專利名稱：：通過組3lea表達(dá)的植物產(chǎn)量改良的制作方法通過組3LEA表達(dá)的植物產(chǎn)量改良本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，并且涉及相對(duì)于對(duì)照植物增加植物產(chǎn)量的方法。更具體的，本發(fā)明涉及包括調(diào)節(jié)編碼OsLEA3a多肽或其同源物的核酸在植物中的表達(dá)的增加植物產(chǎn)量的方法。本發(fā)明還涉及與產(chǎn)量增加相聯(lián)系的代謝物的組成改變。本發(fā)明還涉及具有被調(diào)節(jié)的編碼OsLEA3a多肽或其同源物的核酸表達(dá)的植物，該植物相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)量。本發(fā)明還提供了可用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體。不斷增長的世界人口和可用于農(nóng)業(yè)的適宜耕種土地面積的縮小，刺激了改善農(nóng)業(yè)效率的研究。作物和園藝改良的常規(guī)手段利用選育技術(shù)來鑒定具有期望特性的植物。然而，這種選育技術(shù)具有若干缺點(diǎn)，即這些技術(shù)一般是勞動(dòng)密集型的，而且產(chǎn)生通常含有異質(zhì)遺傳成分的植物，這并非總是產(chǎn)生自親;^i物傳遞過來的期望性狀。分子生物學(xué)的M已經(jīng)允許人類修飾動(dòng)物和植物的種質(zhì)。植物的遺傳工程需要分離和操作遺傳物質(zhì)(一般是DNA或RNA的形式)，隨后把該遺傳物質(zhì)引入到植物中。該技術(shù)能夠使作物或植物具有多種改良的經(jīng)濟(jì)學(xué)、農(nóng)藝學(xué)或園藝性狀。一種具有特殊經(jīng)濟(jì)利益的性狀是產(chǎn)量，其必涉及特定的作物、面積和/或時(shí)間。產(chǎn)量通常定義為作物的可衡量經(jīng)濟(jì)價(jià)值。這可以從數(shù)量和/或質(zhì)量方面定義。產(chǎn)量直接取決于一些因素，例如，器官的數(shù)量和尺寸，植物結(jié)構(gòu)(例如，枝條的數(shù)量)，種子產(chǎn)量等等。才艮的發(fā)育、營養(yǎng)吸收和脅迫耐受性也是確定產(chǎn)量的重要因素。優(yōu)化上述因素之一可以因此有助于提高作物產(chǎn)量。飼料作物例如紫苜蓿、青貯玉米和干草生產(chǎn)植物生物量。對(duì)于產(chǎn)量的許多代用指標(biāo)(proxy)已被用于谷類作物。其中主要是植物尺寸的估計(jì)。根據(jù)物種和發(fā)育階段，可以用多種方法測量植物尺寸，包括總植物干重、地上部分干重、地上部分鮮重、葉面積、莖體積、植物高度、蓮座直徑、葉長度、根長度、根重量、分蘗數(shù)和葉數(shù)目。許多物種在給定發(fā)育階段的植物的不同部分的尺寸間維持了穩(wěn)定的比例。這些比速增長關(guān)系被用于從上述尺寸測量之一推斷另一個(gè)(例如，Tittonell等人，2005，AgricEcosys&Environ105:213)。在發(fā)育早期階段的植物尺寸一般與發(fā)育晚期階段的植物尺寸相關(guān)。有更大葉面積的大g物一般可以比小抹植物吸收更多的光和二氧化碳，因此在相同的時(shí)期可能獲得更多重量(Fasoula&Tollenaar2005Maydica50:39)。這就是除了微環(huán)境或遺傳優(yōu)勢(shì)潛在的延續(xù)外，植物需要在一開始就獲得更大的尺寸。植物尺寸和生長速率有很強(qiáng)的遺傳成分(例如，terSteege等人，2005PlantPhysiology139:1078)，因此，對(duì)于一定范圍的不同基因型，在一種環(huán)境條件下的植物尺寸可能與在另一個(gè)環(huán)境條件下的尺寸相關(guān)(Hittalmani等人，2003TheoreticalAppliedGenetics107:679)。因此，在本領(lǐng)域中使用標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境代替作物在野外的不同位置和時(shí)間遇到的不同的和動(dòng)態(tài)的環(huán)境。收獲指數(shù)，即種子產(chǎn)量和地上部分干重的比例，在多種環(huán)境條件下是相對(duì)穩(wěn)定的，而且通?？梢垣@得植物尺寸和谷類產(chǎn)量間的強(qiáng)烈相關(guān)性(例如，Rebetzke等人，2002CropScience42:739)。這些過程本質(zhì)上是相關(guān)聯(lián)的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)谷類生物量取決于植物葉和莖的現(xiàn)有或儲(chǔ)存的光合成生產(chǎn)力(Gardener等人，1985PhysiologyofCropPlants.IowaStateUniversityPress,第68-73頁)。因此，即使在發(fā)育的早期階段，選擇植物尺寸已經(jīng)作為將來潛在產(chǎn)量的指示(例如，Tittonell等人，2005AgricEcosys&Environ105:213)。當(dāng)檢測遺傳差異對(duì)脅迫耐受性的影響時(shí)，與野外相比，溫室或植物生長室環(huán)境的內(nèi)在優(yōu)勢(shì)是將土壤性質(zhì)、溫度、水和營養(yǎng)物可利用性以及光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化的能力。然而，由于缺少風(fēng)或昆蟲導(dǎo)致授粉不足，或缺乏空間供成熟的根或抹冠生長，造成對(duì)產(chǎn)量的人為限制，這可以限制上述受控環(huán)境在檢查產(chǎn)量差異中的應(yīng)用。因此，在生長室或溫室的標(biāo)準(zhǔn)化條件下測量發(fā)育早期的植物尺寸，是提供指示潛在遺傳產(chǎn)量優(yōu)勢(shì)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐。種子產(chǎn)量是特別重要的性狀，因?yàn)樵S多植物種子對(duì)人和動(dòng)物的營養(yǎng)是重要的。通過直接消費(fèi)種子自身，或通過消費(fèi)用加工種子飼養(yǎng)的肉制品，作物例如玉米、稻、小麥、油菜籽和大豆，占人的總卡路里4I^的一半以上。它們也是糖、油和在工業(yè)加工中使用的多種代謝物的來源。種子包含胚(新生枝條和根的來源)和胚乳(在萌發(fā)和幼苗早期生長中胚生長的營養(yǎng)物來源)。種子的發(fā)育涉及許多基因，并需要從根、葉和莖中將代謝物轉(zhuǎn)移到生長中的種子。特別是胚乳吸收糖類、油和蛋白質(zhì)的代謝前體，并將其合成為儲(chǔ)存大分子填充到谷粒中。增加植物產(chǎn)量的能力在例如農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，包括在生產(chǎn)觀賞植物、樹木栽培、園藝和林業(yè)中，具有多種應(yīng)用。在生產(chǎn)用于生物反應(yīng)器(用于生物4支術(shù)生產(chǎn)物質(zhì)例如藥物、抗體或疫苗、或生物轉(zhuǎn)化有機(jī)廢物)的藻類以及其它同類領(lǐng)域中增加產(chǎn)量也是有用的。OsLEA3a是被分類到LEA蛋白質(zhì)3a組的稻蛋白質(zhì)((Wise&Tunnacliffe，TrendsPlantSci.9，13-17，2004)。LEA蛋白質(zhì)(胚胎發(fā)育后期富集蛋白)在高等植物種子胚的胚胎發(fā)育后期的不同階段和脫水脅迫條件下表達(dá)。也可以被脫落酸誘導(dǎo)。通常，這些蛋白質(zhì)的功能是未知的。最近的分類將LEA蛋白質(zhì)劃分為7個(gè)組；其中若干組特征在于典型的序列基序，計(jì)算機(jī)分析能夠?qū)ζ涔δ茴A(yù)測(Wise&Tunnacliffe,2004)。組3Lea蛋白質(zhì)包括LEA超家族2和5，特征是存在ll-mer^J^^序，該基序可以大致定義如下位置l、2、5和9是疏水殘基，位置3、7和11是帶負(fù)電的或酰胺殘基，位置6和8是帶正電的殘基，位置4和10可以存在任意M酸(Wise&Tunnacliffe,2004,DureIII，L.，ProteinandPeptideLetters8，115-122,2001)。推測組3LEA蛋白質(zhì)具有分子伴侶的功能，在干燥耐受中發(fā)揮作用(Goyal等人，Biochem.J.388，151-157，2005)。由于水脅迫條件下誘導(dǎo)植物中的LEA蛋白質(zhì)，假設(shè)LEA蛋白質(zhì)可用于使植物更抗鹽和干旱。Xu等人(PlantPhysiol.110，249-257，1996)證實(shí)，轉(zhuǎn)化了大麥LEA3a的稻更耐受缺水和鹽脅迫，Rohila等人(PlantSci.163，525-532，2002)描述了組成型或脅迫誘導(dǎo)型表達(dá)大麥LEA3a的轉(zhuǎn)基因印度香米(Basmatirice),其表現(xiàn)出增加的干旱和高鹽度耐受。類似的，轉(zhuǎn)化了組成型啟動(dòng)子控制的大麥LEA3a的小麥比對(duì)照植物對(duì)干燥有更高的抗性(Bahieldin等人，Physiol.Plant.123，421-427,2005)。然而，上述研究也顯示，當(dāng)植物生長在非脅迫條件下時(shí)，與對(duì)照植物相比沒有產(chǎn)量增長。W097/13843描述了使用大麥HVA1增加對(duì)干燥和鹽脅迫的抗性，但未表明表達(dá)大麥HVA1的植物在非脅迫條件下具有改良的生長性質(zhì)。現(xiàn)在令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照植物相比，調(diào)節(jié)編碼稻LEA3a多肽(OsLEA3a)或其同源物的核酸在植物中的表達(dá)使植物具有增加的產(chǎn)量。當(dāng)植物栽培在沒有脅迫的條件(非脅迫條件)下時(shí)，也令人驚奇的發(fā)現(xiàn)了這一產(chǎn)量的增加。優(yōu)選的，OsLEA3a的同源物是植物來源的，更優(yōu)選的，OsLEA3a的同源物源自單子葉植物，條件是OsLEA3a的同源物不是SEQIDNO:22(大麥(i^iYifeM柳vw/gfl^))。最優(yōu)選的，該同源物源自稻(Ozjz"根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了增加植物產(chǎn)量的方法，包括調(diào)節(jié)編碼OsLEA3a多肽或其同源物的核酸在植物中的表達(dá)。有利的，實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法，得到了相對(duì)于對(duì)照植物，具有增加產(chǎn)量，特別是種子產(chǎn)量的植物。對(duì)照植物的選擇是實(shí)驗(yàn)沒計(jì)的常規(guī)部分，可以包括對(duì)應(yīng)的野生型植物或?qū)?yīng)的沒有目的基因的植物。對(duì)照植物通常是待比較植物的同種植物，甚至是相同品種。對(duì)照植物還可以是待比較植物的失效合子。失效合子是由于分離而缺失轉(zhuǎn)基因的個(gè)體。本文中使用的"對(duì)照植物"不僅指全躲物，而且還指植物的部分，包括種子和種子的部分。"參照"、"參照植物"、"對(duì)照"、"對(duì)照植物"、"野生型"或"野生型植物"特別是細(xì)胞、組織、器官、植物或其部分，它們不是根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的。相應(yīng)的，術(shù)語"野生型"、"對(duì)照，，或"參照"是可互換的，并且可以是細(xì)胞或植物的一部分例如細(xì)胞器或組織，或者植物，它們都沒有根據(jù)發(fā)明在本文中描述的方法進(jìn)行修飾或處理。因此，用作野生型、對(duì)照或參照的細(xì)胞或植物的部分(例如細(xì)胞器)或植物，盡可能的對(duì)應(yīng)于其細(xì)胞、植物或其部分，在除了本發(fā)明過程的結(jié)果之外的其它一切性質(zhì)上，盡可能的與發(fā)明的主題一致。因此，對(duì)野生型、對(duì)照或參照進(jìn)行相同的或盡可能相同的處理，只有不影響被檢測性質(zhì)的質(zhì)量的條件或性質(zhì)才可以有差異。這意味著換句話說，野生型是指(l)植物，其帶有基因或等位基因的未改變或未調(diào)節(jié)的形式，或(2)初始的材料/植物，從中衍生出用本發(fā)明的過程或方法生產(chǎn)的植物。優(yōu)選的，在野生型植物和用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的植物之間進(jìn)行的任何比較都是在可比擬的條件下進(jìn)行的。術(shù)語"可比擬的條件"指所有的條件例如，培養(yǎng)或生長條件、分析條件(例如緩沖液組成、溫度、底物、病原體菌林、濃度等等)在進(jìn)行比較的實(shí)驗(yàn)之間都保持一致。"參照"、"對(duì)照"或"野生型"優(yōu)選的是沒有根據(jù)發(fā)明在本文中描述的過程調(diào)節(jié)、修飾或處理的對(duì)象，例如細(xì)胞器、細(xì)胞、組織、植物，并且在其它任何性質(zhì)上盡可能與本發(fā)明的主題相似。參照、對(duì)照或野生型在其基因組、轉(zhuǎn)錄物組、蛋白質(zhì)組或代謝物組中與本發(fā)明的主題盡可能的相似。優(yōu)選的，術(shù)語"參照-"、"對(duì)照-"或"野生型-"的-細(xì)胞器、-細(xì)胞、-組織或植物，是指這樣的細(xì)胞器、細(xì)胞、組織，其與本發(fā)明的細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或植物或其部分幾乎是遺傳同一性的，優(yōu)選的95%,更優(yōu)選的98%，甚至更優(yōu)選的99.00%,特別的99.10%、99.30%、99.50%、99.70%、99.90%、99.99%、99.999%或更多。最優(yōu)選的"參照"、"對(duì)照"或"野生型"是這樣的對(duì)象(例如細(xì)胞器、細(xì)胞、組織、植物)，除了根據(jù)本發(fā)明的方法改變、調(diào)節(jié)或修飾的核酸分子或其編碼的基因產(chǎn)物之外，該對(duì)象與根據(jù)本發(fā)明的方法使用的植物、細(xì)胞、細(xì)胞器是遺傳同一性的。術(shù)語"表達(dá)"或"基因表達(dá)"意指由于一個(gè)或多個(gè)特定的基因轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致的表型性狀的出現(xiàn)。術(shù)語"表達(dá)"或"基因表達(dá)"特別指一個(gè)或多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄成結(jié)構(gòu)RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，后者隨后翻譯成蛋白質(zhì)。該過程包括DNA的轉(zhuǎn)錄，加工獲得的mRNA產(chǎn)物，及其翻譯成活性蛋白質(zhì)。術(shù)語"調(diào)節(jié)"意指涉及表達(dá)或基因表達(dá)的過程，其中與對(duì)照植物相比，所述基因表達(dá)改變了表達(dá)水平，優(yōu)選的表達(dá)水平是增加的。初始的、未調(diào)節(jié)的表達(dá)可以是任何種類的結(jié)構(gòu)RNA(rRNA、tRNA)或具有后續(xù)翻譯的mRNA的表達(dá)。術(shù)語"調(diào)節(jié)活性"應(yīng)該意指發(fā)明的核酸序列或編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)的任何改變，其導(dǎo)致增加的產(chǎn)量和/或增加的植物生長。術(shù)語"產(chǎn)量"一般意指具有經(jīng)^值的可測量產(chǎn)出，其必然與特定的作物、面積和時(shí)間段相關(guān)。個(gè)別植物部分對(duì)產(chǎn)量的直接貢獻(xiàn)基于其數(shù)量、尺寸和/或重量，但是實(shí)際產(chǎn)量是每英畝作物一年的產(chǎn)量，其由總產(chǎn)量(包括收獲的和估計(jì)的產(chǎn)量)除以種植的英畝數(shù)確定。術(shù)語"增加"、"改進(jìn)"或"改良"是可互換的，并且在本申請(qǐng)中應(yīng)該意指，與本文中定義的野生型植物相比，至少5%、6%、7%、8%、9%或10%,優(yōu)選的至少15%或20%,更優(yōu)選的25%、30%、35%或40%的更高的產(chǎn)量和/或生長。與對(duì)照、參照或野生型相比，涉及多肽的活性的增加在細(xì)胞、組織、細(xì)胞器、器官或生物體或其部分中優(yōu)選的共計(jì)至少5%，優(yōu)選的至少10%或至少15%，特別優(yōu)選的至少20%、25%、30%或更多，非常特別優(yōu)選的至少40%、50%或60%，最優(yōu)選的至少70%或更多。本文定義的術(shù)語"增加的產(chǎn)量"意指在植物的一個(gè)或多個(gè)部分增加的生物量(重量)，可以包括地上(可收獲)部分和/或(可收獲的)地下部分。特別的，該可收獲的部分是種子，相對(duì)于對(duì)照植物的種子產(chǎn)量，實(shí)施本發(fā)明的方法獲得具有增加的種子產(chǎn)量的植物。增加的種子產(chǎn)量可以表現(xiàn)為以下一個(gè)或多個(gè)方面a)種子生物量(總種子重量)的增加，其可以基于單個(gè)種子和/或每抹植物和/或每公項(xiàng)或英畝；b)增加的每員物的花的數(shù)目；c)增加的(飽滿)種子數(shù)；d)增加的種子飽滿率(用飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)的比例來表示)；e)增加的收獲指數(shù)，其表示為可收獲的部分如種子的產(chǎn)量，除以總生物量的比例；和f)增加的千粒重(TKW)，其根據(jù)計(jì)數(shù)的飽滿種子數(shù)目及其總重量推算。增加的TKW可源于增加的種子尺寸和/或種子重量，也可源于胚胎和/或胚乳尺寸的增加。種子產(chǎn)量的增加還可以表示為種子尺寸和/或種子體積的增加，它還影響種子的組成(包括油、蛋白質(zhì)和糖類的總含量和組成)。此外，種子產(chǎn)量的增加還可以表示為種子面積和/或種子長度和/或種子寬度和/或種子周長的增加。增加的產(chǎn)量還可以產(chǎn)生改變的構(gòu)造，或作為改變的構(gòu)造的結(jié)果發(fā)生。以谷類為例，產(chǎn)量增加可以表現(xiàn)為下列一種或多種每公項(xiàng)或英畝植物數(shù)量增加、每林植物穗數(shù)量的增加、畦數(shù)、每畦籽粒(kernel)數(shù)、粒重、千粒重、穗的長jL/直徑、種子飽滿率的增加(其是飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)并乘以IOO)等。以稻為例，產(chǎn)量增加可以表現(xiàn)為下列一種或多種的增加每公項(xiàng)或英畝植物數(shù)量、每林植物的圓錐花序數(shù)量、每個(gè)圓錐花序的小穗數(shù)量、每個(gè)圓錐花序花(小花)的數(shù)量(其表示為飽滿種子數(shù)占初級(jí)圓錐花序數(shù)的比例)，種子飽滿率的增加(其是飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)并乘以100)、千粒重的增加等。產(chǎn)量的增加還可產(chǎn)生改變的構(gòu)造或可以作為改變的構(gòu)造的結(jié)果發(fā)生。根據(jù)優(yōu)選的特征，實(shí)施本發(fā)明的方法獲得具有增加的產(chǎn)量，特別是增加的種子產(chǎn)量的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明提供了增加植物產(chǎn)量的方法，該方法包括調(diào)節(jié)編碼OsLEA3a多肽或其同源物的核酸在植物中的表達(dá)。由于根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的產(chǎn)量，因此，相對(duì)于在其生活周期對(duì)應(yīng)階段的對(duì)照植物的生長速度，這些植物很可能表現(xiàn)出增加的生長速度(至少是在其生活周期的一部分)。具有增加的生長速度的植物可以具有更短的生活周期。植物的生活周期意指從干的成熟種子生長到植物產(chǎn)生干的成熟種子(類似于起始物質(zhì))的階段所需的時(shí)間。此生活周期可以受到如早期活力、生長速度、開花時(shí)間和種子成熟速度等因素的影響。生長速度的增加可以發(fā)生在植物生活周期的一個(gè)或多個(gè)階段或者基本遍布整個(gè)植物生活周期期間。在植物生活周期的早期階段增加的生長速度反映了增強(qiáng)的活力。生長速度的增加可以改變植物的收獲周期，這使得植物可以比可能的情形更晚4番種和/或更早收獲(可得到具有提前的開花時(shí)間的類似的效果)。如果生長速度充分增加，可以允許更多播種相同植物物種的種子(例如在播種和收獲稻植物后，接著播種和收獲更多的稻植物，所有這些都在一個(gè)常規(guī)生長期內(nèi))。類似的，如果生長速度充分增加，可以允許更多播種不同植物物種的種子(例如在播種和收獲稻植物后，例如接著播種和任選收獲大豆、馬鈴薯或任何其他適當(dāng)?shù)闹参?。在一些作物植物的情形下，從同一根狀莖收獲多次也是可能的。