專利名稱：：與具有順磁性質(zhì)的小顆粒相連接的各種化學(xué)庫(kù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及組合化學(xué)、蛋白化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：分子的大集合(例如庫(kù))已逐漸顯現(xiàn)成為用于成功鑒別有用的化合物的重要工具。如此的庫(kù)通常利用此處將進(jìn)一步描述的組合方法進(jìn)行合成。組合庫(kù)是多種含有更小亞單元或單體的化學(xué)化合物的集合庫(kù)擁有不同大小，從數(shù)百個(gè)至數(shù)百萬(wàn)種化學(xué)化合物。例如由l8種天然氨基酸制備的直線性六肽庫(kù)含有34x]06中不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。當(dāng)還包括氨基酸類似物和異構(gòu)體時(shí)，可能的結(jié)構(gòu)的數(shù)目實(shí)際上是無(wú)限的。所述化學(xué)方法也促進(jìn)了環(huán)狀肽和支化肽的合成。也有多種庫(kù)的類型，包括由諸如肽、糖、核酸、寡核普酸和小有機(jī)分子等組成的寡聚庫(kù)和高聚庫(kù)。通過(guò)化學(xué)合成(Houghtene^/,1991,A^we354:84-6)或基因表達(dá)(Marks"a/,1991,222:581-97)已制得數(shù)千個(gè)，甚至數(shù)百萬(wàn)種的任意寡核普酸的庫(kù)，陳列在色譜載體上(LamW"/，1991,A^w"354:82-4)、在細(xì)菌細(xì)胞中(Colas"a/,1996,Atow廠e380:548-550)、在細(xì)菌纖毛上(Lu,19卯，AoTec/wo/ogy13:366-372)或噬菌體中(Smith,1985,S固ce228:1315-7)。也已制得蛋白質(zhì)(Ladner,U.S.Pat.No.4,664,989)、甘氨酸氨基取代的陽(yáng)離子寡聚合物(peptoids)(Simon""/，1992,尸racAto/JcadSc,89:9367-71)、核酸(EllmgtonandSzostak,1990,A^wm246:818-22)、糖和小有機(jī)分子(Eichler"a/，1995,M^e』ev15:481-96)的庫(kù)。此外，在固體載體上直接合成了環(huán)肽、肽酰胺、肽醛等(Baranywa/.，1987,/"/1.J尸e/^,de尸廠o,ew尺es30:705-739;Fields"a/.,1990,/尸e//7(ie/Vofe/"i^es35:161-214;Lloyd-Williamsefa/,1993,7^ra/ze<in3w49:11065-11133;Wang,1973,J^merC7ewSoc95:1328;Barlosa/,1989,7Wra/^謂丄襲"30:3947;Beebe"a/，1995,J(>gC/zem60:4204;Rink,1987,7Wraf/zet/rawZ^"e^28:3787;Rapp"a/，in"尸ep"^fes/98S"'Proc.20thEuropeanPeptideSymposium,JungG.andBoyerE.(Eds.),WalkerdeGruyter,Berlin,pp1991989]。為制備組合庫(kù)，將固體載體(樹(shù)脂)與一種以上的化合物亞單元以及與一種以上的試劑在仔細(xì)控制，預(yù)定順序的化學(xué)反應(yīng)中反應(yīng)。換言之，所述庫(kù)亞單元在固體載體上"生長(zhǎng)"。固體載體通常是表面經(jīng)功能化能連接亞單元或單體形成所述庫(kù)的化合物的聚合物體。一個(gè)庫(kù)的合成通常涉及大量的固體載體。在本領(lǐng)域中已知的固體載體包括除別的以外的聚苯乙烯樹(shù)脂小珠、棉線和聚四氟乙烯("PTFE")的膜片材。組合庫(kù)擁有多種用途，例如鑒別和表征化配體，所述配體能結(jié)合受體分子或者能介導(dǎo)所關(guān)心的生物活性(ScottandSmith,1990,249:386-390;Salmon"a/，1993,尸廠oc淑/^cac/園90:11708-11712;);結(jié)合抗肽抗體(Fodora/，1991,S固ce251:767-773;Needles""/，1993,尸rac層/lca""90:10700-10704;ValadonWa/，1996,./Mo/5,o/261:11-22);進(jìn)行篩選以與多種耙結(jié)合，所述耙包括細(xì)胞蛋白(Schmitze,"/，1996,JM)/脂260:664-677)、病毒蛋白(HongandBoulanger,1995,E雄(9,/"j7/"727,、細(xì)菌蛋白(JacobssonandFrykberg,1995,Aotec/zm々認(rèn)s18:878-885)、核酸(Cheng"a/,1996,171:1-8)、塑料(Siani"a/，/99《/CAem/"/Co附/W&z34:588-593)和具有生物功能的分子(Hammonetal.,U.S.patentapplicationNo.2004/0101830)。大配體庫(kù)的另一重要用途是在蛋白質(zhì)組學(xué)中，更具體而言，用于減小在復(fù)雜生物混合物如血清中分析物的濃度范圍。該方法也被稱作"均衡"，涉及將固相固定的配體庫(kù)暴露于來(lái)自樣品的蛋白質(zhì)。當(dāng)使用大庫(kù)時(shí)，樣品中的大多數(shù)或者所有蛋白質(zhì)被所述庫(kù)中至少一種獨(dú)特的配體結(jié)合。通過(guò)限制所使用的庫(kù)的大小，即配體的總實(shí)際數(shù)目，含量豐富的蛋白質(zhì)將使其配體飽和，而稀有蛋白質(zhì)則不能。將沒(méi)有足夠的配體與之結(jié)合的蛋白質(zhì)沖洗掉，被保留的蛋白質(zhì)具有被壓縮的濃度范圍-最豐富的蛋白質(zhì)的相對(duì)量與所述稀有的蛋白質(zhì)的相對(duì)量相近。該方法例如在EP1580559Al(Boschetti)中得以描述。在實(shí)施該方法時(shí)，當(dāng)將被"均衡"的樣品僅能少量提供時(shí)，小體積的配體庫(kù)是有用的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種解決方法以解決在對(duì)于復(fù)雜蛋白質(zhì)化合物的分析和純化蛋白質(zhì)有用的"等分-偶聯(lián)-重組"(split-couple-and-recombine)組合化學(xué)合成中對(duì)非常小的顆粒的操作問(wèn)題。在本發(fā)明的一個(gè)方面，一種方法涉及提供具有順磁性質(zhì)的小顆粒，在其上將進(jìn)行所述"等分-偶聯(lián)-重組"組合化學(xué)合成，并通過(guò)磁力例如使用磁體對(duì)所述顆粒進(jìn)行操作。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，提供了制備與顆粒相連的各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的組合庫(kù)的方法。該方法包括利用具有順磁性質(zhì)的直徑為約100nm約10jum的顆粒集合和大量不同的化學(xué)部分進(jìn)行多次循環(huán)的"等分-偶聯(lián)-重組"化學(xué)合成的步驟，其中每次"等分-偶聯(lián)-重組"化學(xué)合成循環(huán)加入一種化學(xué)部分到化學(xué)結(jié)構(gòu)中，并涉及對(duì)所述具有順;茲性質(zhì)的顆粒的磁性操作，以及其中循環(huán)數(shù)足以建立具有至少100,000種獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)的庫(kù)。在某個(gè)實(shí)施方式中，所述具有順磁性質(zhì)的顆粒具有約300nm約5ium或者ljum3jum的直《圣。許多化學(xué)結(jié)構(gòu)可用于實(shí)施本發(fā)明的方法和制備本發(fā)明的組合物。優(yōu)選的化學(xué)結(jié)構(gòu)是肽、寡核苷酸、寡糖或合成有機(jī)分子。所述庫(kù)擁有多種多樣的大量獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)。優(yōu)選為本發(fā)明的庫(kù)擁有至少1百萬(wàn)種獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性，還更優(yōu)選為所述庫(kù)具有其中擁有至少100,000,000種化學(xué)結(jié)構(gòu)的大小。在化學(xué)結(jié)構(gòu)是肽的實(shí)施方式中，所述庫(kù)擁有至少3百萬(wàn)種獨(dú)特的肽的多樣性，優(yōu)選為至少6千4百萬(wàn)種獨(dú)特的肽。優(yōu)選的的是基本含有組合庫(kù)的所有成員的庫(kù)。采用具有順^f茲性質(zhì)的直徑為約100nm約10Mm的顆粒，在優(yōu)選實(shí)施方式中，庫(kù)尤其是肽庫(kù)少于約ioo微升。具有順磁性質(zhì)的顆?？梢园床煌椒ㄖ圃?。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述具有順磁性質(zhì)的顆粒包含其中嵌有順磁材料的聚合物材料。所述具有順磁性質(zhì)的顆粒也可包含多孔顆粒，其中所述順磁材料容納在這些顆粒的孔中。在本發(fā)明的其他方面，提供了與具有順磁性質(zhì)的直徑為約100nm約10jum的顆粒的集合相連的各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的庫(kù)。所述化學(xué)結(jié)構(gòu)包括大量不同的化學(xué)部分，并且與每個(gè)個(gè)別的具有順>磁性質(zhì)的顆粒相連的化學(xué)結(jié)構(gòu)基本上具有相同的結(jié)構(gòu)，以及所述庫(kù)擁有至少100,000種獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性(adiversityofatleast100,000uniquechemicalstructures)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述顆?；臼菃畏稚⒌?，所述化學(xué)結(jié)構(gòu)是肽，并且所述庫(kù)擁有多種多樣的(adiversityof)至少300,000種獨(dú)特的肽。還優(yōu)選的是擁有多種多樣的至少3,000,000種獨(dú)特的肽，優(yōu)選為多種多樣的至少30,000,000種獨(dú)特的肽，更優(yōu)選為多種多樣的至少64,000,000種獨(dú)特的肽，甚至更優(yōu)選為多種多樣的至少100,000,000種獨(dú)特的肽。優(yōu)選的庫(kù)是基本包含所述組合庫(kù)的所有成員的庫(kù)。所述顆?？珊卸喾N交聯(lián)合成聚合物或天然聚合物。優(yōu)選的是其中交聯(lián)合成聚合物或天然聚合物是聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、尼龍、聚氨酯或聚糖的顆粒。在本發(fā)明的另一方面，提供了與具有順磁性質(zhì)的直徑為約100nm約10Mm的顆粒的集合相連的各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的庫(kù)，其中所述化學(xué)結(jié)構(gòu)包括大量不同的化學(xué)部分，所述庫(kù)擁有多種多樣的至少100,000種獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并且各個(gè)具體的微粒與各種化學(xué)結(jié)構(gòu)中的大部分相連。本發(fā)明還提供了試劑盒。優(yōu)選的本發(fā)明的試劑盒含有本發(fā)明的庫(kù)。例如，本發(fā)明的試劑盒可用于減小在混合物中分析物的濃度范圍，用于檢測(cè)混合物中的分析物或用于純化蛋白質(zhì)。因此，所述試劑盒附有一份或者多份使用說(shuō)明用于使用所述庫(kù)減小在混合物中分析物的濃度范圍，用于檢測(cè)混合物中的分析物或用于純化蛋白質(zhì)?？蛇x的是，試劑盒也包括盛有緩沖液的容器。其他的本發(fā)明的試劑盒的實(shí)施方式包括可選的功能性成分使得本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能實(shí)施此處描述的任何方法變4匕。合物的優(yōu)選用途是用于減小在混合物中分析物的濃度范圍的方法。該方法包括以下步驟(a)提供第一樣品，所述第一樣品含有以第一濃度范圍存在于所述第一樣品中的大量不同的分析物物種(analytespecies);(b)將所述第一樣品與一定量的與具有順磁性質(zhì)的直徑為約100nm~約10Mm的顆粒的集合相連的各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的庫(kù)相接觸，其中所述化學(xué)結(jié)構(gòu)包括大量不同的化學(xué)部分，并且與每個(gè)個(gè)別的具有順磁性質(zhì)的顆粒相連的化學(xué)結(jié)構(gòu)基本上具有相同的結(jié)構(gòu)，以及所述庫(kù)擁有多種多樣的至少100,000種獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)；(c)利用所述不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)從所述第一樣品中俘獲一定量的不同分析物物種并除去未結(jié)合的分析物物種；以及(d)將俘獲的分析物物種與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)分離以制備第二樣品，所述第二樣品含有以第二濃度范圍存在于所述第二樣品中的大量不同的分析物物種；其中所述庫(kù)的量經(jīng)選擇以俘獲一定量的不同分析物物種從而使所述第二濃度范圍小于所述第一濃度范圍。在該方法的一個(gè)方面，所述俘獲的分析物物種的分離包括逐步洗脫以制備大量等分試樣。可選的是，該方法包括檢測(cè)所述已分離的分析物的步驟。才企測(cè)可由質(zhì)譜或電泳完成。在優(yōu)選實(shí)施方式中，分離所述俘獲的分析物包括將分析物合來(lái)自洗出液的分析物。在本發(fā)明的還一個(gè)方面，提供了一種檢測(cè)混合物中的分析物的方法。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該方法包括以下步驟(a)提供第一樣品，所述第一樣品含有以第一濃度范圍存在于所述第一樣品中的大量不同的分析物物種；(b)將所述第一樣品與一定量的與具有順磁性質(zhì)的直徑為約100nm約lOjum的顆粒的集合相連的各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的庫(kù)相接觸，其中所述化學(xué)結(jié)構(gòu)包括大量不同的化學(xué)部分，并且與每個(gè)個(gè)別的具有順磁性質(zhì)的顆粒相連的化學(xué)結(jié)構(gòu)基本上具有相同的結(jié)構(gòu)，以及所述庫(kù)擁有多種多樣的至少100,000種獨(dú)特的(unique)化學(xué)結(jié)構(gòu)；(c)利用所述不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)從所述第一樣品中俘獲一定量的不同分析物物種并除去未結(jié)合的分析物物種；(d)將帶有被俘獲的分析物的顆粒放入質(zhì)譜儀中；(e)利用激光解吸附質(zhì)謙檢測(cè)所述被俘獲的分析物。此外，本發(fā)明提供了純化目標(biāo)蛋白質(zhì)組(targetproteingroup)的方法。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該方法包括以下步驟(a)將含有至少95%和至多5%污染蛋白質(zhì)(contaminatingproteins)的樣品與連接于具有順磁性質(zhì)的直徑為約100nm約10Mm的顆粒集合的各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的庫(kù)(library)相接觸，其中所述化學(xué)結(jié)構(gòu)包括大量不同的化學(xué)部分，并且與每個(gè)個(gè)別的具有順磁性質(zhì)的顆粒相連的化學(xué)結(jié)構(gòu)基本上具有相同的結(jié)構(gòu)，以及所述庫(kù)擁有多種多樣的至少100,000種獨(dú)特的(umque)化學(xué)結(jié)構(gòu)，其量足以結(jié)合污染蛋白質(zhì)和少量的目標(biāo)蛋白質(zhì)組；(b)將所述污染蛋白質(zhì)和少量的目標(biāo)蛋白質(zhì)組與化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)相連接；(c)從與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)相連的污染蛋白質(zhì)和目標(biāo)蛋白質(zhì)組中分離未結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)組；以及(d)從樣品中收集未結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)組；由此所收集的目標(biāo)蛋白質(zhì)組比所述樣品中的目標(biāo)蛋白質(zhì)更純。圖1描述了SDS-PAGE分析顯示使用普通小珠(泳道b)和磁化小珠(泳道c)的均衡方法的對(duì)比分析結(jié)果。泳道a顯示的是分子標(biāo)記。細(xì)節(jié)在實(shí)施例1中提供。圖2描述了血清樣品的SDS-PAGE分析，所述樣品用^f茲化固相六肽配體庫(kù)(泳道c)和普通小3朱(泳道b,lt據(jù)來(lái)自于實(shí)施例1)和初始人血清蛋白(泳道a)。細(xì)節(jié)在實(shí)施例2中提供。圖3描述了來(lái)自14種不同血清處理試驗(yàn)的樣品的SELDIMS分析。所使用的蛋白質(zhì)芯片陣列(ProteinChipArray)是QIO。顯示的分子量范圍從約5kDa約20kDa。細(xì)節(jié)在實(shí)施例3中提供。