專利名稱：：在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)核酸表達(dá)的方法和組合物的制作方法在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)核酸表達(dá)的方法和組合物相關(guān)申請根據(jù)美國法典第35章第119(e)項(xiàng)，本申請要求于2005年4月29曰提交的美國臨時(shí)申請第60/676,139號的權(quán)益，該臨時(shí)申請的完整內(nèi)容在此引入作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)核酸表達(dá)的組合物及其使用方法。發(fā)明背景基因治療的新近發(fā)展已燃起了經(jīng)該方案有效治療各種長期疾病的希望。但是，控制基因表達(dá)合乎安全和靈活治療的需要已變得清晰起來。許多不同的調(diào)節(jié)系統(tǒng)已在基因治療載體中進(jìn)行了測試，并已被證實(shí)在體外和體內(nèi)均調(diào)節(jié)基因表達(dá)，包括四環(huán)素效應(yīng)系統(tǒng)、雷帕霉素調(diào)節(jié)的蛋白二聚化和許多其它系統(tǒng)。這些系統(tǒng)大部分起控制轉(zhuǎn)錄活化的功能，來源于內(nèi)源哺乳動物基因調(diào)節(jié)途徑或與轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域組合的藥物響應(yīng)元件的人工雜種。除轉(zhuǎn)基因以外這些系統(tǒng)還需要表達(dá)一種或多種蛋白，并需要給予活化或抑制轉(zhuǎn)錄的外源藥物或其它化合物。對于包裝能力有限的基因治療載體，如腺相關(guān)病毒(AAV)載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，摻入額外的基因可能限制轉(zhuǎn)基因大小，或需要使用兩種分開的載體，以傳遞所有的必需元件。盡管這些系統(tǒng)可用于有效地控制轉(zhuǎn)錄，但在許多情況下這些大系統(tǒng)不切實(shí)際或不實(shí)用。以幾種轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)，這幾種轉(zhuǎn)錄后水平還可用于控制外源基因表達(dá)。RNA產(chǎn)生受到轉(zhuǎn)錄速率的控制，但功能性RNA需要正確剪接，然后可產(chǎn)生正確的基因產(chǎn)物。通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因RNA的剪接，可控制基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。針對基因治療載體的免疫應(yīng)答也已成為一個(gè)重要考慮因素，尤其是對于需要長期治療的疾病而言。免疫系統(tǒng)不僅可對載體自身應(yīng)答，而且可對載體產(chǎn)生的蛋白應(yīng)答。因?yàn)樵S多最成功的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包含雜種或外源蛋白，所以這些系統(tǒng)特別易于誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，已表明幾個(gè)系統(tǒng)在嚙齒動物和非人靈長類動物中誘導(dǎo)這樣的免疫反應(yīng)。本發(fā)明通過提供用于控制基因表達(dá)而沒有先前所述基因表達(dá)系統(tǒng)的缺陷的組合物和方法，克服了先前的本領(lǐng)域不足。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種分離的核酸，其包含A)至少一個(gè)第一核苷酸序列，其編碼目標(biāo)異源核苷酸序列；和B)至少兩個(gè)異源的第二核普酸序列，其中每個(gè)異源的第二核苷酸序列包含i)限定第一內(nèi)含子的第一組剪接元件，在第二組剪接元件沒有活性的情況下，所述第一內(nèi)含子通過剪接被去除，從而產(chǎn)生賦予生物功能的第一RNA分子；和ii)限定與所述第一內(nèi)含子不同的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子的第二組剪接元件，其中在所述第二組剪接元件有活性時(shí)，與所述第一內(nèi)含子不同的所述一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子通過剪接被去除，從而不產(chǎn)生RNA分子和/或產(chǎn)生不賦予生物功能的第二RNA分子，其中所述異源的第二核苷酸序列選自a)在所述第一核苷酸序列中串聯(lián)的第二核苷酸序列，b)在所述第一核苷酸序列中相距至少25個(gè)堿基對的第二核苷酸序列，c)在所述第一核苷酸序列中相距至少50個(gè)堿基對的第二核苦酸序列，d)在所述第一核苷酸序列中相距至少75個(gè)堿基對的第二核苦酸序列，e)在所述第一核苷酸序列中相距至少100個(gè)堿基對的第二核苷酸序列，f)在所述第一核苷酸序列中相距至少200個(gè)堿基對的第二核苷酸序列，g)在所述第一核苷酸序列中相距至少300個(gè)堿基對的第二核苷酸序列，h)第二核苷酸序列，其中第一個(gè)(primary)第二核芬酸序列位于啟動子和所述第一核苷酸序列之間，而第二個(gè)(secondary)第二核苷酸序列位于所述第一核苷酸序列中；和i)第二核苷酸序列，其中第一個(gè)第二核苷酸序列位于所述第一核苷酸序列中的可讀框和聚腺苷酸尾或聚腺苷酸信號之間，而第二個(gè)第二核苷酸序列位于所述第一核香酸序列的所述可讀框中。本文還提供一種分離的核酸，其包含A)至少一個(gè)第一核苷酸序列，其編碼目標(biāo)異源核苷酸序列；和B)至少一個(gè)第二異源核苷酸序列，其包含i)限定第一內(nèi)含子的第一組剪接元件，在第二組剪接元件沒有活性的情況下，所述第一內(nèi)含子通過剪接被去除，從而產(chǎn)生賦予生物功能的第一RNA分子；和ii)限定與所述第一內(nèi)含子不同的內(nèi)含子的第二組剪接元件，其中所述第二內(nèi)含子通過剪接被去除，從而不產(chǎn)生RNA分子和/或在所述第二組剪接元件有活性時(shí)產(chǎn)生不賦予生物功能的第二RNA分子，其中第二核苷酸序列選自a)SEQIDNO:50(具有564CT突變的IVS2-654內(nèi)含子)；b)SEQIDNO:51(具有657G突變的IVS2-654內(nèi)含子)；c)SEQIDNO:52(具有658T突變的IVS2-654內(nèi)含子)；d)SEQIDNO:20(具有657GT突變的IVS2-654內(nèi)含子)；e)SEQIDNO:53(具有200bp缺失的IVS2-654內(nèi)含子)；f)SEQIDNO:68(僅有197bp的IVS2-654內(nèi)含子)；g)SEQIDNO:55(具有6A突變的IVS2-654內(nèi)含子)；h)SEQIDNO:56(具有564C突變的IVS2-654內(nèi)含子)；i)SEQIDNO:57(具有841A突變的IVS2-654內(nèi)含子);j)SEQIDNO:59(具有564CT突變的IVS2-705內(nèi)含子)、SEQIDNO:50(具有564CT突變的IVS2-654內(nèi)含子)、SEQIDNO:54(具有425bp缺失的IVS2-654內(nèi)含子)、SEQIDNO:69(僅有247bp的IVS2-654內(nèi)含子)、SEQIDNO:59(具有564CT突變的IVS2-705內(nèi)含子)、SEQIDNO:60(具有657G突變的IVS2-705內(nèi)含子)、SEQIDN0:61(具有658T突變的IVS2-705內(nèi)含子)、SEQIDNO:62(具有657GT突變的IVS2-705內(nèi)含子)、SEQIDNO:63(具有200bp缺失的IVS2-705內(nèi)含子)、SEQIDNO:64(具有425bp缺失的IVS2-705內(nèi)含子)、SEQIDNO:65(具有6A突變的IVS2-705內(nèi)含子)、SEQIDNO:66(具有564C突變的IVS2-705內(nèi)含子)、SEQIDNO:67(具有841A突變的IVS2-705內(nèi)含子)及其任意組合。本文另外提供一種生產(chǎn)蛋白的方法，該方法包括a)使封閉寡核苷酸與本發(fā)明核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述封閉寡核苷酸封閉第二組剪接元件的成員，導(dǎo)致第一內(nèi)含子通過剪接被去除，而產(chǎn)生第一RNA;和b)翻譯第一RNA,從而產(chǎn)生蛋白。本文還提供一種生產(chǎn)賦予生物功能的RNA的方法，該方法包括a)使封閉寡核苷酸與本發(fā)明核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述封閉寡核苷酸封閉第二組剪接元件的成員，導(dǎo)致第一內(nèi)含子通過剪接被去除，而產(chǎn)生第一RNA;和b)翻譯第一RNA，從而產(chǎn)生賦予生物功能的RNA。而且，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)賦予生物功能的RNA的方法，該方法包括a)使小分子與本發(fā)明核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述小分子封閉第二組剪接元件的成員，導(dǎo)致第一內(nèi)含子被去除，而產(chǎn)生第一RNA;和b)翻譯第一RNA,從而產(chǎn)生賦予生物功能的RNA。本文另外提供一種在受治療者中調(diào)節(jié)賦予生物功能的異源RNA產(chǎn)生的方法，該方法包括a)將本發(fā)明核酸導(dǎo)入到所述受治療者中；和b)在期望異源RNA產(chǎn)生時(shí)將封閉第二組剪接元件成員的封閉寡核苷酸和/或小分子導(dǎo)入到所述受治療者中，由此調(diào)節(jié)所述受治療者中的異源RNA產(chǎn)生。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種在受治療者中調(diào)節(jié)異源蛋白產(chǎn)生的方法，該方法包括a)將本發(fā)明核酸導(dǎo)入到所述受治療者中；和b)在期望異源蛋白產(chǎn)生時(shí)將封閉第二組剪接元件成員的封閉寡核普酸和/或小分子導(dǎo)入到所述受治療者中，由此調(diào)節(jié)所述受治療者中的異源蛋白產(chǎn)生。本發(fā)明還提供一種鑒別化合物的方法，其中所述化合物封閉本發(fā)明核酸的第二組剪接元件成員，所述方法包括a)使本發(fā)明核酸與所述化合物在允許剪接的條件下接觸；和b)檢測本發(fā)明第一RNA的產(chǎn)生和/或本發(fā)明第二RNA的產(chǎn)生，借此第一RNA的產(chǎn)生鑒別出封閉本發(fā)明核酸的第二組剪接元件成員的化合物。本文還提供一種抑制賦予生物功能的異源RNA產(chǎn)生的方法，該方法包括a)使小分子與本發(fā)明核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述小分子封閉第一組剪接元件成員，導(dǎo)致第二內(nèi)含子被去除，由此抑制第一RNA的產(chǎn)生。另外，本發(fā)明提供一種抑制異源蛋白產(chǎn)生的方法，該方法包括a)使小分子與本發(fā)明核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述小分子封閉第一組剪接元件成員，導(dǎo)致第二內(nèi)含子被去除，由此抑制第一RNA的產(chǎn)生。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種抑制賦予生物功能的異源RNA產(chǎn)生的方法，該方法包括a)使封閉寡核苷酸與本發(fā)明核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述封閉寡核苷酸封閉第一組剪接元件成員，導(dǎo)致第二內(nèi)含子被去除，由此抑制第一RNA的產(chǎn)生。本發(fā)明另外提供一種抑制異源蛋白產(chǎn)生的方法，該方法包括a)使封閉寡核苷酸與本發(fā)明核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述封閉寡核苷酸封閉第一組剪接元件成員，導(dǎo)致第二內(nèi)含子被去除，由此抑制第一RNA的產(chǎn)生。本發(fā)明的前述和其它目標(biāo)及方面在下文陳述的說明書中詳細(xì)闡述。附圖簡述圖1是本發(fā)明核酸構(gòu)建物的一部分的示意圖，顯示了如本文所述基于外源寡核苷酸的存在與否調(diào)節(jié)螢光素酶序列表達(dá)的機(jī)制。圖2A-B顯示了在門靜脈注射lxl011個(gè)載體顆粒后體內(nèi)的AAVLuc表達(dá)。在載體注射后1年和7天，經(jīng)腹膜內(nèi)注射施用25mg/kgLNA寡核苷酸(Aii;B在箭頭處)。螢光素酶轉(zhuǎn)基因活性使用實(shí)時(shí)成像(A)檢測，并表示為隨時(shí)間變化的光單位x106。B:寡核苦酸=菱形；無寡核苦酸-圓形。圖3顯示了在寡核苷酸治療后體內(nèi)的AAT表達(dá)。小鼠肝臟用表達(dá)內(nèi)含子調(diào)節(jié)的AAT編碼序列盒的AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過腹膜內(nèi)注射(箭頭)用0.625mg/200plLNA寡核苷酸治療該小鼠肝臟2天。通圖4顯示了基于加入不同突變至654突變體的荄光素酶表達(dá)變化。按照說明書使用QuickChangeTM定向誘變試劑盒(Stratagene),從而產(chǎn)生以下突變(編號基于距離IVS-654的5'剪接位點(diǎn)的堿基對數(shù))6T變?yōu)锳、564A變?yōu)镃、564AA變?yōu)镃T、657TA變?yōu)镚T以及841C變?yōu)锳。將新內(nèi)含子克隆入螢光素酶cDNA中。用如本文所述的載體和寡核苷酸轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。發(fā)明詳述本文使用的"a"、"an，，或"the，，可為單數(shù)或復(fù)數(shù)，取決于其應(yīng)用范圍。例如，"一種細(xì)胞，，可指單一細(xì)胞，或者其可指許多細(xì)胞。本文還使用的"和/或，，指并包含一種或多種相關(guān)羅列項(xiàng)目的任意什么可能組合，以及在選擇另一解釋("或")時(shí)指并包括沒有組合。此外，本文使用的術(shù)語"約"在指可檢測值(例如本發(fā)明組合物的量、劑量、時(shí)間、溫度等)時(shí)，意味著包括指定量的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%乃至±0.1%的偏差。本發(fā)明基于以下出乎意料的發(fā)現(xiàn)可以例如在體外以轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)核酸如外源核酸的表達(dá)。此調(diào)節(jié)基于與所述核酸相連的不同內(nèi)含子的選擇性剪接，該選擇性剪接視在特定位點(diǎn)選擇性封閉剪接活性的寡核香酸、小分子和/或其它化合物的存在與否而定。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離核酸，其包含以下幾項(xiàng)、基本由以下幾項(xiàng)組成和/或由以下幾項(xiàng)組成a)至少一個(gè)(例如1、2、3、4個(gè)或更多個(gè))第一外源核苷酸序列，其編碼目標(biāo)異源核苷^列；和b)至少一個(gè)(例如2、3、4個(gè)或更多個(gè))第二外源或異源核普酸序列，其中每個(gè)第二外源或異源核苷酸序列包含i)限定第一內(nèi)含子的第一組剪接元件，在第二組剪接元件沒有活性的情況下，所述第一內(nèi)含子通過剪接被去除，從而產(chǎn)生賦予生物功能的第一RNA分子；和ii)限定與所述第一內(nèi)含子不同的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子的第二組剪接元件，其中在所述第二組剪接元件有活性時(shí)，與所述第一內(nèi)含子不同的所述一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子通過剪接被去除，從而不產(chǎn)生RNA分子和/或產(chǎn)生不賦予生物功能的第二RNA分子。例如可由已知突變內(nèi)含子系統(tǒng)獲得的眾多系統(tǒng)，可用于制備本發(fā)明的組合物和實(shí)施本發(fā)明的方法。例如，可使用引起某些地中海貧血的(3-珠蛋白突變內(nèi)含子(例如SEQIDNO:58;SEQIDNO:18;SEQIDNO:19，有和/或沒有本文所述的額外突變)，(參見例如Suwanmanee等，"Restorationofhumanbeta-globingeneexpressioninmurineandhumanIVS2-654thalassemicerythroidcellsbyfreeuptakeofantisenseoligonucleotides"Mo/.P/7wmac0/.(2002)62:545-553，該文獻(xiàn)整體在此引入作為參考)。其它系統(tǒng)包括嚢性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)物(CFTR)基因的突變內(nèi)含子(例如SEQIDNO:70;SEQIDNO:71,有和沒有額外突變)，(參見例如NCBI基因組功能注釋的內(nèi)部版本號36.1(built36version)的核苦酸116907253-117095951,登錄號NC—000007;Highsmith等,(1994)"Anovelmutationinthecysticfibrosisgeneinpatientswithpulmonarydiseasebutnormalsweatchlorideconcentrations"yVewJowrwa/0/Afe<i/c/we331:974-980，"i亥文獻(xiàn)整體在此引入作為參考)。另外的系統(tǒng)包括肌養(yǎng)蛋白基因中的突變(SEQIDNO:74;SEQIDSNO:75，有和沒有額外突變)；(參見例如NCBI基因組功能注釋的內(nèi)部版本號36.1的核苷酸31047266-33267647,登錄號NC—000023;Tuffery-Giraud等，(1999)"Pointmutationsinthedystrophingene:evidenceforfrequentuseofcrypticsplicesitesasaresultofsplicingdefects，，//圃朋Mw她'w14:359-368;Aartsma畫Rus等，(2004)"Antisense-inducedmultiexonskippingforDuchenneMuscularDystrophymakesmoresense"^4wen'cawJowr"a/C7e"e//cs74:83-92;Chamberlain等，(1991)"PCRanalysisofdystrophingenemutationandexpression"/Ce〃.5!'oc/zem.46:255-259;Mann等，(2001)"Antisense-inducedexonskippingandsynthesisofdystrophininthemdxmouse"iVa"JcadUSA98:42-47;Lu等，(2003)"Functionalamountsofdystrophinproducedbyskippingthemutatedexoninthemdxdystrophicmouse"iVof.Med.9:1009-1014;Kole等，(2004)"RNAmodulation,repairandremodelingbyspliceswitchingoligonucleotides"爿cto所oc/z/w/ca尸o/om'ca51:373-378;以上所有文獻(xiàn)都整體在此引入作為參考)。可用于本發(fā)明方法和組合物的再一個(gè)系統(tǒng)是引起可變剪接缺陷的突變tow基因(例如SEQIDNO:78);(參見例如Kalbftiss等，"CorrectionofalternativesplicingintauinfrontotemporaldementiaandParkinsonismlinkedtochromosome17"fifo/.CTzem.276:42986-42993(2001);該文獻(xiàn)整體在此引入作為參考)，以及現(xiàn)在已知的或以后鑒別的產(chǎn)生剪接缺陷的任意其它這樣的突變基因。還可按照一般技術(shù)人員眾所周知的方法產(chǎn)生和檢驗(yàn)導(dǎo)入可變剪接組的修飾型內(nèi)含子。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的核酸，其包含A)至少一個(gè)第一核苦酸序列，其編碼目標(biāo)異源核香酸序列；和B)至少兩個(gè)第二異源核普酸序列，其中每個(gè)第二異源核苷酸序列包含i)限定第一內(nèi)含子的第一組剪接元件，在第二組剪接元件沒有活性的情況下，所述第一內(nèi)含子通過剪接被去除，從而產(chǎn)生賦予生物功能的第一RNA分子；和ii)限定與所述第一內(nèi)含子不同的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子的第二組剪接元件，其中在所述第二組剪接元件有活性時(shí)，與所述第一內(nèi)含子不同的所述一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子通過剪接被去除，從而不產(chǎn)生RNA分子和/或產(chǎn)生不J賦予生物功能的第二RNA分子，其中第二異源核苦酸序列選自a)在所述第一核苷酸序列中串聯(lián)的第二核苷酸序列，b)在所述第一核苷酸序列中相距至少25個(gè)堿基對的第二核苷酸序列，c)在所述第一核苷酸序列中相距至少50個(gè)堿基對的第二核苷酸序列，d)在所述第一核苷酸序列中相距至少75個(gè)堿基對的第二核苷酸序列，e)在所述第一核苷酸序列中相距至少100個(gè)堿基對的第二核苷酸序列，f)在所述第一核苷酸序列中相距至少200個(gè)堿基對的第二核苷酸序列，g)在所述第一核苦酸序列中相距至少300個(gè)堿基對的第二核苦酸序列，h)第二核苷酸序列，其中第一個(gè)第二核苷酸序列位于啟動子和所述第一核苷酸序列之間，而第二個(gè)第二核苷酸序列位于所述第一核苷酸序列中；和i)第二核普酸序列，其中第一個(gè)第二核苷酸序列位于所述第一核苷酸序列中的可讀框和聚腺苷酸尾或聚腺香酸信號之間，而第二個(gè)第二核苷酸序列位于所述第一核苷酸序列的所述可讀框中。盡管這些是內(nèi)含子間距離的具體實(shí)例，但要理解的是，兩個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子可具有任意數(shù)量的堿基對來分隔它們，如本文所述的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200個(gè)堿基對等。還要理解的是，本發(fā)明的第二核苷酸序列可包含如本文所述的任意組合的一個(gè)或多個(gè)突變。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的核酸，所述核酸包含A)至少一個(gè)(例如1、2、3、4個(gè)或更多個(gè))第一核苷酸序列，其編碼目標(biāo)異源核苦酸序列；和B)第二核苷酸序列，其包含i)限定第一內(nèi)含子的第一組剪接元件，在第二組剪接元件沒有活性的情況下，所述第一內(nèi)含子通過剪接被去除，從而產(chǎn)生賦予生物功能的第一RNA分子；和ii)限定與所述第一內(nèi)含子不同的至少一個(gè)(例如1、2、3、4個(gè)或更多個(gè))內(nèi)含子的第二組剪接元件，其中與所述第一內(nèi)含子不同的所述至少一個(gè)內(nèi)含子通過剪才妄被去除，從而不產(chǎn)生RNA分子和/或在所述第二組剪接元件有活性時(shí)產(chǎn)生不賦予生物功能的第二RNA分子，其中第二核香酸序列選自a)SEQIDNO:50(具有564CT突變的IVS2-654內(nèi)含子)；b)SEQIDNO:51(具有657G突變的IVS2-654內(nèi)含子)；c)SEQIDNO:52(具有658T突變的IVS2-654內(nèi)含子)；d)SEQIDNO:20(具有657GT突變的IVS2-654內(nèi)含子)；e)SEQIDNO:53(具有200bp缺失的IVS2-654內(nèi)含子)；f)SEQIDNO:68(僅有197bp的IVS2-654內(nèi)含子)；g)SEQIDNO:55(具有6A突變的IVS2-654內(nèi)含子)；h)SEQIDNO:56(具有564C突變的IVS2-654內(nèi)含子)；i)SEQIDNO:57(具有841A突變的IVS2-654內(nèi)含子)；j)SEQIDNO:59(具有564CT突變的IVS2-705內(nèi)含子)；k)SEQIDNO:60(具有657G突變的IVS2-705內(nèi)含子)；1)SEQIDNO:61(具有658T突變的IVS2-705內(nèi)含子)；m)SEQIDNO:62(具有657GT突變的IVS2-705內(nèi)含子)；n)SEQIDNO:63(具有200bp缺失的IVS2-705內(nèi)含子)；o)SEQIDNO:64(具有425bp缺失的IVS2-705內(nèi)含子)；p)SEQIDNO:65(具有6A突變的IVS2-705內(nèi)含子)；q)SEQIDNO:66(具有564C突變的IVS2-705內(nèi)含子)；r)SEQIDNO:67(具有841A突變的IVS2-705內(nèi)含子)及其任意組合，包括單獨(dú)的序列。第一核普酸序列可編碼，例如為任意組合的蛋白或肽、作為RNA具有酶活性的核苷酸序列(例如RNAi)、編碼核酶的核苷酸序列、編碼反義序列的核苷酸序列和/或小核RNA(snRNA)。而且，第一核苷酸序列可包含一種或多種突變，在某些實(shí)施方案中，這些突變可在限定剪接位點(diǎn)和/或調(diào)節(jié)剪接活性方面起作用。還要理解的是，在本發(fā)明的分離核酸中，本發(fā)明的第一核苷酸序列和第二核普S吏序列在重復(fù)序列和/或交替序列(alternates)的任意組合方面可相同和/或不同。