專利名稱：：促紅細胞生成蛋白的重組生產(chǎn)方法促紅細胞生成蛋白的重組生產(chǎn)方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)高度糖基化形式(相對于天然EPO中3個N連接的糖基化，總共5個N連接的糖基化)的促紅細胞生成素的重組方法。所增加的糖基化位點將產(chǎn)生更多數(shù)目的糖鏈，以及比人EPO更高的唾液酸含量，這將使得該重組分子的半衰期更長。本發(fā)明還涉及表達盒的構(gòu)建，該表達盒包含編碼高度糖基化形式的促紅細胞生成素的核酸序列，以及涉及在宿主細胞中的穩(wěn)定表達。本發(fā)明更涉及用于純化促紅細胞生成蛋白(erythropoiesisstimulatingprotein)6勺^f尤4匕方法。本發(fā)明的重組EPO及其鹽和功能衍生物，可以包含藥物組合物中用于增加血細胞比容的活性成分，因此可用于治療貧血癥以及恢復(fù)患者的健康狀況和生活質(zhì)量。發(fā)明背景促紅細胞生成素(Erythr叩oietin,EPO)是一種糖蛋白激素，是紅細胞生成或者將身體紅細胞總量維持在最適宜水平的主要調(diào)節(jié)因子。作為對組織氧合作用減少的反饋，EPO在腎臟中的合成增加。分泌的激素結(jié)合到骨髓中紅細胞前體表面的特異性受體上，從而調(diào)節(jié)紅細胞前體的存活、增殖、分化以及最終增加血細胞比容(紅細胞體積與全血體積的比率)。自從10多年前，引入重組人EPO(rHuEPO)后，它已成為治療慢性腎衰竭(CRF)相關(guān)的貧血癥的治療標(biāo)準(zhǔn)，在治療貧血癥、恢復(fù)能量水平以及提高患者的健康狀況和生活質(zhì)量方面非常有效，還被批準(zhǔn)用于癌癥、HIV感染相關(guān)的貧血癥，以及用于外科手術(shù)以減少異源輸血的需要。用rHuEPO治療通常推薦的是通過皮下注射或靜脈注射，每周2-3次。對于CRF患者，治療的持續(xù)時間是患者的一生，或者直到成功進行了腎移植，恢復(fù)了腎臟功能，包括促紅細胞生成素激素產(chǎn)生的功能。對于癌癥患者，通常會貫穿整個化學(xué)治療過程，只要貧血癥持續(xù)，就需要進行rHuEPO治療。然而，商業(yè)化可得到的蛋白療法例如EPO的生物利用度，由于其血漿半衰期較短、對蛋白酶降解的敏感性而受到限制。因此，本發(fā)明的目的是提供一種重組方法，用于生產(chǎn)分開的和分離的促紅細胞生成素同等型，該同等型具有確定的唾液S臾含量、更長的半衰期且因此增加的生物活性。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)高度糖基化形式(相對于天然EPO中3個N連接的糖基化，總共5個N連接的糖基化)的促紅細胞生成素的重組方法。所增加的糖基化位點將產(chǎn)生更多數(shù)目的糖鏈，以及比人EPO更高的唾液酸含量，這將使得該重組分子的半衰期更長。本發(fā)明還提供的是新穎必需的生物學(xué)功能和摻入本發(fā)明DNA序列的環(huán)狀質(zhì)粒DNA載體，以及用所述載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主生物體。本發(fā)明相對提供的是用于生產(chǎn)有用多肽的新方法，該新方法包括在促使攜帶DNA序列的外源載體大規(guī)模表達的條件下，培養(yǎng)生長這些已轉(zhuǎn)化或者已轉(zhuǎn)染的宿主；從生長培養(yǎng)基、細胞裂解物或細胞膜片段中分離出所需多肽。本發(fā)明的一個方面，涉及包含有編碼高度糖基化形式的促紅細胞生成素的核酸序列的表達盒的構(gòu)建。與未修飾的EPO和常規(guī)的EPO-PEG綴合物相比，本發(fā)明所述蛋白的循環(huán)半衰期和血漿保留時間增加，清除時間減少，臨床體內(nèi)活性增加。本發(fā)明的重組EPO及其鹽和功能性衍生物，可以包含藥物組合物中用于增加血細胞比容值的活性成分，因此可用于治療貧血癥以及恢復(fù)患者的健康狀況和生活質(zhì)量。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，結(jié)合下文為實施本發(fā)明而提供優(yōu)選實施方案的發(fā)明詳述，本發(fā)明的許多方面和優(yōu)勢將會是顯而易見的。附圖和序列詳細描述SEQIDNo.1:編碼新的4足紅細胞生成蛋白(novelErythropoetinstimulatingprotein,簡寫nesp,Nesp,NESP)的核香酸序列。SEQIDNo.2:編碼新的4足紅細胞生成蛋白的核苦酸序列的密碼子優(yōu)化形式。