改變植物的收獲周期可以使得每英畝每年生物量的產(chǎn)出增加(由于任何特定植物可以生長和收獲次數(shù)(指在一年中)的增加)。生長速度的增加還使得轉(zhuǎn)基因植物可以比它們的野生型對(duì)應(yīng)物在更廣的地域栽培，這是因?yàn)樯L作物的區(qū)域性限制通常決定于種植時(shí)(初期)或收獲時(shí)(晚期)的不利環(huán)境條件。如果收獲周期縮短，那么可以避免此類不利條件?？梢酝ㄟ^生長曲線，得到多個(gè)M來確定生長速度，此類參數(shù)可以是T-Mid(植物達(dá)到其最大尺寸的50%時(shí)所用的時(shí)間)以及T-90(植物達(dá)到其最大尺寸的90%時(shí)所用的時(shí)間)等。在植物的一個(gè)或多個(gè)部分具有增加的生長速度的才直物表現(xiàn)出改變的新陳代謝(由改變的代謝物水平所反映)。改變的代謝物水平與轉(zhuǎn)基因的存在相關(guān)。因此，代謝型可用作診斷工具來表征或鑒定具有增加產(chǎn)量的植物，預(yù)測產(chǎn)量增加所涉及的新蛋白質(zhì)，或鑒定產(chǎn)量增加所涉及的途徑。術(shù)語"代謝物"指中間物，優(yōu)選的指那些在植物或植物細(xì)胞的合成代謝或分解代謝中產(chǎn)生的低分子量的物質(zhì)，換言之，在代謝中產(chǎn)生或消耗的物質(zhì)，例如氨基酸。術(shù)語代謝物的"改良的組成"指這些代謝物濃度的所需改變。根據(jù)代謝物的類型，濃度的改變可以是增加或降低的。優(yōu)選的，代謝物濃JL/水平的改變是相對(duì)于合適的對(duì)照植物測量的。本發(fā)明中優(yōu)選的代謝物包括來自例如M酸代謝、類胡蘿卜素代謝、輔因子代謝、脂肪酸代謝、有機(jī)酸代謝、酚類(phenolics)代謝、植物激素代謝、植物固醇代謝、糖代謝、生育酚和相關(guān)化合物代謝、蠟化合物代謝、脂類代謝的代謝物。不同代謝物的水平一般在某些范圍內(nèi)變動(dòng)(見例如實(shí)施例6中的數(shù)據(jù))，一個(gè)或多個(gè)代謝物水平的改變可用于定義代謝型。該代謝型可以包括關(guān)于特定代謝物和/或代謝物類型(例如氨基酸代謝、類胡蘿卜素代謝、輔因子代謝、脂肪酸代謝、有機(jī)酸代謝、酚類代謝、植物激素代謝、植物固醇代謝、糖代謝、生育酚和相關(guān)化合物代謝、蠟化合物代謝、脂類代謝)的改變水平的數(shù)據(jù)。由于目的基因(如LEA3a)被調(diào)節(jié)的表達(dá)，基本上可以在全抹植物或在某些植物部分、器官、組織或細(xì)胞中改變代謝物的水平。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，改變了種子中的代謝物水平。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的特征，與對(duì)照植物相比，實(shí)施本發(fā)明的方法使植物具有了增加的生長速度或增加的產(chǎn)量。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了在植物中增加產(chǎn)量和/或生長速度的方法，該方法包括調(diào)節(jié)編碼OsLEA3a多肽或其同源物的核酸在植物中的表達(dá)。與對(duì)照植物相比，無論植物是否在非脅迫條件下或植物是否接觸多種脅迫，產(chǎn)生產(chǎn)量和/或生長速度的增加。特別觀察到當(dāng)植物處于非脅迫條件下時(shí)，產(chǎn)量和/或生長速度的增加。植物一般通過生長更加緩慢來應(yīng)答所接觸的脅迫。在嚴(yán)重的脅迫條件下，植物甚至完全停止生長。另一方面，本文將中等脅迫定義為植物所接觸的不引起植物完全停止生長且沒有能力恢復(fù)生長的任何脅迫。與非脅迫條件下的對(duì)照植物相比，本發(fā)明所指的中等脅迫導(dǎo)致被脅迫植物的生長降低少于40%、35%或30%，優(yōu)選的少于25%、20%或15%,更優(yōu)選的少于14%、13%、12%、11%或10%或更少。由于農(nóng)業(yè)實(shí)踐(灌溉、施肥、殺蟲劑處理)的發(fā)展，在栽培的作物植物中通常不會(huì)遇到嚴(yán)重脅迫。因而，中等脅迫誘導(dǎo)的受損生長通常是農(nóng)業(yè)所不希望的特征。中等脅迫是植物所接觸的典型脅迫。這些脅迫可以是植物所接觸的曰常生物和/或非生物(環(huán)境)脅迫。典型的非生物或環(huán)境脅迫包括由反常的熱或寒冷/凍結(jié)溫度引起的溫度脅迫；鹽脅迫；水脅迫(干旱或過量的水)?；瘜W(xué)制劑也可以引起非生物脅迫。生物脅迫通常是那些由病原體，如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲引起的脅迫。特別的，本發(fā)明的方法可以在非脅迫條件下實(shí)施，使植物相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)量。根據(jù)Wang等人的報(bào)道(Planta(2003)218:1-14),非生物脅迫產(chǎn)生一系列形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)和分子上的改變，負(fù)面的影響植物生長和生產(chǎn)力。已知干旱、鹽度、極端溫度和氧脅迫是相互聯(lián)系的，并可以通過相似的機(jī)制誘導(dǎo)生長和細(xì)胞損傷。Rabbani等人(PlantPhysiol(2003)133:1755-1767)描述了在干旱脅迫和高鹽度脅迫間特別高度的"交叉對(duì)話"。例如，干燥和/或鹽化作用主要表現(xiàn)為滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和離子分布的破壞。氧脅迫通常伴隨高溫或低溫、鹽度或干旱脅迫，可以導(dǎo)致功能蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)變性。因此，這些不同的環(huán)境脅迫通常激活相似的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑和細(xì)胞應(yīng)答，例如產(chǎn)生脅迫蛋白質(zhì)、上調(diào)抗氧化劑、積累相容的溶質(zhì)和阻止生長。本文中使用的術(shù)語"非脅迫"條件是那些對(duì)植物不產(chǎn)生脅迫(例如上述脅迫)的環(huán)境條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知給定區(qū)域的正常土壤M和氣候M。在任何植物中可以有利地改良上述生長特性。本文所用的術(shù)語"植物"包括整林植物、植物的祖代和后代、植物細(xì)胞以及植物部分，包括種子、枝條、莖、葉、根(包括塊莖)、花，以及組織和器官，其中前述每種包括目的基因/核酸。術(shù)語"植物"還包括懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚胎、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、花粉和小孢子，同樣的，其中每種前述包含目的基因/核酸。尤其可用于本發(fā)明方法中的植物包括屬于植物界(K/n'^p/朋toe)超家族的所有植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，包括選自如下物種的飼料或飼料豆科植物、觀賞植物、糧食作物、喬木或灌木槭樹屬物種(Jc^spp.)、稱猴杉匕屬物種(v4"Zw,V/!Vispp.)、秋蔡屬物種(J6e/附仍cA"sspp.)、冰草屬物種(々r，/Ymspp.)、蔥芽屬物種(j///m/wspp.)、莧屬物種(J附ar""狄MS1spp.)、鳳梨(Jwo"asco附osMS)、番篇枝屬物種(/i""o鹿spp.)、芽菜(々,m附^r"veo/e"s)、擬南齊(^4r"6/flto戸's1汰a//a"a)、落花生屬物種(y4rflc/r/sspp.)、木波羅屬物種(/1,toca尸/7W51spp.)、石刁柏(Jspamgws1/r/sp論)、巴西栗(jBe"/ro〃dViejcce/sefl)、甜菜(5由vw/gaWs)、蕓莒屬物種(5/msicaspp.)、C"f/fl6"/"nViosfl、大葉茶(CVi附e〃/"siwe"s/s)、美人蕉(Ca""fl,W/cfl)、辣椒屬物種(C"/w/c"附spp.)、金色苫草(Carex:e/W")、番木瓜(CaWc"/7"/7fl^fl)、大果假虎刺(CaW5W附ttcroc"r/m)、山核杉&屬物種(Owjaspp.)、紅花(Ow說fl附ms1f/"cto/7'ws)、栗屬物種(Ca對(duì)aweaspp.)、苦苣(CVc^Ww附e"<//Wfl)、掉屬物種(OMAItt附O附M附S/7/7.)、西瓜(OwZ/附/fl冊(cè),MS1)、甜橘屬物種(O附spp.)、椰子屬物種(Oc仍spp.)、咖啡屬物種(0;5%"spp.)、芋(CV/oaisZaesrw/e"似)、Cb/"spp.、完姿(0,/"mc^m附虛/vm附)、棒屬物種(CVwj/ws1spp.)、山植屬物種(O她eg"s1spp.)、番紅花(Ow附5W,/VW51)、南瓜屬物種(C"cw6/似spp.)、香瓜屬物種(Cwc"附/sspp.)、菜薊屬物種(Q^i"mSPP.)、胡蘿卜(""woisowvto)、山馬蟥屬物種(Des附oflf/w附spp.)、龍目艮(D/附ocw/7WS/owg"")、著賴屬物種(DiVwcore"spp.)、神樹屬物種(D/os/7jr仍spp.)、稗屬物種(Jc/r,Vioc/r/oflspp.)、糝子(^7ewsiViecomowia)、批把(JEW》6o^);"乂"/^rt/ca)、紅^f子果(JE"wgew/"w附y(tǒng)/om)、蕎麥屬物種(Fago/y;rM/wSPP')、山毛櫸屬物種,gwsspp.)、無花果(F/c"sc肌，c")、金桔屬物種CFoW"we〃fl卿.)、草莓屬物種(尸nigfl"Vispp.)、銀杏((7/"紐"http://<6")、大豆屬物種(G/戶."espp.)、陸地棉(G^卿,.w附A/簡似附)、向日葵屬物種(//^//fl"幼"sspp.)、萱草(/^附^001〃&/"/^)、木槿屬物種(/T幼/sc附spp.)、大麥屬物種(Honfe"附Spp.)、甘薯(7/w附M"、核杉&屬物種(/Mg/tfrtSspp.)、萬苣虛/一、山黧豆屬物種(1fl,/yr"sspp.)、兵豆cw//m"r/y)、亞麻(Zi"w附wsitofci'附w附)，篇枝(丄/fc/r/c/r/"ew5is)、百務(wù)M艮屬物種(丄O,MSSpp.)、棱角絲瓜(￡"#""CM,""gw/")、羽扇豆屬物種(丄M/7《Vl附spp.)、丄wz"/flsy/vttrica、石更皮豆屬物種(Macn印/o附flspp.)、蘋果屬物種(Ma/msspp.)、西印度櫻書&(Ma/p/gA/"e附"尸g/fi"to)、曼密蘋果(Mn附附ea"附m.oi聽)、芒果(Afflwgiy^m/"^/Za^、木薯屬物種fMwi狄Wspp.)、人心果(Ma"/汰"mz""似)、紫苜蓿(Medicagosativa)、草木樨屬物種(臉腸加spp.)、薄荷屬物種(M^ir/^spp.)、苦瓜屬物種(Mo附OAv/,'c"spp.)、黑桑(M(/"wsw/gm)、芭蕉屬物種(M附"spp.)、煙草屬物種(A7cori"ww附spp.)、木犀欖屬物種(0/easpp.)、仙人掌屬物種(O戸""."spp.)、O簡幼，sspp.、矛舀屬物種(Ofjz"spp.)、稷(jPfl"/cw附附脂cew附)、雞蛋果(J^siyZor"^/"http://51)、歐防風(fēng)(尸fl5t/艦c"sarivfl)、鱘梨屬物種(尸e/w"spp.)、香芽(7>",05^//聰附C/"/s/7w附)、菜豆屬物種(/V^seo/附spp.)、刺葵屬物種(P/^ew/xspp.)、酸漿屬物種spp.)、；t^屬物種(尸/w船spp.)、阿月渾子(尸&似c/flvera)、豌豆屬物種CP&l/附Spp.)、早熟禾屬物種(戶0"Spp.)、楊屬物種(尸0/m/MSSpp.)、牧豆樹屬物種(尸,卿/7/sspp.)、李屬物種(戶謂附spp.)、番石榴屬物種(PwVZ/鵬spp.)、石榴(戶""/c"gmwa似附)、西洋梨(i^,附co附附im/s)、櫟屬物種(2"e/TM51spp.)、蘿卜(及fl/A"wwss^/vms)、波葉大黃(jR/ie"附r/t"6flrAflrrw附)、茶簾子屬物種(i幼MSpp.)、懸鉤子屬物種(及"6"SSpp.)、甘蔗屬物種(S"C^"I"M附spp.)、接骨木屬物種(spp.)、黑麥(&oi/e"艦/e)、胡麻屬物種(Sesa附w附spp.)、白芥屬物種(5/"/&sp,)、癡屬物種OSo/fl""附spp.)、兩色蜀黍(5WgAM附A/co/w)、菠菜屬物種(iS^/w""Vispp.)、蒲杉b屬物種(5^Jg/w附spp.)、酸豆(ria附af7'w^/w"W/cfl)、可可樹(77reo6/wiflojoio)、車軸草屬物種(7>'7^//"附spp.)、7WAVwec"/en'附/7fli//、小麥屬物種(7Wricw附spp.)、小旱金蓮(r尸o/wo/"柳/imVim51)、金蓮花(7W/7"eo/"附附fl乂ws)、越桔屬物種(K"cc/"^i附spp.)、野豌豆屬物種(K/"Vispp.)、虹豆屬物種(K/g"fl卿.)、香堇(K/o/"o^mto)、葡萄屬物種(W&spp.)、玉蜀黍(Z^i附fl")、北美洲野生稽(Z&fl"/"/7"/w欲/51)、棗屬物種(Z/^p/r"51spp.)等o其它有利的植物選自群組包括紫菀科(Asteraceae)，例如向日葵屬〔^Te//"w^ws)、萬壽菊屬(r"gete力，i口物種向日葵(^^//<1"^"5flwww"s)[向日葵、香葉萬壽菊(ragefes/""v/fl)、萬壽菊(r"gcese""fl)或細(xì)葉萬壽菊([金盞花j;十字花科(5nm/ctfce—例如蕓莒屬(5r鵬/ca)、擬南芥屬(Jr"&Vto/w&)，如物種歐洲油菜(丑m^/c"wfl/7附)、蕪青物種r"/7flspp)[油菜、歐洲油菜(oilseedrape)、蕪青或擬南芥；豆科(F"6fircefle)例如大豆屬((7(vc/"e)，如物種大豆(G/yc/"ewfl^)、大豆(SojaHispida)、大豆(Sojamax)[大豆；亞麻科(丄/"""fl^)例:i。亞麻屬(丄Z"w附)，:i口物種亞麻(丄/"M/fi船ZtoriswVww附)[亞麻、亞麻籽；禾本科CPo"c^ie)，例如大麥屬(^onsfew/w)、黑麥屬(^ecfl/e)、燕麥屬(v4vew")、高粱屬(Sorg/iw附)、稻屬(Of^")、玉蜀黍?qū)?Zefl)、小麥屬(7Wft'cwm)，如物種大麥(好o^few附v"/gttre)[大麥、黑麥(iSmi/ece,e"/e)[黑麥]、燕麥(y4ve冊(cè)sfl,/vfl)、野燕麥(^4vewfl/"/wa)、t匕贊燕麥(y4vewa6j^fl",/w)、^4ve"/ii/av"尸.5^iftVa、雜種燕麥(jvewff/^;&/甴)[燕麥，兩色蜀黍(Swg/iM附[高粱、粟l、稻(Go^iMrivfl)、闊葉稻(0o^"/"ftyi/Z")[稻]、玉蜀黍[包谷、玉米、普通小麥(7WY/cm附aeWv"附)、硬粒小麥(7Wric"附fifw,w附)、圓柱小麥(7>妝《附似/^V/m附)、7Wric"附/^6miM附，馬卡小麥(7W力.c"附附flc/ra)、普通小麥(7V/ftVw附5^rivw附)或普通小麥(7Wricw附viz/g"re)[小麥、面包小麥、普通小麥；癡科(5WflWflce"e)，例:ft口癡屬(iSo/"ww附)、番癡屬(Z^co/e尸s/cow)，i口物種馬鈴薯(5W"""附,"6mwM附)[土豆、番癡(丄j;a/7em.co"esr"/ew似附)、番癡(Z^co/em.co"(vco/;w'cw附)、梨形番癡(Z^co/;mico"/7"ybr附e)、紅薪(5Wtf簡附,7|峰"/<//1附)或番蒜(5^/"聰/11/jco/;em'c"附)[西紅柿.根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，植物是作物植物。作物植物的實(shí)例包括大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、馬鈴薯和煙草。更優(yōu)選的，植物是單子葉植物。單子葉植物的實(shí)例包括甘蔗。更優(yōu)選的植物是谷類。谷類的實(shí)例包括稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱和燕麥。本文所定義的術(shù)語"OsLEA3a或其同源物"指例如SEQIDNO:2代表的稻LEA3a多肽，和屬于LEA蛋白質(zhì)組3的蛋白質(zhì)，其具有對(duì)應(yīng)于Pfam登錄號(hào)PF02987或InterPro登錄號(hào)IPR004238的2個(gè)LEA—4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，并包含大致定義如下的ll-mer氨基酸序列基序位置1、2、5和9是疏水殘基，位置3、7和11是帶負(fù)電的或酰胺殘基，位置6和8是帶正電的殘基，位置4和10可以存在任意M酸；在該基序內(nèi)可以出現(xiàn)一處錯(cuò)配(DureIII，L.，ProteinandPeptideLetters8，115-122，2001)。疏水^J^酸殘基組由A、C、F、G、I、L、M、T、V、W、S和Y組成。帶負(fù)電的氨基酸是D或E，酰胺殘基是Q和N。帶正電的tt酸是H、K和R。該基序中的序列保守性不是絕對(duì)的，可以存在1或2處錯(cuò)配(圖3)。優(yōu)選的，ll-mer氨基酸序列基序(下文命名為共有記號(hào)(consensussignature))對(duì)應(yīng)序列還優(yōu)選的共有記號(hào)序列對(duì)應(yīng)于序列T(S/T/A/K)(Q/E/D)A(A/T)(R/K)(D/Q/E)(K/R)A(A/G/Y)E更優(yōu)選的共有記號(hào)對(duì)應(yīng)于序列T(S/A/K)(Q/D)A(A/T)(R/K)(D/E)KA(A/Y)E，最優(yōu)選的共有記號(hào)是T(S/A)QAARDKAAE。術(shù)語"結(jié)構(gòu)域"指沿著進(jìn)化相關(guān)蛋白質(zhì)序列的比對(duì)，在特定位置保守的一組氨基酸。盡管其它位置的M酸在同源物之間可以變動(dòng)，在特定位置高度保守的氨基酸指示了對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或活性是關(guān)鍵性的M酸。鑒于它們?cè)诘鞍踪|(zhì)同源物家族的比對(duì)序列中的高度保守性，它們可以用作標(biāo)記來確定任何所討論的多肽是否屬于已經(jīng)預(yù)先鑒定的多肽家族(在本案中，LEA3蛋白質(zhì)家族)。術(shù)語"基序，，或"共有序列"或"記號(hào)(signature)"指蛋白質(zhì)序列中的短保守區(qū)域?；蛲ǔＪ墙Y(jié)構(gòu)域的高度保守部分，但也可以只包括結(jié)構(gòu)域的一部分，或位于保守結(jié)構(gòu)域之夕卜(如果基序所有的M酸都位于已定義的結(jié)構(gòu)域之外)。存在專業(yè)數(shù)據(jù)庫用于鑒定結(jié)構(gòu)域。鑒定LEA3蛋白質(zhì)中的LEA一4結(jié)構(gòu)域可以使用以下，例如，SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，5857-5864;Letuni等人(2002)NucleicAcidsRes30，242-244)、InterPro(Mulder等人，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，Ageneralizedprofilesyntaxforbiomolecularsequencesmotifsanditsfunctioninautomaticsequenceinterpretation.(In)ISMB-94;Proceedings2ndInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology.AltmanR.，BrutlagD.，KarpP.，LathropR.，SearlsD.,編箸，53-61頁，AAAI出版，MenloPark;Hulo等人，Nucl.Acids.Res.32:D134-D137，(2004))或Pfam(Bateman等人，NucleicAcidsResearch30(l):276-280(2002))。EXPASY蛋白組學(xué)服務(wù)器(由瑞士生物信息學(xué)中心(SwissInstituteofBioinformatics)主管(Gasteiger等人，ExPASy:theproteomicsserverforin-depthproteinknowledgeandanalysis,NucleicAcidsRes.31:3784-3788(2003)))上有一套計(jì)算機(jī)分析蛋白質(zhì)序列的工具可以使用。OsLEA3a蛋白質(zhì)序列用SMART工具(4.1版；Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，5857-5864;Letunic等人(2002)NucleicAcidsRes30，242-244)分析，并使用其在Pfam(17.0版，2005年3約；Bateman等人(2004)Nucl,AcidsRes.32，D138國141)和InterPro(版本11.0，2005年7月26日；Mulder等人(2005)Nucl.Acids.Res.33,D201-205)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行篩選。序列SEQIDNO:2中的第一個(gè)LEA_4結(jié)構(gòu)域始于G28止于D97，第二個(gè)始于G101至D163。