具體實(shí)施例方式提供給研究者的生物樣品如血清、腦脊髓液等可能僅有不超過(guò)數(shù)毫升的量。在篩選實(shí)驗(yàn)中，優(yōu)選為盡可能少地使用這些珍貴的材料。一種分析生物樣品的方法涉及將所述樣品暴露于例如通過(guò)"等分-偶聯(lián)-重組"方法制得的與顆粒相連的多樣化化學(xué)庫(kù)。然而，通常用于制備如此的化學(xué)庫(kù)的顆粒在40微米100微米的大小范圍內(nèi)。完全的20種氨基酸的六肽組合庫(kù)具有各種各樣的約6千4百萬(wàn)種獨(dú)特的肽種類。附著在具有40微米~IOO微米尺度范圍的小珠上時(shí)，所述庫(kù)的體積約為16毫升。通常，所述向小珠加入最少IO體積的血清，對(duì)應(yīng)于160mL或者9600mg蛋白質(zhì)。為處理100ML的血清體積，需要10juL的配體庫(kù)。這樣的庫(kù)僅擁有各種各樣的30,000種獨(dú)特的六肽種類，這對(duì)于俘獲在復(fù)雜生物樣品如血清中的各種蛋白質(zhì)是不理想的。此外，當(dāng)從由數(shù)千萬(wàn)種組合構(gòu)成的大量?jī)?chǔ)備材料中取樣出10nL這樣的庫(kù)，每一個(gè)單獨(dú)的樣品將相互不同。因此最終結(jié)果的再現(xiàn)性將是可疑的。解決該問(wèn)題的一種方法是使用極小的顆粒，例如直徑在200nm~10的范圍內(nèi)。在第一種情況下，10yl這樣的小珠將含有1.25x1012個(gè)小珠。；在第二種情況下，相同體積將含有約107個(gè)小珠，如此大小的小珠是非常難以操作的。尤其是，組合化學(xué)的等分-偶聯(lián)-重組法通常涉及在流通柱中進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，隨后過(guò)濾分離溶劑和過(guò)量的反應(yīng)物。小顆粒將貼在這些柱子里的過(guò)濾器上，使之不能洗滌所述顆粒并在化學(xué)偶合后收集所述顆粒。本發(fā)明提供了在等分-偶聯(lián)-重組組合化學(xué)合成中對(duì)極小顆粒進(jìn)行操作的問(wèn)題的解決方法。所述方法包括提供具有順磁性質(zhì)的小顆粒，化學(xué)反應(yīng)在其上進(jìn)行，并利用磁性例如使用磁體對(duì)所述顆粒進(jìn)行操作。本發(fā)明還提供了與顆粒相連的配體庫(kù)，其中所述庫(kù)的獨(dú)特的成員中的大部分或者基本全部均附在各自獨(dú)立的顆粒上。I.具有順磁性質(zhì)的小顆粒A.順磁性和非順磁性材料本發(fā)明的顆粒具有順磁性質(zhì)。即，所述顆粒具有可與外部》茲場(chǎng)對(duì)齊的原子/f茲性偶極。因此，本發(fā)明的顆粒可被》茲鐵吸引并在》茲場(chǎng)作用下類似普通磁體一樣具有磁吸引力。所述顆粒通常為單分散，其直徑可為100nm~1000nm。在操作中，這些小珠保持懸??；隨后它們能被磁場(chǎng)分離。"基本為單分散"是指所述顆粒直徑范圍的標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過(guò)2%。本發(fā)明的具有磁性的顆粒通常包括順磁材料和非順磁材料，所述化學(xué)結(jié)構(gòu)與之化學(xué)地通常為共價(jià)地相連。所述順磁材料由非常精細(xì)的具有順;茲性的礦物氧化物如磁鐵礦(混合氧化鐵)、赤鐵礦(氧化鐵)、鉻鐵礦(鐵和鉻的鹽)和所有其他可被電》茲石的永久》茲鐵所吸引的材料的顆粒構(gòu)成。同樣，也可以使用鐵酸鹽如四氧化三鐵(Fe304)、Y-三氧化二鐵(Y-Fe203)、MnZn-鐵酸鹽、NiZn-鐵酸鹽、YFe-石榴石、GaFe-石榴石、Ba-鐵酸鹽和Sr-鐵酸鹽；金屬諸如鐵、錳、鈷和鎳；鐵、錳、鈷、鎳等合金，但并不局限于此。優(yōu)選材料是磁鐵礦，這是因?yàn)槠淙菀纵兜貌⑶页杀镜土?。以大小不同、干燥的顆?；蛘咭苑€(wěn)定的水懸浮液提供。這些顆粒分散在聚合物網(wǎng)絡(luò)中并使整個(gè)顆粒具有被永久磁石或者電；茲石吸收的性質(zhì)。其上附有化學(xué)結(jié)構(gòu)的非順磁材料由聚合材料制成。其中最常用的聚合材料是交聯(lián)丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚氨酯、聚乙烯、尼龍和:^合物所述單體包括i乙烯類可聚合單^例二i乙烯、a-甲基苯乙烯、(3-甲基苯乙烯、鄰曱基苯乙烯、間曱基苯乙烯、對(duì)曱基苯乙烯、2,4-二曱基苯乙烯、對(duì)正丁基苯乙烯、對(duì)叔丁基苯乙烯、對(duì)正己基苯乙烯、對(duì)正辛基苯乙烯、對(duì)正壬基苯乙烯、對(duì)正癸基苯乙烯、對(duì)正十二烷基苯乙烯、對(duì)曱氧基苯乙烯和對(duì)苯基苯乙烯苯乙烯；丙烯酸類可聚合單體例如丙烯酸曱酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丙酯、丙烯酸異丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸異丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸正戊酯、丙烯酸正己酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸正辛酯、丙烯酸正壬酯、丙烯酸環(huán)己酯、丙烯酸苯甲酯、丙烯酸二曱基磷酸乙酯、丙烯酸二乙基磷酸乙酯、丙烯酸二丁基磷酸乙酯和丙烯酸2-苯甲酰氧乙酯；曱基丙烯酸類可聚合單體例如曱基丙烯酸甲酯、曱基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丙酯、甲基丙烯酸異丙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸異丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸正戊酯、甲基丙烯酸正己酯、曱基丙烯酸2-乙基己酯、曱基丙烯酸正辛酯、甲基丙烯酸正壬酯、甲基丙烯酸二乙基磷酸乙酯、丙烯酰胺、曱基丙烯酰胺及其衍生物；甲基丙烯酸二丁基磷酸乙酯；亞曱基脂肪族單羧酸酯單體諸如乙烯酯、乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、苯曱酸乙烯酯、丁酸酯、苯曱酸乙酯、甲乙烯酯；乙烯醚諸如乙烯基曱基醚、乙烯基己基醚和乙烯基異丙基醚；和乙烯酮諸如乙烯基曱基酮、乙烯基己基酮和乙烯基正丁基酮。其他可聚合結(jié)構(gòu)的例子是由無(wú)極固體構(gòu)成的可聚合結(jié)構(gòu)，包括粘土材料諸如高嶺土、斑脫土、滑石和云母等；金屬氧化物諸如氧化鋁、二氧化鈦和二氧化鋅；不溶性無(wú)機(jī)鹽諸如硅膠、羥磷灰石和磷酸釣?zāi)z；金屬諸如金、銀、鉑和銅；和半導(dǎo)體化合物諸如GaAs、GaP和ZnS。所述材料并不局限于此。所述可聚合結(jié)構(gòu)可以兩種以上組合使用。這些非順磁性聚合性網(wǎng)絡(luò)可以是致密的或多孔的。在第一種情況下，外表面區(qū)域用于與分析物相互作用，在第二種情況下如果所述孔對(duì)于分析物的自由擴(kuò)散而言足夠大，則所有多孔性結(jié)構(gòu)將用于分子相互作用。B.微顆粒固體載體的尺寸本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式采用微小的、珠狀微顆?；腆w載體，其小于10Mm，優(yōu)選直徑為200nm~10mm,300nm~5Mm或1jum3pm。(非球形顆粒的直徑指最長(zhǎng)尺度的長(zhǎng)度。)由于微顆粒固體載體與較大的小珠相比具有增加的表面積體積比，因此是合意的。微顆粒固體載體也減少了包含全部組合庫(kù)所必需的載體的體積，因此可以使用更復(fù)雜和有效的庫(kù)。C.制造具有順磁性質(zhì)的微d、珠狀材料可用于本發(fā)明的具有順》茲性質(zhì)的顆粒可由多個(gè)商業(yè)供應(yīng)商提供。其中包括例如Dynal(Invitrogen)(Carlsbad,CA),Ademtech(PessacFrance-superparamagneticnanoparticles)和Spherotech(Libertyville,IL)。本發(fā)明的具有順磁性質(zhì)的微小珠狀材料可采用多種方法制造。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，可將/f茲鐵礦顆?；蛘呔奂w粒包封在聚合物外層中，組合配體可附在所述聚合物外層上。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式中，可通過(guò)用順^茲顆粒如磁鐵礦的膠狀水懸浮液充填已有的非順磁性多孔聚合物小珠得到順磁材料。這些后述順磁顆粒逐漸擴(kuò)散進(jìn)入多空聚合物小珠并被捕獲在所述多孔結(jié)構(gòu)中形成內(nèi)部聚集體。未在所述聚合物小珠內(nèi)被捕獲的過(guò)量順磁材料隨后使用合適的溶劑洗去。可在組合庫(kù)的配體附著到所述聚合物小珠之前或之后完成該順磁材料的"充填"。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，可通過(guò)將順磁材料與聚合物或者單體混合，然后聚合或者交聯(lián)所述聚合物或者單體得到所述具有順磁性質(zhì)的顆粒。在第一種情況下，將微小順磁性材料加入到丙烯酸或者乙烯單體溶液中并在適宜的攪拌下保持懸浮。然后將所述溶液倒入非易混合的溶劑中以保持小液滴的懸浮。所述小液滴的尺寸及其分布取決于攪拌方法。一旦所述小液滴懸浮液達(dá)到期望的尺寸，使單體聚合并且小液滴變?yōu)樾≈?。該方法稱為"乳液聚合，，。所述順磁材料的顆粒因此包封在所述聚合物網(wǎng)絡(luò)中。在第二種情況下，將微小順磁性材料(例如顆粒)加入到多糖溶液(例如瓊脂糖、葡聚糖)中并在適宜攪拌下保持懸浮，同時(shí)加入合適的交聯(lián)劑(例如bisepxoyrance、二乙烯基石風(fēng))并調(diào)節(jié)pH滿足交聯(lián)條件。隨后將所述多糖與懸浮態(tài)顆粒的溶液導(dǎo)入非易混合的溶劑中以保持小液滴的懸浮。所述小液滴的尺寸及其分布取決于攪拌方法。一旦所述小液滴懸浮液達(dá)到期望的尺寸，將所述懸浮液保持在預(yù)定溫度下直至交聯(lián)反應(yīng)完成。微小水性液滴逐漸變?yōu)樾≈?。所述順磁材料的顆粒從而包封在所述聚合物網(wǎng)絡(luò)中使所得材料具有順磁性質(zhì)。D.固體載體用于本發(fā)明，尤其是用于合成肽庫(kù)的固體載體材料的適用性可根據(jù)以下條件進(jìn)行評(píng)價(jià)(a)在所述固體載體上合成肽的能力(所(b)所述固體載體應(yīng)該包含游離氨基，或者合適的穩(wěn)定的但可切割的連接基團(tuán)(然而，應(yīng)當(dāng)注意的是可切割連接基團(tuán)并非必須)；(c)所述固體載體應(yīng)當(dāng)在合成、篩選和處理中機(jī)械穩(wěn)定；(d)所述固體載體的尺寸應(yīng)當(dāng)足夠大使之可以進(jìn)行手工操作，或者任何可以作為替換的操作方法；(e)所述小珠的肽容量應(yīng)當(dāng)至少為每個(gè)小珠上約10pmole肽，或者是任何在測(cè)序和檢測(cè)技術(shù)中切實(shí)可行的更低限(優(yōu)選為約100pmole的容量)；和(f)所述固體載體應(yīng)當(dāng)大體上表現(xiàn)出對(duì)所選擇的配體和蛋白的較低程度的非特異性吸附。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解這些條件不應(yīng)當(dāng)被理解為絕對(duì)的要求。用于本發(fā)明的可接受的固體載體多種多樣。固體載體可以是多孔的或者非多孔的，但優(yōu)選為多孔的。可以是連續(xù)的或者非連續(xù)的，柔性的或者非柔性的。固體載體可以由包括陶瓷、玻璃、金屬、有機(jī)聚合材料或者其組合在內(nèi)的各種材料制成。所述微顆粒載體的形狀可以是諸如聚對(duì)苯二曱酸乙二醇酯(PET)、二乙酸酯、三乙酸酯、玻璃紙、纖維素、聚碳酸酯、聚酰亞胺、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯和聚酯等塑料材料膜的形狀；諸如聚氯乙烯、聚乙烯醇、乙酰纖維素、聚碳酸酯、尼龍、聚丙烯、聚乙烯或者特氟龍(Teflon)等聚合物多孔膜；木板；玻璃板；硅基板；由諸如棉、人造纖維、丙烯酸纖維、絲和聚酯纖維等材料形成的織物；以及由諸如無(wú)原木紙、中等質(zhì)量紙(medium-qualitypaper)、力口工印刷紙、證券纟氏、再生紙、鋇白紙、4壽涂紙、鈹紋氺反紙和樹(shù)脂涂覆紙等紙片材。自然地，所述載體的形狀并非局限于此。膜形狀或者片材形狀的材料可具有光滑的表面或者粗糙的表面，只要所述磁性物質(zhì)能保持在其上。優(yōu)選的固體載體包括有機(jī)聚合物載體諸如顆?；蛘咧闋钶d體，也可以使用聚丙烯酰胺和礦石載體諸如硅酸鹽和金屬氧化物。特別優(yōu)選的實(shí)施方式包括球狀或不規(guī)則狀'J、珠或顆粒的固體載體。因?yàn)槎嗫仔圆牧咸峁┚薮蟮谋砻娣e，所以是有用的。所述多孔型材料可以是合成的或者天然的，有機(jī)的或者無(wú)機(jī)的。合適的固體載體與用于蛋白分離的色i普吸附劑非常相似，具有至少約1.0納米(nm)的孔徑和至少約0.1立方厘米/克(cmVg)的孔體積的多孔性結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的是，所述孔徑為至少30nm,這是因?yàn)楦蟮目讓?duì)擴(kuò)散的限制性越小。優(yōu)選的是，所述孔體積至少為0.5cmVg以具有更大的潛在容量，這是由于圍繞所述孔更大的表面積。優(yōu)選的多孔載體包括顆粒化或者珠狀載體，諸如瓊脂糖、親水性聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、礦物氧化物，包括球狀和不規(guī)則小珠和顆粒。由于明顯的優(yōu)點(diǎn)，用于化學(xué)結(jié)構(gòu)的固體載體優(yōu)選為親水性的。優(yōu)選為，所述親水聚合物是水溶脹性的以滲透更多的分析物。如此的載體的例子包括天然多糖例如纖維素、改性纖維素、瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖、氨基修飾交聯(lián)葡聚糖、瓜爾膠、改性瓜爾膠、黃原膠、槐豆膠和水凝膠。其他例子包括交聯(lián)合成親水聚合物諸如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇(PVA)和改性聚乙二醇。優(yōu)選的聚合材料是根據(jù)其組成能與用于構(gòu)建所述組合庫(kù)的溶劑相容的材料。通常，具有順磁性質(zhì)的顆粒含有反應(yīng)性基團(tuán)如氨基或羧基，或者普遍已知的用于制備其上將連接化學(xué)部分的親和色譜載體的反應(yīng)性基團(tuán)。在表面上的未反應(yīng)交聯(lián)基團(tuán)可與小化合物如巰基乙醇反應(yīng)以防止其進(jìn)一步反應(yīng)。此外，表面可經(jīng)進(jìn)一步處理以防止蛋白質(zhì)的非特異性粘附。所述微顆粒固體載體包括順磁性顆粒，能夠簡(jiǎn)單地一步將未結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)基團(tuán)和與所述順磁性小珠上連接的化學(xué)結(jié)構(gòu)相結(jié)合的蛋白分離。II.化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)用在本發(fā)明中的化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)包括至少100,000種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的集合。在某些具體實(shí)施方式中，所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)擁有至少300,000,1,000,000,3,000,000，10,000,000,50,000,000或者至少100,000,000種獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)。優(yōu)選為，在所述庫(kù)中的至少一種結(jié)構(gòu)識(shí)別在將被分析的化合物中各自的分析物。優(yōu)選為，所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)至少包括與樣品中的分析物相同數(shù)量的不同化學(xué)結(jié)構(gòu)。通常，以及如下詳細(xì)描述，化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)與不溶性固體載體或者顆粒材料相連。每種固體載體或者不溶性顆粒優(yōu)選粘附多份拷貝的相同化學(xué)結(jié)構(gòu)，而每一種顆粒類型連接不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何技術(shù)。例如，化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)可以是化學(xué)合成的，從天然來(lái)源中獲得的，或者在化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)是生物有機(jī)聚合物的情況下使用重組技術(shù)制造的。然而，在優(yōu)選實(shí)施方式中，通過(guò)利用已知的"等分-偶聯(lián)-重組"法的組合合成制備的所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)。也可購(gòu)買預(yù)先與所述固體載體連接的，或者使用標(biāo)準(zhǔn)方法間接連接或者直接固定在所述固體載體上的化學(xué)結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)例如，HarlowandLane,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1988);Biancala""/，LettersinPeptideScience2000,7(291):297;MacBeath""/，Science2000,289:1760-1763;Cass""/，ed.,fVoc'ee<i//7gvo/z1/^TTz/Wee/^/zv4merzc""尸ep"(iejSym/c7'wm，.Leiden,Escom,975-979(1994);美國(guó)專利第5,576,220號(hào)；Cook""/，TetrahedronLetters1994,35:6777-6780;andFodor"a/,Science1991,251(4995):767-773))。