專利名稱：Gitr結(jié)合分子及其用途的制作方法
GITR結(jié)合分子及其用途相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)享有2005年3月25日提交的名為"GITR結(jié)合分子及其用途"的 美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/665322、和2005年6月3日提交的名為"GITR結(jié)合 分子及其用途"的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/687265的優(yōu)先權(quán)，這兩份申請(qǐng)案的 全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子和TNF受體(TNFR)超家族的成員能夠調(diào)節(jié)多種生物功 能，包括細(xì)胞增殖、分化和存活。利用差異顯示來(lái)鑒定被合成糖皮質(zhì)激素 地塞米松所誘導(dǎo)的T細(xì)胞mRNA， Nocentini et al. ((1997) /Voc. AW/.爿c"d 5W., 94:6216-6221997)鑒定到 一 個(gè)編碼TNFR家族新成員的小鼠cDNA。其對(duì)應(yīng)的基因被命名為GITR,代表糖皮質(zhì)激素-誘導(dǎo)的JNF區(qū)家族 -相關(guān)基因(又稱為TNFRSF18)。與其它TNFR—樣，該預(yù)計(jì)的CITR蛋白 質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域含有高半胱氨酸重復(fù)片段。此外，GITR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與小 鼠和人TNFR、 4-1BB以及CD27的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域同源性很高。Nocentini et al. ((1997)尸rac.胸/. y4cad 5W.,園94:6216-6221997)證實(shí)GITR基因在T細(xì) 胞中被地塞米松和其它細(xì)胞激活性刺激誘導(dǎo)。GITR表達(dá)能夠保護(hù)T細(xì)胞免 于由抗CD3抗體處理所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，但不能保護(hù)由其它細(xì)胞凋亡劑引 起的細(xì)胞凋亡。Shimizu et al. ((2002) /附ww"o/ 3:135-42)發(fā)現(xiàn)GITR主要是在 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上表達(dá)。但是，GITR在常規(guī)CD4+和CD8+ T細(xì) 胞上也有表達(dá)，并且其表達(dá)在激活后迅速增強(qiáng)。體外研究表明，GITR在由 這些細(xì)胞介導(dǎo)的外周免疫耐受中發(fā)揮重要作用，能夠消除CD4+CD25+調(diào)節(jié) 性T細(xì)胞的抑制功能(Shimizu e/(2002) Ato/mm腦o/3:135-42; McHugh e a/. (2002)/mmwrn'^y 16:311-23)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了這樣的結(jié)合分子，這些分子能夠特異結(jié)合細(xì)胞(比如T細(xì) 胞和樹(shù)突狀細(xì)胞)上的GITR，例如人GITR (hGITR)。本發(fā)明結(jié)合分子的特 征在于能以高親和性結(jié)合hGITR;在有刺激劑(例如CD3 )存在的情況下有對(duì) 抗作用，能消除調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞對(duì)效應(yīng)性T(Teff)細(xì)胞的抑制。本發(fā)明的 一個(gè)方面提供了包含SEQ ID NO: 1之氨基酸序列的結(jié)合分子， 任選還包含引導(dǎo)序列。另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含SEQIDNO:66之氨基酸序列的結(jié)合分 子，任選還包含引導(dǎo)序列。另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO:2之氨基酸序列的結(jié)合分 子，任選還包含引導(dǎo)序列。另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含SEQIDNO:58之氨基酸序列的結(jié)合分 子，任選還包含引導(dǎo)序列。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了包含SEQ ID NO:59之氨基酸序列的結(jié)合分 子，任選還包含引導(dǎo)序列。另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含SEQIDNO:60之氨基酸序列的結(jié)合分 子，任選還包含引導(dǎo)序列。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了包含SEQ ID NO:61之氨基酸序列的結(jié)合分 子，任選還包含引導(dǎo)序列。另一方面，發(fā)明提供了包含SEQIDNO:62之氨基酸序列的結(jié)合分子， 任選還包含引導(dǎo)序列。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了包含SEQ ID NO:63之氨基酸序列的結(jié)合分 子，任選還包含引導(dǎo)序列。本發(fā)明的再一方面提供了這樣的結(jié)合分子，所述分子包含至少一個(gè)選 自SEQ ID NO.:3、 SEQ ID NO.:4或SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO.:5的互補(bǔ) 決定區(qū)(CDR)氨基酸序列。在一實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含至少兩個(gè)選 自SEQ ID NO.:3、 SEQ ID NO.:4或SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO.:5的互補(bǔ) 決定區(qū)(CDR)氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含至少三個(gè) 選自SEQIDNO.:3、 SEQ ID NO.:4或SEQ ID NO:19和SEQ ID NO.:5的互 補(bǔ)決定區(qū)(CDR)氨基酸序列。本發(fā)明另 一 方面提供了這樣的結(jié)合分子，所述分子包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO.:6、 SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)氨基酸 序列。在一實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含至少兩個(gè)選自SEQ ID NO.:6、 SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)氨基酸序列。在另 一實(shí) 施方案中，所述結(jié)合分子包含至少三個(gè)選自SEQ ID NO.:6、 SEQ ID NO.:7 和SEQ ID NO.:8的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)氨基酸序列。本發(fā)明另一方面提供了包含SEQIDNO:3、 4、 5、 6、 7和8所示CDR 的結(jié)合分子。發(fā)明的另一方面提供了包含SEQIDNO:3、 19、 5、 6、 7和8 所示CDR的結(jié)合分子。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了這樣的結(jié)合分子，該分子包含含有SEQ ID NO:l之氨基酸序列的童鏈可變區(qū)，還包含含有SEQIDNO:2之氨基酸序列 的輕鏈可變區(qū)。發(fā)明的另一方面提供了這樣的結(jié)合分子，該分子包含含有 SEQ ID NO:66之氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，并還包含含有SEQ ID NO:2之 氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一個(gè)以上的實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含 人或基本上是人的重鏈和輕鏈框架區(qū)。在另一實(shí)施方案中， 一或多個(gè)人框 架區(qū)氨基酸殘基被突變成相應(yīng)的小鼠氨基酸殘基。在另一實(shí)施方案中，恒 定區(qū)包含IgG2b重鏈恒定區(qū)。在另一實(shí)施方案中，恒定區(qū)包含人，例如人 IgGl重鏈恒定區(qū)。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子被改變了以便減少效 應(yīng)子功能和/或糖基化。在一實(shí)施方案中，結(jié)合分子結(jié)合人GITR。在一實(shí)施 方案中，結(jié)合分子不會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡。在另一實(shí)施方案中，結(jié)合分子不能 阻斷初級(jí)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。在再一實(shí)施方案中，結(jié)合分子能夠抵消調(diào)節(jié) 性T細(xì)胞對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的抑制。在一實(shí)施方案中，結(jié)合分子能調(diào)節(jié)效應(yīng)T 細(xì)胞的增殖。在一實(shí)施方案中，結(jié)合分子來(lái)自小鼠。在另一實(shí)施方案中， 結(jié)合分子包含鼠IgG2b重鏈。在一實(shí)施方案中，結(jié)合分子是人源化抗體。 再一實(shí)施方案中，結(jié)合分子是嵌合抗體。還有一實(shí)施方案中，結(jié)合分子能 調(diào)整人GITR的活性。在另一實(shí)施方案中，結(jié)合分子減弱I-kB在T細(xì)胞中 的降解。本發(fā)明另 一方面提供了能結(jié)合人T細(xì)胞和人樹(shù)突狀細(xì)胞上的GITR、且 結(jié)合常數(shù)(Kd)為lxl(T9或更低的結(jié)合分子。在一實(shí)施方案中，該結(jié)合分子 能抵消調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的抑制。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合 分子是人源化抗體。本發(fā)明再一 方面提供了包含本發(fā)明結(jié)合分子和可藥用載體的組合物。 在一實(shí)施方案中，所述組合物還包含至少一種用于處置受試者所患癌癥的 其它治療劑。在一實(shí)施方案中，組合物還包含至少一種用于處置受試者所患 病毒感染的其它治療劑。在另一實(shí)施方案中，組合物還包含至少一種用于處 置受試者所患癌癥的腫瘤抗原。再一實(shí)施方案中，所述組合物還包含至少 —種來(lái)自病原體的抗原。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種消除調(diào)節(jié)性T細(xì)月包對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的抑制 的方法，該方法包括將人免疫細(xì)胞與本發(fā)明結(jié)合分子進(jìn)行接觸，從而使得調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的抑制被抵消。本發(fā)明另一方面提供了一種調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞中T細(xì)胞受體所誘導(dǎo)的信 號(hào)傳導(dǎo)的方法，該方法包括將所述細(xì)胞與本發(fā)明的結(jié)合分子進(jìn)行接觸，從 而使效應(yīng)T細(xì)胞中T細(xì)胞誘導(dǎo)的受體信號(hào)傳導(dǎo)得到調(diào)節(jié)。在一實(shí)施方案中， 該方法調(diào)節(jié)了 I-kB的降解。在一實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞是Thl細(xì)胞。在 另一實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞是CD4+細(xì)胞。再一實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞 是CD8+細(xì)胞。本發(fā)明再一方面提供了一種提高受試者的免疫應(yīng)答的方法，該方法包 括將細(xì)胞與本發(fā)明結(jié)合分子進(jìn)行接觸，從而使得受試者的免疫應(yīng)答被增強(qiáng)。本發(fā)明另一方面提供了一種處置受試者所患癌癥的方法，該方法包括 將細(xì)胞與本發(fā)明結(jié)合分子進(jìn)行接觸，從而使得受試者的癌癥得到治療。在 一實(shí)施方案中，癌癥的類型選自胰腺癌(pancreatic cancer)、黑素瘤 (melanomas)、享L腺癌(breast cancer)、月申癌(lung cancer)、 支氣管癌(bronchial cancer)、結(jié)直腸癌(colorectal cancer)、前歹寸月泉癌(prostate cancer)、胃癌(stomach cancer)、 卯巢癌(ovarian cancer)、 尿道膀月光癌(urinary bladder cancer)、月畝或 中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌(brain or central nervous system cancer)、夕卜周神經(jīng)系統(tǒng)癌 (peripheral nervous system cancer)、食管癌(esophageal cancer)、苫頸癌(cervical cancer)、 子宮或子宮內(nèi)月菱癌(uterine or endometrial cancer)、 口月空癌或咽癌 (cancer of the oral cavity or pharynx)、肝癌(liver cancer)、腎癌(kidney cancer)、 睪丸癌(testicular cancer)、月旦管癌(biliary tract cancer)、 小腸或附件癌(small bowel or appendix cancer)、唾液腺癌(salivary gland cancer)、甲狀腺癌(thyroid gland cancer)、 腎上腺癌(adrenal gland cancer)、 骨肉瘤(osteosarcoma)、 軟骨 肉瘤(chondrosarcoma)以及造血纟且織的癌癥(cancer of hematological tissues)。本發(fā)明另一方面提供了一種治療由病原體在受試者體內(nèi)引起的感染的 方法，該方法包括將細(xì)胞與權(quán)利要求1的結(jié)合分子進(jìn)行接觸，從而使受試 者體內(nèi)由病原體引起的感染得到治療。在一實(shí)施方案中，所述病原體是病毒，例如選自曱肝病毒(hepatitistype A)，乙肝病毒(h印atitis type B),丙肝 病毒(hepatitis type C)， 流感病毒(influenza)、 水痘病毒(varicella)、 腺病毒 (adenovirus)、 I型單純皰滲病毒(herpes simplex type I, HSV 1)、 II型單純皰滲 病毒(HSV II)、 牛痙病毒(rinderpest)、 鼻病毒(rhinovims)、 艾可病毒 (echovims)、 4侖4大病毒(rotavirus)、呼吸道合』包病毒(respiratory syncytial virus)、 乳頭瘤病毒(papilloma vims)、 導(dǎo)L多2病毒(papova vims)、 巨纟田月包病毒 (cytomegalovirus)、 echinovirus、 蟲(chóng)媒病毒(arbovirus)、 漢坦病毒(hantavirus)、 才可薩奇病毒(coxsackie vims)、月思月泉炎病毒(mumps vims)、 麻滲病毒(measles virus)、風(fēng)滲病毒(mbellavims)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(polio virus)、 I型人免疫缺 陷病毒(human immunodeficiency virus type I, HIV I)禾口 II型人免疫擊夾陷病毒 (HIV 11)、任何小RNA病毒(picornaviridae)、腸道病毒(enteroviruses)、 杯狀 病毒(caliciviridae)、 i若瓦克病毒群(Norwalk group of vimses)的4壬一種、才皮月莫 病毒(togavimses)(比如曱病毒(alphaviruses))、 黃病毒(flavivimses)、 冠^大病 毒(coronaviruses)、 狂犬病病毒(rabies vims)、 馬爾堡病毒(Marburg viruses)、 埃博拉病毒(ebola viruses)、 副流感病毒(parainfluenza vims)、 正粘病毒 (orthomyxoviruses)、布尼亞病毒(bunya viruses)、砂粒病毒(arenavimses)、呼 月為病毒(reovimses)、專侖狀病毒、環(huán)狀病毒(orbivimses) 、 I型人T細(xì)月包白血病 病毒(human T cell leukemia virus)、 II型人T細(xì)胞白血病病毒、猴免疫缺陷 病毒(simian immunodeficiency vims)、 慢病毒(lentivimses)、 多瘤病毒 (polyomavimses)、 細(xì)小病毒(parvovimses)、 EB病毒(Epstein Ban virus)、 人 皰滲病毒6型(human herpesvirus 6)、獼猴皰滲病毒1型(cercopithecine herpes virus 1, B病毒)和痘病毒(poxvimses)。在一實(shí)施方案中，所述方法被用于處 置慢性病毒感染。在另一實(shí)施方案中，病原體是細(xì)菌，例如選自奈瑟氏球菌物種 (A^〖M6rz'a 、鏈5求菌物種(5Yre; tococciw J7 / )、 變異《連3泉菌(S. wwto/w)、嗜 血菌物種(/aewo/ /n7^印p.)、莫拉氏菌物種(fo/'oxe〃" 5/ / )、博德特氏菌物 種(SoW"e〃a、 分枝桿菌物種(踏coZ)flc化n'wm 、 軍團(tuán)菌物種 (Xegz'oMe〃a 5/7/7)、埃希氏菌物種(i^c/ er/c/n'a 5; p)、弧菌物種(Fz力7i'o s/ p)、 耶爾森氏菌物種(Ferw'm'a 彎曲菌物種(Caw/7y/c^a"er s; / )、沙門氏菌物種CSb/mo"e〃a 、李斯特氏菌物種(Z^en'a )、螺桿菌物種(/^//<%^0^^* s; 尸)、假單月包菌物種(i^ew6fo7"owas s/ p)、葡萄球菌物種OStop/^/ococcM:J spp.)、 腸球菌物種CE"feracoccw s/ p)、梭菌物種(C/o"n'cZ/wm sp; .)、芽孑包桿菌物種 (Bac/〃ws s/ p)、才奉^干菌4勿種(Co 7"e6(3"e"'Mm s; p.)、 j 危蟲(chóng)累方走體4勿種(5orre"a ^T取)、埃里希氏體物種0E/2r/!'c/n'a sp; )、立克次氏體物種(WcA:e"w'a s; p)、衣 原體物種(C/z/am;^fe ^p.)、鉤端螺旋體物種(Zepto ; /ra s; ; .)、密螺旋體物種本發(fā)明另一方面提供了一種調(diào)節(jié)GITR功能的方法，包括在有免疫激活 劑時(shí)，使人GITR與本發(fā)明結(jié)合分子接觸，從而調(diào)整GITR功能。本發(fā)明的一個(gè)方面體現(xiàn)在這樣的結(jié)合分子，其包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO,:3、 SEQIDNO.:4、 SEQIDNO:19、 SEQIDNO,:5、 SEQIDNO,:6、 SEQIDNO.:7和SEQIDNO.:8的CDR氨基酸序列。在一實(shí)施方案中，所述 組合物還包含至少一種處置受試者所患癌癥的治療劑。在另一實(shí)施方案中， 所述結(jié)合分子包含至少一個(gè)衍生自6C8結(jié)合分子的CDR。在另一實(shí)施方案 中，結(jié)合分子包含至少兩個(gè)衍生自6C8結(jié)合分子的CDR。在另一實(shí)施方案 中，結(jié)合分子包含至少三個(gè)衍生自6C8結(jié)合分子的CDR。在另一實(shí)施方案 中，結(jié)合分子包含至少四個(gè)衍生自6C8結(jié)合分子的CDR。在另一實(shí)施方案 中，結(jié)合分子包含至少五個(gè)衍生自6C8結(jié)合分子的CDR。在另一實(shí)施方案 中，結(jié)合分子包含至少六個(gè)衍生自6C8結(jié)合分子的CDR。本發(fā)明另一方面體現(xiàn)在包含SEQIDNOs.: 3、 4或19、 5、 6、 7和8所 示之六個(gè)CDR的結(jié)合分子。本發(fā)明的再一方面體現(xiàn)在這樣的結(jié)合分子，其包含含有SEQ ID NO:l 之氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，并還包含含有SEQ ID NO:2之氨基酸序列的 輕鏈可變區(qū)。在一實(shí)施方案中，該結(jié)合分子包含人或基本是人的重鏈和輕鏈 框架區(qū)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含的人框架區(qū)，其中一 或多個(gè)人框架區(qū)氨基酸殘基被回復(fù)突變成相應(yīng)的小鼠氨基酸殘基，或者被 突變成另外的氨基酸殘基。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含免疫 球蛋白分子的恒定區(qū)，例如IgG2b重鏈恒定區(qū)。還有一實(shí)施方案中，結(jié)合 分子能夠結(jié)合人GITR (hGITR)。在一實(shí)施方案中，結(jié)合分子不會(huì)誘發(fā)細(xì)胞 凋亡。在另一實(shí)施方案中，結(jié)合分子不會(huì)阻斷初級(jí)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。還有一實(shí)施方案中，結(jié)合分子抵消了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的抑制。在一實(shí)施方案中，結(jié)合分子增強(qiáng)了效應(yīng)T細(xì)胞的增殖。在另一實(shí)施方案中， 結(jié)合分子中和了人GITR的活性。還有一實(shí)施方案中，結(jié)合分子減弱了 I-kB 在T細(xì)胞中的降解。一個(gè)方面，本發(fā)明體現(xiàn)在這樣的結(jié)合分子，其結(jié)合人T細(xì)胞和人樹(shù)突 狀細(xì)胞上的GITR，并且結(jié)合常數(shù)(Kd)為1 x10—9或更低。在一實(shí)施方案中, 所述結(jié)合分子抵消了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制作用。在另一實(shí)施方案中，結(jié)合 分子來(lái)源于鼠或包含鼠CDR。再一實(shí)施方案中，結(jié)合分子包含IgG2b重鏈。 在一實(shí)施方案中，結(jié)合分子是人源化抗體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，結(jié)合 分子是嵌合抗體。本發(fā)明另 一 方面提供了包含本發(fā)明結(jié)合分子和可藥用載體的組合物。 在一實(shí)施方案中，所述組合物還包含至少一種其它的治療受試者所患癌癥 的治療劑。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種消除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)T效應(yīng)細(xì)胞的抑制 作用的方法，該方法包括將人免疫細(xì)胞與本發(fā)明結(jié)合分子進(jìn)行接觸，從而 消除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制作用。本發(fā)明另一方面提供了一種調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體誘導(dǎo)的信號(hào)在效應(yīng)T細(xì)胞 中傳導(dǎo)的方法，該方法包括將細(xì)胞與本發(fā)明結(jié)合分子進(jìn)行接觸，從而使效 應(yīng)T細(xì)胞中T細(xì)胞受體誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)得到調(diào)節(jié)。在一實(shí)施方案中，所述 方法調(diào)節(jié)了 I-kB的降解。在一實(shí)施方案中，T纟田胞是TM纟田月包。本發(fā)明再一方面提供了一種增強(qiáng)受試者的免疫反應(yīng)的方法，該方法包 括將細(xì)胞與本發(fā)明結(jié)合分子接觸，從而提高受試對(duì)象的免疫反應(yīng)。本發(fā)明另一方面提供了一種處置受試者所患癌癥的方法，該方法包括 將細(xì)胞與本發(fā)明結(jié)合分子進(jìn)行接觸，從而使癌癥得到治療。在一實(shí)施方案 中，癌癥種類選自胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支氣管癌、結(jié)腸癌、 前列腺癌、胃癌、卵巢癌、尿道膀胱癌、腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、外周神經(jīng) 系統(tǒng)癌、食管癌、宮頸癌、子宮或子宮內(nèi)膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、腎 癌、睪丸癌、膽管癌、小腸或附件癌、唾液腺癌、曱狀腺癌、腎上腺癌、 骨肉瘤、軟骨肉瘤以及造血組織的癌癥。本發(fā)明另一方面提供了一種抑制GITR功能的方法，該方法包括使人 GITR與本發(fā)明結(jié)合分子在有刺激劑的情況下進(jìn)行接觸，從而使得GITR功 能被抑制。本發(fā)明一個(gè)方面提供了分離的核酸分子，該核酸分子包含編碼重鏈可 變區(qū)的含有核苷酸序列SEQIDNO:9的核苷酸序列，任選還包含引導(dǎo)序列。 本發(fā)明另 一方面提供了分離的核酸分子，該核酸分子包含編碼重鏈可變區(qū) 的含有核苷酸序列SEQIDNO:67的核苷酸序列，任選還包含引導(dǎo)序列。本發(fā)明另一方面提供了分離的核酸分子，該核酸分子包含編碼輕鏈可 變區(qū)的含有核苷酸序列SEQ ID NO: 10的核苷酸序列，任選還包含引導(dǎo)序列。本發(fā)明再一方面提供了分離的核酸分子，該核酸分子包含至少 一個(gè)選 自SEQIDNO.:ll、 SEQ ID NO.:12或SEQ ID NO:65和SEQ ID NO.:13的編 碼CDR的核苦酸序列。在一實(shí)施方案中，所述分離的核酸分子包含的核苦 酸序列編碼至少兩個(gè)衍生自6C8結(jié)合分子的CDR。在另一實(shí)施方案中，所 述分離的核酸分子包含的核苦酸序列編碼至少三個(gè)衍生自6C8結(jié)合分子的 CDR。本發(fā)明另 一方面提供了分離的核酸分子，該核酸分子包含至少 一個(gè)選 自SEQIDNO.:14、 SEQ ID NO.:15和SEQ ID NO.:16的編碼CDR的核苦酸 序列。在一實(shí)施方案中，所述分離的核酸分子包含的核苷酸序列編碼至少 兩個(gè)衍生自6C8結(jié)合分子的CDR。在另一實(shí)施方案中，所述分離的核酸分 子所包含的核苦酸序列編碼至少三個(gè)衍生自6C8結(jié)合分子的CDR。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO:ll-16 以及SEQ ID NO:65所示之核苦酸序列。本發(fā)明一個(gè)方面提供了包含發(fā)明所述核酸分子的重組表達(dá)載體。在一酸序列的核酸分子。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了導(dǎo)入了發(fā)明所述重 組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明另 一方面提供了制備能夠結(jié)合人GITR的結(jié) 合分子的方法，方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)明所述宿主細(xì)胞直至該細(xì)胞產(chǎn) 生能夠結(jié)合人GITR的結(jié)合分子。附圖筒述^ /顯示純化的小鼠和人GITR結(jié)合分子的SDS-PAGE印跡。每個(gè)孔中加入了 12微克蛋白質(zhì)。恩2顯示純化的人GITR結(jié)合分子的大小排阻層析(SE-HPLC)結(jié)果。50 微克蛋白質(zhì)以0.6 ml/min的流速注射到SE-HPLC柱子中。經(jīng)SE-HPLC純化 的結(jié)合分子產(chǎn)生結(jié)合分子群體，其中99.8%為單體形式，0.2%為聚集體。^ j顯示轉(zhuǎn)染了 GITR基因的L-M細(xì)胞(小鼠成纖維細(xì)胞)用50i!l表達(dá) GITR的雜交瘤細(xì)胞的上清液進(jìn)行染色的FACS分析結(jié)果。GITR結(jié)合分子 使被GITR-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞染色，而未轉(zhuǎn)染的L-M細(xì)胞沒(méi)有染色。^ 4顯示FACS分析，其表明GITR主要在活化的淋巴細(xì)胞上表達(dá)。 6C8結(jié)合分子使CD4+、 CD8+、 CD25+淋巴細(xì)胞染色，CD103+細(xì)胞弱染色。恩5顯示6C8結(jié)合分子的結(jié)合飽和曲線，是用生物素標(biāo)記的6C8在 CD3活化的淋巴細(xì)胞上滴定而評(píng)估出的。^ 6顯示6C8結(jié)合分子對(duì)T淋巴細(xì)胞具有協(xié)同刺激活性，所述T淋巴 細(xì)胞是經(jīng)亞優(yōu)化(sub-optimal) 0KT3 (抗CD3; 0.01嗎/ml)刺激、并與抗CD28 或抗GITR—起保溫的細(xì)胞。還使用了同種型對(duì)照(IgG2b)。激7^4 一 顯示6C8結(jié)合分子不誘發(fā)細(xì)胞凋亡。淋巴細(xì)胞用PHA活 化3天，再加入10 fig/ml YTH655 (—種已知在活化淋巴細(xì)胞上誘導(dǎo)細(xì)胞凋 亡的抗CD2抗體；Friend, P., " a/. (1987) 7>a—尸roc. 19:4317)、 6C8、 或同種型對(duì)照(IgG2b)。細(xì)胞凋亡通過(guò)細(xì)胞存活率(A)、膜聯(lián)蛋白V染色(B)、 流 式細(xì)胞術(shù)來(lái)測(cè)定。^ S表明6C8結(jié)合分子未阻斷初級(jí)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)。在有不 同濃度TRX1 (抗人CD4)、 6C8或MOPC (TRX1的同種型對(duì)照)的情況下， 將來(lái)自同種異體供體的淋巴細(xì)胞混合。細(xì)胞保溫3天，用3H-胸苷脈沖18 小時(shí)，然后收獲并計(jì)數(shù)。^ 9顯示6C8結(jié)合分子阻斷調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)誘發(fā)的對(duì)T效應(yīng)細(xì)胞 的抑制作用。將CD4+ZCD25+細(xì)胞以各種比率加入CD4+ZCD25-細(xì)胞中。細(xì) 胞用結(jié)合在孩i孔板上的抗CD3和抗CD28進(jìn)行刺激。比率為1: 1日t， €04+/^025-細(xì)胞的增殖被抑制。加入兩種不同稀釋度的6C8能夠阻斷 CD4+ZCD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞誘發(fā)的對(duì)CD4+ T效應(yīng)細(xì)胞的抑制作用。恩20顯示6C8結(jié)合分子具有協(xié)同刺激活性，即使在沒(méi)有抗CD28的 情況下用抗CD3剌激T細(xì)胞時(shí)也是如此。CD4十/CD25+細(xì)胞與CD4+/CD25-細(xì)胞以不同細(xì)胞比率 一 同保溫。細(xì)胞僅用結(jié)合在微孔板上的抗CD3進(jìn)行刺 激。將6C8加入細(xì)胞中，在所述情況下顯示協(xié)同刺激活性。激/7顯示抗GITR對(duì)經(jīng)CD3活化的T細(xì)胞中I-kB的降解的影響。 ^ W顯示抗GITR對(duì)經(jīng)CD3活化的T細(xì)胞中I-kB的磷酸化的影響。 ^ "示抗GITR對(duì)經(jīng)CD3+CD28活化的T細(xì)胞中I-kB的降解的影響。 塔"顯示抗GITR對(duì)經(jīng)CD3+CD28活化的T細(xì)胞中I-kB的磷酸化的 影響。恩75顯示，6C8和R&D Systems (Minneapolis, MN)的抗體識(shí)別獨(dú)特的 表位。在經(jīng)過(guò)OKT3和伴刀豆球蛋白(Con A)活化的淋巴細(xì)胞上進(jìn)行竟?fàn)帉?shí) 驗(yàn)。l叱/ml 6C8與不同量的竟?fàn)幮訰&D Systems抗體(GITR/TNFRSF18.單 克隆抗體)一起使用。