通過比對(duì)SEQIDNO:2和其他蛋白質(zhì)序列，可以容易的鑒定相應(yīng)的共有記號(hào)序列、1^入_4結(jié)構(gòu)域或其它序列基序。這樣，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)如序列比對(duì)，可以方l更的鑒定LEA3多肽或其同源物(包括直系同源物和旁系同源物)。用于比較的序列的比對(duì)方法是本領(lǐng)域普遍已知的，此類方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP利用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48;443-453)的算法尋找可以使匹配數(shù)最大化并使空位數(shù)最小化的兩段完整序列的比對(duì)。BLAST算法(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10)計(jì)算序列同一性百分比，并統(tǒng)計(jì)分析兩段序列間的相似度。實(shí)施BLAST分析的軟件通過國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)公開可用。使用如ClustalW多序列比對(duì)算法(1.83版)，用缺省的配對(duì)比對(duì)參數(shù)和百分比評(píng)分方法可以方便的鑒定同源物。還可以用MatGAT軟件包(Campanella等人，BMCBioinformatics.2003年7月10日；4:29.MatGAT:anapplicationthatgeneratessimilarity/identitymatricesusingproteinorDNAsequences.)中可用的方法之一確定相似度和同一性的整體百分比(globalpercentage)。本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚可以實(shí)施細(xì)微的手動(dòng)編輯，優(yōu)化保守基序間的比對(duì)。此外，除了使用全長序列鑒定同源物外，還可以使用特定的結(jié)構(gòu)域(例如LEA—4結(jié)構(gòu)域)。序列同一性的值，在下文中以百分比顯示，是對(duì)完整的保守結(jié)構(gòu)域或核酸或#^*列使用上述程序及其缺省參數(shù)來測定的。OsLEA3a蛋白質(zhì)或其同源物的實(shí)例包括SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35和SEQIDNO:36代表的序列。應(yīng)該理解用"OsLEA3a多肽或其同源物"定義的序列不限于用SEQIDNO:2、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35和SEQIDNO:36代表的序列，而是含有SEQIDNO:3的共有記號(hào)序列，并且優(yōu)選的還與SEQIDNO:2具有至少42%序列同一性(使用Needleman-Wunsch算法，空位開放罰分為11且空位延伸罰分為l)的任何多肽可以適用于本發(fā)明的方法。然而，本文中使用的術(shù)語"OsLEA3a多肽或其同源物"并不包括SEQIDNO:22(來自大麥的LEA3a)。優(yōu)選的，多肽是來自稻的多肽。術(shù)語"同源物"涵蓋直系同源物序列和旁系同源物序列，這是同源性的兩種特殊形式，涉及用于描述基因遺傳關(guān)系的進(jìn)化概念。旁系同源物是相同物種中由祖先基因復(fù)制產(chǎn)生的基因，直系同源物是在物種形成中產(chǎn)生的、來自不同生物體的基因。直系同源物和旁系同源物可以通過實(shí)施所謂的交互blast搜索找到。這可以通過第一次BLAST進(jìn)行，所述第一次BLAST包括針對(duì)任何序列數(shù)據(jù)庫(如公眾可用的NCBI數(shù)據(jù)庫)對(duì)詢問序列(例如SEQIDNO:l或SEQIDNO:2)進(jìn)行BLAST。當(dāng)起始于核苷酸序列時(shí)可以使用BLASTN或TBLASTX(使用標(biāo)準(zhǔn)缺省值)，當(dāng)起始于蛋白質(zhì)序列時(shí)可以使用BLASTP或TBLASTN(使用標(biāo)準(zhǔn)缺省值)?？梢匀芜x地過濾BLAST結(jié)果。之后將過濾結(jié)果或未過濾結(jié)果的全長序列針對(duì)詢問序列所來源生物的序列進(jìn)行反向BLAST(第二次blast)(當(dāng)詢問序列是SEQIDNO:1或SEQIDNO:2時(shí)，第二次BLAST應(yīng)該針對(duì)稻序列)。然后對(duì)第一次和第二次BLAST的結(jié)果進(jìn)行比較。如果第二次BLAST的高級(jí)別命中(high-rankinghit)來自與詢問序列所來源物種相同的物種時(shí)，就鑒定出了旁系同源物；如果高級(jí)別命中不是來自與詢問序列所來源物種相同的物種時(shí)，就鑒定出了直系同源物。優(yōu)選的直系同源物是SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的直系同源物。高級(jí)別命中是具有低E值的。E值越低，分?jǐn)?shù)越重要(或換言之，由于偶然發(fā)現(xiàn)造成命中的幾率越低)。本領(lǐng)域熟知E值的計(jì)算。除了E值，比較還用同一性百分比評(píng)分。同一性百分比指在特定長度內(nèi)兩個(gè)相比較的核酸(或多肽)序列之間相同核苷酸(或JL^酸)的數(shù)目。優(yōu)選的分值大于50，更優(yōu)選的大于100;并且優(yōu)選的E值小于e-5，更優(yōu)選的小于e-6。在大家族的情況下，可以使用ClustalW，然后產(chǎn)生鄰接樹(neighbourjoiningtree),幫助可視化相關(guān)基因的^m以及鑒定直系同源物和旁系同源物。SEQIDNO:2的序列直系同源物的實(shí)例包括SEQIDNO:24、SEQIDNO:36、SEQIDNO:32和SEQIDNO:22。SEQIDNO:2的旁系同源物的實(shí)例包括SEQIDNO:8和SEQIDNO:12。優(yōu)選的，本發(fā)明方法中使用的LEA3蛋白質(zhì)的LEA一4結(jié)構(gòu)域，按照增加的優(yōu)選順序，與SEQIDNO:2的OsLEA3蛋白質(zhì)具有至少40。/。、42%、45%、49%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、卯％、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。圖4中顯示的矩陣表示蛋白質(zhì)全長的相似度和同一性(粗體)。倘若只比較了特定的結(jié)構(gòu)域，不同蛋白質(zhì)的同一性或相似度會(huì)更高?？蛇M(jìn)行測定確定OsLEA3a的活性。為了確定LEA3蛋白質(zhì)的活性，測定是本領(lǐng)域可用且已知的，例如，用Goyal等人描述了熱脅迫和水脅迫測定(Biochem.J.388，151-157，2005)。此外，植物中OsLEA3a蛋白質(zhì)或其同源物的表達(dá)，特別是稻中的表達(dá)，與對(duì)照植物相比，具有增加轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)量的效果，其中增加的產(chǎn)量包括至少以下之一種子總重量，種子總數(shù)和飽滿種子數(shù)。Os2:五/Oa核^y基因編碼OsLEA3a多肽或其同源物。因此本文中定義的術(shù)語"6^丄^43fl核^/基因"是編碼上述定義的OsLEA3a多肽或其同源物的任何核^/基因。Oy丄EAfl核酸的實(shí)例包括但不限于SEQIDNO:l、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31和SEQIDNO:33中任一項(xiàng)所代表的那些。0"^43fl核1基因及其變體可適用于實(shí)施本發(fā)明的方法。本文中定義的術(shù)語"6^丄五Aa核i^/基因或其變體"不包括編碼SEQIDNO:22(大麥的LEA3a)的核酸。優(yōu)選的，Os丄五Aa基因變體來自稻。變體Osi^J3"核酸/基因包括C^EA^核^/基因的部分、剪接變體、等位基因變體和/或能夠和OsZ五A5fl核^/基因雜交的核酸。本文中論及的"核^列"用于意指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物的任何長度的聚合形態(tài)，其可以是雙鏈或單鏈或其類似物，該類似物具有天然核糖核苷酸的重要特征，因此它可以用類似天然存在的多核苷酸的方式與核酸序列雜交。本文中定義的術(shù)語部分指的是編碼多肽的DNA的片段，所述多肽包含兩個(gè)對(duì)應(yīng)于Pfam登錄號(hào)PF02987或InterPro登錄號(hào)IPR004238的LEA4結(jié)構(gòu)域和(SEQIDNO:3)的共有記號(hào)序列。通過對(duì)Osl^A^核酸制造一個(gè)或多個(gè)缺失來制備其部分。部分可以以分離的形式使用或者例如，它們可以融合到其他編碼(或非編碼)序列以產(chǎn)生組合了一些活性的蛋白質(zhì)。當(dāng)融合到其他編碼序列時(shí)，由翻譯產(chǎn)生得到的多肽要比對(duì)OsLEA3a片段預(yù)測的多肽大。部分一般長度是至少100、150或200個(gè)核苷酸，優(yōu)選的至少250、300或350個(gè)核苷酸長度，更優(yōu)選的至少400、450或500個(gè)核苷酸長度，以及最優(yōu)選的至少550或600個(gè)核苷酸長度。優(yōu)選的，部分是由SEQIDNO:l、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31和SEQIDNO:33中任一項(xiàng)所代表的核酸的一部分。最優(yōu)選的OsLEA3a核酸的部分是SEQIDNO:1代表的。術(shù)語"片段"、"序列片段"或"序列部分"、"部分"或"其部分"指所述初始序列的截短的序列。截短的序列(核酸或蛋白質(zhì)序列)長度可以差異很大；最小尺寸是為序列提供至少與初始序列相當(dāng)?shù)墓δ芎?或活性的足夠尺寸的序列，所述初始序列指本發(fā)明的核酸分子，或與本發(fā)明的核酸分子雜交，或在嚴(yán)格條件下用于本發(fā)明的過程，而最大尺寸不是關(guān)鍵的。在一些應(yīng)用中，最大尺寸一般是基本上不大于提供需要的初始序列的活性和/或功能所需的。相當(dāng)?shù)墓δ苤钢辽?0%、45%或50%,優(yōu)選的至少60%、70%、80%或卯％或更高的初始序列的功能。核酸/基因的另一個(gè)變體是在降低的嚴(yán)格條件下，優(yōu)選的在嚴(yán)格條件下，能夠與本文定義的(M:^Ofl核^/基因、或本文定義的部分雜交的核酸，該雜交序列優(yōu)選的編碼包含兩個(gè)對(duì)應(yīng)于Pfam登錄號(hào)PF02987或InterPro登錄號(hào)IPR004238的LEA4結(jié)構(gòu)域和(SEQIDNO:3)的OsLEA3a共有記號(hào)序列的多肽。雜交序列一般長度至少300個(gè)核普酸，優(yōu)選的長度至少400個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的長度至少500個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的長度至少600個(gè)核苷酸。優(yōu)選的，雜交序列是能夠與由SEQIDNO:l、SEQIDNO:7、SEQID>隱9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33代表的核酸，或上述序列中任一項(xiàng)的部分，上述所定義的部分雜交的序列之一。最優(yōu)選的雜^f列能夠雜交SEQIDNO:1,或其部分(或探針)。本領(lǐng)域熟知設(shè)計(jì)探針的方法。探4j"一般長度小于1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp，優(yōu)選的長度小于500bp、400bp、300bp、200bp或100bp。一般，DNA-DNA雜交如Southern印跡的探針長度在100和500bp之間變化，而探針中用于DNA-DNA雜交如在PCR擴(kuò)增中的雜交區(qū)域一般短于50但長于10個(gè)核苷酸，優(yōu)選的長度是15、20、25、30、35、40、45或50bp。本文所定義的術(shù)語"雜交"是基本同源的互補(bǔ)核苷酸序列相互退火的過程。雜交過程可以完全發(fā)生在溶液中，即互補(bǔ)核酸都在溶液中。雜交過程還可以如此進(jìn)行，即其中互補(bǔ)核酸之一固定于基質(zhì)如磁珠、瓊脂糖珠子或任何其他樹脂上。此外雜交過程可還可以如此進(jìn)行，即其中互補(bǔ)核酸之一固定于固相支持物如硝化纖維素膜或尼龍膜上，或通過例如照相平版印刷術(shù)固定到例如^t玻璃支持物上(后者稱之為核酸陣列或微陣列，或稱之為核酸芯片)。為了〗吏得雜^L生，通常4吏核酸分子熱變性或化學(xué)變性，以使雙鏈解鏈成兩條單鏈和/或從單鏈核酸中除去發(fā)夾或其他二級(jí)結(jié)構(gòu)。術(shù)語"嚴(yán)格"指雜交發(fā)生的條件。雜交的嚴(yán)格受到條件例如溫度、鹽濃度、離子強(qiáng)度和雜交緩沖液組成的影響。一般，低嚴(yán)格條件選擇是大約比在確定的離子強(qiáng)度和pH下特異性序列的熱解鏈溫度(TJ低約30°C。中等嚴(yán)格條件是當(dāng)溫度比Tm低20。C時(shí)并且高嚴(yán)^ft是當(dāng)溫度比Tm低10°C時(shí)。高嚴(yán)格雜交條件通常用于分離與靶標(biāo)核酸序列具有高序列相似度的雜交序列。然而，由于遺傳密碼的簡并性，序列上核酸可以不同并且仍然可以編碼本質(zhì)上相同的多肽。因此，有時(shí)需要中等嚴(yán)格雜交條件鑒別此類核酸分子。Tm是在確定的離子強(qiáng)度和pH下，50%的粑標(biāo)序列與完全匹配的探針雜交時(shí)的溫度。Tm依賴于溶液條件、堿基組成以及探針的長度。例如，較長的序列在較高溫度下特異雜交。雜交的最大速率是在低于Tm大約16°C到32。C下得到的。雜交溶液中一價(jià)陽離子的存在降低了兩條核酸鏈之間的靜電排斥，從而促進(jìn)雜交體的形成；對(duì)于高達(dá)0.4M的鈉濃度，這個(gè)作用是明顯的(對(duì)于更高的濃度，可以忽略該效應(yīng))。甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA雙鏈體的解鏈溫度，每百分?jǐn)?shù)甲酰胺降低0.6至0.7。C，加入50%的曱酰胺雖然使雜交速率降低，但使雜交在30至45。C進(jìn)行。堿基對(duì)錯(cuò)配降低了雜交速率和雙鏈體的熱穩(wěn)定性。一般對(duì)于大探針，每％堿基錯(cuò)配使Tm降低大約rC。取決于雜交體的類型，Tm可以使用下列公式計(jì)算1)DNA-DNA雜交體(Meinkoth和Wahl,Anal.Biochem.，138:267-284，1984):Tm=81.5°C+16.6xlog10[Na+]a+0.41x%[G/Cb—500x[LT1—0.61x%甲酰胺2)DNA-RNA或RNA-RNA雜交體Tm=79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(%G/Cb)+11.8(%G/Cb)2-820/Lc3)寡-DNA或寡-RNAd雜交體對(duì)于<20個(gè)核普酸Tm=2(/n)對(duì)于20-35個(gè)核苷酸Tm=22+1.46(/n)fl或?qū)τ谄渌粌r(jià)陽離子，但是僅僅在0.01-0.4M的范圍精確。6僅僅對(duì)30%至75%范圍的％GC精確。cL=雙鏈體中>^對(duì)的長度。rf寡，寡核苷酸；/n，引物的有效長度=2《(。/<:數(shù)目)+(^11數(shù)目)。用許多已知技術(shù)中的任一項(xiàng)都可以控制非特異性結(jié)合，例如用含蛋白質(zhì)的溶液封閉膜，在雜交緩沖液中添加異質(zhì)性的RNA、DNA和SDS,用Rnase處理。對(duì)于非同源性的探針，通過變動(dòng)(i)逐漸降低退火溫度(例如從68。C至42。C)或(ii)逐漸降低甲酰胺濃度(例如從50%至0%)之一，可以實(shí)施一系列雜交。技術(shù)人員熟知在雜交中可以變動(dòng)的多種參數(shù)，其將維持或者改變嚴(yán)格條件。除了雜交條件，雜交的特異性一般也取決于雜交后洗滌的作用。為了移除非特異性雜交產(chǎn)生的背景，用稀釋的鹽溶液洗滌樣品。此類洗滌的關(guān)鍵因素包括最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度鹽濃度越低以及洗滌溫度越高，洗滌的嚴(yán)格性越高。洗滌條件通常在雜交嚴(yán)格性或低于雜交嚴(yán)格性下進(jìn)行。陽性雜交給出的信號(hào)是背景信號(hào)的至少兩倍。總體上，對(duì)于核酸雜交測定或基因擴(kuò)增檢測方法恰當(dāng)?shù)膰?yán)格條件如上述說明。也可以選擇差不多的嚴(yán)格條件。技術(shù)人員熟知在洗滌中可以變動(dòng)的多種參數(shù)，其將維持或者改變嚴(yán)格條件。例如，對(duì)于長度超過50個(gè)核苷酸的DNA雜交體的典型高嚴(yán)格雜交條件包括在65。ClxSSC中或者42。ClxSSC和50%甲酰胺中雜交，然后在65°C0.3xSSC中洗滌。對(duì)于長度超過50個(gè)核苷酸的DNA雜交體的中等嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例包括在50。C4xSSC中或者40°C6xSSC和50%甲酰胺中雜交，然后在50'C2xSSC中洗滌。雜交體的長度是雜交核酸的預(yù)期長度。當(dāng)雜交已知序列的核酸時(shí)，可以通過比對(duì)序列和鑒定本文中描述的保守區(qū)域來測定雜交體長度。lxSSC是0.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉；雜交和洗滌可以另外地包括5xDenhardt試劑、0.5-1.0%SDS、100ng/ml變性的片段化的鮭精DNA、0.5%焦磷酸鈉。為了定義嚴(yán)格性水平的目的，通常參考Sambrook等人(2001)MolecularCloning:alaboratorymanual,第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,CSH，NewYorkortoCurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989并且每年更新)。還可用于本發(fā)明的方法的核^1編碼SEQIDNO:2代表的^J^,列的同源物的核酸。蛋白質(zhì)的"同源物"涵蓋相對(duì)于所討論的未修飾蛋白質(zhì)具有氨基酸取代、缺失和/或插入，且與其所衍生自的未修飾蛋白質(zhì)具有相似的生物學(xué)活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。同源物可以是蛋白質(zhì)"取代變體，，的形式，即其中氨基^列中的至少一個(gè)殘基已經(jīng)被除去，并且不同的殘基插入到它的位置上。氨基酸取代一般是單殘基的，但是取決于對(duì)多肽構(gòu)成的功能限制可以是成串的；插入片段通常是大約1到10個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選的，氨基酸取代包括保守性M酸取代。為了產(chǎn)生此類同源物，蛋白質(zhì)的氨基酸可以被其他具有相似性質(zhì)(如類似的疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞a-螺旋結(jié)構(gòu)或(5-折疊結(jié)構(gòu)的傾向)的氨基酸所置換。保守性取代表是本領(lǐng)域所熟知的(見例如Creighton(1984)Proteins.W.H.FreemanandCompany和下表1)。表l:保守性M酸取代的實(shí)例:<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>同源物還可以是蛋白質(zhì)的"插入變體"的形式，即將其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基引入到蛋白質(zhì)中的預(yù)定位點(diǎn)。插入可包括N-端和/或C-端融合，以及單個(gè)或多個(gè)M酸的序列內(nèi)插入。通常，^JU^列內(nèi)的插入將小于N-或C-端的融合，約為1到10個(gè)殘基的數(shù)量。N-或C-端融合蛋白質(zhì)或肽的實(shí)例包括如用于酵母雙雜交系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)6-標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-標(biāo)簽、A蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag'100表位、c-myc表位、FLAG⑧表位、lacZ、CMP(釣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。蛋白質(zhì)"缺失變體"形式的同源物的特征在于從蛋白質(zhì)除去一個(gè)或多個(gè)B酸。使用本領(lǐng)域熟知的肽合成技術(shù)，如固相肽合成等等，或通過重組DNA乘作，可以很容易的制備蛋白質(zhì)的氨基酸變體(取代-、缺失-和/或插入-變本)。