專利名稱：：抗瘧疾疫苗的制作方法抗自疫苗本發(fā)明涉及瘧疾抗原在進行免疫抵御瘧疾感染和疾病中的新用途。本發(fā)明特別涉及子孢子抗原，特別是環(huán)子孢子(cs)蛋白或其免疫原性片段或衍生物，與合適佐劑聯(lián)合免疫將到瘧疾流行區(qū)旅行的未接觸過瘧疾的個體，以抵御瘧疾感染的用途。瘧疾是世界范圍內(nèi)的主要健康問題之一。在20世紀，經(jīng)濟和社會發(fā)展以及抗瘧疾運動已經(jīng)使世界上的大部分地區(qū)都根除了賠疾，受影響的地區(qū)占地球陸地面積的比例從50%減少到27%。盡管如此，考慮到預期人口增長，估計到2010年大概一半的世界人口，接近35億人，將生活在癥疾傳染區(qū)(Hay，2004)?，F(xiàn)在的估測表明每年超過1百萬人死于瘧疾，單是非洲的經(jīng)濟費用就是驚人的(Bremen,2004)。這些數(shù)字突出了全球瘧疾危機和擺在國際健康共同體面前的挑戰(zhàn)。該危機的起因是多重的，iW現(xiàn)有的、負擔的起和先前高效藥物的普遍抗藥性的出現(xiàn)，到醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)的癱瘓和不完善以及資源的缺乏。除非發(fā)現(xiàn)控制這種疾病的途徑，否則改善健康和兒童存活率，減少貧困，增強安全感和強化最脆弱社會的^J求努力將會失敗。癥疾還給那些在瘧疾流行區(qū)旅行或者工作的人帶來危險，這些人通常居住在沒有柜疾的地方。對這類旅行者人群來說危險可能更大，因為他們對來自自然接觸的瘧疾不具有任何基礎(chǔ)免疫。到癥疾流行區(qū)的旅，#遭遇危險的另一個方面是，由于流行性感冒樣癥狀，該疾病在其早期經(jīng)常被誤診。當嚴重程度加重和疤疾最終被確診時，可能就太晚了。在癥狀加重的幾日內(nèi)，就可能導致死亡，例如，源于腦型瘧，或者有時是器官(例如肝或者腎)衰竭。該疾病的一個最急性形式是由原生動物寄生惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)引起的，惡性瘧原蟲導致大多數(shù)屬于瘧疾的死亡。該疾病的另一種形式是由間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax)引起的。間日瘧原蟲(P.vivax)是所有疸疾中分布最廣泛的。除了存在于熱帶和亞熱帶地區(qū)外，該寄生蟲在低至615攝氏度的溫度下完成蚊體內(nèi)循環(huán)的能力使其可以在溫帶氣候中傳播。但由于間日瘧原蟲感染極少致命，控制間日瘧原蟲瘧疾的努力(通過疫苗開發(fā))滯后于惡性癥原蟲(尸./a/c^arww)。30多年前做出的觀察為下列看法提供了有力支持，即最終將開發(fā)出有效的賺疫苗。M31用活的、輻射滅活親子孢子免疫，小鼠和人類可以預防瘧疾。體內(nèi)肝內(nèi)期的維持是產(chǎn)生和保持保護性免疫所需的，但基本機理還沒有完全明確?？贵w、CD8和CD4T細胞已經(jīng)暗示其作為關(guān)鍵效應免疫調(diào)節(jié)物(Hoffinan，1996)。瘧原蟲(例如惡性瘧原蟲或者間日瘧原蟲)的生活周期是復雜的，需要兩個宿主，人和蚊子才能完成。人的感染是由受感染蚊子的唾液中子孢子的接種引起的。子孢子遷移到肝臟，在那里感染肝細胞(肝期)，在肝細胞中通過紅細胞外胞內(nèi)期(exoeiythrocyticintracellularstage)，分化進入裂殖性孢子期(merozDitestage)，裂殖性孢子感染紅細胞(RBC)起始無性血液期(asexualbloodstage)中的循環(huán)復制。M大量RBC中的裂殖性孢子分化成有性期配子體，循環(huán)完成，所述配子體被蚊子攝取，在那里配子體在中腸經(jīng)過一系列階段的發(fā)育產(chǎn)生遷移到唾液腺的子包子。瘧原蟲(例如惡性瘧原蟲或者間日瘧原蟲)的子孢子期已經(jīng)被鑒定為一種疫苗的潛在靶標。已知子孢子的主要表面蛋白是環(huán)子孢子蛋白(CS蛋白)。已經(jīng)對不同株系例如惡性瘧原蟲NF54株克隆3D7進行了該蛋白的克隆、表達和測序(Caspers，1989)。來自3D7株的該蛋白的特征是具有中心免疫顯性重復區(qū)，包括重復40次的四肽^11-^3-^11-Pro,但其中散布4個較少重復的四肽Asn-Val-Asp-Pro。在其他株系中，主要的和較少的重復的數(shù)目以及它們的相對位置是不同的。該中心部分位于N和C末端部分中間，所述N和C末端部分由非重復氨基酸序列組成，其被命名為CS蛋白的無重復部分?；贑S蛋白的葛蘭素史密斯克萊恩生物有限公司的(GlaxoSmiih-KlmeBiologicals')RTS,S自疫苗從1987年開始研發(fā)，是當前研究中最有效的，疫苗(Ballou，2004)。該疫苗特異的以惡性瘧原蟲的紅細胞前期(pre-eiytkocytic)作為靶標。RTS,S/AS02A(RTS,S加佐劑AS02A，佐劑AS02A包括免翻U激劑QS21，3D-MPL和水包油乳劑)被用于在岡比亞進行的連續(xù)I期研究，所述研究包括成人(Doherty,1999)，年齡在6-11禾口1_5歲的兒童(Bojang,2005)，證實該疫苗是安全、良好耐受和產(chǎn)生免疫性的。隨后選擇兒科疫苗齊懂，在包括l-4歲莫桑比克兒童的I期研究中發(fā)現(xiàn)它是安全、良好耐受和產(chǎn)生免疫性的(Macete)。RTS,S/AS02A疫苗在美國和西非地區(qū)的臨床試驗中也顯示明顯功效。RTS,S/AS02A誘導針對惡性瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白顯著的IgG抗體應答和實質(zhì)T細胞免疫(Lalvani，1999;Sun，2003)。在美國未接觸過癥疾的志愿者中進行抗惡性瘧原蟲實驗攻擊的效果，據(jù)估算大約平均是30—50%(Stoute，1997;Stoute，1998;Kester，2001)。這些研究(Stoute,1997)中的第一項在小規(guī)模試驗中86%有效，其中用RTS,S/AS02A免疫的7位個體中有6位得到保護。此外，在岡比亞進行的不完全免疫現(xiàn)場研究(在岡比亞成人中進行的安全性研究(Doherty，1999))顯示在15周的傳染季節(jié)期間內(nèi)，總有效率達34%，在隨后的前9周內(nèi)71%的有效率，此后0。/。的有效率(Bojang，2001)。這些研究(Stoute，1997;Stoute，1998;Bojang，2001;Kester，2001)顯示了抗感染的效果。最近報道了在年幼非洲l兒童中利用RTS,S/AS02A進行試驗的結(jié)果。人們發(fā)現(xiàn)基于CS蛋白的RTS,S疫苗不僅可以預防自然接觸下的感染，而且可以預防惡性瘧原蟲引起的一系列臨床疾病。