A.組合庫(kù)在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)是組合庫(kù)或其部分。組合化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)是通過(guò)化學(xué)合成或者生物合成，通過(guò)以所有可能的組合將大量化學(xué)"構(gòu)建塊"組合生成的化合物的集合。例如，完整的線性組合化學(xué)庫(kù)，諸如多肽庫(kù)是通過(guò)將一套化學(xué)構(gòu)建塊(氨基酸)以指定化合物長(zhǎng)度(即在多肽化合物中氨基酸的數(shù)目)以每種可能的方式組合形成的。舉例，如果所述構(gòu)建塊的數(shù)目為5,而所述構(gòu)造由5塊組成，則可能的線性組合的數(shù)目為55或者3125種。在該情況下，所述構(gòu)建塊(A、B、C、D和E)線性地裝配，例如A-A-A-A-A;A-A-A-A-B;A-A畫(huà)A-A-C;A誦A畫(huà)A-B-A;A-A-A匿B畫(huà)B;A-A-A-B-C;A-A-B曙A-A;A-A陽(yáng)B-A-B;A陽(yáng)A畫(huà)B-A-C;E畫(huà)E-E-E-C;E-E-E-E-D;E-E隱E-E-E。"基本全部的"組合庫(kù)的的成員是至少95%的所述庫(kù)的獨(dú)特的成員。組合庫(kù)的其他形式是腳手架類的。這些結(jié)構(gòu)是基于單一中心分子或核心，具有可被構(gòu)建塊選擇性地和/或依次地取代的位置。例子可舉出可連接數(shù)個(gè)取代基的三氯三溱(三個(gè)選擇性溫度依賴性取代位置)。如果取代基的數(shù)目為三，可能的組合數(shù)為10。也可能考慮每個(gè)取代基的相對(duì)位置；在該情況下組合數(shù)更大。腳手架<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>構(gòu)建塊<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>組合庫(kù)腳手架型的另外一個(gè)例子可舉出賴氨酸，其中所述三個(gè)取代位置(羧基、CX-氨基和5-氨基)可被選擇性的保護(hù)并因此可被粘合塊選擇性地取代。作為第三水平，可將線性組合庫(kù)和腳手架型庫(kù)組合，其中后者的取代基是組合線性順序?？赏ㄟ^(guò)如此組合性混合化學(xué)構(gòu)建塊合成百萬(wàn)種化學(xué)化合物。對(duì)于肽化學(xué)結(jié)構(gòu)，所述長(zhǎng)度優(yōu)選限制為15、10、8、6或4個(gè)氨基酸。本發(fā)明的聚核苦酸化學(xué)結(jié)構(gòu)具有至少為4的優(yōu)選長(zhǎng)度，更優(yōu)選為6、8、10、15或者至少20個(gè)核苷酸。寡糖在長(zhǎng)度上優(yōu)選為至少5個(gè)單糖單元，更優(yōu)選為8、10、15、20、25個(gè)或者更多的單糖單元。組合庫(kù)可以是完整的或者不完整的。生物聚合物的完整組合庫(kù)是對(duì)于指定聚合物長(zhǎng)度和組成的單體，擁有每種可能的單體排列的代表的那些庫(kù)。不完整的庫(kù)是對(duì)于指定聚合物長(zhǎng)度缺少一種以上可能的單體排列的那些庫(kù)。在本領(lǐng)域中已知的組合和合成化學(xué)技術(shù)能生成擁有數(shù)百萬(wàn)成員的庫(kù)(Lametal.,Nature354:82-84(1991)和國(guó)際專利申請(qǐng)(PCT)WO92/00091),每一個(gè)具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)。例如由18種天然氨基酸制備的線性六肽庫(kù)包含34x106種不同的結(jié)構(gòu)，例如由20種氨基酸制備的庫(kù)包含64x106種不同的結(jié)構(gòu)。當(dāng)還包括氨基酸類似物和異構(gòu)體時(shí)，可能結(jié)構(gòu)的數(shù)目實(shí)際上是無(wú)限的。組合庫(kù)的成員可在固體載體如小珠上合成或者與之相連，每個(gè)小珠在其表面上主要含有數(shù)百萬(wàn)拷貝的庫(kù)成員。由于不同的小珠可與不同的庫(kù)成員相連，因此用于與庫(kù)成員相連的小珠總數(shù)巨大，能與連接在小珠上的庫(kù)成員結(jié)合的不同分子的可能數(shù)目非常巨大。Hammondetal.,US2003/0212253(2003年U月13日)描述了沿以下線路的組合庫(kù)?？捎上鄬?duì)于天然氨基酸而言穩(wěn)定性提高的氨基酸合成肽化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)。例如，可從庫(kù)中去掉半胱氨酸、曱硫氨酸和色氨酸，而加入諸如2-naphyl丙氨酸和正亮氨酸等非天然氨基酸。所述N-端氨基酸可以是d-異構(gòu)體或者乙?；栽诎被?肽酶存在下提供更高的化學(xué)穩(wěn)定性。所述化學(xué)結(jié)構(gòu)密度必須足以提供與目標(biāo)分子充分的結(jié)合，但不能過(guò)高使得所述化學(xué)結(jié)構(gòu)與其自身而不是目標(biāo)分子發(fā)生反應(yīng)。每克干重量的載體上0.1mmol~500ymol的化學(xué)結(jié)構(gòu)密度是理想的，并更優(yōu)選為每克載體上lOymol-lOOymol的化學(xué)結(jié)構(gòu)密度是理想的。在Toy叩earl-AF氨基650M樹(shù)脂(TosohUSA,GroveCity,OH)上合成6肽庫(kù)。所述樹(shù)脂小珠的尺度為酶小珠60mm~U0mm。所述起始樹(shù)脂的初次取代由Fmoc-Ala-OH和Boc-Ala-OH(1:3.8摩爾比)的混合物的偶聯(lián)完成。在偶聯(lián)后，用純TFA充分地除去Boc保護(hù)基。所得脫保護(hù)氨基隨即乙酰化。通過(guò)保留在所述樹(shù)脂小珠上的Fmoc-Ala-OH位點(diǎn)組裝肽鏈。采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc合成策略。在一個(gè)實(shí)施方式中典型的試驗(yàn)，用20%哌啶/DMF(2x20分鐘)將六克Fmoc-Ala-(Ac-Ala-)Toyopearl樹(shù)脂脫保護(hù)，然后用DMF洗滌(8次)并平均分為18份單獨(dú)的反應(yīng)容器。在每個(gè)單獨(dú)的容器中，單一的Fmoc-氨基酸與所述樹(shù)脂(BOP/NMM,5-10倍過(guò)量)偶聯(lián)4~7小時(shí)。清洗單獨(dú)的樹(shù)脂并采用"分離/混合"庫(kù)技術(shù)進(jìn)行組合(Furkaetal.,Int.J.PeptideProteinRes.,37，487-493(1991);Lametal.,Nature,354,82-84(1991);InternationalPatentApplicationWO92/00091(1992);U.S.Pat.No.5,010,175;U.S.Pat.No.5,133,866;andU.S.Pat.No.5,498,538)。重復(fù)脫保護(hù)和偶聯(lián)循環(huán)直至完成氨基酸序列(對(duì)于六聚體庫(kù)為六個(gè)循環(huán))。在最后的偶聯(lián)循環(huán)中，在獨(dú)立的反應(yīng)容器中用20%哌啶/DMF從肽樹(shù)脂上除去最終的Fmoc。用TFA處理2小時(shí)以除去側(cè)^^保護(hù)基團(tuán)。充分地洗滌樹(shù)脂并在真空下干燥。獲得的肽密度通常為0.06mmol~0.12mmol/g樹(shù)脂。肽配體樹(shù)脂小珠復(fù)合物的測(cè)序和肽組成得到確認(rèn)，由在CommonwealthBiotechnologies,Inc.，Richmond,Va的量^f匕氛基酉臾分沖斤計(jì)算所述樹(shù)脂的取代度。在ProteinTechnologiesLaboratories,TexasA&MUniversity,使用HewlettPackardG1005A通過(guò)埃德曼降解進(jìn)行測(cè)序。用于組合庫(kù)制備的裝置可市售獲得(參見(jiàn)例如357MPS,390MPS，AdvancedChemTech,LouisvilleKY,Symphony,Rainin，Woburn,MA,433AAppliedBiosystems,FosterCity,CA,9050Plus,Millipore,Bedford,MA)。此外，許多組合庫(kù)本身是可市售獲得的(參見(jiàn)例如ComGenex,Princeton,N丄，Tripos,Inc.,St.Louis,MO,3DPharmaceuticals,Exton,PA,MartekBiosciences,Columbia,MD,etc.)。組合庫(kù)，尤其是肽庫(kù)可通過(guò)引入各種取代基進(jìn)行化學(xué)修飾。例如，具有端伯胺基的肽庫(kù)可被許多分子取代使之具有獨(dú)特的附加性質(zhì)。暴露的氨基(端基和賴氨酸側(cè)鏈)可與大量具有反應(yīng)性部分如環(huán)氧化物、醛、羧基、酐、酰氯、異氰酸酯、乙烯砜、曱苯磺酸鹽、內(nèi)酯以及其他部分的分子反應(yīng)。當(dāng)所述反應(yīng)性部分與所述庫(kù)的伯胺基反應(yīng)時(shí)，其加入到庫(kù)中以及加入更多的結(jié)構(gòu)。因此所述庫(kù)可由具有生物化學(xué)功能的化合物封端，所述具有生物化學(xué)功能的化合物可對(duì)初始庫(kù)進(jìn)行補(bǔ)充。例如伯胺端基肽與琥珀酰酐反應(yīng)，在兩個(gè)亞曱基的間隔基的底部得以引入端?；Ｋ脦?kù)的全部性質(zhì)由其初始主要的陽(yáng)離子特性變?yōu)閮糌?fù)離子特性。該變化明確地引入不同行為以減小復(fù)雜混合物的成分濃度范圍。伯胺端基庫(kù)也可以有利地與酰端基庫(kù)混合，并具有潛在的更大范圍的適用性。另一種修飾肽庫(kù)的可用伯胺的方法是引入端基糖；在該情況下，可獲得更好的親水性，同時(shí)也獲得俘獲對(duì)糖有親和性的物種的可能性，由于存在來(lái)自于所述組合肽鏈的結(jié)構(gòu)，所述對(duì)糖的親和性得以增強(qiáng)。在另一個(gè)例子中，螯合劑可與所述端伯胺基相連接。當(dāng)這些化學(xué)官能團(tuán)與過(guò)渡金屬離子一起加入時(shí)，整個(gè)庫(kù)的行為被改變，并可處理更多的能與金屬離子相互作用的特異性蛋白。在該情況下，所述庫(kù)在通過(guò)使用特異性置換劑如螯合劑具體為EDTA對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇性吸附時(shí)，將具有更多的可利用的特征。所有其他庫(kù)如組合寡核苷酸和寡糖。l.小有機(jī)分子在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法包括使樣品與化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)相接觸的步驟，其中所述庫(kù)是小有機(jī)分子的組合庫(kù)。因此，也可補(bǔ)充小分子作為用在本發(fā)明的方法和試劑盒中的化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)。通常，小有機(jī)分子具有特性使之與分析物之間有離子、基團(tuán)'^J如單曱基、二曱基和三曱基氨基乙基基團(tuán)、單乙基、二乙基和三乙基氨基乙基基團(tuán)、磺?；?、磷?；?、苯基、羧曱基等。例如庫(kù)可以4吏用苯并二氮(參見(jiàn)例如Bunin"a/,ProcNatlAcadSciUSA1994,91:4708-4712)和肽酰胺(參見(jiàn)例如Simon"a/,ProcNatlAcadSciUSA1992,89:9367-9371;GilonW"/，說(shuō)o尸ome^1991,31:745-750)))。肽酰胺是其中肽鍵(-NHCO-)被類似結(jié)構(gòu)例如-NRCO-替代的肽類似物。在另一個(gè)具體實(shí)施中，所述化學(xué)結(jié)構(gòu)是染料或三。秦衍生物。該名單是不可窮盡的，正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地筌別出數(shù)千種具有離子、疏水或親和性質(zhì)的化學(xué)功能性基團(tuán)，可相容地用作本發(fā)明的方法中的化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述小有機(jī)分子的組合庫(kù)與固體載體，優(yōu)選為大量的小珠共價(jià)相連。如此處進(jìn)一步的描述，小有機(jī)分子的if2.生物聚合物在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法包括使樣品與化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)相接觸的步驟，其中所述庫(kù)是生物聚合物的組合庫(kù)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，生物聚合物選自由聚肽、聚核苷酸、脂和聚糖構(gòu)成的組。對(duì)于本發(fā)明的生物聚合物化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)，線性長(zhǎng)度優(yōu)選為4個(gè)50個(gè)單體單元，特別為不超過(guò)15個(gè)，不超過(guò)10個(gè)，理想地為8、7、6、5、4或者3個(gè)單體單元。對(duì)于肽庫(kù)，所述長(zhǎng)度優(yōu)選限制為不超過(guò)15、10、8、6或者4個(gè)氨基酸。核酸庫(kù)的優(yōu)選長(zhǎng)度為至少4個(gè)，更優(yōu)選為至少6、8、10、15或者至少20個(gè)核苷酸。寡糖優(yōu)選為至少5個(gè)單糖單元的長(zhǎng)度，更優(yōu)選為至少8、10、15、20、25或者更多的單糖單元。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述小有機(jī)分子的組合庫(kù)與固體栽體，優(yōu)選為大量的小珠共價(jià)相連。如此處進(jìn)一步的描述，生物聚合物的組合庫(kù)可與所述固體載體直接地或者通過(guò)連接基團(tuán)相連。a)肽在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，生物聚合物是肽。特別優(yōu)選的化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)包括含有不超過(guò)50、40、30、25、20、l5、10、8、6或4個(gè)氨基酸的肽，采用重組或者固相化學(xué)技術(shù)可以容易地制造。此外，肽結(jié)構(gòu)化學(xué)庫(kù)能以某種意義上使其方便地用于本發(fā)明的方法的方式進(jìn)行制造。例如，可重組地制備肽作為噬菌體展示庫(kù)，其中所述肽作為噬菌體外殼的一部分。(參見(jiàn)例如Tang""/，JBiochem1997,122(4):686-690)。在本文中，所述肽可與固體載體，噬菌體相連。制備適用于所主張的本發(fā)明的肽化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)的其他方法對(duì)于本發(fā)明技術(shù)人員也是已知的,例如所述"等分-偶聯(lián)-重組"法(參見(jiàn)例如Furka"a/,IntJPeptideProteinRes1991,37:487-493;Fodor"a/，Science1991,251:767-773;Houghton"Nature1991,354:84-88;Lam"a/,Nature1991,354:82-84;國(guó)際專利申請(qǐng)WO92/00091;和美國(guó)專利第5,010,175號(hào)，第5,133,866號(hào)，和5,498,538，所有均在此以參考的方法整體引入。)或者其他在本領(lǐng)域中已知的方法。所述肽庫(kù)的表達(dá)也在Devlin"a/,Sciencel"O,249:404-406得以描述?？梢允褂枚N基因編碼的氨基酸丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酸鹽、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、曱硫氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸合成組合肽庫(kù)，諸如組合六肽庫(kù)。其中，所有的甘氨酸可以是光學(xué)異構(gòu)的，但是在人體中僅發(fā)現(xiàn)L-型。然而，這些氨基酸的D-型也具有生物重要性；例如，D-Phe是已知的止痛劑。因此，這些氨基酸的D-型和L-型均可用作組合肽庫(kù)的構(gòu)建塊。許多其他氨基酸也是已知的并可用作肽庫(kù)的構(gòu)建塊，包括2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、P-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸(哌啶酸)、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-二氨基丁酸、鎖鏈賴氨素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丁酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬氨酸、羥基賴氨酸、另'卜羥基賴氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈賴氨素、別-異亮氨酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、N-甲基異亮氨酸、N-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥(niǎo)氨酸?？