對(duì)DNA序列進(jìn)行操作以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的取代、插入或缺失變體的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，在DNA的預(yù)定位點(diǎn)產(chǎn)生取代突變的技術(shù)是本領(lǐng)成技術(shù)人員熟知的，包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，克利夫蘭:Cleveland)，OH)、快速變換的定點(diǎn)誘變(加拿大圣地亞哥斯萊特基因公司:Stratagene，SanDiego，CA))、PCR-介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變或其他定點(diǎn)誘變方案。本發(fā)明的方法還可以使用編碼衍生物的核酸，所述衍生物為SEQIDVO:2代表的多肽或其直系同源物或旁系同源物的衍生物。"衍生物"包括汰、寡肽、多肽，其與蛋白質(zhì)天然存在形式的M酸序列(例如，如SEQIDVO:2所示的)相比，可以包括用非天然存在的氛基酸殘基取代氨基酸殘基，氛添加非天然存在的氨基酸殘基。蛋白質(zhì)的"衍生物"還包括肽、寡肽、多呔，其與多肽天然存在形式的M酸序列相比，可以包括天然存在的改變的(糖基化、?；愇於┗?、磷酸化、豆蔻?；?、硫酸化)氨基酸殘基或非天然改變的氨基酸殘基。與其所衍生自的M酸序列相比，衍生物還可包括一個(gè)或多個(gè)非氨基酸取代基或添加，例如與M酸序列共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的報(bào)道分子或其他配體，如結(jié)合以便于其檢測的報(bào)道分子，以及相對(duì)于天然存在蛋白質(zhì)的氨基酸序列而言非天然存在的氨基酸殘基。另一種可用于本發(fā)明方法的核酸變體是編碼上述定義的OsLEA3a多肽的剪接變體。本文所用的術(shù)語"剪接變體"涵蓋這樣的核酸序列變體，即其中選定的內(nèi)含子和/或外顯子已經(jīng)被切除、置換、替換或添加，或其中內(nèi)含子已將被縮短或延長。這樣的變體是其中上述蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性基本上保持的那些變體，其可以通過選擇性的保留蛋白質(zhì)的功能片段來獲得。此類剪接變體可以是天然發(fā)現(xiàn)的或人造的。制備此類剪接變體的方法是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選的剪接變體是編碼包含OsLEA3a共有記號(hào)序列(SEQIDNO:3)的多肽的核酸的剪接變體。優(yōu)選的，OsLEA3a多肽或其同源物與SEQIDNO:2具有至少42%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、卯％、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。更優(yōu)選的是SEQIDNO:l、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31和SEQIDNO:33代表的剪接變體。最優(yōu)選的是SEQIDNO:l代表的剪接變體。另一種可用于本發(fā)明方法的核酸變體是上述定義的編碼OsLEA3a多肽的核酸的等位變體。優(yōu)選的等位變體是編碼包含OsLEA3a共有記號(hào)序列(SEQIDNO:3)，并且具有與SEQIDNO:2至少42%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的多肽的核酸。優(yōu)選的，等位變體編碼的多肽是SEQIDNO:l、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31和SEQIDNO:33代表的。最優(yōu)選的，編碼OsLEA3a多肽的等位變體是SEQIDNO:l代表的。等位變體天然存在，并且包括在本發(fā)明方法中的是這些天然等位基因的用途。等位變體包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)以及小的插入/缺失多態(tài)性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多數(shù)生物天然存在的多態(tài)性品系中SNP和INDEL形成了最大的一類序列變體?？捎糜诒景l(fā)明方法的其它核酸變體是用基因改組獲得的核酸變體。還可以用基因改組或定向進(jìn)化產(chǎn)生C^丄五/l"核酸變體。這由下列組成DNA改組的重復(fù)，隨后是適當(dāng)?shù)暮Y選和/或選擇，以生成具有修飾的生物學(xué)活性的核酸或其部分的變體(Castle等人，(2004)Science304(5674):1151-4;美國專利5,811,238和6,395,547)。此外，定點(diǎn)誘變可用于產(chǎn)生Os丄五A核酸的變體。一些方法可用來實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)誘變，最常用方法是基于PCR的方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology.Wiley編著)。Os丄E/1^核酸或其變體可以來自任何天然來源或人造來源。可以從微生物來源如酵母或真菌，或者從植物、藻類或動(dòng)物(包括人)來源中分離核^/基因或其變體?？梢酝ㄟ^嚴(yán)謹(jǐn)?shù)娜斯げ僮髟诮M成和/或基因組環(huán)境方面從其天然形式修飾這一核酸。核酸優(yōu)選是植物來源的，可以是來自相同的植物物種(例如與其待引入的植物物種相同)或來自不同的植物物種。核酸可以分離自單子葉植物物種，優(yōu)選的分離自禾本科，更優(yōu)選的分離自稻。最優(yōu)選的，核酸是SEQIDNO:1所代表的，并且OsLEA3a氨基酸序列是SEQIDNO:2所代表的。因此任何本文中論及的OsLEA3a多肽意指如上述定義的OsLEA3a蛋白質(zhì)。任何編碼此類OsLEA3a蛋白質(zhì)的核酸都適用于本發(fā)明的方法。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方面，希望調(diào)節(jié)、優(yōu)選的增加Os/^A5a核酸或其變體的表達(dá)。增加基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法在本領(lǐng)域中詳細(xì)記載并且包括例如用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子驅(qū)動(dòng)的過量表達(dá)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子的使用?？梢詫⒆饔脼閱?dòng)子或增強(qiáng)子元件的分離的核酸引入至多核苷酸非異源形式的適當(dāng)位置上(一般為上游)，從而上調(diào)Os丄EAa核酸或其變體的表達(dá)。例如，可以通過突變、缺失和/或取代來體內(nèi)改變內(nèi)源啟動(dòng)子(參見Kmiec，美國專利5,565,350號(hào)；Zarling等人，PCT/US93/03868)，或者可以將分離的啟動(dòng)子以適當(dāng)?shù)姆较蚝团c本發(fā)明基因的距離引入植物細(xì)胞中，從而調(diào)控基因的表達(dá)。降低基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法在本領(lǐng)域中有詳細(xì)記載。通過引入遺傳修飾(優(yōu)選的在6^I五J3a基因的基因座中)可以調(diào)節(jié)編碼OsLEA3a多肽或其同源物的核酸的表達(dá)。本文中定義的基因的基因座意指包括目的基因和其編碼區(qū)上游或下游10kb的基因組區(qū)域。例如，遺傳修飾可以通過以下任何一種(或多種)方法引入TDNA激活、TILLING、定點(diǎn)誘變、定向進(jìn)化和同源重組或者通過在植物中引入和表達(dá)編碼OsLEA3a多肽或其同源物的核酸。在引入遺傳修飾后，接下來的步驟是選擇編碼OsLEA3a多肽或其同源物的核酸的修飾表達(dá)，這種表達(dá)的修飾使得植物具有增加的產(chǎn)量。T-DNA激活標(biāo)簽(Hayashi等人Science(1992)1350-1353)涉及在目標(biāo)基因的基因組區(qū)域或基因編碼區(qū)域上游或下游10kb中插入通常包含啟動(dòng)子(也可以是翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子)的T-DNA，如此構(gòu)型以便啟動(dòng)子指引耙基因表達(dá)。通常，破壞耙基因天然啟動(dòng)子對(duì)其的表達(dá)調(diào)控，而使該基因處于新引入的啟動(dòng)子的控制之下。該啟動(dòng)子一般嵌入到T-DNA中。例如，這一T-DNA通過農(nóng)桿菌屬C4rgo6flcfer/M附)感染隨機(jī)插入到植物基因組中，并導(dǎo)致靠近該插入T-DNA的基因過量表達(dá)。由于接近引入的啟動(dòng)子的基因過量表達(dá)，所得的轉(zhuǎn)基因植物顯示出顯性表型。待引入的啟動(dòng)子可以是能指導(dǎo)基因在所需的生物體(在本案中為植物)中表達(dá)的任何啟動(dòng)子。例如，組成型、組織偏好的、細(xì)胞類型偏好的以及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子都適合用于T-DNA激活。也可以使用TILLING技術(shù)(靶向誘導(dǎo)基因組局部損害技術(shù))，把遺傳修飾引入到基因的基因座中。這是一種誘變技術(shù)，可用于產(chǎn)生和/或鑒定，并且最終分離具有被調(diào)節(jié)的表達(dá)和/或活性的Os/:EAfl核酸的誘變變體。TILLING還允許選擇攜帶這類突變變體的植物。這些突變變體可以表現(xiàn)出在強(qiáng)度或位置或計(jì)時(shí)(timing)上被修飾的表達(dá)(例如如果突變影響啟動(dòng)子)。這些突變變體甚至可表現(xiàn)出比該基因的天然形式所表現(xiàn)出的更高的OsLEA3a活性。TILLNG將高密度誘變與高通量篩選方法結(jié)合起來。TILLING—般遵循的步驟是(a)EMS誘變(RedeiGP和KonczC(1992)InMethodsinJ尸"6fV/o/sisResearch,KonczC，ChuaNH,SchellJ，編著Singapore,WorldScientificPublishingCo,第16~82頁；Feldmann等人，(1994)InMeyerowitzEM，SomervilleCR，編著，^4m脇o/w&,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，第137-172頁；LightnerJ和CasparT(1998)InJMartinez-Zapater，JSalinas,編著，MethodsonMolecularBiology,第82巻.HumanaPress,Totowa,NJ，第91-104頁)；(b)DNA制備和個(gè)體合并；(c)目標(biāo)區(qū)域的PCR擴(kuò)增；(d)變性和退火以允許形成異源雙鏈體；(e)DHPLC，其中庫中異源雙鏈體的存在檢測為色鐠圖中額外的峰值；(f)鑒定突變個(gè)體；和(g)突變PCR產(chǎn)物的測序。TILLING的方法是本領(lǐng)域熟知的(McCallum等人，(2000)NatBiotechnol.18,455-457;由Stemple綜述(2004)NatRev.Genet.5(2)，145-150，2004)。定點(diǎn)誘變可用于產(chǎn)生核酸變體。一些方法可用來實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)誘變；最常用方法是基于PCR的方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology.Wiley編著，www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。定向進(jìn)化也可以用來產(chǎn)生核酸變體。這由下列組成DNA改組的重復(fù)，隨后是適當(dāng)?shù)暮Y選和/或選擇，以產(chǎn)生OsZ^Afl核酸或其部分的變體，所述變體編碼具有修飾的生物學(xué)活性的OsLEA3a多肽或其同源物或其部分。(Castle等人，(2004)Science304(5674):1151-4;美國專利5,811,238和6，395，547)。T-DNA激活、TILLING、定點(diǎn)誘變和定向進(jìn)化是能夠產(chǎn)生新的等位基因和變體的技術(shù)的實(shí)例。使用同源重組也可以產(chǎn)生本發(fā)明的效果，該方法能夠在基因組的指定選擇位置引入選定的核酸。同源重組是生物學(xué)中常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用于較低等的生物體如酵母或莒蘚戶/|戸"柳>^/"。用于在植物中進(jìn)行同源重組的方法不僅已在模式植物中描述(Offringa等人(1990)EMBOJ.9(10)，3077-84)，而且在作物植物例如稻中描述(Terada等人，(2002)NatureBiotechnol.20(10)，1030-4;lida和Terada(2004)Curr.Opin.Biotechnol.15(2)，132-8)。引入遺傳修飾(在本案中不需要在6^Z^Aa基因的基因座中)的優(yōu)選方法是在植物中引入和表達(dá)編碼OsLEA3a多肽或其同源物的核酸，如上文所定義的。待引入植物的核酸可以是全長核酸或上文定義的部分或雜^f列。本發(fā)明還提供了遺傳構(gòu)建體和載體，以便于引入和/或表達(dá)可用于本發(fā)明方法中的核苷酸序列。因此，本發(fā)明提供了基因構(gòu)建體，其包含(i)上文定義的6^i:五A^核酸分子或其變體(ii)能驅(qū)動(dòng)(i)中核酸序列表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列；條件是所述核酸或變體不編碼SEQIDNO:22(大麥的LEA3a蛋白質(zhì))?？捎糜诒景l(fā)明方法的構(gòu)建體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建?；驑?gòu)建體可插入到載體中，該載體可以是商購的，適于轉(zhuǎn)化到植物中并適于在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)目的基因。因此本發(fā)明提供了上文定義的基因構(gòu)建體在本發(fā)明方法中的用途。使用包含目的序列(即編碼OsLEA3a多肽或其同源物的核酸)的載體轉(zhuǎn)化植物。技術(shù)人員熟知為了成功轉(zhuǎn)化、選擇和繁殖包含目的序列的宿主細(xì)胞，栽體上必須存在的遺傳元件。目的序列與一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列(至少與啟動(dòng)子)有效連接。術(shù)語"調(diào)節(jié)元件"、"調(diào)控序列，，和"啟動(dòng)子"在文中都可以互換4吏用，且應(yīng)當(dāng)取其廣義，是指能影響與它們連接的序列表達(dá)的調(diào)節(jié)核酸序列。術(shù)語"啟動(dòng)子"一般指位于基因轉(zhuǎn)錄起始上游的核酸調(diào)控序列，其參與識(shí)別和結(jié)合RNA聚合酶和其他蛋白質(zhì)，從而指導(dǎo)有效連接的核酸的轉(zhuǎn)錄。上述術(shù)語包括來源于經(jīng)典真核生物基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(包括精確轉(zhuǎn)錄起始所需的TATA框，帶或不帶CCAAT框序列)以及根據(jù)發(fā)育和/或外界刺激，或以組織特異性方式改變基因表達(dá)的另外的調(diào)節(jié)元件(即上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)。該術(shù)語還包括經(jīng)典原核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，在這種情況下它可以包括-35框序列和/或-10框轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。術(shù)語"調(diào)節(jié)元件"也包括合成的融合分子或衍生物，其使得核酸分子能夠在細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)，激活或增強(qiáng)這種表達(dá)。如本文所用的術(shù)語"有效連接"指啟動(dòng)子序列與目的基因之間的功能性連接，使得啟動(dòng)子序列能起始目的基因的轉(zhuǎn)錄。有利地，可以使用任何類型的啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)核酸序列的表達(dá)。啟動(dòng)子可以是i秀導(dǎo)型啟動(dòng)子，即應(yīng)答化學(xué)、環(huán)境或物理刺激而具有誘導(dǎo)的或增加的轉(zhuǎn)錄起始。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例，迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，即當(dāng)植物接觸多種脅迫條件時(shí)激活的啟動(dòng)子，或病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。另外的或可選的，啟動(dòng)子可以是組織偏好的啟動(dòng)子，即能夠優(yōu)先在某些組織如葉、根、種子組織等中起始轉(zhuǎn)錄的；或者可以是遍在啟動(dòng)子，其基本上在生物的所有組織或細(xì)胞中由活性；或者啟動(dòng)子可以是發(fā)育調(diào)控的，從而在某些的發(fā)育階段或在經(jīng)歷發(fā)育變化的植物部分中有活性。本文中"組織特異性"僅指能夠在某些組織中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。相似的，本文中"細(xì)胞特異性"僅指能夠在某些細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。在植物中有功能的合適啟動(dòng)子是普遍已知的。它們可以采用組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的形式。合適的啟動(dòng)子可以使得在多細(xì)胞真核生物中發(fā)育特異性的和/或組織特異性的表達(dá)；因此，在植物中可以有利的使用葉-、根-、花-、種子-、氣孔-、塊莖-或果實(shí)-特異性的啟動(dòng)子。在植物中使用的不同的植物啟動(dòng)子例如USP、LegB4-、DC3啟動(dòng)子或者歐芽的泛素啟動(dòng)子。"植物"啟動(dòng)子包括介導(dǎo)編碼序列片段在植物細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。因此，植物啟動(dòng)子不必是植物來源的，也可以來源于病毒或微生物，特別是來自例如攻擊植物細(xì)胞的病毒。"植物"啟動(dòng)子還可以源自植物細(xì)胞，例如來自用發(fā)明過程中待表達(dá)和本文描述的核酸序列轉(zhuǎn)化的植物。這也適用于其它"植物"調(diào)節(jié)信號(hào)，例如"植物"終止子。對(duì)于在植物中表達(dá)，如前所述，核酸分子必需有效連接到或包含合適的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子使得以細(xì)胞-或組織-特異性的方式在正確的時(shí)間點(diǎn)表達(dá)基因。可用的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子(Benfey等人，EMBOJ.8(1989)2195-2202)，例如源自植物病毒的那些，例如35SCAMV(Franck等人，Cell21(1980)285-294)、19SCaMV(也見美國5352605和WO84/02913)、34SFMV(Sanger等人，Plant.Mol.Biol"14，19卯433-443)、歐芽泛素啟動(dòng)子，或者植物啟動(dòng)子例如在美國4，962，028中描述的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)小亞基啟動(dòng)子或植物啟動(dòng)子PRPl[Ward等人，Plant.Mol.Biol.22(1993)、SSU、PGEL1、OCS[Leisner(1988)ProcNatlAcadSciUSA85(5):2553-2557、lib4、usp、mas[Comai(1990)PlantMolBiol15(3):373-381)、STLS1、ScBV(Schenk(1999)PlantMolBiol39(6):1221-1230)、B33、SAD1或SAD2(亞麻啟動(dòng)子，Jain等人，CropScience,39(6)，1999:1696陽1701)或nos(Shaw等人，(1984)NucleicAcidsRes.12(20):7831-7846)。