在抗體的最高濃度觀察到一些竟?fàn)?，但這非?？赡苁?由空間位阻引起的。^ /6示6C8抗GITR抗體相對(duì)R&D Systems GITR抗體的動(dòng)力學(xué)分析。激J7顯示，注射了絲裂霉素C處理過(guò)的B16細(xì)胞的小鼠在用抗GITR 抗體(2F8大鼠抗小鼠GITR結(jié)合分子)處置后的存活率。^/《v4-7《"顯示6C8結(jié)合分子的可變重鏈(VHD)(分別是A和B)和可 變輕鏈(VKA)(分別是C和D)的核酸序列和氨基酸序列。引導(dǎo)序列用粗體顯 示；框架序列加有下劃線；CDR序列為斜體。萄和/95顯示，2F8和2F8 F(ab，)2片段增強(qiáng)了對(duì)HA的體液應(yīng)答。 和2^B顯示，2F8和2F8 F(ab，)2片段增強(qiáng)了對(duì)Ova的體液應(yīng)答。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了能夠特異結(jié)合T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞上的GITR,例如人 GITR (hGITR)的結(jié)合分子。本發(fā)明的結(jié)合分子特點(diǎn)在于能以高親和性結(jié)合 hGITR,并且在有刺激劑(例如CD3)的情況下，它們具有對(duì)抗作用，能夠 抵消Treg細(xì)胞對(duì)T效應(yīng)(Teff)細(xì)胞的抑制作用。本發(fā)明的各個(gè)方面涉及結(jié)合 分子、其藥物組合物，以及編碼所述結(jié)合分子的核酸、用于制備該結(jié)合分 子的重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。利用本發(fā)明的結(jié)合分子體外或體內(nèi)檢測(cè)人 GITR或者調(diào)節(jié)人GITR活性的方法也涵蓋在本發(fā)明范圍內(nèi)。為了方便對(duì)本發(fā)明的理解，首先對(duì)一些術(shù)語(yǔ)進(jìn)行定義。I.定義術(shù)語(yǔ)"糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNF受體"(文中縮寫為"GITR，，)，又稱為TNF 受體超家族18 (TNFRSF18),用于本文，是指腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長(zhǎng)因子 受體家族的成員。它是一個(gè)有241個(gè)氨基酸的I型跨膜蛋白，特點(diǎn)在于胞外 結(jié)構(gòu)域中有三個(gè)半胱氨酸假重復(fù)子，特異保護(hù)細(xì)胞免于T細(xì)胞受體誘導(dǎo)的 細(xì)胞凋亡，雖然它不能保護(hù)細(xì)胞免于其它細(xì)胞凋亡信號(hào)，包括Fas誘發(fā)、地 塞米松處置或UV放射(Nocentini， G， ef a/. (1997)戶roc. Ato/. OX4 94:6216-622)。人GITR (hGITR)的核酸序列如SEQ ID NO: 17所示，其氨 基酸序列如SEQ ID NO.: 18所示。術(shù)語(yǔ)"結(jié)合分子"用于本文包括含有至少一個(gè)能夠特異結(jié)合GITR的抗原 結(jié)合位點(diǎn)的分子。"特異結(jié)合，，表示所述結(jié)合分子對(duì)非GITR分子基本只顯示 出背景結(jié)合。但是，特異結(jié)合GITR的分離的結(jié)合分子對(duì)來(lái)自其它物種的 GITR分子可能有交叉反應(yīng)性。本發(fā)明的結(jié)合分子可以包含免疫球蛋白分子的任何同種型(例如，IgG， IgE, IgM, IgD, IgA和IgY)、類型(例如，IgGl, IgG2， IgG3， IgG4， IgAl和IgA2) 或亞型的免疫球蛋白重鏈。結(jié)合分子可以既有重鏈也有輕鏈。用于本文， 術(shù)語(yǔ)結(jié)合分子還包括抗體(包括全長(zhǎng)抗體)；單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆 抗體)；多克隆抗體；多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)；人、人源化或 嵌合抗體抗體；以及抗體片段，例如Fab片段、F(ab')片段、Fab表達(dá)文庫(kù) 產(chǎn)生的片段、以上所有的表位結(jié)合片段，和抗體的工程化形式，例如scFv 分子，只要它們表現(xiàn)出所需的活性，例如能夠結(jié)合GITR。"抗原"是結(jié)合分子所特異結(jié)合的實(shí)體(例如，蛋白性實(shí)體或肽)。術(shù)語(yǔ)"表位"或"抗原決定簇"是指結(jié)合分子特異結(jié)合到的抗原上的位 點(diǎn)。表位可以由連續(xù)氨基酸構(gòu)成，也可以是不連續(xù)的氨基酸通過(guò)蛋白質(zhì)的 四級(jí)折疊而排列在一起的。由連續(xù)氨基酸構(gòu)成的表位在接觸變性溶劑時(shí)通 常能夠維持，而通過(guò)四級(jí)折疊構(gòu)成的表位通常用變性溶劑處理時(shí)會(huì)喪失。 表位通常包括至少有3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14或15個(gè) 氨基酸的獨(dú)特立體構(gòu)象。確定表位的立體構(gòu)象的方法包括，例如X-射線結(jié) 晶學(xué)和2-維核義茲共才展。參見(jiàn)例々口，五戸' cpe j^appz7 g Profoco/s MeZ^ocis Afo/ecw/w說(shuō)》/ogy' Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)。可以通過(guò)簡(jiǎn)單的免疫檢測(cè)，顯示一種抗體能夠阻斷另一種抗體與靶抗 原的結(jié)合，即竟?fàn)幗Y(jié)合法來(lái)鑒定識(shí)別相同表位的結(jié)合分子。竟?fàn)幗Y(jié)合是通過(guò)這樣的檢測(cè)來(lái)確定，其中待測(cè)結(jié)合分子能夠阻止參照結(jié)合分子與共有抗原(比如GITR)的特異結(jié)合。已知的竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)有許多類型，例如固相直 接或間接放射免疫檢定(RIA);固相直接或間接酶免疫檢定法(EIA)夾心 竟?fàn)帣z定法(見(jiàn)Stahli"a/.,MeAoA/"E"z3^o/ogy 9:242 (1983));固相直接 生物素-抗生物素蛋白EIA (參見(jiàn)Kirkland "a/" >//mm""o/. 137:3614 (1986》; 固相直接標(biāo)記檢定法、固相直接標(biāo)記夾心檢定法(參見(jiàn)Harlow and Lane, ^wz^od/w..力丄a6orator少M(fèi)cwwa/, Cold Spring Harbor Press (1988));用1-125 標(biāo)記進(jìn)行的固相直接標(biāo)記RIA (參見(jiàn)Morel d a/., Mo/, /柳w冊(cè)o/. 25(1):7 (1988));固相直接生物素-抗生物素蛋白EI A (Cheung W a/. ， F^o/ogy 176:546 (1990));以及直才妾才示^己RIA (Moldenhauer " a/" Sca"d /mmzmo/. 32:77 (1990))。通常，這類檢測(cè)會(huì)涉及到使用結(jié)合在固體表面或細(xì)胞上的純化抗 原，帶有未標(biāo)記待測(cè)結(jié)合分子和標(biāo)記的參照結(jié)合分子。通過(guò)確定在有待測(cè) 結(jié)合分子的情況下，結(jié)合到固體表面和細(xì)胞上的標(biāo)記的量來(lái)衡量竟?fàn)幰种啤?一般來(lái)說(shuō)，待測(cè)結(jié)合分子是過(guò)量的。通常，當(dāng)竟?fàn)幗Y(jié)合分子是過(guò)量的，它 會(huì)抑制參照結(jié)合分子與共有抗原的特異結(jié)合的至少50-55%、 55-60%、60-65%、 65-70% 、 70-75%或以上。表位還可以被免疫細(xì)胞，例如B細(xì)胞和/或T細(xì)胞所識(shí)別。表位的細(xì)胞 識(shí)別可以通過(guò)測(cè)量抗原依賴性增殖的體外檢定法來(lái)確定，象通過(guò)"H-胸苷摻 入、細(xì)胞因子分泌、抗體分泌或抗原依賴性殺傷(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞檢定 法)來(lái)確定。術(shù)語(yǔ)"單克隆結(jié)合分子"用于本文是指從基本上均質(zhì)的結(jié)合分子群體中 獲得的結(jié)合分子。單克隆結(jié)合分子是高度特異的，定向針對(duì)單個(gè)的抗原位 點(diǎn)。此外，與通常包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同結(jié)合分子的多克隆結(jié)合分子制備物不同，每種單克隆結(jié)合分子是針對(duì)抗原上的單一的決定簇的。 修飾詞"單克隆"表明這類結(jié)合分子的特征在于得自基本均質(zhì)的結(jié)合分子群體，而不應(yīng)解釋為需要任何具體方法來(lái)制備該結(jié)合分子。例如，與本發(fā)明 一致的單克隆結(jié)合分子可以是通過(guò)由Kohler等(A^",'e 256:495 (W乃》首次 描述的雜交瘤方法制備的，或者可以通過(guò)重組DNA方法(參見(jiàn)，例如美國(guó) 專利4,816,567)。"單克隆結(jié)合分子"還可以利用例如Clac.kson, " "/., Wa加'e 352:624-628 (1991)和Marks " a/.， J. 7Wo/所o/. 222:581-597 (1991)中描述的技 術(shù)從噬菌體文庫(kù)中分離。術(shù)語(yǔ)"嵌合結(jié)合分子"是指包含來(lái)源于不同物種的氨基酸序列的結(jié)合分 子。嵌合結(jié)合分子可以例如由不同物種的結(jié)合分子基因片段通過(guò)基因工程 來(lái)構(gòu)建。文中的單克隆結(jié)合分子特別包括"嵌合"結(jié)合分子，其重鏈和/或輕鏈的 一部分與來(lái)源于具體物種，或者屬于具體抗體型或亞型的結(jié)合分子中的相 應(yīng)序列是相同或同源的，而鏈的其它部分與來(lái)源于另一物種或?qū)儆诹硪豢?體型或亞型的結(jié)合分子，以及這樣的結(jié)合分子的片段中的相應(yīng)序列是相同或同源的，只要它們表現(xiàn)出所需的生物活性(美國(guó)專利4,S16,567;和 Morrison, " 尸rac.淑/. Sc,'.固81:6851-6855 (1984)),比如與人GITR(hGITR)結(jié)合。輕鏈和重鏈均被按照結(jié)構(gòu)和功能同源性分成不同區(qū)域。術(shù)語(yǔ)"恒定"和 "可變"是用于描述功能性的。就這方面而言，應(yīng)當(dāng)明白輕鏈部分的可變結(jié)構(gòu) 域(VL)和重鏈部分的可變結(jié)構(gòu)域(VH)決定了抗原識(shí)別和特異性。相反，輕 鏈的恒定結(jié)構(gòu)域(CL)和重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、 CH2或CH3)賦予重要的生 物特性，比如分泌性、穿過(guò)胎盤、Fc受體結(jié)合、補(bǔ)體結(jié)合等等。傳統(tǒng)上， 恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域隨著離抗原結(jié)合位點(diǎn)或抗體氨基末端越遠(yuǎn)其編號(hào)越大。N末 端是可變區(qū)，C末端是恒定區(qū)；CH3和CL結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H上分別包含重鏈和輕 鏈的羧基端。"可變區(qū)"在用于描述結(jié)合分子時(shí)是指結(jié)合分子的氨基末端部分，這一部 分促使抗原結(jié)合到所述結(jié)合分子上，并且不是恒定區(qū)。該術(shù)語(yǔ)包括維持整 個(gè)可變區(qū)的一些或全部結(jié)合功能的功能性片段。術(shù)語(yǔ)"超變區(qū)"用于本文是指結(jié)合分子可變結(jié)構(gòu)域中這樣的區(qū)域，其在序 列上超可變并且/或者形成結(jié)構(gòu)上局限在一起的環(huán)形。超變區(qū)包含來(lái)自"互補(bǔ) 決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基。用于本文，術(shù)語(yǔ)"CDR"或"互補(bǔ)決定區(qū)"意味著在重鏈和輕鏈多肽的可 變區(qū)中可以發(fā)現(xiàn)的非連續(xù)抗原結(jié)合位點(diǎn)。Kabat, et al., /飼.Ozem. 252, 6609-6616 (1977)禾口 Kabat, ef a/" Sequences of protein of immunological interest. (1991)，以及Chothia， d "1" J M /. 196，-917 (1987)和MacCallum, Wa/.， J. Mo/.歷o/. 262:732-745 (1996)描述過(guò)這些具體區(qū)域，其中 的定義包括在相互進(jìn)行比較時(shí)氨基酸殘基的重疊或亞組?？傊?，用這些定界定和使用的術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)。用于本文，術(shù)語(yǔ)"框架區(qū)"或"FR"意味著框架中被CDR分隔開(kāi)的每個(gè) 結(jié)構(gòu)域。因此，可變區(qū)框架長(zhǎng)約100-120個(gè)氨基酸，但僅指CDR之外的那 些氨基酸。非人(例如鼠)結(jié)合分子的"人源化"形式是含有最少的來(lái)自非人結(jié)合分 子序列的嵌合抗體。多數(shù)情況，人源化結(jié)合分子是這樣的人結(jié)合分子(受體/ 接受結(jié)合分子)，其中來(lái)自超變區(qū)的殘基被來(lái)自非人物種(供體結(jié)合分子)， 比如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類超變區(qū)具備所需特異性、親和性和能力 的殘基所取代。在一些例子中，人結(jié)合分子的Fv框架區(qū)(FR)殘基被改變， 例如替換、取代或回復(fù)突變成相應(yīng)的非人殘基。此外，人源化結(jié)合分子可 能包含受體結(jié)合分子或供體結(jié)合分子中都沒(méi)有的殘基。這類修飾一般是為 了進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)合分子的性能。通常，人源化結(jié)合分子會(huì)包含基本上全部 的至少一個(gè)， 一般是兩個(gè)可變區(qū)，其中全部或基本上全部超變環(huán)對(duì)應(yīng)著非 人結(jié)合分子的超變環(huán)，并且全部或基本全部FR區(qū)是人結(jié)合分子序列的FR。 人源化結(jié)合分子任選還包含通常是人結(jié)合分子的結(jié)合分子恒定區(qū)(Fc)的至 少一部分。更詳纟田內(nèi)容，參見(jiàn)Jones, W 7Vfl/w,e 321:522-525 (1986); Riechmann, " a/" A^/7^e 332:323-329 (1988); Presta， Cwn". 5Vrwc〖.S/o/. 2:593-596 (1992)。優(yōu)選的，本發(fā)明的人源化結(jié)合分子包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO.:3 (GFSLSTSGMGVG (HC CDRl))、 SEQ ID NO.:4 (HIWWDDDKYYNPSLKS (HC CDR2N))、 SEQ ID NO.:5 (TRRYFPFAY (HC CDR3))、 SEQ ID NO.:6 (KASQNVGTNVA (LC CDRl))、 SEQ ID NO. :7 (SASYRYS (LC CDR2》、SEQ ID NO.:8 (QQYNTDPLT (LC CDR3》和 SEQ ID NO: 19 (HIWWDDDKYYQPSLKS (HC CDR2Q》的CDR。術(shù)語(yǔ)"工程化的"或"重組"結(jié)合分子用于本文包括通過(guò)重組手段制 備、表達(dá)、創(chuàng)造或分離的結(jié)合分子，比如利用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞的重組表達(dá) 載體表達(dá)的結(jié)合分子，從重組、組合結(jié)合分子文庫(kù)中分離的結(jié)合分子，從 人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)中分離的結(jié)合分子(參見(jiàn)例如， Taylor, L.D., a/. (1992) Jc油L 20:6287-6295),或者通過(guò)其它涉及 將人結(jié)合分子基因序列剪接到其它DNA序列上的手段來(lái)制備、表達(dá)、創(chuàng)造或分離的結(jié)合分子。但是在一些實(shí)施方案中，這類重組人結(jié)合分子經(jīng)受了 體外突變(或者，當(dāng)使用人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，是體內(nèi)體細(xì)胞突變)，因此重組結(jié)合分子的VH和VL區(qū)的氨基酸序列雖然來(lái)源于并且與人種系 VH和VL序列相關(guān)，可能不是天然存在于人結(jié)合分子體內(nèi)種系中的。"分離的結(jié)合分子"用于本文是指這樣的結(jié)合分子，這種結(jié)合分子基本上 不含具有不同抗原特異性的其它結(jié)合分子(例如，特異結(jié)合GITR的分離的 結(jié)合分子基本上不含有特異結(jié)合GITR之外的抗原的結(jié)合分子)。此外，分 離的結(jié)合分子可能基本上不含有其它細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)。"分離的"結(jié) 合分子是已經(jīng)從其天然環(huán)境中的成分中鑒定并且分離和/或回收的結(jié)合分 子。天然環(huán)境的雜質(zhì)成分包括，例如會(huì)干擾結(jié)合分子的診斷或治療用途的 物質(zhì)，可包括酶，激素，及其它蛋白性或非蛋白性溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方 案中，結(jié)合分子經(jīng)過(guò)純化可以達(dá)到以下程度(1)按Lowry法測(cè)定，達(dá)到該 化合物重量的95%以上，最優(yōu)選重量的99%以上，(2)足以經(jīng)轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀 (spinning cup s叫uenator)測(cè)出N-末端氨基酸序列或內(nèi)部氨基酸序列的至少 15個(gè)殘基，或者(3)經(jīng)過(guò)還原或非-還原條件下的SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)或 優(yōu)選銀染色測(cè)出為均質(zhì)。分離的結(jié)合分子包括重組細(xì)胞中的原位結(jié)合分子， 因?yàn)槿鄙僭摻Y(jié)合分子的天然環(huán)境至少一個(gè)成分。但是通常，分離的結(jié)合分 子是通過(guò)至少一個(gè)純化步驟制備的。用于本文，術(shù)語(yǔ)"結(jié)合常數(shù)，，"(kd)"(又稱為"親和常數(shù)")用于衡量?jī)煞N 分子之間可逆結(jié)合的程度，包括實(shí)際結(jié)合親和性和表觀結(jié)合親和性。實(shí)際 結(jié)合親和性是通過(guò)計(jì)算M"S"的結(jié)合常數(shù)與S"的解離常數(shù)的比率確定的， 單位為"M-'"。因此，賦予或者優(yōu)化結(jié)合親和性包括對(duì)這兩個(gè)成分中的一個(gè) 進(jìn)行改變，或者兩者都做改變來(lái)達(dá)到所需水平的結(jié)合親和性。表觀親和性 可以包括，例如反應(yīng)的親和力。例如，兩價(jià)異數(shù)可變區(qū)結(jié)合片段可能因?yàn)?其價(jià)態(tài)，表現(xiàn)出變化的或被優(yōu)化的結(jié)合親和性。結(jié)合親和性可以通過(guò)例如 利用BIAcore系統(tǒng)測(cè)量表面等離子共振來(lái)確定。術(shù)語(yǔ)"核酸分子"用于本文，包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可 以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA。術(shù)語(yǔ)"分離的核酸分子"在本文中用于描述編碼能結(jié)合GITR的結(jié)合分 子的核酸時(shí)，是指該核酸分子中編碼所述結(jié)合分子的核苷酸序列不含有在人基因組DNA中天然側(cè)接該核酸的其它核苷酸序列。這類序列任選包括對(duì)調(diào)節(jié)或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性重要的5，或3，核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)"載體"用于本文是指能夠轉(zhuǎn)移連在它上面的另 一個(gè)核酸的核酸分 子。載體的一類是"質(zhì)粒"，指的是可以在其中連接上其它DNA片段的圓形 雙鏈DNA環(huán)。另一類載體是病毒載體，其中其它的DNA片段可以連接到 病毒基因組中。 一些載體能夠在所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自動(dòng)復(fù)制(例如，帶有 細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體，和游離型哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如，非 游離型哺乳動(dòng)物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后能夠整合到宿主細(xì)胞的基因組中， 從而與宿主基因組一起復(fù)制。此外，還有一些載體能夠指導(dǎo)與它們可操縱 性連接的基因的表達(dá)。這類載體在本文.中稱為"重組表達(dá)載體"(或簡(jiǎn)稱為"表 達(dá)載體")。 一般來(lái)說(shuō)，在重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒。在 本說(shuō)明書(shū)中，"質(zhì)粒"和"載體"可以互換使用，因?yàn)樽畛Ｓ玫妮d體形式就是 質(zhì)粒。但是，本發(fā)明包括其它形式的表達(dá)載體，比如病毒載體(例如，復(fù)制 缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們可以起到相同的功能。術(shù)語(yǔ)"重組宿主細(xì)胞"(或者簡(jiǎn)稱"宿主細(xì)胞")用于本文，是指導(dǎo)入了重 組表達(dá)載體的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)明白的是，這類術(shù)語(yǔ)不僅指具體的所述細(xì)胞，還 包括該細(xì)胞的后代。因?yàn)樵诤罄m(xù)世代中可能因?yàn)橥蛔兓颦h(huán)境影響而發(fā)生修 飾，這些后代可能實(shí)際上是不同于親本細(xì)胞的，但仍然包括在文中所用術(shù) 語(yǔ)"宿主細(xì)胞"的范圍內(nèi)。用于本文，術(shù)語(yǔ)"T細(xì)月包"(即T淋巴細(xì)胞)包括來(lái)自哺乳動(dòng)物(例如人) 的T細(xì)胞系中的所有細(xì)胞，包括胸腺細(xì)胞、未成熟T細(xì)胞、成熟T細(xì)胞等 等。優(yōu)選，所述T細(xì)胞是表達(dá)CD4或者CD8，但不是兩者都表達(dá)，以及T 細(xì)胞受體的成熟T細(xì)胞。文中描述的各種T細(xì)胞群體可以根據(jù)它們的細(xì)胞 因子特點(diǎn)和功能進(jìn)行界定，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。用于本文，術(shù)語(yǔ)"樹(shù)突狀細(xì)胞"是指能夠活化原初(naive)T細(xì)胞、刺激B 細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的專職抗原遞呈細(xì)胞(APCs)。用于本文，術(shù)語(yǔ)"原初(naive) T細(xì)胞"包括還沒(méi)有接觸關(guān)聯(lián)抗原，因此 是未被活化的或者有記憶的T細(xì)胞。原初T細(xì)胞不循環(huán)，人原初T細(xì)胞是 CD45RA+。如果原初T細(xì)胞識(shí)別抗原并且接受了其它信號(hào)，這些信號(hào)可以 是基于但不限于抗原的量、給予途徑和給予時(shí)機(jī)，原初T細(xì)胞可能增殖并 分化成各種T細(xì)力包亞型，例如效應(yīng)T細(xì)月包。用于本文，術(shù)語(yǔ)"效應(yīng)T細(xì)胞，，或者"Teff細(xì)胞，，包括功能在于(例如， 通過(guò)產(chǎn)生能調(diào)節(jié)其它細(xì)胞的活化的細(xì)胞因子或者通過(guò)細(xì)胞毒活性)清除抗原 的T細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"效應(yīng)T細(xì)胞，，包括輔助性T細(xì)胞(例如，Thl和Th2細(xì)胞) 以及細(xì)胞毒性T細(xì)胞。Thl細(xì)胞介導(dǎo)延遲型超敏反應(yīng)和巨細(xì)胞活化，而Th2 細(xì)胞能夠協(xié)助B細(xì)胞，在過(guò)敏反應(yīng)中非常關(guān)鍵(Mosmann and Coffman, 1989, J膽.i ev.力w濯o/. 7, 145-173; Paul and Seder, 1994， CW/ 76， 241-251; Arthur and Mason, 1986， J Med. 163, 774-786; Paliard, 1988, J /畫畫/.141, 849-855; Finkelman, e a/" 1988, J./mm冊(cè)o/. 141,2335-2341)。用于本文，術(shù)語(yǔ)"1型輔助性T細(xì)胞反應(yīng)"(Thl反應(yīng))是指這樣的反 應(yīng)，其特征在于產(chǎn)生一或多種選自IFN-y、 IL-2、 TNF和淋巴毒素(LT)的細(xì) 胞因子，以及其它優(yōu)先或?qū)ｉT由Thl細(xì)胞而非Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。 用于本文，"2型輔助性T細(xì)胞反應(yīng)，，(Th2反應(yīng))是指CD4+ T細(xì)胞的反應(yīng)， 其特征在于產(chǎn)生一或多種選自IL-4、 IL-5、 IL-6和IL-10的細(xì)胞因子，并且 與有效的Th2細(xì)胞提供的B細(xì)月包"協(xié)助"有關(guān)(例如，IgGl和/或IgE的產(chǎn)生 增力口)。用于本文，術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)性T細(xì)胞"或"Treg細(xì)胞，，包括產(chǎn)生低水平IL-2、 IL-4、 IL-5和IL-12的T細(xì)胞。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生TNFa、 TGF卩、IFN-y和 IL-IO，但低于效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生的水平。雖然TGF[3是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生的 主要細(xì)胞因子，它所產(chǎn)生的細(xì)胞因子的水平要低于或等同于Thl或Th2細(xì) 胞產(chǎn)生的，例如比Thl或Th2細(xì)胞中的低一個(gè)數(shù)量級(jí)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可見(jiàn) 于CD4+CD25+細(xì)月包群(參見(jiàn)，例如Waldmann and Cobbold. 2001. /mm訓(xùn)^. 14:399)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能積極主動(dòng)地抑制Thl 、 Th2或者原初T 細(xì)胞的增殖和產(chǎn)生細(xì)胞因子，其中這些原初T細(xì)胞已經(jīng)在培養(yǎng)中用激活信 號(hào)(例如，抗原和抗原遞呈細(xì)胞，或者用模擬MHC中的抗原(例如，抗CD3 抗體，加上抗CD28抗體))刺激過(guò)。用于本文，術(shù)語(yǔ)"耐受性"包括對(duì)活化受體介導(dǎo)的刺激的不應(yīng)性。這種 不應(yīng)性通常是抗原特異性的，在與耐受化抗原的接觸中止后仍然存在。例 如，耐受性的特點(diǎn)表現(xiàn)為缺乏產(chǎn)生細(xì)胞因子(例如IL-2),或者可以利用混合 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)評(píng)價(jià)。耐受性可以對(duì)自身抗原或外來(lái)抗原發(fā)生。"混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，，("MLC，，)是一種淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)，將來(lái)自兩個(gè) 個(gè)體的淋巴細(xì)胞一起培養(yǎng)，通過(guò)3H-標(biāo)記的胸苷的攝取來(lái)測(cè)量增殖反應(yīng)("混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)")。用于本文，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞凋亡，，又稱為程序化細(xì)胞死亡(PCD)，是這樣的 細(xì)胞死亡，其特征包括，但不限于核異染色質(zhì)的凝聚、細(xì)胞收縮、細(xì)胞質(zhì) 凝聚，以及在細(xì)胞凋亡后期，內(nèi)切核酸酶介導(dǎo)的細(xì)胞DNA被切割成具體片 段。在對(duì)已發(fā)生細(xì)胞凋亡的細(xì)胞DNA進(jìn)行電泳分析時(shí)，可能形成明顯的特 征性DNA片段"梯度"。"處置"既包括治療性處置，也包括預(yù)防或防止性措施。需要某種處置的 包括已經(jīng)患有某種紊亂的，也包括還未表現(xiàn)紊亂的。"紊亂"是任何可能受益于用本發(fā)明結(jié)合分子進(jìn)行處置的狀況。它包括慢 性和急性紊亂或疾病或者與過(guò)高或過(guò)低免疫應(yīng)答相關(guān)的病理狀態(tài)。以下部分進(jìn)一步詳細(xì)描述了本發(fā)明的各個(gè)方面。II. GITR結(jié)合分子本發(fā)明提供了分離的GITR結(jié)合分子。示范性的本發(fā)明結(jié)合分子包括 6C8抗體和2F8抗體。6C8抗體是一種抗GITR抗體，能夠與T細(xì)胞和樹(shù) 突狀細(xì)胞，比如人T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞上的GITR高親和性結(jié)合。優(yōu)選的， 這樣的結(jié)合分子抵消Treg細(xì)胞對(duì)Teff細(xì)胞的抑制，在有刺激劑(例如CD" 存在的情況下體外對(duì)部分活化的T細(xì)胞是拮抗性的。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的VH結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO:l所示 之氨基酸序列(6C8 VH結(jié)構(gòu)域"N",包括引導(dǎo)序列)。應(yīng)當(dāng)明白的是'雖然 本文描述的結(jié)合分子的一些序列包括引導(dǎo)序列，本發(fā)明結(jié)合分子也可以不 包含引導(dǎo)序列，這一點(diǎn)是任選的。例如，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合 分子包含SEQ ID NO:l所示成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:l 中的氨基酸20-138。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的VH結(jié)構(gòu)域包含SEQ IDNO:66所 示之氨基酸序列(6C8 VH結(jié)構(gòu)域"Q"，包括引導(dǎo)序列)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的VL結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:2所示 之氨基酸序列(6C8 VL結(jié)構(gòu)域，包括引導(dǎo)序列)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的VH結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO:l中的 氨基酸殘基20-138 (6C8VH結(jié)構(gòu)域"N",不含引導(dǎo)序列)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的VH結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO: 66 中的氨基酸殘基20-138 (6C8VH結(jié)構(gòu)域"Q",不含引導(dǎo)序列)。