捎上鄬?duì)于天然氨基酸而言穩(wěn)定性提高的氨基酸合成肽化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)。例如，可從庫(kù)中去掉半胱氨酸、曱石危氨酸和色氨酸，而加入諸如2-naphyl丙氨酸和正亮氨酸等非天然氨基酸。所述N-端氨基酸可以是D-異構(gòu)體或者乙酰化以在氨基-肽酶存在下提供更高的化學(xué)穩(wěn)定性。所述化學(xué)結(jié)構(gòu)密度必須足以提供與目標(biāo)分子充分的結(jié)合，但不能過(guò)高使得所述化學(xué)結(jié)構(gòu)與其自身而不是目標(biāo)分子發(fā)生反應(yīng)。每克干重量的載體上0.1wmol~500mmol的化學(xué)結(jié)構(gòu)密度是理想的，并更優(yōu)選為每克載體上10Mmol~100mmol的化學(xué)結(jié)構(gòu)密度是理想的。在標(biāo)準(zhǔn)"Mernfidd"合成中，側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸由其羧基端與載體材料如微顆粒樹(shù)脂偶聯(lián)。加入側(cè)鏈和氨基端被保護(hù)的氨基酸試劑，其羧基端與固定氨基酸暴露的氨基端反應(yīng)形成肽鍵。隨后將所得肽的氨基端脫保護(hù)，并加入新的氨基酸試劑。重復(fù)所述循環(huán)直至已合成所需的肽。所述技術(shù)的概述，參看Geisaw,1991,r簡(jiǎn)AS她c/mo/9:294-95)。在該程序的常規(guī)應(yīng)用中，所述氨基酸試劑盡可能的純。然而，如果需要需要肽混合物，在一個(gè)或多個(gè)循環(huán)中采用的氨基酸試劑可以是氨基酸混合物，在循環(huán)與循環(huán)之間，該混合物可以是相同或者不同。因此，如果Ala與所述固體載體相連，然后加入Glu、Cys、His和Phe的混合物,則可以形成二肽Ala-Glu、Ala-Cys、Ala-His和Ala-Phe。肽庫(kù)可基本僅由相同長(zhǎng)度的肽組成，或者可以包括不同長(zhǎng)度的肽。所述庫(kù)的肽可以包括在任何不定的殘基位置的任何所需的氨基酸?？赡艿慕M包括但不局限于(a)所有基因編碼的氨基酸，(b)除半胱氨酸(引起形成二硫交聯(lián)的能力)之外的所有基因編碼的氨基酸，(c)所有基因編碼的氨基酸，及其D-型形式；(d)所有天然氨基酸(包括例如羥基脯氨酸)；(e)所有親水氨基酸；(f)所有疏水氨基酸；(g)所有帶電荷的氨基酸；(f)所有不帶電荷的氨基酸等。所述肽庫(kù)也可包括支化和/或環(huán)肽。在一些組合肽庫(kù)實(shí)施方式中，所述肽在重組噬菌體的表面上表達(dá)以制備大型庫(kù)。使用"噬菌體法"(ScottandSmith,Science249:386-390,1990;Cwirla,Wa/,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:6378-6382,1990;Devlin""/，Science,49:404-406，1990),可以構(gòu)建非常巨大的庫(kù)(106-10s化學(xué)個(gè)體)。第二種方法主要使用化學(xué)法，例子可舉出Geysen法(GeysenWa/，MolecularImmunology23:709-715,1986;GeysenWa/,J.ImmunologicMethod102:259-274,1987;和Fodor法，F(xiàn)odor"a/.(Science251:767-773,1991)。Furka"a/.(14thInternationalCongressofBiochemistry,Volume#5,AbstractFR:013,1988;Furka,Int.J.PeptideProteinRes.37:487-493,1991),Houghton(美國(guó)專利第4,631,211號(hào)，1986年12月授權(quán))和Rutter"a/.(美國(guó)專利第5,010,175號(hào)，1991年4月23日授權(quán))描述了能被檢測(cè)為促效劑或拮抗劑的肽的制備方法。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法包括使樣品與化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)接觸的步驟，其中所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)包括抗體庫(kù)(參見(jiàn)例如Vaughn"a/,NatureBiotechnology1996,14(3):309陽(yáng)314;PCT/US96/10287)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法包括是樣品與展示在噬菌體顆粒上的抗體庫(kù)纟妻觸的方法。b)聚核苷酸核酸是另一種優(yōu)選的生物聚合物化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)。如同肽一樣，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合成或者重組技術(shù)制備核酸。術(shù)語(yǔ)"聚核苷酸"、"核酸，，和"核酸分子"在此處是可以相互替換使用的，指單鏈形式或者雙鏈螺旋的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其類似物的聚合形式。核酸分子也可含有經(jīng)修飾的核酸分子，諸如曱基化核酸分子和核酸分子類似物。噪呤和嘧咬的類似物在本領(lǐng)域中已知。核酸可以是天然產(chǎn)生的，例如DNA或者RNA,或者可以是在本領(lǐng)域中已知的合成的類似物。因其優(yōu)異的穩(wěn)定性，這些類似物可優(yōu)選用作化學(xué)結(jié)構(gòu)。對(duì)天然結(jié)構(gòu)的修飾，包括骨架、糖或者雜環(huán)堿基的變化已顯示出提高了分子內(nèi)穩(wěn)定性和結(jié)合親和性。其中在所述骨架化學(xué)上的有用變化是硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯，其中非橋接氧原子均被硫取代；氨基磷酸酯；烷基磷酸三酯和硼磷酸酯。非手性磷酸酯衍生物包括3'-0'--S-硫代磷酸酯、3'-S-5'-0-硫代磷酸酯、3'-CH2-5'-0-磷酸酯和3'-NH-S'-0-氨基磷酸酯。肽核酸利用肽鍵替代整個(gè)核糖磷酸二酯骨架。當(dāng)所述生物聚合物是核酸時(shí)，可以采用傳統(tǒng)的DNA或RNA合成和測(cè)序方法。正常堿基是噪呤，腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤，以及嘧啶，胸腺嘧啶(對(duì)RNA而言是尿嘧啶)和胞嘧啶。然而，諸如以下這些非常見(jiàn)的堿基也可加入到合成中，或者通過(guò)使用突變劑的合成后處理生成4-乙酰胞嘧啶核普、5-(羧羥基甲基)尿嘧啶核苷、2'-0-曱基胞嘧啶核苷、5-羧曱基氨基曱基-2-thioridme、5-羧曱基氨基曱基尿嘧啶核苷、二氫尿嘧啶核苷、2'-0-曱基假尿嘧啶核苷、P,D-半乳糖基queosine、2'-0-曱基鳥(niǎo)噤呤核苷、次黃噪呤核苷、N6-異戊烯基腺嘌呤核苷、1-曱基腺嘌呤核苷、1-曱基假尿嘧^核香、1-甲基鳥(niǎo)噪呤核苷、l-曱基次黃。票呤核苷、2,2-二曱基鳥(niǎo)嘌呤核苷、2-曱基腺嘌呤核苷、2-甲基鳥(niǎo)嘌呤核苷、3-甲基胞嘧啶核苷、5-曱基胞嘧啶核苷、N6-曱基腺嘌呤核苷、7-曱基鳥(niǎo)嘌呤核苷、5-甲基氨基甲基尿嘧啶核苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶核苷、P,D-甘露糖queosine、5-曱氧羰基曱基尿嘧啶核苷、5-曱氧基尿嘧啶核苷、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤核苷、N-((9-p-D-呋喃核糖-2-曱基硫代嘌呤-6-基)氨基甲?；?蘇氨酸、N-((9-p-0-呋喃核糖嘌呤-6-基^-曱基氨基曱?；?蘇氨酸、尿嘧啶核苷-5-氧乙酸曱基酯、尿嘧啶核苷-5-氧乙酸、wybutoxosine、々i尿嘧咬核苷、queosine、2-石克代胞嘧。定核苷、5-甲基-2-硫代尿嘧啶核苷.-2-硫代尿嘧啶核苷、4-硫代尿嘧啶核苷、5-曱基尿嘧啶核苷、N-((9-|3-D-呋喃核糖噪呤-6-基)氨基甲?；?threonine、2'-〇-曱基-5-甲基尿嘧啶核苷、2'-0-曱基尿嘧啶核苷、wybutosine、3曙(3-氨基-3-羧丙基)尿嘧口定核苦。優(yōu)選的核酸化學(xué)結(jié)構(gòu)是長(zhǎng)度至少為4個(gè)，更優(yōu)選為至少為6、8、10、15或者20個(gè)核苷酸。核酸化學(xué)結(jié)構(gòu)包括與特異性分子標(biāo)靶，例如蛋白質(zhì)或代謝物結(jié)合的雙鏈DNA或單鏈DNA分子(例如核酸適體)。c)寡糖生物聚合物可以是寡糖。因此，寡糖化學(xué)結(jié)構(gòu)也可考慮用在本發(fā)明的方法和試劑盒中。寡糖化學(xué)結(jié)構(gòu)優(yōu)選為長(zhǎng)度至少為5個(gè)單糖單元，更優(yōu)選為長(zhǎng)度至少為8、10、15、20、25或者更多個(gè)單糖單元。在聚合糖類庫(kù)中的單糖可以是醛糖、酮糖或者衍生物。它們可以是四糖、五糖、六糖或者更復(fù)雜的糖。它們可以是D型或者L型。合適的D-糖包括D-甘油醛、D-赤蘚糖、D-蘇糖、D-阿拉伯糖、D-核糖、D-來(lái)蘇糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-阿卓糖、D-阿洛糖、D-塔羅糖、D-半乳糖、D-艾杜糖、D-古洛糖、D-鼠李糖和D-海藻糖。合適的L-糖包括上述D-糖的L型。d)脂質(zhì)生物聚合物可以是脂質(zhì)。如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"脂質(zhì)"指疏水或兩性部分。因此，脂質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)也可考慮用在本發(fā)明的方法和試劑盒中。合適的脂質(zhì)包括C14C50脂肪族、芳基、芳基烷基、芳基烯基或芳基炔基部分，其可包括至少一種選自由氮、硫、氧和磷構(gòu)成的組的雜原子。其他合適的脂質(zhì)包括磷酸甘油酯、糖基甘油酯、神經(jīng)鞘脂、甾醇、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰丙醇胺。脂質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)優(yōu)選為長(zhǎng)度至少為5個(gè)單元，更優(yōu)選為長(zhǎng)度至少為8、10、15、20、25或者更多個(gè)單元。III.化學(xué)結(jié)構(gòu)附著至固體載體A.采用"等分-偶聯(lián)-重組"方法在具有順磁性質(zhì)的顆粒上組裝化學(xué)結(jié)構(gòu)"等分-偶聯(lián)-重組"是已知的組合合成方法，其涉及許多輪如下過(guò)程將固體載體均分為大量等分部分；將一部分例如單體偶聯(lián)至所述載體或者偶聯(lián)至在前一輪中已連在所述固體載體上的化學(xué)結(jié)構(gòu)；然后收集所述固體載體已進(jìn)行混合。以下是所述方法更詳細(xì)的描述。將一定量的直徑小于10微米的磁性小珠和合適的連接物分為具有相同量的很多組。組數(shù)與將用于構(gòu)建所述庫(kù)的構(gòu)建塊的數(shù)目相同。例如，如果使用標(biāo)準(zhǔn)腺噤呤核苷、胸腺嘧啶核苷、胞嘧啶核苷和鳥(niǎo)嘌呤核苷(guanidme)構(gòu)建寡核苷酸庫(kù)，小珠的組數(shù)將為4，與單核苷的數(shù)目相同。所述構(gòu)建塊將被稱為"a"、"b"、"c"、"d"。在第一組小珠上將連接構(gòu)建塊"a"。構(gòu)建塊"b"、"c"和"d"將分別連接在第二、第三和第四組小珠上。一旦在平緩的攪動(dòng)下在懸浮液中完成4個(gè)不同的操作，副產(chǎn)品和合成使用過(guò)的溶劑將被清洗掉。該操作不能通過(guò)過(guò)濾完成，這是因?yàn)榫哂行∮?0微米直徑的顆粒太小而將阻塞所述過(guò)濾器。本發(fā)明通過(guò)提供具有順磁性質(zhì)的顆粒并在所述等分-偶聯(lián)-重組過(guò)程中使用磁力對(duì)這些顆粒進(jìn)行操作解決了這個(gè)問(wèn)題。將其分離的一種模式是依靠外置永磁體將具有順磁性質(zhì)的顆粒保留在所述合成容器中，然后通過(guò)容器筒單的旋轉(zhuǎn)排出液體從而移除溶劑。作為另外一種選擇，也可通過(guò)將通電的電磁體放入懸浮液中使所有的順磁材料粘附其上，從而將具有順磁性質(zhì)的顆粒與液體溶劑分離。一旦充分洗滌并與最終洗滌溶液分離之后，重新混合所述小珠。該操作可通過(guò)在常規(guī)容器里釋放被電磁體俘獲的順磁顆粒而完成。通過(guò)所述電磁體的簡(jiǎn)單斷電即可釋放小珠。一旦使用傳統(tǒng)攪拌器充分細(xì)致地混合所有小珠以后，再次均分為四組。在第一組上將連接構(gòu)建塊"a",而構(gòu)建塊"b"、"c"和"d"將分別連接在第二、第三和第四組具有順磁性質(zhì)的顆粒上。隨后是如上所述的類似操作在再次均分前洗滌，分離和混合。重復(fù)次數(shù)取決于所需配體庫(kù)的長(zhǎng)度。典型地為對(duì)于氨基酸，最常用的使用的構(gòu)建塊數(shù)目為6(六肽)，而對(duì)于寡核苷酸，則可在15~30之間變4匕。固體載體可來(lái)自于完全構(gòu)建完畢的化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)，即通過(guò)將先前構(gòu)建好的化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)與所述載體相連接。作為另外一種選擇，化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)可如下在固體載體上形成，即將前體分子連接到固體載體上并隨后利用所述第一前體分子將其他前體分子連接到與所述固體載體相連的正在成長(zhǎng)的鏈上。這種在所述固體載體上建立吸附劑的機(jī)制在所述化學(xué)結(jié)構(gòu)是聚合物時(shí)特別有用，尤其是生物聚合物諸如多肽、多核苷酸或多糖分子。采用本領(lǐng)域內(nèi)已知方法，通過(guò)持續(xù)地加入單體組分(例如氨基酸、核苦酸或單糖)可將生物聚合物化學(xué)結(jié)構(gòu)提供給已連接在所述固體載體的第一單體組分上。參見(jiàn)例如美國(guó)專利第5,445,934號(hào)(Fodor""/),以引用的方式在此將其全文引入。所述庫(kù)的"多樣性"是在所述庫(kù)中獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)式的預(yù)計(jì)數(shù)目。所述庫(kù)的"大小"是其中化學(xué)結(jié)構(gòu)分子的估計(jì)值。所述大小取決于構(gòu)建塊的初始數(shù)目以及最終組合配體的長(zhǎng)度。在所用采用均分-偶聯(lián)-重組合成的情況中，構(gòu)建庫(kù)所需的小珠數(shù)目必須超過(guò)多樣性種類的最終數(shù)目。例如，如果使用15種構(gòu)建塊構(gòu)建庫(kù)并且最終配體是9聚體，則最終庫(kù)將由159種結(jié)構(gòu)構(gòu)成(這對(duì)應(yīng)于4><101()種結(jié)構(gòu)或者多樣性種類)。在此情況下，如果具有順磁性質(zhì)的顆粒具有6jum的直徑(每ML緊密放置的具有順磁性質(zhì)的顆粒對(duì)應(yīng)于4.6x106個(gè)小珠)，將使用的小珠的最小體積必然超過(guò)10mL的具有順;茲性質(zhì)的顆粒。在使用連接在直徑2.8nm的具有順磁性質(zhì)的顆粒上的20種不同氨基酸制備六肽的情況下，具有順磁性質(zhì)的顆粒的體積必然超過(guò)1.5juL。在某些實(shí)施方式中，所述庫(kù)中的小珠的數(shù)目足以使得至少2種不同的小珠，至少4種不同的小珠或者至少8種不同的小珠，每一種含有相同的特有化學(xué)結(jié)構(gòu)。例如，約2億5千萬(wàn)的小珠的庫(kù)可包括四種小珠，每一種含有相同結(jié)構(gòu)的具有6千4百萬(wàn)成員的庫(kù)。少至一種，多至10、100、1,000、10,000、1,000,000、3,000,000、10,000,000、1,000,000,000或者更多種的化學(xué)結(jié)構(gòu)可偶聯(lián)至單一的固體載體。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述固體載體為小珠的形式，在每個(gè)小珠上連接有單一、不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。例如，在肽化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)中，代表氨基酸的一種排列的肽可連接于一顆小珠，代表另一種排列的肽可連接與另外一顆小珠，等等?？刹捎每赡婊虿豢赡娣磻?yīng)將化學(xué)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)至固體載體。例如，不可逆反應(yīng)可采用如下的載體進(jìn)行，所述載體具有至少一個(gè)與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)相連的反應(yīng)性官能團(tuán)，諸如羥基、羧基、巰基或者氨基，可選地為通過(guò)間隔基。合適的官能團(tuán)包括N-羥基琥珀酰亞胺酯、磺酰酯、碘乙?；?、醛、環(huán)氧化物、咪唑基氨基曱酸酯和溴化氰和其他卣素活化載體?？赏ㄟ^(guò)各種已知技術(shù)將這些官能團(tuán)提供給載體。例如，按已知方法可用氨基丙基三乙氧硅烷處理玻璃表面。