組成型植物啟動(dòng)子的其它實(shí)例是甜菜V-腺苷三磷酸酶(V-ATPase)啟動(dòng)子(WO01/14572)。合成的組成型啟動(dòng)子的實(shí)例是Super啟動(dòng)子(WO95/14098)和來自G-框的啟動(dòng)子(WO94/12015)。如果合適，還可以使用化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，對(duì)照EP-A388186，EP-A335528，WO97/06268。在植物中穩(wěn)定的、組成型的表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)是有利的。然而，誘導(dǎo)表達(dá)本發(fā)明的多肽是有利的，如果，例如在收獲前的晚期表達(dá)是有利的，因?yàn)榇x操作可以導(dǎo)致植物生長延遲。通過化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也可以促進(jìn)植物基因的表達(dá)(作為綜述，參見Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol"48:89-108)。當(dāng)需要以時(shí)間特異性方式表達(dá)基因時(shí)，化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是特別合適的。這類啟動(dòng)子的實(shí)例是水楊酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(WO95/19443)、脫落酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(EP335528)、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Gatz等人.(1992)PlantJ.2，397-404)、環(huán)己醇-或乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(WO93/21334)或本文中描述過的其它啟動(dòng)子。其它合適的啟動(dòng)子是那些與生物或非生物脅迫條件反應(yīng)的啟動(dòng)子，例如病原體誘導(dǎo)型pRPi基因啟動(dòng)子(Ward等人，Plant.Mol.Biol.22(1993))、番茄熱誘導(dǎo)型hsp80啟動(dòng)子(美國5,187,267)、馬鈴薯冷誘導(dǎo)型a淀粉酶啟動(dòng)子(WO96/12814)或創(chuàng)傷-誘導(dǎo)型pinll啟動(dòng)子(EP-A-O375091)或本文中描述過的其它啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子特別是那些在組織和器官、種子細(xì)胞如胚乳細(xì)胞和發(fā)育胚細(xì)胞中引起基因表達(dá)的啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子是歐洲油菜的油菜籽蛋白基因啟動(dòng)子(US5，608，152)、蠶豆(W"Vi/"6")USP啟動(dòng)子(Baeumlein等人，MolGenGenet，1991，225(3):459-67)、擬南芥屬油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子(WO98/45461)、菜豆(尸/^mo/附vw/g"W力菜豆蛋白啟動(dòng)子(US5，504，200)、蕓苔屬Bce4啟動(dòng)子(WO91/13980)、豆arc5啟動(dòng)子、胡蘿卜DcG3啟動(dòng)子、或豆球蛋白B4啟動(dòng)子(LeB4;Baeumlein等人，1992，PlantJournal,2(2):233-9)，和在單子葉植物如玉米、大麥、小麥、黑麥、稻等中引起種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。有利的種子特異性啟動(dòng)子是蔗糖結(jié)合蛋白啟動(dòng)子(WO00/26388)、菜豆蛋白啟動(dòng)子和油菜籽蛋白啟動(dòng)子。必需考慮的合適啟動(dòng)子是大麥lpt2或lptl基因啟動(dòng)子(WO95/15389和WO95/23230)，以及WO99/16890中描述的啟動(dòng)子(大麥醇溶蛋白基因、稻谷蛋白基因、稻水稻素基因、稻谷醇溶蛋白(prolamin)基因、小麥麥醇溶蛋白基因、小麥谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、燕麥谷蛋白基因、高粱kasirin基因和棵麥醇溶蛋白基因的啟動(dòng)子)。其它合適的啟動(dòng)子是Amy32b、Amy6-6和Aleurain[美國5,677,474、Bce4(歐洲油菜)[US5,530,149]、大豆球蛋白(大豆)[EP571741]、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(大豆)[JP06/62870]、ADR12-2(大豆)[WO98/08962、異檸檬酸裂合酶(歐洲油菜)[US5，689,040或a-淀粉酶(大麥)[EP781849。其它可以在植物中表達(dá)基因的啟動(dòng)子是例如在DE-A19644478中描述的葉特異性啟動(dòng)子或光調(diào)節(jié)啟動(dòng)子如豌豆petE啟動(dòng)子。其它合適的植物啟動(dòng)子是胞質(zhì)的FBPase啟動(dòng)子或馬鈴薯ST-LSI啟動(dòng)子(Stockhaus等人，EMBOJ.8，1989，2445)、大豆磷酸核糖焦磷酸轉(zhuǎn)酰胺酶啟動(dòng)子(GenBank登錄號(hào)U87999)或EP-A-O249676中描述的節(jié)特異性啟動(dòng)子。優(yōu)選的，6^Z^Afl核酸或其變體有效的連接組成型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子是在大部分但并非必須全部的生長發(fā)育階段以及在大多數(shù)環(huán)境條件下，在至少一個(gè)細(xì)胞、組織或器官中有轉(zhuǎn)錄活性的。優(yōu)選的組成型啟動(dòng)子是也基本上遍在表達(dá)的組成型啟動(dòng)子。更優(yōu)選的，組成型啟動(dòng)子源自植物，更優(yōu)選的源自單子葉植物。最優(yōu)選的是使用GOS2啟動(dòng)子(來自稻，由SEQIDNO:6代表)。要明確的是本發(fā)明的適用性并不限于由SEQIDNO:l所代表的Oy丄五Afl核酸，本發(fā)明的適用性也不限于由GOS2啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的核酸的表達(dá)。其他也可以用來驅(qū)動(dòng)Os/^Aa核^JJi的組成型啟動(dòng)子的實(shí)例在下表2中顯示。表2:組成型啟動(dòng)子的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>任選的，一個(gè)或多個(gè)終止子序列(還有調(diào)控序列)可用于引入植物的構(gòu)建體中。術(shù)語"終止子"包括調(diào)控序列，其是位于轉(zhuǎn)錄單位末端的DNA序列，標(biāo)志初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的3'加工和聚腺苷酸化以及轉(zhuǎn)錄的終止。終止子可以源自天然基因，多種其它植物基因，或T-DNA。添加的終止子可以源自例如胭脂氨酸合成酶或章魚堿合酶基因，或可選的來自另一種植物基因，或較少優(yōu)選的來自任何其它真核基因。其他調(diào)節(jié)元件可以包括轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子以及翻譯增強(qiáng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉適合用于實(shí)施本發(fā)明的終止子和增強(qiáng)予序列。此類序列是已知的，或本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易的獲得。還可以將內(nèi)含子序列添加到5，非翻譯區(qū)(UTR)或編碼序列中以增加在細(xì)胞溶膠中聚集的成熟信息的量。已經(jīng)表明在植物和動(dòng)物表達(dá)構(gòu)建體中的轉(zhuǎn)錄單位中包含可剪接的內(nèi)含子能在mRNA和蛋白質(zhì)水平上^J^因表達(dá)嗜加達(dá)1000倍，Buchman和Berg，Mol.CellBiol.8，4395-4405(1988);Callis等人，GenesDev.1，1183-1200(1987)。當(dāng)將內(nèi)含子置于轉(zhuǎn)錄單位的5，端附近時(shí)，基因表達(dá)的此類內(nèi)含子增強(qiáng)通常是最大的。本領(lǐng)域已知玉米內(nèi)舍子Adhl-S內(nèi)含子1、2和6，Bronze-l內(nèi)含子的用途?？傮w上參見TheMaizeHandbook,116章，F(xiàn)reeling和Walbot編著，Springer,N.Y.(1994)。其它調(diào)控序列(除了啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、內(nèi)含子序列、3，UTR和喊5'UTR區(qū)域)可以是蛋白質(zhì)和/或RNA穩(wěn)定元件。這類序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或可以輕易獲得的。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還可以包括在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制所需要的復(fù)制原點(diǎn)序列。一個(gè)實(shí)例是需要遺傳構(gòu)建體在細(xì)菌細(xì)胞中作為附加型基因元件(如質(zhì)?；騽嗔?維持的情況。優(yōu)選的復(fù)制原點(diǎn)包括但不局限于fl畫ori和colEl。為了檢測和/或選擇在序列方案中描述和在本發(fā)明過程中使用的核酸序列的成功轉(zhuǎn)移，使用標(biāo)記基因(-報(bào)告基因)是有利的。這些標(biāo)記基因能夠通過一系列不同的原理鑒定核酸分子的成功轉(zhuǎn)移，所述原理例如通過借助于熒光、冷光或在人肉眼可區(qū)別的光波長范圍內(nèi)的視覺鑒定，通過對(duì)除草劑或抗生素的抗性，通過已知的營養(yǎng)標(biāo)記(營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記)或抗?fàn)I養(yǎng)標(biāo)記，通過酶測定或通過植物激素?？梢蕴峒暗倪@類標(biāo)記的實(shí)例可以是GFP(-綠色熒光蛋白)；螢光素/熒光素酶系統(tǒng)，p-半乳糖苷酶及其有色底物如X-Gal，對(duì)除草劑例如咪唑淋酮(imidazolinone)、草甘膦(glyphosate)、草胺膦(phosphinothricin)或磺酰脲的抗性，對(duì)抗生素例如博來霉素、潮霉素、鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、遺傳霉素(G418)，壯觀霉素或殺稻瘟素的抗性(在此僅提出一些)，營養(yǎng)標(biāo)記例如對(duì)甘露糖或木糖的利用，或抗?fàn)I養(yǎng)標(biāo)記例如對(duì)2-脫氧葡萄糖的抗性。該名單僅代表了一小部分可能的標(biāo)記。技術(shù)人員非常熟悉這些標(biāo)記。根據(jù)生物體和選擇方法，優(yōu)選不同的標(biāo)記。因此，遺傳構(gòu)建體任選地可包含選擇標(biāo)記基因。如本文所用，術(shù)語"選棒標(biāo)記，，或"選擇標(biāo)記基因，，包括賦予表達(dá)該基因細(xì)胞以表型，以便于鑒定和喊選擇用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的任何基因。合適的標(biāo)記可選自賦予抗生素或除草劑抗性的標(biāo)記，引入新的新陳代謝性狀或允許可視選擇的標(biāo)記。選擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括能賦予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素辯酸化的或磷酸化潮霉素的hpt)、賦予除草劑抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar;提供草甘膦抗性的aroA或gox)，或提供新陳代謝性狀的基因(如允許植物利用甘露糖作為唯一碳源的manA)?？梢晿?biāo)記基因的表達(dá)導(dǎo)致顏色的形成(例如p-葡糖醛酸糖苷酶，GUS)、發(fā)光(如熒光素酶)或熒光(綠色熒光蛋白GFP及其衍生物)。已知核酸被瞬時(shí)的或穩(wěn)定的整合進(jìn)植物細(xì)胞后，根據(jù)使用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅有一小部分細(xì)胞纟聶取外源DNA，并且如果需要，將其整合進(jìn)入基因組。為了鑒定和選擇這些整合體，通常將編碼選擇標(biāo)記(如上述的抗生素抗性)的基因和目的基因一起引入宿主細(xì)胞。植物中優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括賦予對(duì)除草劑如草甘膦或草丁膦(gluphosinate)抗性的那些。其它合適的標(biāo)記是，編碼在例如糖或氨基酸的生物合成途徑中涉及的基因的標(biāo)記，如(5-半乳糖苷酶、ura3或ilv2。編碼基因如熒光素酶、gfp或其他熒光基因的標(biāo)記同樣也另一合適的。這類以及上述的標(biāo)記可以在所述這些基因失去功能的突變體中4吏用，其中如用常規(guī)方法缺失這些基因。此外，將編碼選擇標(biāo)記的核酸分子^1入宿主細(xì)胞，所述選擇標(biāo)記可以是在包含編碼本發(fā)明或過程中使用的多肽的序列的同一載體上，否則是位于分開的栽體上?？梢酝ㄟ^例如選擇來鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了引入的核酸的細(xì)胞(如整合了選擇標(biāo)記的細(xì)胞存活，而其它細(xì)胞死亡)。由于一旦已經(jīng)成功引入核酸，就不再需要或是在轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中不希望有標(biāo)記基因，特別是對(duì)抗生素和除草劑抗性的基因，因此，根據(jù)本發(fā)明引入核酸的過程有利的是使用能夠去掉或切除這些標(biāo)記基因的技術(shù)。已知一種此類方法是共轉(zhuǎn)化。共轉(zhuǎn)化方法使用兩個(gè)載體同時(shí)轉(zhuǎn)化，一個(gè)載體帶有本發(fā)明的核酸，第二個(gè)帶有標(biāo)記基因。轉(zhuǎn)化體的大部分(高達(dá)40%及以上的轉(zhuǎn)化體)接受，或者在植物的情況下，含有兩個(gè)載體。對(duì)于用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的情況，轉(zhuǎn)化體一般只接受載體的一部分，T-DNA側(cè)翼的序列，其通常代表表達(dá)盒。然后可以通過實(shí)施雜交從轉(zhuǎn)化植物去掉標(biāo)記基因。在另一種方法中，使用整合到轉(zhuǎn)座子中的標(biāo)記基因與需要的核酸一起轉(zhuǎn)化(已知為Ac/Ds技術(shù))。轉(zhuǎn)化體可以與轉(zhuǎn)座酶源雜交或者用賦予轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的核酸構(gòu)建體瞬時(shí)或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體。在一些情況下(約10%),—旦成功進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)座子就跳出宿主細(xì)胞基因組并丟失。在其它一些情況下，轉(zhuǎn)座子跳到不同的位置。在這類情況下，必須實(shí)施雜交消除標(biāo)記基因。微生物學(xué)中，發(fā)展了使得此類事件檢測成為可能、或促進(jìn)檢測的技術(shù)。其它有利的方法依靠已知的重組系統(tǒng)；其優(yōu)勢(shì)在于可以省卻用雜交消除。該類型最有名的系統(tǒng)是已知的Cre/lox系統(tǒng)。Crel是去掉位于loxP序列之間的序列的重組酶。如果標(biāo)記基因整合在loxP序列之間，一旦成功進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，通過表達(dá)重組酶就可以去除所述標(biāo)記基因。其它重組系統(tǒng)是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系統(tǒng)(Tribble等人，J.Biol.Chem.，275，2000:22255-22267;Velmurugan等人，J.CellBiol.，149，2000:553-566)。將根據(jù)本發(fā)明的核酸序列位點(diǎn)特異性的整合到植物基因組是可能的。這些方法自然也可以用于微生物如酵母、真菌或細(xì)菌。本發(fā)明還涵蓋了用本發(fā)明的方法可獲得的植物、植物部分或植物細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得的植物，該植物已在其中引入了上述定義的Os丄^Ofl核酸或其變體。發(fā)明還提供了生產(chǎn)具有增加產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在植物中引入和表達(dá)上述定義的Os丄^4^核酸或其變體。出于發(fā)明的目的，"轉(zhuǎn)基因的"、"轉(zhuǎn)基因"或"重組體"意指在以下方面例如核酸序列、表達(dá)盒(=基因構(gòu)建體)或含有核酸序列的載體或者轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的核酸序列、表達(dá)盒或載體的生物體，所有這些構(gòu)建體都用重組方法產(chǎn)生，其中a)根據(jù)本發(fā)明的核酸序列，或b)有效連接根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的遺傳調(diào)控序列，例如啟動(dòng)子，或c)a)和b)中之一沒有位于它們天然的遺傳環(huán)境中或已經(jīng)用重組方法修飾，可以采用例如取代、添加、缺失、倒位或插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基的形式進(jìn)行修飾。天然遺傳環(huán)境理解為意指在初始植物中的天然基因組或染色體的基因座或者存在于基因組文庫中。對(duì)于基因組文庫的情況，核酸序列的天然遺傳環(huán)境優(yōu)選的至少一部分保留。該環(huán)境位于核酸序列至少一側(cè)的側(cè)翼，序列長度至少為50bp，優(yōu)選的至少500bp,特別優(yōu)選的至少1000bp,最優(yōu)選的至少5000bp。當(dāng)下a達(dá)盒用非天然、合成的("人工的")方法如誘變處理進(jìn)行修飾時(shí)，天然存在的表達(dá)盒-例如核酸序列的天然啟動(dòng)子與對(duì)應(yīng)的核酸序列間天然存在的組合(所述核酸序列編碼具有LEA—4結(jié)構(gòu)域的多肽或該多肽的同源物)-就成為了轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。合適的方法描述在例如美國5,565,350或WO00/15815中。因此，出于本發(fā)明目的的轉(zhuǎn)基因植物理解為意指，如上，本發(fā)明方法使用的核酸不是位于它們?cè)谒鲋参锘蚪M中的天然基因座上，核酸可以被同源的或異源的表達(dá)。然而，如上述，轉(zhuǎn)基因還意指當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的或本發(fā)明方法中使用的核i^A位于它們?cè)谥参锘蚪M中的天然位置上時(shí)，則該序列在天然序列方面已被修飾，和/或該天然序列的調(diào)節(jié)序列已被修飾。轉(zhuǎn)基因優(yōu)選的理解為意指根據(jù)本發(fā)明的核酸在基因組中非天然基因座的表達(dá)，即，進(jìn)行核酸的同源或優(yōu)選的，異源表達(dá)。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物在本文中論及。根據(jù)本發(fā)明方法中使用的核酸或載體的宿主植物，表達(dá)盒或構(gòu)建體或載體原則上有利的是所有植物，其能夠合成本發(fā)明方法中使用的多肽。更具體的，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括(i)在植物或植物細(xì)胞中引入和表達(dá)6^L^43"核酸或其變體；并且(ii)在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。核酸可以直接引入到植物細(xì)胞或植物本身(包括引入到植物的組織、器官或任何其他部分)之中。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特征，核酸優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化引入植物中。