接種RTS,S疫苗的兒童比對照組的兒童經(jīng)歷更少的嚴重有害事件、住院和嚴重的啟疾并發(fā)癥，包括死亡(Alonso，2004)。此外，RTS,S疫苗抗新感染或者臨床發(fā)作的效果似乎并不減弱或者作用緩慢。在試驗后6個月，疫苗仍然是有效的，因為在感染患病率方面存在顯著差異。這與先前在未接觸過疙疾的志愿者或者岡比亞成人中的試驗相反，先前試驗表明RTS,S的疫苗效果是短暫的(Stoute，1998;Bojang，2001)。此外，在繼續(xù)12個月后，觀察到疫苗抗臨床瘧疾發(fā)作的效果沒有顯著減弱(Alonso，2005)。盡管如上所述的疫苗制劑顯示臨床效果，仍然需要進一步改進，以便增加接受預防個體的數(shù)目以及預防的持久性。新的佐劑制劑，例如包含QS21和3D-MPL的脂質(zhì)體制劑(本文稱為佐劑B)，在不同臨床前和臨床調(diào)查中證實對增強T細胞免疫應答更強的潛能。特別的，對于一個不是來自流行區(qū)但將到瘧疾流行區(qū)做有限時間旅行的人來說，需要的是對感染更好的預防。只有當存在肝臟的增殖性感染時才會出現(xiàn)疸疾的臨床表現(xiàn)，肝臟的增殖性感染導致裂殖性孢子的形成和它們從肝臟期的釋放。這些裂殖性孢子然后感染RBC，起始寄生蟲的致病血液期，弓跑臨床癥狀。如果接觸后沒有增殖性感染(即肝臟未受感染和/或沒有肝裂殖性孢子的釋放)，則這稱為無菌免疫。在蛟叮咬后將顯著斷氐如上定義的增殖性肝感染風險的疫苗，對沒有預先免疫的旅行者群體來說是非常需要的，因為通過阻止增殖性肝感染，疫苗將預防任何繼發(fā)的臨現(xiàn)。這可能與以流行區(qū)的兒童或者成人作為目標的疫苗開發(fā)的目的相反，這種開發(fā)的主要目的是降低疾病的嚴重程度和/或降低發(fā)病數(shù)量，但不需要完全預防它們。理論上，在流行區(qū)的人口中長期地維持無菌保護是不可能的，因此他們需要通過接觸培疾感染建立他們自己的免疫性。此外，對居住在流行區(qū)的人口給予長期但有限時段的無菌保護也不是可取的。本文中我們描述了在未接觸過皰疾的群體中由RTS,S/AS02A相對包含不同的佐劑(佐劑B)的RTS,S頭對頭(headtohead)比較組成的攻擊臨床試驗，所述佐劑是包含QS21和3D-MPL的含有膽固醇的脂質(zhì)體制劑(參見實施例)。對T-和B-細胞介導的免疫均進行了研究。結(jié)果顯示在未接觸過皰疾的成年群體中，在瘧疾攻擊后預防增殖性肝感染方面，RT5,S抗原與佐劑B組合比RTS,S/AS02A的有效率高50%。因此，RT5,S抗原與佐劑B組合對無菌保護是更有效的，到自流行區(qū)旅行的未接觸過瘧疾的個體需要無菌保護。這種增強的效果源于佐劑B增強抗原特異性免疫應答(抗體和CD4-ThlT細胞)。因此本發(fā)明提供一種瘧原蟲抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于免疫到流行區(qū)的旅行者以抵御增殖性癥疾感染，所述佐劑是包括脂質(zhì)A(lipidA)衍生物和皂苷的脂質(zhì)體制劑。通常，到流行區(qū)的旅行者都是未接觸過癥疾的。因此，本發(fā)明適用于未接觸過瘧疾的個體。本發(fā)明尤其涉及降低到流行區(qū)的旅行者中增殖性頓感染的發(fā)病率，旅行者可以是任何年齡的，但尤其是成人。本發(fā)明的第二個方面提供一種包括瘧原蟲抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐劑的制劑，所述佐劑是包括脂質(zhì)A衍生物和皂苷柳旨質(zhì)體制劑，用于免疫到流行區(qū)的旅行者以抵御增殖性賺感染。本發(fā)明的第三個方面提供一種在流行區(qū)的旅行者中預防增殖性瘧疾感染的方法，包括施用適量制劑，所述制劑包括瘧原蟲抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐劑，所述佐劑是包括脂質(zhì)A衍生物和皂苷的脂質(zhì)體制劑。在本發(fā)明的一個實施例中，瘧原蟲抗原是惡性瘧原蟲抗原。在本發(fā)明的另一個實施例中，瘧原蟲抗原是間日瘧原蟲抗原。合適地，抗原是紅細胞前期抗原?？乖梢岳邕x自在寄生蟲的子孢子期或者其他紅細胞前期例如肝臟期表達的任意抗原。例如抗原可以選自環(huán)子孢子(CS)蛋白，肝期抗原(liverstageantigen)-l(LSA-l)(參見例如WO2004/044167),肝期抗原-3(LSA-3)(例如描述于EP0570489和EP0833917)，Pfs16kD(描述于W091/18922和EP597843),輸出抗原(Exportedantigen)-l(Exp-l)(例如描述于MeraM等人2002,ParasiteImmunolvol24(3):141)，子孢子-蘇氨酸-天門冬,安-富集蛋白(STARP)，子孢子和肝期抗原(SALSA),血小板反應素相關(guān)蛋白(thrombospondinrelatedanonymousprotein,TRAP)(描述于WO90/01496,W091/11516和W092/11868)和尖端裂殖性孢子抗原(apicalmerezoiteantigen-l,AMA-l)(描述于EP0372019)，它們最近顯示存在于肝期(除紅細胞內(nèi)期之外)。所有這些抗原都是本領(lǐng)域公知的?？乖梢允峭暾牡鞍谆蚱涿庖咴云位蛘呱鲜鋈我环N的衍生物。啟疾抗原的免疫原性片段是公知的，例如AMA-1的胞外域(例如描述于WO02/077195)。衍生物包括例如與其他蛋白融合，其他蛋白可以是疙疾蛋白或者非柜疾蛋白例如HBsAg。本發(fā)明的衍生物能夠激發(fā)抵御天然抗原的免疫應答。瘧原蟲抗原可以與乙型肝炎的表面抗原(HBsAg)融合。本發(fā)明使用的一種具體抗原來源于環(huán)子孢子(CS)蛋白，可以采用與HBsAg雜合蛋白的形式?？乖梢允峭暾腃S蛋白或者其一部分，包括CS蛋白的一個片段或者一些片段，其中這些片段可以融合?；贑S蛋白的抗原可以采用雜合蛋白的形式，包括基本上全部的瘧原蟲CS蛋白C末端部分，4個或者更多CS蛋白免疫顯性區(qū)的串聯(lián)重復，和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。雜合蛋白可以包括一個包含至少160個氨基酸并且基本上與CS蛋白的C末端部分同源的序列。特別的，"基本上全部"CS蛋白的C末端部，括缺少gl7K性錨定序列的C末端。此外，就惡性皰原蟲的抗原而言，它包括4個或者更多，例如10個或者更多，Asn-Ala-Asn-四肽重復模體。CS蛋白可以缺失C末端最后12個氨基酸。本發(fā)明使用的雜合蛋白可以是包括惡性瘧原蟲CS蛋白一部分的蛋白，CS蛋白的這個部分基本上對應于惡性瘧原蟲3D7克隆的207-395位氨基酸，來自ffiii線性接頭與HBsAg的N端符合讀框地(inframe)融合的NF54株(Caspers，1989)。