是至少3.0。57.權(quán)利要求1-3的任一項的方法，其中使用低離子強度的洗脫緩沖液從蛋白A柱上洗脫含產(chǎn)物流體；所述含產(chǎn)物流體的pH值和導(dǎo)電率使用中和緩沖液來調(diào)節(jié)，所述中和緩沖液產(chǎn)生不超過20mM的所述含產(chǎn)物流體的離子強度，產(chǎn)生負載流體；并且其中這種負載流體通過離子交換介質(zhì)。58.權(quán)利要求57的方法，其中所述負載流體通過陰離子交換介質(zhì)而不需要滲濾。59.權(quán)利要求57的方法，其中使用中和緩沖液來調(diào)節(jié)含產(chǎn)物流體的pH值和導(dǎo)電率，所述中和li沖液產(chǎn)生不超過40mM的所述含產(chǎn)物流體的離子強度。60.權(quán)利要求57的方法，其中使用中和緩沖液來調(diào)節(jié)含產(chǎn)物流體的pH值和導(dǎo)電率，所述中和緩沖液產(chǎn)生不超過60mM的所述含產(chǎn)物流體的離子強度。61.權(quán)利要求57的方法，其中使用中和緩沖液來調(diào)節(jié)含產(chǎn)物流體的pH值和導(dǎo)電率，所述中和緩沖液產(chǎn)生不超過80mM的所述含產(chǎn)物流體的離子強度。62.權(quán)利要求57的方法，其中所述洗脫緩沖液包含具有pKa2-5的帶電陰離子基團的分子。63.權(quán)利要求62的方法，其中所述洗脫緩沖液進一步包含具有pKa6.5-10的帶電陽離子基團的分子。64.權(quán)利要求57的方法，其中所述洗脫緩沖液包含pH在4和9之間的兩性離子的分子。65.權(quán)利要求64的方法，其中所述兩性離子選自由甘氨酸；1,4-哌。秦二-(乙烷磺酸)；雙甘氨肽；環(huán)戊烷四-1,2,3，4-羧酸；N,N-二(2-羥乙基)-2-氨基乙烷磺酸；2-(N-嗎啉代)丙烷-磺酸；N-三(羥曱基)曱基-2-氨基乙烷磺酸；N-2-羥基乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸；4-(2-羥乙基)-I-哌。秦丙烷磺酸；N-三(羥甲基)曱基甘氨酸；甘氨酰胺；N,N-二(2-羥乙基)甘氨酸；N-三(羥曱基)曱基-2-氨基丙烷磺酸；和N-甘氨酰-甘氨酸構(gòu)成的組。66.權(quán)利要求65的方法，其中所述兩性離子包括甘氨酸。67.權(quán)利要求57的方法，其中所述負載流體的離子強度是不超過100mM。68.權(quán)利要求57的方法，其中所述負載流體的離子強度是不超過50mM。69.權(quán)利要求57的方法，其中所述負載流體的離子強度是不超過25mM。70.權(quán)利要求57的方法，其中所述負載流體的離子強度是不超過10mM。71.權(quán)利要求1-3的任一項的方法，其中所述介質(zhì)除去選自由宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、產(chǎn)物變體、內(nèi)毒素和蛋白A構(gòu)成的組的混雜物的至少90%。72.權(quán)利要求71的方法，其中所述介質(zhì)除去選自由宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、產(chǎn)物變體、內(nèi)毒素和蛋白A構(gòu)成的組的混雜物的至少99%。73.權(quán)利要求72的方法，其中所述介質(zhì)除去選自由宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、產(chǎn)物變體、內(nèi)毒素和蛋白A構(gòu)成的組的混雜物的至少99.9%。74.權(quán)利要求1-3的任一項的方法，其中結(jié)合到所述介質(zhì)的總產(chǎn)物質(zhì)量是負載到介質(zhì)上的總產(chǎn)物質(zhì)量的至少10%。75.權(quán)利要求74的方法，其中結(jié)合到所述介質(zhì)的總產(chǎn)物質(zhì)量是負載到介質(zhì)上的總產(chǎn)物質(zhì)量的至少20%。76.權(quán)利要求75的方法，其中結(jié)合到所述介質(zhì)的總產(chǎn)物質(zhì)量是負載到介質(zhì)上的總產(chǎn)物質(zhì)量的至少30%。77.權(quán)利要求1-3的任一項的方法，其中所述產(chǎn)物在所述介質(zhì)上的負載是至少10mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。78.權(quán)利要求77的方法，其中所述產(chǎn)物在所述介質(zhì)上的負載是至少50mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。79.權(quán)利要求78的方法，其中所述產(chǎn)物在所述介質(zhì)上的負載是至少100mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。80.權(quán)利要求79的方法，其中所述產(chǎn)物在所述介質(zhì)上的負載是至少500mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。81.權(quán)利要求80的方法，其中所述產(chǎn)物在所述介質(zhì)上的負載是至少1000mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)。82.權(quán)利要求1-3的任一項的方法，其中在所述負載流體中的產(chǎn)物濃度是至少1mg產(chǎn)物/mL負載流體。83.權(quán)利要求82的方法，其中在所述負載流體中的產(chǎn)物濃度是至少5mg產(chǎn)物/mL負載流體。84.權(quán)利要求83的方法，其中在所述負載流體中的產(chǎn)物濃度是至少10mg產(chǎn)物/mL負載流體。85.權(quán)利要求84的方法，其中在所述負載流體中的產(chǎn)物濃度是至少50mg產(chǎn)物/mL負載流體。86.權(quán)利要求85的方法，其中在所述負載流體中的產(chǎn)物濃度是至少100mg產(chǎn)物/mL負載流體。87.由權(quán)利要求1的方法制備的純化的產(chǎn)物。88.由權(quán)利要求2的方法制備的純化的產(chǎn)物。89.由權(quán)利要求3的方法制備的純化的產(chǎn)物。90.