在一些實(shí)施方式中，在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的合成(例如固相肽合成和固相核酸合成)過(guò)程中將化學(xué)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)至固體載體。作為另外一種選擇，可使用與所述固體載體和/或所述化學(xué)結(jié)構(gòu)相連的連接物部分從而進(jìn)行固體載體和化學(xué)結(jié)構(gòu)間的可逆相互反應(yīng)。已知多種適用于本發(fā)明的連接物，其中一些將在此進(jìn)行討論。連接物部分應(yīng)用于偶聯(lián)不同試劑對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公知的，所述本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可應(yīng)用該常識(shí)形成適用于本發(fā)明的固體載體/化學(xué)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)物而不需要更多的例行試驗(yàn)。在另一實(shí)施方式中，每一種不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)可偶聯(lián)至不同的固體載體。例如，當(dāng)采用所述等分-偶聯(lián)-重組方法在小珠上構(gòu)建組合庫(kù)時(shí)即為這種情況。作為另外一種選擇，化學(xué)結(jié)構(gòu)的集合可偶聯(lián)至一堆小珠，因此每顆小珠可連接許多不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。這可以例如通過(guò)如下過(guò)程完成，即在第一批載體上建立組合庫(kù)，將所述化學(xué)結(jié)構(gòu)從所述載體上切下，然后將其重新偶聯(lián)至第二批載體。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了一種建立多種化學(xué)結(jié)構(gòu)的組合庫(kù)的方法，所述多種化學(xué)結(jié)構(gòu)與具有順磁性質(zhì)的直徑為約100nm約10Mm的顆粒的集合相連，所述方法包括以下步驟(a)提供大量不同化學(xué)部分；(b)使用具有活化基團(tuán)的顆粒集合進(jìn)行第一輪的等分-收集-重組化學(xué)合成，其中所述第一輪的等分-收集-重組化學(xué)合成將所述大量不同的化學(xué)部分的第一化學(xué)部分連接到所述顆粒集合的活化基團(tuán)上；(c)磁性操作所述具有順磁性質(zhì)的顆粒集合；以及(d)進(jìn)行第二輪的等分-收集-重組化學(xué)合成，其中所述第二輪的等分-收集-重組化學(xué)合成將所述大量不同的化學(xué)部分的第二化學(xué)部分連接到與所述顆粒集合的活化基團(tuán)相連的第一化學(xué)部分上；其中等分-收集-重組化學(xué)合成的回合數(shù)足以組裝具有多種多樣的至少100,000種獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)的庫(kù)。B.具有順磁性質(zhì)的顆粒，其中，所述多種多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)中的大多數(shù)與每一顆獨(dú)立的具有順^磁性質(zhì)的顆粒相連在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述庫(kù)的化學(xué)結(jié)構(gòu)在其合成之后連接到顆粒上。在該方法中，每顆具體的顆粒將連接有大量不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并且每顆顆粒將連接組合庫(kù)的大部分或者基本所有成員。在一種構(gòu)建方法中，2微升具有順磁性質(zhì)并在其聚合物部分具有反應(yīng)性基團(tuán)的顆粒用碳酸鹽緩沖液在pH9.5下反復(fù)洗滌。通過(guò)由永磁體產(chǎn)生的磁場(chǎng)將液相與所述顆粒分離。一旦洗滌步驟完成，將所述顆粒與1500微克的可溶性六肽庫(kù)相接觸。室溫下?lián)u晃所述懸浮液過(guò)夜以促進(jìn)肽通過(guò)其主要可用的氨基化學(xué)偶聯(lián)著床。加入賴氨酸或乙醇胺破壞顆粒上過(guò)量的反應(yīng)基團(tuán)。IV.降低樣品中的相對(duì)分析濃度A.相互作用力不希望受限制于理論，但可認(rèn)為多種相互作用影響著分析物如何被連接在固相載體上的化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)所俘獲。蛋白質(zhì)被磁性小珠配體庫(kù)所俘獲，這是連接在每顆小珠上的配體結(jié)構(gòu)的功能。根據(jù)定義，每個(gè)配體是由具有復(fù)雜構(gòu)象的結(jié)構(gòu)所構(gòu)成，并且不同配體的集合是非常多種多樣的。例如，如果所述庫(kù)由六肽組成，所述構(gòu)建塊(氨基酸)含有芳香環(huán)、雜環(huán)、正負(fù)電荷、疏水部分。在蛋白質(zhì)及其配體伴倡間建立的相互作用的類型類似于穩(wěn)定所述大分子構(gòu)象的力。它們通常比共價(jià)鍵d、一個(gè)量級(jí)。這些弱相互作用涉及吸引或排斥原子或原子團(tuán)以使構(gòu)象能量最小。它們可分類為離子-離子、氫鍵、偶極-偶極、色散和疏水相互作用。所述永久偶極-永久偶極；永久偶極-誘導(dǎo)偶極和誘導(dǎo)偶極-誘導(dǎo)偶極相互作用共同列舉在范德華力相互作用名下。微弱存在的誘導(dǎo)偶極-誘導(dǎo)偶極相互作用被稱為吸引倫敦色散力。這些吸引力取決于二者間的距離，其能量反比于距離或者距離的某次冪，所述距離將蛋白質(zhì)抗原決定基的原子排列與所述組合配體的原子構(gòu)象分隔開(kāi)。隨著所述與距離成反比關(guān)系的冪次增加，所述相互作用非常快地接近0。直接與此類型的吸引相對(duì)的是空間位阻排斥，其不允許兩個(gè)原子在同一時(shí)間占據(jù)同一空間。二者共同作用，所述吸引色散和排斥作用確定了分隔兩個(gè)原子的最佳距離，處于該距離使得相互作用能量最小。與長(zhǎng)距離相互作用(例如電荷-電荷、電荷-偶極)相關(guān)的能量取決于環(huán)境介質(zhì)。例如，在兩個(gè)帶電原子間的相互作用在極性介質(zhì)中受到屏蔽并因此變?nèi)酢Ｋ鲩L(zhǎng)距離相互作用的能量的表達(dá)式全部反比于所述介質(zhì)的介電常數(shù)并因此在高度可極化介質(zhì)如水中變?nèi)?。所述介質(zhì)的組成附加地影響其他重要的弱相互作用，例如氫鍵和疏水相互作用。這既是為什么當(dāng)用六聚配體庫(kù)俘獲蛋白質(zhì)時(shí)，所述過(guò)程在天然生理pH和離子條件下進(jìn)行。其中由蛋白質(zhì)和配體(例如肽)二者的原子所處位置產(chǎn)生的強(qiáng)相互作用是氫鍵和疏水締合。存在大量的氫鍵促進(jìn)所述六聚配體與天然蛋白質(zhì)的相互作用=NH和沿著oc螺旋的肽鍵的羰基氧之間的；二NH與-OH之間的；二NH和咪唑環(huán)之間的的；二NH和羧基氧之間，以及最后兩個(gè)-OH基團(tuán)(例如Ser、Thr和Tyr的-OH基團(tuán))之間的相互作用。通常是由伴隨疏水性結(jié)構(gòu)的存在相互靠近而形成疏水締合。大量的氨基酸含有如此的結(jié)構(gòu)異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸是主要的例子。根據(jù)親水指數(shù)分類也可分為相對(duì)疏水的氨基酸是色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，這可能是由于其芳香環(huán)。B.合適的試樣本發(fā)明的試樣可以是能讓存在于所述試樣中的分析物與本發(fā)明的結(jié)合部分相接觸的任何形式，如此處所述。合適的試樣包括氣體、液體、懸浮液、乳狀液、可滲透或者粉末固體等。優(yōu)選的測(cè)試溶液是液體?？梢灾苯佑蓙?lái)源獲取試樣，并用于本發(fā)明的方法而不需要任何預(yù)先操作。例如，可直接從含水層中獲取水樣品然后直接使用此處描述的方法進(jìn)行處理。作為另外一種選擇，可按多種方法制備原始樣品以提高其測(cè)試適用性。如此的樣品制備包括去掉某些分析物、濃縮、研磨、提取、滲透等。例如，可將固體樣品粉碎為粉末，然后用水或者有機(jī)溶劑提取。所述粉末的提取物可隨后用于本發(fā)明。氣體樣品可鼓泡入或者滲入溶液以在將所述溶液用于本發(fā)明的方法之前使氣體成分溶解和/或濃縮。試樣優(yōu)選含有至少1000、100,000、1,000,000、10,000,000或者更多的所關(guān)心的分析物。在一些情況下，適用于采用本發(fā)明的方法的操作的試樣可包括數(shù)百或者數(shù)千所關(guān)心的分析物。優(yōu)選的是，在試樣中存在的分析物的濃度橫跨至少一個(gè)量級(jí)，更優(yōu)選為兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或者更多的量級(jí)。一旦用于本發(fā)明的方法，可由至少一種沖全測(cè)方法才全測(cè)到的分析物的濃度范圍將至少降低至1/2,更優(yōu)選為1/10、1/20、1/50、1/100或者更低。例如，已知血清含有最多以1mg/ml和最少pg/ml存在的分析物。這是橫跨至少109的量級(jí)的濃度范圍。然而，在使用本發(fā)明降低濃度以后，濃度范圍可減小1個(gè)4個(gè)或者更多個(gè)量級(jí)?？刹捎萌魏魏线m的方法收集試樣。例如，可通過(guò)浸取、摘取、汲取、吸取或捕集等收集環(huán)境樣品?？赏ㄟ^(guò)拭抹、scapping、手術(shù)或者使用皮下注射器獲取等收集生物樣品。在每種情況下的收集方法高度取決于樣品源以及環(huán)境，有許多本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的可以替代的適用收集技術(shù)?？梢詮臐撛诎P(guān)心的分析物的任何來(lái)源獲取試樣，包括環(huán)境樣品如空氣、水、塵土、提取物等。本發(fā)明的優(yōu)選試樣是生物樣品，優(yōu)選為生物流體。本發(fā)明可處理的生物樣品包括羊水、血液、腦脊髓液、關(guān)節(jié)內(nèi)液、目艮內(nèi)液、淋巴液、乳汁、汗液(perspirationplasma)、唾液、精液、血清、痰、滑液、淚液、臍帶液、尿液、活組織切片勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞提取物、細(xì)胞勻漿、條件培養(yǎng)基、發(fā)酵液、組織勻漿及其衍生物。在生物樣品中所關(guān)心的分析物包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和多糖。更具體而言，所關(guān)心的分析物是在動(dòng)物體內(nèi)正常存在的，或者與疾病或者感染狀態(tài)如癌癥、病毒感染寄生物感染、病毒感染等相關(guān)的細(xì)胞代謝物。特別令人感興趣的分析物是作為細(xì)胞應(yīng)激標(biāo)志的分析物。指示動(dòng)物處于應(yīng)激下的分析物是許多疾病狀態(tài)包括某些精神疾病、心肌梗塞和感染的指示所關(guān)心的分析物還包括對(duì)于動(dòng)物是外來(lái)的，但在動(dòng)物組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)的分析物。在這點(diǎn)上，特別令人感興趣的分析物包括治療藥物包括其中許多以不同的對(duì)映異構(gòu)體存在的抗生素，由感染有機(jī)體產(chǎn)生的或者由動(dòng)物從環(huán)境中獲取并含在體內(nèi)的毒素。例如，樣品可以是蛋白或者Eco/z提取物。C.運(yùn)用化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)從試樣中俘獲分析物可通過(guò)將所述試樣與結(jié)合部分在允許每個(gè)結(jié)合部分與其相應(yīng)的分析物偶聯(lián)的條件下相接觸從而俘獲在試樣中存在的分析物。如上所指出，結(jié)合部分可與試樣直接接觸，或者所述結(jié)合部分首先與固體載體如測(cè)深尺、SELDI探針，或者不溶性聚合物小珠、膜或粉末相接觸。也可利用所述顆粒的順磁性質(zhì)對(duì)其進(jìn)行操作從而進(jìn)行這些過(guò)程。即，在將所述顆粒與樣品混合和溫育之后，通過(guò)施加/磁力以吸引所述顆粒并將其從液體中分離，從而使附著有分析物的顆粒與液體分離?？梢酝ㄟ^(guò)例如移液管移除所述液體。然后，為洗滌可加入新液體，與顆粒混合，然后再次通過(guò)施加》茲力將顆粒與洗滌液分離。在其中結(jié)合部分是小珠庫(kù)的一部分的情況下，磁性小珠的體積與復(fù)雜樣品如血清的樣品體積之比可以例如在1:150~1:1之間。小珠與樣品之比越小，增加低豐度或者稀有分析物物種的相對(duì)濃度的能力越強(qiáng)。小珠:樣品體積的優(yōu)選恒定比例為約1:10?？赏ㄟ^(guò)將兩者混合、將試樣抹在所述結(jié)合部分上、使所述試樣流過(guò)其中附著有結(jié)合部分的固體載體，以及其他對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的方法實(shí)現(xiàn)所述結(jié)合部分與所述試樣的接觸。所述結(jié)合部分和所述分析物保持接觸一定的時(shí)間以足以是結(jié)合部分達(dá)到與所述樣品的結(jié)合平衡。在典型的實(shí)驗(yàn)室條件下這至少為IO分鐘。D.移除未結(jié)合的分析物本發(fā)明的一個(gè)特征是除減小分析物濃度之間的差異之外，根據(jù)此處描述的方法進(jìn)行的分析物的處理優(yōu)選濃縮并部分純化已結(jié)合的分析物。完全實(shí)現(xiàn)該特征包括可選地從與固體載體上結(jié)合部分相結(jié)合的分析物中沖洗掉任何和結(jié)合的分析物。優(yōu)選通過(guò)將與結(jié)合部分相結(jié)合的分析物與溫和洗滌溶液接觸以清洗掉未結(jié)合的分析物。所述溫和洗滌溶液經(jīng)設(shè)計(jì)可除去在起初含有所述分析物的試樣中常常發(fā)現(xiàn)的雜質(zhì)和未結(jié)合的分析物。典型地是，洗滌液具有生理pH和離子強(qiáng)度，并且所述洗滌將在室溫條件的溫度和壓力下進(jìn)行。例如在V.Thulasiramanetal.,Electrophoresis,26,(2005),3561-3571;Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice(1982);Ausubel,etal.(1987andperiodicsupplements);CurrentProtocolsinMolecularBiology;Deutscher(1990)"GuidetoProteinPurification"inMethodsinEnzymologyvol.182,以及該系列的其他巻中。E.從結(jié)合部分上分離俘獲的分析物尤其是當(dāng)其在簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)中相連時(shí)，存在明確的蛋白質(zhì)-配體相互作用在所述磁性小珠俘獲方法中扮演重要角色。正是對(duì)于這些力的分析和了解才可能區(qū)分洗脫劑，所述洗脫劑可用于從非常復(fù)雜的化合物如血清中分離俘獲的蛋白質(zhì)。已考慮所述相互作用力的重要性，可設(shè)計(jì)出洗脫劑。通過(guò)所述途徑或者可以全部一起釋放蛋白或者根據(jù)其相互作用的主要類型繼續(xù)釋放。對(duì)于離子-離子相互作用為主的情況(這是當(dāng)所述肽配體主要由或者全部由酸性氨基酸如天冬氨酸或者谷氨酸構(gòu)成的情況)，可用鹽溶液諸如1M氯化鈉溶液洗脫蛋白質(zhì)，正如通常在離子交換色語(yǔ)中完成的一樣。通常，此過(guò)程應(yīng)當(dāng)可分離天然形式的蛋白質(zhì)，因此可進(jìn)行進(jìn)一步的監(jiān)測(cè)。利用合適的電場(chǎng)破壞離子鍵也可實(shí)現(xiàn)與存在鹽相類似的效果，該過(guò)程也可保持蛋白質(zhì)的整體性。為溫和地石皮壞蛋白質(zhì)和具有順》茲性質(zhì)的顆粒的配體之間的疏水相互作用，可以使用50%乙二醇(如同親合色譜)。然而，對(duì)于強(qiáng)疏水締合(六肽主要由亮氨酸、異亮氨酸或者纈氨酸構(gòu)成)，優(yōu)選在水中含有異丙醇、乙腈以及類似溶劑的水-有機(jī)混合物。其他類型的蛋白質(zhì)洗脫液是pH2.5的200mM甘氨酸-HCl:典型地是采用該洗脫液以破壞可能與構(gòu)象結(jié)構(gòu)相關(guān)的牢固相互作用，諸如在免疫-親合柱內(nèi)出現(xiàn)的抗原況下，通過(guò)相對(duì)高的離子強(qiáng)度，非常:的pH可助^使蛋白質(zhì)抗原決定基變形因此減小所述相互作用，從而使其變?nèi)酢Ｔ谒械?M石克脲、7M尿素、4%CHAPS的混合物似乎是對(duì)于吸附在肽庫(kù)上的蛋白質(zhì)的優(yōu)異的洗脫劑。這是混合模式的洗脫劑，能同時(shí)破壞氫^t以及疏水締合因此釋放大量蛋白質(zhì)。也可使用在酸性或堿性pH下的尿素濃縮水溶液，而具有幾乎定量的蛋白質(zhì)脫附效率。最后，為全部洗脫蛋白質(zhì)，可使用pH6的6M鹽酸胍(GuHCl)。由于其強(qiáng)離液作用以及其高離子強(qiáng)度，該溶液可被視作通用洗脫劑，并破壞所有鍵并簡(jiǎn)化所有的蛋白質(zhì)為隨機(jī)聚合物盤繞物。如果所有蛋白質(zhì)不得不立刻脫附，或者用作最終步驟，在順序洗脫級(jí)聯(lián)過(guò)程最后GuHCl可用作單3蟲(chóng)；先脫步冬聚(參見(jiàn)4列爺口Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice(1982);和Deutscher(1990)"GuidetoProteinPurification"inMethodsinEnzymologyvol.182,以及該系歹ij的其4也巻)。從具有順/磁性質(zhì)的顆粒上分組脫附蛋白質(zhì)的典型順序是首先通過(guò)加入氯化鈉提高離子強(qiáng)度，100mM300mM的谷氨酸-鹽酸，pH2.2~2.6的酸性溶液用作第二洗脫液，之后是異丙醇-乙腈-水的水-有機(jī)混合物。