本文所涉及的術(shù)語"《1入"或"轉(zhuǎn)化"包括把外源多核苷酸向宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移，而不管轉(zhuǎn)移所用的方法如何。無論是通過器官發(fā)生還是胚胎發(fā)生能夠隨后克隆繁殖的植物組織，可以用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，并從其再生出整林植物。選擇的特定組織將根據(jù)可用于且最適于待轉(zhuǎn)化的特定物種的克隆繁殖系統(tǒng)而不同。例示性的靶標(biāo)組織包括葉圓盤、花粉、胚胎、子葉、下胚軸、雌配子體、愈傷組織、已存在的分生組織(例如，頂端分生組織，腋生的芽和根分生組織)以及誘導(dǎo)的分生組織(例如，子葉分生組織和下胚軸分生組織)。多核苷酸可以瞬時(shí)或穩(wěn)定的被引入到宿主細(xì)胞中，并可保持非整合狀態(tài)，例如，作為質(zhì)粒?？蛇x擇的，它可以整合到宿主基因組中。以本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法，所得的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞然后可用來再生轉(zhuǎn)化植物。將外源基因轉(zhuǎn)移到植物基因組被稱為轉(zhuǎn)化。為此描述的用于轉(zhuǎn)化和從植物組織或植物細(xì)胞再生植物的方法被用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。有利的轉(zhuǎn)化方法是inplanta轉(zhuǎn)化。為此目的，例如可以允許農(nóng)桿菌作用于植物種子或用農(nóng)桿菌接種植物分生組織。按照本發(fā)明已經(jīng)證明將轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌懸浮液作用于完整植林或至少作用于花原基是特別方便的。然后生長植物直到獲得被處理植物的種子(Clough和Bent,PlantJ.(1998)16，735-743)。為了選擇轉(zhuǎn)化的植物，在轉(zhuǎn)化中獲得的植物材料通常是在選擇性條件下，使轉(zhuǎn)化的植物可以與未轉(zhuǎn)化的植物區(qū)別開。例如，可以種植在上述方法中獲得的種子，在初始生長階段后，通過噴霧進(jìn)行合適的選擇。其它可能性在于在瓊脂平板上使用合適的選擇劑生長種子(如果合適在滅菌后)，使得只有轉(zhuǎn)化的種子可以生長為植物。其它特別對(duì)植物有利的轉(zhuǎn)化方法是技術(shù)人員已知的，并且描述在下文中。植物物種的轉(zhuǎn)化目前是一種相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)。有利的，任何轉(zhuǎn)化方法都可用于將目的基因引入到合適的祖代細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、能增加游離DNA攝入的化學(xué)品、直接注射DNA到植物中、基因槍轟擊、使用病毒或花粉進(jìn)行轉(zhuǎn)化以及顯微注射。方法可選自用于原生質(zhì)體的釣/聚乙二醇方法(Krens，F(xiàn).A.等人，(1982)Nature296，72-74;Negrutiu1等人(1987)PlantMol.Biol.8，363-373);原生質(zhì)體的電穿孑L(ShillitoR.D.等人，(1985)Bio/Technol3，1099-1102);顯微注射到植物材料中(Crossway等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202，179-185);DNA或RNA包被顆粒轟擊(KleinTM等人，(1987)Nature327，70);用(非整合型)病毒感染等等。優(yōu)選通過農(nóng)桿菌屬(Jgn^acfen7iw)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化使用任何用于稻轉(zhuǎn)化的熟知方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因稻植物，所述的方法例如在任何以下文獻(xiàn)中描述的方法公開的歐洲專利申請(qǐng)EP1198985Al，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996);Chan等人(PlantMol.Biol.22(3)491-506，1993),Hiei等人(PlantJ.6(2)，271-282，1994)，其公開的內(nèi)容以其全文在此引用作為參考。在玉米轉(zhuǎn)化情形下，優(yōu)選的方法如Ishida等人(Nat.Biotechnol.14(6),745-50，1996)或Frame等人(PlantPhysiol.129(1),13-22，2002)中所述，其^開的內(nèi)容以其全文在此引用作為參考。在B.Jenes等人,TechniquesforGeneTransfer,在TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization編著，S.D.Kung和R.Wu，AcademicPress(1993)128-143以及在PotrykusAnnu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)205-225)的實(shí)例中進(jìn)一步描述了所述的方法。待表達(dá)的核酸或構(gòu)建體優(yōu)選的克隆到適于轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(JgrMflc&n'w/Mmwe/ade/w)的載體中，例如pBinl9(Bevan等人，Nucl.AcidsRes.12(1984)8711)。然后可以以已知方法用該載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物，特別是作物植物如作為示例，煙草植物，例如通過將擦傷的或切斷的葉子浸浴在農(nóng)桿菌溶液中，然后在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)它們。通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物描述在例如H6fgen和Willmitzer，在Nucl.AcidRes.(1988)16，9877中，或從F.F.White,VectorsforGeneTransferinHigherPlants;在TransgenicPlants中，第1巻，EngineeringandUtilization,編著.S.D.Kung和R.Wu，AcademicPress,1993,第15-38頁等中獲知。通常在轉(zhuǎn)化以后，選擇存在有與目的基因共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)基因所編碼的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的植物細(xì)胞或細(xì)胞群，接著將轉(zhuǎn)化的材料再生成整躲物。如上所述，用根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌也可以以本質(zhì)上已知的方式用于轉(zhuǎn)化植物如實(shí)驗(yàn)植物如擬南芥屬或作物植物，例如谷類、玉米、燕麥、黑麥、大麥、小麥、大豆、稻、棉花、甜菜、油菜、向曰葵、亞麻、大麻、馬鈴薯、煙草、番茄、胡蘿卜、柿子椒、歐洲油菜、木薯(tapioca)、樹薯(cassava)、葛根(arrowroot)、萬壽菊、苜蓿、萵苣和各種樹、堅(jiān)果和葡萄藤物種，特別是含油作物植物例如大豆、花生、蓖麻油植物、向曰葵、玉米、棉花、亞麻、歐洲油菜、椰子、油棕、紅花(CViW/itf/w"srirtctoW附)或可可豆，例如在農(nóng)桿菌溶液中浸浴受損的葉或葉段，然后在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)它們。除了隨后再生成完整植抹的體細(xì)胞轉(zhuǎn)化外，還可以轉(zhuǎn)化植物分生組織的細(xì)胞特別是那些發(fā)育成配子的細(xì)胞。在此情況下，轉(zhuǎn)化的配子在天然的植物發(fā)育后，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。因此，例如，用農(nóng)桿菌處理擬南芥屬的種子并且從發(fā)育中的植物獲得的種子，該植物的某些部分是被轉(zhuǎn)化從而轉(zhuǎn)基因的(Feldman，KA和MarksMD(1987).MolGenGenet208:274-289;FeldmannK(1992).在CKoncz，N畫HChuaandJShell，編著，MethodsinArabidopsisResearch.WordScientific,Singapore,第274-289頁)。備選方法是基于重復(fù)的去除熒光，并用轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌孵育蓮座中心的切除位點(diǎn)，籍此在后期類似的獲得轉(zhuǎn)化的種子(Chang(I994).PlantJ.5:5S1-558;Katavic(1994).MolGenGenet,245:363-370)。然而，特別有效的方法是真空滲入方法及其修正例如"花浸(floraldip)"方法。在擬南芥屬的真空滲入的情況下，完整植林在降低的壓力下用農(nóng)桿菌懸浮液處理(Bechthold，N(1993).CRAcadSciParisLifeSci，316:1194-1199)，而在"花浸，，方法的情況下，發(fā)育的花組織與表面活性劑處理的農(nóng)桿菌懸浮液暫時(shí)孵育(Clough，SJ和Bent,AF(1998).ThePlantJ.16，735-743)。收獲兩種情況下的某些部分轉(zhuǎn)基因種子，通過生長在上述選擇性條件下區(qū)分這些種子與非轉(zhuǎn)基因的種子。此外，細(xì)胞質(zhì)體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化是有利的，因?yàn)榧?xì)胞質(zhì)體在大多數(shù)作物中是母體遺傳的，這降低或消除了通過花粉的轉(zhuǎn)基因流動(dòng)(transgeneflow)的風(fēng)險(xiǎn)。葉綠體基因組的轉(zhuǎn)化一般通過在Klaus等人，2004[NatureBiotechnology22(2)，225-229]中系統(tǒng)展示過的過程來實(shí)現(xiàn)。簡言之，待轉(zhuǎn)化的序列與選擇性標(biāo)記基因一起克隆到與葉綠體基因組同源的側(cè)翼序列之間。這些同源的側(cè)翼序列指導(dǎo)了位點(diǎn)特異性的整合到原質(zhì)體系中。已經(jīng)描述了用于多種不同植物種的質(zhì)體轉(zhuǎn)化，Bock(2001)Transgenicplastidsinbasicresearchandplantbiotechnology.JMolBiol.2001年9月21j312(3):425畫38或者M(jìn)aliga，P(2003)Progresstowardscommercializationofplastidtransformationtechnology.TrendsBiotechnol.21，20-28中也給出了綜述。現(xiàn)在其它生物技術(shù)i^艮已經(jīng)報(bào)道了可以用瞬時(shí)共整合的標(biāo)記基因生成無標(biāo)記質(zhì)體轉(zhuǎn)化體的形式(Klaus等人，2004，NatureBiotechnology22(2)，225-229)。可以通過技術(shù)人員熟悉的所有方法再生遺傳修飾的植物細(xì)胞。在上述的S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或H6fgen和Willmitzer的公開出版物中可以發(fā)現(xiàn)合適的方法。DNA轉(zhuǎn)移和再生之后，可評(píng)價(jià)推定轉(zhuǎn)化植物中目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組結(jié)構(gòu)，例如使用Southern分析?？蛇x的或另外的，新引入DNA的表達(dá)水平可使用Northern和/或Western分析進(jìn)行監(jiān)控，兩種技術(shù)都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可通過多種方法進(jìn)行繁殖，如通過克隆繁殖或經(jīng)典育種技術(shù)。例如，第一代(或Tl)轉(zhuǎn)化植物可以自花授精并且選擇純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，并且T2植物然后可進(jìn)一步通過經(jīng)典的育種技術(shù)進(jìn)行繁殖。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物可以是多種形式的。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；克隆轉(zhuǎn)化體(例如，所有的細(xì)胞都被轉(zhuǎn)化以含有表達(dá)盒)；轉(zhuǎn)化與未轉(zhuǎn)化組織的嫁接體(例如，在植物中，轉(zhuǎn)化的根莖被嫁接到未轉(zhuǎn)化的接穗中)。本發(fā)明顯然延及由文中描述的任何方法產(chǎn)生的任何植物細(xì)胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖體。本發(fā)明還延及嚢括由任何上述方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞、組織、器官或整林植物的后代，唯一的要求是該基因型和/或表型特征。本發(fā)明還包括含有分離的0"五A"核酸或其變體的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。本發(fā)明還延及植物的可收獲部分，例如但不限于種子、葉、果實(shí)、花、莖、莖培養(yǎng)物、根莖、塊莖和鱗莖。本發(fā)明另外涉及直接來自此類植物的可收獲部分的產(chǎn)物，如干的顆?；蚍?、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白質(zhì)。這些產(chǎn)物還包括以升高的水平存在的并具有經(jīng)^值的代謝物。本發(fā)明還包括Os/JAa核酸或其變體的用途，以及OsLEA3a多肽或其同源物的用途。一種此類用途涉及改良植物的生長特性，尤其是改良產(chǎn)量，特別是種子產(chǎn)量。種子產(chǎn)量可以包括下列一種或多種增加的種子總重量、增加的飽滿種子數(shù)和增加的種子總數(shù)。發(fā)現(xiàn)as丄^^3fl核酸或其變體，或OsLEA3a多肽或其同源物可以在育種方案中用途，所述育種方案中鑒定了與OsZ^^3"基因或其變體遺傳連鎖的DNA標(biāo)記。Oy丄五A^核^/基因或其變體，或OsLEA3a多肽或其同源物可以用來定義分子標(biāo)記。之后可以將此DNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記用在育種方案中以選擇具有增加的產(chǎn)量的植物。例如，0"^43基因或其變體可以是由SEQIDNO:l、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31和SEQIDNO:33中任一項(xiàng)代表的核酸。還發(fā)現(xiàn)OsiJ^La核^/基因的等位變體在標(biāo)記輔助的育種方案中的用途。此類育種方案有時(shí)需要通過植物的誘變處理引入等位變異，例如使用EMS誘變；可選的，該方案可以開始于收集無意引起的"天然"來源的等位變體。之后通過例如PCR進(jìn)行等位變體的鑒定。接著是選擇步驟，用于選擇所討論序列的優(yōu)良等位變體，其產(chǎn)生增加的產(chǎn)量。通常通過監(jiān)控含有所討論序列的不同等位變體的植物的生長特性來進(jìn)行選擇，所述不同等位變體例如SEQIDNO:l、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31和SEQIDNO:33中任一項(xiàng)的不同等位變體。監(jiān)控生長特性可以在溫室或野外進(jìn)行。此外任選的步驟包括使已鑒定優(yōu)良等位變體的植物與另一種植物雜交。例如，這可用于產(chǎn)生目標(biāo)表型特征的組合。核酸或其變體還可用作探針，以對(duì)基因進(jìn)行遺傳和物理作圖，這些基因是與之連鎖的性狀的一部分和標(biāo)記。此類信息可用于植物育種，以開發(fā)具有所需表型的品系。0sZ^A^核酸或其變體的此類用途僅需要長度至少為15個(gè)核苷酸的核酸序列。核酸或其變體可用作限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記。限制性消化的植物基因組DNA的Southern印跡(SambrookJ，F(xiàn)ritschEF和ManiatisT(1989)MolecularCloning,ALaboratoryManual)可4吏用6^L￡L43tf核酸或其變體進(jìn)行探測。然后可以使用計(jì)算機(jī)程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics1:174-181)對(duì)所得的帶型進(jìn)行遺傳分析，以構(gòu)建遺傳圖鐠。此外，該核酸可用于探測Southern印跡，該Southern印跡含有代表親本和確定的遺傳雜交后代的一組個(gè)體的限制酶處理的基因組DNA。記錄DNA多態(tài)性的分離，并用來計(jì)算6^L五A"核酸或其變體在之前使用該群體獲得的遺傳圖鐠中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。在Bematzky和Tanksley(1986)PlantMol.Biol.R印orter4,37-41，中描述了遺傳作圖中植物基因來源的探針的制備和用途。眾多出版物描述了使用上述方法或其變通形式對(duì)特定的cDNA克隆進(jìn)行遺傳作圖。例如，F(xiàn)2雜交群體、回交群體、隨機(jī)交配群體、近等基因系及其他的個(gè)體組可用于作圖。這類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。核酸探針也可用于物理作圖(即將序列置于物理圖上；參見Hoheisel等人，在Non-mammalianGenomicAnalysis:APracticalGuide,Academicpress1996，第319-346頁，以及其中引用的參考文獻(xiàn))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸探針可用于直接熒光原位雜交(FISH)作圖(Trask(1991)TrendsGenet.7:149-154)。雖然現(xiàn)在的FISH作圖方法偏向l于使用大的克隆(幾個(gè)kb到幾百kb;參見Laan等人(1995)GenomeRes.5:13-20)，但是靈敏度的提高允許使用較短的探針進(jìn)行FISH作圖。遺傳和物理作圖的多種基于核酸擴(kuò)增的方法可以使用所述核酸進(jìn)行。實(shí)例包括等位基因特異性擴(kuò)增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11:95-96)、PCR擴(kuò)增片段的多態(tài)性(CAPS;Sheffield等人(1993)Genomics16，325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等人(1988)Science241:1077-1080)、核苷^/f申反應(yīng)(Sokolov(19卯)NucleicAcidRes.18:3671)、放射雜交作圖(Walter等人(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作圖(Dear和Cook(1989)NucleicAcidRes.17:6795-6807)。為實(shí)施這些方法，使用核^列設(shè)計(jì)和制備引物對(duì)，以用于擴(kuò)增反應(yīng)或引物延伸反應(yīng)。此類引物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在采用基于PCR的遺傳作圖方法中，有必要鑒定跨越了對(duì)應(yīng)于此核酸序列區(qū)域作圖的親代之間的DNA序列差異。但是，這對(duì)作圖方法通常不是必要的。根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生如上所述的具有增加的產(chǎn)量和改變的代謝型的植物。這些有利的生長特性也可與其他經(jīng)濟(jì)學(xué)上有利的性狀組合，如進(jìn)一步增產(chǎn)性狀、對(duì)各種脅迫的耐受性、修飾各種結(jié)構(gòu)特征和/或生化和/或生理學(xué)特征的性狀。改變的代謝型可以發(fā)現(xiàn)用作表征具有增加產(chǎn)量的植物的替代途徑，所述植物用本發(fā)明的方法制備。改變的代謝型還可以作為診斷工具或作為生物標(biāo)記。本發(fā)明現(xiàn)將參考以下附圖進(jìn)行描述，其中圖1顯示了OsLEA3a多肽的典型結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。