接頭可以包括來自HBsAg的preS2的一部分。本發(fā)明使用的CS構(gòu)建Wf述于WO93/10152。一種特異的構(gòu)建體是稱為RTS的雜合蛋白，在W093/10152(其中它被標注為RTS*)和WO98/05355中有描述，這兩篇在此整體引入作為參考。本發(fā)明使用的特異雜合蛋白是稱為RTS的雜合蛋白，RTS由下歹,質(zhì)組成得自釀酒酵母(Sacchromyescerevisiae)TDH3基因序列的1059到1061位核苷酸編碼的甲硫氨酸殘基。(Musti,1983)。得自用于構(gòu)建雜交基因的克隆過程產(chǎn)生的核苷序列(1062到1070)的3個氨基酸，MetAlaPro。核苷酸1071到1637位編碼的189個氨基酸的一段序列代表惡性瘧原蟲3D7株的環(huán)子孢子蛋白(CSP)的207至lj395位氨基酸(Caspers，1989)。用于構(gòu)建雜交基因的克隆過程編碼的核苷酸1638到1640位的氨基酸(Gly)。1641到1652位核苷酸編碼的4個氨基酸，ProValThrAsn，代表乙型肝炎病毒adw血清型)pres2蛋白的4個羧基末端殘基(Valenzuela，1979)。核苷酸1653到2330位編碼的226個氨基酸的一辦列，指定是乙型肝炎病毒(adw血清型)的S蛋白。RTS可以是RTS,S混合顆粒的形式。RTS,S顆粒包括兩個多肽RTS和S，RTS和S可以同時合成并自發(fā)形成組合微粒結(jié)構(gòu)(RTS,S)，例如在純化期間。RTS蛋白可以在酵母，例如釀酒酵母(Sce"v/由e)中表達。在這類宿主中，RTS將表達為脂蛋白顆粒。受體酵母菌株可以在其基因組中攜帶乙型肝炎S表達盒的幾個整合拷貝。所獲菌株因此合成兩個多肽S和RTS，這兩個多肽自發(fā)地共組裝成混合(RTS，S)脂蛋白顆粒。這些顆粒可以在它們的表面呈現(xiàn)雜交分子的CSP序列。這些混合顆粒中的RTS和S可以特定比例存在，例如1:4。在本發(fā)明中其他癥疾抗原或者其片段或其衍生物的用途也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。其他的紅細胞前期抗原例如AMA-1，LSA-1，LSA-3(例如描述于EP0570489和EP0833917)和Pfs16kD，可以與RTS,S聯(lián)用。此外，RTS,S與血液期抗原例如裂殖性孢子表面蛋白-1(MSP-1)(例如描述于US4,837,016)、紅細胞結(jié)合抗原-175(EBA-175)或者MSP—3(例如描述于EP0666916)聯(lián)用。本文所述的任意抗原的免疫原性片段將包括至少一個抗原表位，并顯示皰疾抗原性，當存在于合適構(gòu)建體，例如融合到其他疫疾抗原或者其他非抗原或者存在于載體時，能夠激發(fā)免疫應答，該免疫應答針對天然抗原。通常免疫原性片段包括來自瘧疾抗原的至少20，或者至少50，或者至少100個連續(xù)氨基酸。本文所述的抗原或其片段的衍生物類似地將包括至少一個抗原表位，并顯示瘧疾抗原性，能夠激發(fā)免疫應答，該免疫應答針對天然抗原。衍生物包括例如瘧疾抗原與另一種蛋白的融合，該蛋白可能是也可能不是另一種瘧疾蛋白，可以是例如HBsAg。根據(jù)本發(fā)明，純化的雜合蛋白水溶液可以直接使用，并與本發(fā)明的合適佐劑組合。或者，該蛋白可以在與佐劑混合前凍干。佐劑可以是一種液體，因此可用于將抗原重組成液體疫苗形式。因此本發(fā)明還提供如本文所述的瘧原蟲抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐劑在制備用于免疫到流行區(qū)的旅行者以抵御瘧疾感染的試劑盒中的用途，所述佐劑是包括脂質(zhì)A衍生物和皂苷的脂質(zhì)體制劑，其中提供的抗原是凍干形式，抗原和佐劑在施用前混合。根據(jù)本發(fā)明的疫苗劑量可以在每劑量1-100微克RTS，S之間，例如25到75微克RTS,S，例如一次劑量50微克RTS,S，其可以存在于500微升中(最終液體制劑)。這是供成人使用的合適劑量。供兒童使用的合適劑量是成人劑量的一半，即25微克RTS,S，其可以存在于250微升中(最終液體制劑)。相似的劑量可以用于其他抗原。本發(fā)明的抗原與佐劑組合，所述佐劑是包括脂質(zhì)A衍生物和皂苷的脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明的合適佐劑是來自任意來源的脫毒脂質(zhì)A和脂質(zhì)A的無毒衍生物，它是Thl細胞應答的優(yōu)i^lj激劑(本文也稱為Thl型應答)。免疫應答可以大致分為兩個大類，體液或者細胞介導的免疫應答(通常分別表征為保護的抗體機制和細胞效應機理)。這些類型的應答被稱為Thl型應答(細胞介導的應答)和Th2型免疫應答(#答)。極端Thl型免疫應答可以表征為抗原特異的、單倍型限制的細胞毒T淋巴細胞和天然殺傷細胞應答的產(chǎn)生。在小鼠中，Thl型應答通常表征為IgG2a亞型抗體的產(chǎn)生，而在人中這些對應于IgGl型抗體。Th2型免疫應答表征為一系列免疫球蛋白同種型的產(chǎn)生，包括小鼠中的IgGl。人們認為這兩種類型免ffi答發(fā)展背后的推動力是細胞因子。高水平的Thl型細胞因子傾向于誘導針對給定抗原的細胞介導的免疫應答，而高水平的Th2型細胞因子貝,向于誘導針對抗原的體液免^答。Thl和Th2型免疫應答的區(qū)另杯是鄉(xiāng)樹的，可以采取這兩種極端間的連續(xù)形式。實際上，個懶每支持被描述為主要的Thl或者主要的Th2的免疫應答。但是，常常方便的依據(jù)Mosmann和Coffinan在小鼠CD4+veT細胞克隆中的描述來考慮細胞因子家族(Mosmann，1989)。通常，Thl型應答與T淋巴細胞產(chǎn)生的INF-Y細胞因子有關(guān)。通常與Thl型免疫應答的誘導直接相關(guān)的其他細胞因子不是由T細胞產(chǎn)生的，例如EL-12。相反，Th2型應答與IL4,IL-5,EL-6,IL"IO和腫瘤壞死因子-P(TNF-beta)的分泌相關(guān)。眾所周知某些疫苗佐劑特別適合于刺激Thl或者Th2型細胞因子應答。通常，疫苗接種或者感染后免疫應答Thl:Th2平衡的指示包括，體外抗原再刺激后T淋巴細胞產(chǎn)生Thl或者Th2細胞因子的直接測量，禾Q/或抗原特異抗體應答的lgGl:IgG2a比例的檢測(至少在小鼠中)。因此，Thl型佐劑是一種刺激獨立T細胞ffiE接受體外抗原再刺激后產(chǎn)生高水平的Thl型細胞因子的佐劑，該佐劑還誘導與Thl型同種型相關(guān)的抗原特異免疫球蛋白應答。能夠優(yōu)先的刺激Thl細胞應答的佐劑描述于WO94/00153和WO95/17209。很早就已經(jīng)知道腸道菌脂多糖(LPS)是免疫系統(tǒng)的有效刺激劑，雖然因為毒性其作為佐劑的用途已經(jīng)減少。