本發(fā)明的第二核苷酸序列可為限定含一個(gè)或多個(gè)突變的內(nèi)含子的核苷酸序列，所述突變的存在產(chǎn)生第一組剪接元件和第二組剪接元件。在某些實(shí)施方案中，第二核苦酸序列可為限定內(nèi)含子-夕卜顯子-內(nèi)含子區(qū)的序列，其中在內(nèi)含子和/或外顯子區(qū)任一個(gè)中的突變導(dǎo)致存在第一組剪接元件和第二組剪接元件。在該后一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)?shù)诙M剪接元件有活性時(shí)，結(jié)果是產(chǎn)生含內(nèi)含子-外顯子-內(nèi)含子區(qū)的外顯子的RNA。本文還提供一種含本發(fā)明核酸的載體和含本發(fā)明核酸或載體的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，載體可為但不限于非病毒載體、病毒載體和合成的生物納顆粒。本發(fā)明病毒載體的非限制性實(shí)例包括AAV載體、腺病毒載體、慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、皰滲病毒載體、曱病毒載體、痘病毒載體、桿狀病毒載體和嵌合病毒載體。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明核酸的各種方法。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)賦予生物功能的蛋白和/或RNA的方法，該方法包括a)使封閉寡核苷酸與本發(fā)明核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述封閉寡核苷酸封閉第二組剪接元件成員，導(dǎo)致第一內(nèi)含子通過剪接被去除，從而產(chǎn)生第一RNA;和b)翻譯第一RNA,從而產(chǎn)生蛋白和/或產(chǎn)生賦予生物功能的RNA。本發(fā)明的封閉寡核苷酸和/或d、分子和/或其它封閉化合物可導(dǎo)入到含本發(fā)明核酸的細(xì)胞中.，此細(xì)胞可位于體外或如本文所述的本發(fā)明受治療者(例如動物，其可為人)中。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)賦予生物功能的蛋白和/或RNA的方法，該方法包括a)使小分子與本發(fā)明的任一種核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述小分子封閉第二組剪接元件成員，導(dǎo)致第一內(nèi)含子被去除，而產(chǎn)生第一RNA;和b)翻譯第一RNA，從而產(chǎn)生產(chǎn)生賦予生物功能的蛋白和/或RNA。另外，本發(fā)明提供一種在受治療者中調(diào)節(jié)異源賦予生物功能的蛋白和/或RNA的產(chǎn)生的方法，該方法包括a)將本發(fā)明核酸導(dǎo)入到受治療者中；和b)在期望產(chǎn)生異源蛋白和/或RNA時(shí)將封閉第二組剪接元件成員的封閉寡核苷酸和/或小分子導(dǎo)入到受治療者中，由此在所述受治療者中調(diào)節(jié)RNA產(chǎn)生。本文還提供篩選方法，例如鑒別化合物的方法，其中所述化合物封閉本發(fā)明核酸的第二組剪接元件的成員，所述方法包括a)使本發(fā)明核酸與該化合物在允許剪接的條件下接觸；和b)檢測第一RNA的產(chǎn)生和/或第二RNA的產(chǎn)生，借此第一RNA的產(chǎn)生鑒別出封閉第二組剪接元件成員的化合物。在本文描述的某些實(shí)施方案中，將轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)以O(shè)FF(關(guān)閉)位導(dǎo)入(例如受治療者中)，并與將所述系統(tǒng)轉(zhuǎn)向ON(打開)位的本發(fā)明封閉寡核苷酸和/或小分子接觸。本文還提供將以O(shè)N位導(dǎo)入(例如受治療者中)的系統(tǒng)轉(zhuǎn)向OFF位的方法，例如抑制異源賦予生物功能的蛋白和/或RNA的產(chǎn)生的方法，該方法包括a)使封閉寡核苷酸和/或小分子與本發(fā)明核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述小分子封閉第一組剪接元件成員，導(dǎo)致第二內(nèi)含子被去除，由此抑制第一RNA的產(chǎn)生。內(nèi)含子是介于真核DNA或RNA的編碼部分或"外顯子"之間的該DNA或RNA的一部分。內(nèi)含子和外顯子由DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，稱為"初級轉(zhuǎn)錄物、RNA前體"(或"前mRNA，，)。內(nèi)含子必須由前mRNA中去除，使得可產(chǎn)生由外顯子編碼的蛋白(本文使用的術(shù)語"蛋白"指天然蛋白、野生型蛋白或功能蛋白)。內(nèi)含子由前mRNA中去除以及隨后的外顯子接合在剪接過程中進(jìn)行。剪接過程是在轉(zhuǎn)錄之后(即轉(zhuǎn)錄后)但在翻譯前在RNA上進(jìn)行的一系列由剪接因子介導(dǎo)的反應(yīng)。因此，"前mRNA，，是含外顯子以及一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子的RNA,"信使RNA(mRNA或RNA)"是已由其中去除了任意內(nèi)含子的RNA,其中外顯子隨后接合在一起，使得可通過用核糖體翻譯為功能蛋白或通過翻譯為功能性RNA由外顯子產(chǎn)生基因產(chǎn)物。本文使用的術(shù)語"翻譯"包括由核糖體引導(dǎo)的氨基酸鏈(例如肽或多肽)產(chǎn)生，核糖體沿著含編碼氨基酸序列的密碼子的信使RNA移動。本文使用的術(shù)語翻譯還包括由編碼RNA分子核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列(例如外顯子)產(chǎn)生功能性RNA分子(例如核酶、反義RNA、RNAi、snRNA等)。內(nèi)含子的特征為一組"剪接元件"，它們是剪接機(jī)器的一部分，是剪接必需的。內(nèi)含子是相對短的保守核酸區(qū)段，其結(jié)合進(jìn)行剪接反應(yīng)的各種剪接因子。因此，每個(gè)內(nèi)含子都由5'剪接位點(diǎn)、3'剪接位點(diǎn)和位于它們之間的分支點(diǎn)限定。剪接元件還包含位于外顯子中的外顯子剪接增強(qiáng)子和沉默子，以及位于內(nèi)含子中、與剪接位點(diǎn)和分支點(diǎn)有一段距離的內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子和沉默子。除了剪接位點(diǎn)和分支點(diǎn)以外，這些元件還控制可變剪接、異常剪接和組成型剪接。按照本發(fā)明的實(shí)施方案，第一核苷酸序列可為但不限于任意組合的編碼蛋白或肽的核苷酸序列、作為RNA具有酶活性的核苷酸序列(例如RNAi)、編碼核酶的核苦酸序列、編碼反義序列的核苷酸序列和/或編碼小核RNA(snRNA)的核苷酸序列。本文使用的術(shù)語"外源的"和/或"異源的"還可包括在包含其的核酸構(gòu)建物和/或傳遞載體(例如病毒傳遞載體)中天然不存在的核苷酸序列，還可包括相對于其它核苷酸序列處于非天然環(huán)境和/或位置的核苦酸序列(例如通過與天然不與其相連的啟動子或編碼序列連接)。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的第一核苷酸序列可編碼本發(fā)明的蛋白、肽和/或RNA，它們對待導(dǎo)入其中的細(xì)胞是外源的或異源的(即非天然的、不以天然狀態(tài)存在的和/或修飾的和/或重復(fù)的)。第一核苷酸序列對其所置入的載體(例如病毒載體)而言也可為外源的或異源的。而且，第二核苦酸序列對其所置入的載體和/或相對于與其連接的作為內(nèi)含子的第一核苷酸序列和/或相對于其所置入的細(xì)胞可為外源的或異源的?；蛘?，由第一核苷S吏序列編碼的蛋白、肽或RNA對細(xì)胞可為內(nèi)源的(即其在該細(xì)胞中天然存在)，但作為分離的核酸導(dǎo)入到細(xì)胞中和/或存在于細(xì)胞中。所述"分離的核酸"指大致上或基本上沒有某些組分的核酸，這些組分一般被發(fā)現(xiàn)在其天然狀態(tài)下與所述核酸結(jié)合。這些組分包括其它細(xì)胞材料、來自重組生產(chǎn)的培養(yǎng)基和/或在化學(xué)合成核酸時(shí)使用的各種化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明的"分離的"核酸一般沒有在該核酸所來源的生物體基因組DNA中鄰接目標(biāo)核酸的核酸序列(例如在5'或3'末端存在的編碼序列)。但是，本發(fā)明的核酸可包括并不有害地影響核酸基本特征的一些額外堿基或部分。所謂的本發(fā)明"分離的"蛋白或肽指基本上沒有某些組分的蛋白或肽，這些組分一般被發(fā)現(xiàn)在其天然狀態(tài)下與所述肽或蛋白結(jié)合。賦予生物功能的本發(fā)明分子可為信使RNA、蛋白、肽、核酶、RNAi、snRNA、反義RNA等。因此，在某些實(shí)施方案中，賦予生物功能的RNA是被翻譯成賦予生物功能的蛋白或肽的RNA，或者為被翻譯成和/或直接用作如本文所述賦予生物功能的RNA的(例如核酶、RNAi、snRNA、反義RNA等)RNA。本發(fā)明核酸的非限制性實(shí)例包括這樣的核酸，其包含以下幾項(xiàng)、基本由以下幾項(xiàng)組成和/或由以下幾項(xiàng)組成任意組合的如SEQIDNO:l(質(zhì)粒TRCBA-int-luc突變型)、SEQIDNO:2(質(zhì)粒TRCBA-int-luc(野生型))、SEQIDNO:3(質(zhì)粒TRCBA-int-luc(657GT))、SEQIDNO:4(質(zhì)粒GL3-int-Luc(突變型》、SEQIDNO:5(GL3-int-Luc(野生型))、SEQIDNO:6(GL3-int隱Luc(657GT))、SEQIDNO:7(GL3-2int畫fron-sph(突變型》、SEQIDNO:8(GL3-3int-2fron-sph(突變型))、SEQIDNO:9(GL3-int-LucA(突變型》、SEQIDNO:IO(GL3-int-LucB))、SEQIDNO:lI(GL3-int-LucC)、SEQIDNO:12(GL3-int-fron(突變型》、SEQIDNO:13(GL3-2int-sph(突變型))、SEQIDNO:14(GL3-2int畫Sph-C)、SEQIDNO:15(GL3-sint200-sph(突變型))、SEQIDNO:16(GL3-sint200-sph(657GT))、SEQIDNO:17(GL3-sint425-sph)和/或SEQIDNO:35(TRCBA-int-AAT-654CT)陳述的核苷酸序列。還提供如本文所述的這些序列的功能區(qū)的非限制性實(shí)例(例如SEQIDNO:l-17的內(nèi)含子和編碼序列(即SEQIDNO:21-34)、含654C-T突變的內(nèi)含子(SEQIDNO:18)、野生型內(nèi)含子(SEQIDNO:19)、含654C-T突變和657TA-GT突變的內(nèi)含子(SEQIDNO:20)以及SEQIDNO:35的內(nèi)含子和編碼序列(SEQIDNO:36)。因此，本發(fā)明的核酸可包含以下幾項(xiàng)、基本上由以下幾項(xiàng)組成和/或由以下幾項(xiàng)組成本文鑒別為第一核苷酸序列的一種或一種以上的核普酸序列和/或其功能區(qū)。此第一核苷酸序列和/或功能區(qū)可以彼此相對和/或相對于核酸的其它組分和本發(fā)明的核酸構(gòu)建物的任意組合(包括相同核苷酸序列的重復(fù))、任意順序和任意位置存在。本發(fā)明核酸還可包含引導(dǎo)第一核苷酸序列表達(dá)的啟動子?？砂诒景l(fā)明核酸中并與本發(fā)明的第一核苷酸序列有效連接(operablyassocited)的啟動子的實(shí)例包括但不限于組成型啟動子和/或誘導(dǎo)型啟動子，其一些非限制性實(shí)例包括病毒啟動子(例如CMV、SV40)、組織特異性啟動子(例如肌肉MCK)、心臟啟動子(例如NSE)、眼啟動子(例如MSK)和合成啟動子(SP1元件)。本發(fā)明啟動子的實(shí)例是如本文實(shí)施例中描述的雞P肌動蛋白啟動子(CB或CBA)。本發(fā)明的啟動子可存在于本發(fā)明核酸上的任意位置，在該位置啟動子與第一核苷酸序列有效連接。可相同或不同的一個(gè)或多個(gè)啟動子可一起存在于同一核酸分子中，或者可彼此相對和/或相對于存在于核酸上的第一核苦酸序列和/或第二核苷酸序列定位在核酸分子上的不同位置。此外，內(nèi)部核糖體進(jìn)入信號(IRES)和/或其它核糖體通讀元件可存在于該核酸分子上。一個(gè)或多個(gè)這樣的IRES和/或核糖體通讀元件可相同或不同，可一起存在于同一核酸分子中，和/或存在于核酸分子上的不同位置。當(dāng)多個(gè)第一核苷酸序列存在于本發(fā)明的核酸分子上時(shí)，這樣的IRES和核糖體通讀元件可用于通過非帽依賴性機(jī)制來翻譯信使RNA序列。在其中啟動子存在于本發(fā)明的分離核酸上的本發(fā)明實(shí)施方案中，啟動子可相對于第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列定位于核酸分子中的任意位置。例如，第二核苷酸序列可位于啟動子和第一核普酸序列之間。此外，第二核苷酸序列可相對于第一核苷酸序列定位于核酸分子中的任意位置。例如，第二核苷酸序列可定位于第一核苷酸序列之前、之后和/或當(dāng)中。在某些實(shí)施方案中，第二核苷酸序列可定位于第一核苷酸序列的5'1/3核苷酸中的任意位置、第一核苷酸序列的中間1/3核苷酸中的任意位置和/或第一核普酸序列的3'1/3核苷酸中的任意位置。在某些實(shí)施方案中，第二核普酸序列可定位于第一核苷酸序列的可讀框和polyA位點(diǎn)之間的任意位置。在其中兩個(gè)或多個(gè)第二核苷酸序列存在于本發(fā)明分離核酸中的某些實(shí)施方案中，第二核苷酸序列可間隔至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或1000個(gè)核苷酸定^立，包括本文未具體提及的5-1000之間的任意核苷酸數(shù)量。本發(fā)明核酸分子的第二核苷酸序列可包含以下幾項(xiàng)、基本由以下幾項(xiàng)組成和/或由以下幾項(xiàng)組成限定第一內(nèi)含子的第一組剪接元件，在第二組剪接元件沒有活性的情況下，所述第一內(nèi)含子通過剪接被去除，從而產(chǎn)生賦予生物功能的第一RNA分子；和限定與第一內(nèi)含子不同的第二內(nèi)含子的第二組剪接元件，其中第二內(nèi)含子通過剪接被去除，從而不產(chǎn)生RNA分子和/或在所述第二組剪接元件有活性時(shí)產(chǎn)生不賦予生物功能的第二RNA分子。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的第二核苷酸序列可包含一個(gè)或多個(gè)突變，所述突變可為置換、添力口、缺失等。本發(fā)明的第二核苷酸序列的具體但非限制性的實(shí)例可包括但不限于SEQIDNO:18畫20、50-71、74、75和78中任一個(gè)的核苷酸。本發(fā)明的分離核酸的具體實(shí)例包括但不限于SEQIDN0:l-17和21-36。本發(fā)明的封閉寡核苷酸的具體但非限制性的實(shí)例包括SEQIDNO:37-49、72、73、76、79和80。在本發(fā)明核酸中，第一內(nèi)含子是功能性內(nèi)含子，其通過剪接被去除，從而產(chǎn)生賦予生物功能的第一RNA分子。生物功能可在其中第一核苦酸序列為功能性RNA的實(shí)施方案中被直接賦予和/或通過將第一RNA分子翻譯成賦予生物功能的蛋白、肽或RNA而被間接賦予。這樣的生物功能可包括治療作用，包括例如用于恢復(fù)和/或增加蛋白、肽和/或RNA的活性的基因治療，而在其它情況下所述活性缺失和/或以不足或較低的量存在(例如修正導(dǎo)致疾病或障礙并對基因療法之類的治療有反應(yīng)的遺傳缺陷)。如本文所述，當(dāng)本發(fā)明核脧存在于其中可發(fā)生剪接的環(huán)境中且沒有本發(fā)明的封閉分子或化合物的情況下，限定第二內(nèi)含子的第二組剪接元件是有活性的，則第二內(nèi)含子被去除，導(dǎo)致沒有由該核酸產(chǎn)生第一RNA分子。當(dāng)?shù)诙?nèi)含子被去除時(shí)，結(jié)果可為產(chǎn)生不賦予本發(fā)明的生物功能的第二RNA分子(即非功能性RNA)和/或根本不產(chǎn)生第二RNA分子。本發(fā)明核酸的第二核苷酸序列可作為單個(gè)核苷酸序列存在于核酸分子上的任意位置，或者第二核苷酸序列可作為兩個(gè)或多個(gè)可相同或不同的第二核苷酸序列存在于同一核酸分子上。因此，例如，第二核苷酸序列可以眾多的兩個(gè)或多個(gè)相同和/或不同的核苷酸序列存在，這些核苷酸序列可串聯(lián)存在、分散于整個(gè)核酸分子中的不同位置和/或既一起(例如串聯(lián))又分散。本發(fā)明核酸可存在于載體中，此載體可存在于細(xì)胞中。任意合適的載體都包含在本發(fā)明的實(shí)施方案中，包括但不限于非病毒載體(例如質(zhì)粒、聚氧體(poloxymer)和脂質(zhì)體)、病毒載體和合成生物納顆粒(BNP)(例如由不同的腺相關(guān)病毒以及其它細(xì)小病毒綜合設(shè)計(jì))。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可使用任意合適的載體來傳遞本發(fā)明的異源核酸。可基于本領(lǐng)域已知的眾多因素對傳遞載體進(jìn)行選擇，所述因素包括目標(biāo)宿主的年齡和物種、體外對體內(nèi)傳遞、期望的表達(dá)水平和持續(xù)性、預(yù)期用途(例如用于治療或多肽生產(chǎn))、靶細(xì)胞或器官、傳遞途徑、分離核酸的大小、安全性考慮，等等。合適的載體還包括與核酸分子如質(zhì)粒等一起使用的病毒載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、曱病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒或單純皰瘆病毒)、脂質(zhì)載體、聚賴氨酸載體、合成多氨基聚合物載體。本發(fā)明可使用本領(lǐng)域已知的任意病毒載體。此病毒載體的實(shí)例包括但不限于得自以下的載體腺病毒科(Adenoviridae)、雙RNA病毒科(Bimaviridae)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)、杯狀病毒科(Caliciviridae)、細(xì)形病毒組(Capillovirusgroup)、香石竹潛病毒組(Carlavirusgroup)、香石竹斑駁病毒組(Carmovirusvirusgroup)、花椰菜花葉病毒組(GroupCaulimovirus)、長線形病毒纟且(ClosterovirusGroup)、鴨恥草黃化斑駁病毒組(Commelinayellowmottlevirusgroup)、虹豆花葉病毒組(Comovirusvirusgroup)、冠狀病菌科(Coronaviridae)、PM2p藍(lán)菌體組(PM2phagegroup)、覆蓋嗟菌體科(Corcicoviridae)、潛隱病毒組(GroupCrypticvirus)、隱病毒組(groupCryptovirus)、黃瓜花葉病毒組家族(CucumovirusvirusgroupFamily)、[PHgr]6噬菌體組([PHgr]6phagegro叩)、囊狀噬菌體科(Cysioviridae)、香石+個(gè)3不斑病毒纟且(GroupCarnationringspot)、香石竹病毒纟且(Dianthovirusvirusgroup)、蠶豆坤古萎病毒纟且(GroupBroadbeanwilt)、蠶豆病毒組(Fabavirusvimsgroup)、線狀病毒科(Filoviridae)、黃病毒科(Flaviviridae)、真菌傳桿狀病毒組(Furovirusgroup)、聯(lián)體病毒組(GroupGerminivirus)、賈第鞭毛蟲病毒組(GroupGiardiavirus)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、皰滲病毒科(Herpesviridae)、大麥病毒纟且(Hordeivirusvirusgroup)、等軸不牙急定環(huán)J趕病毒纟且(Illarvirusvirusgroup)、絲桿嗟菌體科(Inoviridae)、虹彩病毒一牛(Iridoviridae)、輕小謹(jǐn)菌體科(Leviviridae)、脂毛噬菌體科(Lipothrixviridae)、黃癥病毒組(Luteovirusgroup)、玉米雷亞朵非羅病毒組(Marafivirusvirusgroup)、玉米退纟錄病矮小病毒纟且(Maizechloroticdwarfvirusgroup)、^數(shù)小p盆茵體科(icroviridae)、肌尾p藍(lán)菌體牙牛(Myoviridae)、壞死病毒組(Necrovirusgroup)、線蟲傳多面體病毒組(N印ovirusvirusgroup)、野田村病毒科(Nodaviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、乳頭多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)、富寸粘病毒-牛(Paramyxoviridae)、歐防風(fēng)黃點(diǎn)病毒組(Parsnipyellowfleckvirusgroup)、雙組分雙鏈RNA球狀真菌病毒科(Partitiviridae)、細(xì)小病毒一牛(Parvoviridae)、S宛豆耳突花葉病毒組(Peaenationmosaicvirusgroup)、藻類DNA病毒科(Phycodnaviridae)、小RNA病毒科(Picomaviridae)、芽生喧菌體科(Plasmaviridae)、短尾病毒科(Prodoviridae)、多DNA病毒科(Polydnaviridae)、馬鈴薯X病毒組(Potexvirusgroup)、馬鈴薯Y病毒組(Potyvirus)、痘病毒科(Poxviridae)、呼腸孤病毒科(Reoviridae)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、根前毛菌噬菌體組(GroupRhizidiovirus)、長尾p藍(lán)菌體科(Siphoviridae)、南方菜豆花葉病毒組(Sobemovirusgroup)、SSV1畫型噬菌體(SSV1-TypePhages)、復(fù)層謹(jǐn)菌體科(Tectiviridae)、纖細(xì)病毒屬(Tenuivirus)、四體病毒科(Tetraviridae)、煙草花葉病毒組(GroupTobamovirus)、煙草脆裂病毒組(GroupTobravirus)、披膜病毒科(Togaviridae)、番茄叢矮病毒組(GroupTombusvirus)、環(huán)曲病毒屬(GroupTorovirus)、單組分雙鏈RNA球狀真菌病毒科(Totiviridae)、蕪菁黃化花葉病毒組(GroupTymovirus)和植物衛(wèi)星病毒(Plantvirussatellites)。產(chǎn)生重組病毒載體的方法和使用病毒載體進(jìn)行核酸傳遞的方法可見于例長口Cwre"f尸ratoco/s7W0/ecw/ar5Zo/ogy，Ausubel,F.M,等(編輯)GreenePublishingAssociates,(1989)和其它標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室指引(例如VectorsforGeneTherapy.載于CurrentProtocolsinHumanGenetics.JohnWileyandSons,Inc.:1997)。胞中的任意核普酸構(gòu)建物，例如質(zhì)粒、非病毒載體或病毒載體，如可包裝重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見例如Pastan等,尸亂編.JcW."S乂85:4486(1988);Miller等，Mo/.Ce〃.脂.6:2895(1986))。例如，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒可用于感染，并由此傳遞本發(fā)明核酸至感染細(xì)胞。將改變型核酸導(dǎo)入到哺乳動物細(xì)胞中的確切方法當(dāng)然不限于使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。其它技術(shù)普遍可用于該程序，包括使用腺病毒載體(Mitani等，TTzer.5:94l-948，l994)、腺相關(guān)病毒(AAV)載體(Goodman等，5/ood84:1492-1500，1994)、慢病毒載體(Naldini等，272:263-267，1996)、假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Agrawal等，//emato/.24:738-747,1996)，以及目前已知或以后鑒別的任意其它載體系統(tǒng)。還包括本領(lǐng)域眾所周知的嵌合病毒顆粒，其可包含來自兩種或多種不同病毒的任意組合的病毒蛋白和/或核酸，以產(chǎn)生功能性病毒載體。本發(fā)明的嵌合病毒顆粒還可包含非病毒來源的氨基酸序列和/或核苷酸序列(例如有利于將載體靶向特定細(xì)胞或組織和/或誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答)。本發(fā)明還提供"靶向"病毒顆粒(例如含細(xì)小病毒殼體和重組AAV基因組的細(xì)小病毒載體，其中外源耙向序列已插入或替換入細(xì)小病毒殼體中)。還可使用物理轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，例如脂質(zhì)體傳遞以及受體介導(dǎo)的和其它的胞吞機(jī)制(參見例如Schwartzenberger等，說ood87:472-478,1996)。本發(fā)明可與這些和/或其它常用核酸轉(zhuǎn)移方法中的任一種聯(lián)合使用。合適的轉(zhuǎn)染工具，包括病毒載體、化學(xué)轉(zhuǎn)染劑或物理-機(jī)械方法(如電穿孔)以及DNA直接擴(kuò)散，描述于例如Wolff等，247:1465-1468，(1990);和Wolff，淑臟352:815-818,(1991)。