SEQIDNo.3:NESP或者達依泊汀a(Darbepoietinalfa)的氨基酸序列。圖1:編碼新的促紅細胞生成蛋白的DNA核苦酸序列的未優(yōu)化形式和密碼子優(yōu)化形式的配對序列比對圖。圖2:促紅細胞生成蛋白的從頭合成的優(yōu)化cDNA序列(AVCIP-Nesp-Opt)與促紅細胞生成蛋白已確立的和進一步優(yōu)化的序列(合成Nesp-Opt)的序列比對圖。圖3:促紅細胞生成蛋白的從頭合成的cDNA序列(AVCIP-Nesp)與促紅細胞生成蛋白的已確立序列(合成Nesp)的序列比對圖。圖4:載體和插入片段的限制酶切消化圖。圖5:AVCIP-Nesp、AVCIP-Nesp國Opt和pcDNA3.1D/V5國His的限制酶切消化片段的凝膠純化圖。圖6:AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp假定克隆和AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp-Opt假定克隆的限制酶切消化分析圖。圖7:用/人內(nèi)切開AVCIP-NespcDNA和AVCIPNesp-OptcDNA的酶，對AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp克隆和AVCEPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp-Opt克隆的限制酶切消化分析。圖8:AVCIP-Nesp-Opt4號cDNA克隆(合成Nesp-Opt)與已確立的Nesp-Opt基因序列的序列比對圖。圖9:AVCIP-Nesp9號cDNA克隆(合成Nesp)與已確立的Nesp基因序列的序列比對圖。圖10:AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp構(gòu)建體圖譜。圖11:AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp-Opt構(gòu)建體圖譜。圖12:pcDNA3.1/NESP(天然序列)。圖13:pcDNA3.1/NESP(優(yōu)化序列)。圖14:用兔抗人促紅細胞生成素抗體(2ug/ml)對用pcDNA3.1/NESP(天然序列)或者pcDNA3.1/NESP(優(yōu)化序列)和Aranesp頂轉(zhuǎn)染的CHOKl細胞系的總細胞裂解物的蛋白質(zhì)印跡分析。圖15:穩(wěn)定細胞系開發(fā)的流程圖。圖16:挑選用于開發(fā)表達達依泊汀a(Darbepoetinalfa)的穩(wěn)定CHOK1細胞系的集落圖快照。發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于生產(chǎn)促紅細胞生成素同等型的可選擇的新的重組方法。根據(jù)本發(fā)明獲得的特殊促紅細胞生成素同等型及其性質(zhì)，隨原料的來源不同可能有所不同。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)促紅細胞生成素同等型的可選擇的新的重組方法，該同等型在5個位置(Ala30Asn;His32Thr;Pro87Val;Trp88Asn和Pro90Thr)上不同于重組人促紅細胞生成素(recombinanthumanErythropoietin,rHuEPO)和天然的人EPO。本文使用的術(shù)語"促紅細胞生成素同等型(erythropoietinisoform)"是指有單一等電點(pl)，以及有相同氨基酸序列的促紅細胞生成素制備物。本文所用的術(shù)語"促紅細胞生成素(erythropoietin)",包括天然產(chǎn)生的促紅細胞生成素、尿源的人促紅細胞生成素以及非天然產(chǎn)生的多肽，所述非天然產(chǎn)生的多肽具有促使骨髓細胞增加網(wǎng)織紅細胞和紅細胞產(chǎn)生的體內(nèi)生物學(xué)性質(zhì)，還具有天然產(chǎn)生的促紅細胞生成素的氨基酸序列和充分復(fù)制的糖基化形式。依照本發(fā)明，通過從頭合成方法得到編碼高度糖基化形式的人促紅細胞生成素的DNA序列。對于將使用的具體哺乳動物細胞，這一方法將能夠使密碼子得以更好的優(yōu)化。此外，合成DNA用于真核/原核表達目的，提供可分離數(shù)量的、顯示天然產(chǎn)生的促紅細胞生成素(EPO)生物學(xué)特性以及EPO的體內(nèi)和體外生物活性的多肽。下面的實施例用于說明本發(fā)明，具體涉及在鑒定編碼EPO的猴cDNA克隆和人基因組克隆之前所實施的方法，進行所述鑒定的方法，以及測序方法、表達系統(tǒng)的開發(fā)和EPO在所述系統(tǒng)中表達的免疫學(xué)驗證方法。