通過從還原端葡糖胺去除核心糖類基團和磷酸酯產(chǎn)生的LPS的無毒衍生物，單磷酸脂A(MPL)，已經(jīng)有相對艮道(Ribi，1986)，并具有下列結(jié)構(gòu):<formula>seeoriginaldocumentpage14</formula>MPL的其他脫毒形式源自從二糖骨架的3-位置去除?；?，被稱為3-0-脫?；鶈瘟姿嶂珹(3D-MPL)。可以根據(jù)GB2122204B教導的方法純化和制備3-0-脫酰單磷翻旨A，該參考文獻還公開了二磷翻旨A和其3-0-脫酰變體的制備。本發(fā)明使用的3D-MPL的特殊形式是乳劑形式，其微粒直徑小于0.2微米，W094/21292公開了其制備方法。WO98/43670已經(jīng)描述了包括單磷酸脂A和表面活性劑的水劑。本發(fā)明使用的細菌脂多糖來源的佐劑可以從細菌來源純化和制備，或者它們也可以是合成的。例如，Ribi等人(Ribi，1986)描述了純化的單磷酸脂A，GB2220211和US4912094描述了來源于沙門氏菌(Salmonellasp)的3-0-脫酰單磷酸或者二磷翻旨A。其他純化和合成的脂多糖也已經(jīng)有描述(Hilgers，1986;Hilgers，1987;EP0549074B1)。本發(fā)明使用的一個特異細菌脂多糖是3D-MPL。因此，可用于本發(fā)明的LPS衍生物是那些與LPS或者MPL或者3D-MPL結(jié)構(gòu)相似的免自微劑。在另一種選擇中，LPS衍生物可以是?；瘑翁?，這是MPLi上述結(jié)構(gòu)的亞基。皂苷也是Thl免疫激劑。皂苷是公知的佐劑(Lacaille-Dubois，1996)。本發(fā)明使用的合適皂苷包括免疫活性皂苷，例如，QuilA(來源于南美QuillajaSaponanaMobna樹的樹皮)，及其免疫活性部分，描述于US5,057,540和"Sapo扁asvaccineadjuvants"(Kensil，1996)和EP036227犯1。溶血皂苷QS21和QS17(QmlA的HPLC純化部分)已經(jīng)被描述為有效的全身性佐劑，美國專利號5,057,540和EP0362279B1公開了它們的生產(chǎn)方法。這些參考文,描述了QS7(Quil-A的非溶血部分)的用途，QS7是全身性疫苗的有效佐劑。Kensil等人(Kensil，1991)也描述了QS21的用途。QS21和聚山梨酯80或者環(huán)糊精的組合也是已知的(WO99/10008)。W096/33739和W096/11711描述了包括QuilA部分例如QS21和QS7的微粒佐劑系統(tǒng)。用于本發(fā)明的上述脂多糖和阜苷免M微劑與脂質(zhì)體載體一起配制。例如，如W096/33739所述，載體可以由含有膽固醇的脂質(zhì)體組成。單磷酸脂A和皂苷衍生物的組合描述于WO94/00153;WO95/17210;W096/33739;W098/56414;W099/12565;W099/11241,QS21禾口3D誦MPL的組合公開于WO94/00153。因此，本發(fā)明〗頓的合適佐劑系統(tǒng)包括，例如，單磷酸脂A，例如3D-MPL，與皂苷衍生物的組合，尤其是WO94/00153公開的QS21和3D-MPL的組合。佐劑系統(tǒng)包括脂質(zhì)體載體，例如含有膽固醇的脂質(zhì)體，例如W096/33739公開的在組合物中，QS21在含有膽固醇的脂質(zhì)體(DQ)中被淬滅。因此如W096/33739所述，皂苷例如QS21可能存在于脂質(zhì)體膜上或者與脂質(zhì)體膜結(jié)合。3D-MPL或者其他脂質(zhì)A衍生物可以固定于脂質(zhì)體膜，或者出現(xiàn)在脂質(zhì)體外，或者兩種情況都存在。本發(fā)明使用的一種特殊佐劑包括兩種免疫刺激劑QS21和3D-MPL，在含有膽固醇的脂質(zhì)體制劑中，其中3D-MPL位于脂質(zhì)體內(nèi)，而QS21與脂質(zhì)體結(jié)合。選擇各個疫苗劑量中存在的本發(fā)明蛋白的量為誘導免疫保護應答而沒有典型疫苗中顯著不良副作用的量。這種量將根據(jù)所使用的具體免疫原和具體佐劑而不同。通常，可以預期每次劑量將含有1-1000tt克蛋白，例如1-200微克，例如10-100微克。特殊疫苗最適量可以通過標準研究確定，包括觀察受試者的抗體滴度和其他應答來確定。本發(fā)明使用的合適免疫方案是到瘧疾流行區(qū)旅行前的初始免疫，這可以在到達該區(qū)域前例如至少2-4周完成。這個初始免疫可能包括1到3次齊l遣，例如2次或者3次劑量，在施用各次劑量之間間隔至少7天，或者1到4周之間或者例如1個月。只要感染風險仍然存在，在初始免疫后，可以每隔6個月重復力口強。在反復到流行區(qū)旅行前進行周期性加強免疫是合適的。每次劑量中RT5,S蛋白的合適量如本文上面所述。本發(fā)明的疫苗可以M任意各種途徑施用，例如口服的、局部的、皮下的、粘膜的(通常陰道內(nèi)的)、靜脈的、肌肉的、鼻內(nèi)的、舌下的、真皮內(nèi)的和通過栓劑。本發(fā)明還可用于，初始-加強(prime-boost)療法。替代或者除了包含RTS,S或者其他多肽的組合物的重復劑量之外，不同形式的疫苗可以采用異源"初始-加強"免疫方式施用。初始組合物和加強組合物應具有至少一個共同抗原，盡管它不需要是相同形式的抗原；它可能是相同抗原的不同形式。本發(fā)明的初始-加強免疫可以利用蛋白和多核苷酸的組合進行，尤其是基于DNA的制劑。這樣一個策略被認為可有效誘導廣譜免疫應答。佐劑化蛋白疫苗主要誘導抗體和T輔助免疫應答，而作為質(zhì)粒或者活載體輸送的DNA誘導強的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答。因此，蛋白和DNA免疫的組合可適用于廣譜的免疫應答。因此本發(fā)明還提供如本文所述的瘧原蟲抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐劑，以及編碼瘧原蟲抗原或者其免疫原性片段或其衍生物的多核苷酸，在制備用于免疫到流行區(qū)的旅行者以抵御增殖性賺感染的試劑盒中的用途，所述佐劑是包括脂質(zhì)A衍生物和皂苷的脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明還提供一種試劑盒，包括以凍干形式提供的瘧原蟲抗原或者其免疫原性片段或其衍生物，包括脂質(zhì)A衍生物和阜苷的脂質(zhì)體劑型的佐劑，和說明書，該說明書詳細說明在施用到流行區(qū)的旅行者前將抗原、佐劑和可選的載體混合，從而保護所述旅行者免于增殖性瘧疾感染。因此當RTS,S或者另一種基于CS蛋白的多肽被用作初始-加強療法的多肽組分時，多核苷酸組分將編碼CS蛋白或者其免疫原性片段或其衍生物。