因此，可通過眾多周知方法中的任一種實(shí)現(xiàn)本發(fā)明核酸的施用，這些方法例如但不限于直接轉(zhuǎn)移核酸、在質(zhì)?；虿《据d體中或者經(jīng)由在細(xì)胞中或與諸如陽離子脂質(zhì)體的載體組合轉(zhuǎn)移。這樣的方法在本領(lǐng)域眾所周知，可容易地適用于本文描述的方法。而且，這些方法可利用載體的靶向特性用于^^向某些疾病和組織、器官和/或細(xì)胞類型和/或群體，這些載體應(yīng)當(dāng)是技術(shù)人員眾所周知的。還要充分理解的是，可在本發(fā)明核酸中使用細(xì)胞和組織特異性啟動子，以靶向特定組織和細(xì)胞和/或治療特定疾病和障礙。含本發(fā)明載體和/或核酸的細(xì)胞可為可包含本發(fā)明載體和/或核酸的任意細(xì)胞，包括但不限于得自肌肉(例如平滑肌、骨骼肌、心肌肌細(xì)胞)、肝臟(例如肝細(xì)胞)、心臟、腦(例如神經(jīng)元)、目艮(例如視網(wǎng)膜、角膜)、胰腺、腎、內(nèi)皮、上皮、干細(xì)胞(例如骨髓、臍血)、組織培養(yǎng)細(xì)胞(例如HeLa細(xì)胞)等的細(xì)胞，它們是本領(lǐng)域眾所周知的。在某些實(shí)施方案中，在與其它基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)相比時(shí)，本發(fā)明核酸具有降低水平的"泄漏性"。所謂"泄漏性"指系統(tǒng)處于"off，位時(shí)產(chǎn)生的基因產(chǎn)物或功能性RNA的量。例如，在本文描迷的某些實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明的核酸沒有與本發(fā)明的封閉寡核苦酸、小分子和/或其它化合物接觸時(shí)，給出的系統(tǒng)處于"off，位，因此，第一內(nèi)含子不被剪接。泄漏性可以是這些調(diào)節(jié)系統(tǒng)中固有的問題，但在所給出系統(tǒng)的某些實(shí)施方案中，泄漏性水平可低于本領(lǐng)域已知的系統(tǒng)。因此，本發(fā)明還提供一種基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其具有的泄漏性比其它基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)低，其中所迷系統(tǒng)包含本發(fā)明核酸和/或本發(fā)明載體。與其它系統(tǒng)相比，在所給出系統(tǒng)中泄漏性降低的程度可比在本領(lǐng)域已知系統(tǒng)中觀察到的泄漏量低5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%。作為一個(gè)實(shí)例，可通過在系統(tǒng)中使用報(bào)告基因并檢測系統(tǒng)處于"OFF"位時(shí)產(chǎn)生的報(bào)告基因產(chǎn)物量來測定系統(tǒng)的泄漏量?？墒褂帽姸鄿y定來檢測報(bào)告基因產(chǎn)物，包括但不限于蛋白檢測實(shí)驗(yàn)，如ELISA和蛋白質(zhì)印跡分析，以及核酸一全測實(shí)驗(yàn)，例如聚合酶鏈反應(yīng)、DNA印跡分析和RNA印跡分析。檢測基因產(chǎn)物的其它實(shí)驗(yàn)可包括功能性測定，例如檢測因基因產(chǎn)物引起的生物活性量。本發(fā)明的核酸和方法可用于對比性實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)與其它已知基因調(diào)節(jié)表達(dá)系統(tǒng)和其中使用的核酸相比泄漏性水平P爭4氐。本文還提供使用本發(fā)明核酸、載體和細(xì)胞的各種方法。具體地說，本文4是供一種產(chǎn)生本發(fā)明的第一RNA的方法，該方法包括a)使本發(fā)明的封閉寡核苦酸和/或'J、分子和/或其它化合物與本發(fā)明核酸在允許剪接的條件下接觸，其中封閉寡核苷酸和/或小分子和/或其它化合物封閉第二組剪接元件成員，導(dǎo)致第一內(nèi)含子通過剪接被去除，而產(chǎn)生第一RNA。另外提供一種生產(chǎn)蛋白的方法，該方法包括a)使本發(fā)明的封閉寡核香酸和/或'J、分子和/或其它化合物與本發(fā)明核酸在允許剪接的條件下接觸，這些條件在本領(lǐng)域應(yīng)當(dāng)是眾所周知的，在本文提供的實(shí)施例中有描述，其中封閉寡核苷酸封閉第二組剪接元件成員，導(dǎo)致第一內(nèi)含子通過剪接被去除，而產(chǎn)生第一RNA;和b)翻譯第一RNA，從而產(chǎn)生蛋白。在其它實(shí)施方案中，提供一種產(chǎn)生賦予生物功能的RNA的方法，該方法包括a)使本發(fā)明的封閉寡核苷酸和/或小分子和/或其它化合物與本發(fā)明核酸在允許剪接的條件下接觸，其中封閉寡核苷酸和/或小分子和/或其它化合物封閉第二組剪接元件成員，導(dǎo)致第一內(nèi)含子通過剪接被去除，而產(chǎn)生第一RNA;和b)翻譯第一RNA,從而產(chǎn)生賦予生物功能的RNA。在某些實(shí)施方案中，第一RNA可直接用作賦予生物功能的RNA，在其它實(shí)施方案中，第一RNA可被翻譯為賦予生物功能的RNA。在本文描述的任一種方法中，本發(fā)明的封閉寡核苷酸和/或小分子和/或其它化合物可被導(dǎo)入到含本發(fā)明核酸的細(xì)胞中，這樣的細(xì)胞可處于動物中，所述動物可為人、非人哺乳動物(狗、貓、馬、母牛等)或其它動物。本發(fā)明的封閉寡核苷酸是阻止特定剪接位點(diǎn)的剪接活性的寡核苷酸(例如RNA或DNA或二者的組合)。剪接活性被阻止的原因在于封閉寡核苷酸結(jié)合作為引導(dǎo)剪接事件的剪接元件組成員的核苷酸序列，由此抑制剪接元件活性，導(dǎo)致剪接活性被抑制。因此，封閉寡核苷酸可與剪接界(splicejunction)、5'剪接元件、3'剪接元件、隱蔽剪接元件、分支點(diǎn)、隱蔽分支點(diǎn)、天然剪接元件、突變型剪接元件等互補(bǔ)。本發(fā)明的封閉寡核苷酸的一些非限制性實(shí)例包括對P珠蛋白內(nèi)含子的654T突變特異性的GCTATTACCTTAACCCAG(SEQIDNO:37)和對卩珠蛋白內(nèi)含子的657GT突變特異性的GCACTTACCTTAACCCAG(SEQIDNO:38)。其它實(shí)例包括含以下幾項(xiàng)、基本由以下幾項(xiàng)組成和/或由以下幾項(xiàng)組成的寡核苷酸SEQIDNO:37、38、42、49、46、47、48、39、40、4i、43、44、45、72、73、76、79和80的核苷酸序列。至于在這些寡核苷酸序列背景下的"基本由……組成"，意指寡核苷酸可在寡核苷酸序列的3'末端或5'末端包括額外核苷酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)額外核苦酸)，這些額外核普酸并不顯著地影響寡核苷酸的功能或活性(例如這些額外的核苷酸不與原寡核苷酸序列的互補(bǔ)性序列雜交)。在其中封閉寡核苷酸用于本發(fā)明方法的方法中，封閉寡核苷酸在某些實(shí)施方案中可為不活化RNA酶H的寡核苷酸。不活化RNA酶H的寡核苷酸可按照已知技術(shù)制備。參見例如Pederson等的美國專利第5,149,797號。這樣的寡核苷酸可為脫氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，包含在空間上阻礙或防止RNA酶H與含所述寡核苷酸作為其一員的雙鏈分子結(jié)合的任意結(jié)構(gòu)修飾，該結(jié)構(gòu)修飾基本上不阻礙或破壞雙鏈形成。因?yàn)閰⑴c雙鏈形成的寡核苷酸部分與參與和RNA酶H結(jié)合的那些部分顯著不同，所以可獲得眾多不活化RNA酶H的寡核香酸。本發(fā)明的寡核苷酸還可為其中至少一個(gè)或全部核苷酸間橋接磷酸酯殘基為修飾型磷酸酯的寡核苷酸，所述修飾型磷酸酯例如為曱基磷酸酯、甲基硫代磷酸酯、嗎啉代磷酸酯(phosphoromorpholidates)、哌嗪代磷酸酯(phosphoropiperazidates)和氨基磷酸酯。作為另一個(gè)實(shí)例，每隔一個(gè)核苷酸間橋接磷酸酯殘基可如所述修飾。在另一個(gè)非限制性實(shí)例中，此寡核苷酸為其中至少一個(gè)或全部核苷酸包含2'低級烷基部分(例如Cl-C4直鏈或支鏈的飽和或不飽和烷基，例如曱基、乙基、乙烯基、丙基、l-丙烯基、2-丙烯基和異丙基)的寡核苷酸。例如，每隔一個(gè)核苷酸可如所述修飾。(另參見Furdon等，W"c/dcZc/A及仏17:9193-9204(1989);Agrawal等，尸rac.A^/.爿cac.Sd.87:1401-1405(1990);Baker等，M/c/e/c爿c/A18,3537-3543(1990);Sproat等，A^c/ez'c爿d^s17:3373-3386(1989);Walder和Walder，尸rac.A^/.Jcfldt/5^85:5011-5015(1988))。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的封閉核苷酸可包含修飾型核苷酸間橋聯(lián)磷酸酯殘基，后者可為但不限于任意組合的曱基硫代磷酸酯、嗎啉代磷酸酯、哌溱代磷酸酯和/或氨基磷酸酯。在某些實(shí)施方案中，封閉寡核苷酸可包含在其2'位具有低級烷基取代基的核普酸。本發(fā)明的修飾型寡核苷酸的額外實(shí)例包括肽核酸(PNA)和鎖定核酸(LNA)。在PNA中，主鏈由通過肽4建連接的重復(fù)的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單元組成。不同的堿基(嘌呤和嘧啶)通過亞曱羰基鍵連接至主鏈。與DNA或其它DNA類似物不同，PNA不包含任何戊糖部分或磷酸酯基團(tuán)。PNA被描述為類似在第一個(gè)(左側(cè))位置具有N-末端和在右側(cè)具有C-末端的肽。PNA主鏈不帶電，這賦予該聚合物在PNA/DNA鏈之間比PNA鏈之間和DNA鏈之間更強(qiáng)的結(jié)合。這是由于在PNA和DNA鏈之間沒有電荷排斥。采用同型嘧啶鏈的早期實(shí)驗(yàn)已表明，6聚體PNAT/DNAdA的Tm經(jīng)測定為31°C，相比之下DNAdT/DNAdA6聚體雙鏈體在低于10'C的溫度變性。具肽主鏈并攜帶噤呤和嘧咬堿基的PNA不是容易被核酸酶或蛋白酶識別的分子類別。因此，它們抗酶降解。PNA還在廣泛的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定。因?yàn)樗鼈儾蝗菀妆幻附到猓赃@些聚合物的壽命在體外和體內(nèi)均延長。另外，它們不帶電的事實(shí)有利于其穿過細(xì)胞膜，其較強(qiáng)的結(jié)合特性應(yīng)降低調(diào)節(jié)基因表達(dá)所需的寡核苷酸量。LNA是一類含核普的核酸，其主要的區(qū)別特征是在核糖環(huán)的2'-O和4'-C原子之間存在亞曱基橋。該橋限制了核苷酸類似物的呋喃核糖環(huán)的屈曲性，并將其鎖成剛性的雙環(huán)N-型構(gòu)象。而且，LNA誘導(dǎo)鄰近的DNA堿基釆用該構(gòu)象，導(dǎo)致形成熱動力學(xué)更穩(wěn)定形式的A雙鏈體LNA核苷，其包含出現(xiàn)在DNA中的4種普通核苷堿基(nucleobase)(A、T、G、C),這些堿基可按照標(biāo)準(zhǔn)Watson-Crick法則與其互補(bǔ)核苷配對?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺DNA合成化學(xué)法使LNA與DNA或RNA以及其它核酸類似物混合。因此，LNA寡核普酸可容易地用例如氨基接頭、生物素、熒光團(tuán)等標(biāo)記。因此，在設(shè)計(jì)引物和探針方面存在非常高的自由度。其鎖定構(gòu)象增加了對互補(bǔ)序列的結(jié)合親和力，提供了優(yōu)化和精調(diào)用于核酸的敏感性和特異性檢測的引物和探針的新化學(xué)方法。該差異可經(jīng)實(shí)驗(yàn)作為LNA-NA雜雙鏈體的熱穩(wěn)定性增加而觀察到，取決于序列中存在的LNA核苷數(shù)以及使用的核苷堿基的化學(xué)性質(zhì)這二者。該實(shí)驗(yàn)差異可用于調(diào)節(jié)寡核苷酸探針的特異性，其中所述探針設(shè)計(jì)用于通過標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)檢測特定核酸靶。本文使用的"第二組剪接元件成員"包括參與活化第二內(nèi)含子的剪接的任意元件。例如，第二組剪接元件元件可為天然DNA和/或前mRNA中的突變結(jié)果，所述突變可為產(chǎn)生新剪接元件的置換突變和/添加突變和/或缺失突變。因此，新剪接元件是限定第二內(nèi)含子的第二組剪接元件的一員。第二組剪接元件的其余成員還可為限定第一內(nèi)含子的剪接元件組成員。例如，如果突變產(chǎn)生新的第二個(gè)3'剪接位點(diǎn)，該位點(diǎn)既位于第一個(gè)3'剪接位點(diǎn)的上游(即5')，也位于第一個(gè)分支點(diǎn)的下游(即3'),則第一個(gè)5'剪接位點(diǎn)和第一個(gè)分支點(diǎn)可同時(shí)用作第一組剪接元件成員和第二組剪接元件成員。在某些情況下，導(dǎo)入第二組剪接元件可使一般靜息或不起剪接元件作用的RNA天然區(qū)被活化，而用作剪接元件。這樣的元件稱為"隱蔽，，元件。例如，如果導(dǎo)入位于第一個(gè)3'剪接位點(diǎn)和第一個(gè)分支點(diǎn)之間的新3'剪接位點(diǎn)，則其可活化新3'剪接位點(diǎn)和第一個(gè)分支點(diǎn)之間的隱蔽分支點(diǎn)。在其它情況下，導(dǎo)入位于第一個(gè)分支點(diǎn)和第一個(gè)5'剪接位點(diǎn)之間的新5'剪接位點(diǎn)，還可活化順序地位于新5'剪接位點(diǎn)上游的隱蔽3'剪接位點(diǎn)和隱蔽分支點(diǎn)。在此情況下，第一內(nèi)含子被分為兩個(gè)異常內(nèi)含子，新外顯子位于它們之間。此外，在其中第一個(gè)剪接元件(特別是分支點(diǎn))也是第二個(gè)剪接元件組成員的某些情況下，有可能封閉第一個(gè)元件，并活化隱蔽元件(即隱蔽分支點(diǎn))，該隱蔽元件將募集第一組剪接元件的其余成員，以迫使正確的剪接超過不正確的剪接。還要指出的是，在隱蔽剪接元件被活化時(shí)，其可位于任一個(gè)內(nèi)含子中和/或鄰近的一個(gè)外顯子中。因此，如上所示，根據(jù)組成"第二組剪接元件"的剪接元件組，本發(fā)明的封閉寡核苷酸、小分子和/或其它化合物可封閉各種不同的剪接元件，以實(shí)施本發(fā)明。例如，其可封閉突變元件、隱蔽元件、天然元件、5'剪接位點(diǎn)、3'剪接位點(diǎn)和/或分支點(diǎn)。一般來說，其將不封閉還限定第一內(nèi)含子的剪接元件，當(dāng)然要考慮到如上所論述的情況封閉第一內(nèi)含子的剪接元件活化隱蔽元件，然后隱蔽元件用作第一組剪接元件的替代成員，并參與正確剪接。封閉寡核苷酸的長度(即其中核苷酸的數(shù)量)并不關(guān)鍵，只要其選擇性結(jié)合至預(yù)期位置，并可按照常規(guī)程序測定。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的封閉寡核苷酸可為約5個(gè)至約100個(gè)核苷酸長。具體地說，本發(fā)明的封閉寡核苷酸可為約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個(gè)核苦酸長。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的封閉寡核苷酸為8-50個(gè)核苷酸長。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，封閉寡核苷酸為15-25個(gè)核苷酸長，還可為18-20個(gè)核苷酸長。封閉寡核苷酸可作為相同寡核苷酸群和/或彼此之間以任意組合和/或任意比率存在的不同寡核苷酸群用于本文所述方法。本發(fā)明的小分子是與其它小分子相比在結(jié)構(gòu)上和/或功能上不同的活性化合物，其具有低分子量(例如《5000道爾頓)。小分子可為天然或合成物質(zhì)。它們可通過有^l化學(xué)方法合成，和/或由天然來源如植物、真菌和微生物分離。小分子可為"藥物樣的"(例如阿司匹林、青霉素、化療劑)、有毒的和/或天然的。小分子藥物可為一種或多種活性化合物，通常配制為口服使用的丸劑，其與特定生物靶如受體、酶或離子通道相互作用，以提供療效。本發(fā)明小分子的具體但非限制性的實(shí)例包括抗生素、核苦類4以物(例如豐加霉素)和適體(例如RNA適體；DNA適體)。本發(fā)明的小分子可為存在于大量小分子文庫中的小分子，其中一些是商品化的?？砂景l(fā)明小分子的文庫的非限制性實(shí)例包括由各個(gè)商業(yè)機(jī)構(gòu)獲得的小分子文庫，這些商業(yè)機(jī)構(gòu)例如為SPECS和BioSPECB.V.(Rijswijk,theNetherlands)、ChembridgeCorporation(SanDiego,CA)、ComgenexUSAInc.,(Princeton,NJ)、MaybridgeChemicalLtd.(Cornwall,UK)和Asinex(Moscow,Russia)。一個(gè)代表性實(shí)例稱為DIVERSet,得自ChemBridgeCorporation,16981ViaTazon，SuiteG,SanDiego，Calif.92127。DIVERSet包含10,000-50,000個(gè)人工合成的藥物樣小分子。預(yù)選擇化合物，以形成用最少量的化合物覆蓋最大藥效團(tuán)多樣性并適于高通量或低通量篩選的"通用"文庫。有關(guān)其它文庫的描述，參見例如Tan等，"StereoselectiveSynthesisofOverTwoMillionCompoundsHavingStructuralFeaturesBothReminiscentofNaturalProductsandCompatiblewithMiniaturizedCell-BasedAssays"爿w.C/zewSoc.120,8565-8566，1998;Floyd等，iVogMec/CTzew36:91-168，1999。眾多文庫是商品化的，例如來自AnalytiConUSAInc.,P.O.Box5926,Kingwood，Tex.77325;3-DimensionalPharmaceuticals,Inc.,665StocktonDrive,Suite104,Exton，Pa.19341-1151;Tripos，Inc.,1699HanleyRd.,St.Louis,Mo"63144-2913，等等。本發(fā)明的小分子和其它化合物可通過各種機(jī)制操作，以改變本發(fā)明核酸中的剪接事件。例如，本發(fā)明的小分子和其它化合物可干涉剪接復(fù)合物、剪接體及其組分如hnRNP、snRNP、SR-蛋白和其它剪接因子或元件的形成和/或功能和/或其它特性，導(dǎo)致阻止和誘導(dǎo)前-mRNA分子中的剪接事件。作為另一個(gè)實(shí)例，本發(fā)明的小分子和其它化合物可阻止和/或改變基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄，所述基因產(chǎn)物可包括例如但不限于hnRMP、snRNP、SR-蛋白和其它剪接因子，它們隨后參與特定剪接體的形成和/或功能。本發(fā)明的小分子和其它化合物還可阻止和/或改變基因產(chǎn)物的磷酸4t、糖基化和/或其它修飾，所述基因產(chǎn)物包括但不限于hnRNP、snRNP、SR-蛋白和其它剪接因子，它們隨后參與特定剪接體的形成和/或功能。另外，本發(fā)明的小分子和其它化合物可結(jié)合和/或要不然影響特定前mRNA,使得特定剪接事件經(jīng)某種機(jī)制被阻止或誘導(dǎo)，該機(jī)制不包括以序列特異性方式與RNA堿基配對。本發(fā)明還提供一種在受治療者中產(chǎn)生賦予生物功能的蛋白和/或RNA的方法，該方法包括a)將本發(fā)明的核酸、載體和/或細(xì)胞導(dǎo)入受治療者中；和b)將封閉第二組剪接元件成員的本發(fā)明的封閉寡核苷酸和/或小分子和/或其它化合物導(dǎo)入受治療者中，由此在受治療者中產(chǎn)生賦予生物功能的蛋白和/或RNA。另外提供一種在受治療者中調(diào)節(jié)賦予生物功能的蛋白和/或RNA的產(chǎn)生的方法，該方法包括a)將本發(fā)明的核酸、載體和/或細(xì)胞導(dǎo)入受治療者中；和b)在期望產(chǎn)生所述蛋白和/或RNA時(shí)將封閉第二組剪接元件成員的本發(fā)明的封閉寡核苷酸和/或小分子和/或其它化合物導(dǎo)入受治療者中，由此在受治療者中調(diào)節(jié)該蛋白和/或RNA的產(chǎn)生?？砂凑毡绢I(lǐng)域已知方法監(jiān)測隨時(shí)間變化的存在于受治療者中的蛋白和/或RNA的量，當(dāng)該量落在期望水平和/或治療水平之下時(shí)，可將封閉寡核苷酸、小分子和/或其它化合物導(dǎo)入受治療者中，以增加蛋白和/或RNA的產(chǎn)生，由此調(diào)節(jié)所述產(chǎn)生。在其中將本發(fā)明的核酸、栽體和/或細(xì)胞施用給受治療者的本文所述方法中，所述核酸、載體和/或細(xì)胞最初可在沒有封閉寡核苷酸和/或小分子和/或其它化合物的情況下存在于受治療者中，該封閉寡核香酸和/或小分子和/或其它化合物的存在會導(dǎo)致封閉第二組剪接元件成員。在此狀況下，第二組剪接元件有活性，由第一核苷酸序列編碼的、賦予生物功能的外源蛋白、肽和/或RNA在受治療者中沒有產(chǎn)生或產(chǎn)生非常少(不顯著)。當(dāng)本發(fā)明的封閉寡核苷酸、小分子和/或其它化合物存在于受治療者中時(shí)，核酸上的第二組剪接元件成員被封閉，導(dǎo)致通過剪接去除第一內(nèi)含子，隨后在受治療者中產(chǎn)生由第一核苦酸序列編碼的、賦予生物功能的蛋白和/或RNA?？稍谙鄬τ趯⒈景l(fā)明的核酸、載體和/或細(xì)胞導(dǎo)入受治療者中的任意時(shí)刻將封閉寡核苷酸、小分子和/或其它化合物導(dǎo)入受治療者中。例如，可在將所述核酸、載體和/或細(xì)胞導(dǎo)入受治療者中之前、同時(shí)和/或之后將封閉寡核苷酸、小分子和/或其它化合物導(dǎo)入受治療者中。而且，封閉寡核香酸、小分子和/或其它化合物可以任意時(shí)間間隔一次或多次施用，并可擴(kuò)展至受治療者的整個(gè)生命期。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種在受治療者中治療疾病或障礙的方法，該方法包括a)將有效量的本發(fā)明核酸、載體和/或細(xì)胞導(dǎo)入受治療者中；和b)將有效量的本發(fā)明封閉寡核苷酸、小分子和/或其它化合物導(dǎo)入受治療者中，由此在所述受治療者中治療疾病。當(dāng)核酸、載體和/或細(xì)胞以及封閉寡核苷酸、小分子和/或其它化合物存在于受治療者中時(shí)，它們在某些條件下存在，借助于這些條件，封閉寡核苷酸、小分子和/或其它化合物可接觸核酸，并封閉第二組剪接元件成員，由此導(dǎo)致在受治療者中產(chǎn)生蛋白、肽和/或賦予生物功能的RNA。在本發(fā)明的另外實(shí)施方案中，依據(jù)本發(fā)明方法的基因表達(dá)調(diào)節(jié)可與本文描述的系統(tǒng)相反發(fā)生。具體地說，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在沒有調(diào)節(jié)剪接介導(dǎo)的表達(dá)(例如不產(chǎn)生第一RNA，導(dǎo)致產(chǎn)生蛋白、肽和/或賦予生物功能的RNA)的封閉寡核苷酸、小分子和/或其它化合物的情況下，所述系統(tǒng)處于本文所述的"OFF'位。在某些其它實(shí)施方案中，在沒有調(diào)節(jié)剪接介導(dǎo)的表達(dá)的封閉寡核苷酸、小分子和/或其它化合物的情況下，本發(fā)明的系統(tǒng)可處于"ON"位。在后面的這些實(shí)施方案中，可實(shí)施本發(fā)明的方法，由此在導(dǎo)致第一內(nèi)含子被去除而產(chǎn)生第一RNA的條件下存在的本發(fā)明的核酸、載體和/或細(xì)胞與本發(fā)明的封閉寡核苷酸、小分子和/或其它化合物接觸，導(dǎo)致封閉第一組剪接元件成員，由此導(dǎo)致第二內(nèi)含子被剪接和去除，從而未產(chǎn)生第二RNA分子和/或產(chǎn)生不賦予生物功能的第二RNA分子。本發(fā)明的核酸、載體、細(xì)胞、封閉寡核苷酸、小分子和/或其它化合物的"有效量"指無毒但足以提供期望作用的量，所述期望作用可為有益作用或治療性作用。本領(lǐng)域眾所周知，需要的確切量將在受治療者之間變化，取決于受治療者的年齡、性別、物種、身體狀況、要治療的病癥的嚴(yán)重性、要施用的具體藥劑等。在任意個(gè)體情況中適宜的"有效量"可由本領(lǐng)域一般技術(shù)人員參照相關(guān)教科書和文獻(xiàn)(例如iew/"gtowk7V^聽ce"".c"/5We"ces(最新版)和/或使用常規(guī)藥理學(xué)方法確定。本文使用的"治療"指給予受治療者利益的任意治療類型，其中所述受治療者被診斷為患有疾病或障礙、處于疾病或障礙的風(fēng)險(xiǎn)之中、疑似患有和/或可能患有疾病或障礙，所述疾病或障礙以積極方式對本發(fā)明的蛋白和/或RNA起反應(yīng)。利益可包括受治療者身體狀況(例如一種或多種癥狀)的改善、病癥演進(jìn)的延遲和/或逆轉(zhuǎn)、疾病或障礙發(fā)作的預(yù)防或延遲，等等。如本文所指出的，本發(fā)明提供一種治療本發(fā)明的障礙或疾病的方法，該方法包括a)將有效量的本發(fā)明核酸導(dǎo)入受治療者中；和b)將有效量的本發(fā)明封閉寡核苷酸和/或小分子導(dǎo)入受治療者中，由此治療受治療者中的障礙或疾病?？赏ㄟ^本發(fā)明方法治療的疾病或障礙可包括對治療有響應(yīng)的任意疾病或障礙，所述治療包括在受治療者中存在本發(fā)明的蛋白、肽和/或賦予生物功能的RNA和/或它們的量增加。這樣的蛋白、肽和/或RNA可通過將本發(fā)明的核酸、載體和/或細(xì)胞導(dǎo)入到受治療者中以及將本發(fā)明的封閉寡核苷酸、小分子和/或其它化合物導(dǎo)入受治療者中而存在于受治療者中。