由SEQIDNO:2編碼的蛋白質(zhì)包含兩個(gè)LEA_4結(jié)構(gòu)域(粗體)；11-mer氨基i^&序用下劃線表示。最C端的結(jié)構(gòu)域(斜體)是低復(fù)雜性區(qū)域。圖2顯示了二元載體p070，用于在稻中表達(dá)受到GOS2啟動(dòng)子控制下的擬南芥Os丄EA5"編碼序列(內(nèi)部參考PRO0129)。圖3詳述了可用于實(shí)施本發(fā)明方法的序列的實(shí)例。SEQIDNO:1和2代表Os丄EAfl編碼序列和推論的蛋白質(zhì)序列。SEQIDNO:7至20代表其它稻LEA3a蛋白質(zhì)的序列和編碼序列，SEQIDNO:21和22是大麥HVAl的序列。SEQIDNO:4和5是用于克隆OsZ^Aa的引物序列。SEQIDNO:23至344戈表來自非稻物種的LEA3同源物的編碼序列和蛋白質(zhì)序列。SEQIDNO:35和SEQIDNO:36分別是SEQIDNO:14和SEQIDNO:34的變體。SEQIDNO:3代表共有記號(hào)序列。圖4代表用MATGAT(BLOSUM62矩陣，空位開放罰分為11，空位延伸罰分為1)產(chǎn)生的序列同一性/相似度表。對(duì)角線上方用粗體給出序列同一性，在對(duì)角線下方給出序列相似度。使用的是全長蛋白質(zhì)序列。實(shí)施例本發(fā)明現(xiàn)將參考以下實(shí)施例進(jìn)行描述，其僅僅是為了例證說明。DNA操作除非另外說明，否則重組DNA才支術(shù)按照例如Sambrook(MolecularCloning:alaboratorymanual,第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,CSH，NewYork,2001)或Ausubel等人(1994),CurrentProtocolsinMolecularBiology，CurrentProtocols的巻1和2(http:〃www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.Mml)中描述的標(biāo)準(zhǔn)方案實(shí)施。用于植物分子工作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法描述于R.D.DCroy的PlantMolecularBiologyLabfax(1993),由BIOSScientificPublicationsLtd(UK)(BIOS科學(xué)出版有限公司)和BlackwellScientificPublications(UK)(布萊克威爾科學(xué)出版社)出版。實(shí)施例1:asZJE"A5fl的基因克隆寸吏用日本晴7JC稻(6^j^asa&V"cvA^7/ww6fl/r)幼苗cDNA文庫(英俊公司(Invitrogen)，Paisley,UK)作為模板，PCR擴(kuò)增稻6^丄五J3tf編碼基因。對(duì)從幼苗提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以后，把cDNA克隆到pCMVSport6.0中。文庫的平均插入大小為1.5kb,并且克隆的原始數(shù)為1.59xl07cfu。原始滴度確定為9.6xl05cfu/ml，并且在第一輪擴(kuò)增以后變成6xl011cfu/ml。質(zhì)粒提取以后，將200ng的模板用于50piPCR混合物。用于PCR擴(kuò)增的引物為prm06120(正向斜體表示AttBl位點(diǎn)，粗體表示起始密碼子:5，5f0Pgac朋gWgftecaa朋aefgcaggcffaaacaatggcttGccaccagga-3、(SEQIDNO:4)和prm06121(反向，互補(bǔ)，斜體表示AttB2位點(diǎn)，粗體表示終止密碼子5，ggrggraceacttfgftocaagaaagcfg^gfeaateattcacggcgtctagt-3')(seQIDno5),其包含用于Gateway重組的AttB位點(diǎn)。使用HifiTagDNA聚合酶，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行PCR。同樣使用標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增和純化期望大小的PCR片段。然后進(jìn)行Gateway方法的第一步，即BP反應(yīng)，在此期間，PCR片段與pDONR201質(zhì)粒體內(nèi)重組以產(chǎn)生"進(jìn)入克隆，，(entryclone)"p06(根據(jù)Gateway術(shù)語)。質(zhì)粒pDONR201作為Gateway技術(shù)的一部分購自英俊公司(Invitrogen)。實(shí)施例2:載體構(gòu)建然后在LR反應(yīng)中使用進(jìn)入克隆p06和用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體(destinationvector)p00640。該載體包含位于T-DNA邊界內(nèi)的以下部分作為功能性元件植物選擇性標(biāo)記；可篩選的標(biāo)記表達(dá)盒；旨在與已克隆到進(jìn)入克隆中的目的序列進(jìn)行LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于組成型表達(dá)(PRO0129)的稻GOS2啟動(dòng)子(SEQIDNO:6)位于該Gateway盒的上游。在LR重組步驟后，使用熱擊或電穿孔方法將獲得的表達(dá)載體p07(圖l)轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌屬菌林LBA4044。在YEP培養(yǎng)基中生長轉(zhuǎn)化的菌落，并且用各自的抗生素選擇，這在28。C進(jìn)行2天。將這些農(nóng)桿菌屬培養(yǎng)物用于進(jìn)行實(shí)施例3中描述的植物轉(zhuǎn)化。植物轉(zhuǎn)化也可以使用其它根癌農(nóng)桿菌菌林，其是本領(lǐng)域熟知的。這類菌林的實(shí)例是C58C1或EHA105。實(shí)施例3:植物轉(zhuǎn)化稻轉(zhuǎn)化使用含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化稻植物。將稻日本型栽培種日本晴(ricejaponicacultivarNipponbare)的成熟干燥種子脫殼。在70%乙醇中孵育1分鐘，然后在0.2%HgCl2中孵育30分鐘，然后用滅菌的蒸餾水洗15分鐘共6次進(jìn)行滅菌。將滅菌的種子隨后在含有2,4-D的培養(yǎng)基(愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上萌發(fā)。在黑暗中孵育4周后，切離胚胎發(fā)生的，盾蓋衍生的愈傷組織并在同一培養(yǎng)基上繁殖。兩周后，在相同培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)另外2周以倍增或繁殖愈傷組織。在共培養(yǎng)之前，胚胎發(fā)生的愈傷組織片在新鮮培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)3天(以增強(qiáng)細(xì)胞分裂活性)共培養(yǎng)使用含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌林LBA4404。農(nóng)桿菌接種在含有合適的抗生素的AB培養(yǎng)基上，28。C培養(yǎng)3天。然后收集細(xì)菌并懸浮在液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中達(dá)到大約1的密度(OD600)。然后，將懸浮液轉(zhuǎn)移到培一中，并將愈傷組織浸入懸浮液15分鐘。在濾紙上吸干愈傷組織，將其轉(zhuǎn)移到固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在黑暗中25。C培養(yǎng)3天。在存在選擇劑時(shí)，共培養(yǎng)的愈傷組織生長在含有2，4-D的培養(yǎng)基中，在黑暗中28。C培養(yǎng)4周。在這段時(shí)間內(nèi)，itA出快速生長的抗性愈傷組織島(callusisland)。將這一材料轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基并在光中孵育后，胚胎發(fā)生潛能釋放并在之后的四到五周內(nèi)發(fā)育枝條。從愈傷組織切離枝條并將其在含有生長素的培養(yǎng)基中孵育2至3周，然后將它們從所述培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移到土壤中。變硬的枝條在溫室中高濕度和短日照下生長。一個(gè)構(gòu)建體產(chǎn)生約35個(gè)獨(dú)立的TO稻轉(zhuǎn)化體。初級(jí)轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到溫室。在定量PCR分析mtT-DNA插入片段的拷貝數(shù)后，只保留對(duì)選擇試劑表現(xiàn)出耐受性的單拷貝轉(zhuǎn)基因植物用于收獲Tl種子。在移植三至五個(gè)月后收獲種子。該方法提供單基因座轉(zhuǎn)化體的比率超過50%(Aldemita和Hodges1996，Chan等人，1993，Hiei等人，1994)。玉米轉(zhuǎn)化；用Ishida等人(1996)NatureBiotech14(6):745-50描述的方法的修改方案實(shí)施玉米(Zeamays)轉(zhuǎn)化。在玉米中轉(zhuǎn)化是基因型依賴的并且只有特定的基因型才能轉(zhuǎn)化和再生。近交系A(chǔ)188(明尼蘇達(dá)大學(xué))或以A188為親本的雜種是轉(zhuǎn)化供體材料的好來源，但是也可以成功使用其它基因型。授粉約11天后(DAP)，當(dāng)未成熟胚胎的長度是約1至1.2mm時(shí)，從玉米植物中收獲穗。共培養(yǎng)未成熟胚胎和含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌，并通過器官發(fā)生重新獲得轉(zhuǎn)基因植物。切離的胚依次生長在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，和含有選擇劑(例如咪唑啉酮，但可使用多種選擇標(biāo)記)的玉米再生培養(yǎng)基上。培養(yǎng)板在光及25。C下孵育2-3周，或直到枝條發(fā)育。從每個(gè)胚中將新鮮枝條轉(zhuǎn)移到玉米生根培養(yǎng)基上并且在25。C孵育2-3周，直到根發(fā)育。將生根的枝條移植到溫室的土壤中。從表現(xiàn)出對(duì)選擇劑耐受性的和含有單拷貝T-DNA插入片段的植物中產(chǎn)生T1種子。小麥轉(zhuǎn)化通過Ishida等人，(1996)NatureBiotech14(6):745-50.中描述的方法實(shí)施小麥的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化中常用栽培種Bobwhite(可從CIMMYT，Mexico(墨西哥)獲得)。共培養(yǎng)未成熟胚和含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌，并且通過器官發(fā)生重新獲得轉(zhuǎn)基因植林。與農(nóng)桿菌孵育后，胚依次體外生長在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，和含有選擇試劑(例如咪唑啉酮，但可使用多種選擇標(biāo)記)的再生培養(yǎng)基上。培養(yǎng)板在光及25。C下孵育2-3周，或直到枝條發(fā)育。從每個(gè)胚中將新鮮枝條轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上并且在25。C孵育2-3周，直到根發(fā)育。將生根的枝條移植到溫室的土壤中。從表現(xiàn)出對(duì)選擇劑耐受性的和含有單拷貝T-DNA插入片段的植物中產(chǎn)生Tl種子。大豆轉(zhuǎn)化根據(jù)在TexasA&M專利US5,164,310中描述的方法的修改方案轉(zhuǎn)化大豆。一些商業(yè)的大豆品種可以通過該方法轉(zhuǎn)化。栽培種Jack(得自伊利諾斯種子公司(theIllinoisSeedfoundation))通常用于轉(zhuǎn)化。大豆種子被滅菌以用于體外播種。從七天大的幼苗中切除下胚軸，胚根和一個(gè)子葉。進(jìn)一步培養(yǎng)上胚軸和剩下的子葉以發(fā)育腋結(jié)。這些腋結(jié)被切離并與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌孵育。在共培養(yǎng)處理后，外植體被洗滌并轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基中。切離再生的枝條并置于枝條伸長培養(yǎng)基中。將長度不超過lcm的枝條至于生根培養(yǎng)基中直到根生長。將生根的枝條移植到溫室的土壤中。從對(duì)選擇劑表現(xiàn)出耐受性的和含有單拷貝T-DNA插入片段的植物產(chǎn)生Tl種子。油菜籽/油菜轉(zhuǎn)化將5-6天大的幼苗的子葉柄和下胚軸用作外植體用于組織培養(yǎng)并且根據(jù)Babic等(1998，PlantCellRep17:183-188)被轉(zhuǎn)化。商業(yè)的栽培種(加拿大農(nóng)業(yè)(AgricultureCanada))是用作轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)品種，但是也可以使用其它品種。將油菜種子表面滅菌用于體外播種。從體外幼苗中切離附著了子葉的子葉柄外植體，并通過將葉柄外植體的切割端浸入細(xì)菌懸浮液中來用農(nóng)桿菌(含有表達(dá)載體)接種。將外植體然后在含有3mg/1BAP、3%蔗糖，0.7%Phytagar的MSBAP-3培養(yǎng)基中在23。C，16小時(shí)光中培養(yǎng)2天。與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)2天后，將葉柄外植體轉(zhuǎn)移到含有3mg/1BAP，頭孢噻肟、羧節(jié)青霉素、或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培養(yǎng)基中7天，并且然后在有頭孢噻肟、羧節(jié)青霉素、或特美汀和選擇劑的MSBAP-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)直到枝條再生。當(dāng)枝條5-10mm長時(shí)，將其切下并轉(zhuǎn)移到枝條伸長培養(yǎng)基(MSBAP-0.5，含有0.5mg/1BAP)中。將約2cm長的枝條轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(MSO)用于根誘導(dǎo)。將生根的枝條移植到溫室的土壤中。從對(duì)選擇劑表現(xiàn)出耐受性的和含有單拷貝T-DNA插入片段的植物產(chǎn)生Tl種子。苜蓿轉(zhuǎn)化；利用(McKersie等1999PlantPhysiol119:839-847)的方法轉(zhuǎn)化苜蓿(肘^//01^5^'^1)的再生克隆。苜蓿的再生和轉(zhuǎn)化是基因型依賴的，因此需要再生植林。獲得再生植林的方法已被描述過。例如，這些可以選自栽培種Rangelander(加拿大農(nóng)業(yè)(AgricultureCanada))或j壬何其它的如BrownDCW和AAtanassov(1985.PlantCellTissueOrganCulture4:111-112)描述過的商業(yè)苜蓿品種?？蛇x的，RA3品種(威斯康辛大學(xué)(UniversityofWisconsin))被選擇在組織培養(yǎng)中使用(Walker等，1978AmJBot65:654-659)。葉柄外植體與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌C58C1pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol119:839—847)或LBA4404的過夜培養(yǎng)物共培養(yǎng)。將外植體在含有288mg/LPro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/LK2S04，和100乙酰丁香酮的SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上在黑暗中共培養(yǎng)3天。將外植體在半強(qiáng)度Murashige-Skoog培養(yǎng)基(Murashige和Skoog,1962)中洗滌并置于相同的SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基不含有乙酰丁香酮但含有合適的選擇劑和合適的抗生素以抑制農(nóng)桿菌生長。數(shù)周后，體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到不含生長調(diào)節(jié)劑，不含抗生素，含有50g/L蔗糖的BOi2Y發(fā)育培養(yǎng)基中。將體細(xì)胞胚隨后在半強(qiáng)度Murashige-Skoog培養(yǎng)基上萌發(fā)。生根的幼苗移植到盆中并在溫室中生長。從對(duì)選擇劑表現(xiàn)出耐受性的和含有單拷貝的T-DNA插入片段的植物產(chǎn)生Tl種子。實(shí)施例4:稻中在稻GOS2啟動(dòng)子控制下Os丄五A^表達(dá)的評(píng)估和結(jié)果產(chǎn)生了大約15到20個(gè)獨(dú)立的TO稻轉(zhuǎn)化體。將初級(jí)轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到溫室中生長，并收獲T1種子。5個(gè)事件得以保留，其中Tl后代發(fā)生3:l的轉(zhuǎn)基因存在/缺乏分離。對(duì)于這些事件中的每一個(gè)，通過監(jiān)控可視標(biāo)記選擇，選擇了大約10個(gè)包含轉(zhuǎn)基因的Tl幼苗(雜合子和純合子)，以及大約10個(gè)缺乏轉(zhuǎn)基因的Tl幼苗(失效合子)。將選擇的Tl植物轉(zhuǎn)移到溫室中。每個(gè)植物具有一個(gè)唯一的條形標(biāo)簽以將表型數(shù)據(jù)與對(duì)應(yīng)植物明確聯(lián)系起來。所選擇的Tl植物在10cm直徑花盆的土壤中并在下列環(huán)境狀態(tài)下生長光周期=11.5小時(shí)、日光強(qiáng)度=30,000勒克斯或更多、日間溫度=28°C、夜間溫度-22。C、相對(duì)濕度-60-70%。轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)的失效合子在隨機(jī)位置上并排生長。當(dāng)心植物不受到任何脅迫。從播種期到成熟期，植物幾次通過數(shù)字成像箱。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對(duì)每#物從至少6個(gè)不同的角度取得數(shù)字圖l象(2048xl536像素，1千6百萬色)。地上面積(對(duì)應(yīng)于多葉生物量)通過計(jì)數(shù)區(qū)別于背景的地上植物部分的像素的總數(shù)而確定。此值取同一時(shí)間點(diǎn)從不同的角度拍攝的照片的平均值并通過校準(zhǔn)轉(zhuǎn)換到由平方毫米表示的物理表面值(physicalsurfacevalue)。實(shí)驗(yàn)表明通過這種方法測量的地上植物面積與植物地上部分的生物量相關(guān)。收獲成熟的初級(jí)圓錐花序、裝袋并貼上條碼標(biāo)簽，然后在37。C烘箱中干燥三天。隨后將圓錐花序脫粒并且收集所有的種子。使用鼓風(fēng)裝置將飽滿外殼和空外殼分開。在分離后，使用可商購的計(jì)數(shù)儀器對(duì)兩批種子進(jìn)行計(jì)數(shù)。棄去空外殼。在分析天平上稱重飽滿外殼并且使用數(shù)字成〗象測量種子的截面積。此方法得到一組下列種子相關(guān)參數(shù)通過計(jì)數(shù)在分離步驟之后剩下的飽滿外殼數(shù)確定飽滿種子的數(shù)目。通過稱量所有從植物中收獲的飽滿外殼來測量總的種子產(chǎn)量(總的種子重量)。通過計(jì)數(shù)從植林收獲的外殼的數(shù)目測量每林植物的總種子數(shù)。從計(jì)數(shù)的飽滿的種子數(shù)目和它們的總重推斷得出千粒重(TKW)。收獲指數(shù)定義為總種子重量和地上面積(mm、之間的比值，再乘以因子106。將這些參數(shù)用圖像分析軟件從數(shù)字圖像中自動(dòng)獲得并統(tǒng)計(jì)分析。個(gè)體種子參數(shù)(包括寬度、長度、面積、重量)用定制的裝置測量得到，該裝置由兩個(gè)主要元件組成，即稱重和成像裝置，連接到圖像分析軟件。將對(duì)不平衡設(shè)計(jì)進(jìn)行修正的雙因素ANOVA(方差分析)用作統(tǒng)計(jì)模型，用于植物表型特征的全面評(píng)估。對(duì)用該基因轉(zhuǎn)化的所有植林的所有事件的所有測量參數(shù)進(jìn)行F測驗(yàn)。進(jìn)行F檢驗(yàn)以檢查基因?qū)λ修D(zhuǎn)化事件的效應(yīng)，并檢驗(yàn)基因的總效應(yīng)，亦在此稱之為"整體基因效應(yīng)"。