氨基酸殘基21-127 (6C8VL結(jié)構(gòu)域，不含引導(dǎo)序列)。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，VL鏈包含引導(dǎo)和/或信號(hào)序列，即SEQID NO:2中的氨基酸殘基1-20 (SEQ ID NO:59)。在一 實(shí)施方案中，VH鏈包含 引導(dǎo)和/或信號(hào)序列，即SEQ ID NO:l中的氨基酸殘基1-19 (SEQ ID NO:64)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含的VH結(jié)構(gòu)域含有SEQIDNO:3 所示之CDR (6C8 VH CDRl)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含的VH結(jié)構(gòu)域含有SEQIDNO:4 所示之CDR (6C8 VH CDR2-"N")。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含的VH結(jié)構(gòu)域含有SEQIDNO:5 所示之CDR (6C8 VH CDR3)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含的VH結(jié)構(gòu)域含有SEQ ID NO: 19 所示之CDR (6C8 VH CDR2-altemate "Q")。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含的VL結(jié)構(gòu)域含有SEQ ID NO: 6 所示之CDR (6C8 VL CDRl)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含的VL結(jié)構(gòu)域含有SEQ ID NO: 7 所示之CDR (6C8 VL CDR2)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含的VL結(jié)構(gòu)域含有SEQ ID NO: 8 所示之CDR (6C8 VL CDR3)。本發(fā)明還涉及編碼上述氨基酸序列的核酸分子。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的VH結(jié)構(gòu)域包含SEQ IDNO:9所 示之核苷酸序列(6C8 VH結(jié)構(gòu)域，"N"，包括引導(dǎo)序列)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的VH結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:65 所示之核苷酸序列(6C8 VH結(jié)構(gòu)域，"Q",包括引導(dǎo)序列)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的VH結(jié)構(gòu)域包含SEQ IDNO:9中 的核芬酸58-414 (6C8 VH結(jié)構(gòu)域，"N",不含引導(dǎo)序列)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的VH結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:65 中的核苦酸58-414(6C8 VH結(jié)構(gòu)域，"Q",不含引導(dǎo)序列)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的VL結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:IO 所示之核苷酸序列(6C8 VL結(jié)構(gòu)域，包括引導(dǎo)序列)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的VL結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:IO 中的核苷酸61-381(6C8 VL結(jié)構(gòu)域，不含引導(dǎo)序列)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含的VH結(jié)構(gòu)域含有其核酸序列如 SEQ ID NO: 11所示的CDR (6C8 VH CDRl)。在一 實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含的VH結(jié)構(gòu)域含有其核酸序列如 SEQ ID NO: 12所示的CDR (6C8 VH CDR2-"AAT")。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含的VH結(jié)構(gòu)域含有其核酸序列如 SEQ IDNO:13所示的CDR (6C8 VHCDR3)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含的VH結(jié)構(gòu)域含有其核酸序列如 SEQ ID NO:65所示的CDR (6C8 VH CDR2-alternate "CAA")。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含的VL結(jié)構(gòu)域含有其核酸序列如 SEQ IDNO:14所示的CDR(6C8VL CDR1)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含的VL結(jié)構(gòu)域含有其核酸序列如 SEQ ID NO: 15所示的CDR(6C8 VL CDR2)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含的VL結(jié)構(gòu)域含有其核酸序列如 SEQ ID NO:16所示的CDR (6C8 VL CDR3)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的CL結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:20所 示之氨基酸序列(鼠IgGh輕鏈恒定區(qū))。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的CH結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:21所 示之氨基酸序列(鼠IgG2a重鏈恒定區(qū))。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含SEQ ID NO:22所示之氨基酸序 列(嵌合-6C8VL/人CLIgGl)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含SEQIDNO:23所示之氨基酸序 列(嵌合Gly-6C8VH/人CHIgGl)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含SEQ IDNO:24所示之氨基酸序 列(嵌合Agly-6C8VH/人CHIgGl)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含SEQIDNO:44所示之氨基酸序 列(人源化6C8VL)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含SEQIDNO:53所示之氨基酸序 列(人源化6C8VH"N")。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含SEQ ID NO:54所示之氨基酸序 列(人源化6C8VH"Q")。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的CL結(jié)構(gòu)域包含如SEQ ID NO:55 所示之氨基酸序列(人IgGl Gly重鏈恒定區(qū))。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的CH結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO:56所 示之氨基酸序列(人IgGl Agly重鏈恒定區(qū))。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的CL結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO:57所 示之氨基酸序列(人IgGl輕鏈恒定區(qū))。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含SEQIDNO:58所示之氨基酸序 列(完全人源化6C8輕鏈)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含SEQ ID NO:60所示之氨基酸序 列(完全人源化6C8重鏈-HuN6C8-Gly)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含SEQIDNO:61所示之氨基酸序 列(完全人源化6C8重鏈-HuN6C8-Agly)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含SEQIDNO:62所示之氨基酸序 列(完全人源化6C8重鏈-HuQ6C8-Gly)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子包含SEQIDNO:63所示之氨基酸序 列(完全人源化6C8重鏈-HuQ6C8-Agly)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子具有如

圖18A-18D所示的VL和 VH序列；SEQ ID NO: 1也顯示了 6C8 VH區(qū)的氨基酸序列；6C8 VL區(qū)的氨 基酸序列如SEQ ID NO:2所示。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子具 有SEQ ID NO:20 和21所示之 LC 和 HC 序列；FNRNE (SEQ ID NO:20)在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，VL鏈包含引導(dǎo)和/或信號(hào)序列，例如SEQ ID NO:2的氨基酸殘基1-20。在一實(shí)施方案中，VH鏈包含引導(dǎo)和/或信號(hào)序列， 例如SEQ ID NO:l中的氨基酸殘基1-19。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié) 合分子不含有引導(dǎo)和/或信號(hào)序列。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及6C8結(jié)合分子和其它與6C8特性相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合 分子，所述特性比如高親和性結(jié)合GITR，以及抵消Treg細(xì)胞對(duì)Teff細(xì)胞 的抑制作用。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子不會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡，也不會(huì)抑制混 合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。相應(yīng)的，本發(fā)明的等同的結(jié)合分子是GITR拮抗劑，即它 們能誘發(fā)經(jīng)由GITR進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。GITR是TNFR超家族的成員。因?yàn)?TNFR家族的成員通過(guò)經(jīng)由NF-kB進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與細(xì)胞存活和細(xì)胞凋 亡，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子能減弱I-kB的降解。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的hGITR結(jié)合分子，其輕鏈可變 區(qū)(VL)包含SEQIDNO:2之氨基酸序列，以及任選的引導(dǎo)序列；重鏈可變 區(qū)(VH)包含SEQIDNO:l之氨基酸序列，以及任選的引導(dǎo)序列。在一些實(shí) 施方案中，所述結(jié)合分子包含重鏈恒定區(qū)，比如IgGl,IgG2，IgG3,IgG4,IgA， IgE, IgM或IgD恒定區(qū)。此外，所述結(jié)合分子可以包含輕鏈恒定區(qū)，即k 輕鏈恒定區(qū)或K輕鏈恒定區(qū)。所述結(jié)合分子優(yōu)選包含k輕鏈恒定區(qū)。在一 實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含SEQIDNO:20所示之輕鏈恒定區(qū)。在 一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含SEQIDNO:21所示之重鏈恒定區(qū)。 在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含SEQ ID NO:55所示之重鏈恒定區(qū)。 在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含SEQ ID NO:56所示之重鏈恒定區(qū)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有6C8相關(guān)VL CDR結(jié)構(gòu)域的結(jié) 合分子，例如帶有這樣的輕鏈可變區(qū)(VL)的結(jié)合分子，該輕鏈可變區(qū)有至 少 一個(gè)CDR結(jié)構(gòu)域，后者包含的氨基酸序列選自SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8。在另一實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)(VL)有至少兩個(gè)CDR結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列選自SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8。還有一實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)(VL)的CDR結(jié)構(gòu)域包含的氨基酸序 列選自SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8。還有一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有6C8-相關(guān)的VHCDR結(jié)構(gòu)域 的結(jié)合分子，例如結(jié)合分子的輕鏈可變區(qū)(VH)的CDR結(jié)構(gòu)域包含選自SEQ ID NO: 3 、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。 在另一實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)(VH)有至少兩個(gè)CDR結(jié)構(gòu)域，其包含的 氨基酸序列選自SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO:19。還有一實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)(VH)具有的CDR結(jié)構(gòu)域包含選自 SEQ ID NO: 3 、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 19的氨基酸序 列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少一個(gè)來(lái)源于小鼠抗人 GITR結(jié)合分子，例如6C8結(jié)合分子的CDR。用于本文，術(shù)語(yǔ)"來(lái)源于"一 個(gè)指定的蛋白質(zhì)表示多肽的來(lái)源。在一實(shí)施方案中，來(lái)源于具體起始多肽 的多肽或氨基酸序列是CDR序列或其相關(guān)序列。在另一實(shí)施方案中，來(lái)源 于具體起始多肽的多肽或氨基酸序列是FR序列或其相關(guān)序列。在一實(shí)施方 案中，來(lái)源于具體起始多肽的氨基酸序列不是連續(xù)的。例如，在一實(shí)施方案中，有1、 2、 3、 4、 5、或6個(gè)CDR來(lái)源于小鼠 6C8抗體。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含小鼠6C8抗體的至少 一個(gè)重鏈或輕鏈CDR。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少兩 個(gè)來(lái)自小鼠6C8抗體的CDR。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含 至少三個(gè)來(lái)自小鼠6C8抗體的CDR。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分 子包含至少四個(gè)來(lái)自小鼠6C8抗體的CDR。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的 結(jié)合分子包含至少五個(gè)來(lái)自小鼠6C8抗體的CDR。本發(fā)明的結(jié)合分子包含 至少六個(gè)來(lái)自小鼠6C8抗體的CDR。6C8分子在氨基酸序列上不同。例如，可以進(jìn)行導(dǎo)致保守性取代的核苷酸或 氨基酸取代，或?qū)Ψ潜匦璋被釟埢?例如，在CDR和/或框架中的殘基)進(jìn) 行改變，且保持其結(jié)合GITR(例如人GITR)的能力。在一實(shí)施方案中，至少一個(gè)CDR (或者結(jié)合分子中一個(gè)以上6C8 CDR 中的至少一個(gè))被修飾成與天然6C8結(jié)合分子的序列不同，但保持了結(jié)合6C8的能力。例如，在一實(shí)施方案中，6C8抗體中的一或多個(gè)CDR被修飾 以便除去潛在的糖基化位點(diǎn)。例如，因?yàn)榘被嵝蛄蠥sn-X-(Ser/Thr)預(yù)計(jì) 是糖基化位點(diǎn)的共有序列，可能影響到結(jié)合分子的產(chǎn)生，而6C8重鏈的 CDR2具有序列Asn- Pro-Ser,故該重鏈的第二個(gè)版本4支制備成SEQ ID NO:53中氨基酸殘基62的天冬酰胺(Asn)被保守取代成谷氨酰胺(Gln)。在一 實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含這樣的多肽或氨基酸序列， 其與6C8抗體或者該抗體的一部分基本相同，所述部分由至少3-5個(gè)氨基 酸、至少5-10個(gè)氨基酸、至少10-20個(gè)氨基酸、至少20-30個(gè)氨基酸或者 至少30-50個(gè)氨基酸組成，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員可以看出其來(lái)源于起始序 列。在另 一實(shí)施方案中，來(lái)源于具體起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基 酸序列具有約80%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、卯％、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%的氨基酸序列相同性，或者本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以看出其來(lái)源于所述起始序列。編碼多肽之非天然變體的分離核酸分子可以通過(guò)向結(jié)合分子的核苦酸 序列中引入一或多個(gè)核苷酸取代、添加或缺失，從而在所編碼的蛋白質(zhì)中 引入一或多個(gè)氨基酸取代、添加或缺失來(lái)產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)技術(shù)，比如 定點(diǎn)突變和PCR介導(dǎo)的突變來(lái)引入突變。在一實(shí)施方案中，在一或多個(gè)非 關(guān)鍵氨基酸殘基處做了保守性氨基酸取代。"保守性氨基酸取代"是將氨基酸 殘基用有類似側(cè)鏈的另 一 個(gè)氨基酸殘基代替。有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家 族在本領(lǐng)域已有明確界定，包括堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、 酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨 酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性 側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱 硫氨酸、色氨酸)、(3-分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香 側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，結(jié)合分子多肽 中的一個(gè)非關(guān)鍵氨基酸殘基可以替換成來(lái)自相同側(cè)鏈家族的另 一個(gè)氨基酸 殘基。在另一實(shí)施方案中， 一列氨基酸可以替換成結(jié)構(gòu)類似，但順序和/或 側(cè)鏈家族組成不同的氨基酸串。替代的，在另一實(shí)施方案中，可以沿著結(jié)合分子編碼序列的全部或部 分來(lái)引入突變。優(yōu)選的本發(fā)明結(jié)合分子包含來(lái)源于人氨基酸序列的框架和恒定區(qū)氨基 酸序列。但是，所述結(jié)合分子可以包含來(lái)源于另一個(gè)哺乳動(dòng)物物種的框架 和/或恒定區(qū)序列。例如，所述結(jié)合分子中可以包括靈長(zhǎng)類的框架區(qū)(例如， 非人靈長(zhǎng)類)、重鏈部分，和/或鉸鏈部分。在一實(shí)施方案中，結(jié)合多肽的框 架區(qū)可以含有一或多個(gè)鼠氨基酸，例如人或非人靈長(zhǎng)類框架氨基酸序列可 以包含一或多個(gè)氨基酸取代和/或回復(fù)突變，其中有對(duì)應(yīng)的鼠氨基酸殘基。 優(yōu)選的本發(fā)明結(jié)合分子的免疫原性比起始的6C8鼠抗體的低。本發(fā)明還提供了 GITR的特異性嵌合和/或人源化結(jié)合分子(即，嵌合和/ 或人源化免疫球蛋白)。嵌合和/或人源化結(jié)合分子與提供作為構(gòu)建該嵌合或 人源化結(jié)合分子的起始原料的小鼠或其它非人結(jié)合分子有相同或類似的結(jié) 合特異性和親和性。嵌合結(jié)合分子一般是通過(guò)基因工程，由屬于不同物種的免疫球蛋白基 因片段構(gòu)建成它的輕鏈和重鏈基因。例如，可以將小鼠單克隆結(jié)合分子基因的可變(V)片段與人的恒定(C)片段(比如，IgGl或IgG4，優(yōu)選人同種型 IgGl)連在一起。因此， 一個(gè)示范性的嵌合結(jié)合分子是由來(lái)自小鼠結(jié)合分子 的V或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及來(lái)自人結(jié)合分子的C或效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的雜 交蛋白質(zhì)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及到人源化6C8結(jié)合分子的可變區(qū)以及包 含這樣的人源化可變區(qū)的多肽。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含 至少一個(gè)人源化6C8結(jié)合分子可變區(qū)，例如輕鏈或重鏈可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)"人源化結(jié)合分子"是指這樣的結(jié)合分子，其包含至少一個(gè)含有來(lái) 源于人結(jié)合分子鏈(稱為受體免疫球蛋白或結(jié)合分子)的可變區(qū)框架殘基的 鏈，和至少一個(gè)來(lái)源于小鼠結(jié)合分子(稱為供體免疫球蛋白或結(jié)合分子)的互 補(bǔ)決定區(qū)。人源化結(jié)合分子可以采用下面討論的重組DNA技術(shù)來(lái)制備。參 見(jiàn)例如，Hwang, W.Y.K., " a/. (2005)逾Ws 36:35; Queen " a/., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1989), 86:10029-10033; Jones " a/., Nature, (1986), 321:522-25; Riechmann " "/., Nature, (1988), 332:323-27; Verhoeyen " a/., Science, (1988)， 239:1534-36; Orlandi " a/., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1989), 86:3833-37;美國(guó)專利5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 6,180,370, Selick " a/" WO 90/07861以及Winter, US 5,225,539(以參考文獻(xiàn)的方式全部并入本文)。恒定區(qū)，如果有的話，優(yōu)選也來(lái)源于人免疫球蛋白。當(dāng)選定了優(yōu)選非人供體結(jié)合分子進(jìn)行人源化時(shí)，可以從例如表達(dá)的人 抗體基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)、種系Ig序列或多個(gè)人結(jié)合分子的共有序列來(lái)獲得合 適的人受體結(jié)合分子。在一實(shí)施方案中，基于CDR同源性的方法被用于進(jìn)行人源化(參見(jiàn)， 例如Hwang, W.Y.K., e/ a/. (2005) MeAoA 36:35，該文內(nèi)容以引用的方式全 部并入本文)。這種方法通常涉及到根據(jù)類似結(jié)構(gòu)的小鼠和人CDR,而不是 類似結(jié)構(gòu)的d、鼠和人框架來(lái)將小鼠CDR取代到人可變結(jié)構(gòu)域框架中。確定 小鼠和人CDR的類似性一般是通過(guò)鑒定相同類型的鏈(輕鏈或重鏈)的人基 因，所述鏈與小鼠結(jié)合分子有相同的規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)組合，從而保持CDR 肽骨架的三維構(gòu)象。第二，對(duì)每個(gè)具有匹配的規(guī)范結(jié)構(gòu)的候選可變基因， 在小鼠和候選人CDR之間評(píng)價(jià)殘基和殘基的同源性。最后，為了產(chǎn)生人源 化結(jié)合分子，將選中的人候選CDR中和小鼠CDR不同的CDR殘基改變成 小鼠的序列。在一實(shí)施方案中，人源化結(jié)合分子中沒(méi)有引入人框架的突變。在一實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)了人種系序列與GITR結(jié)合分子CDR的CDR同 源性。例如，對(duì)小鼠6C8抗體，將IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)中具有2-1-1規(guī)范結(jié)構(gòu)的 所有種系輕鏈K鏈V基因與6C8抗體序列進(jìn)行了比較。對(duì)重鏈同樣將所有 3-1種系重鏈V基因與6C8氨基酸序列進(jìn)行了比較。相應(yīng)的，在一實(shí)施方案 中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含具有2-1-1規(guī)范結(jié)構(gòu)的人K鏈V區(qū)框架。在另一 實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含具有3-1規(guī)范結(jié)構(gòu)的人重鏈V區(qū)框架。我們鑒定到以下潛在的人輕鏈種系序列，可以引入到本發(fā)明的結(jié)合分 子中IGKV3-15基因的IMGT登錄號(hào)是M23090。氨基酸序列是(SEQ ID NO:25)。IGKV3D-11基因的IMGT登錄號(hào)是X17264。氨基酸序列是:ID NO:26)。IGKV3-11基因有兩個(gè)等位基因。IGKV3-11基因的等位基因*01的 IMGT登錄號(hào)是X01668。氨基酸序列是(SEQID NO:27)。等位基因*02的IMGT登錄號(hào)是X02768。氨基酸序列是:ID NO:28)。IGKV1D-43基因的IMGT登錄號(hào)是X72817。氨基酸序列是ID NO:29)。IGKV1-39基因有兩個(gè)等位基因。IGKV1-39基因的等位基因*01的 IMGT登錄號(hào)是X59315。氨基酸序列是ID NO:30)。IGKVl-39基因的等位基因^02的IMGT登錄號(hào)是X59318((SEQ基酸序列疋:(SEQID NO:31)。IGKV1-33基因的IMGT登錄號(hào)是M64856。氨基酸序列是:(SEQID NO:32)。IGKVl-27基因的IMGT登錄號(hào)是X63398。氨基酸序列是:(SEQIDNO:33)cIGKV1-17基因有兩個(gè)等位基因。IGKV1-17基因的等位基因*01的 IMGT登錄號(hào)是X72808。氨基酸序列是(SEQID NO:34)。IGKV1-17基因的等位基因^02的IMGT登錄號(hào)是D88255。氨基酸序列疋(SEQID NO:35)。IGKV1D-16基因有兩個(gè)等位基因。IGKV1D-16基因的等位基因*01的 IMGT登錄號(hào)是K01323。氨基酸序列是(SEQID NO:36).IGKV1D-16基因的等位基因*02的IMGT登錄號(hào)是J00244。氨基酸序 列是(SEQID NO:37)。IGKV1-16基因的IMGT登錄號(hào)是J00248。氨基酸序列是:ID NO:38)。IGKV1-12基因有兩個(gè)等位基因。IGKV1-12基因的等位基因*01的 IMGT登錄號(hào)是V01577。氨基酸序列是(SEQID NO:39)。IGKV1-12基因的等位基因^02的IMGT登錄號(hào)是V01576。氨基酸序列是DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLL ID NO:40)。IGKVl-9基因的IMGT登錄號(hào)是Z00013。氨基酸序列是ID N0:41)。IGKVl-6基因的IMGT登錄號(hào)是M64858。氨基酸序列是ID NO:42)。IGKVl-5基因有三個(gè)等位基因。IGKV1-5基因的等位基因*01的IMGT 登錄號(hào)是ZOOOOl。氨基酸序列是(SEQID NO:43)。我們鑒定到以下潛在的人重鏈種系序列，可以？i入到本發(fā)明的結(jié)合分 子中IGHV2-5基因有十個(gè)等位基因。IGHV2-5基因的等位基因*01的IMGT 登錄號(hào)是X62111。氨基酸序列是(SEQ ID NO:45)。IGHV2-26基因的IMGT登錄號(hào)是M99648 。氨基酸序列是(SEQIDNO:46)。IGHV2-70基因有十三個(gè)等位基因。IGHV2-70基因的等位基因*01的 IMGT登錄號(hào)是L21969。氨基酸序列是WLALIDWDDDKYYSTSLKTRLTISKDTSKNQWLTMTNMDPVDTATYY CARI(SEQ ID NO:47)。IGHV4-30-2基因有4個(gè)等位基因。IGHV4-30-2基因的等位基因*01的 IMGT登錄號(hào)是L10089。氨基酸序列是AR(SEQIDNO:48)。IGHV4-30-4基因有六個(gè)等位基因。IGHV4-30-4基因的等位基因5^01的 IMGT登錄號(hào)是Z14238。氨基酸序列是AR(SEQ ID NO:49)。IGHV4-31基因有十個(gè)等位基因。IGHV4-31基因的等位基因*01的 IMGT登錄號(hào)是L10098。氨基酸序列是AR (SEQ ID NO :50)。IGHV4-39基因有六個(gè)等位基因。IGHV4-39基因的等位基因*01的 IMGT登錄號(hào)是L10094。氨基酸序列是(SEQ ID NO:51)。IGHV4-61基因有八個(gè)等位基因。IGHV4-61基因的等位基因*01的 IMGT登錄號(hào)是M29811。氨基酸序列是AR(SEQ ID NO:52)。這些種系序列每一個(gè)都可以用于提供框架區(qū)和一或多個(gè)6C8 CDR —起使用。用于本文，"規(guī)范結(jié)構(gòu)"是由不同CDR形成的保守的超變環(huán)構(gòu)象，結(jié)合 分子借助這些構(gòu)象與抗原產(chǎn)生接觸。利用公共領(lǐng)域的軟件可以將新的結(jié)合 分子劃分規(guī)范結(jié)構(gòu)類型。在另 一 實(shí)施方案中，將小鼠CDR取代到人可變結(jié)構(gòu)域框架中是在能夠 維持小鼠可變結(jié)構(gòu)域框架的正確立體取向的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，這是通過(guò)鑒定 到這樣的人可變結(jié)構(gòu)域框架，這些人可變結(jié)構(gòu)域框架能維持在和CDR所來(lái) 源的小鼠可變結(jié)構(gòu)域框架相同的構(gòu)象。