ir在r哲由本發(fā)明的第一個(gè)核苷酸序列編碼并可賦予治療性作用的基因產(chǎn)物的一些實(shí)例包括代謝性疾病，例如糖尿病(胰島素)、生長/發(fā)育障礙(生長激素、調(diào)節(jié)生長因子的鋅指蛋白)、凝血障礙(例如血友病A(VIII因子)、血友病B(IX因子))、中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙(例如癲癇發(fā)作、帕金森病(膠質(zhì)細(xì)胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)和GDNF樣生長因子)、阿爾茨海默病(神經(jīng)生長因子、GDNF和GDNF樣生長因子)、肌萎縮性側(cè)索硬化、脫髓鞘病)、同種異體骨移植(骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(蛋白1-9，例如MBP2))、炎性疾病(例如關(guān)節(jié)炎、自身免疫病)、肥胖、癌癥、心血管疾病(例如充血性心力衰竭(受磷蛋白和〔&++泵相關(guān)基因))、黃斑變性(色素上皮衍生因子(PDEF)、P-地中海貧血、a-地中海貧血、Tay-Sachs綜合癥、苯丙酮酸尿癥、嚢性纖維化和/或病毒感染。其它實(shí)例包括編碼可溶解CD4、用于治療AIDS的核酸以及用于治療由oc-抗胰蛋白酶缺乏引起的肺氣腫的a-胰蛋白酶?？赏ㄟ^本發(fā)明方法和組合物治療的其它疾病、綜合癥和病癥包括例如腺苷脫氨酶缺乏癥、鐮狀細(xì)胞缺乏癥、諸如亨廷頓舞蹈病的腦病、溶酶體沉積病、高歇病、胡爾勒病、克拉伯病、諸如顯性脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)的運(yùn)動神經(jīng)元病(實(shí)例包括SCA1、SCA2和SCA3)、地中海貧血、血友病、苯丙酮酸尿癥和心臟病(例如由膽固醇代謝改變引起的心臟病)和免疫系統(tǒng)缺陷?？赏ㄟ^這些方法治療的其它疾病包括代謝疾病，例如肌與骨骼疾病、心血管疾病和癌癥。本發(fā)明的核酸還可傳遞至氣道上皮，以治療遺傳疾病，例如嚢性纖維化、假性醛固酮減少癥和纖毛不能移動綜合征，以及非遺傳性疾病(例如支氣管炎、哮喘)。本發(fā)明的核酸還可傳遞至肺泡上皮，以治療遺傳性疾病(例如a-l-抗胰蛋白酶)以及肺病(例如治療肺炎和肺氣腫肺纖維化、肺水腫；傳遞編碼表面蛋白的核酸至早產(chǎn)兒或ARDS患者)。一般來說，本發(fā)明的核酸和載體可用于傳遞任何具有生物功能的核酸，以治療或緩解與任意基因表達(dá)相關(guān)性疾病有關(guān)的癥狀。示例性病狀包括但不限于嚢性纖維化(和其它肺病)、血友病A、血友病B、地中海貧血、貧血和其它血液疾病、AIDS、癌癥(例如腦瘤)、糖尿病、肌營養(yǎng)不良(例如Duchenne、Becker)、高歇病、胡爾勒病、腺苦脫氨酶缺乏癥、糖原貯積病和其它代謝缺陷、粘多糖病和實(shí)質(zhì)器官(例如腦、肝、腎、心臟、肺、目艮)疾病等。在某些實(shí)施方案中，可施用本發(fā)明的傳遞載體，以治療CNS病，包括遺傳疾病、神經(jīng)變性性疾病、精神疾病和/或腫瘤。示例性的CNS疾病包括但不限于阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、Rett綜合癥、Canavan病、Leigh病、Refsum病、Tourette綜合癥、原發(fā)性側(cè)索硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化、進(jìn)行性肌萎縮、Pick病、肌營養(yǎng)不良、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、Binswanger病、歸因于脊髓或頭部損傷的外傷、TaySachs病、Lesch-Nyan病、癲癇、腦梗塞、精神疾病(包括心境障礙(例如抑郁、雙相情感障礙、持續(xù)性情感障礙、繼發(fā)性心境障礙))、精神分裂癥、藥物依賴性(例如醇中毒和其它物質(zhì)依賴性)、神經(jīng)癥(例如焦慮、強(qiáng)迫性障礙、身體癥狀性疾患(somatoformdisorder),分離性障礙、悲慟、產(chǎn)后抑郁癥)、精神病(例如幻覺和妄想)、癡呆、偏執(zhí)狂、注意力不集中癥、性心理障礙、睡眠障礙、疼痛疾病、進(jìn)食或體重障礙(例如^1巴胖、惡病質(zhì)、神經(jīng)性食欲缺乏和貪食癥)以及CNS癌癥和腫瘤(例如垂體瘤)?？砂凑毡景l(fā)明方法治療的CNS疾病包括涉及視網(wǎng)膜、后束和視神經(jīng)的眼部疾病(例如色素性視網(wǎng)膜炎、糖尿病^f見網(wǎng)膜病和其它視網(wǎng)膜變性性疾病、葡萄膜炎、年齡相關(guān)性黃斑變性、青光眼)。即便不是全部也有大部分眼科疾病和障礙與以下三種類型適應(yīng)癥中的一種或多種相關(guān)(l)血管生成，(2)炎癥，和(3)變性。本發(fā)明的傳遞載體可用于傳遞抗血管生成因子；抗炎因子；延遲細(xì)胞變性、促進(jìn)細(xì)胞保留或促進(jìn)細(xì)胞生長的因子，以及前述的組合。例如，糖尿病性視網(wǎng)膜病的特征在于血管生成。糖尿病性視網(wǎng)膜病可通過眼內(nèi)(例如在玻璃體中)或眼周(例如在筋膜下區(qū))傳遞一種或多種抗血管生成因子來治療。還可眼內(nèi)(例如玻璃體內(nèi))或眼周共傳遞一種或多種神經(jīng)營養(yǎng)因子。葡萄膜炎涉及炎癥。一種或多種抗炎因子可通過眼內(nèi)(例如玻璃體或前房)施用本發(fā)明的核酸來l^予。比較起來，色素性視網(wǎng)膜炎的特征在于視網(wǎng)膜變性。在示例性實(shí)施方案中，色素性視網(wǎng)膜炎可通過眼內(nèi)(例如玻璃體)施用編碼一種或多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的傳遞載體來治療。年齡相關(guān)性黃斑變性涉及血管生成和視網(wǎng)膜變性這二者。該疾病可通過眼內(nèi)(例如玻璃體)施用編碼一種或多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的本發(fā)明核酸和/或眼內(nèi)或眼周(例如在筋膜下區(qū))施用編碼一種或多種抗血管生成因子的本發(fā)明核酸來治療。青光眼的特征在于眼壓增加和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失。青光眼的治療包括使用本發(fā)明的傳遞載體施用一種或多種保護(hù)細(xì)胞免遭興奮毒性損傷的神經(jīng)保護(hù)劑。這樣的藥劑包括眼內(nèi)、優(yōu)選玻璃體內(nèi)傳遞的N-曱基-D-天冬氨酸(NMDA)拮抗劑、細(xì)胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于治療癲癇發(fā)作，例如減少癲癇的發(fā)作、發(fā)病率和/或嚴(yán)重性。癲癇發(fā)作的治療性治療的效力可通過行為(例如眼或嘴的顫動、抽搐)和/或電描記圖法(大部分癲癇發(fā)作具有才示i己電4苗記圖異常(signatureelectrographicabnormalities))來評價(jià)。因此，本發(fā)明還可用于治療以隨時(shí)間推移的多次癲癇發(fā)作為標(biāo)志的癲癇。作為又一個(gè)實(shí)例，可使用本發(fā)明的傳遞載體將促生長素抑制素(或其活性片段)傳遞至腦，以治療垂體瘤。按照該實(shí)施方案，編碼促生長素抑制素(或其活性片4幻的傳遞載體可通過微量輸注給予到垂體中。同樣，此治療可用于治療^I支端肥大癥(垂體的異常生長激素分泌)。促生長素抑制素的核酸序列(例如GenBank登錄號J00306)和氨基酸序歹'K例如GenBank登錄號P01166;包含經(jīng)加工的活性肽促生長素抑制素-28和促生長素抑制素-14)是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明還提供篩選能調(diào)節(jié)本發(fā)明核酸中剪接事件的化合物的方法。因此，在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種鑒別化合物的方法，其中所述化合物封閉本發(fā)明核酸的第二組剪接元件成員，所述方法包括a)使核酸與該化合物在允許剪接的條件下接觸；和b)檢測第一RNA的產(chǎn)生或第二RNA的產(chǎn)生，借此第一RNA的產(chǎn)生鑒別出封閉本發(fā)明核酸的第二組剪接元件成員的化合物，而第二RNA的產(chǎn)生鑒別不封閉第二組剪接元件成員的化合物。這些方法還可用于鑒別出允許增加或降低第一種和/或第二RNA的產(chǎn)生的化合物。由本文所述方法鑒別的化合物可用于本發(fā)明的方法，包括生產(chǎn)賦予生物功能的蛋白和/或RNA的方法以及治療方法。在其它實(shí)施方案中，可變剪接事件可通過使用本發(fā)明的寡核苷酸、小分子和/或化合物來調(diào)節(jié)。例如，可將本發(fā)明的核酸、載體和/或細(xì)胞連同本發(fā)明的封閉寡核苷酸、小分子和/或化合物一起導(dǎo)入到受治療者中，從而由于對特定組剪接組的活化而在受治療者中產(chǎn)生賦予生物功能的第一種蛋白和/或RNA?？晒こ谈脑煜嗤暮怂幔酝ㄟ^活化剪接組的不同組而編碼在受治療者中賦予生物功能的不同蛋白、肽和/或RNA。當(dāng)將不同的本發(fā)明封閉寡核苷酸、小分子和/或化合物導(dǎo)入到受治療者中時(shí)，產(chǎn)生不同的蛋白和/或RNA。作為實(shí)例，當(dāng)存在第一種封閉寡核苷酸、小分子和/或其它化合物時(shí)，第一RNA可產(chǎn)生第一種目標(biāo)蛋白，而在加入不同的第二種本發(fā)明封閉寡核苷酸、小分子和/或化合物后，第二RNA可導(dǎo)致產(chǎn)生第二種目標(biāo)蛋白或功能RNA(例如可產(chǎn)生第一種蛋白的同種型(例如白介素(IL)-4及其剪接變體IL4A"。(參見例如Fletcher等,"IncreasedexpressionofmRNAencodinginterleukin(IL)-4anditssplicevariantIL-4A2incellsfromcontactsofAfyco6ac/en.畫fwZerw/as7.j，intheabsenceofv/rrostimulation"immwwo/ogy2004年8月;112(4):669-73;Minn等,"Insulinomasandexpressionofaninsulinsplicevariant"￡a"c"2004年1月31日；363(9406):363-7;Schlueter等,"Tissue-specificexpressionpatternsoftheRAGEreceptoranditssolubleforms—aresultofregulatedalternativesplicing"Sz.o//^s勿"2003年10月20日；1630(l):l-6;Vegran等，"Implicationofalternativesplicetranscriptsofcaspase-3andsurvivininchemoresistance"歸C"膨r2005年3月；92(3):219-26;Ren等，"AlternativesplicingofvitaminD-24勿droxylase:Anovelmechanismfortheregulationofextra-renal1,25-dihydroxyvitaminDsynthesis，V傷o/CTzew.2005年3月23日；等,"Mutanthuntingtonprotein:asubstratefortransglutaminase1，2,and3"/A^"ra/7a^/70/TVewro/2005年1月；64(1):58-65;Ding和Keller."Splicevariantsofthereceptorforadvancedglycosylationendproducts(RAGE)inhumanbrain"臉w簡c/丄饑2005年l月3日；373(1):67-72;等,"Transcriptscanningrevealsnovelandextensivesplicevariationsinhuman1-typevoltage-gatedcalciumchannel,Cavl.2alsubunit"/腺Cto2004年10月22日；279(43):44335-43,2004年8月6日電子版。所有這些文獻(xiàn)都整體在此引入作為參考)。本發(fā)明還提供組合物中的本發(fā)明核酸、載體和/或細(xì)胞。因此，在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種組合物，其包含在藥學(xué)可接受載體中的本發(fā)明核酸、本發(fā)明栽體和/或本發(fā)明細(xì)胞。所謂"藥學(xué)可接受載體"指與藥用組合物中的其它成分相容并對受治療者無害或無毒的載體。具體地說，意指藥學(xué)可接受載體是配制用于施用給或傳遞至本發(fā)明受治療者的無菌載體。還提供含本發(fā)明組合物和藥學(xué)可接受載體的藥用組合物。本文描述的組合物可配制用于按照已知技術(shù)在藥用載體中施用。參見例如Remington,TTze5Wewce/l"dPrac"'ceo/尸/zarmacy(最新版)。所迷載體可為固體或液體或這二者，優(yōu)選與本發(fā)明組合物一起配制為單位劑量制劑，例如片劑，其可相當(dāng)于所述組合物重量的約0.01或0.5°/。至約95%或99%。藥用組合物通過任一種眾所周知的藥學(xué)技術(shù)制備，包括但不限于混合組分，可選i也包含一種或多種助劑組分。本發(fā)明的藥用組合物包括適于口服、直腸、局部、吸入(例如通過氣溶膠)、口腔含化(例如舌下)、陰道、胃腸外(例如皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、胸膜內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、動脈內(nèi)或靜脈內(nèi))、局部(即皮膚和粘膜表面，包括氣管表面)和經(jīng)皮施用的組合物，但如本領(lǐng)域眾所周知的，在給定情況下最適宜的途徑將取決于諸如受治療者的物種、年齡、性別和整體身體狀況、要治療病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重性和/或要施用的具體組合物的性質(zhì)(即劑量、制劑)之類的因素。適于口服施用的藥用組合物可存在于分立單位中，例如膠嚢劑、扁嚢劑、錠劑或片劑，每種均含預(yù)定量的本發(fā)明組合物；作為粉劑或顆粒劑存在；作為在水性或非水性液體中的溶液或懸浮液存在；或作為水包油或油包水型乳劑存在?？赏ㄟ^使本發(fā)明的組合物與能夠抵抗動物腸道中的消化酶降解的載體復(fù)合來實(shí)施口服傳遞。此類載體的實(shí)例包括本領(lǐng)域已知的塑料膠嚢或片劑。這些制劑可通過任一種適宜的藥學(xué)方法制備，所迷方法包括使組合物和適宜載體(其可包含一種或多種如上指出的助劑組分)結(jié)合的步驟。一般來說，如下制備依照本發(fā)明實(shí)施方案的藥用組合物將組合物與液體或細(xì)碎固體載體或這二者均一并緊密地混合，然后，如果需要的話，將所獲得的混合物定型。例如，片劑可通過壓制或模制含所述組合物且可選地具有一種或多種助劑的粉劑或顆粒劑來制備。壓片如下制備在適宜的機(jī)器中壓制自由流動形式的組合物，例如粉末或顆粒劑，其可選地與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑和/或表面活性劑/分散劑混合。模制的片劑通過在適宜的機(jī)器中模制用惰性液體粘合劑潤濕的粉狀化合物制備。適于口腔含化(舌下)施用的藥用組合物包括在調(diào)味基劑(通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠)中的含本發(fā)明組合物的錠劑；以及在惰性基劑(例如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠)中的含所述組合物的軟錠劑。適于胃腸外施用的本發(fā)明藥用組合物可包含本發(fā)明組合物的無菌水性和非水性注射溶液，所述制備物優(yōu)選與預(yù)期接受者的血液等滲。這些制備物可包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和溶質(zhì)，它們使組合物與預(yù)期接受者的血液等滲。水性和非水性無菌懸浮液、溶液和乳劑可包括懸浮劑和增稠劑。非水性溶劑的實(shí)例為丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油和可注射有機(jī)酯，例如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。胃腸外溶媒包括氯化鈉溶液、Ringer氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸鹽Ringer或非揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)溶媒包括流體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(例如基于Ringer氏葡萄糖的補(bǔ)充劑)等。還可存在防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。所述組合物可存在于單位劑量或多劑量容器中，例如存在于密封安瓿和管形瓶中，并可儲存于冷凍干燥(凍干)條件下，其僅需要在臨使用前加入無菌液體載體，例如鹽水或注射用水。臨場調(diào)制的注射溶液和懸浮液可由先前描述類型的無菌粉劑、顆粒劑和片劑制備。例如，可提供在密封容器中為單位劑型的可注射的、穩(wěn)定的、無菌的本發(fā)明組合物。所述組合物可以凍干品的形式提供，凍干品可用適宜的藥學(xué)可接受載體復(fù)水，以形成適于注射入受治療者中的液體組合物。單位劑型可為約11^g至約10g本發(fā)明組合物。當(dāng)所述組合物基本不溶于水時(shí)，可納入足量的生理學(xué)可接受的乳化劑，其量足以乳化在水性載體中的組合物。一種這樣的有用乳化劑是磷脂酰膽石咸。適于直腸施用的藥用組合物優(yōu)選以單位劑量的栓劑存在。這些栓劑可如下制備將所述組合物與一種或多種常規(guī)固體載體(例如可可脂)混合，然后將所獲混合物定型。適于局部施用于皮膚的本發(fā)明藥用組合物優(yōu)選采用軟膏劑、霜?jiǎng)?、洗劑、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣溶膠或油劑的形式?？墒褂玫妮d體包括但不限于凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇類、透皮促進(jìn)劑及其兩種或多種的組合。在某些實(shí)施方案中，例如，局部傳遞可如下實(shí)施將本發(fā)明的藥用組合物與能夠穿透皮膚的親脂試劑(例如DMSO)混合。適于經(jīng)皮施用的藥用組合物可為分立貼劑的形式，適于長時(shí)間保持與受治療者的表皮緊密接觸。適于經(jīng)皮施用的組合物還可通過離子電滲療法(參見例如P/zarwaceWca/A"ean^3:318(1986))傳遞，通常采用本發(fā)明組合物的任選緩沖的水溶液形式。適宜的制劑可包含檸檬酸鹽或bis\tris緩沖液(pH6)或乙醇/水，并可包含0.1-0.2M活性成分。本發(fā)明組合物的有效量將在組合物之間和受治療者之間變化，并取決于諸如受治療者的年齡、物種、性別、體重、整體身體狀況以及要治療的具體疾病或障礙之類的各種因素?？砂凑毡绢I(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的常規(guī)藥學(xué)方法確定有效量。在某些實(shí)施方案中，約O.l昭/kg至約lg/kg的劑量將具有治療效力。在使用病毒載體傳遞本發(fā)明核酸的實(shí)施方案中，可檢測病毒劑量，以根據(jù)使用的病毒納入特定數(shù)量的病毒顆?；蚴删咝纬蓡挝?pfo)或感染顆粒。例如，在某些實(shí)施方案中，具體單位劑量可包括約103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或10"pfii或感染顆粒。本發(fā)明組合物的施用頻率可為賦予期望的療效所必需的頻率。例如，組合物可每天施用1、2、3、4次或更多次，1周施用1、2、3、4次或更多次，1個(gè)月施用1、2、3、4次或更多次，1年施用1、2、3、4次或更多次和/或根據(jù)需要施用，以控制具體病癥和/或?qū)崿F(xiàn)特定作用和/或利益。在某些實(shí)施方案中，在受治療者一生中施用1、2、3或4劑足可獲得期望的療效。施用本發(fā)明組合物的量和頻率將根據(jù)要治療或要預(yù)防的具體病癥和期望的療效而有所變化。本發(fā)明的組合物可體內(nèi)或離體(exWvo)施用給受治療者的細(xì)胞。對于體內(nèi)施用給受治療者的細(xì)胞以及施用給受治療者，例如如上所述，可口服、胃腸外(例如靜脈內(nèi))、肌內(nèi)注射、皮內(nèi)(例如通過基因槍)、腹膜內(nèi)注射、皮下注射、經(jīng)皮、離體、局部等施用本發(fā)明的組合物。另外，本發(fā)明的組合物可按照本領(lǐng)域眾所周知的方法被脈沖到由受治療者細(xì)胞分離或培養(yǎng)的樹突細(xì)胞上，或者脈沖到受治療者的混合PBMC或其各種細(xì)胞亞組分上。如果使用離體方法，則可4要照本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法取出細(xì)胞或組織，并在機(jī)體外部保持，同時(shí)將本發(fā)明組合物導(dǎo)入到所迷細(xì)胞或組織中。例如，可經(jīng)任意基因轉(zhuǎn)移機(jī)制，例如病毒介導(dǎo)的基因傳遞、磷酸4丐介導(dǎo)的基因傳遞、電穿孔、微注射或脂蛋白體，將本發(fā)明的核酸和載體導(dǎo)入到細(xì)l包中。然后可按照用于所述細(xì)胞或組織類型的標(biāo)準(zhǔn)方法將轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞灌輸(例如在藥學(xué)可接受的載體中)或移植回受治療者中。用于將各種細(xì)胞移植或灌輸入受治療者中的標(biāo)準(zhǔn)方法是已知的。本發(fā)明的制劑可包含活性化合物的無菌水性和非水性注射溶液，該制備物優(yōu)選與預(yù)期接受者的血液等滲，基本上無熱源。這些制劑可包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和溶質(zhì)，所述溶質(zhì)使制劑與預(yù)期接受者的血液等滲。水性和非水性無菌懸浮液可包括懸浮劑和增稠劑。所述制劑可存在于單位劑量或多劑量容器如密封安瓿和管形瓶中，并可儲存于冷凍干燥(凍干)環(huán)境下，其僅需要在臨使用前加入無菌液體載體，例如鹽水或注射用水。在一種制劑中，本發(fā)明的組合物可包含在可適用于胃腸外施用的脂質(zhì)顆粒或嚢泡中，例如脂質(zhì)體或微晶體。所述顆?？蔀槿我夂线m的結(jié)構(gòu)，例如單層或多層，只要所述化合物包含在其中。針對此顆粒和嚢泡，特別優(yōu)選正電荷脂質(zhì)，如N-[l-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三曱基-銨硫酸甲酯或"DOTAP"。所述脂質(zhì)顆粒的制備眾所周知。參見例如Janoff等的美國專利第4，880，635號;Kurono等的美國專利第4,906,477號；Wallach的美國專利第4，911，928號；Wallach的美國專利第4,917,951號；Allen等的美國專利第4,920,016號；Wheatley等的美國專利第4，921，757號;等等。本發(fā)明的藥用組合物例如可用于生產(chǎn)治療本文所述的疾病和/或障礙的藥物。以下序列包括在本發(fā)明中。SEQIDNO:l.質(zhì)粒TRCBA-int-luc突變型。核普酸163-2036:CBA啟動子；核苷酸2739-4573:突變內(nèi)含子(654C-T);核苷酸4592-4813:polyA信號。SEQIDNO:2.質(zhì)粒TRCBA-int-luc(野生型)。核苦酸163-2036:CBA啟動子；核苦酸2739-3588:野生型內(nèi)含子(654C);核苦酸2071-4573:螢光素酶中的內(nèi)含子；核苦酸4592-4813:polyA信號。SEQIDNO:3.質(zhì)粒TRCBA-int-luc(657GT)。核普酸163-2036:CBA啟動子；核普酸2739-3588:突變內(nèi)含子(654C-T;657TA-GT);核苦酸2071-4573:螢光素酶中的內(nèi)含子；核苦酸4592-4813:polyA信號。SEQIDNO:4.質(zhì)粒GL3-int-Luc(突變型)。核普酸48-250:SV40啟動子；核苷酸948-1797:突變型內(nèi)含子(654C-T);核苷酸2814-3035:polyA信號；核苷酸280-2782:具有突變內(nèi)含子的螢光素酶。SEQIDNO:5.質(zhì)粒GL3-int-Luc(野生型)。核苷酸48-250:SV40啟動子；核苷酸948-1797:野生型內(nèi)含子(654C);核苷酸280-2782:具有內(nèi)含子的螢光素酶；核苷酸2814-3035:polyA信號。SEQIDNO:6.質(zhì)粒GL3-int-Luc(657GT)。核苦酸48-250:SV40啟動子；核苷酸948-1797:內(nèi)含子(654C-T;657TA-GT);核苦酸280-2782:具有突變內(nèi)含子的安光素酶；核苦酸2814-3035:polyA信號。SEQIDNO:7.質(zhì)粒GL3-2int-fron-sph(突變型)。核苷酸48-250:SV40啟動子；核苷酸251-1100、1771-2620:突變內(nèi)含子(654C-T);核苷酸1103-3635:具有突變內(nèi)含子的螢光素酶；核苷酸3637-3858:polyA信號。SEQIDNO:8.質(zhì)粒GL3-3int-2fron-sph(突變型)。核苷酸48-250:SV40啟動子;核苷酸251-1100、1106-1965、2635-3484:突變內(nèi)含子(654C-T);核苷酸1967-4469:具有突變內(nèi)含子的螢光素酶；核苷酸4514-4735:polyA信號。SEQIDNO:9.質(zhì)粒GL3-int-lucA(突變型)。核苷酸48-250:SV40啟動子；核苷酸673-1522:內(nèi)含子(654C-T);核苷酸280-2782:具有內(nèi)含子的螢光素酶；核苷酸2814-3035:polyA信號。