實施例1:重組促紅細胞生成蛋白(NESP)的合成通過從頭合成方法得到編碼高度糖基化形式的人促紅細胞生成素的DNA序列。對于將使用的具體哺乳動物細胞，這一方法將能夠使密碼子得以更好的優(yōu)化。此外，合成DNA用于真核/原核表達目的，提供可分離數(shù)量的、顯示天然產(chǎn)生的促紅細胞生成素(EPO)生物學(xué)特性以及EPO的體內(nèi)和體外生物活性的多肽。編碼促紅細胞生成蛋白的核香酸序列如SEQIDNo.l所示。與編碼促紅細胞生成素的人基因的天然產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物相比，在所述促紅細胞生成蛋白中因摻入額外的糖基化位點而發(fā)生改變的核苷酸殘基用大寫字母突出顯示。作為密碼子優(yōu)化過程的一部分，已改變促紅細胞生成蛋白編碼區(qū)中的密碼子，以保證重組蛋白可在哺乳動物細胞系(例如CHOKl和HEK293)中最佳化表達。編碼促紅細胞生成蛋白的密碼子優(yōu)化核苦酸序列如SEQIDNo.2所示。編碼促紅細胞生成蛋白的未優(yōu)化核苷酸序列和密碼子優(yōu)化核苷酸序列的配對序列比對見圖1。本發(fā)明的促紅細胞生成蛋白的完整一級氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。與天然產(chǎn)生的人EPO相比，已將發(fā)生改變的NESP氨基酸殘基突出顯示。實施例2:編碼促紅細胞生成蛋白的從頭合成的cDNA的真實性^iiE從頭合成的原始cDNA序列(AVCIP-Nesp)和密碼子優(yōu)化cDNA序列(AVCIP-Nesp-Opt)，通過自動化DNA測序法進行真實性驗證，所得結(jié)果見圖2和圖3。實施例3:將AVCIP-Nesp和AVCIP-Nesp-OptcDNA亞克隆到哺乳動物細胞特異性表達載體pcDNA3.1D/V5-His中將從頭合成的原始cDNA序列(AVCIP-Nesp)和密碼子優(yōu)化cDNA序列(AVCIP-Nesp-Opt)分別亞克隆到哺乳動物細胞特異性表達載體pcDNA3.1D/V5-His中，以產(chǎn)生即用于轉(zhuǎn)染的構(gòu)建體。所用方法的細節(jié)見下文A.試劑和酶1.QIAGEN凝膠提取試劑盒和PCR純化試劑盒2.pcDNA3.1D/V5畫His載體DNA(Invitrogen)酵，10x緩沖液1.Bamffl10緩沖液E2.Xhol10緩沖液E3.HindIII20緩沖液C4.Xbal10緩沖液C5.T4DNA連4妄酶40連接酶緩沖液所有反應(yīng)均按照生產(chǎn)商推薦的步驟進行。每個反應(yīng)都將提供的10x反應(yīng)緩沖液稀釋成lx終濃度。B.載體和插入片段的限制酶切消化方法使用下列DNA樣品和限制性內(nèi)切酶:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>將反應(yīng)物混勻，短暫離心并在37。C孵育2小時。用瓊脂糖凝膠電泳分析限制酶切消化產(chǎn)物。觀察到預(yù)期的酶消化譜，可見600bp的基因片段(對3號反應(yīng)和4號反應(yīng))和一條5.5kb的載體主鏈片段(對1號反應(yīng)和2號反應(yīng))為結(jié)果特征(圖4)。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞將代表AVCIP-NespcDNA和AVCIP-Nesp-OptcDNA的600bpDNA片段，用QIAGEN凝膠提取試劑盒，按照凝膠提取的方法分別純化。哺乳動物表達載體pcDNA3.1D/V5-His已消化的5.5kb載體主鏈也用相同的試劑盒純化。后續(xù)限制酶切消化和凝膠提取必需的cDNA片段和載體DNA片段，每一純化的DNA樣品取小樣(l-2iul)，用瓊脂糖凝膠電泳分析檢查純度和完整性，見圖5。C.pcDNA3.1D/V5畫His主鏈與AVCIP-NespcDNA和AVCIP畫Opt曙NespcDNA的連接估計已消化和已純化的載體和插入片段的DNA濃度，并以下列方式建立連接反應(yīng)試劑成分終濃度1號反應(yīng)2號反應(yīng)(AVCIP/Nesp)(AVCIP-Nesp-Opt)水-5nl5|Lll10x反應(yīng)緩沖液lx2pi2^1載體~50ng2pi2pi插入片段~17nglpllnlT4DNA連接酶40U"11nl終體積10pl10pl10將反應(yīng)物輕輕地混勻，短暫離心并在室溫孵育2-3小時。