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的蛋白質(zhì)的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少lmg蛋白質(zhì)/mL介質(zhì)；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的蛋白質(zhì)。91.一種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的蛋白質(zhì)的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件由至少0.1的分配系數(shù)限定；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的蛋白質(zhì)。92.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的蛋白質(zhì)的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少1到約70mg蛋白質(zhì)/mL介質(zhì)并且由0.3到20的分配系數(shù)限定；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的蛋白質(zhì)。93.由權(quán)利要求90的方法制備的純化的蛋白質(zhì)。94.由權(quán)利要求91的方法制備的純化的蛋白質(zhì)。95.由權(quán)利要求92的方法制備的純化的蛋白質(zhì)。96.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少lmg抗體/mL介質(zhì)；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。97.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件由至少0.1的分配系數(shù)限定；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。98.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少1到約70mg抗體/mL介質(zhì)并且由0.3到20的分配系數(shù)限定；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。99.由權(quán)利要求96的方法制備的純化的抗體。100.由權(quán)利要求97的方法制備的純化的抗體。101.由權(quán)利要求98的方法制備的純化的抗體。102.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的產(chǎn)物的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少lmg產(chǎn)物/mL介質(zhì)；其中所述操作條件在篩選步驟中鑒定；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的產(chǎn)物。103.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的產(chǎn)物的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件由至少0.1的分配系數(shù)限定；其中所述操作條件在篩選步驟中鑒定；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的產(chǎn)物。104.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的產(chǎn)物的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少1到約70mg產(chǎn)物/mL介質(zhì)并且由0.3到20的分配系數(shù)限定；其中所述操作條件在篩選步驟中鑒定；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的產(chǎn)物。105.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的蛋白質(zhì)的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少lmg蛋白質(zhì)/mL介質(zhì)；其中所述操作條件在篩選步驟中鑒定；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的蛋白質(zhì)。106.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的蛋白質(zhì)的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件由至少0.1的分配系數(shù)限定；其中所述操作條件在篩選步驟中鑒定；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的蛋白質(zhì)。107.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的蛋白質(zhì)的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少1到約70mg蛋白質(zhì)/mL介質(zhì)并且由0.3到20的分配系數(shù)限定；其中所述操作條件在篩選步驟中鑒定；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的蛋白質(zhì)。108.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少lmg抗體/mL介質(zhì)；其中所述操作條件在篩選步驟中鑒定；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。109.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件由至少0.1的分配系數(shù)限定；其中所述操作條件在篩選步驟中鑒定；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。110.