在一實(shí)施方案中，這一點(diǎn)的實(shí)現(xiàn)是 通過(guò)獲取人結(jié)合分子中那些其框架序列與CDR所來(lái)源的小鼠可變框架結(jié)構(gòu) 域表現(xiàn)出高度序列相同性的人可變結(jié)構(gòu)域。參見(jiàn)Kettleborough W a/., /Vo&z力 ￡ g7' een> g 4:773 (1991); Kolbinger eZ a/" /Vote/w EV7gz'"eenVzg 6:971 (1993)禾口 Carter ef a/.， WO 92/22653 。優(yōu)選人受體結(jié)合分子保留供體結(jié)合分子的規(guī)范和界面殘基。此外，所 述人受體結(jié)合分子優(yōu)選在CDR環(huán)長(zhǎng)度方面有相當(dāng)?shù)念愃菩?。參?jiàn)， Kettleborougha/., Protein Engineering 4:773 (1991》Kolbingera/.， Protein Engineering 6:971 (1993)和Carter "a/., WO 92/22653。在另一實(shí)施方案中，可以在與6C8結(jié)合分子的框架區(qū)的同源性的基礎(chǔ) 上選擇合適的人受體序列。例如，可以將6C8結(jié)合分子的氨基酸序列與其 它已知結(jié)合分子的氨基酸序列進(jìn)行比較，例如通過(guò)將6C8氨基酸序列的FR 區(qū)或可變區(qū)與已知結(jié)合分子的公眾數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，挑選那些可變區(qū)或FR 區(qū)氨基酸相同百分比最高的序列，即達(dá)到80%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%、 99.5% 相同的。在一實(shí)施方案中，可以使用SEQ ID NO:67列出的框架系列 (QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLE WLAHIWWDDDKYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTRDTATYYC ARTRRYFPFAYWGEGTSVTVTS (SEQ ID NO:67;框架殘基以粗體表示))。 在另一實(shí)施方案中，可以使用SEQ ID NO:68列出的框架序列EWLAHIWWDDDKYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMT謹(jǐn)DPVDTAT YYCARTRRYFPFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:68;框架殘基以4且體 表示))。鑒定出鼠供體免疫球蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)和合適的人受體免疫球蛋白 后，下一步是決定如果需要這些成分中的哪些殘基應(yīng)當(dāng)被取代以便使所得 人源化結(jié)合分子的特性得到優(yōu)化。通常，應(yīng)當(dāng)盡量減少用鼠取代人的氨基 酸殘基，因?yàn)閷?dǎo)入鼠殘基會(huì)提高結(jié)合分子在人體內(nèi)引發(fā)人抗小鼠抗體 (HAMA)反應(yīng)的危險(xiǎn)?？梢詰?yīng)用本領(lǐng)域認(rèn)可的確定免疫反應(yīng)的方法來(lái)監(jiān)視具體患者或者臨床試驗(yàn)過(guò)程中的HAMA反應(yīng)?？梢詫?duì)被給予人源化結(jié)合分子 的患者在進(jìn)行該項(xiàng)療法的開(kāi)始和過(guò)程中進(jìn)行免疫原性評(píng)價(jià)。例如利用本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的方法，包括表面等離子共振技術(shù)(BIACORE)和/或固相 ELISA分析法，通過(guò)檢測(cè)患者血清樣品中針對(duì)該人源化治療劑的抗體來(lái)衡 量HAMA反應(yīng)。如果必要，可以將人框架區(qū)中的 一 或多個(gè)殘基改變或取代成鼠抗體中 相應(yīng)位點(diǎn)的殘基，從而保留人源化抗體對(duì)抗原的結(jié)合親和性。這種改變有 時(shí)被稱為"回復(fù)突變"?；谒鼈儗?duì)CDR構(gòu)象和/或結(jié)合抗原的可能影響， 挑選人可變區(qū)框架殘基中的一些氨基酸來(lái)做回復(fù)突變。用人可變框架區(qū)代 替鼠CDR區(qū)可能造成構(gòu)象限制，如果不通過(guò)取代一些氨基酸殘基來(lái)進(jìn)行糾 正，會(huì)導(dǎo)致結(jié)合親和性的丟失。在一實(shí)施方案中，進(jìn)行回復(fù)突變的氨基酸殘基可以部分地利用本領(lǐng)域 認(rèn)可的技術(shù)通過(guò)計(jì)算機(jī)模型構(gòu)建來(lái)選擇。通常，是以免疫球蛋白鏈或其結(jié) 構(gòu)域已經(jīng)解決的結(jié)構(gòu)為起點(diǎn)產(chǎn)生分子模型。比較待建模的鏈與已知三維結(jié) 構(gòu)的鏈或結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列類似性，挑選表現(xiàn)出最高序列類似性的鏈或 結(jié)構(gòu)域作為分子建模的起點(diǎn)。選擇具有至少50%序列相同性，優(yōu)選有至少 60%、 70%、 80%、 90%或更高序列相同性的鏈或結(jié)構(gòu)域進(jìn)行建模。將已知 的起始結(jié)構(gòu)進(jìn)行改動(dòng)，允許待模擬免疫球蛋白鏈或結(jié)構(gòu)域中的實(shí)際氨基酸 和起始結(jié)構(gòu)中的氨基酸之間的差別。然后將改動(dòng)過(guò)的結(jié)構(gòu)組裝成組合免疫 球蛋白。最后，對(duì)模型進(jìn)行精調(diào)，包括通過(guò)能量最小化，以及確認(rèn)所有原 子處在合適的距離內(nèi)，鍵長(zhǎng)和鍵角在化學(xué)上可接受的范圍內(nèi)。選擇進(jìn)行取代的氨基酸殘基也可以部分通過(guò)檢驗(yàn)具體位置上的氨基酸 的特點(diǎn)，或者借助經(jīng)驗(yàn)觀察具體氨基酸取代或突變可能造成的影響。例如， 當(dāng)小鼠可變區(qū)框架殘基和選定的人可變區(qū)框架殘基的氨基酸不同時(shí)，如果 可以合理地預(yù)期該氨基酸(l)非共價(jià)地直接結(jié)合抗原，(2)與CDR區(qū)接近， (3)或者與CDR區(qū)有相互作用(例如，通過(guò)計(jì)算機(jī)建模確定其與CDR區(qū)在為3-6A內(nèi))，或者(4)參與VL-VH界面，可以將人框架氨基酸用小鼠結(jié)合分子 中的等同框架氨基酸來(lái)取代。"非共價(jià)地直接結(jié)合抗原"的殘基包括框架區(qū)位點(diǎn)上的氨基酸，它們有很 大的可能與抗原上的氨基酸根據(jù)已建立的化學(xué)力(例如氫鍵、范德華力、疏 水相互作用等)直接相互作用。"接近CDR區(qū)"的殘基包括人源化免疫球蛋白鏈一級(jí)序列中緊挨著一 或多個(gè)CDR的位點(diǎn)上的氨基酸殘基，例如處于緊挨著Kabat所定義的CDR, 或者Chothia定義的CDR(參見(jiàn),例如Chothia and Lesk/ikffi 196:901 (1987)) 的位點(diǎn)上。這些氨基酸特別可能與CDR中的氨基酸發(fā)生相互作用，如果從 受體中選擇，可能會(huì)使供體CDR變形，降低親和性。此外，相鄰氨基酸可 能與抗原直接相互作用(Amit e a/., 6We"ce, 233:747 (1986),該文以參考文 獻(xiàn)方式并入本文)，就可能希望選擇供體中的這些氨基酸，以便保持原有結(jié) 合分子中提供親和性的所有抗原接觸。"或者與CDR區(qū)相互作用，，的殘基包括那些被二級(jí)結(jié)構(gòu)分析確定為處 于足夠影響CDR區(qū)的立體取向的殘基。在一實(shí)施方案中，"或者與CDR區(qū) 相互作用"的殘基是通過(guò)分析供體免疫球蛋白的三維模型(例如計(jì)算機(jī)產(chǎn)生 的模型)鑒定到的。三維模型，通常是原有的供體結(jié)合分子的三維模型，顯 示CDR外的一些氨基酸接近CDR，有很大的可能通過(guò)氫鍵、范德華力、疏 水相互作用等與CDR中的氨基酸相互作用。在這些氨基酸位點(diǎn)上，可以選 擇供體免疫球蛋白氨基酸而不是受體免疫球蛋白氨基酸。符合這一標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸通常有側(cè)鏈原子與CDR中的一些原子處于約3A以內(nèi)，并且必須含 有原子能夠與CDR原子根據(jù)已建立的化學(xué)力，比如上面列舉的那些化學(xué)力 相互作用。對(duì)于可能形成氫鍵的原子，3A是其核間距的測(cè)量值，但是對(duì)于不成鍵 的原子，3 A是其范德華表面之間的距離的測(cè)量值。因此，在后一種情況中， 原子核必須在約6 A以內(nèi)(3 A加上范德華半徑的和)，原子才被認(rèn)為能夠相 互作用。許多情況中，原子核是相距4或5到6 A。在確定氨基酸是否與 CDR有相互作用時(shí)，優(yōu)選不把重鏈CDR的最后8個(gè)氨基酸認(rèn)為是CDR的 一部分，因?yàn)閺慕Y(jié)構(gòu)上看，這8個(gè)氨基酸更象是框架區(qū)的一部分。能夠與CDR中的氨基酸相互作用的氨基酸還可以通過(guò)另 一種方法來(lái)鑒 定。以兩種方式計(jì)算每個(gè)框架氨基酸的溶劑可接近表面積(l)在完整結(jié)合分子中，和(2)在去除了 CDR的結(jié)合分子構(gòu)成的假象分子中。這兩個(gè)數(shù)字之 間有約10平方?；蚋蟮牟顒e表明框架氨基酸與溶劑的接觸至少部分地被 CDR所阻斷，因此該氨基酸與CDR有接觸。 一個(gè)氨基酸的溶劑可接近表面 積可以在結(jié)合分子的三維模型的基礎(chǔ)上，利用本領(lǐng)域已知的算法進(jìn)行計(jì)算 (例如，Connolly, 乂 J; ; /. 16:548 (1983)和Lee and Richards, 乂 Mo/.歷o/.55:379 (1971),這兩篇文章均以參考文獻(xiàn)的方式并入本文)?？蚣馨被嵬?過(guò)影響另一個(gè)與CDR有接觸的框架氨基酸的構(gòu)象偶爾也可能與CDR間接 相互作用。框架中幾個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸已知在許多結(jié)合分子中能夠與CDR相互作 用 (Chothia and Lesk, 同前,Chothia fl/" 同前,口 Tramontano a/., J. Mol. Biol. 215:175 (19卯)，這些文章均以參考文獻(xiàn)的方式并入本文)。具體來(lái)說(shuō)， 輕鏈中位點(diǎn)2、 48、 64和71上的氨基酸，重鏈位點(diǎn)26-30、 71和94的氨基 酸(編號(hào)按照Kabat的)是已知在許多結(jié)合分子中能與CDR相互作用的。輕 鏈位點(diǎn)35以及重鏈位點(diǎn)93和103的氨基酸也可能與CDR相互作用。在所 有這些編號(hào)位點(diǎn)，優(yōu)選在人源化免疫球蛋白中選擇供體氨基酸而不是受體 氨基酸(當(dāng)它們不同時(shí))。另一方面， 一些殘基能與CDR區(qū)相互作用，比如 輕鏈的開(kāi)始5個(gè)氨基酸，有時(shí)可以從受體免疫球蛋白中選擇，而不會(huì)丟失 人源化結(jié)合分子的親和性。"參與VL-VH界面，，的殘基或"堆積殘基"包括那些位于例如Novotny和 Haber (/Voc. A^/. JcW. 82:4592-66 (1985))或Chothia等(同前)定義的VL和VH之間的界面的殘基。 一般來(lái)說(shuō)，應(yīng)當(dāng)在人源化結(jié)合分子中保留 不常見(jiàn)堆積殘基，如果它們與人框架中的不同。通常， 一或多個(gè)滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸被取代。在一些實(shí)施方案中， 全部或大部分滿足以上標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸被取代。偶爾的，難以判斷一個(gè)具體 氨基酸是否滿足上述標(biāo)準(zhǔn)，會(huì)產(chǎn)生替代的變體結(jié)合分子，其中一個(gè)帶有該 具體取代，另一個(gè)沒(méi)有?？梢栽谖闹忻枋龅娜我环治龇ㄖ袦y(cè)試這樣產(chǎn)生的 替代的變體結(jié)合分子的活性，從而選擇優(yōu)選的那個(gè)結(jié)合分子。一般來(lái)說(shuō)，人源化結(jié)合分子的CDR區(qū)與供體結(jié)合分子中的相應(yīng)CDR 區(qū)基本上相同，或者更經(jīng)常的就是相同。雖然通常不需要，有時(shí)可以對(duì)CDR 殘基做一或多個(gè)保守氨基酸取代，而基本不影響所得人源化結(jié)合分子的結(jié)合親和性。保守取代表示的是Gly, Ala; Val, lie, Leu; Asp, Glu; Asn， Gin; Ser， Thr; Lys, Arg;和Phe， Tyr這些組合。其它候選進(jìn)行取代的是那些對(duì)于該人免疫球蛋白位點(diǎn)來(lái)說(shuō)是不常見(jiàn)或 "罕見(jiàn)(rare)"的受體人框架氨基酸。這些氨基酸可以用小鼠供體結(jié)合分子中 等同位點(diǎn)的氨基酸，或者更普通的人免疫球蛋白等同位點(diǎn)上的氨基酸進(jìn)行 取代。例如，當(dāng)受體免疫球蛋白中人框架區(qū)的氨基酸對(duì)于該位點(diǎn)來(lái)說(shuō)是罕 見(jiàn)的，而供體免疫球蛋白中的相應(yīng)氨基酸對(duì)人免疫球蛋白序列的該位點(diǎn)來(lái) 說(shuō)是常見(jiàn)的時(shí)；或者當(dāng)受體免疫球蛋白中的氨基酸對(duì)該位點(diǎn)來(lái)說(shuō)是罕見(jiàn)的， 供體免疫球蛋白中的相應(yīng)氨基酸相對(duì)其它天序列的該位點(diǎn)來(lái)說(shuō)也是罕見(jiàn)的 時(shí)，就可能希望進(jìn)行取代。這些標(biāo)準(zhǔn)保證了人框架中的非典型氨基酸不會(huì) 破壞結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)。而且，用來(lái)自供體結(jié)合分子中恰巧對(duì)于人結(jié)合分子 是典型的氨基酸來(lái)代替不常見(jiàn)的人受體氨基酸，得到的人源化結(jié)合分子可 能免疫原性更低。術(shù)語(yǔ)"罕見(jiàn)"用于本文表明，氨基酸在少于約20。/。、但通常少于約10% 的代表性序列樣品中在該位點(diǎn)出現(xiàn)，術(shù)語(yǔ)"常見(jiàn)"用于本文，表示氨基酸在 超過(guò)約25%、但通常超過(guò)約50%的代表性樣品中出現(xiàn)。例如，所有人輕鏈 和重鏈可變區(qū)序列都被分別劃分到相互之間特別有同源性，并且在 一 些關(guān) 鍵位點(diǎn)上氨基酸相同的序列"亞組"中(Kabat等，同前)。在決定人受體序列 中的氨基酸對(duì)于人序列來(lái)說(shuō)是"罕見(jiàn)"還是"常見(jiàn)"時(shí)，經(jīng)常優(yōu)選只將相同亞 組中的人序列認(rèn)為是受體序列。其它候選進(jìn)行取代的是按照Chothia等(同前)提議的定義會(huì)被認(rèn)定為 CDR區(qū)的一部分的受體人框架氨基酸。另外的候選進(jìn)行取代的是按照AbM 和/或接觸定義會(huì)被認(rèn)定為CDR區(qū)的一部分的受體人框架氨基酸。特別是可 變重鏈中的CDR1被界定為包括殘基26-32。其它可供選擇進(jìn)行取代的是與罕見(jiàn)或不常見(jiàn)供體框架殘基對(duì)應(yīng)的受體 框架殘基。罕見(jiàn)或不常見(jiàn)供體框架殘基是對(duì)于小鼠結(jié)合分子該位點(diǎn)來(lái)說(shuō)罕 見(jiàn)或不常見(jiàn)(如文中定義)的殘基。對(duì)于小鼠結(jié)合分子，可以根據(jù)Kabat以及 被認(rèn)定與共有殘基不同的殘基位點(diǎn)來(lái)劃分亞組。這些供體特有的差異可能 表明小鼠序列中那些使得活性得到提高的體細(xì)胞突變。預(yù)計(jì)會(huì)影響結(jié)合的 不常見(jiàn)殘基被保留，而預(yù)計(jì)對(duì)結(jié)合不重要的殘基可以被取代。其它可供選擇進(jìn)行取代的是出現(xiàn)在受體框架區(qū)中的非種系殘基。例如， 將受體結(jié)合分子鏈(即與供體結(jié)合分子鏈有明顯序列相同性的人結(jié)合分子 鏈)與種系結(jié)合分子鏈(同樣與供體鏈有明顯序列同 一性)進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)， 受體鏈框架和種系鏈框架之間不匹配的殘基可以用相應(yīng)的種系序列中的殘 基進(jìn)行取代。除了上面討論的特異氨基酸取代，人源化結(jié)合分子框架區(qū)通?；旧?， 或者就是與它所來(lái)源的人結(jié)合分子的框架區(qū)相同。當(dāng)然，框架區(qū)中的許多 氨基酸對(duì)結(jié)合分子的特異性或親和性有很少或者沒(méi)有直接的貢獻(xiàn)。因此， 可以容忍許多框架殘基的單個(gè)保守性取代，而不明顯改變所得人源化結(jié)合 分子的特異性或親和性。所以，.在一實(shí)施方案中，人源化結(jié)合分子的可變 框架區(qū)與人可變框架區(qū)序列或這些序列的共有序列有至少85%的序列相同 性。在另一實(shí)施方案中，人源化結(jié)合分子的可變框架區(qū)與人可變框架區(qū)序列或這些序列的共有序列有至少90%,優(yōu)選95%,更優(yōu)選96%, 97%, 98%或 99%的序列相同性。但是，總起來(lái)說(shuō)，是不希望進(jìn)行這類取代的。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子還包含至少 一個(gè)從人氨基酸殘基 到相應(yīng)小鼠氨基酸殘基的回復(fù)突變，所述殘基是界面堆積殘基。"界面堆積 殘基(interface packing residue)"包括位于VL和VH之間的界面的殘基，例如 Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-66 (1985)中定義的。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子還包含至少一個(gè)人氨基酸殘基到 相應(yīng)小鼠氨基酸殘基的回復(fù)突變，其中所述氨基酸殘基是一個(gè)規(guī)范殘基。"規(guī) 范殘基(canonical residue)，，是保守的框架殘基，它們屬于已知對(duì)CDR構(gòu)象非 常重要的規(guī)范或結(jié)構(gòu)類型(Tramontano W a/., J. Mol, Biol. 215:175 (1990), 該文全文以參考文獻(xiàn)方式并入本文)。規(guī)范殘基包括輕碌連中的殘基2、 25、 27B、 28、 29、 30、 33、 48、 51、 52、 64、 71、 90、 94和95，以及重4連的 殘基24、 26、 27、 29、 34、 54、 55、 71和94。其它的殘基(例如，CDR 結(jié)構(gòu)決定性殘基)可以根據(jù)Martin and Thorton (1996) J. Mol. Biol. 263:800的 方法進(jìn)行鑒定。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子還包含至少一個(gè)人氨基酸殘基到 相應(yīng)小鼠氨基酸殘基的回復(fù)突變，其中所述氨基酸殘基位于能夠與CDR相 互作用的位點(diǎn)。特別的，輕鏈位點(diǎn)2、 48、 64和71以及重《連位點(diǎn)26-30, 71和94的氨基酸(遵循Kabat的編號(hào))是已知在許多抗體中能與CDR相互作用 的。輕鏈位點(diǎn)35以及重鏈位點(diǎn)93和103的氨基酸也可能與CDR相互作用?；贑LUSTAL W分析，鑒定到人框架中的多個(gè)氨基酸殘基可能用例 如6C8輕鏈中的相應(yīng)氨基酸殘基進(jìn)行取代。這些包括位點(diǎn)1、 8、 9、 10、 11、 13、 15、 17、 19、 20、 21、 22、 43、 45、 46、 58、 60、 63、 70、 76、 77、 78、 79、 83、 85、 87、 100和104上的殘基。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的可變輕鏈框架還包含至少一個(gè)人 氨基酸殘基到相應(yīng)小鼠氨基酸殘基的取代，所述殘基選自E1D(即，包含小 鼠CDR和人FR區(qū)的CDR移植抗體中位點(diǎn)1的E被突變成D,后者是6C8 抗體中的對(duì)應(yīng)氨基酸殘基)，P8Q， A9K， T10F, L11M, V13T, P15V, E17D, A19V, T20S, L21V, S22T, A43S, R45K, L46A, I58V, A60D, S63T, E70D， S76N， S77N， L78V, Q79H, F83L, V85E, Y87F, G100A和V104L?；贑LUSTAL W分析，我們鑒定了人框架中可能以例如6C8重鏈的 相應(yīng)氨基酸殘基來(lái)取代的幾個(gè)氨基酸殘基。它們包括位點(diǎn)5， 10, 11, 12, 15, 19, 23, 43, 46, 68, 77, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90和92。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的可變重鏈框架還包含至少一個(gè)人 氨基酸殘基到相應(yīng)小鼠氨基酸殘基的取代，所述殘基選自R5K (即，包含 小鼠CDR和人FR區(qū)的CDR移植抗體中位點(diǎn)5的R被突變成K，后者是 6C8抗體中的對(duì)應(yīng)氨基酸殘基)，A10G， Llll， V12L， T15S， T19S, T23S， P43S, A46G, R68Q， K77R, V81F， T83K, M84I, N86S, M87V, P89T, V90A和T92A。109或101。 M人通常，人源化結(jié)合分子對(duì)抗原的結(jié)合親和性的上限在供體 免疫球蛋白結(jié)合親和性上限的3、 4或5倍以內(nèi)。結(jié)合親和性的下限也在供 體免疫球蛋白結(jié)合親和性下限的3、 4或5倍以內(nèi)。替代的，結(jié)合親和性可 以與沒(méi)有取代的人源化結(jié)合分子(例如，具有供體CDR和受體FR,但沒(méi)有 FR取代的結(jié)合分子)的結(jié)合親和性相比。在這種情況中，經(jīng)過(guò)優(yōu)化的結(jié)合分 子的結(jié)合優(yōu)選比未取代結(jié)合分子至少高2到3倍，或3到4倍。為了做比 較，各種結(jié)合分子的活性可以通過(guò)例如BIACORE (即用未標(biāo)記試劑進(jìn)行表 面等離子共振)或竟?fàn)幗Y(jié)合檢驗(yàn)法來(lái)確定。從理論上選定了人源化結(jié)合分子的CDR和框架成分后，有許多方法可 供制備這樣的結(jié)合分子。由于密碼的筒并性，每個(gè)結(jié)合分子氨基酸序列會(huì)有多種核酸序列編碼。所需核酸序列可以通過(guò)重新固相DNA合成或?qū)ο惹爸苽涞乃瓒嗪塑账岬淖凅w進(jìn)行PCR誘變來(lái)生產(chǎn)。寡核苷酸-介導(dǎo)的突變是制備靶多肽DNA的取代、缺失和插入變體的優(yōu) 選方法。參見(jiàn)Adelman " a/. (DNA 2:183 (1983))。簡(jiǎn)而言之，靶多肽DNA 通過(guò)將編碼所需突變的寡核苷酸與單鏈DNA模板進(jìn)行雜交被改變。雜交后， 用DNA聚合酶合成模板的全長(zhǎng)第二互補(bǔ)鏈，所述模板引入了寡核苷酸引物， 編碼革巴多肽DNA的選定改變。如上所述制備的結(jié)合分子可變片段(例如，嵌合、人源化或人結(jié)合分子 的重鏈和輕鏈可變區(qū))通常會(huì)連接上至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)， 一般是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。人恒定區(qū)DNA序列可以按照眾所周知的方 法從多種人細(xì)胞中分離，但優(yōu)選從永生化的B細(xì)胞中分離(參見(jiàn)Kabat"a/., 同前和Liu W a/.， WO87/02671)(兩文均以引用方式全部并入本文)。 一般來(lái) 說(shuō)，結(jié)合分子既含有輕鏈也含有重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)一般包括CHl、 鉸鏈、CH2、 CH3和CH4區(qū)。本文描述的結(jié)合分子包括有所有類型恒定區(qū) 的抗體，包括IgM、 IgG、 IgD、 IgA和IgE;所有同種型，包括IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4。恒定區(qū)的選擇部分上取決于是否需要結(jié)合分子依賴性的補(bǔ)體 以及/或者細(xì)胞介導(dǎo)的毒性。例如，同種型IgGl和IgG3具有補(bǔ)體活性，而 同種型IgG2和IgG4沒(méi)有。當(dāng)希望結(jié)合分子(例如，人源化結(jié)合分子)表現(xiàn)出 細(xì)胞毒活性時(shí)，恒定結(jié)構(gòu)域通常是補(bǔ)體固定恒定結(jié)構(gòu)域，類型一般是IgGl。 當(dāng)不需要這種細(xì)胞毒活性時(shí)，恒定結(jié)構(gòu)域可以是例如IgG2型。同種型的選 擇還可能影響抗體進(jìn)入腦部。優(yōu)選人同種型IgGl。輕鏈恒定區(qū)可以是X或 k。人源化結(jié)合分子可以包含來(lái)自一個(gè)以上類型或同種型的序列。可以將結(jié) 合分子表達(dá)為含有兩個(gè)輕鏈和兩個(gè)重鏈的四聚體、分開(kāi)的重鏈、輕鏈、Fab、 Fab' 、 F(ab')2和Fv,或者表達(dá)為其重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域通過(guò)間隔臂連在 一起的單鏈結(jié)合分子。III.制備結(jié)合分子本發(fā)明提供了對(duì)GITR，例如人GITR有特異性的結(jié)合分子。這類結(jié)合 分子可以用于配制發(fā)明所述的各種醫(yī)療組合物，或者優(yōu)選的提供制備人源 化或嵌合結(jié)合分子的補(bǔ)體決定區(qū)(下文有詳細(xì)描述)。制備非人(例如小鼠、 豚鼠、靈長(zhǎng)類、兔或大鼠)單克隆結(jié)合分子可以通過(guò)例如用GITR或編碼GITR的核酸分子給動(dòng)物接種來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可以通過(guò)將編碼人GITR的基因置入表達(dá)載體，并給動(dòng)物接種來(lái)制備6C8結(jié)合分子。也可以使用包含GITR或 GITR的免疫原性片段或GITR的抗獨(dú)特型結(jié)合分子的較長(zhǎng)多肽。(參見(jiàn)，例 如Harlow &Lane，同前，以引用方式并入本文)。這類免疫原可以得自天然 來(lái)源、經(jīng)過(guò)肽合成或重組表達(dá)。任選的，如下文所述免疫原可以與載體蛋 白融合或者以其它方式復(fù)合在一起來(lái)給予。任選的，所述免疫原可以與佐 劑一起給予。術(shù)語(yǔ)"佐劑"是指這樣一種化合物，當(dāng)與抗原聯(lián)合給予時(shí)，它 能增強(qiáng)對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)，但在單獨(dú)給予時(shí)不會(huì)引起對(duì)該抗原的免疫反 應(yīng)。佐劑可以通過(guò)幾種機(jī)制增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括召集淋巴細(xì)胞、刺激B和/ 或T細(xì)胞，以及刺激巨噬細(xì)胞。正如下文所述，有幾種類型的佐劑可以使 用。完全弗氏佐劑隨后用不完全弗氏佐劑是免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的優(yōu)選方法。通常用兔子或豚鼠來(lái)制備多克隆結(jié)合分子。示范性的制備用于例如被 動(dòng)保護(hù)的多克隆結(jié)合分子可以如下操作。將動(dòng)物用100嗎GITR,加上佐劑 接種，4-5個(gè)月時(shí)處以安樂(lè)死。收集血液，從其它血液成分中分離IgG。免 疫原的特異結(jié)合分子可以通過(guò)親和層析做部分純化。每只動(dòng)物平均可獲得 約0.5-1.0 mg的免疫原特異性結(jié)合分子，總共可達(dá)60-120 mg。通常使用小鼠來(lái)制備單克隆結(jié)合分子。針對(duì)某片段的單克隆的制備可 以通過(guò)將GITR的片段或較長(zhǎng)形式注射到小鼠中，制備雜交瘤并篩選雜交瘤 尋找特異結(jié)合GITR的結(jié)合分子。任選的，所篩選的結(jié)合分子能夠結(jié)合GITR 的具體區(qū)域或目標(biāo)片段，而不結(jié)合GITR的其它非重疊片段。后一項(xiàng)篩選可 以通過(guò)確定結(jié)合分子與GITR肽的一系列缺失突變體的結(jié)合情況，并確定哪 個(gè)突變體能夠與結(jié)合分子發(fā)生結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。評(píng)價(jià)結(jié)合可以通過(guò)例如Western 印跡或ELISA進(jìn)行。顯示出對(duì)結(jié)合分子的特異結(jié)合的最小片段界定了結(jié)合 分子的表位。替代的，可以通過(guò)竟?fàn)帣z定法，即待測(cè)和參照結(jié)合分子竟?fàn)?結(jié)合GITR來(lái)確定表位特異性。如果待測(cè)和參照結(jié)合分子發(fā)生竟?fàn)?，則它們 結(jié)合相同的表位(或結(jié)合的表位足夠近)，因此與一個(gè)結(jié)合分子的結(jié)合干擾了 與另一個(gè)的結(jié)合。這類結(jié)合分子的優(yōu)選同種型是小鼠同種型IgG2a或其它 物種中的對(duì)等同種型。小鼠同種型IgG2a是人同種型IgGl的等同物。在另一實(shí)施方案中，編碼結(jié)合分子的DNA可以采用常規(guī)方法(例如，通 過(guò)使用能與編碼鼠結(jié)合分子重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)容 易地分離并測(cè)序。分離并亞克隆的雜交瘤細(xì)胞是優(yōu)選的這類DNA的來(lái)源。一經(jīng)分離，可以將所述DNA放入表達(dá)載體，然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到那些本來(lái)不會(huì)產(chǎn)生免疫球蛋白的原核或真核宿主細(xì)胞中，比如大腸桿菌細(xì)胞、猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠印巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞。更具體地說(shuō)，分離DNA (可以象本文描述的是合成DNA)可以象Newman等1995年1月25日提交 的美國(guó)專利5,658,570(該專利以參考文獻(xiàn)的方式并入本文)中描述的，用于克 隆恒定和可變區(qū)序列以便制備結(jié)合分子?；旧?，該專利闡述了從所選細(xì)胞 中提取RNA,轉(zhuǎn)化成cDNA，利用Ig特異性引物經(jīng)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。適用于 這一目的的引物在美國(guó)專利5,658,570中也有描述。可以相對(duì)大量地產(chǎn)生能表 達(dá)所需抗體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞以便保證結(jié)合分子的臨床和商業(yè)供應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明白，編碼結(jié)合分子或其片段(即抗原結(jié)合位點(diǎn))的 DNA還可以利用例如pd噬菌體或Fd噬粒技術(shù)來(lái)源于抗體噬菌體文庫(kù)。在 例如EP 368 684 Bl;美國(guó)專利5,969,108, Hoogenboom, H.R. and Chames. 2000. /簡(jiǎn)畫/. 7Wa_y 21:371; Nagy et al. 2002. 淑她d. 8:801; Huie et al. 2001.尸rac.淑.爿cad 園98:2682; Lui et al. 2002. ■/嵐脂. 315:1063 (這些文章均以參考文獻(xiàn)的方式并入本文)中舉出了示范性的方法。 多份出版物(例如，Marks et al.說(shuō).。/rec/wo/ogy 10:779-783 (1992))描述了通過(guò) 鏈改組、組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建大的噬菌體文庫(kù)的策略來(lái)產(chǎn)生高親和 性人結(jié)合分子。在另一實(shí)施方案中，可以用核糖體展示來(lái)代替噬菌體作為展 示平臺(tái)(參見(jiàn)，例^口HanesetaL 2000. Wa/.說(shuō)'otec/zw /. 18:1287; Wilson et al. 2001.