SEQIDNO:IO.質(zhì)粒GL3-int-LucB(突變型)。核苷酸48-250:SV40啟動子;核苷酸1440-2289:內(nèi)含子(654C-T);核苦酸280-2782:具有內(nèi)含子的螢光素酶；核苷酸2814-3035:polyA信號。SEQIDNO:ll.質(zhì)粒GL3-int-LucC(突變型)。核苷酸48-250:SV40啟動子;核苦酸1691-2540:內(nèi)含子(654C-T);核香酸280-2782:具有內(nèi)含子的螢光素酶；核香酸2814-3035:polyA信號。SEQIDNO:12.質(zhì)粒GL3-int-fron(突變型)。核苷酸48-250:SV40啟動子；核苷酸251-1100:內(nèi)含子(654C畫T);核苷酸1103-2755:具有內(nèi)含子的螢光素酶；核苷酸2787-3008:polyA信號。SEQIDNO:13.質(zhì)粒GL3-2int-sph(突變型)。核苷酸48-250:SV40啟動子；核苷酸948-1797;1798-2647:內(nèi)含子(654C-T);核普酸280-3632:具有內(nèi)含子的螢光素酶；核苷酸3664-3885:polyA信號。SEQIDNO:14.質(zhì)粒GL3-2int-sphC(突變型)。核苷酸48-250:SV40啟動子；核苷酸948-1797;2541-3390:內(nèi)含子(654C-T);核普酸280-3632:具有內(nèi)含子的螢光素酶；核苷酸3664-3885:polyA信號。SEQIDNO:15.質(zhì)粒GL3-sint200-sph(突變型)。核香酸48-250:SV40啟動子；核苷酸948-1597:內(nèi)含子(654C-T);核苷酸280-2582:具有內(nèi)含子的安光素酶；核苷酸2794-2835:polyA信號。SEQIDNO:16.質(zhì)粒GL3-sint200-sph(657GT)。核苦酸48-250:SV40啟動子；核香酸948-1597:內(nèi)含子(654C-T;657TA-GT);核苷酸280-2582:具有內(nèi)含子的螢光素酶；核苷酸2794-2835:polyA信號。SEQIDNO:17.質(zhì)粒GL3-sint425-sph。核苷酸48-250:SV40啟動子；核苷酸948-1373:內(nèi)含子(654C-T);核苷酸280-2358:具有內(nèi)含子的螢光素酶；核普酸2569-2615:polyA信號。SEQIDNO:18.突變型內(nèi)含子(654C-T)。SEQIDNO:19.野生型內(nèi)含子(654C)。SEQIDNO:20.具有兩個(gè)突變(654C-T;657TA-GT)的內(nèi)含子。SEQIDNO:21.螢光素酶cDNA,其在核苷酸669-1518具有突變內(nèi)含子(654C-T)。SEQIDNO:22.安光素酶cDNA，其在核苷酸669-1518具有野生型內(nèi)含子。SEQIDNO:23.螢光素酶cDNA,其在核苷酸669-1518具有雙突變內(nèi)含子(C654C-T;657TA-GT)。SEQIDNO:24.螢光素酶cDNA，其在核普酸1-850具有突變內(nèi)含子(654C-T),在核苷酸1521-2370具有突變內(nèi)含子(654C-T)。SEQIDNO:25.荄光素酶cDNA,其在核苷酸1-850具有突變內(nèi)含子(654C-T),在核苦酸861-1710和核苷酸2385-3234具有兩個(gè)突變內(nèi)含子(654C-T)。SEQIDNO:26.螢光素酶cDNA，其在可變位置A(核苷酸394-1243)具有突變內(nèi)含子(654C-T)。SEQIDNO:27.螢光素酶cDNA,其在可變位置B(核苷酸1161-2010)具有突變內(nèi)含子(654C-T)。SEQIDNO:28.螢光素酶cDNA,其在可變位置C(核苷酸1412-2261)具有突變內(nèi)含子(654C-T)。SEQIDNO:29.螢光素酶cDNA,其在翻譯位點(diǎn)上游(核苷酸1-850)具有突變內(nèi)含子(654C-T)。SEQIDNO:30.螢光素酶cDNA,其在核香酸669-1518和核苷酸1519-2368具有兩個(gè)突變內(nèi)含子(654C-T)。SEQIDNO:31.螢光素酶cDNA，其在核苷酸669-1518和核苷酸2262-3111具有兩個(gè)突變內(nèi)含子(654C-T)。SEQIDNO:32.螢光素酶cDNA,其在核苷酸669-1318具有突變內(nèi)含子(654C-T)以及具有200個(gè)堿基對缺失。SEQIDNO:33.螢光素酶cDNA,其在核普酸669-1318具有雙突變內(nèi)含子(654C-T;657TA-GT)以及具有200個(gè)堿基對缺失。SEQIDNO:34.螢光素酶cDNA，其在核苷酸669-1094具有突變內(nèi)含子(654C-T)以及具有425個(gè)堿基對缺失。SEQIDNO:35.質(zhì)粒TRCBA,具有ot抗胰蛋白酶cDNA和在核普酸2866-3715的突變內(nèi)含子(654C-T)。SEQIDNO:36.a抗胰蛋白酶cDNA，在核苷酸772-1621具有突變內(nèi)含子(654C-T)。SEQIDNO:37.針對IVS2-654的封閉寡核苷酸GCTATTACCTTAACCCAG。SEQIDNO:38.針對具有657GT突變的IVS2-654的封閉寡核苷酸GCACTTACCTTAACCCAG。SEQIDNO:50SEQIDNO:51SEQIDNO:52SEQIDNO:20SEQIDNO:53SEQIDNO:54SEQIDNO:68SEQIDNO:69SEQIDNO:55SEQIDNO:56SEQIDNO:57SEQIDNO:58SEQIDNO:59(具有564CT突變的IVS2-654內(nèi)含子)。(具有657G突變的IVS2-654內(nèi)含子)。(具有658T突變的IVS2-654內(nèi)含子)。(具有6"GT突變的IVS2-654內(nèi)含子)c(具有200bp缺失的IVS2-654內(nèi)含子)。(具有425bp缺失的IVS2-654內(nèi)含子)。(僅具有197bp的IVS2-654內(nèi)含子)。(僅具有2Wbp的IVS2-654內(nèi)含子)。(具有6A突變的IVS^654內(nèi)含子)。(具有564C突變的IVS2-654內(nèi)含子)。(具有841A突變的IVS2-654內(nèi)含子)。(IVS2-705內(nèi)含子)。(具有564CT突變的IVS2-705內(nèi)含子)。SEQIDNO:60SE(JIDNO:61SEQIDNO:62SEQIDNO:63SEQIDNO:64SEQIDNO:65SEQIDNO:66SEQIDNO:67SEQIDNO:70SEQIDNO:71SE()IDNO:72SEQIDNO:73SEQIDNO:74野生型序列)。SEQIDNO:75子23無義突變)。SEQIDNO:76SEQIDNO:39SEQIDNO:40SEQIDNO:41SE(JIDNO:43SEQIDNO:44SEQIDNO:45SEQIDNO:42SEQIDNO:49SEQIDNO:46SEQIDNO:47:具有657G突變的IVS2-705內(nèi)含子)。:具有658T突變的IVS2-705內(nèi)含子)。:具有657GT突變的IVS2-705內(nèi)含子)。:具有200bp缺失的IVS2-705內(nèi)含子)。:具有425bp缺失的IVS2-705內(nèi)含子)。:具有6A突變的IVS2-705內(nèi)含子)。:具有564C突變的IVS2-705內(nèi)含子)。:具有841A突變的IVS2-705內(nèi)含子)。CFTR外顯子19野生型序列)。CFTR外顯子193849+10kbC至T突變)。:CFTR外顯子19野生型寡核香酸)。CFTR外顯子193849+10kbC至T突變寡核香:小鼠肌養(yǎng)蛋白內(nèi)含子22、外顯子23和內(nèi)含子23mdx小鼠月/L養(yǎng)蛋白內(nèi)含子22、外顯子23和內(nèi)含:反義外顯子23跳躍(skipping)誘導(dǎo)性寡核苷酸)。:針對IVS2-654中6A突變的寡核苷酸)。:針對IVS2-654中564C突變的寡核苷酸)。:針對IVS2-654中564CT突變的寡核苷酸)。:針對IVS2-654中841A突變的寡核苦酸)。:針對IVS2-654中657G突變的寡核苦酸)。:針對IVS2-654中658T突變的寡核普酸)。:針對IVS2-705中705G突變的寡核苷酸)。:針對IVS2-705的寡核苷酸)。:針對IVS2-654的寡核苷酸)。:針對IVS2-654的寡核普酸)。SEQIDNO:48(針對IVS2-654的寡核苷酸)。陳述以下的實(shí)施例是為了闡明本發(fā)明，不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例l:來自病毒載體的基因表達(dá)的剪接介導(dǎo)的控制質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒pGL3購自Promega。所有引物都得自UNC-CHLCCC寡核苷酸核心實(shí)驗(yàn)室。所有酶都得自NewEnglandBiokbs，并^要照銷售商的推薦使用。為在綠色焚光蛋白(GFP)或螢光素酶(Luc)cDNA的中部插入野生型(wt)或具有隱蔽剪接位點(diǎn)的內(nèi)含子，插入位點(diǎn)按照前mRNA中的共有序列選擇(LucaCartegni等，"Listeningtosilenceandunderstandingnonsenseexonicmutationsthataffectsplicing"jV/Tev2002年4月；3(4):285畫98)。將內(nèi)含子插入到不同位置(基于編號為1的螢光素酶cDNA起始密碼子ATG):393-394(A)，668-669(B)，1160-1161(C)和1411-1412(D)。在某些研究中，將內(nèi)含子插入到啟動子和螢光素酶cDNA之間。應(yīng)用4片段連接策略。Pfo酶(Stratagen)用于通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增內(nèi)含子以及側(cè)翼的具有Ncol的上游序列和具有Xbal的下游序列。GL3主鏈用Ncol和Xbal這二者消化，同時(shí)用Ncol或Xbal鄰接PCR產(chǎn)物。通過平端連接插入內(nèi)含子。由凝膠純化所述區(qū)段。在1小時(shí)后，通過FastLigase(Epicentre)進(jìn)行室溫連接，然后通過電穿孔將核酸轉(zhuǎn)化入DH10B細(xì)菌細(xì)胞中。病毒制備按照標(biāo)準(zhǔn)3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法制備攜帶內(nèi)含子調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的AAV2載體(Xiao等,"Efficientlong-termgenetransferintomuscletissueofimmunocompetentmicebyadeno-associatedvirusvector"J"K/ra/.1996年11月；70(11):8098-108)。滴度通過斑點(diǎn)印跡測定。體外螢光素酶表達(dá)測定在某些實(shí)驗(yàn)中，在24孔板中轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。對于每個(gè)孔，在加入1002XHeBS前將10ng質(zhì)粒5|ul、2.5MCaCl210pl和ddH2085W混合在一起。在形成沉淀后在光學(xué)顯微鏡下將其加入到細(xì)胞中。一些細(xì)胞同時(shí)用寡核苷酸(例如0.05mM,10iul)處理。在于37。C、5%<:02中聘育24小時(shí)后，用200nllxPBS清洗，之后用100|^1lx裂解緩沖液裂解每個(gè)孔中的細(xì)胞。取20ial體積至96孔不透明板，用于使用微板發(fā)光計(jì)(Tropix)進(jìn)行螢光素酶測定。螢光素酶底物購自Promega。動物處理在病毒注射后1周，通過腹膜內(nèi)(i.p.)注射2.5mM阿佛丁或異氟烷麻醉動物。i.p.給予螢光素底物(12525mg/ml，P腿ega)，以激發(fā)熒光反應(yīng)。應(yīng)用螢光素酶成像系統(tǒng)(RoperScientific)或IVIS成像系統(tǒng)(Xenogen)捕獲整只動物的螢光素酶螢光的"實(shí)時(shí)"圖像。開始時(shí)采集圖象(第0天)，然后在連續(xù)兩天給予寡核苷酸(i.p.25mg/kg)后采集圖象。在該實(shí)施例中，P-珠蛋白內(nèi)含子中的天然突變用于開發(fā)受調(diào)節(jié)的剪接系統(tǒng)。這些內(nèi)含子突變在具有P-地中海貧血的患者中被發(fā)現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)其通過建立新的5'剪接供體位點(diǎn)而引起疾病。新的供體位點(diǎn)協(xié)同隱蔽3，剪接受體一起導(dǎo)致在mRNA中包含攜帶符合讀框的終止信號的一部分內(nèi)含子。具體地說，在該實(shí)施例中，已表明包含在AAV載體的綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因中的突變內(nèi)含子可用作完整的載體調(diào)節(jié)系統(tǒng)。加入針對該突變的寡核苷酸("oligo")校正剪接缺陷，并在體外和體內(nèi)均誘導(dǎo)正確的基因表達(dá)。如下構(gòu)建AAV質(zhì)粒載體克隆含野生型或突變型p-珠蛋白內(nèi)含子的綠色熒光蛋白(GFP)或螢光素酶報(bào)告基因，所述內(nèi)含子摻入到人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子或雜種CMV雞(3-肌動蛋白啟動子(CB或CBA)之后。將兩種不同的剪接突變摻入到分離的AAV載體中在內(nèi)含子的核普酸654處的突變(AAV-654)和在隱蔽剪接位點(diǎn)中具有一個(gè)額外突變的核苷酸705處的突變(AAV-705U)。將所述AAV構(gòu)建物轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中或HeLa細(xì)胞中，導(dǎo)致野生型內(nèi)含子產(chǎn)生良好的基因表達(dá)，而突變內(nèi)含子產(chǎn)生低基因表達(dá)。隨后用分別針對核苷酸654突變或核苷酸705突變的2，-0-曱氧基乙基硫代磷酸酯(MOE)寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別增加654和705U突變體的基因表達(dá)。在HEK293細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中產(chǎn)生和測試重組AAV。在AAV感染后24小時(shí)，用針對對應(yīng)突變的MOE寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在寡核苷酸轉(zhuǎn)染后24和48小時(shí)觀察報(bào)告基因表達(dá)。用AAV-654或AAV-705U感染而沒用寡核苷酸感染的細(xì)胞表明在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)實(shí)際上沒有GFP表達(dá)，在48小時(shí)時(shí)僅有些微的基因表達(dá)。相比之下，用寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在24小時(shí)時(shí)表現(xiàn)出明顯的基因表達(dá)，該表達(dá)在48小時(shí)時(shí)在強(qiáng)度上稍微增加，但細(xì)胞數(shù)量沒有增加。GFP陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)表明，在48小時(shí)時(shí)，對于654突變體，加入寡核苷酸誘導(dǎo)達(dá)200倍，對于705突變體，誘導(dǎo)達(dá)70倍。705U突變體表明，在HeLa細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中幾乎沒有強(qiáng)誘導(dǎo)，這根據(jù)GFP熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)的數(shù)量和全視野熒光來測定。這看起來歸因于略高的基礎(chǔ)基因表達(dá)水平以及對寡核苷酸加入幾乎無強(qiáng)響應(yīng)。用含野生型內(nèi)含子的rAAV(AAV-wtint)感染在接近100%的細(xì)胞中以和突變體相同的感染復(fù)數(shù)(MOI)始終獲得強(qiáng)GFP表達(dá)。在寡核苷酸存在下，AAV-野生型內(nèi)含子表現(xiàn)出明顯比任一種突變體高的基因表達(dá)，表明未被寡核苷酸完全^^正。半定量RT-PCR證實(shí)，在寡核苷酸存在下在AAV-654和AAV-706U感染細(xì)胞中均有正確剪接和不正確剪接的物質(zhì)。但是，增加寡核苷酸劑量并不顯著增加基因表達(dá)。增加病毒量的確稍微增加全視野強(qiáng)度，但不增加GFP陽性細(xì)胞數(shù)目。表1顯示了一個(gè)內(nèi)含子在相對于愛光素酶cDNA的不同位置的校正效率。表2顯示了插入多個(gè)內(nèi)含子對螢光素酶轉(zhuǎn)基因表達(dá)的改變。表3顯示了內(nèi)含子(SEQIDNO:53)的轉(zhuǎn)基因校正效率，所述內(nèi)含子通過缺失石威基對151-350而縮短了原長度的1/4。實(shí)施例2體內(nèi)研究還在體內(nèi)用由CB啟動子驅(qū)動的654突變內(nèi)含子構(gòu)建物(AAV-CB-654)研究了寡核苷酸對AAV介導(dǎo)的基因表達(dá)的誘導(dǎo)。通過門靜脈注射將在螢光素酶報(bào)告基因中攜帶654突變體內(nèi)含子的rAAV2型載體(5xl0"個(gè)載體顆粒)傳遞入小鼠肝臟中。l年后，以每日25mg/kg腹膜內(nèi)給予寡核普酸達(dá)2天。在第3天進(jìn)行螢光素酶成象。當(dāng)與未接受寡核苷酸治療的動物相比時(shí)，螢光素酶表達(dá)高達(dá)8-10倍。在體內(nèi)觀察到的寡核苷酸誘導(dǎo)的上調(diào)持續(xù)超過1個(gè)月，隨后回落至基線水平。給予載體達(dá)1周、之后給予寡核苷酸的第二組動物產(chǎn)生特征性的轉(zhuǎn)基因表達(dá)上調(diào)，之后在1個(gè)月內(nèi)下降。重復(fù)施用寡核苷酸還可再活化內(nèi)含子調(diào)節(jié)的基因表達(dá)。此結(jié)果表明，載體特異性組成型啟動子在延長的時(shí)間段內(nèi)表達(dá)mRNA(與AAV介導(dǎo)的體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)一致)，但功能性基因產(chǎn)物僅在施用"剪接介導(dǎo)的"藥物(例如寡核苷酸)之后觀察到。這些結(jié)果表明，通過調(diào)節(jié)載體產(chǎn)生的RNA由非功能性mRNA至功能性mRNA的剪接而調(diào)節(jié)功能性基因表達(dá)。加入寡核苷酸相當(dāng)快速地誘導(dǎo)基因表達(dá)，在組織培養(yǎng)物中至24小時(shí)時(shí)產(chǎn)生表達(dá)，在體內(nèi)于1-2天內(nèi)產(chǎn)生表達(dá)?；虮磉_(dá)的持續(xù)時(shí)間受到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的蛋白的半衰期和寡核苷酸的半衰期影響。諸如2，-O-曱氧基乙基疏代磷酸酯主鏈的寡核苷酸具有長體內(nèi)半衰期；在大鼠中于8小時(shí)后十分完整。在單次注射MOE或LNA寡核苷酸的情況下，持續(xù)的mRNA校正和蛋白表達(dá)可持續(xù)相當(dāng)一段時(shí)間。通過改變寡核苦酸主鏈以及劑量應(yīng)當(dāng)有可能改變基因校正的持續(xù)時(shí)間。不同的主鏈已表現(xiàn)出明顯不同的生物穩(wěn)定性，并可用于更精確地控制基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間。靶mRNA的半衰期還可通過包含順式作用元件來控制，所述順式作用元件將使剪接過的mRNA具有快或慢的周轉(zhuǎn)率。這些元件的使用在本領(lǐng)域是標(biāo)準(zhǔn)的，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。加入強(qiáng)聚腺普酸化信號也將影響加工過的信使的半衰期。因此，"剪接介導(dǎo)的藥物"上調(diào)功能性mRNA的能力可受到給定量、生物分布、穩(wěn)定性和/或?qū)Π行蛄械挠H和性以及靶mRNA的豐度和穩(wěn)定性的影響。所有這些參數(shù)都可按照本領(lǐng)域已知的方法修改，以更精確地控制"剪接介導(dǎo)的"調(diào)節(jié)。通過使用內(nèi)含子調(diào)節(jié)基因表達(dá)，消除了對加入轉(zhuǎn)基因以外的外源蛋白的需要，因此避免了針對調(diào)節(jié)性反式激活物的嚴(yán)重免疫反應(yīng)的可能性。另外，內(nèi)含子的大小可變(1000bp或以下)，并可容易地與組織特異性啟動子組合，在加入寡核苷酸后在單個(gè)載體中產(chǎn)生組織特異性和蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)。在更常規(guī)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)中，這一般需要兩反式激活物的組織特異性啟動子)。為進(jìn)一步表明該系統(tǒng)的用途，將功能性治療性轉(zhuǎn)基因(otl-抗胰蛋白酶，AAT)克隆入具有內(nèi)含子調(diào)節(jié)基因表達(dá)盒系統(tǒng)的AAV載體中。在門靜脈注射載體顆粒后，通過ELISA測定檢測隨時(shí)間變化的功能性AAT轉(zhuǎn)基因活性。在沒有"剪接介導(dǎo)的"寡核苷酸的情況下，檢測到低人AAT至無人AAT。但是，在存在藥物(在該實(shí)施例中為LNA寡核苷酸)的情況下，可監(jiān)測到血液中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)上調(diào)(100倍)，動力學(xué)和持續(xù)時(shí)間與對報(bào)告基因的描述相似(在30天內(nèi))。與AAV載體相一致，在載體傳遞后，轉(zhuǎn)基因表達(dá)將接著發(fā)生并持續(xù)，與目標(biāo)組織中的基因表達(dá)盒(報(bào)告體或治療劑)無關(guān)。對于"剪接介導(dǎo)的"受控載體，載體傳遞的所有方面都相同，功能性mRNA的表達(dá)除外。該方面僅受控于外源"剪接介導(dǎo)"藥物的存在，僅可在選定時(shí)間給予和/或重復(fù)地給予，以獲得期望的轉(zhuǎn)基因mRNA的功能活性。實(shí)施例3在圖1-3中描述的研究在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，如下構(gòu)建AAV質(zhì)粒載體將在編碼序列中含突變P-珠蛋白內(nèi)含子的報(bào)告基因表達(dá)盒(綠色熒光蛋白-GFP或螢光素酶-Luc)克隆在人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子或雜種CMV雞卩-肌動蛋白啟動子(CB)之后。AAV載體按照標(biāo)準(zhǔn)的3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法產(chǎn)生(Xiao等，/owtw/o/F/ra/ogy(1998))。基于內(nèi)含子突變序列的存在，這些載體RNA表達(dá)盒的RNA表達(dá)導(dǎo)致形成前mRNA(圖l(l))。在沒有外源寡核苷酸的情況下，前mRNA將卩吏用隱蔽剪接位點(diǎn)剪接。這是位于內(nèi)含子的核苷酸654處的單點(diǎn)突變的結(jié)果，導(dǎo)致形成可變剪接位點(diǎn)(在圖l(l)(i)中的前mRNA上的小三角)。由該反應(yīng)產(chǎn)生的剪接過的mRNA在兩個(gè)編碼序列之間含一部分內(nèi)含子序列(圖l(2)(i))。該mRNA是無功能的，不表達(dá)功能性產(chǎn)物(圖l(3)(i))。隨后針對核苷酸654突變的2'-0-曱氧基乙基硫代磷酸酯(MOE)寡核苷酸的轉(zhuǎn)染(在圖l(l)(ii)中黑條棒的右側(cè))封閉可變剪接，產(chǎn)生正確的剪接(圖1②(ii))和功能性基因產(chǎn)物(圖1(3)(ii))。產(chǎn)生攜帶以上表達(dá)盒的重組AAV載體，并測試其在人細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)中的受調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。AAV感染后24小時(shí)，K的細(xì)胞用針對654突變的MOE寡核苷酸轉(zhuǎn)染，在寡核苷酸轉(zhuǎn)染后48小時(shí)觀察報(bào)告基因表達(dá)。用AAV-654載體而不用寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞實(shí)際上沒有表現(xiàn)出可^f企測的GFP表達(dá)。相比之下，用654特異性寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的基因表達(dá)。GFP陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)表明，在加入針對654突變的寡核苷酸的情況下達(dá)200倍誘導(dǎo)。如本文所述產(chǎn)生攜帶由"剪接介導(dǎo)的"內(nèi)含子控制的螢光素酶報(bào)告基因的AAV載體，并通過門靜脈注射將其用于感染小鼠肝臟。在一組動物中，在傳遞寡核苷酸藥物前1年施用載體(圖2A)。