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少1到約70mg抗體/mL介質(zhì)并且由0.3到20的分配系數(shù)限定；其中所述操作條件在篩選步驟中鑒定；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。111.一種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過帶電的離子交換介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少lmg抗體/mL介質(zhì)；其中所述操作條件包括pH值水平和離子強度；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。112.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過帶電的離子交換介質(zhì)，所述操作條件由至少0.1的分配系數(shù)限定；其中所述操作條件包括pH值水平和離子強度；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。113.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過帶電的離子交換介質(zhì)，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少1到約70mg抗體/mL介質(zhì)并且由0.3到20的分配系數(shù)限定；其中所述操作條件包括pH值水平和離子強度；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。114.一種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過疏水性相互作用層析樹脂，所述操作條件使得所述樹脂結(jié)合至少lmg抗體/mL樹脂；其中所述操作條件包括pH值水平、離子強度、和鹽濃度；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。115.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過疏水性相互作用層析樹脂，所述操作條件由至少0.1的分配系數(shù)限定；其中所述操作條件包括pH值水平、離子強度和鹽濃度；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。116.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過疏水性相互作用層析樹脂，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少1到約70mg抗體/mL介質(zhì)并且由0.3到20的分配系數(shù)限定；其中所述操作條件包括pH值水平、離子強度和鹽濃度；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。117.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過羥基磷灰石層析樹脂，所述操作條件使得所述樹脂結(jié)合至少lmg抗體/mL樹脂，其中所述操作條件包括pH值水平、離子強度、磷酸鹽濃度、鈣濃度、精氨酸濃度、甘氨酸濃度和HEPES濃度；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。118.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過羥基磷灰石層析樹脂，所述操作條件由至少0.1的分配系數(shù)限定；其中所述操作條件包括pH值水平、離子強度、磷酸鹽濃度、鈣濃度、精氨酸濃度、甘氨酸濃度和HEPES濃度；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。119.一種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過羥基磷灰石層析樹脂，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少1到約70mg抗體/mL介質(zhì)并且由0.3到20的分配系數(shù)限定；其中所述操作條件包括pH值水平、離子強度、磷酸鹽濃度、鉤濃度、精氨酸濃度、甘氨酸濃度和HEPES濃度；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。120.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過固定的金屬親和層析樹脂，所述操作條件使得所述樹脂結(jié)合至少lmg抗體/mL樹脂；其中所述操作條件包括反配體水平和pH值水平；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。121.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過固定的金屬親和層析樹脂，所述操作條件由至少0.1的分配系數(shù)限定；其中所述操作條件包括反配體水平和pH^直水平；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。122.—種從包括一種或多種混雜物的負載流體回收純化的抗體的方法，包括步驟使所述負載流體在操作條件下通過固定的金屬親和層析樹脂，所述操作條件使得所述介質(zhì)結(jié)合至少1到約70mg抗體/mL介質(zhì)并且由0.3到20的分配系數(shù)限定；其中所述操作條件包括反配體水平和pH值水平；和在負載循環(huán)和任何基本上等度的洗滌期間在柱流出物中回收所述純化的抗體。全文摘要本發(fā)明涉及使用弱分配層析從含有一種或多種混雜物的負載流體中純化產(chǎn)物的方法。進一步的，本發(fā)明涉及由操作條件限定的弱分配層析的方法，所述操作條件使得介質(zhì)結(jié)合至少1mg產(chǎn)物/ml介質(zhì)，或作為選擇，由至少0.1的分配系數(shù)限定。文檔編號C07K1/00GK101175765SQ200680016391公開日2008年5月7日申請日期2006年3月10日優(yōu)先權(quán)日2005年3月11日發(fā)明者B·D·凱利,J·E·布思,J·科夫曼,M·B·斯威策,P·布朗,R·戈達瓦蒂,S·孫,S·文努姆,T·于,T·艾斯克拉申請人:惠氏公司