尸rac. A^/. Jcad Sc/. OS^ 98:3750;或者Irving et al. 2001 / /mm柳o/. M"/zwfc 248:31)。還有一實(shí)施方案中，可以在細(xì)胞表面文庫(kù)中篩 選結(jié)合分子(Boder et al. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10701; Daugherty et al. 2000 J /mm柳o/. Me^ocfe 243:211)。這些程序提供了分離和 克隆單克隆結(jié)合分子的傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)的替代方法。本發(fā)明的其它實(shí)施方案還包含了在那些不能產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白的轉(zhuǎn) 基因動(dòng)物(例如，小鼠)中生產(chǎn)人或基本上是人的結(jié)合分子(參見(jiàn)，例如美國(guó) 專利6,075,181, 5,939,598， 5,591,669和5,589,369，每份專利都以參考文獻(xiàn)的 方式并入本文)。例如，已有人描述過(guò)在嵌合和種系突變小鼠中同型缺失抗 體重鏈連接區(qū)導(dǎo)致內(nèi)源抗體產(chǎn)生被完全抑制。將人免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn) 移到這樣的種系突變小鼠中會(huì)導(dǎo)致在用抗原進(jìn)行攻擊時(shí)產(chǎn)生人結(jié)合分子。 另外一種優(yōu)選的利用SCID小鼠產(chǎn)生人結(jié)合分子的手段在美國(guó)專利5,811,524中被公開(kāi)，該專利以參考文獻(xiàn)的方式并入本文。應(yīng)當(dāng)明白的是，與這些人結(jié)合分子相關(guān)聯(lián)的基因材料也可以象本文描述的那樣進(jìn)行分離和操作。產(chǎn)生重組結(jié)合分子的再一個(gè)高效方法在Newman,說(shuō)o^c/z"o/ogy, 10: 1455-1460 (1992)中有公開(kāi)。具體來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)技術(shù)導(dǎo)致產(chǎn)生了含有猴可變結(jié) 構(gòu)域和人恒定序列的靈長(zhǎng)源化結(jié)合分子。這篇參考文獻(xiàn)通過(guò)引用全文并入 本文。此外，這項(xiàng)技術(shù)在美國(guó)專利5,658,570、 5,693,780和5,756,096中也 有描述，這些專利均通過(guò)引用并入本文。在另一實(shí)施方案中，可以通過(guò)顯微操作來(lái)挑選淋巴細(xì)胞，并分離可變 基因。例如，可以從接種過(guò)的哺乳動(dòng)物中分離外周血單核細(xì)胞，體外培養(yǎng) 約7天。篩選培養(yǎng)物以得到滿足篩選標(biāo)準(zhǔn)的特異性IgG?？梢苑蛛x陽(yáng)性小孔 中的細(xì)胞。單個(gè)產(chǎn)生Ig的B細(xì)胞可以通過(guò)FACS來(lái)分離，或者通過(guò)在補(bǔ)體 介導(dǎo)的溶血斑試驗(yàn)中鑒定。產(chǎn)生Ig的B細(xì)胞可以顯微操作到試管中，利用 例如RT-PCR來(lái)擴(kuò)增VH和VL基因。可以將VH和VL基因克隆到抗體表 達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞(例如，真核或原核細(xì)胞)進(jìn)4亍表達(dá)。此外，用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的基因序列可以得自多種不同來(lái)源。例 如，象上文廣泛討論過(guò)的，許多人抗體基因可以公眾可獲取的保藏形式得 到。大量抗體和編碼抗體的基因的序列已被公開(kāi)，可以利用本領(lǐng)域認(rèn)可的 技術(shù)由這些序列來(lái)化學(xué)合成合適的抗體基因。與本發(fā)明這一方面相容的寡 核苷酸合成技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可以利用任何商品自動(dòng)化合 成儀來(lái)進(jìn)行。另外，編碼文中列出的幾類重鏈和輕鏈的DNA序列可以由商 業(yè)的DNA合成服務(wù)來(lái)獲得。然后，利用任何上述方法得到的基因材料可以 被改變或合成從而提供本發(fā)明的多肽。替代的，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)來(lái)挑選和培養(yǎng)抗體產(chǎn)生細(xì) 胞系。這類技術(shù)在許多實(shí)驗(yàn)手冊(cè)和一級(jí)出版物中都有描述。在這方面，適用 于本發(fā)明的才支術(shù)在Cwfrew/1尸廠otoco/i17www/w/ogy， Coligan et al., Eds.， Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991)中有描述，該文以參考文獻(xiàn)的方式全文(包括補(bǔ)充材料)并入本文。眾所周知的，可以從起始的雜交瘤中或者其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞中通過(guò)常規(guī)技 術(shù)來(lái)分離RNA,比如異硫氰酸胍提取和沉淀，隨后離心或?qū)游?。如果需要，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，比如在寡dT纖維素上進(jìn)行層析來(lái)從總RNA中分離 mRNA。合適的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。在一實(shí)施方案中，可以按照人們熟知的方法，利用逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚 合酶同時(shí)或分別制備編碼結(jié)合分子輕鏈和重鏈的cDNA?？梢栽谝压_(kāi)的重 鏈和輕鏈DNA和氨基酸序列的基礎(chǔ)上，利用共有恒定區(qū)引物或更特異的引 物進(jìn)行PCR。如上文討論過(guò)的，還可以利用PCR來(lái)分離編碼結(jié)合分子的輕 鏈和重鏈的DNA克隆。這種情況中，可以通過(guò)共有引物或大的同源性探針， 比如小鼠恒定區(qū)探針來(lái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選。DNA,通常是質(zhì)粒DNA可以用本領(lǐng)域已知的技術(shù)從細(xì)胞中分離，按照 前面提及的與重組DNA技術(shù)有關(guān)的文獻(xiàn)中詳細(xì)描述的標(biāo)準(zhǔn)、眾所周知技術(shù) 做限制酶切圖譜并測(cè)序。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明在分離或后續(xù)的分析過(guò)程中的 任何時(shí)候DNA都可以是合成的。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含抗體的抗原結(jié)合片段，或者 由抗體的抗原結(jié)合片段組成。術(shù)語(yǔ)"抗原結(jié)合片段"是指免疫球蛋白或抗體 中能夠結(jié)合抗原，或者與完整抗體(即，與它們所來(lái)源的完整抗體)竟?fàn)幗Y(jié)合 抗原(即，特異性結(jié)合)的多肽片段。用于本文，術(shù)語(yǔ)抗體分子的"片段"包 括抗體的抗原結(jié)合片段，例如，抗體輕鏈(VL)、抗體重鏈(VH)、單鏈抗 體(scFv)、 F(ab，)2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段，以及單結(jié)構(gòu)域抗體 片段(DAb)。這些片段可以通過(guò)例如對(duì)完整或全部抗體或抗體鏈進(jìn)行化學(xué)或 酶法處理，或者通過(guò)重組手段獲得。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是工程化的或者被修飾的抗體。 工程化形式的抗體包括，例如微型抗體(minibodies)、雙功能抗體、融合了 CH3分子的雙功能抗體、四價(jià)抗體、胞內(nèi)雙功能抗體(intradiabodies)(例如， Jendreyko et al. 2003. J. Biol. Chem. 278:47813)、雙特異性抗體、融合蛋 白(例如，抗體細(xì)胞因子融合蛋白)、或者雙特異性抗體。其它免疫球蛋白(Ig) 和它們的一些變體在例如美國(guó)專利4,745,055; EP 256,654; Faulkner et al.， Nature 298:286 (1982); EP 120,694; EP 125,023; Morrison, J. Immun. 123:793 (1979); Kohler et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980); Raso et al., Cancer Res. 41:2073 (1981); Morrison et al" Ann. Rev. Immunol. 2:239 (1984); Morrison, Science 229:1202 (1985); Morrison et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984); EP 255,694; EP 266,663;和WO 88/03559中有描述。重新組合的免疫球蛋白鏈也是已知的。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利4，444，878; WO 88/03565;和EP 68,763以及它們引用的參考文獻(xiàn)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的修飾抗體是微型抗體。微型抗體是由兩個(gè)多肽鏈構(gòu)成的二聚體分子，這兩個(gè)多肽鏈各自包含一個(gè)ScFv分子(包含一或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的單個(gè)多肽，例如VL結(jié)構(gòu)域借助柔性接頭連接著VH結(jié)構(gòu)域，后者經(jīng)連接肽融合CH3結(jié)構(gòu)域。ScFv分子可以構(gòu)建成VH-接頭-VL取向或者VL-接頭-VH取向。 將構(gòu)成抗原結(jié)合位點(diǎn)的VL和VH結(jié)構(gòu)域連接在一起的柔性鉸鏈優(yōu)選包含約10到50個(gè)氨基酸殘基。用于該用途的連接肽例子是(Gly4Ser)3 (SEQ IDNO: 17) (Huston et al. 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879)。其它連接肽是本領(lǐng)域已知的。制備單鏈抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，例如Hoetal. 1989. Gene 77:51; Bird et al. 1988 S".e廳242:423; Pantoliano et al. 1991.所oc/z麵勿 30:10117; Milenic et al. 1991. Ca臟r 7 e廳rc/z 51:6363; Takkinen et al. 1991. /V<9 /wg 4:837。微型抗體(minibody)可以利用本領(lǐng)域已知方法(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利 5,837,821或WO 94/09817A1),通過(guò)構(gòu)建ScFv組分并連接肽-CH3組分來(lái)制 備。這些組分可以作為限制酶切片段從分開(kāi)的質(zhì)粒中分離，然后連接并重 新克隆到合適的載體中。組裝是否正確可以通過(guò)限制酶切和DNA序列分析 來(lái)確認(rèn)。雙功能抗體與scFv分子類似，但通常有一個(gè)短的(少于10個(gè)，優(yōu)選1-5 個(gè))氨基酸殘基接頭將兩個(gè)V結(jié)構(gòu)域連在一起，因此同一多肽鏈的VL和 VH結(jié)構(gòu)域不能相互作用。相反的， 一個(gè)多肽鏈的VL和VH結(jié)構(gòu)域與第二 個(gè)多肽鏈的VH和VL結(jié)構(gòu)域(分別)相互作用(WO 02/02781)。在一實(shí)施方 案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是融合了至少一個(gè)重鏈部分的雙功能抗體。在優(yōu) 選實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是融合了 CH3結(jié)構(gòu)域的雙功能抗體。其它形式的修飾抗體也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)(例如，WO 02/02781 Al; 5,959,083; 6,476,198 Bl; US 2002/0103345 Al; WO 00/06605; Bym et al. 1990. Nature. 344:667-70; Chamow and Ashkenazi. 1996. Trends Biotechnol. 14:52)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含免疫球蛋白恒定區(qū)。本領(lǐng)域 已知恒定區(qū)介導(dǎo)著多種效應(yīng)子功能。例如，補(bǔ)體的Cl組分與結(jié)合分子發(fā)生 結(jié)合能夠激活補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體的活化對(duì)于細(xì)胞病原體的調(diào)理作用和裂解是 非常重要的。補(bǔ)體的活化還剌激炎癥反應(yīng)，也可能參與自身免疫超敏反應(yīng)。此外，結(jié)合分子借助Fc區(qū)與細(xì)胞結(jié)合，結(jié)合分子Fc區(qū)的Fc受體位點(diǎn)結(jié)合 細(xì)胞的Fc受體(FcR)。有許多對(duì)不同類型結(jié)合分子是特異的Fc受體，包括 IgG(y受體)、IgE(s受體)、IgA (a受體)和IgM O受體)。結(jié)合分子結(jié)合到 細(xì)胞表面的Fc受體上能夠引發(fā)多種重要的不同的生物反應(yīng)，包括包被結(jié)合 分子的顆粒的內(nèi)吞和破壞、免疫復(fù)合體的清除、包被結(jié)合分子的靶細(xì)胞被 殺傷細(xì)胞裂解(稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，或者ADCC)、釋放炎 癥介質(zhì)、胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)和控制免疫球蛋白的產(chǎn)生。在一實(shí)施方案中，利用IgG4結(jié)合分子的恒定區(qū)，該恒定區(qū)被認(rèn)為不能 消除靶細(xì)胞，或者通過(guò)利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)(例如，美國(guó)專利5,585,097) 將Fc區(qū)中效應(yīng)子功能的關(guān)鍵殘基突變來(lái)制備Fc變體，可以除去或降低效 應(yīng)子功能。例如，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域缺失或滅活(通過(guò)點(diǎn)突變或其它手段實(shí)現(xiàn))， 可以減弱Fc受體與循環(huán)的修飾結(jié)合分子的結(jié)合，從而提高對(duì)腫瘤的定位。 其它情況中，可以是與本發(fā)明一致的恒定區(qū)修飾能夠調(diào)節(jié)補(bǔ)體結(jié)合，因此 降低血清半壽期以及與偶聯(lián)的細(xì)胞毒素的非特異性關(guān)聯(lián)(association)。還可 以利用其它恒定區(qū)的修飾來(lái)修飾二硫鍵或寡糖部分，從而因?yàn)榭乖禺愋?或結(jié)合分子柔性提高而使得定位增強(qiáng)。概括來(lái)說(shuō)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明白 按照本文描述修飾的結(jié)合分子可以發(fā)揮多種微妙的效果，而這些作用可能 很容易或者不容易認(rèn)識(shí)到。但是，這些修飾最后產(chǎn)生的生理變化譜、生物 可利用性和其它生化效果，比如腫瘤定位能力、生物分布和血清半壽期可 以利用公知的免疫學(xué)技術(shù)，不需過(guò)多實(shí)驗(yàn)就容易地測(cè)量和定量。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子可以衍生或者連接上另一個(gè)功能 分子(例如，另一個(gè)肽或蛋白質(zhì))。相應(yīng)的，本發(fā)明的結(jié)合分子包括文中描 述的抗GITR結(jié)合分子的衍生和其它修飾形式，包括免疫粘附分子。例如， 本發(fā)明的結(jié)合分子可以功能性地連接(通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價(jià)關(guān) 聯(lián)或其它方式)上一或多個(gè)其它分子實(shí)體，比如另一個(gè)結(jié)合分子(例如，雙特 異性抗體或雙功能抗體)、可檢測(cè)試劑、細(xì)胞毒性劑、藥劑，和/或能夠介導(dǎo)該結(jié)合分子與另一分子的聯(lián)系的蛋白或肽(比如鏈霉親和素核心區(qū)或多組 氨酸標(biāo)記)。一類衍生化結(jié)合分子是通過(guò)兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合分子(相同類型或不同類 型，例如為了產(chǎn)生雙特異性抗體時(shí))的交聯(lián)產(chǎn)生的。合適的交聯(lián)物包括異種 雙功能的，即有兩個(gè)由適宜的間隔臂分開(kāi)的不同的反應(yīng)基團(tuán)(例如，間-馬來(lái)酰亞氨苯曱基-N-羥基琥珀酰亞氨酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester));或者是同種雙功能的(例如，辛二酸二琥珀酰亞 氛酯(disuccinimidyl suberate))。 這些"f禺4關(guān)齊寸在Pierce Chemical Company, Rockford, IL有售。本發(fā)明的結(jié)合分子可以衍生而具有有用的可檢測(cè)試劑，包括熒光化合 物。示范性的熒光可檢測(cè)試劑包括熒光素、異硫氰酸酯焚光素、羅丹明(rhodamine)、丹磺酰氯(5-dimethylamine-l-napthalenesulfonyl chloride)、 藻紅 蛋白(phycoerythrin)等。結(jié)合分子還可以衍生有可檢測(cè)的酶，比如堿性磷脂 酶、辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶等。結(jié)合分子衍生有可檢測(cè)酶時(shí)，可 以通過(guò)加入其它該酶與之產(chǎn)生可檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的試劑來(lái)檢測(cè)。例如，當(dāng)存 在可檢測(cè)試劑辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，加入過(guò)氧化氫和二氨基聯(lián)苯胺會(huì)產(chǎn)生有 色的反應(yīng)產(chǎn)物，就可以檢測(cè)到了。結(jié)合分子還可以衍生有生物素，通過(guò)間 接測(cè)量抗生物素蛋白或者鏈霉親和素結(jié)合來(lái)檢測(cè)。IV.表達(dá)結(jié)合分子本發(fā)明的結(jié)合分子可以通過(guò)在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)免疫球蛋白輕鏈和 重鏈來(lái)制備。為了重組表達(dá)結(jié)合分子，用一或多個(gè)帶有編碼結(jié)合分子之免 疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA片段的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使得輕鏈 和重鏈在宿主細(xì)胞中被表達(dá)，并且優(yōu)選分泌到生長(zhǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中， 從該培養(yǎng)基中就可以回收結(jié)合分子。利用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)，比如 Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Afo/ecw/ar C7om'wg,.爿JLa60ra 07 Ma wfl/: Secowd ￡淑叫Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel， F.M. a/, (eds.) Cw/reW /V0toc0/5 z'm Mo/ecw/ar _6/o/ogy， Greene Publishing Associates, (1989) 以及Boss等的美國(guó)專利4,816,397中描述的技術(shù)來(lái)獲取抗體重鏈和輕鏈基 因，將這些基因?qū)胫亟M表達(dá)載體，后者引入宿主細(xì)胞。為了表達(dá)本發(fā)明的結(jié)合分子，可以將編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈和重鏈的 DNA插入表達(dá)載體，使基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列可操縱地連接在一起。 在這里的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)"可操縱地連接"表示所述結(jié)合分子基因被連接到載 體中，從而載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列能夠發(fā)揮它們計(jì)劃中調(diào)節(jié)結(jié)合分 子基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能。在一實(shí)施方案中，選擇的表達(dá)載體和表達(dá)調(diào) 控序列與所用表達(dá)宿主細(xì)胞相容。結(jié)合分子輕鏈基因和結(jié)合分子重鏈基因 可以插入分開(kāi)的載體中，更常見(jiàn)的，是將兩個(gè)基因插入同一個(gè)表達(dá)載體中。 可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，將結(jié)合分子基因片段和載體上的互補(bǔ)限制酶切位 點(diǎn)連接起來(lái)，或者如果沒(méi)有限制酶切位點(diǎn)時(shí)，進(jìn)行平末端連接)將結(jié)合分子 基因插入表達(dá)載體。在插入結(jié)合分子輕鏈或重鏈序列前，表達(dá)載體可能已經(jīng)攜帶了結(jié)合分子的恒定區(qū)序列。例如，將VH和VL序列轉(zhuǎn)換成全長(zhǎng)結(jié)合 分子基因的一個(gè)策略是將它們插入已經(jīng)能夠分別編碼重鏈和輕鏈恒定區(qū)的 表達(dá)載體中，使得載體中VH片段與CH片段可操縱地連接，VL片段與CL 片段可操縱地連接。此外或者替代的，重組表達(dá)載體可以編碼能夠協(xié)助結(jié) 合分子鏈從宿主細(xì)胞中分泌出來(lái)的信號(hào)肽?？梢詫⒔Y(jié)合分子鏈基因克隆到 載體中，使得信號(hào)肽與結(jié)合分子鏈基因的氨基末端符合讀框地連在一起。 所述信號(hào)肽可以是免疫球蛋白信號(hào)肽或者異源信號(hào)肽(即，來(lái)自非免疫球蛋 白的信號(hào)肽)。除了結(jié)合分子鏈基因，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還帶有能夠控制結(jié)合分 子鏈基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的調(diào)控序列。術(shù)語(yǔ)"調(diào)控系列"包括啟動(dòng)子、 增強(qiáng)子和其它控制結(jié)合分子鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的表達(dá)調(diào)控元件(例如，多 聚腺苷化信號(hào))。這類調(diào)控序列在例如Goeddel;五xp,'e^^o" rec/wo/ogy: Me^7ods1 z'w五/ zjwo/ogy 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)中有描述。 本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，設(shè)計(jì)表達(dá)載體，包括選擇調(diào)控序列可能要取決于這 樣一些因素，比如可供選擇的用于轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，目的蛋白的表達(dá)水平 等。優(yōu)選的用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的調(diào)控序列包括指導(dǎo)蛋白質(zhì)在哺乳 動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)的病毒元件，比如來(lái)源于巨細(xì)胞病毒(CMV)的啟動(dòng)子 和/或增強(qiáng)子(比如CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)、猴病毒40 (SV40)(比如SV40啟 動(dòng)子/增強(qiáng)子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP)和多瘤病毒。 關(guān)于病毒調(diào)控元件及其序列的進(jìn)一步描述，參見(jiàn)例如Stinski的美國(guó)專利5,168,062、 Bell等的美國(guó)專利4,510,245以及Schaffner等的美國(guó)專利 4,968,615。除了結(jié)合分子鏈基因和調(diào)控系列，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以帶有其 它序列，比如能夠調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中的復(fù)制的序列(例如復(fù)制原點(diǎn))和可 選擇的標(biāo)記基因?？蛇x擇標(biāo)記基因能夠協(xié)助挑選出那些載體導(dǎo)入了的宿主 細(xì)胞(參見(jiàn)例如美國(guó)專利4，399，216、4,634，665和5,179,017,都是Axel等的)。 例如，通常可選擇標(biāo)記基因使導(dǎo)入了載體的宿主細(xì)胞對(duì)藥物(比如G418、潮 霉素或曱氨蝶呤)產(chǎn)生抗性。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶 (DHFR)基因(用于dhfr宿主細(xì)胞，用曱氨蝶呤進(jìn)行選擇/擴(kuò)增)和weo基因 (用G418進(jìn)行挑選)。為了表達(dá)輕鏈和重鏈，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼結(jié)合分子重鏈和輕鏈的表 達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)染"的各種形式意在涵蓋多種常用于將外源DNA導(dǎo)入原核或真核宿主細(xì)胞的技術(shù)，例如電穿孔、磷酸4丐沉淀、 DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等等。本發(fā)明結(jié)合分子可以在原核或真核宿主細(xì)胞中表 達(dá)，最優(yōu)選在真核細(xì)胞(最優(yōu)選是哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞)中表達(dá)結(jié)合分子，因?yàn)?這類真核細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，比原核細(xì)胞更能組裝和分泌出正確 折疊的、具有免疫活性的結(jié)合分子。通常，表達(dá)載體含有選擇標(biāo)記(例如，氨千抗性、潮霉素抗性、四環(huán)素 抗性或新霉素抗性)以便能夠檢測(cè)到轉(zhuǎn)化了所需DNA序列的細(xì)胞(參見(jiàn)，例 如Itakura等，美國(guó)專利4,704,362)。大腸桿菌是一個(gè)尤其有用的克隆發(fā)明所述多核苷酸(例如，DNA序列) 的原核宿主。其它適用的微生物宿主包括芽孢桿菌(比如枯草芽孢桿菌)，和 其它腸桿菌科，比如沙門氏菌、沙雷氏菌和各種^_單胞菌。在這些原核宿 主中，也可以制備表達(dá)載體，它們通常含有與宿主細(xì)胞相容的表達(dá)調(diào)控序 列(例如，復(fù)制起點(diǎn))。此外，可以有任何數(shù)量的眾所周知的啟動(dòng)子，比如 乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、(3-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子系統(tǒng)或者來(lái)自 X噬菌體的啟動(dòng)子系統(tǒng)。啟動(dòng)子一般會(huì)控制表達(dá)的進(jìn)行，任選用搡縱子序列 進(jìn)行控制、并具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列等用于啟始和結(jié)束轉(zhuǎn)錄和翻譯。其它微生物，比如酵母菌也可以用于表達(dá)。糖酵母(Sacc/raTOw;/c")是優(yōu) 選的酵母宿主，它具有按照需要攜帶表達(dá)調(diào)控序列(例如，啟動(dòng)子)、復(fù)制起 點(diǎn)、終止序列等的合適載體。典型的啟動(dòng)子包括3-磷酸甘油酸激酶和其它糖酵解酶。誘導(dǎo)性酵母啟動(dòng)子包括來(lái)自乙醇脫氫酶、異細(xì)胞色素C、和負(fù)責(zé) 麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子等。除了微生物，哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)物也可以用于表達(dá)和產(chǎn)生本發(fā)明的多肽(例如，編碼結(jié)合分子的多肽)。參見(jiàn)Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)。實(shí)際上優(yōu)選的是真核細(xì)胞，因?yàn)楸绢I(lǐng)域 已建立了大量能夠分泌異源蛋白(例如，完整結(jié)合分子)的合適宿主細(xì)胞系， 包括CHO細(xì)胞系、各種Cos細(xì)胞系、HeLa細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞系、或轉(zhuǎn)化 的B細(xì)胞或雜交瘤。優(yōu)選的，所述細(xì)胞不是人細(xì)胞。用于這些細(xì)胞的表達(dá) 載體可以包括表達(dá)控制序列，比如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(Queene/fl/.， 力w簡(jiǎn)/w/. i ev. 89:49 (1986)),以及必要的加工信息位點(diǎn)，比如核糖體結(jié)合位 點(diǎn)、RNA剪切位點(diǎn)、多聚腺苷化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選的表達(dá)調(diào)控序 列是來(lái)源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細(xì)胞病毒 等的啟動(dòng)子。參見(jiàn)Co /mmww/. 148:1149(1992)。替代的，編碼結(jié)合分子的序列可以并入轉(zhuǎn)基因，用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 的基因組，隨后表達(dá)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的奶中(參見(jiàn)，例如Deboer "/.， US 5,741，957, Rosen, US 5,304,489和Meade " a/., US 5,849,992)。合適的轉(zhuǎn)基因 包括輕鏈和/或重鏈的編碼序列與來(lái)自哺乳動(dòng)物腺體特異性基因(比如酪蛋 白或(3-乳球蛋白)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子可操縱地連在一起。優(yōu)選用于表達(dá)發(fā)明所述重組結(jié)合分子的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括中國(guó)倉(cāng) 鼠卵巢(CHO纟田月包)(包括Urlaub and Chasin, (1980)尸roc. jVa". Jcad 5W. OS^ 77:4216-4220所述dhfr- CHO細(xì)胞，與DHFR選擇標(biāo)記一起使用，例如R丄 Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mo/. B/o/. 159:601-621所述)、NSO骨髓瘤細(xì) 胞、COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。當(dāng)編碼結(jié)合分子基因的重組表達(dá)栽體導(dǎo)入哺乳 動(dòng)物宿主細(xì)胞時(shí)，通過(guò)將宿主細(xì)胞培養(yǎng)足夠時(shí)間使得宿主細(xì)胞表達(dá)所述結(jié) 合分子，或更優(yōu)選，使結(jié)合分子分泌到宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，產(chǎn)生結(jié) 合分子。利用常規(guī)蛋白質(zhì)純化方法可以從培養(yǎng)基中回收結(jié)合分子。含有目標(biāo)多核苷酸序列(例如，結(jié)合分子重鏈和輕鏈編碼序列和表達(dá)調(diào) 控序列)的載體可以通過(guò)公知方法轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，具體方法取決于宿主 細(xì)胞的類型。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)染通常用于原核細(xì)胞，而磷酸鈣處理、電穿 孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、基因槍技術(shù)或基于病毒的轉(zhuǎn)染可以用于其它宿主細(xì)胞(可以總體參見(jiàn)Sambrookfl/" ^Mo/ecw/a " C7om力g:爿<36ora/or_y (ColdSpring Harbor Press, 2nd ed., 1989)(以參考文獻(xiàn)方式全部并入本文)。其它用 于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法包括polybrene的使用、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)體、 電穿孔和顯微注射(總體參見(jiàn)Sambrook"a/.,同前)。為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物， 可以將轉(zhuǎn)基因顯微注射到受精的卵母細(xì)胞中，或者整合到胚胎干細(xì)胞基因 組中，這些細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到去核的卵母細(xì)胞中。