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞。D.AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp假定克隆和AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp-Opt假定克隆的限制酶切消化分析將質(zhì)粒DNA從含有氨芐青霉素的L.B瓊脂平板上獲得的菌落中分別純化出來。并通過限制酶切消化分析分離的質(zhì)粒DNA，證實所需的cDNA插入片段存在，見圖6。在限制酶切消化含有AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp和AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp-Opt的幾個假定克隆后，根據(jù)所得結(jié)果，選出一些已顯示出所需限制酶譜的克隆，用能從內(nèi)切開AVCIP-Nesp和AVCIPNesp-OptcDNA，并產(chǎn)生不同大小片段的限制性內(nèi)切酶進行進一步的限制酶切消化分析，見圖7。E.通過DNA測序驗證所選擇的AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp克隆和AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp-Opt克隆根據(jù)限制酶切分析結(jié)果而選擇的AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp克隆和AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp-Opt克隆，通過自動化DNA測序進一步進行驗證。名稱引物描述序列T7測序引物Invitrogen試齊'盒引物5，TAATACGACTCACTATAGGG3'AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp克隆和AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Nesp-Opt克隆顯示與模板序列具有100%同一性，見圖8和圖9。用/人頭合成的AVCIP-NespcDNA和AVCIP-Nesp-OptcDNA制備的重組表達構(gòu)建體的圖譜，見圖10和圖11。實施例4:cDNA融合構(gòu)建體的維持和繁殖編碼新的促紅細胞生成蛋白的cDNA構(gòu)建體，在標(biāo)準(zhǔn)細菌細胞系例如Top10(Invitrogen)中維持和繁殖。實施例5:在CHO-K1細胞中瞬時/穩(wěn)定表達重組蛋白(a)促紅細胞生成蛋白在CHOKl細胞中的瞬時表達用優(yōu)化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染實驗方案，以1.pcDNA3.1/NESP(天然序列)2.pcDNA3.1/NESP(優(yōu)化序列)轉(zhuǎn)染CHO細胞。CHOKl貼壁細胞的瞬時轉(zhuǎn)染1.轉(zhuǎn)染前一天，將細胞按lml生長培養(yǎng)基(D-MEM/F1:1)lx105個的密度接種到24孔板的各孔內(nèi)。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，已接種的細胞數(shù)量應(yīng)產(chǎn)生80%匯合。2.將該細胞在其正常生長條件(通常37。C和5%CO。下孵育。3.轉(zhuǎn)染當(dāng)天，A管-將2嗎溶于TE緩沖液(pH7-pH8)的DNA(DNA最低濃度為0.1ngl)用Opti-MEMTM稀釋，至總體積為100^1?；靹虿⒍虝弘x心幾秒鐘以除去試管頂部的液滴。4.B管-在lOOplOpti誦MEMTM中加入6^1LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，并置于室溫5分鐘。5.通過上下吸打5次使A管和B管的內(nèi)容物混勻。6.將樣品在室溫(15-25。C)下孵育15分鐘，以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。7.當(dāng)形成復(fù)合物時，從培養(yǎng)皿中輕輕地吸出生長培養(yǎng)基，并用2mlPBS洗滌細胞一次。8.將O.lml細胞Opti-MEMTM加入到含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的反應(yīng)管中。