如果F檢驗(yàn)的值顯示數(shù)據(jù)具有顯著性，那么結(jié)論是有"基因"效應(yīng)，這意味著基因的存在或定位引起了效應(yīng)。真實(shí)整體基因效應(yīng)的顯著性閣值設(shè)置為F檢驗(yàn)的5%概率水平。為了檢查基因在事件中的效應(yīng)，即品系特異性效應(yīng)，在每一事件中使用來自轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)無效植物的數(shù)據(jù)集進(jìn)行t檢驗(yàn)。"無效植物"或"無效分離子"或"無效合子"是以與轉(zhuǎn)基因植物相同的方式處理的，但是轉(zhuǎn)基因已經(jīng)從中分離的植物。也可以將無效植物描述為純合的陰性轉(zhuǎn)化植物。將t檢驗(yàn)顯著性的閾值設(shè)定為10%概率水平。一些事件的結(jié)果可以高于此閾值或低于此閾值。這是基于這種假設(shè)，即基因可能僅在基因組中的某些位置中具有效應(yīng)，并且此位置依賴性效應(yīng)的發(fā)生不是罕見的。本文中此類基因效應(yīng)也稱為"基因的線性效應(yīng)(lineeffectofthegene)"。通過比較t值和t分布得到p值，或者通過比較F值和F分布得到p值。p值給出了零假設(shè)(即沒有轉(zhuǎn)基因的效應(yīng))為正確的概率。將在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中得到的6^:EA^數(shù)據(jù)在使用T2植物的第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)。選擇了具有正確表達(dá)模式的四個(gè)品系用于進(jìn)一步分析。通過監(jiān)控標(biāo)記基因表達(dá)來篩選T1中的來自陽性植物(雜合子和純合子)的幾批種子。對(duì)于每一個(gè)所選事件，隨后保存幾批雜合種子用于T2評(píng)估。在每批種子中，在溫室中種植等量的陽性和陰性植物用于評(píng)估。將總數(shù)為120的6^Z五Afl轉(zhuǎn)化的植物在T2代中評(píng)估，即每一事件30#^物，其中15林轉(zhuǎn)基因陽性，15林陰性。由于進(jìn)行了具有重疊事件的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行組合分析。這可用于檢查兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中效應(yīng)的一致性，并且如果在這種情形下，其可用于從兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中收集證據(jù)從而增加結(jié)論的可信性。使用的方法是考慮到數(shù)據(jù)的多級(jí)結(jié)構(gòu)(即實(shí)驗(yàn)-事件-分離子)的混合模型方法。P值通過比較似然比值測定和卡方分布得到。實(shí)施例5:6^Z五A5fl轉(zhuǎn)化體的評(píng)估產(chǎn)量相關(guān)^的測量當(dāng)對(duì)上述種子進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用OsZ^A^基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物比缺乏OA五Afl轉(zhuǎn)基因的植物具有更高的種子產(chǎn)量，以種子總數(shù)量(增加11%)，飽滿種子數(shù)(增加21%)和種子總重量(增加25%)表示。Tl代植物中得到的結(jié)果在表3中總結(jié)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>這些陽性結(jié)果在T2代中再次得到。T2數(shù)據(jù)在與Tl代結(jié)果的組合分析中進(jìn)行再次評(píng)估，并且得到的p值顯示觀察到的效應(yīng)是非常顯著的。實(shí)施例6:轉(zhuǎn)化植物的代謝分析轉(zhuǎn)化了OsLEA3a的植物(如實(shí)施例1所描述)在如實(shí)施例4所描述的在溫室中生長。在多種代謝物方面，通過下列程序確定依照本發(fā)明的改變的組成。a)樣品的均化轉(zhuǎn)移10至30個(gè)稻粒到塑料管中(Eppendorf(微量離心管)，Safe-Lock,2nnL),并且在液氮冷卻下在球磨機(jī)(萊馳公司(Retsch))中用不銹鋼球均化。b)凍干在實(shí)驗(yàn)過程中，小心操作通過凍干均化材料使樣品或者保持在深度冷凍狀態(tài)(-40。C以下)或者沒有水，直到第一次和溶劑接觸。樣品被轉(zhuǎn)移到預(yù)冷(-40。C)的冷凍干燥儀中。在主要的干燥階段初始溫度是-35。C和壓力是0.120毫巴。在干燥過程中，在壓力和溫度程序后改變參數(shù)。12小時(shí)后最終的溫度是+30。C并且最終壓力是0.001至0.004毫巴。在關(guān)閉真空泵和制冷裝置時(shí)，用空氣(通過干燥管干燥)或氬氣沖洗系統(tǒng)。c)提取在沖洗完凍干i殳備后，馬上嚴(yán)格密封有凍干植物材料的管以保護(hù)材料免受空氣濕度。為提取，在玻璃纖維提取套管(thhnble)中稱量50mg的一部分干的均化的植物材料并將其轉(zhuǎn)移到5mlASE裝置(具有溶劑控制器(SolventController)和AutoASE軟件的加速溶劑提取器(AcceleratedSolventExtractor)ASE200(戴安公司))的提取柱體內(nèi)。ASE裝置(具有溶劑控制器和AutoASE軟件的加速溶劑提取器ASE200(戴安公司))的24個(gè)樣品位置裝滿植物樣品，包括用于質(zhì)量控制測試的一些樣品。極性物質(zhì)用大約10ml甲醇/水(80/20，v/v)在70。C和140巴壓力，5分鐘加熱期，1分鐘靜態(tài)提取而被提取。更親脂的物質(zhì)用大約10ml甲醇/二氯甲烷(40/60，v/v)在70。C和140巴壓力，5分鐘加熱期，1分鐘靜態(tài)提取而被提取。兩種溶劑混合物被倒i^目同的玻璃管中(離心管，50ml,裝備有螺旋蓋和可刺穿的隔膜用于ASE(DIONEX))。在溶劑中添加商業(yè)可得的內(nèi)標(biāo)，如核糖醇，L-甘氨酸-2，2-d2，L-丙氨酸-2，3，3,3-d4，甲硫氨酸-d;j，精氨酸_(13C),色氨酸-ds,(x-甲基吡楠葡萄糖苷甲基十九酸酯，甲基十一酸酯，甲基十三酸酯，曱基十五酸酯，甲基二十九酸酯?？偟奶崛∥锱c8ml水混合。扔棄植物樣品的固體殘?jiān)吞崛√坠?sleeve)。搖晃提取物并且然后以最小1400g離心5至10分鐘以加速相分離。移出lml上層甲醇/7JC相("極性相"，無色)用于氣相色譜(GC)分析，并且移出lml用于液相色鐠(LC)分析。扔棄甲醇/7JC相的剩余物。類似地，移出0.75ml有才M目("脂相"，深綠)用于進(jìn)一步地GC分析，并且移出0.75ml用于LC分析。所有的這些樣品用IRDancer紅外線真空蒸發(fā)器(海蒂詩公司(Hettich))蒸發(fā)至干燥。蒸發(fā)過程中的最大溫度不超過40°C。設(shè)備內(nèi)的壓力是10毫巴或更低。d)加工脂和極性相用于LC/MS或LC/MS/MS分析蒸發(fā)至干燥的脂提取物和極性提取物在流動(dòng)相中繼續(xù)用于LC分析。e)LC-MS分析在從安捷倫科技公司(AgilentTechnologies,USA)商業(yè)可得的LC/MS系統(tǒng)上進(jìn)行LC部分。取lOpl極性提取物以200jU/分鐘的流速注入系統(tǒng)。在色譜法中，分離柱(反相C18)保持在15。C。對(duì)于脂提取物，5nl以200|nl/分鐘的流速注入系統(tǒng)。分離柱(反相C18)保持在30°C。用梯度洗脫實(shí)施HPLC。在具有渦輪離子噴射源的應(yīng)用生物系統(tǒng)7>司(AppliedBiosystems)API4000三級(jí)四極儀器上完成質(zhì)語分析。對(duì)于極性提取物，儀器在全掃描模式陰離子模式中從100-1000amu測量；而對(duì)于脂相，儀器在全掃描模式陽離子模式中從100-1000amu測量。f)用于GC/MS分析的脂相衍生化140pi氯仿，37jil鹽酸(37%(重量)的HC1在水中)，320pi曱醇和20pi甲苯的混合物加入到蒸發(fā)的提取物中，用于轉(zhuǎn)曱醇分解(transmethanolysis)。嚴(yán)格密封容器并在搖動(dòng)的同時(shí)在100。C加熱2小時(shí)。隨后蒸發(fā)溶液直到殘?jiān)耆稍铩ｔ驶募籽趸?methoximation)通過在嚴(yán)格密封容器內(nèi)與甲氧胺鹽酸鹽(5mg/ml在吡啶中，100ml在60。C進(jìn)行1.5小時(shí))反應(yīng)完成。加入20pl奇數(shù)、直鏈脂肪酸溶液(從7至25個(gè)碳原子的脂肪酸每種0.3mg/mL和具有27，29和31個(gè)碳原子的脂肪酸每種0.6mg/mL在3/7(v/v)吡力甲苯中的溶液)作為時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)。最后，用100pl的N-曱基-N-三甲基硅烷基-2，2，2-三氟乙酰胺(MSTFA)的衍生化在60。C進(jìn)行30分鐘，同樣在密封容器中。在注入GC之前的終體積是220^1。2)用于GC/MS分析的極性相衍生化羰基的曱氧化(methoximation)通過在嚴(yán)格密封的容器內(nèi)與曱氧胺鹽酸鹽(5mg/ml在吡咬中，50ml在60。C進(jìn)行1.5小時(shí))反應(yīng)完成。加入10奇數(shù)、直鏈脂肪酸溶液(從7至25個(gè)碳原子的脂肪酸每種0,3mg/mL和具有27，29和31個(gè)碳原子的脂肪酸每種0.6mg/mL在3/7(Wv)吡力甲苯中的溶液)作為時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)。最后，用50plN-甲基-N-三甲M烷基-2，2,2-三氟乙酰胺(MSTFA)的衍生化在60。C進(jìn)行30分鐘，同樣在密封容器中。在注入GC之前的終體積是110nl。h)GC-MS分析GC-MS系統(tǒng)由連接到安捷倫(Agilent)5973MSD的安捷倫(Agilent)6890GC組成。自動(dòng)取樣器是來自CTC的CompiPal或GCPal。才艮據(jù)樣品材料和要分析的相分離步驟中分離的級(jí)分，商業(yè)可得的具有不同的含有0%直到35%的芳香部分的聚-甲基-硅氧烷固定相的毛細(xì)管分離柱(30mx0.25mmx0.25pm)被用于分析(例如DB-lms，HP-5ms，DB-XLB，DB-35ms，安捷倫科技乂i^司(AgilentTechnolo-gies))。多達(dá)lpL的終體積不分流注入并且具有從70。C至340。C的烘箱溫度梯度(根據(jù)樣品材料和來自相分離步驟的級(jí)分的具有不同的加熱速率)，以實(shí)現(xiàn)充分的色謙分離和每個(gè)分析物峰中的掃描數(shù)。使用通常的GC-MS標(biāo)準(zhǔn)條件，例如具有名義上的l至1.7ml/分鐘的恒流和氦氣被用作流動(dòng)相氣體。電離作用通過具有70eV的電子^3Mt進(jìn)行，以2.5至3掃描/秒的掃描速率和標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧條件在從15至600的m/z范圍內(nèi)掃描。i)多種植物樣品的分析樣品在每一20個(gè)樣品的個(gè)體系列中分析。在實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)系列包含每個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的至少3個(gè)復(fù)制和至少3個(gè)各自的無效分離子品系植物作為對(duì)照。每一分析物的峰面積根據(jù)為植物確立的干重進(jìn)行調(diào)整(標(biāo)準(zhǔn)化面積)。通過進(jìn)一步針對(duì)對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算比值。在實(shí)驗(yàn)中比值通過標(biāo)準(zhǔn)化面積除以相同系列中對(duì)照組的的相應(yīng)數(shù)據(jù)的平均值而計(jì)算得到。得到的值作為占對(duì)照比值(ratio一by一contro1)。它們?cè)谙盗兄惺强杀容^的并且表明轉(zhuǎn)基因植物的分析物濃度與對(duì)照組相差多少，所述對(duì)照組是給定的系列中各自的無效分離子品系植物。在之前進(jìn)行了合適的對(duì)照以證明栽體和轉(zhuǎn)化步驟本身對(duì)植物代謝組成沒有顯著的影響。不同植物的分析結(jié)果可以從下面的表4中看到表4:從OsLEA3a轉(zhuǎn)化體得到的種子的分析結(jié)果，最小比和最大比是相對(duì)于對(duì)照植物的。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>列2顯示分析的代謝物，列1給出了代謝物所屬的代謝種類。列3和4顯示最小和最大比，從此可以得到轉(zhuǎn)基因植物和它們的野生型各自無效分離子對(duì)照品系之間在獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的分析的代謝物增加或減少的范圍。列4指出了分析方法(氣相色譜分析或液相色語分析)。該表顯示占對(duì)照比值(ratio—by—control)值的范圍在氨基酸組內(nèi)是0.7和7.7之間；在類胡蘿卜素組內(nèi)是1.8和19.3之間；在輔因子組內(nèi)是1.3和1.5之間；在脂肪酸和相關(guān)代謝物組內(nèi)是0.3和0.9之間；在有機(jī)酸組內(nèi)是1.4和20.0之間；在酚類組內(nèi)是1.4和8.5之間；在植物激素和植物固醇組內(nèi)是1.0和10.9之間；在糖代謝物組內(nèi)是0.5和7.1之間；在生育酚和相關(guān)代謝物組內(nèi)是0.3和4.2之間。權(quán)利要求1.相對(duì)于對(duì)照植物增加植物產(chǎn)量的方法，包括調(diào)節(jié)在植物中編碼OsLEA3a多肽或其同源物的核酸的表達(dá)，和任選的選擇具有增加產(chǎn)量的植物，條件是所述OsLEA3a多肽或其同源物不是SEQIDNO22(大麥)。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述調(diào)節(jié)的表達(dá)是通過優(yōu)選的在編碼OsLEA3a多肽或其同源物的基因的基因座中引入遺傳修飾來實(shí)現(xiàn)。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述遺傳修飾通過以下之一來實(shí)現(xiàn)T-DNA、激活，TILLING,定點(diǎn)誘變或定向進(jìn)化。4.相對(duì)于對(duì)照植物增加植物產(chǎn)量的方法，其包括在植物中引入和表達(dá)核酸或其變體，條件是所述的核酸或其變體不編碼SEQIDNO:22(大麥LEA3a)。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的核酸編碼SEQIDNO:2的OsLEA3a蛋白質(zhì)的同源物，優(yōu)選的所述的核酸編碼SEQIDNO:2的OsLEA3a蛋白質(zhì)的旁系同源物。6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的變體是Os/:五J3a核酸的一部分或能夠雜交0"^43a核酸的序列，該部分或雜交序列編碼包含2LEA—4結(jié)構(gòu)域和SEQIDNO:3的OsLEA3a共有記號(hào)序列的多肽。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中所述的Os/JM3核酸或其變體在植物中是過量表達(dá)的。8.根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述C^丄EAa核酸或其變體是植物來源的，優(yōu)選來自單子葉植物，更優(yōu)選來自禾本科，最優(yōu)選的，核酸來自稻。9.根據(jù)權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)的方法，其中所述的6^丄^43fl核酸或其變體與組成型啟動(dòng)子有效連接。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述的組成型啟動(dòng)子是GOS2啟動(dòng)子。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中所述的增加的產(chǎn)量是增加的種子產(chǎn)量。12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法，其中所述的增加的產(chǎn)量選自增加的種子總重量，增加的飽滿種子數(shù)或增加的收獲指數(shù)。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法可獲得的植物。14.構(gòu)建體，其包含(i)asZjE^h核酸或其變體；(ii)有效連接到(i)的核酸序列的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列，條件是所述的0^^A^核酸或其變體不編碼SEQIDNO:22(大麥LEA3a)。15.根據(jù)權(quán)利要求14的構(gòu)建體，其中所述的調(diào)控序列是組成型啟動(dòng)子。16.根據(jù)權(quán)利要求15的構(gòu)建體，其中所述的組成型啟動(dòng)子是GOS2啟動(dòng)子。17.根據(jù)權(quán)利要求16的構(gòu)建體，其中所述的GOS2啟動(dòng)子由SEQIDNO:6所代表。18.用根據(jù)權(quán)利要求14至17中任一項(xiàng)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物。19.生產(chǎn)與對(duì)照植物相比具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括(i)在植物或植物細(xì)胞中引入并表達(dá)6^丄EAfl核酸或其變體；(ii)在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞，條件是所述的t^^Afl核酸或其變體不編碼SEQIDNO:22(大麥LEA3a)。20.在非脅迫條件下生長時(shí)具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物，其由引入所述植物的OsZ^A"核酸或其變體而產(chǎn)生。21.根據(jù)權(quán)利要求13、18或20的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉植物，例如甘蔗或其中該植物是谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、燕麥或高粱。22.根據(jù)權(quán)利要求13、18、20或21中任一項(xiàng)的植物的可收獲部分。23.根據(jù)權(quán)利要求22的植物的可收獲部分，其中所述的可收獲部分是種子。24.直接來自根據(jù)權(quán)利要求21的植物和/或來自根據(jù)權(quán)利要求22或23的植物的可收獲部分的產(chǎn)品。25.&/^43"核^/基因或其變體的用途，或OsLEA3a多肽或其同源物的用途，其用于相對(duì)于對(duì)照植物，改良在非脅迫條件下生長的植物的產(chǎn)量，特別是種子產(chǎn)量。26.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述的種子產(chǎn)量是下面一種或多種增加的種子總重量，增加的飽滿種子數(shù)和增加的收獲指數(shù)。27.0^^A^核^/基因或其變體的用途，或OsLEA3a多肽或其同源物的用途，其用作分子標(biāo)記。28.具有改變的代謝物水平的植物種子，其中所述植物種子中代謝物水平和對(duì)照植物種子的代謝物水平的比值范圍在g酸組內(nèi)是0.7和7.7之間；在類胡蘿卜素組內(nèi)是1.8和19.3之間；在輔因子組內(nèi)是1.3和1.5之間；在脂肪酸和相關(guān)代謝物組內(nèi)是0,3和0.9之間；在有機(jī)酸組內(nèi)是1.4和20.0之間；在酚類組內(nèi)是1.4和8.5之間；在植物激素和植物固醇組內(nèi)是1.0和10.9之間；在糖代謝物組內(nèi)是0.5和7.1之間；在生育酚和相關(guān)代謝物組內(nèi)是0.3和4.2之間；該植物具有編碼OsLEA3a蛋白質(zhì)或其同源物的核酸的調(diào)節(jié)的表達(dá)。全文摘要本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)編碼OsLEA3a多肽或其同源物的核酸在植物中的表達(dá)來增加植物產(chǎn)量的方法。此類方法之一包括將OsLEA3a核酸或其變體引入植物。本發(fā)明還涉及在其中已經(jīng)引入了OsLEA3a核酸或其變體的轉(zhuǎn)基因植物，該植物與對(duì)照植物相比具有增加的產(chǎn)量和改變的代謝型。本發(fā)明還涉及可用于本發(fā)明方法中的構(gòu)建體。文檔編號(hào)C07K14/415GK101268193SQ200680034067公開日2008年9月17日申請(qǐng)日期2006年9月15日優(yōu)先權(quán)日2005年9月15日發(fā)明者A·I·桑茲莫林納羅申請(qǐng)人:克羅普迪塞恩股份有限公司