DNA可以作為裸DNA例如質(zhì)粒DNA輸送，或者采用重組活載體的形式。本發(fā)明使用的活載體可以是復制缺陷型的。可使用活載體的實例是痘病毒載體，包括修飾的痘病毒載體，例如修飾的病毒安卡拉(ModifiedVirusAnkara,MVA)，甲病毒載體例如VenezuelianEquineEncephalitis病毒載體，或者腺病毒載體例如非人類腺病毒載體例如黑猩猩腺病毒載體，或者任意其他合適的活載體。在本發(fā)明初始-加強疫苗中作為活載體使用的合適腺病毒是一種低血清陽性率的人腺病毒，例如Ad5或者Ad35，或者非人，源腺病毒例如非人類靈長類動物腺病毒例如猿腺病毒。載體可以是復制缺陷型的。通常這些病毒含有E1缺陷，可以在轉(zhuǎn)化了E1基因的細胞系中生長。合適的猿腺病毒是從黑猩猩分離的病毒。尤其是，C68(也稱為Pan9)(參見美國專利號6083716)和Pan5,6和Pan7(WO03/046124)也可在本發(fā)明中使用。因此可以對這些載體進行操作以插A^發(fā)明的異源多核苷酸，以便能夠表達本發(fā)明的多肽。這類重組腺病毒載體的使用、制劑和制備詳細描述于W003/046142?？梢栽谧⑸涞鞍卓乖淮位蛘邤?shù)次后，施用一次或者多次DNA，或者首先施用一次或者多次DNA，然后進行一次或者多次蛋白免疫。首先施用DNA，然后施用蛋白可能是有益的。因此本發(fā)明初始-加強免疫的一W寺定實施例涉及用單一齊糧的多核苷酸初始免疫，該多核苷用例如上述任意的重組活載體形式，然后使用一次或者多次齊懂的，例如2次或者3次劑量的，佐齊U化蛋白例如RTS,S與本文描述的佐齊叻膙免疫。該多核苷酸編碼相同的蛋白(例如CS蛋白)或者其免疫原性片段或其衍生物。因此本發(fā)明還提供一種藥物試劑盒，包括a)瘧原蟲抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐劑，所述佐劑是包括脂質(zhì)A衍生物和皂苷棚旨質(zhì)體制劑，禾口b)編碼瘧原蟲抗原或者其免疫原性片段或其衍生物的多核苷酸；其中a)和b)可以按任意次序順序使用，但特別的，其中b)被用作初始而a)被用作加強。本發(fā)明還提供所述試劑盒的說明書，說明關(guān)于a)，在給到流行區(qū)的旅fi^"施用前，混合抗原、佐劑和可選的載體。組合物a)可以是在本文所述合適佐劑中的任意本文所述多肽組合物。例如a)可以是包括RTS，S和佐劑的組合物，所述佐劑是包括QS21和3D-MPL的脂質(zhì)體制劑，和b)可以是本文描述的活載體例如腺病毒載體，例如黑猩猩腺病毒載體，編碼CS蛋白或者其免疫原性片段或其衍生物。初始組合物和加強組合物可以施用不止一次劑量。此外，初始引發(fā)和加強劑量后可以采用更高的劑量，這可以交替以產(chǎn)生例如DNA初始/蛋白加衝更高的DNA劑獻更高的蛋白劑量。本發(fā)明使用的合適的藥學上可接受的稀釋劑或者賦形劑是本領(lǐng)域公知的，包括例如7jC或者緩沖液。疫苗制備方法被廣泛報道(Powell,1995;Voller，1978)。例如Fullerton，美國專利4,235,877描述了月旨質(zhì)體內(nèi)的包裹。例如Likhite，美國專利4,372,945和Armor等人，美國專利4,474,757公開了蛋白與高分子的結(jié)合。在另一方面，本發(fā)明提供一種在給個體施用瘧疾抗原組合物，尤其是紅細胞前期瘧疾抗原組合物后，檢測個體是否預防皰疾的方法，該方纟跑括檢測個體中激發(fā)的賠疾抗原特異的CD4T細胞水平。本發(fā)明還提供一種在給個體施用瘧疾抗原組合物，尤其是紅細胞前期癥疾抗原組合物后，檢測個體是否預防瘧疾的方法，該方法包括檢測個體中激發(fā)的瘧疾抗原特異的抗體濃度。在另一方面，本發(fā)明提供一種評價纟，疫苗，尤其是紅細胞前期候選疫苗，預防賠疾的效果的方法，該方法包括檢觀U個體中激發(fā)的抗候選疫苗的CD4細胞水平。在另一方面，本發(fā)明提供一種評價候選疫苗，尤其是紅細胞前期特異抗體候選疫苗，預防瘧疾的效果的方法，該方法包括檢測個體中激發(fā)的抗候選疫苗的特異抗體濃度。在更具體的實施例中，這類疫苗包括瘧原蟲抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐劑，所述佐齊提包括脂質(zhì)A衍生物和皂苷的脂質(zhì)體制劑。實施例實施例1:使用RTS，S和佐劑B的免疫和實驗性驗攻擊。疫苗RTS,S:RTS是含424個氨基酸(a.a.)的51kDa雜合多肽,連，由來源于寄生惡性瘧原蟲NF54株(CSP抗原，氨基酸207到395)的子孢子表面抗原(CS蛋白中心串驢復和羧基末端區(qū)域，總共189個^^酸)融合到乙型肝炎病毒S蛋白的氨基末端組成。S是對應于乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的24kDa的多肽(長226氨基酸)，用作GSKBiologicalsEngerix-B⑧疫苗中的抗原。這兩個蛋白在酵母(釀酒酵母(S.cwev&ae))胞內(nèi)產(chǎn)生，自發(fā)組裝成混合聚合微粒結(jié)構(gòu)，該微粒結(jié)構(gòu)估計包含大約100個多肽。WO93/10152描述了RTS,S的制備。RTS,S/AS02A(GlaxoSmithKlineBiologjcals,RixensaitBelgium)的完整劑量，包含構(gòu)建于500微升AS02A佐劑-水包油乳劑中的50微克凍干RTS,S抗原，AS02A佐劑-7j^包油乳劑包含免翻ij激劑3D-MPL(GlaxoSmithKlineBiologicals,Montana,USA)和QS21各50微克。RTS,S/佐劑B(GlaxoSmithKlineBiologicals,Rixens賊Bdgium)的完整劑量，包含構(gòu)建于500微升佐劑B中的50微克凍干RTS，S抗原，佐劑B是包含免疫刺激劑3D-MPL(GlaxoSmithKlineBiologicals,Montana^USA)和QS21(各50微克)的含有膽固醇柳旨質(zhì)體制劑。可以從有機翻'沖的脫油磷脂醐旦堿(DOPC)、膽固醇和3D-MPL的混合物制備脂質(zhì)體，其中混合物被脫水。然后添加ZK溶液以懸浮脂質(zhì)。懸浮液被微流體化(microfluidised)，直至鵬質(zhì)體大小縮小到可以無菌土過0.2,濾器。通常膽固醇磷脂Stl旦堿比例是l:4(w/w)，添加水溶液到最終膽固醇濃度為5到50毫彌毫升。添加QS21到包含膽固醇的脂質(zhì)體中。方法該臨床試驗評價一種痏疾疫苗的安全性，致反應力，免疫原性和初步效果，所述痏疾疫苗包含抗原RTS,S并添加AS02A或者佐劑B。103位受試者被分為兩組，根據(jù)0、1、2個月免疫方案隨機接種3次齊糧的任一疫苗。因為涉及大量受試者，所招募的各組依次接受抗原攻擊。