通過上下吸打兩次混勻，并立即將全部體積量轉(zhuǎn)移到24孔板的一個孔內(nèi)。9.將細胞與轉(zhuǎn)染復(fù)合物在其正常生長條件下孵育6小時。10.通過輕輕地吸取，從細胞中除去含有殘留復(fù)合物的培養(yǎng)基，并用4mlPBS(磷酸緩沖鹽溶液)洗滌細胞一次。11.加入新鮮的細胞生長培養(yǎng)基(含有血清和抗生素)。經(jīng)過適當(dāng)?shù)姆跤龝r間后，測定細胞對已轉(zhuǎn)染基因的表達。將這些轉(zhuǎn)染的細胞用抗促紅細胞生成素抗體染色，以評價該蛋白的表達。如圖12和圖13所示，用兩套瞬時轉(zhuǎn)染實驗檢測所述蛋白的特異性表達。它們代表用pcDNA3.1/NESP(天然序列)和pcDNA3.1/NESP(優(yōu)化序列)獨立轉(zhuǎn)染的CHOKl細胞系。(b)通過蛋白質(zhì)印跡法檢測促紅細胞生成蛋白在轉(zhuǎn)染的CHOKl細胞系中的瞬時表達從用pcDNA3.1/NESP(天然序列)或者pcDNA3.1/NESP(優(yōu)化序歹寸)獨立轉(zhuǎn)染的CHOKl細胞系制備總細胞裂解物。轉(zhuǎn)染后48小時，制備細胞裂解物，在細胞裂解物轉(zhuǎn)印到PVDF膜上之前，用12%SDS-PAGE電泳分離這兩個不同量的總蛋白制備物(10jug和20jLig)。然后，將該PVDF膜用2fxg/ml的兔抗人促紅細胞生成素抗體進行探測，所得結(jié)果見圖14。從圖8顯而易見，在用pcDNA3.1/NESP(天然序列)或者pcDNA3.1/NESP(優(yōu)化序列)轉(zhuǎn)染的CHOKl細胞系的總細胞裂解物中，在更高的所用蛋白制備物濃度(20fxg)下，特異性檢測到促紅細胞生成蛋白的存在。發(fā)現(xiàn)經(jīng)轉(zhuǎn)染的CHOK1細胞系的細胞裂解物中存在的所述促紅細胞生成蛋白的電泳遷移率，與在治療劑Aranesp廻中觀察到的促紅細胞生成蛋白的電泳遷移率相匹配，因此說明已表達重組蛋白的預(yù)期高度糖基化性質(zhì)。(c)表達促紅細胞生成蛋白的穩(wěn)定CHOKl細胞系的開發(fā)DNA整合到染色體上，或者以穩(wěn)定的附加型載體維持，其中已知報告基因和其它基因?qū)⒁韵鄬Φ偷念l率出現(xiàn)。使用編碼對致死藥物抗性的基因可以對這些細胞作出選擇。這種組合的一個實例是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記基因以及藥物GeneticinTM。藥物處理后幸存的個體細胞擴大為可^L單獨選擇、繁殖和分析的克隆類群。描述這些與開發(fā)穩(wěn)定系有關(guān)的步驟的流程圖見圖15。實驗方案2:CHOKl貼壁細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染1.轉(zhuǎn)染前一天，將細胞按lml生長培養(yǎng)基(D-MEM/F1:1)lx105個的密度接種到24孔板的各孔內(nèi)。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，已接種的細胞數(shù)量應(yīng)產(chǎn)生80%匯合。2.將該細胞在其正常生長條件(通常37。C和5。/。C02)下孵育。3.轉(zhuǎn)染當(dāng)天，A管-將2嗎溶于TE緩沖液(pH7-pH8)的DNA(DNA最低濃度為0.1pg^l)用Opti-MEM稀釋，至總體積為100^1?；靹虿⒍虝弘x心幾秒鐘以除去試管頂部的液滴。4.B管-在100^1Opti-MEM中加入6plLipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，并置于室溫5分鐘。5.通過上下吸打5次使A管和B管的內(nèi)容物混勻。6.將樣品在室溫(15-25。C)下孵育15分鐘，以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。7.當(dāng)形成復(fù)合物時，從培養(yǎng)皿中輕輕地吸出生長培養(yǎng)基，并用2mlPBS洗滌細胞一次。8.將O.lml細胞Opti-MEM加入到含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的反應(yīng)管中。通過上下吸打兩次混勻，并立即將全部體積轉(zhuǎn)移到24孔板的一個孔內(nèi)。9.將細胞與轉(zhuǎn)染復(fù)合物在其正常生長條件下孵育6小時。10.通過輕輕地吸取，從細胞中除去含有殘留復(fù)合物的培養(yǎng)基，并用4mlPBS洗滌細胞一次。11.加入新鮮的細胞生長培養(yǎng)基(含有血清和抗生素)。