在經(jīng)腹膜內(nèi)注射施用剪接特異性寡核苷酸達(dá)連續(xù)2天后，在注射螢光素底物后對動物進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，以依據(jù)光子的發(fā)射和收集檢測功能性螢光素酶活性(并轉(zhuǎn)變?yōu)楣鈫挝?。如在圖2A中所示，與未治療動物(圖2A(i)和圖2C)相比，接受寡核苷酸的小鼠(圖2A(ii)和圖2C)顯示出增加的螢光素酶活性(暗灰色陰影和增加的表面積量)。這些結(jié)果還表明，載體特異性組成型啟動子正在表達(dá)無功能mRNA，該活性持續(xù)1年以上。如圖1所述，只有在加入"剪接介導(dǎo)的"寡核苷酸后才能將無功能mRNA轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄詍RNA。在另一組用"剪接介導(dǎo)的"載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒感染的動物中，在施用寡核苷酸后誘導(dǎo)了調(diào)節(jié)，該調(diào)節(jié)持續(xù)達(dá)1個(gè)月以上，并穩(wěn)定回落到基線。重復(fù)施用寡核苷酸(圖2B箭頭)表明轉(zhuǎn)基因活性上調(diào)，與第一種藥物的施用(圖2B;菱形)一致。在未接受"剪接介導(dǎo)的"寡核苷酸藥物的動物中未觀察到上調(diào)證據(jù)(圖2B;實(shí)心圓)。這些實(shí)驗(yàn)表明，載體傳遞的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒在體內(nèi)響應(yīng)于寡核苷酸藥物的存在，并對寡核苷酸藥物的持續(xù)時(shí)間敏感。涉及藥物傳遞的眾多實(shí)驗(yàn)參數(shù)都可由本領(lǐng)域技術(shù)人員修改，以影響受調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)基因功能的水平和持續(xù)時(shí)間(例如藥物的劑量和生物分布、藥物和耙mRMA的半衰期、mRNA產(chǎn)物的穩(wěn)定性等)。在體內(nèi)研究中使用攜帶受調(diào)節(jié)的治療性轉(zhuǎn)基因的AAV載體(al-抗胰蛋白酶；AAT)進(jìn)行相似的實(shí)驗(yàn)。在該實(shí)施例中，AAV載體通過門靜脈注射給予至小鼠肝臟。1周后，一部分動物通過腹膜內(nèi)注射施用來給予LNA寡核苷酸，之后通過ELISA測定檢測AAT蛋白的循環(huán)水平。AAT表達(dá)在約1周時(shí)達(dá)到峰值(圖3;方形)，并在l個(gè)月內(nèi)緩慢下降。在僅接受載體的動物(圖3;菱形)中，在實(shí)驗(yàn)過程中沒有觀察到基線以上的AAT表達(dá)的證據(jù)。在該實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)關(guān)鍵因素主要確定誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因的壽命；即分別是寡核普酸和蛋白產(chǎn)物的半衰期。根據(jù)所使用的寡核苷酸類型(PNA對LNA等)和被靶向以便調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)基因(AAT對生長因子對細(xì)胞因子等)可獲得不同的結(jié)果。無論如何，全部這些結(jié)果都模擬了"剪接介導(dǎo)的"受調(diào)節(jié)報(bào)告基因的結(jié)果，表明了在經(jīng)"剪接介導(dǎo)的"受調(diào)節(jié)機(jī)制而外部施用藥物后調(diào)節(jié)體內(nèi)治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。實(shí)施例4.雙內(nèi)含子系統(tǒng)應(yīng)可變剪接控制體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。將人P-珠蛋白基因的異常剪接突變內(nèi)含子IVS2_654插入到綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)盒中。IVS2-654內(nèi)含子大小為850bp，含4個(gè)剪接位點(diǎn)。IVS2-654內(nèi)含子的核苷酸序列(SEQIDNO:19)示于以下。兩個(gè)可變內(nèi)含子位于核苷酸1-579和653-850?？勺兺怙@子位于核苷酸580-652。兩個(gè)箭頭指示可變內(nèi)含子-外顯子之何的接合處。4個(gè)剪接位點(diǎn)和4個(gè)潛在分支點(diǎn)分別由直線和波浪線下劃線表示。5，ss62/18AON的靶序列以粗體浮雕表示。有效剪接和3'末端形成所需的序列為粗斜體。iGTgJGTC7^rGVG^cccrr(爿;TGTnTCT;rttcccttcttttctatggttAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACAG91TTTAGAATGGGAAACAGACGAATGA丁TGCATCAGTGTGGAAGTCTCAGGATCGTTTTAGTTTCTTTTATTTGCTGTTCATAACAATTGTT181TTCTTTTGTTTAATTCTTGCTTTCTTTTTTTTTCTTCTCCGCAATTTTTACTATTATACTTAATGCCTTAACATTGTGTATAACAAAAGG271AAATATCTCTGAGATACATTAAGTAACTTAAAAAAAAACTTTACACAGTCTGCCTAGTACATTACTATTTGGAATATATGTGTGCTTATT361TGCATATTCATAATCTCCCTACTTTATTTTCTTTTATTTTTAATTGATACATAATCATTATACATATTTATGGGTTAAAGTGTAATGTTT45TAA丁ATGTGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTT541ATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAG^GGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAA631CAGTGATAATTTCTC鵬Tmf—(SH^^jSC1AATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAAC5X^fXX^^GGTTTCATA721TTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGJGTCC4/i(CX4((7CCCT8117TTOC7^7rJrC7TC4rJCC7rT7M7r7TCCTCrC4C4C7通過使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將所獲質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人腎上皮細(xì)胞系293細(xì)胞中。隨后，將特異性AON以0.5|iM終濃度加入到兩組相同的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的其中一組中，以誘導(dǎo)GFP表達(dá)。所述特異性AON稱為5'ss652/18AON，是一種18聚體寡核苷酸，其與5'可變剪接位點(diǎn)互補(bǔ)，能夠抑制異常外顯子的摻入。作為陽性對照，293細(xì)胞單獨(dú)^;用含在GFP表達(dá)盒中的相同位置插入的野生型內(nèi)含子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。陽性對照細(xì)胞不用5，ss652/18AON處理。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，使用熒光顯微鏡檢查細(xì)胞的GFP表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)組中，經(jīng)轉(zhuǎn)染但不用AON處理的細(xì)胞不能表達(dá)可檢測水平的GFP。相反，用AON處理的細(xì)胞以和陽性對照組相似的水平表達(dá)功能性GFP。因此，可變剪接可用于控制體外轉(zhuǎn)基因表達(dá)。為確定可變剪接是否還可用于控制體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)，構(gòu)建了重組AAV質(zhì)粒，其攜帶螢光素酶表達(dá)盒(Promega),該表達(dá)盒插入了一個(gè)拷貝的850bpIVS2-654內(nèi)含子。螢光素酶基因由已表明能夠在小鼠中驅(qū)動組成型轉(zhuǎn)基因表達(dá)的CMV增強(qiáng)子/雞p-肌動蛋白啟動子所驅(qū)動。AAV通過使用無腺病毒的生產(chǎn)流程產(chǎn)生，該生產(chǎn)流程包括用以下3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞重組AAV質(zhì)粒、提供結(jié)構(gòu)性和非結(jié)構(gòu)性的腺病毒輔助質(zhì)粒。通過使用包含碘克沙醇梯度和硫酸肝素層析步驟的純化方法純化所產(chǎn)生的AAV載體。然后，將5xl0"個(gè)純化AAV顆粒施用給每只小鼠。注射后1周，通過每日腹膜內(nèi)注射25mg/kg的5，ss652/18AON達(dá)連續(xù)兩天誘導(dǎo)螢光素酶表達(dá)。通過給予螢光素后使用螢光素酶成像系統(tǒng)(RoperScientific)進(jìn)行整體成像來確定螢光素酶表達(dá)水平。當(dāng)通過門靜脈注射將AAV靶向肝臟時(shí)，器官中的螢光素酵表達(dá)被誘導(dǎo)達(dá)10.4倍，在第8天達(dá)到峰值，持續(xù)超過29天。通過直接注射將AAV靶向心臟也表現(xiàn)出相似模式的誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。還在AAV注射后1年給小鼠施用AON，肝臟中的螢光素酶表達(dá)被誘導(dǎo)至相似的水平，表明將所述內(nèi)含子摻入AAV載體中并不影響AAV基因組的持續(xù)性。為更精確地定量轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和確定可變剪接是否能在體內(nèi)控制其它目標(biāo)基因的表達(dá)，構(gòu)建了另一種攜帶al-抗胰蛋白酶(AAT)表達(dá)盒的AAV載體，該表達(dá)盒插入了一個(gè)拷貝的850bp的IVS2-654內(nèi)含子。獲得的純化AAV經(jīng)門靜脈注射給予小鼠。AAT表達(dá)通過給予5'ss652/18AON來誘導(dǎo)，并通過ELISA測定定量。與螢光素酶表達(dá)模式類似，AAT表達(dá)被誘導(dǎo)達(dá)8.9倍，在第8天和第29天達(dá)到峰值，持續(xù)超過43天。這些結(jié)果表明，可變剪接既可用于控制體外轉(zhuǎn)基因表達(dá)，也可用于控制體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。優(yōu)化可變剪接以控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)。為有利于可變剪接優(yōu)化以控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)，使用螢火蟲螢光素酶標(biāo)記基因插入850bp的可變剪接內(nèi)含子IVS2-654。因此，轉(zhuǎn)基因表達(dá)的控制可通過測定外顯子摻入和外顯子跳躍(即有或沒有5'ss652/18AON)條件下的螢光素酶表達(dá)水平便利地測定。為優(yōu)化該可變剪接以控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)，進(jìn)行以下三組實(shí)驗(yàn)l)在螢光素酶表達(dá)盒中插入單拷貝的IVS2-654內(nèi)含子，以控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)。為確定插入位點(diǎn)是否影響內(nèi)含子的剪接，將單拷貝的850bpIVS2-654內(nèi)含子在核芬酸393-394(A)、668-669(B)、1160隱1161(C)或1411-1412(D)之間以及緊鄰翻譯起點(diǎn)上游(F)插入，即在營光素酶表達(dá)盒的A、B、C、D和F位插入。將內(nèi)含子插入到編碼序列上游的原因在于異常外顯子自身同時(shí)含上游ATG起始密碼子和下游TAA終止密碼子。因此，在F位摻入異常外顯子應(yīng)阻止螢光素酶蛋白的合成。通過使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將所獲質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中。隨后將游離的5'ss652/18AON以終濃度0.5pM加入兩組相同的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的其中一組中。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，收集細(xì)胞定量螢光素酶表達(dá)。對于A-D位的內(nèi)含子插入，螢光素酶表達(dá)的實(shí)際水平在相同條件下(即在沒有或有AON的情況下)顯著變化達(dá)3.8倍。但是，這4種構(gòu)建物的誘導(dǎo)水平是相似的，由4.0倍至5.7倍。構(gòu)建物A-D的誘導(dǎo)水平的相似性提示，側(cè)翼序列不顯著影響可變剪接。在F位插入令人驚奇地產(chǎn)生低誘導(dǎo)水平的表達(dá)和相對高的背景表達(dá)水平。低誘導(dǎo)水平可能是因?yàn)?'可變剪接位點(diǎn)的識別被5，帽結(jié)構(gòu)增強(qiáng)，導(dǎo)致更有效的外顯子摻入。高背景水平可能歸因于在正確的起始密碼子開始的翻譯。因?yàn)槲灩馑孛副磉_(dá)系統(tǒng)能夠方便地定量誘導(dǎo)水平和實(shí)際表達(dá)水平這二者，所以對可變剪接方法和自切割核酶方法(38)進(jìn)行平行比較。將單拷貝的83bpN79核酶插入到螢光素酶表達(dá)盒的Kozak序列和ATG起始密碼子上游。通過4吏用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將所獲質(zhì)粒和構(gòu)建物C單獨(dú)地轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中。對于含核酶的構(gòu)建物，將豐加霉素以1.5|LiM的終濃度加入到兩組相同的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的其中一組中。對于含內(nèi)含子的構(gòu)建物，將游離的5，ss652/18AON以0.5的終濃度加入到兩組相同的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的其中一組中。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，收集細(xì)胞用于定量螢光素酶表達(dá)。舍內(nèi)含子和核酶的構(gòu)建物的誘導(dǎo)水平分別為5.3倍和1.8倍。另外，含核酶的構(gòu)建物的實(shí)際螢光素酶表達(dá)水平是含內(nèi)含子構(gòu)建物表達(dá)水平的0.4%。含核酶構(gòu)建物的螢光素酶表達(dá)水平較低與以下觀點(diǎn)相一致將含AUG的核酶置于翻譯起點(diǎn)上游應(yīng)導(dǎo)致抑制正確的翻譯或合成突變蛋白。含內(nèi)含子構(gòu)建物的螢光素酶表達(dá)水平較高可能歸因于在內(nèi)含子序列存在下更有效的mRNA3'末端形成。應(yīng)當(dāng)澄清的是，對核酶法報(bào)告的約260倍螢光素酶表達(dá)誘導(dǎo)基于攜帶插入到螢光素酶表達(dá)盒中的兩個(gè)拷貝的N79核酶的穩(wěn)定細(xì)胞系(38)。2)在螢光素酶表達(dá)盒中插入兩個(gè)拷貝的IVS2-654內(nèi)含子，以控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)。該組實(shí)驗(yàn)的目的是測試插入兩個(gè)拷貝的內(nèi)含子是否會改善轉(zhuǎn)基因表達(dá)的誘導(dǎo)水平，以及兩個(gè)內(nèi)含子之間的距離是否對誘導(dǎo)水平具有任何影響。因此，將組合大小為1，700bp的兩個(gè)拷貝的IVS2-654內(nèi)含子以(AB、AC、AD、BC、BD和FB)之間不同的距離置于兩個(gè)不同位點(diǎn)或串聯(lián)置于一個(gè)位點(diǎn)(BB)。通過使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將所獲質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中。隨后將游離的5'ss652/18AON以終濃度0.5)LiM加入兩組相同的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的其中一組中。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，收集細(xì)胞用于定量螢光素酶表達(dá)。除了BB以外，所有構(gòu)建物都產(chǎn)生顯著降低水平的背景表達(dá)。結(jié)果，誘導(dǎo)水平被極大提升，在10.1倍至倍的范圍內(nèi)。誘導(dǎo)水平幾乎與兩個(gè)內(nèi)含子之間的距離成反向關(guān)聯(lián)，而兩個(gè)內(nèi)含子串聯(lián)即BB構(gòu)建物的情況除外。當(dāng)兩個(gè)拷貝的內(nèi)含子緊密鄰近至一定程度時(shí)降低水平的背景表達(dá)以及由此改善的轉(zhuǎn)基因表達(dá)誘導(dǎo)水平，可能是因?yàn)榭勺兗艚游稽c(diǎn)的識別被增強(qiáng)和/或無義介導(dǎo)的mRNA衰變被加速。無義介導(dǎo)的mRNA衰變是一種通過消除編碼不完整多肽的異常mRNA而減少基因表達(dá)錯(cuò)誤的監(jiān)視途徑。對于BB構(gòu)建物，表達(dá)的背景水平顯著高于其余組別。較高水平的背景表達(dá)可能是因?yàn)樯嫌蝺?nèi)含子的3'剪接位點(diǎn)和下游內(nèi)含子的5'剪接位點(diǎn)彼此太接近，以至于剪接位點(diǎn)的識別被削弱。因此，兩個(gè)最外部的剪接位點(diǎn)可能變成被認(rèn)識的顯性位點(diǎn)。這些結(jié)果表明，插入多個(gè)拷貝的內(nèi)含子可改善轉(zhuǎn)基因表達(dá)的誘導(dǎo)水平。它們還表明，在內(nèi)含子之間可能存在最佳距離，該距離會產(chǎn)生最高誘導(dǎo)水平。3)使IVS2-654內(nèi)含子的可變剪接位點(diǎn)突變，以調(diào)整可變剪接。使850bpIVS2-654內(nèi)含子中的可變剪接位點(diǎn)突變，以改變其強(qiáng)度。第一個(gè)實(shí)驗(yàn)包括敲除構(gòu)建物B的上游可變內(nèi)含子中的兩個(gè)潛在分支點(diǎn)中的一個(gè)。將在核苷酸564和565處的AA轉(zhuǎn)變?yōu)镃T,以使上游潛在分支點(diǎn)與共有序列的相似性較低。通過使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將所獲質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中。隨后將游離的5，ss652/18AON以終濃度0.5iaM加入相同的轉(zhuǎn)染細(xì)胞組中。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，收集細(xì)胞用于定量螢光素酶表達(dá)。AA^CT突變將誘導(dǎo)水平由4.3倍增加至13倍，同時(shí)保留相對高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)誘導(dǎo)。這與當(dāng)前使用分支點(diǎn)是調(diào)節(jié)可變剪接的其中一種機(jī)制的想法一致。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用于優(yōu)化可變剪接，方法是在構(gòu)建物B中將核苷酸657的T轉(zhuǎn)變?yōu)镚，將核苦酸658的A轉(zhuǎn)變?yōu)門，或?qū)A同時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)镚T。突變將通過使剪接位點(diǎn)更類似于或等同于共有序列而增加可變5，剪接位點(diǎn)的強(qiáng)度。在剪接位點(diǎn)具有單堿基轉(zhuǎn)變的兩種構(gòu)建物都產(chǎn)生約2倍的誘導(dǎo)水平增加。其間，雙堿基轉(zhuǎn)變導(dǎo)致誘導(dǎo)水平增加至55倍。誘導(dǎo)水平的增加顯然是緣于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的背景水平比轉(zhuǎn)基因表達(dá)的誘導(dǎo)水平更顯著地下降。這些結(jié)果提示，通過調(diào)整分支點(diǎn)的使用以及可變剪接位點(diǎn)的強(qiáng)度，可優(yōu)化可變剪接，以控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)。用于可變剪接的小內(nèi)含子的開發(fā)。IVS2-654內(nèi)含子長為850個(gè)堿基對(bp)。該大小經(jīng)證明對插入多個(gè)拷貝的內(nèi)含子以控制由AAV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)有問題。這是因?yàn)锳AV的包裝限度是4.7kb。為使內(nèi)含子尺寸最小化，由構(gòu)建物B的內(nèi)含子中缺失一個(gè)200bp的片段-核苷酸151-350，產(chǎn)生構(gòu)建物BA200。還沒有表明該序列在內(nèi)含子剪接中起作用。在與構(gòu)建物B相比時(shí)，構(gòu)建物BA200在誘導(dǎo)水平方面沒有降低。197bp的內(nèi)含子也來源于IVS2-654，其含4個(gè)必需剪接位點(diǎn)和修飾型可變外顯子，以及對P-珠蛋白mRNA3'末端的有效剪接和形成所必需的5'末端上的前32bp和3'末端上的后57bp。將該197bp內(nèi)含子插入螢光素酶基因中導(dǎo)致信使的可變剪接，雖然誘導(dǎo)水平與構(gòu)建物B相比被降低。這些結(jié)果表明，IVS2-654內(nèi)含子可被縮短，而不顯著誘導(dǎo)水平。產(chǎn)生攜帶含可變剪接內(nèi)含子的螢光素酶表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因小鼠。產(chǎn)生攜帶螢火蟲螢光素酶表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因小鼠，該表達(dá)盒插入單拷貝的原始850bpIVS2-654內(nèi)含子。成功傳遞IVS2-654的特異性AON應(yīng)抑制外顯子摻入，并誘導(dǎo)外顯子跳躍，因此導(dǎo)致功能性螢光素酶蛋白的翻譯。因此，螢光素酶表達(dá)的整體成像可便利地用于監(jiān)視AON的傳遞。因?yàn)檗D(zhuǎn)基因小鼠測定系統(tǒng)不需要標(biāo)記AON或處死實(shí)驗(yàn)小鼠，所以應(yīng)大大有利于AON傳遞的優(yōu)化。在施用AON后于轉(zhuǎn)基因小鼠中成功誘導(dǎo)螢光素酶表達(dá)表明了使用AON傳遞和調(diào)節(jié)體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的可4亍性?？勺兗艚觾?nèi)含子的進(jìn)一步優(yōu)化。將兩個(gè)拷貝的IVS2-654內(nèi)含子插入相同表達(dá)盒中顯著降低了轉(zhuǎn)基因表達(dá)的背景水平，并增加誘導(dǎo)水平。但是，因?yàn)榭捎行Оb的AAV基因組大小被限制在4.7kb，所以插入多個(gè)拷貝的850bpIVS2-654內(nèi)含子應(yīng)顯著降低AAV載體的克隆能力。通過缺失200bp片段縮短IVS2-645內(nèi)含子產(chǎn)生相似的轉(zhuǎn)基因表達(dá)誘導(dǎo)水平，由IVS2-654內(nèi)含子獲得小197bp內(nèi)含子仍保留經(jīng)歷可變剪接的能力，雖然誘導(dǎo)水平降低。因此，似乎IVS2-654內(nèi)含子的系統(tǒng)缺失可產(chǎn)生這樣的可變剪接內(nèi)含子，其既具有可接受的誘導(dǎo)水平，又具有適于摻入到AAV載體中的減小尺寸。為控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)，期望具有可變剪接內(nèi)含子，其在用于外顯子摻入的條件下產(chǎn)生低背景水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，在用于外顯子跳躍的條件下產(chǎn)生高誘導(dǎo)水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。通過改變分支點(diǎn)的使用和微調(diào)可變剪接位點(diǎn)的強(qiáng)度有可能獲得此期望的內(nèi)含子。這是因?yàn)橥蛔兤渲幸粋€(gè)分支點(diǎn)顯著增加誘導(dǎo)水平。另外，使剪接位點(diǎn)序列突變大大增加了誘導(dǎo)水平，但同時(shí)顯著降低了轉(zhuǎn)基因表達(dá)的實(shí)際水平。內(nèi)含子的尺寸可最小化，可產(chǎn)生一系列具有修飾型分支點(diǎn)的最小內(nèi)含子，和/或可產(chǎn)生文庫，以篩選具有突變剪接位點(diǎn)的最小內(nèi)含子，以便產(chǎn)生具有低背景水平和高誘導(dǎo)水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的優(yōu)化內(nèi)含子。