最后，在還有一些蛋白質(zhì)仍吸附在小珠上的情況下，推薦使用pH3.3的9M尿素。合適的洗脫緩沖液的例子包括改變分析物和/或結(jié)合部分的表面電荷的洗脫緩沖液，諸如pH緩沖溶液。通過(guò)改變酸性用于破壞表面電荷的pH緩沖溶液優(yōu)選為強(qiáng)緩沖液，足以保持溶液的pH在酸性范圍，即在低于7的pH下，優(yōu)選低于6.8、6.5、6.0、5.5、5.0、4.0或者3.0;或者在pH高于7的餞行范圍內(nèi)，優(yōu)選高于7.5、8.0、8.3、8.5、9.0、9.3、10.0或者11.0。在某些實(shí)施方式中，所述洗脫緩沖液可包括pH3的9M尿素，pHll的9M尿素或者6.66%MeCN/13.33%IPA/79.2%H2O/0.8%TFA的混合物。選4奪一種而不是另一種方法取決于用于均等樣品的分析方法。作為另外一種選擇，也可以使用具有足夠的離子強(qiáng)度以掩蔽所述分析物和/或結(jié)合部分的電荷性質(zhì)的高鹽濃度溶液。在這點(diǎn)上，尤其優(yōu)選具有多價(jià)離子的鹽，例如結(jié)合堿土金屬或過(guò)渡金屬反離子的硫酸鹽和磷酸鹽，雖然解離出一個(gè)或多個(gè)單價(jià)離子的鹽也適用與本發(fā)明，倘若所得溶液的離子強(qiáng)度至少為0.1，優(yōu)選為0.25、0.3、0.35、0.4、0.5、0.75、1.0mol/l或者更高。通過(guò)實(shí)施例，許多蛋白質(zhì)分析物/結(jié)合部分相互作用對(duì)其環(huán)境的離子強(qiáng)度的變化敏感。因此，通過(guò)將已結(jié)合的分析物與鹽溶液，優(yōu)選為無(wú)機(jī)鹽溶液如氯化鈉的接觸可從所述結(jié)合部分上分離分析物。這可采用多種方法實(shí)現(xiàn)，例如將所述分析物與之結(jié)合的固體載體浸泡、浸透或浸入洗脫緩沖液中，或者用所述洗脫緩沖液沖洗、噴射或者洗滌所述固體載體。這樣的處理將所述分析物從偶聯(lián)在固體載體的結(jié)合部分上釋放。然后從所述洗脫緩沖液中分離分析物。[135]離液劑，諸如胍或尿素破壞包圍在所述結(jié)合部分和已結(jié)合分析物四周的水包膜的結(jié)構(gòu)，引起所述分析物和結(jié)合部分的復(fù)合物的離解。適用作本發(fā)明的洗脫緩沖液的離液鹽溶液是應(yīng)用專一性的，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)例行試驗(yàn)進(jìn)4亍配制。例如，合適的離液洗脫緩沖液可含有濃度為0.1M9M的尿素或胍。去污劑類洗脫緩沖液在表面張力和分子復(fù)合結(jié)構(gòu)方面改變親合分子的選擇性。適合用作洗脫緩沖液的去污劑包括離子和非離子去污劑。非離子去污劑通過(guò)改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù)破壞分子間的疏水相互作使得被;蓋的分子排斥類似被覆蓋的分子。例:，離子性^污劑十二烷基磺酸鈉(SDS)以使其帶上均勻負(fù)電荷的方法覆蓋蛋白質(zhì)。非離子去污劑的例子包括TritonX-lOO、TWEEN、NP-40和辛基糖苷。兩性離子去污劑的例子包括CHAPS。另一類通過(guò)改變?nèi)芤航殡姵?shù)破壞疏水相互作用的類去污劑化合物包括乙二醇、丙二醇和諸如乙醇、丙醇、乙腈和甘油等有機(jī)溶劑。本發(fā)明的一種緩沖液包含適用于質(zhì)譜的基質(zhì)材料。基質(zhì)材料可包含在所述洗提緩沖液中。本發(fā)明的一些實(shí)施方式可選地包括從結(jié)合部分上洗脫分析物直接至質(zhì)譜探針，例如蛋白質(zhì)或者生物芯片。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，所述基質(zhì)與從結(jié)合部分上洗脫的分析物混合。片，所SsEN;或SEAC/SEND蛋白質(zhì)芯片包^預(yù)先分布在所述蛋白質(zhì)芯片上的能量吸收基質(zhì)。在這些后述實(shí)施方式中，不再需要在所述洗脫緩沖液中存在其他的基質(zhì)材料。其他適用于本發(fā)明的洗提緩沖液包括上述緩沖液成分的組合。由兩種或者兩種以上的前述洗提緩沖液成分配制的洗提緩沖液根據(jù)在一中實(shí)施方式;,'被俘獲的分析物被具有連續(xù)梯度或者分步梯度的洗脫緩沖液洗脫。例如，可首先使用僅能洗脫輕4敬吸附的分析物的洗提緩沖液。然后使用能洗脫結(jié)合得更強(qiáng)的分析物的緩沖液，依此類推。按此方式，所述分析物的子集合能洗脫為不同的等分試樣。使用本發(fā)明分離的分析物將具有的分析物濃度或者分析物之間的濃度差異比在所述試樣中最初具有的分析物濃度范圍或者濃度差異更小。例如，經(jīng)過(guò)使用本發(fā)明的方法的處理，與所述試樣經(jīng)過(guò)在此處描述的任何方法處理之前，在所述試樣中存在的相同分析物之間的濃度差異相比，被分離的分析物將具有的分析物濃度范圍或者與其他被分離的分析物的濃度差異與將至少降低至1/2，更優(yōu)選為1/10、1/20、1/25、1/50、1/100、1/1000或者更低。優(yōu)選為，采用最少量的洗脫緩沖液執(zhí)行本發(fā)明的方法以確保在所述洗脫緩沖液中的被分離分析物的濃度最大。更優(yōu)選為，至少一種被分離的分析物在洗脫緩沖液中的濃度將高于之前在試樣中的濃度。在分離被俘獲的分析物后，依照一些化學(xué)或者物理性質(zhì)諸如分子量、等電點(diǎn)或者與化學(xué)或生物化學(xué)配體的結(jié)合力等，通過(guò)濃縮或者分提對(duì)所述分析物進(jìn)行進(jìn)一步的處理。核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖的分才是法在本4貞i或內(nèi)7^知并在例如Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice(1982》Sambrooketal.,MolecularCloning—ALaboratoryManual(2nded.)Vol.1-3,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborPress,N.Y.,(Sambrook)(1989);和CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubeletal.,eds.,CurrentProtocols,ajointventurebetweenGreenePublishingAssociates,Inc.andJohnWiley&Sons,Inc.,(1994Supplement)(Ausubel)中進(jìn)行了討論。F.檢測(cè)被分離的分析物在分析物經(jīng)洗脫并與結(jié)合部分分離之后，所述分析物可被征化。對(duì)復(fù)雜試樣運(yùn)用本發(fā)明的分析技術(shù)的特點(diǎn)在于，相對(duì)于在原始試樣中發(fā)現(xiàn)的分析物濃度的寬范圍，被分離的分析物的分析物濃度差異的動(dòng)態(tài)減小。與使用原始樣品本身所提供的供分析的百分比例相比，所述分析物濃度范圍的減小使得在原始試樣中發(fā)現(xiàn)的分析物以更大的百分比被檢測(cè)和特征化而不需要重新校準(zhǔn)檢測(cè)設(shè)備。實(shí)際達(dá)到的分析物濃度范圍減小取決于多種因素，包括所述原始試樣的性質(zhì)，以及所使用的結(jié)合部分的性質(zhì)和多樣性。通常，采用此處描述的技術(shù)的分析物濃度差異的減小足以使得至少25%,更優(yōu)選為至少30%、40%、50%、60%、70%、75%或80%的分析物經(jīng)分離檢測(cè)而無(wú)需進(jìn)行儀器再校準(zhǔn)。理想地是，本發(fā)明使得至少90%、95%、98%或更多的分析物經(jīng)分離檢測(cè)也無(wú)需儀器再校準(zhǔn)?？蛇\(yùn)用任何適合的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法檢測(cè)采用此處描述的技術(shù)分離的分析物。例如，采用染料的比色測(cè)定是廣泛可用的。作為另外一種選擇，可通過(guò)光譜實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。光譜檢測(cè)器依賴于折射率的變化；紫外和/或可見(jiàn)光吸收，或用合適的波長(zhǎng)激發(fā)后的熒光來(lái)檢測(cè)反應(yīng)成分。示例性的檢測(cè)方法包括熒光計(jì)、吸收光語(yǔ)、反射光譜和透射光語(yǔ)。檢測(cè)的其他例子則依據(jù)抗體的使用(例如，ELISA和蛋白質(zhì)印跡法)。雙折射、折射率或衍射的變化也可用于檢測(cè)復(fù)合物形成或反應(yīng)圓光度法、共振鏡技術(shù)、光柵偶合波導(dǎo)技術(shù)和多極共::譜。i些以及其他技術(shù)是公知的并能容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用于本發(fā)明，而無(wú)需不適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)。許多這樣的或者其他方法可在例如"SpectrochemicalAnalysis"Ingle,J.D.andCrouch,S.R.,PrenticeHallPubl.(1988)and"AnalyticalChemistry"Vol.72,No.17中找到。優(yōu)選的檢測(cè)方法是通過(guò)質(zhì)譜。質(zhì)譜技術(shù)包括但并不局限于離子化(I)技術(shù)如基質(zhì)輔助激光解附(MALDI)、連續(xù)或脈沖電噴霧(ESI)及相關(guān)方法(例如，IONSPRAY或THERMOSPRAY),或者massiveclusterimapct(MCI);這些離子源可與碎全測(cè)方式相配合，所述檢測(cè)方式包括線性或非線性發(fā)射飛行時(shí)間(TOF),單個(gè)或多個(gè)四極桿，單個(gè)或多個(gè)磁性扇，傅立葉變換離子回旋共振(FTICR),離子阱及其組合(例如，離子阱/飛行時(shí)間)。對(duì)于離子化，可采用多種基質(zhì)/波長(zhǎng)組合(MALDI)或溶劑組合(ESI)。例如采用ESI(Valaskovic,G.A.etal.,(1996)Science273:1199-1202)質(zhì)譜或MALDI(Li,L.etal.,(1996)J.Am.Chem.Soc.118:1662-1663)質(zhì)譜可檢測(cè)分析物的subattomole水平。ESI質(zhì)謙由Fennetal.(J.Phys.Chem.88,4451-59(1984);PCT申請(qǐng)?zhí)朩O90/14148)提出并且在最近的綜述文章(R.D.Smithetal.，Anal.Chem.62,882-89(1990)andB.Ardrey,ElectrosprayMassSpectrometry,SpectroscopyEurope,4,10-18(1992))中總結(jié)了其當(dāng)前的應(yīng)用。MALDI-TOF質(zhì)語(yǔ)由Hillenkamp等提出("MatrixAssistedUV-LaserDesorption/Ionization:ANewApproachtoMassSpectrometryofLargeBiomolecules,"BiologicalMassSpectrometry(BurlingameandMcCloskey,editors),ElsevierSciencePublishers,Amsterdam,pp.49-60,1990)。利用ESI，由于存在多重離子峰用于質(zhì)量計(jì)算，在毫微微摩爾量的樣品中的分子量測(cè)定是非常準(zhǔn)確。本發(fā)明的優(yōu)選分析方法利用表面增強(qiáng)激光解附/離子化(SELDI)，如在U.S.Pat.No.6,020,208中所討論的。對(duì)于那些其中分析物的洗脫液直接至質(zhì)譜探針或者生物芯片，或者其中洗脫緩沖液含有基質(zhì)材料或洗脫緩沖液在分析物從結(jié)合部分上洗脫以后與基質(zhì)材料混合的本發(fā)明的實(shí)施方式，質(zhì)譜是特別優(yōu)選的方法。另一種不同的將被具有順磁性質(zhì)的組合小珠俘獲的蛋白質(zhì)洗脫的模式可與所述蛋白質(zhì)的分析相結(jié)合。例如當(dāng)所述小珠的尺寸小到足以使所有的配體多樣性在數(shù)ML的體積之內(nèi)，與蛋白質(zhì)相連的具有順磁性質(zhì)的顆粒樣品可直接加載到MALDI探針或者ProteinChip(蛋白質(zhì)芯片)分析點(diǎn)上。加入所述基質(zhì)(存在溶劑和酸)使蛋白質(zhì)和配體的相互作用減弱，向該化合物發(fā)射的激光將使蛋白質(zhì)離子化并因此可由質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。另一種廣泛采用的檢測(cè)方法是根據(jù)所關(guān)心的分析物的一種或多種物理性質(zhì)的電泳分離。特別優(yōu)選的用于多肽和蛋白質(zhì)分析物的實(shí)施方式是二維電泳。優(yōu)選的應(yīng)用在第一維上通過(guò)等電點(diǎn)分離所述分析物，然后在第二維上通過(guò)尺寸分離。分析物的電泳分析方法隨所研究的分析物而廣泛變化，但判斷適用于給定分析物的特定電泳方法的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。V.利用生產(chǎn)小珠庫(kù)的蛋白質(zhì)純化非常常見(jiàn)其性質(zhì)未知的污染蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)共同純化至一定程度，并非常難以從目標(biāo)蛋白質(zhì)中去除。例如，在治療性蛋白質(zhì)溶液的情況下，即使痕量的污染蛋白質(zhì)也可對(duì)被施用所述治療性蛋白質(zhì)的患者產(chǎn)生災(zāi)難性的作用。如此的作用包括嚴(yán)重的過(guò)敏或免疫反應(yīng)。經(jīng)常這些作用是由來(lái)自于用于重組性表達(dá)所述治療性蛋白質(zhì)的真核或原核細(xì)胞的污染蛋白質(zhì)引起的。這些污染蛋白質(zhì)已知為HCP(宿主細(xì)胞蛋白質(zhì))。根據(jù)定義，HCP是非常多種多樣的并且采用現(xiàn)有技術(shù)的方法不能在單一方法中除去。因此將其除去是在一系列步驟中能發(fā)生但并非一定發(fā)生的，所述一系列的步驟也使所關(guān)心的治療性蛋白質(zhì)的總產(chǎn)率降低。因此，本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供采用此處描述的組合物純化感興趣的蛋白質(zhì)。A.將樣品與化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)相接觸以及相結(jié)合本發(fā)明提供了用于純化目標(biāo)蛋白質(zhì)組的方法。這些方法包括步驟U)將含有至少95%所述目標(biāo)蛋白質(zhì)組和至多5%污染蛋白質(zhì)的樣品與與具有至少100種不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)的化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)相接觸，所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)的量足以結(jié)合污染蛋白質(zhì)和少量目標(biāo)蛋白質(zhì)組；(b)將所述污染蛋白質(zhì)和少量的目標(biāo)蛋白質(zhì)組與化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)相連接。再次，在所述方法中利用磁力操作具有順磁性質(zhì)的顆粒使之能洗滌所述顆粒并移除液體，而在所述過(guò)程中不損失所述顆粒。當(dāng)被放置與含有各種各樣分析物的樣品接觸時(shí)，所述化學(xué)結(jié)構(gòu)將與所述樣品中的各種雜質(zhì)如污染蛋白質(zhì)結(jié)合。含量豐富的分析物如所關(guān)心的目標(biāo)蛋白質(zhì)組的存在量將遠(yuǎn)超過(guò)使其對(duì)應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)飽和所需的量。因此，這些含量豐富的分析物總量的高百分比例將保持未結(jié)合狀態(tài)，而僅有少量將與化學(xué)結(jié)構(gòu)結(jié)合。相反，含量較少的痕量分析物，諸如所述污染蛋白質(zhì)，指那些不能使其所有可用的化學(xué)結(jié)構(gòu)飽和的蛋白質(zhì)。因此，所述污染蛋白質(zhì)的原始量的大部分將與其對(duì)應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)結(jié)合。在樣品中存在的分析物，目標(biāo)蛋白質(zhì)組和污染蛋白質(zhì)與具有至少100,000種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)在在以下條件下接觸，即，使每種化學(xué)結(jié)構(gòu)與其相應(yīng)的如果在樣品中存在的分析物結(jié)合。通常，樣品與化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)在以下條件下相接觸，即，能使污染蛋白質(zhì)和少量目標(biāo)蛋白質(zhì)組與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)結(jié)合。純化目標(biāo)蛋白質(zhì)組所需的條件將根據(jù)各種參數(shù)變化，所述參數(shù)包括所述目標(biāo)蛋白質(zhì)組的固有性質(zhì)，所述污染蛋白質(zhì)的性質(zhì)等?？赏ㄟ^(guò)多種方法將樣品與化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)相接觸。在優(yōu)選方法中，所述樣品與磁性材料混合并溫育足夠的時(shí)間以使所述雜質(zhì)與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)結(jié)合。