在適當(dāng)?shù)姆跤龝r間后，測定細胞對已轉(zhuǎn)染的基因的表達。12.將細胞按1:10-1:15轉(zhuǎn)到適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基中，在其正常生長條件下維持細胞在選擇培養(yǎng)基中生長，直到出現(xiàn)集落。實施例6:表達促紅細胞生成蛋白的穩(wěn)定CHOKl細胞系的選擇用pcDNA3.l/NESP(天然序列)或者pcDNA3.1/NESP(優(yōu)化序列)轉(zhuǎn)染的瞬時表達CHO細胞用胰蛋白酶消化，并用含lmg/mlGeneticin的選擇培養(yǎng)基稀釋。將該細胞在選擇培養(yǎng)基中孵育14天直到可以分離出集落(圖2A和2B)。在無菌條件下，總共挑選出89個pcDNA3.1NESP(天然序列)集落和91個pcDNA3.1NESP(優(yōu)化序列)集落，并接種到96孔板中，每孔一個集落。為開發(fā)出過量表達促紅細胞生成蛋白的生產(chǎn)細胞系，Avesthagen已選出了89個CHOKl/pcDNA3.1/NESP(天然序列)集落和91個CHO/pcDNA3.1/-NESP(優(yōu)化序列)集落。所有選出的CHOKl細胞集落將通過免疫熒光、蛋白質(zhì)印跡、ELISA和基于細胞的功能測定進行分析，以使產(chǎn)生得自單一細胞的CH0K1生產(chǎn)細胞系，穩(wěn)定表達本發(fā)明的促紅細胞生成蛋白。實施例7:新的促紅細胞生成蛋白的純化生物制藥的質(zhì)量和生物安全性很大程度上取決于用于生產(chǎn)純化產(chǎn)品的提取方法。一方面，下游處理必須確保能從細胞培養(yǎng)過程獲得的培養(yǎng)液或細胞材料中，經(jīng)濟有效地分離出所需產(chǎn)品。然而，另一方面，必須可靠地分離出那些會污染成品的成分。毫無疑問在這些步驟中，要去除那些不同類型的、不應(yīng)存在于成品制劑中的成分。第一組包括介質(zhì)衍生的或工藝過程衍生的雜質(zhì)，可以是蛋白類或非蛋白類(例如脂質(zhì)、消泡劑、抗生素)雜質(zhì)。這一組還包括宿主細胞衍生的雜質(zhì)，例如可能誘導(dǎo)不必要免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)；或者核酸，因為當(dāng)它們摻入到健康人細胞中時，可能潛在地攜帶有害的遺傳信息，所以成為主要關(guān)注方面。第二組由外源因子和污染物組成，并包括病毒、病毒樣顆粒(VLP)、細菌、真菌、支原體等。分離產(chǎn)品的主要方面是去除培養(yǎng)基成分和蛋白雜質(zhì)。針對去除培養(yǎng)基添加物，例如抗生素或細月包毒物質(zhì)(例如geniticine或甲氨纟菜呤)的分離方法，將組合到純化策略中，并且將建立適當(dāng)?shù)臏y試以驗證其效率。通過仔細選擇培養(yǎng)或收獲條件，將可以減少某些雜質(zhì)(例如DNA)。因為實際原因，不可能制造100%純的產(chǎn)品，所以對于成品制劑中可接受的雜質(zhì)濃度水平已有規(guī)定。例如，世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定，源于生物工程的蛋白質(zhì)藥物，每一劑量可接受的最大量DNA將為100pg。因此在純化策略中，可以利用純化步驟中滅活外源物質(zhì)的潛能，或者包括額外的滅活步驟。例如病毒和VLP,可通過使用化學(xué)滅活藥品(例如N-乙酰哌溱、磷酸三正丁基酯)、有機溶劑、離液鹽、極端pH值、輻射等等進行滅活。通過應(yīng)用微波技術(shù)進行溫度處理已顯示出能夠滅活病毒。盡管如上所述，所選擇的針對滅活殘留物的技術(shù)潛力，將進行驗證，并且這種^S正還必須證明，滅活方法不會損害產(chǎn)品的完整性。成熟的人EPO蛋白由165個氨基酸不變序列組成，該蛋白是通過兩步由193個氨基酸前體衍生而來，其N末端27個氨基酸前導(dǎo)序列在該激素分泌前被切除，并且其C末端的精氨酸通過內(nèi)源性羧肽酶的蛋白水解^皮去除。按照管理才幾構(gòu)對于過量表達所需重組蛋白的指導(dǎo)方針，后續(xù)確定無污染的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，可利用一系列步驟對新的促紅細胞生成蛋白進行純化，包括透析-過濾和柱色鐠法(包括陰離子交換和反相基質(zhì))。將回收含有最多高度分枝的聚糖和最高唾液酸含量的部分，以使體內(nèi)活性最大化。