各個組中，第3次劑量后，志愿者被要求接受標準化初始瘧疾攻擊(CMay，1986)2到4周。初始攻擊包括讓5只感染惡性瘧原蟲子孢子的斑須按蚊C4wqp/^fe^艦ve腦mosquitos)對攻擊志愿者叮咬5辦中。每組中，12個未免疫的對照志愿者也被攻擊。在初始攻擊大概6個月后，在初始攻擊中受到保護的志愿者被要求接受重復攻擊。在攻擊之間沒有施用額外劑量的疫苗。重復攻擊按照初始攻擊的方式進行。每組中，6個未免疫對照志愿者也被攻擊。在每次攻擊后的至少30天內(nèi)，每天檢測受試者是否被感染。檢測感染的主要方法是鑒定Giesma染色外周血涂片，M31光學顯微鏡檢測無性期寄生蟲。^示受試者已經(jīng)遭受增殖性感染，寄生蟲已經(jīng)Ay干臟釋放并iSA紅細胞內(nèi)期。因此沒有實現(xiàn)抵御攻擊的無菌保護。一旦出現(xiàn)感染癥狀時，受試者被宣布為瘧疾陽性的，接受治療量的氯喹。主要療效體現(xiàn)為無菌保護，即受試者從不發(fā)生無性期寄生蟲血癥(parasitaemia)。此外，記錄在攻擊和那些未被完全保護的受試者中出現(xiàn)寄生蟲血癥之間的時間。此外，在免疫前、n次免疫后2周和m次免疫后14-28天(攻擊日期DOC)，收集外周血單核細胞(PBMC)樣品。通過細胞因子流式細胞儀，檢測PBMCs樣品中的CD4和CD8T細胞應答。流式細胞技術(shù)可以對給定抗原特異的T細胞定量。細胞表型進行常規(guī)免疫熒光標記以及產(chǎn)生胞內(nèi)細胞因子后，通過流式細胞儀計數(shù)抗原特異的CD4和CD8T細胞。簡單來說，當與其相應抗原孵育時，夕卜周血中抗原特異的CD4和CD8T細胞可以在體外被再次刺激，產(chǎn)生IL-2、CD40L、TNF-a或者IFN-Y。肽的HBs(乙型肝炎表面抗原)和CSP庫都可用作再刺激抗原特異T細胞的抗原。結(jié)果可以表示為CD4或者CD8T細胞亞群中表達CD40L、IL-2、TNF-a或者IFN-Y中至少兩個不同細胞因子的CD4或者CD8T細胞的表達頻率。利用重組蛋白R32LR作為捕獲抗原的標準ELISA方法檢測對惡性瘧原蟲CS重復區(qū)的抗體(IgG)應答，確定抗體水平。簡單的說，在96孔板上包被R32LR蛋白[對應于惡性瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白(CSP)的重復區(qū)(NANP)]。在板被t包和后，直接向板上添加血清樣品的連纟釋液。血清樣品中的R32LR抗懶每結(jié)合預包被的R32LR。洗板。添加過氧化物酶標記的山羊抗人IgG(Y)，它將結(jié)合抗CSIgG抗體。在另一個洗滌步驟后，過氧化物酶特異生色底物的添加提供一種檢測與預包被抗原結(jié)合的抗CSIgG的方法。過氧化物Hf崔化顯色反應。形成的顏色強度與血清中含有的抗CSIgG抗體的滴度成正比。相對每塊板上的已知的血清標準確定抗重復抗體水平，表示為微彌毫升。結(jié)果組1<table><row><column>佐劑</column><column>接受免疫的志愿者數(shù)目</column><column>接受攻擊的志愿者數(shù)目(受保護的數(shù)目)</column><column>接受再攻擊的志愿者數(shù)目(受保護的數(shù)目)</column></row><row><column>佐劑B</column><column>26</column><column>17(10)</column><column>5(3)</column></row><row><column>AS02A</column><column>25</column><column>24(9)</column><column>5(1)</column></row><row><column>TOTAL:</column><column>51</column><column>41</column><column>10</column></row><table>組2:<table><row><column>佐劑</column><column>接受免疫的志愿者數(shù)目</column><column>接受攻擊的志愿者數(shù)目(受保護的數(shù)目)</column><column>接受再攻擊的志愿者數(shù)目(受保護的數(shù)目)</column></row><row><column>佐劑B</column><column>數(shù)字未提供</column><column>19(8)</column><column>未進行</column></row><row><column>AS02A</column><column>數(shù)字未提供</column><column>20(5)</column><column>未進行</column></row><row><column>總數(shù)</column><column>52</column><column>39</column><column></column></row><table>對于初始攻擊的組1&2組合:<table><row><column>佐劑</column><column>接受免疫和攻擊的志愿者數(shù)目(初始攻擊)</column><column>受保護的志愿者數(shù)目</column><column>受感染的志愿者數(shù)目</column><column>疫苗有效率</column></row><row><column>佐劑B</column><column>36</column><column>18</column><column>18</column><column>50%</column></row><row><column>AS02A</column><column>44</column><column>14</column><column>30</column><column>32%</column></row><table>因此在這項逸驗中，佐劑B離多更有效的保護未接觸過皰疾的個術(shù)氐御癥疾感染。佐劑B組50。/。的受攻擊個體得到保護，AS02A組32%的受攻擊個體得到保護。這4樣兩種佐齊胸保護的提高超過50%。此外，在組l中，發(fā)現(xiàn)佐劑B比AS02A能夠更高效的誘導針對RTS，S中抗原的CD4T細胞應答(圖l，p=0.01663)。組1和2的組合數(shù)據(jù)是不顯著的(圖2，p=0.07)。在免疫前，沒有可檢測的針對HBs或者CSP的CD4/CD8T細胞應答。與此相反，在n次免疫后2周以及m次免疫后2周(doc:攻擊日期)，在大多數(shù)接種兩種制劑的個體中發(fā)現(xiàn)HBs和CSP特異的CD4T細胞。在相同時間點，沒有觀察到可檢測的CD8T細胞應答。這些觀察證明用于T細胞免g控的方法是特異和敏感的，而這是在接受不同疫苗制齊啲組間進行正式比較的前提條件。