當(dāng)重鏈和輕鏈被克隆到分開(kāi)的表達(dá)載體中時(shí)，將載體共轉(zhuǎn)染以便表達(dá) 和組裝完整免疫球蛋白。 一旦表達(dá)后，整個(gè)結(jié)合分子、其二聚體、單個(gè)的 輕鏈和重鏈或者本發(fā)明的其它免疫球蛋白形式可以按本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法純 化，所述方法包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、HPLC纟屯化、凝膠電泳等 (可總體參見(jiàn)Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag， N.Y.， (1982))。用于 醫(yī)藥用途時(shí)，優(yōu)選至少約90-95%均質(zhì)的基本上純的結(jié)合分子，最優(yōu)選 98-99%或以上均質(zhì)的結(jié)合分子。
宿主細(xì)胞也可以用于產(chǎn)生完整結(jié)合分子的部分，比如Fab片段或scFv 分子。應(yīng)當(dāng)理解，以上方法的各種變化也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可能 希望用編碼本發(fā)明結(jié)合分子的輕鏈或重鏈(不是兩者同時(shí))的DNA轉(zhuǎn)染宿主 細(xì)胞。還可以利用重組DNA技術(shù)除去編碼那些對(duì)于結(jié)合GITR不是必需的 輕《連或重鏈或者兩者的DNA的部分或全部。由這樣截?cái)嗟腄NA分子表達(dá) 的分子也包含在本發(fā)明的結(jié)合分子范圍內(nèi)。此外，可以利用常規(guī)的化學(xué)交 聯(lián)方法，通過(guò)將本發(fā)明的結(jié)合分子與第二個(gè)結(jié)合分子交聯(lián)，制得雙功能結(jié) 合分子，使其中的一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈?zhǔn)潜景l(fā)明結(jié)合分子，另一個(gè)重鏈和 輕鏈?zhǔn)翘禺愑诔?GITR以外的抗原。
如上述，本發(fā)明另一方面涉及可用來(lái)重組表達(dá)本發(fā)明結(jié)合分子的核酸、 載體和宿主細(xì)胞組合物。編碼6C8輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列見(jiàn)圖18和SEQ ID NO:IO。 VL的CDR1結(jié)構(gòu)域涵蓋SEQ ID NO:IO的核苷酸130-162 (SEQ ID NO:14)， CDR2結(jié)構(gòu)域涵蓋SEQ ID NO:10中的核苦酸208-228 (SEQ ID NO: 15), CDR3結(jié)構(gòu)域涵蓋SEQ ID NO: 10的核苷酸325-351 (SEQ ID NO:16)。編碼6C8重鏈可變區(qū)的核苷酸序列見(jiàn)圖18和SEQIDNO: 9。 VH 的CDR1結(jié)構(gòu)域涵蓋SEQ IDNO:9的核香酸133-168 (SEQ ID NO:ll),CDR2 結(jié)構(gòu)域涵蓋SEQIDNO:9中的核香酸211-258 (SEQ ID NO:12), CDR3結(jié)構(gòu) 域涵蓋SEQ ID NO:9中的核苦酸355-381 (SEQ ID NO:13)。在一實(shí)施方案中， 編碼VH CDR2的核香酸序列包含SEQ ID NO:12。在另一實(shí)施方案中，編碼VH CDR2的核苷酸序列包含SEQ ID NO:65 (CACATTTGGTGGGATGAT GATAAGTACTATCAACCATCCCTGAAGAGC)。本領(lǐng)域4支術(shù)人員明白，利
得到編碼與6C8相關(guān)的結(jié)合分子的核苷酸序列。
在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼多肽序列的分離的核酸分子，所 述多肽序列包含6C8 CDR，例如包含選自SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQIDNO:19、 SEQIDNO:5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO:
8的氨基酸序列。
另 一 實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼結(jié)合分子輕鏈可變區(qū)的分離的核 酸分子，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，但是本領(lǐng)域技 術(shù)人員明白，因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性，其它核酸分子也可以編碼SEQ ID NO:2的氨基酸序列。所述核酸分子可以是僅編碼VL或者也可以編碼與VL 可操縱性連接的結(jié)合分子輕鏈恒定區(qū)。在一實(shí)施方案中，該核酸分子在重 組表達(dá)載體中。
另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼結(jié)合分子重鏈可變區(qū)的分離的核 酸分子，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:l的氨基酸序列，但是本領(lǐng)域技 術(shù)人員明白，因?yàn)檫z傳密碼的筒并性，其它核酸分子也可以編碼SEQ ID NO:l的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼結(jié)合分子重鏈 可變區(qū)的分離的核酸分子，所述可變區(qū)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列， 但是本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性，其它核酸分子也可以 編碼SEQ ID NO:66的氨基酸序列。所述核酸分子可以是僅編碼VH或者也 可以編碼與VH可操縱性連接的重鏈恒定區(qū)。在一實(shí)施方案中，該核酸分子 在重組表達(dá)載體中。
本發(fā)明還提供了編碼結(jié)合分子重鏈和/或結(jié)合分子輕鏈的重組表達(dá)載 體。例如，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的重組表達(dá)載體編碼
a) 結(jié)合分子輕鏈，該輕鏈含有的可變區(qū)包含SEQIDNO:2的氨基酸序 列；和
b) 結(jié)合分子重鏈，該重鏈含有的可變區(qū)包含SEQIDNO:l的氨基酸序列。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的重組表達(dá)載體編碼a) 結(jié)合分子輕鏈，該輕鏈含有的可變區(qū)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序 列；和b) 結(jié)合分子重鏈，該重鏈含有的可變區(qū)包含SEQIDNO:66的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了導(dǎo)入了本發(fā)明的一或多個(gè)重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。 優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。再進(jìn)一步，本發(fā)明提供了合成發(fā)明所述重組結(jié)合分子的方法，即將發(fā) 明所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中直至合成發(fā)明所述重組結(jié)合分子。 該方法還可以還包含從培養(yǎng)基中分離重組結(jié)合分子。F.本發(fā)明結(jié)合分子的用途考慮到它們結(jié)合GITR的能力，本發(fā)明的結(jié)合分子可以用于常規(guī)免疫檢 測(cè)法，比如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射免疫檢測(cè)(RIA)或組織免疫組織化 學(xué)檢測(cè)法來(lái)探測(cè)GITR(例如，在象血清或血漿這樣的生物樣品中)。本發(fā)明 提供了檢測(cè)生物樣品中的hGITR的方法，該方法包括將生物樣品與本發(fā)明 結(jié)合分子進(jìn)行接觸，通過(guò)探測(cè)結(jié)合了 hGITR的結(jié)合分子或者未結(jié)合的結(jié)合 分子，從而檢測(cè)生物樣品中的hGITR。所述方法可以體外或體內(nèi)進(jìn)行。將 結(jié)合分子直接或間接標(biāo)記上可檢測(cè)物質(zhì)以協(xié)助探測(cè)到結(jié)合或未結(jié)合的結(jié)合 分子。合適的可檢測(cè)物質(zhì)包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光物質(zhì)和放射 性物質(zhì)。合適的酶的例子包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷脂酶、P-半乳糖苷酶 或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基的例子包括鏈霉親和素/生物素和抗生物素蛋 白/生物素；合適的熒光物質(zhì)的例子包括傘形酮(umbelliferone)、熒光素、異 硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三吖溱胺(dichlorotriazinylamine)熒光素、丹磺 酰氯(dansyl chloride)或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的一個(gè)例子是魯米諾(luminal); 以及合適的放射性物質(zhì)的例子包括1251、 1311、 35S或3H。作為標(biāo)記結(jié)合分子的替代，可以利用標(biāo)記了可檢測(cè)物質(zhì)的GITR標(biāo)準(zhǔn) 和未標(biāo)記的抗hGITR結(jié)合分子，通過(guò)竟?fàn)幟庖叻治龇▉?lái)檢測(cè)生物樣液中的 hGITR。在這種分析法中，將生物樣品、標(biāo)記的GITR標(biāo)準(zhǔn)和抗hGITR結(jié)合 分子組合起來(lái)，確定結(jié)合到未標(biāo)記結(jié)合分子上的標(biāo)記GITR標(biāo)準(zhǔn)品的量。生 物樣品中的hGITR的量與結(jié)合到抗hGITR結(jié)合分子上的標(biāo)記GITR標(biāo)準(zhǔn)品 的量成反比。本發(fā)明的抗GITR結(jié)合分子還可以用于^r測(cè)除人以外的物種的樣品中 的GITR，特別是靈長(zhǎng)類(例如，黑猩猩(chimpanzee)、狒狒(baboon)、指猴 (marmoset)、食蟹猴(cynomolgus)和獼猴(rhesus))的GITR。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種消除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)T效應(yīng)細(xì) 胞的抑制作用的方法。消除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)T效應(yīng)細(xì)胞的抑制作用可以通 過(guò)例如測(cè)量在有效應(yīng)性T細(xì)胞的情況下，所述結(jié)合分子增強(qiáng)T細(xì)胞效應(yīng)子 功能的能力來(lái)^f會(huì)測(cè)。例如通過(guò)測(cè)量3H-胸香摻入或者FACS來(lái)分析細(xì)胞因子 的產(chǎn)生(例如，IL-2產(chǎn)量)或者細(xì)胞增殖(例如，輔助T性細(xì)胞的增殖)。例如 在有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的情況下，T效應(yīng)細(xì)胞的反應(yīng)或活性低，但是加入GITR 結(jié)合分子后即使有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，它們也會(huì)升高，即GITR結(jié)合分子抵消 了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)T效應(yīng)細(xì)胞的抑制作用。本發(fā)明的結(jié)合分子還可以用于減弱I-kB在細(xì)胞中的降解。例如，可以 用抗GITR結(jié)合分子處理細(xì)胞，進(jìn)行Western印跡，并定量I-kB,從而檢測(cè) 細(xì)胞中I-kB降解的減弱情況。許多疾病或病理狀況會(huì)受益于T效應(yīng)細(xì)胞活性的增強(qiáng)以及/或者調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞活性的下調(diào)，例如通過(guò)抵消調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)T效應(yīng)細(xì)胞的抑制作用。 例如，免疫效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)常不能有效地與癌癥細(xì)胞反應(yīng)。相應(yīng)的，當(dāng)需要增 強(qiáng)的效應(yīng)T細(xì)胞或抗體反應(yīng)時(shí)，本發(fā)明的方法可以用于處置患有這類紊亂 的受試者。在一實(shí)施方案中，這類方法包含將本發(fā)明的結(jié)合分子給予受試 者，從而使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)T效應(yīng)細(xì)胞的抑制作用被消除，因此增強(qiáng)了免 疫反應(yīng)。優(yōu)選的，所述受試者是人受試對(duì)象。替代的，所述受試對(duì)象可以 是能表達(dá)與本發(fā)明的結(jié)合分子發(fā)生交叉反應(yīng)的GITR的哺乳動(dòng)物。更進(jìn)一 步，所述受試者可以是導(dǎo)入了 GITR(例如，通過(guò)給予GITR或者通過(guò)表達(dá) GITR轉(zhuǎn)基因)的哺乳動(dòng)物?？梢詾榱酥委熁蝾A(yù)防目的，將本發(fā)明的結(jié)合分子 給予人受試對(duì)象。例如，所述受試者可能被診斷患有疾病或紊亂，或者易 患該病或?qū)υ摬∫赘小４送?，可以將本發(fā)明的結(jié)合分子給予表達(dá)與所述結(jié) 合分子交叉反應(yīng)的GITR分子的非人哺乳動(dòng)物(例如，靈長(zhǎng)類動(dòng)物)，以實(shí)現(xiàn) 獸醫(yī)目的或者作為人疾病的動(dòng)物模型。就后一個(gè)目的而言，這樣的動(dòng)物模 型可以用來(lái)評(píng)價(jià)本發(fā)明結(jié)合分子的治療和/或預(yù)防效果(例如，評(píng)估劑量以 及/或者給藥療程)。
本發(fā)明的結(jié)合分子的示范性用途在下面有更詳細(xì)的討論免疫刺激組合物正如在下文附上的實(shí)施例中描述的，本發(fā)明的結(jié)合分子可以例如與抗 原組合，作為免疫刺激組合物(或疫苗)來(lái)提高受試者對(duì)靶抗原(例如蛋白質(zhì) 抗原)的免疫反應(yīng)。這就是說(shuō)，本發(fā)明的結(jié)合分子可以作為增強(qiáng)免疫反應(yīng)的 佐劑。例如，為了刺激對(duì)靶抗原的抗體或細(xì)胞免疫反應(yīng)(例如，為了接種的 目的)，可以將所述抗原與本發(fā)明的結(jié)合分子一起給藥(例如，同時(shí)在相同或 分開(kāi)的組合物中給藥)從而發(fā)生增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。目標(biāo)抗原和結(jié)合分子可以 配制成同一個(gè)藥物組合物，或者分開(kāi)的組合物。在一實(shí)施方案中，目標(biāo)抗 原和結(jié)合分子被同時(shí)給予受試者。替代的，在一些情況中，可能希望先給 予抗原，然后給予結(jié)合分子，或者相反(例如，可能先單獨(dú)給予抗原來(lái)引起 反應(yīng)，然后將結(jié)合分子單獨(dú)或與抗原一起給予是有益的)。在優(yōu)選實(shí)施方案 中，本發(fā)明的GITR結(jié)合分子在用抗原進(jìn)行致敏時(shí)，即在第一次給予抗原時(shí)給予。例如，第-3、 -2、 -1、 0、 +1、 +2、 +3天。特別優(yōu)選的給予發(fā)明所 述GITR結(jié)合分子的一天是給予抗原前的一天。目標(biāo)抗原是，例如這樣的抗原，其能夠給受試者提供針對(duì)該抗原所來(lái) 源的傳染源的攻擊的保護(hù)，或者能夠以有益于受試者的方式影響腫瘤生長(zhǎng) 和轉(zhuǎn)移。因此目標(biāo)抗原的示范性例子包括那些來(lái)源于傳染源、癌癥細(xì)胞等 的抗原，此時(shí)針對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)能夠預(yù)防或治療由該來(lái)源引起的疾病。 這類抗原包括，但不限于，病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲(chóng)蛋白質(zhì)、糖蛋白、 脂蛋白、糖脂等等。目標(biāo)抗原還包括那些能給有危險(xiǎn)染上或者已被診斷患 有腫瘤的受試者帶來(lái)好處的抗原，可能包括例如腫瘤細(xì)胞專門表達(dá)的或者 在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平提高的胂瘤相關(guān)抗原。所述受試者優(yōu)選是哺乳動(dòng)物， 最優(yōu)選是人。用于本文，術(shù)語(yǔ)"病原菌，，或"病原體"包括能感染或寄生正常宿主(例如， 動(dòng)物C比如哺乳動(dòng)物，優(yōu)選靈長(zhǎng)類，例如人))的微生物。用于本文，該術(shù)語(yǔ) 還包括機(jī)會(huì)性病原體，例如能夠感染或寄生異常宿主的微生物，例如因?yàn)?治療方案導(dǎo)致正常菌群被打亂的宿主，或者是免疫缺陷的宿主。用于本文， 該術(shù)語(yǔ)還包括其復(fù)制在受試者中是不受歡迎的微生物，或者這些微生物產(chǎn) 生的毒性分子(例如，毒素)。病毒抗原的非限制性例子，包括但不限于，流感病毒的核蛋白(NP)和fflV的Gag蛋白質(zhì)。其它異源抗原包括，但不限于HIV Env蛋白或其組成 部分gpl20和gp41、 HIVNef蛋白、和HIVPol蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶。 此外，還可以使用其它病毒抗原比如埃博拉病毒(EBOV)抗原，EBOVNP或 糖蛋白(GP)(全長(zhǎng)或者該分子的粘蛋白區(qū)GP缺失(Yang Z-Y, W a/. (2000) WW Med 6:886-9, 2000));天花抗原；曱肝、乙肝或丙肝病毒；人鼻病毒， 比如2型和14型；單純皰滲病毒；2型或3型脊髓灰質(zhì)炎病毒；口蹄疫病 毒(FMDV);狂犬病病毒；輪狀病毒；流感病毒；柯薩奇病毒；人乳頭瘤病 毒人(HPV)，例如16型乳頭瘤病毒、其E7蛋白，以及含有E7蛋白或其表 位的片段；以及猴免疫缺陷病毒(SIV)。目標(biāo)抗原不需要限制為病毒來(lái)源的 抗原。寄生蟲(chóng)抗原，例如癡原蟲(chóng)抗原也包4舌在內(nèi)，以及真菌抗原、細(xì)菌抗 原和肺瘤抗原也可以用于本文公開(kāi)的組合物和方法中。細(xì)菌抗原的非限制 性例子包括百日咳桿菌(5orafete//apeW^^)(例如，P69蛋白和絲狀血凝素 (FHA)抗原)、霍亂弧菌、炭疽芽孢桿菌0^c77/w朋/2racz》和大腸桿菌抗原， 比如大腸桿菌不耐熱毒素B亞基(LT-B)、大腸桿菌K88抗原和腸毒素性大 腸4干菌抗原。其它抗原的例子包括曼氏血吸蟲(chóng)(5W7&to owa mawom') P28谷 胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶抗原(P28抗原)和吸蟲(chóng)(fluke)、支原體(mycoplasma)、線蟲(chóng) (roundworm)、 緣蟲(chóng)(tapeworm)、 沙眼衣原體(C7z/awy必a加c/2oma叫禾口癥疾 寄生蟲(chóng)(malaria parasite), 例如癥原蟲(chóng)屬(plasmodium)或焦蟲(chóng)(babesia)的哥生 蟲(chóng)，例如惡性疰原蟲(chóng)0P/awwo&ww /a/")^ram)的抗原，以及決定上述抗原的 免疫源表位的肽?？梢酝ㄟ^(guò)給予本發(fā)明的疫苗來(lái)治療或預(yù)防的感染、疾病或紊亂包括任 何會(huì)引起宿主免疫反應(yīng)來(lái)防止的感染、疾病或紊亂?？梢酝ㄟ^(guò)給予本發(fā)明 的免疫刺激組合物來(lái)治療或預(yù)防的疾病、紊亂或感染包括，但不限于，任 何由真菌、寄生蟲(chóng)、病毒或細(xì)菌引起的或和它們有關(guān)的感染、疾病或紊亂， 由以下各種病原體引起的或和它們相關(guān)的疾病、紊亂或感染，包括用于生 物恐怖襲擊的、李斯特氏菌病、埃博拉病毒、SARS、天花、曱肝、乙肝、 丙肝或戊肝、人鼻病毒、HIV(例如，HIV-1和HIV-2)、以及AIDS、皰滲、 脊髓灰質(zhì)炎、口蹄疫、狂犬病、輪狀病毒、流感、柯薩奇病毒、人乳頭瘤 病毒、SIV、疰原蟲(chóng)、癌癥，例如腫瘤、人皰滲病毒、巨細(xì)胞病毒(特別是 人巨細(xì)胞病毒)、EB病毒、水痘-帶狀皰滲病毒、肝炎病毒(比如乙肝病毒、曱肝病毒、丙肝病毒)、副粘病毒呼吸道合胞病毒、副流感病毒、麻滲病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒(例如HPV6、 11、 16、 18等等)、黃病毒(例 如黃熱病病毒(Yellow Fever Virus)、登革病毒(Dengue Virus)、蜱傳腦炎病毒 (Tick-borne encephalitis virus)、曰本月S炎病毒(Japanese Encephalitis Virus))或 者流感病毒，例如曱型流感病毒(例如，血凝素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)亞型)、 乙型流感病毒和丙型流感病毒；以及由細(xì)菌生物，包括革蘭氏陽(yáng)性和革蘭 氏陰性細(xì)菌引起的相關(guān)的疾病或紊亂。例子包括，但不限于奈瑟氏球菌， 包括淋球菌(TV. go"orr/7efl)和腦膜炎奈瑟氏菌(7V. wem' g^fifa);鏈球菌，包括 肺炎鏈球菌(S. p"ewww /ae)、化膿性鏈球菌(S. / _yoge ")、無(wú)乳鏈球菌(S. (3ga/flc^ae)、 變形鏈3求菌(51. wwtora);嗜血菌物種(Z/(2emo;7/w7"j w/ ),包括乙 型流感嗜血菌(//. / /Zz^ zfle />^e 6)、非分型流感嗜血菌(杜克雷嗜血菌(//.血cr。/,');莫拉菌屬的一些種，包括卡他莫拉菌 (Af cato〃'/7a/z》)，又牙爾為爭(zhēng)占刀莫炎布蘭漢氏J求菌("/77w/M7we〃" c"to廠r/2a/z'力；十辱德-特氏菌，包括百曰咳桿菌、副百曰咳桿菌(及/ "ra; "/w"/》和支氣管腐敗桿 菌(5. 6ro"c/^印r/ca);分枝桿菌，包括結(jié)核分枝桿菌(M /Werc"/ow'力、牛分 枝桿菌OZ 6ov/力、麻風(fēng)桿菌(M /eprae)、鳥(niǎo)分枝桿菌(M av/"w)、副結(jié)核分 枝桿菌(Mp"ra/z^wra/on;y)、恥祐分枝桿菌(tW: swegma"s);軍團(tuán)菌屬，包括 嗜月申軍團(tuán)菌(丄.p"ew,wc^/w7;3);埃希氏菌，包括腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(e"&ratodc 五.co/z')、腸出血性大腸桿菌0w/ero/2emo/^agz'c co/z')、腸致病性大腸桿菌 0"fera; fl /2Ogew'c co/z〕；弧菌屬(Kz'6n'o)細(xì)菌，包括霍亂弧菌(F. c/w/era);志賀氏菌物種0%/^// ^ p)，包括宋氏志賀菌OS. 50WZ&)、痢疾志賀氏菌(S.4^Wer/ae)、弗氏志賀氏菌OS.^/fewen'/);耶爾森菌屬，包括小腸結(jié)腸炎耶爾 森菌(7. e/7to'oco/f"ca)、 鼠疫桿菌(J. 、假結(jié)核耶爾森菌(K戸ewcfo^^6rcw/ow'力；彎曲菌物種(Campy/o6a"er 包括空腸彎曲菌(C.y'e/'Mm:)和大腸彎曲菌(C. co/z');沙門菌屬，包括傷寒沙門菌CS.妙W)、副傷寒 沙門菌(S. para0/p/7/)、豬霍亂沙門氏菌(S. c/zo/eraesw/s)、腸炎沙門氏菌(S. e"fcrz力Vfo);李斯特菌屬，包括單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(丄.mo"ocytoge e5); 螺桿菌屬，包括幽門螺桿菌(//. ; _y/oW);假單胞菌屬，包括綠膿桿菌(尸. aen^'wwa);葡萄球菌屬，包括金黃色葡萄球菌(S. awew力、表皮葡萄球菌(S. 印We7，/cfo);腸球菌屬，包括糞腸球菌(五./aecato)、屎腸球菌(￡, /aec/w附); 梭菌屬，包括破傷風(fēng)梭菌(C.似am')、肉毒梭菌(C. k^//"wm)、艱難梭菌(C力，"7e);芽孢桿菌屬，包括炭疽芽孢桿菌；棒狀桿菌，包括白喉棒狀桿菌(C. ^ /2/Z2en'ae);疏螺旋體屬，包括布氏疏螺旋體(及Z)wrgdo;/w/)、嘎氏疏螺旋體 (及g"n'm7)、阿氏疏螺旋體(5. a/ze/")、 5. awfersom'z'，赫氏蜱疏螺旋體(5. Zzen7W");埃里希氏體屬，包括馬埃里希氏體(E巧w')和人埃里希氏體 (//謂朋GVa肌/oc,'c ￡/7,'//c/n.cw>);立克次氏體屬,包括立氏立克次氏體(兄 , 'cfeto/z');衣原體屬，包括沙眼衣原體(C. frac/2omato)、肺炎衣原體(C. pweMmom'ae)、鸚鵡熱衣原體(C. ;w/toc);鉤端螺旋體屬，包括問(wèn)號(hào)鉤端螺旋 體(丄.We/rog朋力；密螺旋體屬，包括蒼白密螺旋體(:T. pa///^m)、齒垢密螺 旋體(r. A""co/a)、豬痢疾密螺旋體(r. /y;o4^e^en'ae)。優(yōu)選的細(xì)菌包括， 但不限于，李斯特氏菌、分枝桿菌(例如結(jié)核分枝桿菌)、炭疽菌、沙門氏菌 和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、百日咳桿菌、霍亂弧菌、吸蟲(chóng)、衣原體、線 蟲(chóng)、絳蟲(chóng)、沙眼衣原體和癥疾寄生蟲(chóng)。用于本文，術(shù)語(yǔ)"細(xì)菌性感染"包括被各種細(xì)菌感染。在另一實(shí)施方案 中，可以從患者中移去T細(xì)胞，在體外與抗GITR結(jié)合分子接觸，任選同時(shí) 有活化信號(hào)(例如> 抗原加上APC或者多克隆抗體)并重新導(dǎo)入患者體內(nèi)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過(guò)抑制對(duì)自身免疫性疾病和癌癥的免疫反應(yīng)，在維持 自我免疫耐受性發(fā)明起到重要作用。相應(yīng)的，在一實(shí)施方案中，抵消調(diào)節(jié) 性T細(xì)胞對(duì)T效應(yīng)細(xì)胞的抑制作用將有利于增強(qiáng)癌癥中的免疫反應(yīng)。因此， 本發(fā)明的結(jié)合分子可以用于處置惡性肺瘤，抑制腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移。所述結(jié) 合分子可以系統(tǒng)地或局部地給予到腫瘤位點(diǎn)。在一實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)GITR功能可能用于誘導(dǎo)腫瘤免疫，即用于處置 患有瘤形成疾病或癌癥的受試者。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子減 小了腫瘤大小、抑制了腫瘤生長(zhǎng)和/或延長(zhǎng)了帶瘤受試者的存活期?？梢詫?GITR結(jié)合分子給予帶有肺瘤細(xì)胞(例如，肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、 神經(jīng)母細(xì)胞瘤、癌(carcinoma))的患者以便克服受試者的胂瘤特異性耐受。術(shù)語(yǔ)"腫瘤相關(guān)抗原"用于本文表示宿主生物中影響腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的 抗原。腫瘤相關(guān)抗原可以是腫瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原，或者是非腫瘤細(xì)胞表達(dá) 的抗原，但是后一種情況中，當(dāng)它表達(dá)時(shí)會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移。 腫瘤抗原和腫瘤相關(guān)抗原的類型包括任何已知或迄今為止未知的腫瘤抗 原，包括但不限于，白血病中的bcr/abl抗原；與宮頸癌相關(guān)的致癌病毒的HPVE6和E7抗原；黑素瘤中的或者與黑素瘤相關(guān)的MAGE1和MZ2-E抗 原；以及乳腺癌中的或與乳腺癌相關(guān)的MVC-1和HER-2抗原。用于本文，術(shù)語(yǔ)"瘤形成疾病"的特點(diǎn)在于惡性紳瘤生長(zhǎng)或處于以良性 增殖和增生細(xì)胞為特點(diǎn)的疾病狀態(tài)。術(shù)語(yǔ)"瘤形成"的一般醫(yī)學(xué)含義是指 造成對(duì)正常生長(zhǎng)控制失去反應(yīng)的"新細(xì)胞生長(zhǎng)"，例如瘤形成細(xì)胞生長(zhǎng)。用于本文，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞增生的"、"增生的"、"惡性的"和"瘤形成的"可以交換使用，是指處于以快速增殖或瘤形成為特征的異常狀態(tài)或情形的 那些細(xì)胞。這些術(shù)語(yǔ)意圖包括所有類型的增生性生長(zhǎng)、增生、癌變生長(zhǎng)或 致癌過(guò)程、轉(zhuǎn)移問(wèn)題或惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞、組織或器官，而不管侵染的組織病 理類型或階段。但是，用于本文，術(shù)語(yǔ)瘤形成和增生可以交換使用，象它 們的名字提示的，都是泛指經(jīng)歷異常細(xì)胞生長(zhǎng)速率的細(xì)胞。瘤形成和增生 包括"胂瘤"，可以是良性的、癌前病變或者惡性的。術(shù)語(yǔ)"瘤形成"、"增生"和"腫瘤"通常都被稱為"癌癥"，它是100多種以 不受控制、反常細(xì)胞生長(zhǎng)為特征的疾病的總稱。癌癥的例子包括但不限于: 乳腺癌；結(jié)腸癌；非小細(xì)胞肺癌，頭頸癌；大腸癌;肺癌;前列腺癌；卵巢癌；腎 癌；黑素瘤;和胃腸道癌(例如，胰腺癌和胃癌)；以及骨肉瘤。在一實(shí)施方案中，所述癌癥選自胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支 氣管癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、尿道膀胱癌、腦或中樞神經(jīng) 系統(tǒng)癌、外周神經(jīng)系統(tǒng)癌、食管癌、宮頸癌、子宮或子宮內(nèi)膜癌、口腔癌 或咽癌、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽管癌、小腸或附件癌、唾液腺癌、曱狀 腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤以及造血組織的癌癥。