例如，可開發(fā)能夠有效可變剪接的最小內(nèi)含子。如本文所述，IVS2-654內(nèi)含子的200bp片段缺失并不降低誘導(dǎo)水平。合成含IVS2-654內(nèi)含子中所有剪接必需元件的小197bp內(nèi)含子仍保留經(jīng)歷可變剪接的能力。但該小內(nèi)含子僅有2.3倍的誘導(dǎo)水平，顯著低于IVS2-654內(nèi)含子的水平，為其水平的4.3分之一。為確定仍應(yīng)具有與IVS2-654內(nèi)含子相似的誘導(dǎo)水平的最大缺失，可對含200bp缺失的質(zhì)粒作進(jìn)一步缺失，以由核苷酸150至33向5'末端擴(kuò)展缺失。缺失還可獨(dú)立地由核苷酸350至519向3'末端擴(kuò)展。還可在核苷酸660-793之間的下游可變內(nèi)含子中獨(dú)立地實(shí)施更多缺失。對于每個(gè)缺失區(qū)域，要缺失的片段大小均可在開始時(shí)增加約30bp，隨后增加約10bp,用于進(jìn)一步最大化缺失大小。通過使用例如StratageneQuikChange多位點(diǎn)定向誘變試劑盒產(chǎn)生缺失突變體。該方法包括使用含期望突變的引物來合成突變鏈，用Dpnl消化，以去除親代質(zhì)粒，并將所合成的單鏈質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入細(xì)菌宿主中，以轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈質(zhì)粒。為快速地和定量地測定轉(zhuǎn)基因表達(dá)的誘導(dǎo)水平，將使用螢光素酶測定系統(tǒng)。但是，理解控制每個(gè)突變內(nèi)含子作用的機(jī)制對于更好地設(shè)計(jì)控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)用的內(nèi)含子應(yīng)當(dāng)是必需的。因此，可在獨(dú)立研究中分析mRNA水平和剪接模式。將獲得的構(gòu)建物獨(dú)立地轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中，以測定其螢光素酶表達(dá)的誘導(dǎo)水平。在確定了3種當(dāng)中每一種的最大缺失后，將它們組合在一種構(gòu)建物中，測試所獲內(nèi)含子的營光素酶表達(dá)的誘導(dǎo)水平。因?yàn)槭褂米钚?nèi)含子會最大化插入多個(gè)拷貝內(nèi)含子以控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)后的AAV克隆能力，所以將由該組實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的最小內(nèi)含子用于余下的提議研究。產(chǎn)生和評價(jià)具有突變分支點(diǎn)的修飾型最小內(nèi)含子。如本文所述，使上游可變內(nèi)含子中的兩個(gè)潛在分支點(diǎn)之一突變將誘導(dǎo)水平由4.3倍增加至13倍。為優(yōu)化用于在內(nèi)含子插入后最大化AAV克隆能力的最小內(nèi)含子，單獨(dú)地突變4個(gè)潛在分支點(diǎn)，并評價(jià)其基因表達(dá)的誘導(dǎo)水平上游可變內(nèi)含子中的兩個(gè)分支點(diǎn)是核苷酸5M-526處的TTTTAAT以及560-566處的CCCTAAT，下游可變內(nèi)含子中的兩個(gè)分支點(diǎn)是813-819的TGCTAAT以及831-837的CTCTTAT。因?yàn)楣灿蟹种c(diǎn)序列是PyNPyUPuAPy，其中Py-C或U,Pu-A或G，而標(biāo)下劃線的A是高度保守的，所以保守的A以及上游A將轉(zhuǎn)變?yōu)镃T。因?yàn)樵?31-837處的潛在分支點(diǎn)CTCTTAT具有T，而不是保守A上游的保守Pu，所以僅保守的A^皮突變。分支點(diǎn)和3'剪接位點(diǎn)之間的距離通常為18個(gè)堿基，但變化很廣。為確定該距離是否對誘導(dǎo)水平有影響，改變距離，以嘗試進(jìn)一步優(yōu)化誘導(dǎo)水平。如所述通過使用StratageneQuikChange多位點(diǎn)定向誘變試劑盒產(chǎn)生突變。為快速地和定量地測定轉(zhuǎn)基因表達(dá)的誘導(dǎo)水平，將使用螢光素酶測定系統(tǒng)。為理解控制每個(gè)突變內(nèi)含子作用的機(jī)制，以便更好地設(shè)計(jì)控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)用的內(nèi)含子，在單獨(dú)的研究中分析mRNA水平和剪接模式。將獲得的構(gòu)建物獨(dú)立地轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中，以測定其螢光素酶表達(dá)的誘導(dǎo)水平。用于上游和下游可變內(nèi)含子的優(yōu)化修飾將組合在一種構(gòu)建物中，測試所獲內(nèi)含子的改善的誘導(dǎo)水平。由具有突變剪接位點(diǎn)的最小內(nèi)含子文庫的產(chǎn)生和篩選具有低背景水平和高誘導(dǎo)水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的內(nèi)含子。為最大化內(nèi)含子插入后的AAV克隆能力，最小內(nèi)含子將用作產(chǎn)生具有突變剪接位點(diǎn)的內(nèi)含子的文庫的模板。為有利于優(yōu)化內(nèi)含子的篩選，在產(chǎn)生文庫之前將最小內(nèi)含子插入到標(biāo)記表達(dá)盒中。使用的標(biāo)記表達(dá)盒是表達(dá)噤呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶和截短形式的單純皰滲病毒1型胸香激酶之間的雙功能融合蛋白(puAtk)的表達(dá)盒。puAtk融合蛋白已表明允許分別使用嘌呤霉素和更昔洛韋類似物1-(-2-脫氧-2-氟-1-(3-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶(FIAU)正選擇和負(fù)選擇表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞。有幾種已開發(fā)的正/負(fù)選擇標(biāo)記，它們應(yīng)可同樣好地用于文庫篩選。使5，可變剪接位點(diǎn)突變，以優(yōu)化內(nèi)含子的誘導(dǎo)水平。這是因?yàn)楦鶕?jù)計(jì)算剪接位點(diǎn)強(qiáng)度的方法，5'可變剪接位點(diǎn)的強(qiáng)度顯著弱于5，和3'剪接位點(diǎn)的強(qiáng)度以及3'可變剪接位點(diǎn)的強(qiáng)度。該選擇還因?yàn)橥ㄟ^修飾其序列增加5'可變剪接位點(diǎn)的強(qiáng)度顯著增加了其誘導(dǎo)水平(但同時(shí)降低其整體轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平)。因?yàn)樵谄渲屑^標(biāo)記外顯子-內(nèi)含子接合處的共有5'剪接位點(diǎn)序列-2AG丄GUPuAGlT6中，+1和+2位的GU是100%保守的，所以-2和-l以及+3至+6位的核苷酸將被突變。為產(chǎn)生突變內(nèi)含子的文庫，將使用StratageneQuikChange多位點(diǎn)定向i秀變試劑合JULo作為產(chǎn)生突變內(nèi)含子文庫的備選方法，在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中獨(dú)立地使用一對重疊引物，一種引物跨越5'可變剪接位點(diǎn)，在要突變的位置具有簡并堿基，另一種引物在內(nèi)含子的上游或下游。兩個(gè)獨(dú)立反應(yīng)的PCR產(chǎn)物將組合為模板，用于另一輪的PCR反應(yīng)，以重構(gòu)突變內(nèi)含子。獲得的PCR產(chǎn)物用限制酶消化，并用于替換親代質(zhì)粒中的對應(yīng)片段，由此產(chǎn)生突變內(nèi)含子文庫。使用以下策略篩選具有低背景水平和高誘導(dǎo)水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的優(yōu)化內(nèi)含子。為使文庫的每個(gè)克隆都能獨(dú)立地被表達(dá)和選擇，在EB病毒(EBV)質(zhì)粒的主鏈中產(chǎn)生文庫。因?yàn)镋BV質(zhì)粒載體能作為附加體增殖，所以其傳統(tǒng)上用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以便進(jìn)行藥物選擇。將所獲質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞或HeLa細(xì)胞中。為選擇由于其在特異性AON存在下能經(jīng)歷有效的外顯子跳躍而具有高轉(zhuǎn)基因表達(dá)誘導(dǎo)水平的突變內(nèi)含子，所述細(xì)胞用AON處理，并用噤呤霉素選擇。因?yàn)槲膸鞈?yīng)在與5'ss652/18AON互補(bǔ)的5'可變剪接位點(diǎn)中含有突變，所以將另一種AON即3，ss579/18用于文庫篩選。3，ss579/18AON是一種與3'可變剪接位點(diǎn)互補(bǔ)的18聚體寡核苷酸，能夠以和5'ss652/18AON相同的效率抑制異常外顯子摻入。為消除由于在沒有AON的情況下其不能經(jīng)歷有效的外顯子摻入而具有高背景水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的突變內(nèi)含子，嘌呤霉素選擇后的抗性細(xì)胞將停止使用AON處理。然后用FIAU處理所述細(xì)胞，以選擇具有低水平puAtk表達(dá)的細(xì)胞。用于藥物選擇的濃度將有所變化，以允許篩選具有最高轉(zhuǎn)基因表達(dá)誘導(dǎo)水平的內(nèi)含子。為從經(jīng)選4奪細(xì)胞中回收內(nèi)含子，由細(xì)胞提取低分子量DNA,并電穿孔入細(xì)菌宿主DH5a中。將回收的內(nèi)含子再插入到螢光素霉表達(dá)盒中，以允許定量其轉(zhuǎn)基因表達(dá)的誘導(dǎo)水平。為理解每個(gè)經(jīng)篩選內(nèi)含子的作用機(jī)制，在獨(dú)立的研究中分析mRNA水平和剪接模式。由此鑒別的具有高轉(zhuǎn)基因表達(dá)誘導(dǎo)水平的突變內(nèi)含子進(jìn)行DNA測序，以鑒別其序列。將可變剪接內(nèi)含子摻入到AAV載體中，以控制動物模型中的長期轉(zhuǎn)基因表達(dá)。因?yàn)榭勺兗艚涌稍隗w內(nèi)用于控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)，所以將可變剪接內(nèi)含子摻入到AAV載體中應(yīng)使該載體能夠在所治療動物中長期控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)。因?yàn)椴迦雰蓚€(gè)拷貝的IVS2-654內(nèi)含子顯著增加誘導(dǎo)水平，并因?yàn)锳AV載體的包裝限度僅為4.7kb，所以將優(yōu)化的最小內(nèi)含子摻入到AAV載體中，以最大化插入內(nèi)含子后的AAV克隆能力。已知內(nèi)含子之間的距離可影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)的誘導(dǎo)水平(圖7),構(gòu)建在不同位置以不同拷貝數(shù)插入優(yōu)化可變內(nèi)含子的AAV質(zhì)粒，評價(jià)所獲AAV載體在體內(nèi)的最佳轉(zhuǎn)基因表達(dá)誘導(dǎo)。通過插入多個(gè)拷貝的內(nèi)含子提升誘導(dǎo)水平還可容易地適用于具有較大包裝能力的其它基因轉(zhuǎn)移載體。因此，重要之處在于確定應(yīng)對轉(zhuǎn)基因表達(dá)的誘導(dǎo)水平具有協(xié)同作用的最佳內(nèi)含子數(shù)量。在體外構(gòu)建和評價(jià)攜帶標(biāo)記基因、插入優(yōu)化的可變剪接內(nèi)含子的AAV質(zhì)粒。如本文所述，插入兩個(gè)內(nèi)含子后的誘導(dǎo)水平與內(nèi)含子之間的距離反向關(guān)聯(lián)。例外之處是串聯(lián)的兩個(gè)內(nèi)含子僅稍微提升誘導(dǎo)水平。因此，在內(nèi)含子之間應(yīng)存在會產(chǎn)生最高誘導(dǎo)水平的最佳距離。為確定最佳距離，將兩個(gè)拷貝的優(yōu)化內(nèi)含子以之間的不同距離插入到螢光素酶基因中。所獲AAV基因組的預(yù)期大小應(yīng)不超過4.0kb,其在4.7kbAAV包裝P艮度之內(nèi)(4.0kbAAV基因組=兩個(gè)末端重復(fù)+啟動子+螢光素酶cDNA+兩個(gè)內(nèi)含子+polyA-0.29+0.56+1.65+2x0.65+0.2,最小內(nèi)含子應(yīng)不超過650bp)。選擇螢光素酶基因中的5，AGPu3，序列(其中Pu=G或A),用于插入優(yōu)化內(nèi)含子中。該標(biāo)準(zhǔn)基于以下事實(shí)壓倒性多數(shù)的5，和3'剪接位點(diǎn)序列分別與共有-2AG丄GUPuAGlf6和-4NPyAG丄PuN+2—致，其中箭頭標(biāo)記外顯子-內(nèi)含子接合處。因此，在序列5，AG和Pu3'之間插入內(nèi)含子應(yīng)恢復(fù)共有的5，和3'剪接位點(diǎn)。因?yàn)锳B構(gòu)建物產(chǎn)生273倍的最佳誘導(dǎo)水平，并在內(nèi)含子之間具有2乃bp的距離，所以通過插入兩個(gè)拷貝的優(yōu)化內(nèi)含子開始縮減275bp距離，一個(gè)拷貝在B位，另一個(gè)拷貝在A位和B位之間的各個(gè)候選位點(diǎn)。該組質(zhì)粒將在兩個(gè)拷貝的內(nèi)含子之間具有191、118、105、98、49、30和15bp的距離。為確定兩個(gè)拷貝的內(nèi)含子之間的序列是否影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)的誘導(dǎo)水平，構(gòu)建另一組插入質(zhì)粒，其含有在核苷酸964-965之間插入的一個(gè)內(nèi)含子拷貝，另一個(gè)內(nèi)含子拷貝在核苷酸988-1161之間并包括核苷酸988和1161在內(nèi)的7個(gè)候選位點(diǎn)的每個(gè)位點(diǎn)處插入。因此，在兩個(gè)內(nèi)含子拷貝之間將具有197、153、99、69、52、40和24bp的距離。將所獲構(gòu)建物單獨(dú)轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中，以測定其轉(zhuǎn)基因表達(dá)的誘導(dǎo)水平。內(nèi)含子之間的距離將與誘導(dǎo)水平相關(guān)聯(lián)。為研究插入3個(gè)拷貝的優(yōu)化內(nèi)含子是否進(jìn)一步提升轉(zhuǎn)基因表達(dá)的誘導(dǎo)水平，我們將使用選自以上實(shí)驗(yàn)的插入兩個(gè)拷貝內(nèi)含子的優(yōu)化構(gòu)建物，用于插入另一個(gè)拷貝的內(nèi)含子。含有3個(gè)拷貝內(nèi)含子的AAV基因組的預(yù)期大小應(yīng)不超過4.65kb,其在4.7kbAAV包裝限度之內(nèi)(4.65kbAAV基因組=兩個(gè)末端重復(fù)序列+啟動子+螢光素酶cDNA+三個(gè)內(nèi)含子+polyA=0.29+0.56+1.65+3x0.65+0.2,最小內(nèi)含子應(yīng)不超過650bp)。在不同位點(diǎn)插入第三個(gè)內(nèi)含子，使得第三個(gè)內(nèi)含子和最接近的內(nèi)含子之間將有約800、600、400、200、100和50bp的距離。將所獲構(gòu)建物單獨(dú)轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中，以測定其轉(zhuǎn)基因表達(dá)的誘導(dǎo)水平。在以下的螢火蟲螢光素酶cDNA核苷酸序列(SEQIDNO:77)中，將用于內(nèi)含子插入的潛在位點(diǎn)標(biāo)以下劃線。A-D位由波浪下劃線和左側(cè)的相應(yīng)字母表示。1ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCGCTGGAAGATGGAACCGCTGG^AGCAACTGCATAAGGCTATG91AAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTAC4Q_ATGCACATATCGAGGTGGACATCACTTACGCTGAGTACTTCGAAATGTCC181GTTCGGTTGGC^S4AGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAQAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATG271CCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTCAACAGTATGGGCATTA361TCGCAGCCTACCGTGGTGTTCGTTTCCAAAAAQ2GGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAGCTCCCAATCATCCAAAAAATTATT451ATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGAT541TTTGTGCCAGAGTCCTTCGATAGGGACAAGACAATTGCACTGATCATGAACTCCTCTGGATCTACTGGTCTGCCTAAAGGTGTCGCTCTGB631CCTCATAGAACTGCCTGCGTGAGATTCTCGCATGCCASAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTT721GTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAA811QAGCTGTTTCTGAGGAGCCTTCAGGATTACAAGATTCAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACCCTATTCTCCTTCTTCGCCAAAAGCACTCTG則ATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGTGGCGCTCCCCTCTCTAAGGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCCAAGAGG991TTCCATCTGCCAGGTATCAGGCAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCC1081GCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGC丁GGGCGTTAATCAAAOASSCGAACTG171TGTGTGAGAGGTCCTATGATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCT1261GGAGACATAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATCGTTGACCGCCTGAAGTCTCTGATTAAGTACAAAGGCTATCAGGTGGCTD1351CCCGCTGAATTGGAATCCATCTTGCTCCAACACCCCAACATCTTCGACGC^QeTGTCGCAjQQTCTTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTT"41CCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGA丁TACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAA1531AAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCTTACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATA1621AAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGTAA評價(jià)由所獲AAV載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的長期體內(nèi)控制。將如上所述確定的具有最優(yōu)轉(zhuǎn)基因表達(dá)控制的AAV質(zhì)粒包裝入病毒載體中。通過使用無腺病毒的生產(chǎn)流程產(chǎn)生載體，該流程包括用3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞重組AAV質(zhì)粒、提供結(jié)構(gòu)性和非結(jié)構(gòu)性AAV基因的AAV輔助質(zhì)粒以及提供AAV載體產(chǎn)生所必需的輔助基因的腺病毒輔助質(zhì)粒。獲得的AAV載體將通過使用包含碘克沙醇梯度和硫酸肝素層析步驟的純化方法純化。然后，通過門靜脈注射將純化載體導(dǎo)入肝臟，以及通過本文所述的直接注射導(dǎo)入骨骼肌和心臟，評價(jià)AAV載體介導(dǎo)體內(nèi)長期可控的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。在用對照AON或內(nèi)含子特異性AON注射動物后，通過對小鼠成像確定螢光素酶基因表達(dá)的誘導(dǎo)水平。作為對照載體，將攜帶綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)盒的AAV納入該組實(shí)驗(yàn)。經(jīng)不同途徑(例如門靜脈注射、直接肌肉注射、直接心臟注射)用AAV載體注射小鼠。施用特異性AON和對照AON這二者，以調(diào)節(jié)螢光素酶基因的表達(dá)。螢光素酶表達(dá)的水平將通過整體成像確定。AAV-luc-int和AAV-GFP分別表示攜帶插入內(nèi)含子的螢光素酶表達(dá)盒的AAV載體或攜帶GFP表達(dá)盒的AAV載體。為確定長期控制螢光素酶基因表達(dá)的能力，在先前誘導(dǎo)的螢光素酶表達(dá)回落至背景水平后再一爭AON施用給小鼠。新誘導(dǎo)的表達(dá)通過整體成像再監(jiān)測。重復(fù)該輪次誘導(dǎo)的表達(dá)，以評價(jià)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的長期控制。插入第三個(gè)內(nèi)含子以在第三個(gè)內(nèi)含子和最近的內(nèi)含子之間產(chǎn)生不同距離的潛在問題，在于在期望位置可能沒有插入所需的5，AGPu3'序列。在此情況下，各個(gè)氨基酸的多種密碼子選擇將用于產(chǎn)生這種插入所需要的序列。例如，在序列5，(NNX)(GPuN)3'(其中各對括號標(biāo)記密碼子)中，核普酸X可作為沉默突變轉(zhuǎn)變?yōu)锳,由此產(chǎn)生內(nèi)含子插入所需要的5'AGPu3'序列。同樣，在序列5'(NAZ)(PuNN)3'中，核香酸Z可作為沉默突變轉(zhuǎn)變?yōu)镚。在20種氨基酸中，其中11種在其密碼子的最后一位含G作為備選，其中12種在其密碼子的最后一位含A作為備選。因此，能夠在期望位置建立插入位點(diǎn)的可能性相對較高。在AAV感染小鼠中重復(fù)誘導(dǎo)螢光素酶表達(dá)應(yīng)允許評價(jià)體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的長期控制。實(shí)施例5.RETT綜合癥研究沒有針對RTT的有效療法。如果發(fā)現(xiàn)治療方法，則6-18個(gè)月的生后無癥狀窗口期可允許在發(fā)生永久性神經(jīng)元損傷之前啟動干涉。使用AAV傳遞正?；蛑罜NS中是一種合理方法。理想的載體是該研究必需的。發(fā)現(xiàn)合適的載體可直接闡明未來治愈或緩解該疾病癥狀的潛力。通過使用可變剪接作為調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可避免目標(biāo)基因過表達(dá)或表達(dá)不足，可控制在正確的發(fā)育期表達(dá)，并可能有希望滿足CNS的正常功能要求。長期目標(biāo)是在代表RTT的動物模型中將腦特異性傳遞用的理想載體與可變剪接的可控表達(dá)相聯(lián)。預(yù)期這些研究最終導(dǎo)致開發(fā)出在患者中安全而有效的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。不同血清型的rAAV載體在體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)模式。為了確定不同血清型AAV載體在體內(nèi)的向性，將血清型1_5和8AAV載體導(dǎo)入小鼠肝臟、肌肉和大鼠視網(wǎng)膜中。所測試血清型之間在不同組織中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)非常不同。AAV1和AAV8可啟動在肝臟和肌肉中的最高轉(zhuǎn)基因表達(dá)，但AAV5和4可比其它血清型更有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞。在注射后的46天中，轉(zhuǎn)基因(綠色熒光蛋白，GFP)表達(dá)成比例增加，這些動物在實(shí)驗(yàn)過程中(4個(gè)月)保持陽性。使用用于整體基因傳遞的公開方法在小鼠腦中進(jìn)行類似分析。轉(zhuǎn)基因是具有CMV增強(qiáng)子的雞P-肌動蛋白啟動子(CBA)驅(qū)動的hAAT(a)和CMV立即早期啟動子驅(qū)動的EGFP(b)。記分由對各組動物觀察到最高蛋白水平(+++++)至各組中的最低表達(dá)水平(+)變動。使用互補(bǔ)AON調(diào)節(jié)體外基因表達(dá)。