圖1顯示在n次免疫后和m次免疫后2周(DOC)，組1中接種RTS,S/佐劑B的個體相對那些接種RTS,S/AS02A的個體具有更高頻率的CSP特異的CD4T細胞。對HBs特異的CD4T細胞可以得出相似的結(jié)論，該細胞在n次免疫后2周產(chǎn)生,-Y和另一種來自IL-2、CD40L、TNF-a其中之一的細胞因子(數(shù)據(jù)未顯示)。圖2顯示和圖1相同的研究，只是其包含兩組的數(shù)據(jù)。在圖1和2中，結(jié)果可以表示為106個CD4T細胞中表達CD40L、IL-2、TNF-a或者IFN-y中至少兩個不同細胞因子的CD4T細胞的表達頻率。在抗CSP特異抗體應答中可以看到相似的圖象。從圖5可知RTS,S/佐劑B激發(fā)的抗體濃度顯著大于RTS,S/AS02A激發(fā)的濃度(特別參見DOC—m次免疫后2周(P=0.00793)，但II次免疫后2周的效果顯著)。結(jié)果表示為幾何平均濃度(GMC)。前(Pre)是指施用任意劑量前的起始時間點。Ml是指第一次劑量后2周的時間點。M2是指第二次劑量后2周的時間點。DOC是指"攻擊的日期"，是第三次劑量后2周。抵御瘧疾攻擊的保護與顯著更高的CD4T細胞應答和對CSP的特異抗體應答有關(guān)。RTS,S/佐劑B相對RTS,S/AS02A免疫原性的增強并不一定表祐將轉(zhuǎn)化成生物相關(guān)的效果。但是，本試驗中接種RTS,S/佐劑B的個體(36位個體中的18位50X)相對那些接種RTS,S/AS02A的個體(44位個體中的14位32%)，顯示抵御瘧疾攻擊保護水平的提高。因此發(fā)現(xiàn)了CD4T細胞應答變幅和對瘧疾的防護之間的可能聯(lián)系。如果戰(zhàn)假設(shè)成立，受保護的個體比接種RTS,S/AS02A或者甚至比RTS,S/佐劑B的個體具有更高的CD4T細胞應答。分別針對第1組和合并組(和兩個佐劑組庫)的圖3和4，明確的證實了上述假設(shè)，并支持以下觀點，即CSP特異的CD4T細胞在保護作用中起重要作用。與此一致，對II次免疫后2周以及m次免疫后2周收集樣品的統(tǒng)計分析證明受保護和未受保護的個體間頻率的差異是統(tǒng)計上有顯著意義的。在圖3和4中，結(jié)果可以表示為106個CD4T細胞中表達CD40L、IL~2、TNF-a或者IFN-Y中至少兩個不同細胞因子的CD4T細胞的表達頻率。免疫原性分析還顯示，與CSP特異的CD4T細胞相反，HBs特異的CD4T細胞與n次免疫后2周以及m次免疫后2周的抵御疤疾的保護作用無關(guān)(分別為p=0.14和p=053)。鄉(xiāng)一步證實了戰(zhàn)結(jié)果的可靠性，強烈表明保護作用是與能夠識別CSP而不是HBs肽的CD4T細胞的存在特異相關(guān)的。最后，因為沒有可檢測的CD8T細胞應答，還可以得出結(jié)論，即最有可能的是，用佐劑B或者AS02A佐劑化的RTS,S弓撥的疤疾紅細胞前期保護不像是因為免疫后CSP特異的CD8T細胞的誘導造成的。在監(jiān)控抗CSP抗體應答中可以觀察到相似的圖象。圖6顯示受保護和未受保護個體中的抗體濃度(結(jié)果涉及使用兩種佐劑組庫的兩個組)。很明顯那些受保護的個體比那些未受保護的個體顯示明顯更高的抗體濃度(P<O.0001)。討論上述結(jié)果一方面清楚表明CSP特異的CD4T細胞和抗體應答之間的關(guān)聯(lián)，另一方面表明存在抵御攻擊的保護狀態(tài)。CSP特異的CD4T細胞或者抗體產(chǎn)生抵御寄生效果的機制還是未知的。但是，分析還是清楚地鑒定出少數(shù)未受保護的個體具有高CD4T細胞或者高抗體應答。這表明僅由對CSP的強CD4T細胞應答或者高抗體應答不能預示抵御攻擊的保護作用。己經(jīng)開發(fā)出不同的監(jiān)控T細胞應答的技術(shù)，例如淋巴細胞增殖(lymphoproloferation)、細胞因子分泌、四聚體染色(tetramerstaining)、Elipsot或者細胞因子流式細胞術(shù)?；诹己玫闹貜蛼熘噩F(xiàn)性數(shù)據(jù)以及相關(guān)標記物檢測(CD4,CD8,CD40L,IL-2,TNF,IFNg)，最近后者被選為先導技術(shù)。此外還鑒定了一種特異的分析方法學，這解決了細胞因子流式細胞術(shù)方法中常見的高背景問題。本文證明了在人臨床試驗中禾,細胞因子流式細胞術(shù)穩(wěn)定監(jiān)控T細IM答的可行性。此外，它還證明了有可能鑒定不是與體液免M:接相關(guān)的保護標記盡管已經(jīng)證明佐劑B比AS02A制齊脂,明顯更有效的誘導CSP特異的CD4T細胞和抗體，但CD4T細胞頻率和抗體濃度的差異是相對適中的，可以得出結(jié)論，即它們不是生物相關(guān)的。該臨床試驗中獲得的數(shù)據(jù)允許利用抵御瘧疾的數(shù)據(jù)作為生物相關(guān)標記物正式鑒定這類差異的生物關(guān)聯(lián)性。分析清楚地顯示，佐劑之間關(guān)于T細胞頻率和抗體濃度的適中但顯著的差異轉(zhuǎn)化為顯著地更高程度的抵御瘧疾攻擊的保護作用。參考文獻·Al·DnsoP等人(2004)E．1~cacyoftheRTS,．S/AS02AvaccineagainstPlasmodiumfalciparuminfectionanddiseaseinyoungAfricanchildrenrandomisedcontrolledtrial．LancetOct；364141l-1420．·AI—ONSO等人(2005)DurationofprotectionwithRTS,S/AS02AmalariavaccineinpreventionofPlasmodiumfalciparumdiseaseinMozambicanchildrenjsingle·bRndextendedfollow-upofarandomisedcontrolledtrial．Lancet．Dec10366(9502)2012—8．·BallouWR，Arevalo·Hene~M，CarucciD，RichieTL，CorradinG，DiggsC，等人(2004)Updateontheclinicaldevelopmentofcandidatemalariavacci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多核苷酸。13.—種用于免疫到流行區(qū)的旅行者以抵御增殖性癥疾感染制劑，包括瘧原蟲抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐劑，所述佐劑是包括脂質(zhì)A衍生物和皂苷柳旨質(zhì)體制劑。14.如權(quán)利要求13所述的制劑，其特征在于瘧原蟲抗原是環(huán)子孢子蛋白或者其免疫原性片段或者其旨詢對，針對疙原蟲的免疫應答的衍生物。