實施例8:純化方法的最優(yōu)化為了從穩(wěn)定、高表達細胞系最大化重組NESP產(chǎn)量，根據(jù)以上提及的受推薦的功能/結(jié)合測定，后續(xù)確定可重現(xiàn)的生物活性，將努力使所用純化方法最佳化。純化策略將針對產(chǎn)品的工藝過程經(jīng)濟學(xué)、上市速度、規(guī)才莫性、重復(fù)性和最高純度，以及功能穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)整體性為主要目的。為實現(xiàn)這一目的，將探索由過濾(常規(guī)過濾和切向流過濾)和色鐠兩者組合的方法。所述方法的合格要求和接受標(biāo)準(zhǔn)研究將實施3批。一般選擇性利用糖蛋白的聚糖成分作為捕獲目標(biāo)，用親和色譜進行蛋白純化。最常用的基質(zhì)是間氨基苯基硼酸瓊脂糖和固定化的凝集素、伴刀豆凝集素A瓊脂糖凝膠(ConASepharose)和麥胚凝集素瓊脂糖凝膠(WGA-Sepharose)。當(dāng)ConA基質(zhì)特異性結(jié)合到在C3、C4和C6位置含有未修飾羥基的甘露糖基和葡糖基殘基上時，以上提及的間氛基苯基硼酸基質(zhì)能夠與任一含有1,2-順-二醇基的分子形成臨時性鍵合。WGASepharose基質(zhì)對于該糖蛋白的N-乙酰葡糖胺(NAG)或者N-乙酰神經(jīng)氨酸(NANA或者唾液酸)殘基是高度特異性的。因此，純化過程將包括以下的下游步驟a.初步澄清和濃縮，用常規(guī)過濾方法和切向流過濾方法；b.超濾/透析過濾(基于切向流過濾)；c.色譜步驟I:親和色語，用凝集素/基于間氨基苯基的基質(zhì)。更優(yōu)選基于間氨基苯基配體的親和介質(zhì)；d.色譜步驟II:離子交換色i普(IEX)，用Q-Sepharose陰離子交換劑；e.色譜步驟III:疏水作用色譜(HIC)，用丁基Sepharose;f.去除病毒和過濾除菌；g.去除內(nèi)毒素；h.配制。注釋在色譜步驟中，為得到高純度和最大回收量的產(chǎn)品，單元操作的順序可以變換。在純化過程的每一階段，其結(jié)果將用物理化學(xué)和免疫學(xué)方法評價該蛋白結(jié)構(gòu)和功能的完整性。在另一個優(yōu)選的實施方案中，純化過程將針對從粗培養(yǎng)液中直接捕獲目標(biāo)蛋白，與常規(guī)的填充床;f莫式相比，使用陰離子交換樹脂擴張床吸附模式，并包括下列步驟a.陰離子交換色譜，緊4秦鹽梯度洗脫后，用Q-SepharoseXL作為捕獲步驟。b.疏水作用色譜(HIC),用丁基Sepharose;c.二次陰離子交換色譜，用ResourceQ作為補齊步驟；d.去除病毒和過濾除菌；e.去除內(nèi)毒素；f.配制。更優(yōu)選兩步純化方法，根據(jù)產(chǎn)品回收百分比和純度，使用陰離子交換色譜和HIC作為主要的色譜步驟。然后，將進行上文提及的策略中概述的后續(xù)步驟。注釋根據(jù)選擇性富集具有高糖基含量和高唾液酸基含量的酸性pi的同等型的捕獲效率，在以上概述的兩種策略中可任選將酸洗步驟摻入到陰離子交換捕獲后步驟中，并用于去除無關(guān)的堿性蛋白污染。另夕卜，基于流通的陰離子交換劑，例如硫酸纖維素介質(zhì)(cellufinesulfate)將用于選擇性結(jié)合過程污染物、內(nèi)源性/外源性病毒和柱提取物。實施例9:用生物化學(xué)、免疫學(xué)和物理化學(xué)方法確定目標(biāo)蛋白的特性每一階段總蛋白的回收百分比，將用BCA(bicinchoninicacid,二辛可寧酸，二羧酸二喹啉)方法/Bmdford染料結(jié)合法進行定量。每一純化階段的目標(biāo)蛋白濃度將用高度特異性的和高可靠的基于酶的免疫測定法，例如直接或間接夾心ELISA進行探測。更優(yōu)選，雙抗體夾心ELISA將適合用于評價該目標(biāo)蛋白濃度。因為NESP是一種糖蛋白，將用特異性的染色方法，檢測在還原條件下已電泳的SDS凝膠中的糖蛋白，定量評價糖基化程度。定量和目標(biāo)特異性的蛋白印跡分析將在每一階段后進行。將應(yīng)用反相色譜、等電聚焦和雙向凝膠電泳評價已純化的產(chǎn)物。可用遠紫外圓二色性進行二級結(jié)構(gòu)分析檢測。1將用大小排阻和MALDI-TOF進行分子質(zhì)量和寡聚狀態(tài)研究。該研究還將集中于在pH和溫度變化下該蛋白的穩(wěn)定性。因為NESP是一種高度糖基化蛋白，所以已純化蛋白的糖基化譜可用氣相色譜法(GC)分析取得證明文件。實施例10:新的促紅細胞生成蛋白體外和體內(nèi)活性的測定生物測定檢測新的促紅細胞生成蛋白體外結(jié)合EPO受體，將用以下方法完成(a)竟?fàn)幮越Y(jié)合，用1125標(biāo)記的新的促紅細胞生成蛋白；(b)[Hf-胸苷攝入，用受推薦的人細胞系(例如Ut/EPO)。