通過在轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒中使用已知突變內(nèi)含子(人卩珠蛋白內(nèi)含子2)，已成功實(shí)現(xiàn)了在加入AON后調(diào)節(jié)報(bào)告基因表達(dá)。使用內(nèi)含子特異性GFP作為報(bào)告體和AON的校正作用。將突變?nèi)粟?珠蛋白內(nèi)含子2構(gòu)建入GFPcDNA和質(zhì)粒(pEGFP-mut-int)或病毒(AAV2/EGFP-mut-int)中，它們分別用于轉(zhuǎn)染或感染293細(xì)胞。隨時(shí)間變化檢測AON對轉(zhuǎn)基因表達(dá)的作用。在治療后48小時(shí)使用焚光顯微鏡(LeitzDMIRB,VashawScientificInc)檢測GFP表達(dá)。AON校正前mRNA異常剪接的效率由GFP陽性細(xì)胞指示。將野生型或突變型內(nèi)含子插入到螢光素酶cDNA中以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。通過將野生型或突變型人P-珠蛋白內(nèi)含子2插入到質(zhì)粒pGL3(Promega)的可讀框中，改變安光素酶前mRNA的剪接。然后，將重構(gòu)的質(zhì)粒(pGL3-int-luc)轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中。同時(shí)，用AON處理一些細(xì)胞。在24小時(shí)時(shí)用微板發(fā)光計(jì)(Tropix)檢查螢光素酶的表達(dá)，以評價(jià)前mRNA的剪接效率。數(shù)據(jù)表明，在AON存在下，具有突變內(nèi)含子的質(zhì)粒的表達(dá)相對于原始質(zhì)粒增加2-3倍。另外，背景可降低至相當(dāng)?shù)偷乃?。基因表達(dá)校正表現(xiàn)出AON劑量依賴性關(guān)系。使用互補(bǔ)AON調(diào)節(jié)體內(nèi)基因表達(dá)。因?yàn)锳ON可非常有效地在體外調(diào)節(jié)基因表達(dá)，所以在體內(nèi)測試該調(diào)節(jié)系統(tǒng)。因?yàn)槭褂媒M織特異性啟動子，所以肝臟和肌肉用作靶器官，使用"實(shí)時(shí)"螢光素酶成像系統(tǒng)(RoperScientific)易于觀察表達(dá)。結(jié)果提示，AON可在體內(nèi)有效校正可變剪接。使用報(bào)告基因(例如綠色熒光蛋白GFP)鑒別特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元的理想AAV血清型載體。盡管AAV2和其它血清型之間在殼體的氨基酸序列方面有一些差異，但AAV2基因組或鄰接AAV2反向末端重復(fù)序列的轉(zhuǎn)基因可被包裝入不同血清型的殼體中，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒體。這提供了一種直接對比參與體內(nèi)感染的血清型殼體功能的極佳工具。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法。將AAV2/GFP基因組分別包裝入AAV血清型1-8殼體中，從而產(chǎn)生用于體內(nèi)測試的活A(yù)AV重組體的集合。進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)l)將相同顆粒數(shù)的不同AAV血清型給予小鼠，以便確定哪種血清型可在CNS中實(shí)現(xiàn)最佳表達(dá)。雞P-肌動蛋白啟動子(CBA)將用于在所有測試血清型中驅(qū)動GFP表達(dá)。這是一種組成型非組織特異性啟動子。如果必要的話，將在選定血清型中使用諸如NSE啟動子的其它啟動子，以進(jìn)一步對比神經(jīng)元中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的強(qiáng)度和特異性。2)在最佳AAV血清型中構(gòu)建由最佳啟動子驅(qū)動的MeCP2cDNA,在RTT小鼠模型的CNS中測試病毒的MeCP2基因傳遞。以免疫組織化學(xué)以及行為表型的拯救來表征基因表達(dá)。鑒別將轉(zhuǎn)基因傳遞入小鼠CNS中的合適AAV血清型。制備AAV1-8載體，它們具有相同的AAV2載體基因組，該基因組攜帶CBA啟動子和GFP報(bào)告基因(rAAVl-8/CBA-GFP)。病毒將按照3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法制備，顆粒數(shù)通過DNA酶抗性斑點(diǎn)印跡技術(shù)來評價(jià)。在iv灌輸200|ul甘露醇(25%)后15-20分鐘，將各個(gè)血清型的約1><1012個(gè)顆粒注射入每只野生型C57BL品系小鼠腦的小腦延髓池。在注射后第14天處死小鼠。同時(shí)處死未注射的對照。沿冠狀平面和旁矢狀平面切成切片，如果必要的話，使用熒光顯微鏡(LeitzDMIRB,VashawScientificInc)、免疫組織化學(xué)(Pierce)和蛋白質(zhì)印跡研究不同腦部分中的GFP表達(dá)。測試優(yōu)化載體將MeCP2轉(zhuǎn)基因傳遞入MeCP2基因缺陷動物中的情況。MeCP2缺陷小鼠模型得自JacksonLaboratoiy。該模型模擬人類患者中的癥狀。通過使用該動物模型，可觀測所傳遞基因在體內(nèi)的作用。將MeCP2cDNA構(gòu)建入選定的AAV載體(AAV/MeCP2)中，并通過腦池內(nèi)注射(2xl0"個(gè)顆粒數(shù))導(dǎo)入小鼠腦中。如下將動物分為兩組。在注射后14天測試組1的基因表達(dá)，而組2動物保持存活，以評價(jià)存活時(shí)間，并縱向)C測行為和癥狀改變達(dá)1年。所有動物都根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)測l)癥狀的改善，例如體重、腦重量、存活時(shí)間(對比相同年齡的正常和突變動物)以及通過使用紅外光束;敫活的移動監(jiān)觀'j月空(infraredbeam-activatedmovement-monitoringchamber)(Opto-Varimax-MiniA,ColumbusInstruments)監(jiān)測運(yùn)動負(fù)g力。還觀察其它癥狀，如震顫和重呼吸?？蓪赡苡蒑eCP2過表達(dá)產(chǎn)生的癥狀進(jìn)行特別關(guān)注(例如不能竟食、大小或拒絕交配)。2)然后通過使用兔抗MeCP2抗體(Upstate,LakePlacid)、生物素化山羊抗兔IgG(VectorLaboratories)和VectastainEliteABC試劑盒(VectorLaboratories)以免疫組織化學(xué)法檢測腦中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。如Luikenhuis等("ExpressionofMeCP2inpostmitoticneuronsrescuesRettsyndromeinmice"/WAS1園101(16):6033-8(2004年4月6日電子版)；其整體在此引入作為參考)所述，使用最大劑量的病毒，希望拯救動物模型表型。表征一種通過可變剪接調(diào)節(jié)小鼠腦中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的新方法?；蛉毕菘梢疬z傳疾病，包括RTT,而某些基因的過表達(dá)也可產(chǎn)生嚴(yán)重問題。研究已表明，在發(fā)生嚴(yán)重的運(yùn)動障礙之前，神經(jīng)元僅能耐受高至正常水平2-3倍的MeCP2表達(dá)。為此，校正水平變成一個(gè)重要問題。AAV載體太小，以至于不能攜帶MeCP2組織特異性啟動子盒。為控制過表達(dá)，將本文所述的可變剪接調(diào)節(jié)系統(tǒng)導(dǎo)入到載體盒中。選擇螢光素酶作為報(bào)告基因有兩個(gè)原因1)底物螢光素可腹膜內(nèi)注射，并穿過BBB,在那里其可受到在該區(qū)域表達(dá)的螢光素酶蛋白的作用；和2)螢光素酶成像系統(tǒng)(Roper)允許觀察腦中的螢光素酶表達(dá)的實(shí)時(shí)變化，而不用處死動物。測試以AON劑量依賴性方式表現(xiàn)出來的螢光素酶表達(dá)。確定要給予的AON的頻率和劑量，并與對照(僅GFP載體)相比。在用MeCP2內(nèi)含子依賴性轉(zhuǎn)基因盒測試前，確定該載體在CNS中的性能。本文描述的研究已表明，AON可通過經(jīng)內(nèi)含子校正增加轉(zhuǎn)基因表達(dá)或由于寡核苷酸被清除而降低表達(dá)起作用。這使得AON的轉(zhuǎn)基因調(diào)節(jié)成為一種對目前使用的反式作用盒的有吸引力的替代，所述反式作用盒已顯示出有免疫應(yīng)答傾向。盡管為獲得與直接顱內(nèi)注射實(shí)現(xiàn)的表達(dá)水平相同的水平需要靜脈內(nèi)注射(IV)更高劑量的AON，但I(xiàn)V法遠(yuǎn)為便利和實(shí)用。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法。本文描述的研究將通過構(gòu)建在螢光素酶報(bào)告基因中的野生型或突變型內(nèi)含子盒而得以擴(kuò)展。該內(nèi)含子依賴性盒將被構(gòu)建入由適宜啟動子驅(qū)動的選定AAV載體中。病毒將如上所述產(chǎn)生，并直接注射入C57BL小鼠腦的小腦延髓池中(2xl0"個(gè)顆粒/小鼠)。收集基線圖象，然后給予AON，以在注射后2周誘導(dǎo)螢光素酶表達(dá)。評價(jià)用于拯救轉(zhuǎn)基因表達(dá)的AON的給藥劑量和頻率。通過使用螢光素酶成像系統(tǒng)(Roper)每周一次直接觀察結(jié)果。為確定要注射的AON的適宜劑量，通過靜脈內(nèi)注射將不同劑量的AON(例如0.02pg、1嗎、4)Lig、20嗎和100嗎的100pl鹽水溶液)注射入小鼠中，以獲得劑量依賴性轉(zhuǎn)基因表達(dá)曲線。對照組僅接受相同量的鹽水。這些數(shù)據(jù)應(yīng)有助于確定在腦中表達(dá)內(nèi)含子依賴性MeCP2轉(zhuǎn)基因表達(dá)所需的AON劑量。依據(jù)本文所述研究，AON誘導(dǎo)的體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)在一定時(shí)間后將逐漸降低。所以，從理論上講，首次施用AON誘導(dǎo)的螢光素酶表達(dá)將在一定時(shí)間后降低。因?yàn)樵摻档涂蓪?shí)時(shí)觀測到，所以在表達(dá)降低至最初表達(dá)水平的一半時(shí)給予AON。使用螢光素酶表達(dá)將轉(zhuǎn)基因表達(dá)保持在穩(wěn)定水平，并外推至MeCP2的相似表達(dá)時(shí)間點(diǎn)。所述蛋白的半衰期將確定該實(shí)驗(yàn)方法的最終條件(例如分鐘對小時(shí))。使用采用s"標(biāo)記的甲硫氨酸的經(jīng)典^o中追蹤實(shí)驗(yàn)，確定這些蛋白在組織培養(yǎng)物中的半衰期。這些實(shí)驗(yàn)條件的建立將允許以保持MeCP2表達(dá)于恒定水平的頻率施用AON。為解決有關(guān)穿越血腦屏障的效率的問題，可使用化學(xué)修飾的AON,例如硫代磷酸酯寡核苷酸。確立AAV調(diào)節(jié)的載體在腦中總體來說對基因治療領(lǐng)域有重要價(jià)值，對與全腦疾病如Rett綜合癥有關(guān)的神經(jīng)學(xué)領(lǐng)域更重要。應(yīng)用選定的血清型特異性載體和內(nèi)含子依賴性剪接調(diào)節(jié)系統(tǒng)傳遞MeCP2轉(zhuǎn)基因至小鼠腦中。將依賴于突變型人P-珠蛋白內(nèi)含子2的調(diào)節(jié)系統(tǒng)構(gòu)建入MeCP2cDNA(AAV/MeCP2-mut-int)中。將該轉(zhuǎn)基因盒摻入理想的血清型載體中，并由選定啟動子(NSE、CBA等)驅(qū)動。轉(zhuǎn)基因小鼠由JacksonLaboratory訂購。AON以上文確定的量和頻率給予小鼠。在AON傳遞后，表征動物的轉(zhuǎn)基因表達(dá)(如上所述)，并如本文所述監(jiān)測行為變化。前述實(shí)施例闡述了本發(fā)明，不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明。本發(fā)明由以下權(quán)利要求描述，權(quán)利要求的等同方案包含在本發(fā)明中。本文提及的所有出版物、專利申請、專利、專利出版物和其它參考文獻(xiàn)都整體引入作為參考，用于與其中提到參考文獻(xiàn)的句子和/或段落相關(guān)的教導(dǎo)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>一個(gè)內(nèi)含子在相對于螢光素酶cDNA的不同位置中的校正效率。a.Pre-代表在啟動子和安光素酶cDNA之間插入的內(nèi)含子；b.與無寡核香酸相比在寡核苦酸校正后的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的倍數(shù)增加。c.在寡核普酸校正后具有突變內(nèi)含子的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因表達(dá)相對于螢光素酶cDNA中具有1個(gè)野生型內(nèi)含子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的百分率。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>插入多個(gè)內(nèi)含子的校正效率。a.Pre-代表在啟動子和螢光素酶cDNA之間插入的內(nèi)含子；b.與無寡核苷酸相比在寡核苷酸校正后的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的倍數(shù)增加。c.在寡核苷酸校正后具有突變內(nèi)含子的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因表達(dá)相對于螢光素酶cDNA中具有1個(gè)野生型內(nèi)含子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的百分率。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>縮短的內(nèi)含子的轉(zhuǎn)基因校正效率。a.與無寡核苷酸相比在寡核苷酸校正后的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的倍數(shù)增加。b.在寡核普酸校正后具有突變內(nèi)含子的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因表達(dá)相對于螢光素酶cDNA中具有1個(gè)野生型內(nèi)含子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的百分率。權(quán)利要求1.分離的核酸，所述核酸包含A)至少一個(gè)第一核苷酸序列，其編碼目標(biāo)異源核苷酸序列；和B)至少兩個(gè)第二異源核苷酸序列，其中每個(gè)第二異源核苷酸序列包含i)限定第一內(nèi)含子的第一組剪接元件，在第二組剪接元件沒有活性的情況下，所述第一內(nèi)含子通過剪接被去除，從而產(chǎn)生賦予生物功能的第一RNA分子；和ii)限定與所述第一內(nèi)含子不同的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子的第二組剪接元件，其中在所述第二組剪接元件有活性時(shí)，與所述第一內(nèi)含子不同的所述一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子通過剪接被去除，從而不產(chǎn)生RNA分子和/或產(chǎn)生不賦予生物功能的第二RNA分子，其中所述第二異源核苷酸序列選自a)在所述第一核苷酸序列中串聯(lián)的第二核苷酸序列，b)在所述第一核苷酸序列中相距至少25個(gè)堿基對的第二核苷酸序列，c)在所述第一核苷酸序列中相距至少50個(gè)堿基對的第二核苷酸序列，d)在所述第一核苷酸序列中相距至少75個(gè)堿基對的第二核苷酸序列，e)在所述第一核苷酸序列中相距至少100個(gè)堿基對的第二核苷酸序列，f)在所述第一核苷酸序列中相距至少200個(gè)堿基對的第二核苷酸序列，g)在所述第一核苷酸序列中相距至少300個(gè)堿基對的第二核苷酸序列，h)第二核苷酸序列，其中第一個(gè)第二核苷酸序列位于啟動子和所述第一核苷酸序列之間，而第二個(gè)第二核苷酸序列位于所述第一核苷酸序列中；和i)第二核苷酸序列，其中第一個(gè)第二核苷酸序列位于所述第一核苷酸序列中的可讀框和聚腺苷酸尾或聚腺苷酸信號之間，而第二個(gè)第二核苷酸序列位于所述第一核苷酸序列的所述可讀框中。2.權(quán)利要求1的核酸，其中所述第一核苷酸序列選自以下序列及其任意組合編碼蛋白或肽的核苷酸序列、作為RNA具有酶活性的核苷酸序列(例如RNAi)、編碼核酶的核苷酸序列、編碼反義序列的核苷酸序列和/或小核RNA(snRNA)。3.權(quán)利要求1或2的核酸，所述核酸包含兩個(gè)或多個(gè)可相同或不同的第一核苷酸序列。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的核酸，所迷核酸包含兩個(gè)或多個(gè)相同的第二核苷乾序列。5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的核酸，所述核酸包含彼此不同的兩個(gè)或多個(gè)第二核苷酸序列。6.載體，所述載體包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸。7.權(quán)利要求6的載體，所述載體選自非病毒載體、病毒載體和合成生物納顆粒。8.權(quán)利要求6的載體，所述載體選自AAV載體、腺病毒載體、慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、皰疹病毒載體、甲病毒載體、痘病毒載體、桿狀病毒載體和嵌合病毒載體。9.細(xì)胞，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸。10.細(xì)胞，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的載體。11.組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸和藥學(xué)可接受載體。12.組合物，所述組合物包含權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的載體和藥學(xué)可接受載體。13.組合物，所述組合物包含權(quán)利要求9-10中任一項(xiàng)的細(xì)胞和藥學(xué)可接受載體。14.生產(chǎn)蛋白的方法，所迷方法包括a)使封閉寡核苷酸與權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述封閉寡核苷酸封閉第二組剪接元件的成員，導(dǎo)致第一內(nèi)含子通過剪接被去除，而產(chǎn)生第一RNA;和b)翻譯第一RNA，以生產(chǎn)所述蛋白。15.產(chǎn)生賦予生物功能的RNA的方法，所述方法包括a)使封閉寡核苷酸與權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述封閉寡核苷酸封閉第二組剪接元件的成員，導(dǎo)致第一內(nèi)含子通過剪接被去除，而產(chǎn)生第一RNA;和b)翻譯第一RNA,以產(chǎn)生j武予生物功能的RNA。16.權(quán)利要求14-15中任一項(xiàng)的方法，其中將所述封閉寡核苷酸導(dǎo)入到含所述核酸的細(xì)胞中。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述細(xì)胞處于動物中。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述動物是人。19.權(quán)利要求14-18中任一項(xiàng)的方法，其中所述封閉寡核苷酸不激活RNA酶H。20.權(quán)利要求14-19中任一項(xiàng)的方法，其中所迷封閉寡核香酸包含修飾型核苦酸間橋接磷酸酯殘基，所述磷酸酯殘基選自甲基硫代磷酸酯、嗎啉代磷酸酯、哌，秦代磷酸酯和氨基磷酸酯。21.權(quán)利要求14-20中任一項(xiàng)的方法，其中所迷封閉寡核苦酸包含在其2'位具有低級烷基取代基的核普酸。22.權(quán)利要求14-21中任一項(xiàng)的方法，其中所迷封閉寡核苦酸長8-50個(gè)核苦酸。23.生產(chǎn)蛋白的方法，所述方法包括a)使小分子與權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述小分子封閉第二組剪接元件的成員，導(dǎo)致第一內(nèi)含子被去除，而產(chǎn)生第一RNA;和b)翻譯第一RNA,從而生產(chǎn)所述蛋白。24.產(chǎn)生賦予生物功能的RNA的方法，所述方法包括a)使小分子與權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述小分子封閉第二組剪接元件的成員，導(dǎo)致第一內(nèi)含子被去除，而產(chǎn)生第一RNA;和b)翻譯第一RNA,從而產(chǎn)生賦予生物功能的RNA。25.權(quán)利要求23-24中任一項(xiàng)的方法，其中將所述小分子導(dǎo)入到含所述核酸的細(xì)胞中。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述細(xì)胞處于動物中。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述動物是人。28.在受治療者中調(diào)節(jié)賦予生物功能的異源RNA的產(chǎn)生的方法，所述方法包括a)將權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸導(dǎo)入到所述受治療者中；和b)在期望產(chǎn)生所述異源RNA時(shí)將封閉第二組剪接元件成員的封閉寡核苷酸和/或小分子導(dǎo)入到所述受治療者中，由此調(diào)節(jié)所述受治療者中所述RNA的產(chǎn)生。29.調(diào)節(jié)受治療者中的異源蛋白產(chǎn)生的方法，所述方法包括a)將權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸導(dǎo)入到所述受治療者中；和b)在期望產(chǎn)生所述異源蛋白時(shí)將封閉第二組剪接元件成員的'封閉寡核苷酸和/或小分子導(dǎo)入到所述受治療者中，由此調(diào)節(jié)所迷受治療者中所述蛋白的產(chǎn)生。30.治療受治療者中的疾病的方法，所述方法包括a)將權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸導(dǎo)入到所述受治療者中；和b)將封閉寡核苷酸和/或小分子導(dǎo)入到所述受治療者中，由此治療所述受治療者中的疾病。31.鑒別化合物的方法，其中所述化合物封閉權(quán)利要求1的核酸的第二組剪接元件成員，所述方法包括a)使權(quán)利要求1的核酸與所述化合物在允許剪接的條件下接觸；和b)檢測權(quán)利要求1的第一RNA的產(chǎn)生和/或第二RNA的產(chǎn)生，借此權(quán)利要求1的第一RNA的產(chǎn)生鑒別出封閉權(quán)利要求1的第二組剪接元件成員的化合物。32.抑制賦予生物功能的異源RNA產(chǎn)生的方法，所述方法包括a)使小分子與權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述小分子封閉第一組剪接元件成員，導(dǎo)致第二內(nèi)含子被去除，由此抑制第一RNA的產(chǎn)生。33.抑制異源蛋白產(chǎn)生的方法，所述方法包括a)使小分子與權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述小分子封閉第一組剪接元件成員，導(dǎo)致第二內(nèi)含子被去除，由此抑制第一RNA的產(chǎn)生。34.抑制賦予生物功能的異源RNA產(chǎn)生的方法，所述方法包括a)使封閉寡核苷酸與權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述封閉寡核苷酸封閉第一組剪接元件成員，導(dǎo)致第二內(nèi)含子被去除，由此抑制第一RNA的產(chǎn)生。35.抑制異源蛋白產(chǎn)生的方法，所述方法包括a)使封閉寡核苷酸與權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸在允許剪接的條件下接觸，其中所述封閉寡核苷酸封閉第一組剪接元件成員，導(dǎo)致第二內(nèi)含子被去除，由此抑制第一RNA的產(chǎn)生。全文摘要本發(fā)明提供分離的核酸，所述核酸包含a)至少一個(gè)第一核苷酸序列，其編碼目標(biāo)異源核苷酸序列；和b)至少兩個(gè)第二異源核苷酸序列，其中每個(gè)第二異源核苷酸序列都包含i)限定第一內(nèi)含子的第一組剪接元件，在第二組剪接元件沒有活性的情況下，所述第一內(nèi)含子通過剪接被去除，從而產(chǎn)生賦予生物功能的第一RNA分子；和ii)限定與所述第一內(nèi)含子不同的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子的第二組剪接元件，其中在所述第二組剪接元件有活性時(shí)，與所述第一內(nèi)含子不同的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子通過剪接被去除，從而不產(chǎn)生RNA分子和/或產(chǎn)生不賦予生物功能的第二RNA分子。還提供使用本發(fā)明核酸調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方法。文檔編號C07H21/02GK101213203SQ200680023753公開日2008年7月2日申請日期2006年4月28日優(yōu)先權(quán)日2005年4月29日發(fā)明者R·J·薩穆爾斯基申請人:教堂山北卡羅萊納州大學(xué)