15.如權(quán)利要求14所述的制劑，其特征在于CS蛋白或其片段與乙型肝炎表面抗原(HBsAg)融合。16.如權(quán)利要求15所述的制劑，其特征在于CS蛋白或其片段為雜合蛋白的形式，所述雜合蛋白包括基本上全部的瘧原蟲CS蛋白C末端部分、CS蛋白免疫顯性區(qū)的4個或者更多的串ra復和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。17.如權(quán)利要求13到16中任意一項所述的制劑，其特征在于雜合蛋白包括惡性癥原蟲CS蛋白的序列，該序列基本上對應于惡性癥原蟲NF516株3D7克隆CS蛋白的207-395位氨基酸，所述CS蛋白fflii線性接頭與HBsAg的N端符合讀框地融合。18.如權(quán)利要求17所述的制劑，其特征在于雜合蛋白是RTS。19.如豐又利要求18所述的制劑，其特征在于RTS為混合顆粒RTS,S的形式。20.如權(quán)利要求19所述的制劑，其特征在于RTS,S的量是每劑量25或者50微克。21.如木又利要求13到20中任意一項所述的制劑，其特征在于佐劑包括3D-MPL和QS213。22.如權(quán)利要求21所述的制劑，其特征在于QS21在含有膽固醇柳旨質(zhì)體中淬滅。23.如權(quán)利要求13-22中任意一項所述的制齊怖為初始/加強療法一部分的用途，其特征在于其他部分包括編碼瘧原蟲抗原或者其免疫原性片段或其衍生物的多核苷酸，其中抗原s/佐劑混合物和多核苷酸可以按任意7娘jlim頓。24.如權(quán)利要求23所述的制劑，其特征在于首先使用多核苷酸。25.—種在瘧疾流行區(qū)的旅行者中預防增殖性瘧疾感染的方法，包括施用適量制劑，所述制劑包括瘧原蟲抗原或其免疫性片段或其衍生物和佐劑，所述佐劑是包括脂質(zhì)A衍生物和皂苷柳旨質(zhì)體制劑。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于瘧原蟲抗原是環(huán)子孢子蛋白或者其免疫原性片段或者其旨,激發(fā)針對疙原蟲的免疫應答的衍生物。27.如權(quán)禾腰求26所述的方法，其特征在于CS蛋白或其片段與乙型肝炎表面抗原(HBsAg)融合。28.如豐又利要求27所述的方法，其特征在于CS蛋白或其片段為雜合蛋白的形式，包括基本上全部的瘧原蟲CS蛋白C末端部分、CS蛋白免疫顯性區(qū)的4個或者更多的串聯(lián)重復和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。29.如權(quán)利要求25到28中任意一項所述的方法，其特征在于雜合蛋白包括惡性瘧原蟲CS蛋白的序列，該序列基本上對應于惡性瘧原蟲NF528株3D7克隆CS蛋白的207-395位氨基酸，所述CS蛋白M線性接頭與HBsAg的N端符合讀框地融合。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于雜合蛋白是RTS。31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于RTS為混合顆粒RTS,S的形式。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于RTS,S的量是每劑量25或者50微克。33.如權(quán)利要求25到32中任意一項所述的方法，其特征在于佐劑包括3D-MPL和QS21。34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于QS21在含有膽固醇柳旨質(zhì)體中淬滅。35.如t又利要求25到34中任意一項所述的方法，還包括施用編碼瘧原蟲抗原或其免疫原性片段或其衍生物的多核苷酸，用于初始/加強療法。36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于首先{柳多核苷酸。37.瘧原蟲抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐齊贓制備用于免疫到流行區(qū)的旅，話以抵御媒感染的試劑盒中的用途，所述佐劑是包括脂質(zhì)A衍生物和皂苷的脂質(zhì)體制劑，其中提供的抗原是凍干形式，抗原和佐劑在施用前混合。38.如權(quán)利要求37所述的用途，其特征在于瘧原蟲抗原是環(huán)子孢子蛋白或者其免疫原性片段或者其能夠激發(fā)針對瘧原蟲的免疫應答的衍生物。39.—種試劑盒，包括；*以凍干形式提供的瘧原蟲抗原或者其免疫原性片段或其衍生物，*包括脂質(zhì)A衍生物和皂苷糊旨質(zhì)體劑型的佐劑，和*說明書，該說明書詳細說明在施用到流行區(qū)的旅行者前將抗原、佐劑和可選的載體混合，從而保護所述旅行者免于增殖性^感染。40.如權(quán)利要求39所述的試劑盒，還包括編碼瘧原蟲抗原或者其免疫原性片段或其衍生物的多核苷酸；其中抗原s/佐劑混合物和多核苷酸可以按任意次序順序使用，但特別地，其中的多核苷酸用于初始，抗原7佐劑混合物用于加強。41.如權(quán)利要求39或者40所述的試劑盒，其特征在于瘧原蟲抗原是環(huán)子孢子蛋白或者其免疫原性片段或者其能夠激發(fā)針對瘧原蟲的免疫應答的衍生42.—種評價候選疫苗，尤其是紅細胞前期的候選疫苗，預防賠疾的效果的方法，該方法包括檢測個體中激發(fā)的抵御fl，疫苗的CD4細胞7]C平。43.—種評價候選疫苗，尤其是紅特異抗體前期候選疫苗，預防培疾的效果的方法，該方法包括檢測個體中激發(fā)的抵御候選疫苗的特異抗體濃度。44.如權(quán)利要求42或者43所述的方法，其特征在于疫苗包括瘧原蟲抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐劑，所述佐劑是包括脂質(zhì)A衍生物和皂苷柳旨質(zhì)體制劑。45.—種檢測個jtt施用了瘧疾抗原組合物，尤其是紅細胞前期瘧疾抗原組合物后是否預防了疤疾的方法，該方法包括檢測個體中激發(fā)的抗原特異的CD4T細胞水平。46.—種檢測個體施用了瘧疾抗原組合物，尤其是紅細胞前期瘧疾抗原組合物后是否預防了瘧疾的方法，該方法包括檢測個體中激發(fā)的瘧疾抗原特異的抗微度。全文摘要本發(fā)明提供一種在瘧疾流行區(qū)的旅行者中預防增殖性瘧疾感染的方法，包括施用適量的制劑，所述制劑包括瘧原蟲(Plasmodium)抗原或者其免疫原性片段或其衍生物和佐劑，所述佐劑是包括脂質(zhì)A(lipidA)衍生物和皂苷的脂質(zhì)體制劑。文檔編號C07K14/445GK101208100SQ200680023139公開日2008年6月25日申請日期2006年6月29日優(yōu)先權(quán)日2005年6月30日發(fā)明者J·D·科亨申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司