然后，利用磁力將結(jié)合有雜質(zhì)的具有順磁性質(zhì)的顆粒與溶液分離。所述溶液與顆粒分離，并含有經(jīng)純化的蛋白。典型地，所述樣品和化學(xué)結(jié)構(gòu)存在于結(jié)合緩沖液中。合適的結(jié)合緩沖液的非限制性實(shí)施例包括含有50mM磷酸鈉和0.15MNaCl,pH7的溶液；含有50mM磷酸鈉和0.15MNaCl,pH8的溶液等。合適的結(jié)合緩沖液包括，例如，Tris類緩沖液、硼類緩沖液、磷類緩沖液、咪哇、HEPES、PIPES、MOPS、MOPSO、MES、TES、乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽等。合適的結(jié)合緩沖液包括那些改變分析物和/或化學(xué)結(jié)構(gòu)的表面電荷的結(jié)合緩沖液，例如pH緩沖液。pH緩沖液優(yōu)選為強(qiáng)緩沖液，足以使溶液的pH保持在酸性范圍內(nèi)，即，pH低于7，優(yōu)選為低于6.8、6.5、6.0、5.5、5.0、4.0或3.0;或者在pH高于7的堿性范圍內(nèi)，優(yōu)選為高于7.5、8.0、8.3、8.5、9.0、9.3、10.0或11.0。適于從含有目標(biāo)蛋白質(zhì)組和污染蛋白質(zhì)的樣品中純化所述目標(biāo)蛋白質(zhì)組的pH條件為約3.5~約11，約4.0~約10.0，約4.5約9.5，約5.0約9.0，約5.5~8.5，約6.0~約8.0或者約6.5~約7.5。典型地，結(jié)合緩沖液具有約6.5~約7.5的pH。在可作為另外一種選擇的的實(shí)施方式中，結(jié)合緩沖液具有約6.5~約8.5的pH。作為另外一種選擇，可以使用各種鹽濃度的結(jié)合緩沖液。適用于從含有目標(biāo)蛋白質(zhì)組和污染蛋白質(zhì)的樣品中純化所述目標(biāo)蛋白質(zhì)組的示例性NaCl鹽濃度為約0.01MNaCl~約3MNaCl，約0.05MNaCl約1.5MNaCl，約0.1MNaCl~約1.0MNaCl或者約0.2MNaCl~約0.5MNaCl。優(yōu)選的結(jié)合緩沖液具有約0M~約0.25M的鹽濃度。其他適合在結(jié)合緩沖液中的鹽是KC1或者NaHOAc。其他適用于本發(fā)明的結(jié)合緩沖液包括上述緩沖液成分的組合。由兩種或者兩種以上的上述結(jié)合緩沖液成分配制的結(jié)合緩沖液能改變所述污染蛋白質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)間分子相互作用的選擇性。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能理解的是，用于蛋白質(zhì)純化的溫度條件根據(jù)被純化的所關(guān)心的目標(biāo)蛋白質(zhì)組的性質(zhì)而變化。典型地，適用于從含有目標(biāo)蛋白質(zhì)組和污染蛋白質(zhì)的樣品中純化所述目標(biāo)蛋白質(zhì)組的溫度條件為約4°C~約40°C,約15。C約40。C,約20°C~約37。C或約22。C約25°C。典型的溫度條件為約4。C約25°C。一個(gè)優(yōu)選溫度是約4°C。經(jīng)過(guò)一段足以使污染蛋白質(zhì)和少量目標(biāo)蛋白質(zhì)與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)結(jié)合的時(shí)間完成使樣品與化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)接觸并使分析物與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)結(jié)合。典型地，所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)與所述含有目標(biāo)蛋白質(zhì)組和污染蛋白質(zhì)的樣品共同溫育至少約IO分鐘，通常為至少20分鐘，更優(yōu)選為至少30分鐘，更優(yōu)選為至少約60分鐘。溫育時(shí)間也可以為數(shù)個(gè)小時(shí)，例如長(zhǎng)達(dá)至12小時(shí)，但典型地為不超過(guò)約1小時(shí)。當(dāng)例如采用柱進(jìn)行本發(fā)明的方法時(shí)，樣品與化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)接觸的時(shí)間稱為駐留時(shí)間。典型的駐留時(shí)間為約1分鐘~約20分鐘。—旦分析物已經(jīng)與化學(xué)結(jié)構(gòu)結(jié)合，所希望的是將所述分析物洗脫以進(jìn)行進(jìn)一步的分析。其中有效的洗脫緩沖液是在表1中所描述的洗脫緩沖液。它們可以單獨(dú)使用或者按照預(yù)先確定的順序使用(例如，先是起離子交換作用的洗脫液，然后是能解開(kāi)疏水締合的洗脫液等)。表l:用于吸附在固相肽庫(kù)上的蛋白質(zhì)的不同洗脫方案列表<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>本發(fā)明的一種緩沖液包含適用于質(zhì)譜的基質(zhì)材料。在所述洗提緩沖液中包含基質(zhì)材料，本發(fā)明的一些實(shí)施方式可選地包括從結(jié)合部分上洗脫分析物直接至質(zhì)譜探針，例如蛋白質(zhì)或者生物芯片。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，所述基質(zhì)與從結(jié)合部分上洗脫的分析物混合。另外的實(shí)施方式包括直接洗脫分析物至SEND或SEAC/SEND蛋白質(zhì)芯片，所述SEND或SEAC/SEND蛋白質(zhì)芯片包括預(yù)先分布在所述蛋白質(zhì)芯片上的能量吸收基質(zhì)。在這些后述實(shí)施方式中，不再需要在所述洗脫緩沖液中存在其他的基質(zhì)材料。在一種實(shí)施方式中，是通過(guò)施加磁力從與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)相結(jié)合的污染蛋白質(zhì)和目標(biāo)蛋白質(zhì)組中分離未結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)組，其中所述化學(xué)結(jié)構(gòu)與磁性小珠相連。與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)/磁性小珠相結(jié)合的蛋白質(zhì)將被拉離未結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)組。所述未結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)組將存在于上清液中，并從其中得以收集。典型地，磁性小珠包括鐵磁氧化物顆粒，諸如鐵磁性氧化鐵、磁赤鐵礦、磁鐵礦或鐵酸錳鋅(參見(jiàn)例如U.S.專利號(hào)6,844,426)VI.試劑盒本發(fā)明還提供用于純化目標(biāo)蛋白質(zhì)組的試劑盒。所述試劑盒包括能使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)施此處描述的方法的成分。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑盒包括具有至少ioo種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)和通過(guò)將含有至少95%的目標(biāo)蛋白質(zhì)組和至多5%污染蛋白質(zhì)的樣品與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)相接觸純化目標(biāo)蛋白質(zhì)的說(shuō)明書(shū)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，試劑盒包括此處所描述的可用于減小混合物中分析物濃度范圍的組合物。在另一實(shí)施方式中，試劑盒包括此處所描述的可用于檢測(cè)混合物中分析物的組合物?？蛇x地，本發(fā)明的試劑盒包括應(yīng)用所述組合物以實(shí)踐本發(fā)明的方法的說(shuō)明書(shū)。所述說(shuō)明書(shū)可以以各種形式的附屬試劑盒存在，在所述試劑盒中可有一個(gè)或者一個(gè)以上的說(shuō)明書(shū)。所述說(shuō)明書(shū)可以以在合適介質(zhì)或基材，例如紙，上的印刷信息存在，例如在其上印刷有如何通過(guò)將含有至少95%的目標(biāo)蛋白質(zhì)組和至多5%污染蛋白質(zhì)的樣品與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)相接觸純化目標(biāo)蛋白質(zhì)組的信息。其他形式可以是電腦可讀的介質(zhì)，諸如CD或磁盤，在其上記錄有如何通過(guò)將含有至少95%的目標(biāo)蛋白質(zhì)組和至多5%污染蛋白質(zhì)的樣品與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)相接觸純化目標(biāo)蛋白質(zhì)組的信息。另一種形式可以是網(wǎng)頁(yè)地址，試劑盒的用戶可通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)使用該網(wǎng)頁(yè)地址獲得如何通過(guò)將含有至少95%的目標(biāo)蛋白質(zhì)組和至多5%污染蛋白質(zhì)的樣品與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)相接觸純化目標(biāo)蛋白質(zhì)組的信息。其他說(shuō)明書(shū)描述除此處描述的方法之外的組合物的用途。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一步包括復(fù)數(shù)個(gè)容器盛有用于使所述樣品與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)或者一根或一根以上的柱子如分提柱相接觸的溫育緩沖液。本發(fā)明的試劑盒也可包括復(fù)數(shù)個(gè)容器盛有用于樣品制備和分析物分離的成分。該種類的示例性成分包括一種或一種以上的溶液足以從顆粒上移除未結(jié)合的材料，和至少一種洗脫溶液足以釋放與化學(xué)結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的分析物。在本發(fā)明的一些試劑盒實(shí)施方式中，提供與固體載體，優(yōu)選為不溶性小珠相連的化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)。在其他實(shí)施方式中，所述固體載體和化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)是分別提供的。當(dāng)分別提供時(shí)，所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)和/或固體載體包括連接部分和/或補(bǔ)充性連接部分使得本發(fā)明的操作者能在此處供獨(dú)立的化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)和固體載體的試劑盒可選地包括進(jìn)行連接所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)至所述固體載體試劑所必需的其他試劑。此外，本發(fā)明的試劑盒可包括色譜介質(zhì)用于從先前的樣品中純化目標(biāo)蛋白質(zhì)，用于隨后使用本發(fā)明的結(jié)構(gòu)化學(xué)庫(kù)進(jìn)行修飾。其他本發(fā)明的試劑盒包括可選的功能性成分諸如磁體，將是的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能實(shí)施此處描述的任何方法變化。雖然為清楚和理解的目的，上述發(fā)明已通過(guò)描述和實(shí)施例的方式略為詳細(xì)地進(jìn)行了描述，但對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是根據(jù)本發(fā)明的教學(xué)，不必背離本發(fā)明的精神和范圍可做出某些變體、改變、修改以及替代等價(jià)物。因此結(jié)果，此處描述的實(shí)施方式可經(jīng)過(guò)各種修改、改變等，而本發(fā)明的范圍僅僅決定于參考引用所述的權(quán)利要求。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地意識(shí)到許多非關(guān)鍵性的參數(shù)能被變化、改變或修改以獲得基本類似的結(jié)果。當(dāng)本發(fā)明的每一種要素在此處描述為含有多種實(shí)施方式時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解的是，除非另外指明，本發(fā)明的每一指定要素的每一種實(shí)施方式是能夠與本發(fā)明的其他要素的每一種實(shí)施方式共同應(yīng)用，并且每一種如此應(yīng)用旨在形成本發(fā)明的截然不同的實(shí)施方式。從上述公開(kāi)顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明具有廣泛多樣化的應(yīng)用。通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅僅是描述性的而并非旨在以任何方式限制本發(fā)明的定義和范圍。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，在化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)，例如組合庫(kù)中的獨(dú)立化學(xué)結(jié)構(gòu)的數(shù)目是如此巨大，因此假設(shè)樣品中存在的每種蛋白對(duì)所述獨(dú)立化學(xué)結(jié)構(gòu)中的至少一種具有親合性。典型地，所述化學(xué)結(jié)構(gòu)與固體載體例如小珠相連。當(dāng)含有所感興趣的需經(jīng)純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)組和許多污染蛋白質(zhì)的樣品與這樣的組合庫(kù)相接觸時(shí)，獨(dú)立的化學(xué)結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合伴侶，包括目標(biāo)蛋白質(zhì)組和污染蛋白質(zhì)。所述組合庫(kù)的多種多樣性提供了對(duì)樣品中每一種蛋白質(zhì)即對(duì)于感興趣的目標(biāo)蛋白質(zhì)組和污染蛋白質(zhì)具有特異性的化學(xué)結(jié)構(gòu)。然而，由于適用于單個(gè)蛋白質(zhì)物種的小珠的有限容量，最少量的所述目標(biāo)蛋白質(zhì)組將被結(jié)合并隨后從樣品中除去。理論上，如果加入到樣品中的連接在小珠上的多樣性組合庫(kù)的量是充分計(jì)算的，則所有污染蛋白質(zhì)應(yīng)當(dāng)被除去而感興趣的目標(biāo)蛋白質(zhì)組將被很少被除去。未結(jié)合的感興趣的目標(biāo)蛋白質(zhì)組將留在所述上清液中并通過(guò)過(guò)濾、離心或其他方法與結(jié)合在所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)上的蛋白質(zhì)分離。在分離后，收集所述目標(biāo)蛋白質(zhì)組。所收集的目標(biāo)蛋白質(zhì)組比在樣品中的目標(biāo)蛋白質(zhì)組更純。從含有感興趣的目標(biāo)蛋白質(zhì)組和污染蛋白質(zhì)的樣品中純化目標(biāo)蛋白質(zhì)組是有利的，但有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員也應(yīng)理解本發(fā)明的方法也可被實(shí)施用于從含有目標(biāo)蛋白質(zhì)組和非多肽雜質(zhì)或雜質(zhì)的樣品中分離感興趣的目標(biāo)蛋白質(zhì)組。VII.實(shí)施例磁性固相配體庫(kù)的制備可采用兩種不同的方法完成使用常規(guī)珠性吸附劑，并在其上構(gòu)建庫(kù)，隨后引入順磁材料，或者首先制造磁性顆粒然后在其上構(gòu)建配體庫(kù)。第一種方法已簡(jiǎn)化用于實(shí)踐，采用如下過(guò)程將肽庫(kù)小珠裝填入色語(yǔ)柱形成約10cm長(zhǎng)的基體。用生理緩沖液使所述小珠柱子平衡。將一體積或者兩體積的磁鐵礦懸浮液推入流過(guò)所述柱基體。然后使用最初的生理緩沖液充分清洗所述柱以除去過(guò)量的磁鐵礦。然后用當(dāng)前用于所述庫(kù)的溶液如呈酸性或堿性pH的濃縮尿素溶液、濃縮胍-鹽酸水溶液、硫脲-尿素-去污劑混合物、水-有機(jī)混合物等完成再次的清洗。所得預(yù)先載有肽配體的小珠具有順磁性質(zhì)，并能通過(guò)磁場(chǎng)方式從液體中分離。約100埃的磁性顆粒的膠狀懸浮液(可用陰離子或者陽(yáng)離子表面活性劑穩(wěn)定)緩慢地從所述柱的頂部載入。實(shí)施例1:磁性固相肽配體庫(kù)的制備以及用于威小人血清中蛋白質(zhì)濃度差異("均衡")的非磁性固相肽配體庫(kù)和磁性固相肽配體庫(kù)的評(píng)值在初始樣品中，對(duì)非磁性和磁性顆粒使用六肽庫(kù)，進(jìn)行并排比較以確定存在磁鐵礦對(duì)在均衡方法中使用具有順磁性質(zhì)的顆粒是否有任何不利的影響。由預(yù)先存在的非磁化材料開(kāi)始制備固相配體庫(kù)，如在WO05094467A2中所描述的(該庫(kù)由每粒小珠上連有一種具有端伯胺基的肽類型構(gòu)成；"OLOB")。然后如下對(duì)部分非磁化材料進(jìn)行磁化。10mL的粒徑為40微米~UO微米的非磁化材料裝填在色譜柱中，用生理緩沖液(磷酸緩沖的鹽水)充分沖洗。然后用20mL的磁性膠狀顆粒懸浮液(EMG807來(lái)自Ferroflmdics,德國(guó))填入柱中，并放置一小時(shí)，，用相同的緩沖液充分沖洗直至移除過(guò)量的磁性膠狀顆粒。