相應(yīng)的，本發(fā)明還涉及治療受試者(優(yōu)選是人或其它動(dòng)物)中的瘤形成疾 病或癌癥的方法，該方法是通過(guò)將有效量的本發(fā)明結(jié)合分子給予受試者或 動(dòng)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)，可以確定用于處置瘤形成疾病或癌 癥的目的，有效量的多肽是多少。例如，本發(fā)明的結(jié)合分子的治療有效量 可能根據(jù)多種因素而變化，比如疾病階段(例如，I期相對(duì)于IV期)、年齡、 性別、醫(yī)學(xué)綜合征(例如，免疫抑制狀態(tài)或疾病)以及受試者的體重，和結(jié) 合分子在受試者中引發(fā)所需反應(yīng)的能力?？梢哉{(diào)節(jié)劑量方案來(lái)提供最佳的 治療和/或預(yù)防反應(yīng)。例如，可以每天給予幾次分開(kāi)的劑量，或者按照治療 狀況的緊急情況相應(yīng)減少劑量。但一般來(lái)說(shuō)，有效劑量預(yù)計(jì)在每天每公斤 體重約0.05到100毫克的范圍內(nèi)，更優(yōu)選每天每公斤體重約0.5到10毫克。增強(qiáng)免疫反應(yīng)的方法所述結(jié)合分子還可以用于提高免疫反應(yīng)的方法。上調(diào)免疫反應(yīng)可以采 取提高已有免疫反應(yīng)的形式，或者引發(fā)初始免疫反應(yīng)的形式。例如，通過(guò) 調(diào)節(jié)GITR來(lái)提高免疫反應(yīng)在病毒感染的情況中可以是有益的。因?yàn)榭笹ITR結(jié)合分子能夠提高免疫反應(yīng)，它們?cè)谀切┬枰旎蚋鼜氐椎厍宄?原體(例如細(xì)菌和病毒)的情況中有醫(yī)療用途。相應(yīng)的，本發(fā)明的抗GITR結(jié)病或紊亂的受試者，比如前面列舉的那些感染性疾病或癌?？笹ITR結(jié)合分子還可以用在疫苗中預(yù)防各種病原體?？梢酝ㄟ^(guò)將病 毒蛋白和GITR結(jié)合分子一起接種來(lái)誘導(dǎo)抗病原體(例如病毒)的免疫力(如 上所述)。替代的，可以使用編碼病原體抗原和GITR結(jié)合分子的基因的表 達(dá)載體來(lái)進(jìn)行接種，例如被工程化用來(lái)表達(dá)編碼病毒蛋白的核酸和編碼 GITR結(jié)合分子的核酸的痘苗病毒表達(dá)載體。疫苗可能有用的病原體包括， 例如乙肝、丙肝、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、HIV-1、 HIV-2、流感、肺結(jié)核、 癥原蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)病。本發(fā)明進(jìn)一步涉及到以所述結(jié)合分子為基礎(chǔ)的療法，該療法包括將本 發(fā)明結(jié)合分子給予動(dòng)物患者，優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人，以便處置、 檢測(cè)和/或預(yù)防提及的疾病、紊亂或狀況中的一或多種。本發(fā)明的治療組合 物包括但不限于，本發(fā)明結(jié)合分子(包括文中描述的類似物和衍生物)和本 文描述的抗獨(dú)特型結(jié)合分子。本發(fā)明的結(jié)合分子可以用來(lái)處置、診斷、抑 制或預(yù)防與GITR異?；钚韵嚓P(guān)的疾病、紊亂或狀況，包括但不限于，文中 描述的疾病、紊亂或狀況中的一或多種(例如，可以將本發(fā)明結(jié)合分子提供 成本領(lǐng)域已知的或文中描述的可藥用組合物)。本發(fā)明的結(jié)合分子可以有利地與其它單克隆或嵌合結(jié)合分子、或者淋 巴因子或造血細(xì)胞因子(比如，例如IL-2， IL-3和IL-7)聯(lián)合使用，例如能提 高與結(jié)合分子相互作用的效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量或活性的那些。本發(fā)明的結(jié)合分子可以單獨(dú)或與其它類型的治療方法(例如，放療、化 療、激素療法、免疫療法)和抗腫瘤劑、抗生素、針對(duì)病原體的療法(比如能 有效對(duì)抗病毒病原體或細(xì)菌抗原的免疫治療或化療劑)以及免疫刺激劑聯(lián)合 使用。還可以將本發(fā)明的結(jié)合分子與抗原聯(lián)合給藥，所述抗原就是希望提高對(duì)它的免疫反應(yīng)的抗原，例如來(lái)自病原體的疫苗或抗原(或減毒形式的病 毒或細(xì)菌)或者來(lái)自上面描述過(guò)的腫瘤的抗原。在一實(shí)施方案中，將本發(fā)明 的結(jié)合分子以單獨(dú)或聯(lián)合療法給予患有感染的受試者。在另一實(shí)施方案中， 本發(fā)明的結(jié)合分子被單獨(dú)或聯(lián)合給予有慢性病毒感染的受試者。還有一實(shí) 施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子被單獨(dú)或聯(lián)合給予患有癌癥的受試者。在優(yōu)選實(shí)施方案中，人結(jié)合分子、其衍生物、類似物或核酸被給予人患者 用于治療或預(yù)防。VI. 藥物組合物本發(fā)明結(jié)合分子可以被導(dǎo)入適合給予受試者的藥物組合物。通常，所 述藥物組合物包含本發(fā)明的結(jié)合分子和可藥用載體。用于本文時(shí)，說(shuō)法"可 藥用載體"包括與藥物組合物相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗 真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。將這些介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)是 本領(lǐng)域眾所周知的。除非任何常規(guī)的介質(zhì)或試劑與活性化合物是不相容的， 否則本發(fā)明涉及它們?cè)诮M合物中的應(yīng)用。補(bǔ)充性的活性化合物也可以并入 組合物中。本發(fā)明的藥物組合物被配制成與其預(yù)期給藥途徑相容的劑型。給藥途 徑的例子包括腸胃外，例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口腔(例如吸入)、經(jīng)皮(表 面局部)、經(jīng)粘膜和直腸給藥。用于腸胃外、皮內(nèi)或皮下使用的溶液或懸浮液可以包括以下成分無(wú)菌稀釋劑，比如注射用水、鹽水溶液、固定油(fixed oil)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細(xì)菌劑比如苯曱醇或?qū)?羥基苯曱酸曱酯(methyl parabens);抗氧化劑比如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉； 螯合劑比如乙二胺四乙酸；緩沖液比如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及調(diào)節(jié) 滲透壓的試劑比如氯化鈉或葡萄糖?？梢杂盟峄蚴?lái)調(diào)節(jié)pH,比如鹽酸或 氬氧化鈉。腸胃外用藥劑可以封在玻璃或塑料制成的安瓿、 一次性注射器 或多劑量小^L中。適于注射用途的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液(當(dāng)可溶于水時(shí))或懸浮液 和用于即時(shí)配制無(wú)菌注射用液或懸浮液的無(wú)菌粉末。適合靜脈內(nèi)給藥的載 體包括生理鹽水、抑菌水、CremophorELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸鹽 緩沖液(PBS)。所有這些情況中> 所述組合物必須是無(wú)菌的，其流動(dòng)性應(yīng)達(dá)到容易進(jìn)行針管注射的水平。它必需在制造和存儲(chǔ)條件下是穩(wěn)定的，必需 在防止微生物(比如細(xì)菌和真菌)污染的條件下保存。載體可以是含有例如 水、乙醇、多元醇(例如，乙二醇、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)的溶劑或分散 介質(zhì)，以及它們的合適混合物。通過(guò)例如使用包衣(比如卯磷脂)、在懸浮液 的情況中維持所需顆粒大小、以及使用表面活性劑來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。 可以利用各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑來(lái)防止微生物污染，例如對(duì)羥、基苯曱酸酯(parabens)、氯丁醇(chlorobutanol)、苯酚(phenol)、抗壞血酸、硫柳汞等。 許多情況中，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，例如糖(sugar)、多元醇(比如甘 露醇、山梨醇)和氯化鈉。延遲可注射組合物的吸收可以通過(guò)在組合物中包 含能延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠來(lái)實(shí)現(xiàn)。
無(wú)菌注射溶液可以通過(guò)在合適溶劑中引入需要量的活性化合物以及上 面列舉的成分中的一種或多種，經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾制得。通常，懸浮液是在含有 基本分散介質(zhì)和所需的上迷其它成分的無(wú)菌載體中引入活性化合物來(lái)制備 的。在用于配制無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉末的情況中，優(yōu)選的制備方法是真空 干燥和冷凍干燥，從而產(chǎn)生活性成分和任何其它所需成分的粉末，所述其 它所需成分來(lái)自該成分纟是前無(wú)菌過(guò)濾的溶液?？诜M合物一般包括惰性稀釋劑或可食用載體。可以將它們密封在明 膠膠嚢中或壓成片劑。為了經(jīng)口治療給藥，可以將活性化合物與賦形劑一 起用于片劑、錠劑(troche)或膠嚢的形式。還可以用液體載體來(lái)制備口服組 合物作為漱口液，其中配制在液態(tài)載體中的化合物經(jīng)口施用，漱口后吐出片劑、丸劑、膠嚢、錠劑等可以含有任何以下成分，或類似特性的化合物粘 合劑，比如微晶纖維素、西黃蓍膠(gumtragacanth)或明膠；賦形劑，比如淀 粉或乳糖；崩解劑，比如海藻酸、Primogd或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑，比如硬脂 酸鎂或Sterotes;助流劑，比如膠體二氧化硅；甜味劑，比如蔗糖或糖精； 或者增味劑，比如胡椒薄荷、曱基水楊酸鹽或橙味劑(orangeflavoring)。為了通過(guò)吸入給藥，從加壓容器或含有合適的推進(jìn)劑(例如二氧化碳這 樣,的氣體)的分散器，或者噴霧器中以氣溶膠噴霧形式來(lái)遞送所述化合物。系統(tǒng)給藥還可以通過(guò)經(jīng)粘膜或經(jīng)皮途徑。用于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮給藥時(shí)， 在制劑中使用適合用于待穿透的屏障的滲透劑。這類滲透劑是本領(lǐng)域公知 的，在經(jīng)粘膜給藥時(shí)，包括例如表面活性劑、膽鹽和夫西地酸(fusidic acid)衍生物。經(jīng)粘膜給藥可以通過(guò)使用噴鼻劑或栓劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于經(jīng)皮給藥，可以將活性化合物配制成本領(lǐng)域熟知的軟膏(ointment)、油膏(salve)、凝膠或霜?jiǎng)?。所述組合物還可以配制成栓劑的形式(例如，用常規(guī)栓劑基底比如椰子 油和其它甘油酯)或者保留灌腸來(lái)經(jīng)結(jié)腸遞送。的載體來(lái)制備，所述載體比如控釋配制劑，包括植入物和微嚢遞送系統(tǒng)。 可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，比如乙烯乙酸乙烯共聚物、 聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制備這些制劑的方法對(duì) 本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。這些材料也可以從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc購(gòu)買。脂質(zhì)體懸浮液也可以作為可藥用載體?？梢园凑?本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，象美國(guó)專利4,522,811中描述的來(lái)制備這些。尤其有利的是配制成單位劑量形式的口服或腸胃外組合物以方便給藥 和達(dá)到劑量的統(tǒng)一性。單位劑量形式用于本文表示物理上單獨(dú)的單元，適 用于作為待處置受試者的單個(gè)劑量；每個(gè)單元含有與所需藥用載體組合的， 預(yù)先確定好用量的活性化合物，經(jīng)過(guò)計(jì)算能產(chǎn)生所需治療效果。本發(fā)明的 劑量單元形式的特性是直接決定于所述活性化合物的獨(dú)特性質(zhì)和要達(dá)到的這些化合物的毒性和治療效力可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)程序在細(xì)胞培養(yǎng)物 或?qū)峖r動(dòng)物中確定，例如確定LD50 (對(duì)群體50%致死的劑量)和ED50 (對(duì) 群體的50%有療效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比率是療效指數(shù)， 可以表達(dá)為比率LD50/ED50。優(yōu)選表現(xiàn)出較高療效指數(shù)的化合物。雖然可 以使用顯示毒性副作用的化合物，但要小心設(shè)計(jì)能夠?qū)⒃摶衔锒ò械绞?影響組織的遞送系統(tǒng)，以便盡量減少對(duì)未受影響細(xì)胞的可能破壞，從而減 少副作用。由細(xì)胞培養(yǎng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)可以用于配制人用的劑量。這些 化合物的劑量?jī)?yōu)選處于這樣的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)，即包括ED50而有很少或 沒(méi)有毒性?？梢愿鶕?jù)釆用的劑量形式和所用給藥途徑在該范圍內(nèi)對(duì)劑量做 改動(dòng)。對(duì)于任何用于發(fā)明所述方法的化合物，治療有效的劑量可以首先由 細(xì)胞培養(yǎng)分析來(lái)確定?？梢栽趧?dòng)物模型中確定劑量，以達(dá)到循環(huán)血漿濃度 范圍包括由細(xì)胞培養(yǎng)確定的IC50(即達(dá)到對(duì)癥狀最大抑制的一半的待測(cè)化合物的濃度)?？梢杂眠@類信息更精確地確定可以用于人的劑量。血漿中的 濃度可以通過(guò)例如高效液態(tài)層析來(lái)測(cè)量。所述藥物組合物可以與用藥說(shuō)明一起包含在容器、包裝或分散器中。VII.給藥本發(fā)明結(jié)合分子將本發(fā)明的結(jié)合分子與來(lái)自受試者的細(xì)胞在體外或體內(nèi)以生物可容性 形式進(jìn)行接觸。"生物可容性形式"意味著要給予的試劑的形式，其中任何毒 性效果都被所述結(jié)合分子的治療效果抵消了 。在一實(shí)施方案中，所述組合物被給予受試者。給予藥物活性量的本發(fā) 明藥物組合物是指，在一定時(shí)間內(nèi)達(dá)到所需結(jié)果的有效用量和每次劑量。 例如，結(jié)合分子的藥物活性量可能隨著一些因素而變動(dòng)，比如疾病階段、 年齡、性別和個(gè)體體重，以及該結(jié)合分子在個(gè)體中引發(fā)預(yù)期反應(yīng)的能力。 可以調(diào)節(jié)劑量方案來(lái)提供最大醫(yī)療反應(yīng)。例如，可以每天給予幾次分開(kāi)的 劑量，或者根據(jù)治療情況的緊急與否相應(yīng)減少劑量。本發(fā)明的藥物組合物可以包括"治療有效量"或"預(yù)防有效量"的本發(fā)明 結(jié)合分子。"治療有效量"是指在所需時(shí)間內(nèi)達(dá)到目標(biāo)治療結(jié)果的有效用量和 每次劑量。結(jié)合分子的治療有效量可能隨著一些因素而變動(dòng)，比如疾病階 段、年齡、性別和個(gè)體體重，以及該結(jié)合分子在個(gè)體中引發(fā)預(yù)期反應(yīng)的能 力。治療有效量也是其中結(jié)合分子的任何毒性或有害效果均被其治療有益 效果所超越的一個(gè)用量。"預(yù)防有效量"是指在所需時(shí)間內(nèi)達(dá)到目標(biāo)預(yù)防結(jié)果 的有效用量和每次劑量。通常，因?yàn)轭A(yù)防劑量是在發(fā)病前或疾病的早期用 于受試者的，預(yù)防有效量會(huì)比治療有效量低?？梢哉{(diào)節(jié)劑量方案來(lái)實(shí)現(xiàn)最佳的預(yù)期反應(yīng)(例如，治療或預(yù)防反應(yīng))。例 如，可以給予單個(gè)大劑量、 一段時(shí)間內(nèi)給予幾個(gè)分開(kāi)的劑量或者根據(jù)治療 情況的緊急與否相應(yīng)地減少或增加劑量。尤其有利的是配制成單位劑量形 式的腸胃外組合物以方便給藥和達(dá)到劑量的統(tǒng)一性。單位劑量形式用于本文表示物理上單獨(dú)的單元，適用于作為待處置哺乳動(dòng)物受試者的單個(gè)劑量； 每個(gè)單元含有與所需藥物載體組合的、預(yù)定用量的活性化合物，經(jīng)過(guò)計(jì)算 能產(chǎn)生所需治療效果。本發(fā)明的劑量單元形式的特性直接決定于(a)所述活 性化合物的獨(dú)特性質(zhì)和要達(dá)到的具體治療效果，以及(b)現(xiàn)有技術(shù)中組合該 活性化合物用于個(gè)體處置的敏感性的局限。本發(fā)明結(jié)合分子的治療或預(yù)防有效量的示范性，非限制性范圍是例如，約0.1-25 mg/kg,約1.0-10 mg/kg,約0.5-2.5 mg/kg，約5-25mg/kg,約1-400 mg/kg。需要說(shuō)明的是劑量值可能隨著欲緩解狀況的類型和嚴(yán)重程度而變 化。要進(jìn)一步明白，對(duì)于任何具體的受試者，應(yīng)當(dāng)根據(jù)個(gè)體所需和給予或 監(jiān)督給予所述組合物的人的專業(yè)判斷來(lái)隨時(shí)調(diào)整具體劑量方案，這里給出 的劑量范圍僅是范例，沒(méi)有限制要求保護(hù)的組合物的范圍或使用的意圖。 此外，本發(fā)明結(jié)合分子的治療或預(yù)防有效量的非限制性范圍是約0.0001到 100mg/kg,禾口約0.01 5'J 5 mg/kg"列i口， 0.02 mg/kg、 0.25 mg/kg、 0.5 mg/kg、 0.75 mg/kg、 lmg/kg、 2 mg/kg等)受試者體重。例如，劑量可以是1 mg/kg 體重或10 mg/kg體重或者在1-10 mg/kg的范圍內(nèi)，優(yōu)選至少1 mg/kg。處于 上述范圍中間的劑量也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可以將這樣的劑量每天、隔天、每周或者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)決定的其它時(shí)間表 來(lái)給藥。示范性的處置需要在一段時(shí)間，例如至少六個(gè)月內(nèi)以多個(gè)劑量進(jìn) 行給藥。其它示范性處置方案規(guī)定每?jī)蓚€(gè)周或每月一次或每3到6個(gè)月一 次給藥。示范性的劑量方案包括連續(xù)每天給予1-10 mg/kg或15 mg/kg、隔 天給予30 mg/kg或者每周給予60 mg/kg。本發(fā)明的結(jié)合分子可以多次給予。單個(gè)劑量間的間隔可以是例如，每 天、每周、每月或每年。通過(guò)測(cè)量患者體內(nèi)結(jié)合分子的血液水平，也可以 決定間隔是不規(guī)律的。任選將本發(fā)明的結(jié)合分子與其它對(duì)所需處置(例如，預(yù)防或治療)的紊亂 或狀況有效的試劑聯(lián)合給藥。優(yōu)選的其它試劑是現(xiàn)有技術(shù)認(rèn)可的，.—常規(guī)給 予具體紊亂的那些試劑?？梢砸苑奖愕姆绞絹?lái)給予結(jié)合分子，比如注射(皮下、靜脈內(nèi)等)、口服、 吸入、經(jīng)皮施用或結(jié)腸給藥。根據(jù)給藥途徑，可以將活性化合物包被在某 種材料中以便保護(hù)該化合物不受酶、酸和其它可能使化合物被滅活的天然 狀況的作用。例如，當(dāng)通過(guò)非腸胃外途徑給予試劑時(shí)，可能會(huì)希望將試劑 包被，或者和能防止它被滅活的材料一起給藥。本發(fā)明的結(jié)合分子可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法來(lái)給藥，盡管對(duì)于 許多治療性應(yīng)用來(lái)說(shuō)，優(yōu)選的給藥途徑/模式是靜脈注射或滴注。本領(lǐng)域技 術(shù)人員明白，給藥途徑和/或模式根據(jù)預(yù)期結(jié)果會(huì)有變化。在一些實(shí)施方案 中，可以將活性化合物和能使它免于被快速釋放的載體一起制備成比如控釋制劑，包括植入物、經(jīng)皮貼劑、和微嚢化遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山?解的、生物相容性聚合物，比如乙烯乙酸乙烯共聚物、聚酑、聚乙醇酸、 膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制備這類制劑的許多方法是受專利保護(hù)的或者本領(lǐng)域々支術(shù)人員 一般都知道的。參見(jiàn)例如，5W/"/"eJ Ow ro〃ed i e/g(zye Z>wg Z)e//vw_y iSyWe"w, J,R. Robinson, ed" Marcel Dekker， Inc., New York, 1978。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子可以是例如與惰性稀釋劑或可 同化可食用載體一起口服的。化合物(以及其它成分，如果需要的話)還可以 密封在硬的或軟的明膠膠嚢中，擠壓成片劑，或者直接摻入受試者的飲食 中。用于經(jīng)口治療性給藥，可以將化合物與賦形劑組合，以可分解的片劑、 錠劑、膏藥、膠嚢、酏劑、懸浮液、糖漿、速溶片(wafer)等形式使用。將本 發(fā)明的化合物以非腸胃外途徑給藥時(shí)，可能有必要將所述化合物包被上某 種材料或與某種材料一起給予來(lái)防止被滅活?？梢詫⒔Y(jié)合分子和酶抑制劑或者在合適的載體(比如脂質(zhì)體)中一起給 予?？伤幱孟♂寗┌}水和水緩沖液。可以使用最廣義上的佐劑，包括 任何免疫刺激化合物比如干擾素。這里預(yù)期的佐劑包括雷鎖辛(resorcinol)、 非離子表面活性劑，比如聚氧乙烯油基醚(polyoxyethylene oleyl ether)和正十 六烷基聚乙烯醚(n-hexadecyl polyethylene ether)。酶抑制劑包括胰蛋白酶抑 制劑、二異丙基氟磷酸(diisopropylfluorophosphate， DEEP)和抑肽酶(trasylol)。 脂質(zhì)體包括水包油包水乳劑以及常規(guī)的脂質(zhì)體(Sterna W a/. (1984) 7. iVewro/mmwwo/. 7:27)?；钚曰衔镞€可以經(jīng)腸胃外或腹膜內(nèi)給予。分散體還可以在甘油、脂 質(zhì)聚乙二醇和它們的混合物以及油中制備。在普通保存和使用條件下，這 些制品可以含有防腐劑以便防止微生物的生長(zhǎng)。當(dāng)活性化合物象上文描述的那樣有適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)，結(jié)合分子可以與例如 惰性稀釋劑或者可同化可食性載體一起經(jīng)口給予。補(bǔ)充性活性化合物也可以加入組合物中。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明 的結(jié)合分子與一或多種其它治療劑共同成劑和/或共同給藥。例如，本發(fā)明 的抗GITR結(jié)合分子可以與一或多種結(jié)合別的靶分子的其它抗體共同成劑 和/或共同給藥，其中所述抗體是例如能結(jié)合其它細(xì)胞因子或結(jié)合細(xì)胞表面分子的抗體。這種聯(lián)合療法可以有利地使用低劑量治療試劑，從而避免和 各種單獨(dú)療法相關(guān)的毒性或綜合征。本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋偶聯(lián)了診斷或治療劑的結(jié)合分子。結(jié)合分子可以診 斷性地用于，例如作為臨床測(cè)試的一部分，監(jiān)控腫瘤發(fā)展或進(jìn)展以便確認(rèn) 給定治療方案的效果?？梢酝ㄟ^(guò)給抗體偶聯(lián)上一個(gè)可^^測(cè)物質(zhì)來(lái)協(xié)助探測(cè)。 可檢測(cè)物質(zhì)的例子包括各種酶、輔基、萸光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物 質(zhì)、放射性物質(zhì)、用各種正電子發(fā)射X射線斷層術(shù)放射正電子的金屬，以 及非放射性順磁性金屬離子。所述可檢測(cè)物質(zhì)可以直接或者利用本領(lǐng)域已 知技術(shù)借助中間物(比如，例如本領(lǐng)域已知的接頭)間接地與結(jié)合分子偶聯(lián)或綴合。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利4,741,卯O的金屬離子可以與結(jié)合分子綴合用做診斷劑。合適的酶的例子包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷脂酶、p-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基的例子包括鏈霉親和素/生物素和抗生物素蛋 白/生物素；合適的熒光物質(zhì)的例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、 羅丹明、二氯三吖嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白;發(fā)光物質(zhì)的一個(gè)例 子是魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的例子包括熒光素酶、熒光素和水母發(fā)光蛋白； 合適的放射性物質(zhì)的例子包括I125 、 I131、 I111、 In99Tc。更進(jìn)一步，結(jié)合分子可以偶聯(lián)上一個(gè)治療部分，比如細(xì)胞毒素，例如 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑或殺細(xì)胞性試劑、治療劑、放射性金屬離子(例如，a放射 源，象^Bi)、生物毒素、前藥、肽、蛋白質(zhì)、酶、病毒、脂類、生物反應(yīng) 調(diào)理劑、藥物試劑、免疫活性配體(例如，淋巴因子和其它抗體)。在另一實(shí) 施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子可以偶聯(lián)上能夠抑制腫瘤血管形成的分子。 在其它實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的組合物可以包含偶聯(lián)了藥物或前藥的本發(fā)明結(jié)合分子。本發(fā)明的再一些實(shí)施方案包含偶聯(lián)了比如蓖麻毒素、白樹(shù)毒 蛋白(gelonin)、假單胞菌外毒素或白喉毒素這些特異生物毒素或它們的細(xì)胞 毒性片段的結(jié)合分子的用途。選擇使用什么樣的偶聯(lián)或未偶聯(lián)結(jié)合分子取 決于癌癥的類型和階段、是否使用輔助治療(例如，化療或體外放射)以及患 者的狀況。我們認(rèn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員參照本文的教導(dǎo)可以容易地作出選擇。 細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑包括任何對(duì)細(xì)胞有害的試劑。例子包括紫杉醇 (paclitaxol)、細(xì)胞松他素(cytochalasin) B、短桿菌肽(gmmicidin) D、溴化乙 錠、依米丁(emetine)、絲裂霉素(mitomycin)、依托泊苦(etoposide)、替尼泊 香(tenoposide)、 長(zhǎng)春花新械(vincristine)、 長(zhǎng)春花威(vinblastine)、 秋水仙威(colchicin)、多柔比星(doxombicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、 二羥基炭疽菌 素二酉同(dihydroxy anthracin dione)、 米4乇蒽、@昆(mitoxantrone)、 光法軍零素 (mithramycin)、》丈線菌素(actinomycin) D、 l-去氮睪酉同(dehydrotestosterone)、 糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、 丁卡因(tetracaine)、利多 卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)和噪呤霉素(puromycin)以及它們的類 似物或同系物。治療劑包括但不限于，抗代謝物(例如，氨曱蝶呤 (methotrexate)、 6-巰基噪呤(6-mercaptopurine) 、 6-石克鳥(niǎo)噪呤(6-thioguanine)、 阿糖胞苷(cytarabine)、 5-氟尿嘧咬(5-fluorouracil)、達(dá)卡巴口秦(dacarbazine))、 烷化劑(例如，氮芥(mechlorethamine)、 蓬替喊(thiotepa)、 氯氨布西 (chlorambucil)、美法侖(melphalan)、 carnusti.ne (BSNU)和洛莫司汀(lomustine, CCNU)、環(huán)磷酰胺(cycl叩hosphamide)、白消安(busulfan) 、 二溴甘露醇 (dibromomannitol)、鏈脲佐菌素(streptozotocin)、絲裂霉素C和順式二氯二 氨合粕(cis-dichlorodiamine platinum) (II) (DDP，順鈿(cisplatin))、蒽環(huán)類藥 (anthracycline)(例如，柔紅霉素(以前稱為daunomycin)和阿霉素)，抗生素(例 如，放線菌素D(dactinomycin，以前稱為放線菌素)、博萊霉素(bleomycin)、 光輝霉素和氨茴霉素(anthramycin， AMC),以及抗有絲分裂試劑(例如，長(zhǎng) 春花新械和長(zhǎng)春花堿)。本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)行闡述，這些實(shí)施例不應(yīng)被理解為對(duì) 發(fā)明的限制。本申請(qǐng)中提及的所有參考文獻(xiàn)、專利和已公開(kāi)的專利申請(qǐng)的 全部?jī)?nèi)容，以及附圖均以引用的方式并入本文。實(shí)施例以下材料和方法用于一些實(shí)施例中 方法培養(yǎng)T細(xì)胞系用各種方法從得自人臍帶血的細(xì)胞或者外周血CD4+CD45RA+原初T 細(xì)胞產(chǎn)生分化的細(xì)胞系，所述方法包括流式細(xì)胞儀和萬(wàn)茲珠分離。起始群體 純度>95%。然后細(xì)胞在RPMI 1640中用CD3和CD28抗體刺激來(lái)產(chǎn)生分 化的細(xì)胞類型，所述培養(yǎng)基含有10%FCS和1%人AB血清，以及細(xì)胞因子 和抗細(xì)胞因子中和抗體的指定混合物。用IL12 (62U/ml)和抗IL4 (0.2叱/ml) 培養(yǎng)，產(chǎn)生Thl細(xì)胞；用IL4 (145U/ml)和抗IL12 (10ug/ml)以及抗IFNy(10ug/ml)培養(yǎng)，產(chǎn)生Th2細(xì)胞；用TGF卩(32U/ml)、 IL9 (42U/ml)、抗IL4 (1 Oug/ml)和抗IL12 (1 Oug/ml)以及抗IFNy( 1 Oug/ml)培養(yǎng)，產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。 (注所有實(shí)驗(yàn)中都未使用抗IL12)。所有培養(yǎng)物均補(bǔ)充了 IL2 (65U/ml)和IL15 (4500U/ml)。根據(jù)細(xì)胞分裂的需要將細(xì)胞分到更大的培養(yǎng)板中。實(shí)施例1:分離和純化6C86C8抗體是IgG2b, k型。該抗體經(jīng)純化表明存在兩個(gè)重鏈(圖1)。這 可以是由于取兩種糖基化之一或者污染了另一種抗體(Ab)所致。大小排阻層 析只顯示有一個(gè)峰(圖2)。如下純化6C8抗體
1. 用5個(gè)柱體積的dPBS洗20 ml蛋白G (Pharmacia HR 10/30)
2. 上樣1L (第1輪)或2 L (第2輪)hGITR (6C8)上清液
3. 用10個(gè)柱體積的dPBS洗滌
4. 用100 mM檸檬酸鹽，pH 2.8直接洗脫到1 M Tris (20-25% v:v)中