新的促紅細胞生成蛋白的臨床前體內(nèi)生物活性(正常的血細胞比容恢復(fù)能力)將在受推薦的小鼠細胞系例如BDF1上進行測試。權(quán)利要求1.一種用于制備有體內(nèi)生物活性的促紅細胞生成蛋白的方法，該方法包括以下步驟(a)讓已用選自以下的分離的DNA序列轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的宿主細胞在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)條件下生長(i)SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的DNA序列，(ii)SEQIDNo.3所示的蛋白編碼序列，和(iii)在嚴謹條件下，能與(i)和(ii)所述的DNA序列或者它們的互補鏈雜交的DNA序列；和(b)從中分離出所述促紅細胞生成素產(chǎn)品。2.—種用于制備有體內(nèi)生物活性的促紅細胞生成素產(chǎn)品的方法，該方法包括以下步驟用編碼促紅細胞生成素氨基酸序列為SEQEDNo.3的合成DNA序列轉(zhuǎn)化宿主細胞；從所述宿主細胞或其生長的培養(yǎng)基中分離出所述促紅細胞生成素產(chǎn)品。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞。4.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述宿主細胞優(yōu)選是CHOKl細胞。5.—種用于生產(chǎn)有促使骨髓細胞增加網(wǎng)織紅細胞和紅細胞產(chǎn)生的體內(nèi)生物特性的糖基化促紅細胞生成素多肽的方法，該方法包括以下步驟a)讓含有以下元件的哺乳動物細胞在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)條件下生長人編碼成熟促紅細胞生成素氨基酸序列為SEQIDNo.3的DNA;和b)分離出由所述細胞表達的所述糖基化促紅細胞生成素多肽。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述啟動子DNA是病毒啟動子DNA。7.—種用于制備有體內(nèi)生物活性的促紅細胞生成素產(chǎn)品的方法，該方法包括以下步驟用圖IO或圖11所示的載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細胞；從所述宿主細胞或其生長的培養(yǎng)基中分離出所述促紅細胞生成素產(chǎn)品。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述載體是哺乳動物細胞特異性表達載體，最優(yōu)選的載體如圖10和圖11所示。9.一種藥物組合物，該藥物組合物包含治療有效量的人促紅細胞生成素和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、輔劑或載體，其中所述促紅細胞生成素是從培養(yǎng)物中生長的哺乳動物細胞中純化出來的。10.—種提高和維持哺乳動物血細胞比容的方法，該方法包括給予治療有效量的權(quán)利要求9的藥物組合物中所包含的高度糖基化促紅細胞生成素類似物，其中該類似物比同等摩爾量的重組人促紅細胞生成素給藥次數(shù)少，但得到相當(dāng)?shù)哪繕?biāo)血細胞比容。全文摘要本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)高度糖基化形式(相對于天然EPO中3個N連接的糖基化，總共5個N連接的糖基化)的促紅細胞生成素的重組方法。所增加的糖基化位點將產(chǎn)生更多數(shù)目的糖鏈，以及比人EPO更高的唾液酸含量，這將使得該重組分子的半衰期更長。本發(fā)明還涉及包含編碼高度糖基化形式的促紅細胞生成素的核酸序列表達盒的構(gòu)建，以及在宿主細胞中的穩(wěn)定表達。本發(fā)明還涉及用于純化促紅細胞生成蛋白的優(yōu)化方法。本發(fā)明的重組EPO及其鹽和功能衍生物，可以包含藥物組合物中用于增加血細胞比容的活性成分，因此可用于治療貧血癥以及恢復(fù)患者的健康狀況和生活質(zhì)量。文檔編號C07K14/505GK101228185SQ200680026492公開日2008年7月23日申請日期2006年5月24日優(yōu)先權(quán)日2005年5月24日發(fā)明者V·莫拉瓦拉帕特爾申請人:阿維斯塔金格蘭技術(shù)有限公司