用含有最終濃度50mM的檸檬酸的9M尿素第二次充分沖洗。最后在生理緩沖液中使小珠平衡。所得小珠非常容易受到磁場(chǎng)影響；通過(guò)簡(jiǎn)單地使用幾秒鐘的；茲體即可將其從液體中分離。1mL這些磁化小珠和和1ml非磁化小珠，每種已于所述六肽庫(kù)相連接，然后與10mL人血清混合并在平緩攪動(dòng)下放置30分鐘。采用永磁體分離磁性肽組合配體小珠并棄去上清液。采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)非磁化小珠進(jìn)行操作，諸如過(guò)濾和離心。在使用生理緩沖液進(jìn)行數(shù)次洗滌之后，用9M尿素(檸檬酸調(diào)至pH3.3)洗脫吸附在所述磁性小珠上的蛋白質(zhì)。收集的蛋白質(zhì)隨后用電泳(SDS-PAGE)和質(zhì)語(yǔ)(SELDIMS)進(jìn)4亍分析，與相同非磁性小珠進(jìn)行對(duì)比。如在圖l中所看到的，非磁性小珠和具有順磁性質(zhì)的小珠均顯示出相似的已結(jié)合的分析物的圖案，所述已結(jié)合的分析物從與每種固體載體相連的六肽庫(kù)上分離得到。此外，沒(méi)有觀察到明顯的分析物與具有順磁性質(zhì)的顆粒的非特異性結(jié)合。實(shí)施例2:用于減小人血清中蛋白質(zhì)濃度差異的^t性固相肽配體庫(kù)的制備和評(píng)估使用磁力棒將懸浮在2ml體積溶液中的lmL直徑為1Mm的具有順》茲性質(zhì)的反應(yīng)性顆粒(來(lái)自Dynal)從上清液中分離，然后用100mM硼酸鈉，pH9.5清洗多次。分別地，60mg組合六肽庫(kù)溶解在由3mL的100mM硼酸鈉，pH9.5，1.3mL的乙醇和1mL的DMSO構(gòu)成的混合物中。所述經(jīng)處理沉淀的具有順磁性質(zhì)的顆粒(lmL)加入到所述六肽溶液中。然后加入2.75mL的在100mM硼酸鈉，pH9.5中的3.0M硫酸銨。在輕微晃動(dòng)下將所述混合物在37。C溫育25小時(shí)。當(dāng)所述小珠由于施加磁場(chǎng)而保持在所述容器內(nèi)時(shí)，用含有0.1M乙醇胺的生理緩沖液替換所述上清液以封閉任何殘留的活'性基團(tuán)。在37。C過(guò)夜完成該封端操作。最后，用生理緩沖液充分清洗所得偶聯(lián)小珠直至完全除去試劑和副產(chǎn)品。所構(gòu)建的庫(kù)包括在單個(gè)小珠上的所有具有游離端羧基的肽("ALOB",所有配體在一粒小珠上，all-ligands-one-bead)。如實(shí)施例1所述，對(duì)所得的在具有順,茲性質(zhì)的小珠上的組合肽庫(kù)進(jìn)行評(píng)估。簡(jiǎn)言之，80mL的磁化小珠與800juL的人血清混合并在平緩攪動(dòng)下放置30分鐘。采用永磁體分離磁性肽組合配體小珠并棄去上清液。在使用生理緩沖液進(jìn)行數(shù)次洗滌之后，用檸檬酸調(diào)至pH3.3的9M尿素洗脫吸附在所述磁性小珠上的蛋白質(zhì)。收集的蛋白質(zhì)隨后用電泳(SDS-PAGE)和質(zhì)譜(SELDIMS)進(jìn)行分析。顯示在圖2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與在更大尺寸的小珠上俘獲的蛋白質(zhì)(圖1,泳道c)或者與用非磁性小珠俘獲的蛋白質(zhì)(圖1，泳道b，圖2,泳道b)相比，在lym直徑的磁性小珠上俘獲類似的蛋白質(zhì)(泳道c)。此外，與較大的磁性小珠的觀察一樣，在lym直徑的磁性小珠上沒(méi)有觀察到明顯的非特異性結(jié)合。實(shí)施例3:用連有肽配體庫(kù)的具有順^t性質(zhì)的顆粒進(jìn)^f亍樣品處理的再現(xiàn)性來(lái)自于實(shí)施例2的覆蓋有組合肽配體的磁性1jam直徑的小珠用于對(duì)比性研究以核查血清處理的再現(xiàn)性。14份10|aL的小珠從儲(chǔ)備懸浮液中取出并分放在14根不同的小試管中。向每根試管中加入800mL的血清并在平緩攪動(dòng)下將所有試管溫育30分鐘。如以上實(shí)施例1和2所述分離每根試管中的上清液，并用生理緩沖液充分洗滌。隨后，用含有50mM檸檬酸的9M尿素水溶液，pH3.3從每根試管的小珠上洗脫吸附的蛋白質(zhì)。收集的蛋白質(zhì)溶液用SELDIMS分析。圖3顯示出該分析的良好重現(xiàn)性。實(shí)施例4:用于減小人血清中蛋白質(zhì)濃度差異("均衡")的》茲性固相肽配體庫(kù)的制備和評(píng)估來(lái)自于Dynal的直徑為2.8]um的具有順磁性質(zhì)的反應(yīng)性顆粒經(jīng)修飾以引入伯胺。這根據(jù)供應(yīng)商的推薦利用偶聯(lián)乙二胺實(shí)現(xiàn)。所述活潑衍生物用磷酸緩沖的鹽水以及用去離子水充分洗滌。然后逐漸用二甲基甲酰胺洗滌所得衍生物數(shù)次以完全除去水。在該階段，所述小珠用于傳統(tǒng)組合方式(等分-偶聯(lián)-重組)的固相肽合成以得到最終六肽庫(kù)。該庫(kù)具有端伯胺。所有操作例如固液分離均采用外部磁場(chǎng)完成以將小珠保留在容器中。最終產(chǎn)品用以下系列的溶液充分洗滌100%DMF、500/。-50Q/。DMF-水、100%7jC、生理緩沖液并最終保存在含有20%乙醇的1M氯化鈉溶液中。隨后將所述最終懸浮液儲(chǔ)存在+4。C。按此方法構(gòu)建的庫(kù)包括在單個(gè)小珠上的一種具有端伯氨基的肽。含有約10ML已沉淀的具有順》茲性質(zhì)的顆粒的20juL的小珠懸浮液用生理緩沖液充分洗滌并加入到200pL人血清中。在室溫下晃動(dòng)所述懸浮液30分鐘。從所述懸浮液中，通過(guò)小磁體的方式除去具有順磁性質(zhì)的顆粒并放入小試管中洗滌直至從所述上清液中除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。帶有從血清中俘獲的蛋白質(zhì)的小珠隨后用由經(jīng)過(guò)加入2M檸檬酸鈉酸化至pH3.3的9M尿素構(gòu)成的洗脫緩沖液處理。在這些條件下，俘獲的蛋白質(zhì)從小珠上解附并分別收集。分離的蛋白質(zhì)隨后通過(guò)此處描述的SDS-PAGE和SELDIMS分析。預(yù)計(jì)結(jié)果顯示蛋白質(zhì)組成與初始樣品相似，然而，作為初試樣品中蛋白質(zhì)濃度差異減小的結(jié)果，預(yù)計(jì)檢測(cè)到更多的蛋白質(zhì)物種。引用參者的引入在本說(shuō)明書(shū)中引用的所有公報(bào)、專利和專利申請(qǐng)?jiān)诖颂幰砸玫姆绞綄⑵湔w引入，并達(dá)到與將各單獨(dú)的公報(bào)、專利和專利申請(qǐng)具體地、個(gè)別地指出并以引用的方式引入相同的程度。權(quán)利要求1.一種建立與顆粒相連的各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的組合庫(kù)的方法，所述方法包括利用具有順磁性質(zhì)的直徑為約100nm～約10μm的顆粒集合和大量不同的化學(xué)部分進(jìn)行多次循環(huán)的等分-偶聯(lián)-重組化學(xué)合成，其中每次等分-偶聯(lián)-重組化學(xué)合成循環(huán)加入化學(xué)部分到所述化學(xué)結(jié)構(gòu)中，并涉及對(duì)所述具有順磁性質(zhì)的顆粒的磁性操作，以及其中循環(huán)數(shù)足以建立擁有至少100,000種獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性的庫(kù)。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中具有順磁性質(zhì)的顆粒具有約300nm~約5pm的直徑。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中具有順磁性質(zhì)的顆粒具有約1Mm~約3|am的直徑。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述化學(xué)結(jié)構(gòu)是肽、寡核苷酸、寡糖或者合成有機(jī)分子，并且所述庫(kù)擁有至少百萬(wàn)種獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化學(xué)結(jié)構(gòu)是肽，并且所述庫(kù)擁有至少3百萬(wàn)種獨(dú)特的肽的多樣性。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化學(xué)結(jié)構(gòu)是肽，并且所述庫(kù)擁有至少6千4百萬(wàn)種獨(dú)特的肽的多樣性。7.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述庫(kù)具有至少100,000,000種化學(xué)結(jié)構(gòu)的大小。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述庫(kù)基本包含組合庫(kù)的所有成員。9.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述庫(kù)的體積小于約IOO微升。10.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述具有順磁性質(zhì)的顆粒包含其中嵌有順磁材料的聚合物材料。11.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述具有順磁性質(zhì)的顆粒包含多孔顆粒，其中順》茲材料容納在所述多孔顆粒中。12.與具有順磁性質(zhì)的直徑為約100nm約10ym的顆粒的集合相連的各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的庫(kù)，其中所述化學(xué)結(jié)構(gòu)包括大量不同的化學(xué)部分，并且與每個(gè)個(gè)別的具有順磁性質(zhì)的顆粒相連的化學(xué)結(jié)構(gòu)基本上具有相同的結(jié)構(gòu)，以及所述庫(kù)擁有至少IOO，OOO種獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性。13.如權(quán)利要求12所述的庫(kù)，其中所述顆?；旧鲜菃畏稚⒌?，所述化學(xué)結(jié)構(gòu)是肽，以及所述庫(kù)擁有至少300,000種獨(dú)特的肽的多樣性。14.如權(quán)利要求13所述的庫(kù)，其中所述庫(kù)擁有至少3,000,000種獨(dú)特的肽的多樣性。15.如權(quán)利要求14所述的庫(kù)，其中所述庫(kù)擁有至少30,000,000種獨(dú)特的肽的多樣性。16.如^又利要求14所述的庫(kù)，其中所述庫(kù)擁有至少64,000,000種獨(dú)特的肽的多樣性。17.如權(quán)利要求14所述的庫(kù)，其中所述庫(kù)擁有至少100,000,000種肽的大小。18.如權(quán)利要求12所述的庫(kù)，其中所述庫(kù)基本包含組合庫(kù)的所有成員。19.如權(quán)利要求12所述的庫(kù)，其中所述顆粒包含選自由聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、尼龍、聚氨酯和聚糖構(gòu)成的組的交聯(lián)合成聚合物或天然聚合物。20.與具有順》茲性質(zhì)的直徑為約100nm約10ym的顆粒的集合相連的各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的庫(kù)，其中所述化學(xué)結(jié)構(gòu)包括大量不同的化學(xué)部分，所述庫(kù)擁有至少100,000種獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性，并且各個(gè)具體的微粒與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性中的大部分相連。21.包含權(quán)利要求12或者權(quán)利要求20的庫(kù)的試劑盒和使用所述庫(kù)以減小在混合物中分析物濃度的范圍的說(shuō)明書(shū)。22.如權(quán)利要求21所述的試劑盒，所述試劑盒包括盛有緩沖液的六w谷為。23.—種減小在混合物中不同分析物物種濃度的范圍的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供第一樣品，所述第一樣品含有以第一濃度范圍存在于所述第一樣品中的大量不同的分析物物種；(b)將所述第一樣品與一定量的與具有順磁性質(zhì)的直徑為約100nm約10jum的顆粒集合相連的各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的庫(kù)相接觸，其中所述化學(xué)結(jié)構(gòu)包括大量不同的化學(xué)部分，并且與每個(gè)個(gè)別的具有順磁性質(zhì)的顆粒相連的化學(xué)結(jié)構(gòu)基本上具有相同的結(jié)構(gòu)，以及所述組合庫(kù)擁有至少100,000種獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性；(C)利用所述不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)從所述第一樣品中俘獲一定量的不同分析物物種并除去未結(jié)合的分析物物種；以及(d)將俘獲的分析物物種與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)分離以制備第二樣品，所述第二樣品含有以第二濃度范圍存在于所述第二樣品中的大量不同的分析物物種；其中所述庫(kù)的量經(jīng)選擇以俘獲一定量的不同分析物物種從而使所述第二濃度范圍小于所述第一濃度范圍。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中分離包括逐步洗脫以制備大量等分試樣。25.如權(quán)利要求23所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)所述已分離的分析物的步驟。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述已分離的分析物由質(zhì)譜或電〉永4全測(cè)。27.如權(quán)利要求23所述的方法，其中分離包括將分析物從所述顆粒上洗脫至具有吸附表面的生物芯片，其中所述吸附表面結(jié)合來(lái)自洗出液的分一斤物。28.—種檢測(cè)混合物中的分析物的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供第一樣品，所述第一樣品含有以第一濃度范圍存在于所述第一樣品中的大量不同的分析物物種；(b)將所述第一樣品與一定量的與具有順磁性質(zhì)的直徑為約100nm約10pm的顆粒集合相連的各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的庫(kù)相^^妄觸，其中所述化學(xué)結(jié)構(gòu)包括大量不同的化學(xué)部分，并且與每個(gè)個(gè)別的具有順磁性質(zhì)的顆粒相連的化學(xué)結(jié)構(gòu)基本上具有相同的結(jié)構(gòu)，以及所述庫(kù)擁有至少〗00,000種獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性；(c)利用所述不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)從所述第一樣品中俘獲一定量的不同分析物物種并除去未結(jié)合的分析物物種；(d)將帶有被俘獲的分析物的顆粒放入質(zhì)譜儀中；(e)利用激光解吸附質(zhì)譜檢測(cè)所述被俘獲的分析物。29.—種純化目標(biāo)蛋白質(zhì)組的方法，所述方法包括以下步驟(a)將含有至少95%目標(biāo)蛋白質(zhì)組和至多5%污染蛋白質(zhì)的樣品與具有順》茲性質(zhì)的直徑為約100nm約10|Lim的顆粒的集合相連的各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的庫(kù)相接觸，其中所述化學(xué)結(jié)構(gòu)包括大量不同的化學(xué)部分，并且與每個(gè)個(gè)別的具有順磁性質(zhì)的顆粒相連的化學(xué)結(jié)構(gòu)基本上具有相同的結(jié)構(gòu)，以及所述庫(kù)擁有至少100,000種獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性，其量足以結(jié)合污染蛋白質(zhì)和少量的目標(biāo)蛋白質(zhì)組；(b)將所述污染蛋白質(zhì)和少量的目標(biāo)蛋白質(zhì)組與化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)相結(jié)合；(c)將與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)結(jié)合的污染蛋白質(zhì)和目標(biāo)蛋白質(zhì)組與未結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)組分離開(kāi)；以及(d)從樣品中收集未結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)組；由此所收集的目標(biāo)蛋白質(zhì)組比所述樣品中的目標(biāo)蛋白質(zhì)組更純。全文摘要本發(fā)明提供了各種與具有順磁性質(zhì)的小顆粒相連的化學(xué)庫(kù)。典型地是，所述化學(xué)結(jié)構(gòu)包括大量不同的化學(xué)部分，所述顆粒為順磁的并具有約100nm～約10μm的直徑，與每個(gè)顆粒相連的化學(xué)結(jié)構(gòu)基本具有相同結(jié)構(gòu)，以及所述組合庫(kù)包含至少100,000種不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。文檔編號(hào)C07K7/00GK101512013SQ200680017991公開(kāi)日2009年8月19日申請(qǐng)日期2006年3月22日優(yōu)先權(quán)日2005年3月23日發(fā)明者E·博謝蒂,L·羅馬斯申請(qǐng)人:生物-拉德實(shí)驗(yàn)室公司