5. 用100 mM檸檬酸鹽(pH 2.8)、 0.3 MNaCl剝離(strip)實(shí)施例2:鑒定6C86C8抗體與轉(zhuǎn)染了 GITR-L-M的細(xì)胞(圖3)和活化的PBL(圖4)結(jié)合。 活化的淋巴細(xì)胞上生物素標(biāo)記的抗GITR的飽和曲線提示，相對(duì)親和力良好 (圖5)。6C8抗體對(duì)于利用亞優(yōu)化的抗CD3激活的T淋巴細(xì)胞具有協(xié)同刺激活 性(圖6)。該抗體的協(xié)同刺激未達(dá)到與CD28 —樣的水平，但是與抗GITR 商品(R&D)是相當(dāng)?shù)摹?C8抗體未請(qǐng)導(dǎo)活化的淋巴細(xì)胞凋亡(圖7)。用PHA活化淋巴細(xì)胞， 3天后加入抗體。與YTH 655 (已知能誘導(dǎo)活化的淋巴細(xì)胞凋亡的抗人CD2) 相比，6C8未增加活化的T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。6C8抗體未阻斷初級(jí)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)(圖8)。用TRX1 (抗人 CD4)作所述MLR的陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)施例3: 6C8抗體抵消調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)T效應(yīng)細(xì)胞的抑制作用6C8抗體能夠阻斷調(diào)節(jié)性T細(xì)胞誘發(fā)的抑制作用(圖9)。 CD4+/CD25+ 細(xì)胞以不同比率加入CD4十/CD25-細(xì)胞。所述細(xì)胞用結(jié)合在微孔板上的抗 CD3和抗CD28來(lái)刺激。當(dāng)比率為1:1時(shí)，CD4十/CD25+細(xì)胞能夠消除 CD4+ZCD25-細(xì)胞的增殖。在培養(yǎng)物中加入6C8能夠以劑量依賴方式阻斷該 抑制作用。當(dāng)僅通過(guò)抗CD3(并非與抗CD28進(jìn)行協(xié)同刺激)來(lái)刺激T細(xì)胞時(shí)，將 CD4+ZCD25+細(xì)胞加入CD4+ZCD25-細(xì)胞中，未觀察到抑制作用，實(shí)際上， 所述抗GITR抗體在這些情況中具有微弱的協(xié)同刺激效果(圖10)。實(shí)施例4: 6C8抗體調(diào)節(jié)經(jīng)由NF-kB進(jìn)行的信號(hào)傳導(dǎo)T細(xì)胞經(jīng)CD3或者CD3+CD28活化，導(dǎo)致激活I(lǐng)-kB信號(hào)傳導(dǎo)途徑，這 可通過(guò)I-KB的磷酸化(圖12和14)和隨后的降解(圖11和13)來(lái)評(píng)估明。如圖ll所示，在部分活化的情況下，抗GITR對(duì)I-KB信號(hào)傳導(dǎo)有明顯 的影響，I-kB的時(shí)間依賴性降解證實(shí)了這一點(diǎn)。在有GITR結(jié)合分子的情況 中，在所分析的所有時(shí)間點(diǎn)，降解明顯減弱。上述變化與I-kB磷酸化的下 降有很好的相關(guān)性(圖12)。有趣的是，對(duì)TH2和Treg的反應(yīng)強(qiáng)度(magnkude of response)比對(duì)TH1 的大。此外，在平行實(shí)驗(yàn)中，與TH2和Treg細(xì)胞相比，GITR的表達(dá)似乎 在TH1細(xì)胞上更高(經(jīng)MCF(平均通道熒光)評(píng)價(jià)得出)。通過(guò)交聯(lián)CD3和 CD28而被完全活化的T細(xì)胞失去了它們針對(duì)抗GITR的反應(yīng)性，但是完全 保持了經(jīng)由TNF-a進(jìn)行的I-Kb活化。實(shí)施例5:6C8抗體增強(qiáng)免疫反應(yīng)B16黑素瘤腫瘤模型是一種有侵占性的(aggressive)黑素瘤模型，其曾被 用于研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在癌癥中的作用。對(duì)耗盡抗CD25抗體或者抗 CTLA-4的小鼠進(jìn)行的處理在該模型中已顯示出很有希望的結(jié)果。兩種情況 中，所述處理均可延遲腫瘤的發(fā)生以及腫瘤大小的增長(zhǎng)。由于GITR在 CD25+細(xì)胞上表達(dá)，且可能參與抵消調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制作用，因而用抗 GITR結(jié)合分子來(lái)處置BI6荷瘤小鼠，以便確定是否對(duì)腫瘤發(fā)生或腫瘤大小 有影響。小鼠在注射腫瘤的一天后用抗GITR結(jié)合分子進(jìn)行處置，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和大小增長(zhǎng)被延遲(圖17)。此外，GITR處理組中有一些小鼠在實(shí)驗(yàn)的最后仍未出現(xiàn)腫瘤。第0天，所有動(dòng)物在右體側(cè)注射104 B16黑素瘤細(xì)胞。GITR組在第1 天接受了2毫克、1毫克、0.5毫克或0.2毫克抗GITR結(jié)合分子。從第16 天開(kāi)始出現(xiàn)可測(cè)量到的肝瘤。實(shí)施例6:同時(shí)遞送抗GITR和抗原導(dǎo)致佐劑效果進(jìn)一步研究了抗mGITR抗體在對(duì)抗卵清蛋白(Ova)或血凝素(HA)的體 液反應(yīng)中的佐劑效果。小鼠在第-1、 0和1天用無(wú)抗體、0.4mg/天的YAML (同種型對(duì)照)或0.4mg/天的2F8 (大鼠-抗mGITR)處置。為了評(píng)價(jià)Fc受體的 參與在所述結(jié)合分子的作用機(jī)制中的重要性，另外一組動(dòng)物用6 mg/天的 2F8 F(ab，)2在第-1、 0和1天處置。該劑量是根據(jù)F(ab，)2的半壽期比完整 抗體短來(lái)選擇的。第0天，小鼠用Ova (IOO嗎)或HA (10 iag)免疫。經(jīng)Ova 處置的小鼠在第14天用lOO(igOva攻擊，然后在第21和28天取血，獲得 血清進(jìn)行ELISA分析。經(jīng)HA處置的小鼠在第14天用5pgHA攻擊，也在 第21和28天取血。監(jiān)測(cè)2F8和2F8 F(ab，)2的血清濃度，來(lái)評(píng)價(jià)結(jié)合分子的藥代動(dòng)力學(xué)變 化。第1天，在經(jīng)2F8或2F8 F(ab，)2片段處置的小鼠中，結(jié)合分子的血清 水平相當(dāng)。在經(jīng)2F8處置的小鼠中，檢測(cè)到結(jié)合分子的情況持續(xù)直至第9 天，而經(jīng)2F8 F(ab，)2片段處置的小鼠檢測(cè)到結(jié)合分子的情況僅持續(xù)到第3 天，雖然其劑量是2F8的15倍。這些結(jié)果表明，在本研究的HA分支中，第21天和28天，經(jīng)2F8處置 的小鼠與未經(jīng)抗體處置的小鼠相比，抗HA抗體分別增加4和5倍；與經(jīng) YAML處置的小鼠相比，抗HA抗體分別增加18和20倍(圖19)。在以抗 mGITR抗體為佐劑時(shí)觀察到的抗HA滴度，與將HA和弗氏不完全佐劑(IFA) 一起給予時(shí)觀察到的滴度相當(dāng)。這提示，用所述抗mGITR抗體觀察到的反 應(yīng)與免疫學(xué)研究中常用的最強(qiáng)效佐劑之一是相當(dāng)?shù)摹Ｔ诒狙芯康腛va分支中，第21天和28天，經(jīng)2F8處置的小鼠與未經(jīng) 抗體處置的小鼠相比，抗Ova抗體分別增加13和6倍；與經(jīng)YAML處置 的小鼠相比，抗Ova抗體分別增加17和8倍(圖20)。 2F8抗體在針對(duì)Ova 的反應(yīng)中的影響與在針對(duì)HA的反應(yīng)中觀察到的影響相當(dāng)。第21天和28天，經(jīng)2F8F(ab，)2處置的小鼠與未經(jīng)抗體處置的小鼠相比，抗Ova抗體分 別增加4和3倍；與經(jīng)YAML處置的小鼠相比，抗Ova抗體分別增加6和 5倍(圖20)。 F(ab，)2相比于完整抗體的劑量及不同藥代動(dòng)力學(xué)變化，可以 解釋與經(jīng)2F8處置的小鼠相比時(shí)抗Ova反應(yīng)的下降?？傊?，這些數(shù)據(jù)顯示，2F8抗體在針對(duì)抗原的體液反應(yīng)中的影響主要?dú)w 功于該抗體的F(ab，)2部分，在所述抗mGITR抗體發(fā)揮佐劑效果時(shí)可能并 非必需有Fc受體參與。實(shí)施例7:制備嵌合抗GITR結(jié)合分子采用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)將6C8可變輕鏈區(qū)移植到人輕鏈恒定區(qū)上。 使用的是IgGl輕鏈恒定區(qū)。完整嵌合輕鏈GITR結(jié)合分子的氨基酸如下所 示THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:22)。采用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，還將6C8可變重鏈移植到人重鏈恒定區(qū)上。 使用的是IgGl重鏈恒定區(qū)。完整嵌合重鏈GITR結(jié)合分子的氨基酸序列如 下所示(又稱為"Gly"):LSPGK (SEQ ID NO:23)。因?yàn)榘被嵝蛄蠳X(S/T)是一個(gè)推測(cè)的糖基化位點(diǎn)共有序列，該序列可 能影響到結(jié)合分子的產(chǎn)生，而6C8重鏈的IgGl恒定區(qū)含有序列NST,我們 制備了重鏈恒定區(qū)的第二個(gè)版本將SEQ ID NO:23中氨基酸殘基299的谷氨 酰胺保守取代為天冬酰胺(粗體，并加有下劃線)。相應(yīng)的，第二個(gè)人恒定區(qū) 被移植到6C8重鏈可變區(qū)上。完整嵌合重鏈GITR結(jié)合分子的氨基酸序列 如下所示(又稱為"Agly"):LSPGK (SEQ ID NO:24)。實(shí)施例8:制備人源化形式的6C8抗GITR結(jié)合分子采用Hwang " a/. (2005) A/"/zoA (36) 35-42中描述的基于CDR同源性 的策略來(lái)人源化6C8。用公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)重鏈和輕鏈氨基酸序列進(jìn)行檢索， 結(jié)果表明6C8有一個(gè)3-1重鏈規(guī)范結(jié)構(gòu)和一個(gè)2-1-1輕鏈規(guī)范結(jié)構(gòu)。由此， 將IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)中所有具備2-1-1規(guī)范結(jié)構(gòu)的種系K鏈V基因與6C8抗體 序列進(jìn)行了比較。同樣所有3-1種系重鏈V基因與6C8氨基酸序列進(jìn)行了 比較。只比較了 CDR序列，并且根據(jù)哪個(gè)種系序列在CDR中有最多匹配 挑選了框架。(參見(jiàn)以下序列比對(duì))。對(duì)于輕鏈，3-15*01序列在CDR中有14個(gè)匹配，選擇了該序列。因?yàn)?CDR 3末尾是亮氨酸和蘇氨酸，我們使用了 Jk4 J基因片段序列。具備2-1 -1規(guī)范結(jié)構(gòu)的輕鏈V基因工MGT基因名稱 CDR1 CDR2 CDR3 IDsIGKV1-5 RASQS工SSWLA...... DASSLES....... QQYNSYS . . 11工GKV1-6 RASQGIRNDLG...... AASSLSQ....... LQDYNYP . . 9IGKV1-9 RASQGISSYIA...... AASTLQS....... QQLNSYP.. 11工GKV1-12 RASQG工SSWLA...... AASSLQS....... QQANSFP.. 11IGKV1-16 RASQGISSWLA...... AASSLQS....... QQYNSYP . . 12IGKV1D-16 RARQGISSWLA...... AASSLQS....... QQYNSYP..〗1工GKV1-17 RASQGIRNDLG...... AASSLQS....... LQHNSYP.. 9IGKV1-27 RASQG工SNYLA...... AASTLQS....... QKYNSAP . . 11工GKV1-33 QASQDISNYLN...... DASNLET....... QQYDNLP.. 9IGKV1-39 RASQS工SSYLN...... AASSLQS....... QQSYSTP.. 9IGKV1D-43 WASQGISSYLA...... YASSLQS....... QQYYSTP.. 11IGKV3-11 RASQSVSSYLA...... DASNRAT....... QQRS麗P . . 11IGKV3D-11 RASQGVSSYLA...... DASNRAT....... QQRS麗H. . 10工GKV3-15 RASQSVSSNLA...... GASTRAT....... QQYN麗P . . 146C8 KASQNVGTNVA...... SASYRYS....... QQYNTDP將IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)中所有具備2-1-1規(guī)范結(jié)構(gòu)的種系輕鏈k鏈V 6C8抗體序列進(jìn)行了比較。同樣將所有3-1種系重鏈V基因與6C8 序列進(jìn)行了比較。利用該方法制備了輕鏈的 一 個(gè)版本基因與氨基酸— 7FGG GTKVEIK (SEQ ID NO:44) (CDR用斜體表示)對(duì)重鏈來(lái)說(shuō)，序列2-05*01有17個(gè)匹配。但是，CDR3周圍的序列與 6C8不同(YYCARvs. YYCAHR)。因?yàn)橐延凶C明顯示CDR 3對(duì)于CDR的 識(shí)別能力是最重要的，應(yīng)當(dāng)盡量地使該區(qū)域達(dá)到完全匹配。序列2-70*01 在CDR中有16個(gè)匹配，緊挨CDR3前面的序列與6C8的完全匹配，因此 我們選擇了 2-70*01。對(duì)于重鏈的J基因片段，JH4有最多的匹配，因此被選中。然后氨基酸 序列被反翻譯，對(duì)應(yīng)目標(biāo)核苷酸序列的引物購(gòu)自IDT (Coralville, IA)。帶有3-1規(guī)范結(jié)構(gòu)的重鏈V基因IMGT基因名稱 CDR1 CDR2 IDs工GHV2-5 TSGVGVG..... LI Y麗DDKRYS PSLKS 17工GHV2-26 NARMGVS..... H工FSNDEKSYSTSLKS 12工GHV2-70 TSGMCVS..... L工DWDDDKYYSTSLKT 16IGHV4-30-2 SGGYSWS..... YIYHSGSTYYNPSLKS 10工GHV4-30-4 SGDYYWS..... Y工YYSGSTYYNPSLKS 9工GHV4-31 SGGYYWS..... YIYYSGSTYYNPSLKS 9IGHV4-39 SSSYYWG..... SIYYSGSTYYNPS!LKS 10IGHV4-61 SGSYYWS..... YIYYSGSTNYNPSLKS 86C8 TSGMGVG..... HIWWDDDKYYNPSLKS利用這種方法，制備了重鏈的一個(gè)版本:WL認(rèn)/,節(jié)UT^S7X肌TISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYC因?yàn)榘被嵝蛄蠳X(S/T)是一個(gè)推測(cè)的糖基化位點(diǎn)共有序列，可能影響 到結(jié)合分子的產(chǎn)生，而6C8重鏈的CDR2含有序列NPS，我們制備了重鏈 的第二個(gè)版本將SEQ ID NO:53中氨基酸殘基62的谷氨酰胺保守取代為天 冬酰胺(粗體，并加有下劃線)。相應(yīng)的，制備了重鏈的第二版本我們還做了 6C8輕鏈可變區(qū)和3-15*01種系輕鏈序列的CLUSTAL W (1.82)多重序列比對(duì)(利用Blosum評(píng)分陣列，空位罰分為10)。結(jié)果如下3-15*01 rfsgsgsgteftlt工ss:lqsedfavyycqqynnwp------------基于CLUSTAL W分析，在人框架中鑒定到一些氨基酸殘基可能用與 人源化6C8輕鏈的6C8框架殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基進(jìn)行取代。具體來(lái)說(shuō)， 是位點(diǎn)1的E，位點(diǎn)8的P,位點(diǎn)9的A,位點(diǎn)10的T,位點(diǎn)11的L, 位點(diǎn)13的V,位點(diǎn)15的P,位點(diǎn)17的E,位點(diǎn)19的A,位點(diǎn)20的T, 位點(diǎn)21的L，位點(diǎn)22的S,位點(diǎn)43的A，位點(diǎn)45的R,位點(diǎn)46的L,位 點(diǎn)58的I,位點(diǎn)60的A,位點(diǎn)63的S,位點(diǎn)70的E,位點(diǎn)76的S,位點(diǎn) 77的S，位點(diǎn)78的L，位點(diǎn)79的Q,位點(diǎn)83的F,位點(diǎn)85的V，位點(diǎn)87 的Y,位點(diǎn)100的G,以及位點(diǎn)104的V。類似的，還對(duì)6C8重鏈可變區(qū)和含有2-70*01氨基酸序列的種系重鏈 蛋白質(zhì)進(jìn)行了 CLUSTAL W(1.82)多重序列比對(duì)(用Blosum評(píng)分陣列，空位 罰分為10)。結(jié)果如下-70*01 YSTSLKTRLTISKDTSKNQWLTMTNMDPVDTATYYCARI基于CLUSTAL W分析，在人框架中鑒定到一些氨基酸殘基可能用與 人源化6C8重鏈的6C8框架殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基進(jìn)行取代。具體來(lái)說(shuō)， 是位點(diǎn)5的R,位點(diǎn)10的A,位點(diǎn)11的L,位點(diǎn)12的V,位點(diǎn)15的T， 位點(diǎn)19第T，位點(diǎn)23的T，位點(diǎn)43的P，位點(diǎn)46的A，位點(diǎn)68的R， 位點(diǎn)77的K，位點(diǎn)81的V，位點(diǎn)83的T,位點(diǎn)84的M，位點(diǎn)86的N， 位點(diǎn)87的M,位點(diǎn)89的P，位點(diǎn)90的V,以及/或者在位點(diǎn)92的T。制備了具有如下人源化重鏈和輕鏈組合方式的4種人源化全長(zhǎng)6C8結(jié) 合分子全長(zhǎng)版本1 (HuN6C8-Gly)-人源化(Hu) 6C8輕鏈(L)/人源化重鏈， CDR2中有N("N'，)、且包含具有N的恒定區(qū)("Gly，，)全長(zhǎng)版本2 (HuN6C8-Agly)-人源化(Hu) 6C8輕鏈(L)/人源化的重 鏈，CDR2中有N("N，，)、且包含具有A的恒定區(qū)("Agly")全長(zhǎng)版本3 - (HuQ6C8-Gly)-人源化(Hu) 6C8輕鏈(L)/人源化的重 鏈，CDR2中有Q("Q，，)、且包含具有N的恒定區(qū)("Gly，，)全長(zhǎng)版本4 - (HuQ6C8-Agly)-人源化(Hu) 6C8輕鏈(L)/人源化的重 鏈、CDR2中有Q("Q")、且包含具有A的恒定區(qū)("Agly")用于產(chǎn)生全長(zhǎng)結(jié)合分子的糖基化IgGl重鏈恒定區(qū)氨基酸序列如下 用于產(chǎn)生全長(zhǎng)結(jié)合分子的去糖基化IgGl重鏈恒定區(qū)氨基酸序列如下:用于制備全長(zhǎng)結(jié)合分子的IgGl輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列如下:KSFNRGEC (SEQ ID NO:57)。人源化6C8輕鏈的完整氨基酸序列如下:LSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:5 8).還可包括引導(dǎo)序列METQSQVFVYMLLWLSGVDG (SEQ ID NO:59)。 人源化6C8重鏈版本HuN6C8-Agly、 HuQ6C8-Gly和HuQ6C8-Agly的完整氨基酸序列如下HuN6C8-Gly SPGK (SEQ ID NO:60); HuN6C8-AglySPGK (SEQ ID NO:62);以及 HuQ6C8-AglyAHIWWDDDKYYQPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCASPGK (SEQ ID NO:63).還可包括引導(dǎo)序列MDRLTFSFLLLIVPAYVLS (SEQ ID NO:64)。等同物本領(lǐng)域技術(shù)人員只需運(yùn)用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就能認(rèn)識(shí)到，或者確認(rèn)文中描述的 本發(fā)明具體實(shí)施方案的許多等同物。以下權(quán)利要求意在涵蓋這些等同物。
權(quán)利要求
1. GITR結(jié)合分子，其包含SEQ ID NO.1中的氨基酸殘基20-138或SEQ ID NO66中的氨基酸殘基20-138。
2. GITR結(jié)合分子，其包含SEQIDNO.:2中的氨基酸殘基21-127。
3. GITR結(jié)合分子，其包含至少一個(gè)選自SEQIDNO.:3， SEQIDNO.:4 或SEQIDNO:19，和SEQIDNO.:5的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)氨基酸序列。
4. 權(quán)利要求3的GITR結(jié)合分子，其包含至少兩個(gè)CDR。
5. 權(quán)利要求3的GITR結(jié)合分子，其包含三個(gè)CDR。
6. GITR結(jié)合分子，其包含至少一個(gè)選自SEQIDNO.:6、 SEQIDNO.:7 和SEQ ID NO.:8的CDR氨基酸序列。
7. 權(quán)利要求6的GITR結(jié)合分子，其包含至少兩個(gè)CDR。
8. 權(quán)利要求6的GITR結(jié)合分子，其包含三個(gè)CDR。
9. GITR結(jié)合分子，其包含SEQIDNO: 3、 4或19、 5、 6、 7或8所示 的CDR。
10. GITR結(jié)合分子，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可 變區(qū)含有SEQIDNO.:l中的氨基酸殘基20-138或者SEQ ID NO:66中的氨 基酸殘基20-138，所述輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO:2中的氨基酸殘基 21-127。
11. 權(quán)利要求3-10任一項(xiàng)的GITR鏈框架區(qū)。
12. 權(quán)利要求11的GITR 殘基被回復(fù)突變成相應(yīng)的鼠氨基酸殘基。
13. 權(quán)利要求9的GITR結(jié)合分子.區(qū)。
14. 權(quán)利要求9的GITR結(jié)合分子.
15. 權(quán)利要求9的GITR結(jié)合分子亡。
16. 權(quán)利要求9的GITR結(jié)合分子 合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
17. 權(quán)利要求9的GITR "aa-其包含人種系重鏈和輕其中的一或多個(gè)人框架氨基酸其中恒定區(qū)包含IgG2b重鏈恒定其中所述結(jié)合分子結(jié)合人GITR。 其中所述結(jié)合分子不誘發(fā)細(xì)胞凋其中所述結(jié)合分子不阻斷初級(jí)混 其中所述結(jié)合分子抵消調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)T效應(yīng)細(xì)胞的抑制作用。
18. 權(quán)利要求9的GITR結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子促進(jìn)T效應(yīng)細(xì) 胞的增殖。
19. 權(quán)利要求9的GITR結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子是來(lái)源于鼠的。
20. 權(quán)利要求19的GITR結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子包含鼠IgG2a重鏈。
21. 權(quán)利要求9的GITR結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子調(diào)節(jié)人GITR的活性。
22. 權(quán)利要求9的GITR結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子減弱I-kB在T 細(xì)胞中的降解。
23. 權(quán)利要求ll的GITR結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子是嵌合抗體。
24. GITR結(jié)合分子，該分子結(jié)合人T細(xì)胞和人樹(shù)突狀細(xì)胞上的 GITR,并且結(jié)合常數(shù)(Kd)為1 x10—9或更低。
25. 權(quán)利要求24的GITR結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子抵消調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞對(duì)T效應(yīng)細(xì)胞的抑制作用。
26. 權(quán)利要求24的GITR結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子是人源化抗體。
27. 組合物，其包含權(quán)利要求1-10或13-26任一項(xiàng)所述的GITR結(jié)合 分子和可藥用載體。
28. 權(quán)利要求27的組合物，還包含至少一種另外的用于治療受試者 所患癌癥的治療劑。
29. 權(quán)利要求27的組合物，還包含至少一種另外的用于治療受試者 的病毒感染的治療劑。
30. 權(quán)利要求27的組合物，還包含至少一種治療受試者所患癌癥的 腫瘤抗原。
31. 權(quán)利要求27的組合物，還包含至少一種治療受試者的病毒感染 的病原體抗原。
32. —種消除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)T效應(yīng)細(xì)胞的抑制作用的方法，該方法 包括將人免疫細(xì)胞與權(quán)利要求l-10或13任一項(xiàng)所述GITR結(jié)合分子進(jìn)行接 觸，從而消除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)T效應(yīng)細(xì)胞的抑制作用。
33. —種調(diào)節(jié)T效應(yīng)細(xì)胞中經(jīng)T細(xì)胞受體誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的方法，該方法包括將細(xì)胞與權(quán)利要求1-10或13任一項(xiàng)所述GITR結(jié)合分子進(jìn)行接觸， 從而使T效應(yīng)細(xì)胞中經(jīng)T細(xì)胞受體誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)得到調(diào)節(jié)。
34. 權(quán)利要求33的方法，其中所述I-kB的降解是受到調(diào)節(jié)的。
35. 權(quán)利要求33的方法，其中所述T細(xì)胞是Thl細(xì)胞。
36. 權(quán)利要求35的方法，其中所述T細(xì)胞是CD4+細(xì)胞。
37. 權(quán)利要求35的方法，其中所述T細(xì)胞是CD8+細(xì)胞。
38. —種增強(qiáng)受試者免疫反應(yīng)的方法，該方法包括將細(xì)胞與權(quán)利要求 1-10或13-26任一項(xiàng)所述GITR結(jié)合分子進(jìn)行接觸，從而使受試者的免疫反 應(yīng)增強(qiáng)。
39. —種治療受試者所患癌癥的方法，該方法包括將細(xì)胞與權(quán)利要求 1-10或13-26任一項(xiàng)所述GITR結(jié)合分子進(jìn)行接觸，從而使受試者的癌癥得 到治療。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中所述癌癥的類型選自胰腺癌、黑素瘤、 乳腺癌、肺癌、支氣管癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、尿道膀 胱癌、腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、外周神經(jīng)系統(tǒng)癌、食管癌、宮頸癌、子宮或 子宮內(nèi)膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽管癌、小腸或附件 癌、唾液腺癌、曱狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤以及造血組織的 癌癥。
41. 一種治療受試者體內(nèi)由病原體引起的感染或紊亂的方法，該方法 包括將細(xì)胞與權(quán)利要求1所述GITR結(jié)合分子進(jìn)行接觸，從而使受試者體內(nèi) 由病原物引起的疾病、紊亂或狀況得到治療。
42. 權(quán)利要求41的方法，其中所述病原體是選自下列的病毒HIV、 人皰滲病毒、巨細(xì)胞病毒、輪狀病毒、EB病毒、水痘帶狀皰滲病毒、肝炎 病毒(比如乙肝病毒、曱肝病毒、丙肝病毒和戊肝病毒)、副粘病毒呼吸道 合胞病毒、副流感病毒、麻瘆病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒、黃病毒 和流感病毒。
43. 權(quán)利要求41的方法，其中所述病原體是選自下列的細(xì)菌奈瑟 氏球菌物種、鏈球菌物種、變異鏈球菌、嗜血菌物種'、莫拉氏菌物種、博 德特氏菌物種、分枝桿菌物種、軍團(tuán)菌物種、埃希氏菌物種、弧菌物種、 耶爾森氏菌物種、彎曲菌物種、沙門氏菌物種、李斯特氏菌物種、螺桿菌 物種、假單胞菌物種、葡萄球菌物種、腸球菌物種、梭菌物種、芽孢桿菌物種、棒桿菌物種、疏螺旋體物種、埃里希氏體物種、立克次氏體物種、 衣原體物種、鉤端螺旋體物種、密螺旋體物種。
44. 一種調(diào)節(jié)GITR功能的方法，該方法包括在有刺激劑的情況下， 將人GITR與權(quán)利要求l-10或13-26任一項(xiàng)所述的GITR結(jié)合分子進(jìn)行接觸， 從而使GITR功能得到調(diào)整。
45. —種分離的核酸分子，其包含編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列，所 述序列含有SEQ IDNO:9中的核苷酸58-414。
46. —種分離的核酸分子，其包含編碼輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，所 述序列含有SEQIDNO:IO中的核苷酸61-381。
47. —種分離的核酸分子，其包含編碼至少一個(gè)CDR的核苷酸序列， 所述序列選自SEQ ID NO.:ll、 SEQ ID NO.: 12或SEQ ID NO:65和SEQ ID NO.:13。
48. 權(quán)利要求47的分離的核酸分子，其包含編碼至少兩個(gè)CDR的核香酸序列。
49. 權(quán)利要求47的分離的核酸分子，其包含編碼三個(gè)CDR的核苷酸序列。
50. —種分離的核酸分子，其包含編碼至少一個(gè)CDR的核苷酸序列， 所述序列選自SEQIDNO.:14、 SEQ ID NO.:15和SEQ ID NO.:16。
51. 權(quán)利要求50的分離的核酸分子，其包含編碼至少兩個(gè)CDR的核 苦酸序列。
52. 權(quán)利要求50的分離的核酸分子，其包含編碼三個(gè)CDR的核苷酸序列。
53. —種分離的核酸分子，其包含SEQIDNO: 11、 12或65、 13、 14、15和16所示的核苦酸序列。
54. 重組表達(dá)載體，包含權(quán)利要求45-53任一項(xiàng)所述的核酸分子。
55. 重組表達(dá)載體，其包含核苷酸分子，所述分子具有編碼權(quán)利要求 24所述結(jié)合分子的核苷酸序列。
56. 宿主細(xì)胞，導(dǎo)入了權(quán)利要求55所述的重組表達(dá)載體。
57. —種制備結(jié)合人GITR的GITR結(jié)合分子的方法，該方法包括在 培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求56的宿主細(xì)胞，直至所述細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)合人GITR的 結(jié)合分子。
全文摘要
本發(fā)明提供了特異結(jié)合T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞上的GITR，例如人GITR(hGITR)的結(jié)合分子。本發(fā)明的結(jié)合分子特點(diǎn)在于以高親和性結(jié)合hGITR；在有刺激劑，例如CD3存在的情況下，它是拮抗性的，能夠抵消Treg細(xì)胞對(duì)Teff細(xì)胞的抑制作用。本發(fā)明的多個(gè)方面涉及結(jié)合分子、其藥物組合物，以及用于制備所述結(jié)合分子的核酸、重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。體外或體內(nèi)利用本發(fā)明結(jié)合分子來(lái)探測(cè)人GITR或者調(diào)節(jié)人GITR活性的方法也包括在本發(fā)明內(nèi)。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101218257SQ200680018394
公開(kāi)日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2006年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月25日
發(fā)明者L·M·史密斯, 喬斯·F·龐特, 保羅·波納思, 格雷齊納·齊曼斯卡, 邁克爾·羅森韋格 申請(qǐng)人:托勒克斯股份有限公司